KR910004868B1 - 인체 단일 클론항체 및 그것을 활성성분으로 함유하는 감염증의 예방 및 치료용 약학적 제제 - Google Patents

인체 단일 클론항체 및 그것을 활성성분으로 함유하는 감염증의 예방 및 치료용 약학적 제제 Download PDF

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Abstract

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Description

[발명의 명칭]
인체 단일 클론항체 및 그것을 활성성분으로 함유하는 감염증의 예방 및 치료용 약학적 제제
[도면의 간단한 설명]
제 1 도 내지 제 7 도는 인체 단일 클론항체와 LPS의 결합에 대한 각종 혈청형의 녹농균의 LPS의 억제시험을 통해 인체 단일 클론항체와 녹농균의 O-항원과의 교차반응성을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
제 1 도는 D형과 I형의 녹농균의 LPSs가 HPs1의 결합을 억제함을 도시하는 것이다.
제 2 도는 E형과 F형의 녹농균의 LPSs가 HPs2의 결합을 억제함을 도시하는 것이다.
제 3 도는 A형과 L형의 녹농균의 LPSs가 HPs4의 결합을 억제함을 도시하는 것이다.
제 4 도는 G형과 H형의 녹농균의 LPSs가 HPs5의 결합을 억제함을 도시하는 것이다.
제 5 도는 E형과 F형의 녹농균의 LPSs가 HPs6의 결합을 억제함을 도시하는 것이다.
제 6 도는 A형과 F형의 녹농균의 LPSs가 HPs7의 결합을 억제함을 도시하는 것이다.
제 7 도는 E형과 F형의 녹농균의 LPSs가 HPs8의 결합을 억제함을 도시하는 것이다.
[발명의 상세한 설명]
[산업상의 이용분야]
본 발명은 단일한 단일 클론항체로서 복수의 혈청형 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 O-항원에 대하여 친화성을 나타내는 녹농균에 대한 인체 단일 클론항체를 산생하는 세포, 상기 항체, 그것을 활성성분으로 함유하는 녹농균 감염증의 예방 및 치료제, 및 이것의 제조에 관한 것이다.
[종래 기술]
녹농균은 자연계에 광범위하게 존재하며 하수물과 기타 인체 및 동물의 구강 또는 장내에서 고빈도로 발견된다. 이 균은 그 자체의 독성에 의한 일반 감염 환자에서 보다는 감염에 대한 저항력이 감소된 환자, 즉 암환자, 면역억제 치료중의 환자, 이식환자, 화상환자, 신생아에게서 그 병원성을 나타낸다.
현재, 녹농균 감염증은 가장 치료가 곤란한 감염증으로 간주되고 있다. 즉, 녹농균은 상용되고 있는 거의 모든 항생제에 대하여 내성을 가질뿐만 아니라 근년에 개발된 항생제에 대하여도 용이하게 내성을 유도시키는 경향이 있다. 따라서, 항생제 치료의 한계에 직면하고, 숙주의 녹농균 처리능력을 증강시키기 위한 예방 및 치료법의 연구를 행하였다. 연구결과 왁찐이 개발되었으나, 이것은 이미 감염된 환자에 대하여는 속효를 기대하기 곤란하다. 한편, 최근에는 녹농균 감염증을 치료함에 있어서 건강한 사람의 혈청 또는 혈장으로부터 정제한 인체면역 글로불린과 이것의 화학적 변성물을 유효성분으로 함유하는 제제가 많이 사용되었다. 그러나, 이러한 제제중에 함유된 항체중 녹농균에 대한 친화성을 가짐과 동시에 치료에 유효한 항체의 양이 일정하지 않고 그 양이 적기 때문에 대다수의 연구자들이 상기 제제의 예방 및 치료효과에 대하여 의문점을 제기하였다. 따라서, 소량으로도 유효한 인체 단일 클론항체의 개발이 절실히 요구되어 왔다.
한편, 녹농균의 표면 항원으로서는, 외막 단백질(OMP), 편모 또는 점액에서 유래된 다당류 및 지질 다당류(이하, LPS로 약칭한다) 항원이 존재하는 것으로 알려져 있다. 이중, LPS는 혈청형 특이항원 부위인 O-다당류(이하, 경우에 따라서 O-항원으로 약칭한다), 및 그람 음성균의 공통 기본구조인 지질 A와 핵으로 구성된다. O-다당류 사슬은 올리고 사카라이드가 반복되어 구성된다. 이러한 O-폴리 사카라이드 사슬의 면역적 성질에 의하여 녹농균의 혈청형별 분류가 행해진다. 그러나, 현재까지도 녹농균의 혈청형 분류에 대해서는 많이 논의되고 있는 실정이다. 일본에서는, 녹농균을 A형 내지 M형의 13종으로 분류한 일본국 녹농균 연구회의 혈청형 분류법[Homma, Japan J.Exp. Med., 46, 329-336(1976)]을 널리 이용 하고 있다. 일본국 녹농균 연구회의 혈청형 분류법을 다른 분류법과 비교한 결과는 다음과 같다.
일본국 녹농균 연구회의 혈청형별 분류와 다른 분류와의 비교
Figure kpo00001
최근, O-다당류 사슬의 1차 구조가 순차적으로 명백해지고 있는바(예를들면, Kropinski 등, Antibiot. Chemother., 36, 58-73(1985)) 이것은 장래에 새로운 분류법이 채택될 수 있음을 시사하는 것이다. 녹농균의 LPS의 O-다당류 사슬에 대한 항체, 즉 녹농균 O-항원에 대한 항체는 보족체계를 게재하여 강한 용균작용 또는 옵소닌 작용을 발휘하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자등은 녹농균 감염증의 예방 및 치료에 유효한 인체 단일 클론항체를 얻고자 예의 연구한 결과, 녹농균의 혈청형 항원에 대한 인체 단일 클론항체, 즉 녹농균과 혈청형 특이적으로 반응할 수 있는 단일 클론항체가 동일 혈청형의 녹농균 감염에 대한 극히 높은 보호활성을 가짐을 밝혀내고 일본국 특허출원 제248626/1985호에 기술되어 있는 발명을 완성하기에 이르렀다. 그러나, 그후에 공개된 것으로서 녹농균의 LPS의 O-다당류 사슬감염에 대한 인체 단일 클론항체의 보호활성에 관한 일본국 특허출원 제152280/1986호 및 제155398/1986호에 기술되어 있는 바와 같이, 녹농균과 혈청형 특이적으로 반응하는 인체 단일 클론항체는 단일 혈청형의 녹농균과만 특이적으로 반응하며 동일 혈청형의 녹농균 감염에 대한 보호활성은 가지나 다른 혈청형의 녹농균 감염에 대한 보호활성은 가지지 않는다.
한편, 녹농균의 외막 단백질에 대한 단일 클론항체[Sawada 등, J.Infect. Dis., 150, 570-576(1985), Yoshiaki NAKAMURA등, Jpn, J.Bacteriol., 39, 337 (1984)] 또는 녹농균의 공통 다당류에 대한 인체 단일 본 클론항체[Sawada 등, J.Infect. Dis., 150, 1290-1299(1985)]는 녹농균 감염에 대한 호활성이 낮다.
[본 발명이 해결하고자 하는 문제점]
전술한 바와 같이, 녹농균의 O-항원에 대한 인체 단일 클론항체는 녹농균의 다른 항원에 대한 인체 단일 클론항체에 비해 보호항체로서 극히 높은 활성을 가지지만 해당하는 혈청형의 녹농균 감염에 대해서만 효과적이다. 일본국 녹농균 연구회의 혈청형별 분류법에 의하면, O-항원은 13종으로 분류되며, 빈도에 차이가 있기는 하지만 임상적으로 분리된 녹농균의 혈청형은 모든 혈청형균에 포함된다. 따라서, 녹농균의 감염증에 대한 예방 및 치료제로서 O-항원에 대한 인체 단일 클론항체를 일반적으로 사용하기 위해서는, 수종 내지 십수종의 항체를 배합하여 제제를 제조하여야 한다. 그러나, 배합에 사용되는 단일 클론항체의 수가 증가하면, 제제의 품질조절이 복잡해진다. 이러한 복잡성을 감소시키기 위해서는, 복수의 다른 혈청형 녹농균과의 교차 반응성을 나타냄과 동시에 복수의 다른 혈청형 녹농균으로 인한 감염증에 대해 강한 보호활성을 갖는 O-항원에 대한 인체 단일 클론항체의 취득이 요망된다. 그러나, 이에 대한 성공사례의 기록이 없다. 또한, 인체에 안전하게 주사할 수 있는 상기 인체 단일 클론항체를 대량으로 안정하게 생성하는 세포주의 제조도 중요한 과제이다.
[문제점을 해결하기 위한 수단]
본 발명자들은 높은 보호활성을 가지며 복수의 혈청형 녹농균을 공통으로 인지할 수 있는 단일한 인체 단일 클론항체를 분비하는 세포주를 취득하기 위해 예의 연구한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 복수의 다른 녹농균의 O-항원과 반응할 수 있는 인체 단일 클론항체, 즉, 녹농균의 O-항원과 복수적으로 반응할 수 있는 인체 단일 클론항체를 연속 생성하는 자기복제 세포주를 취득하고, 이 세포주에 의해 생성된 인체 단일 클론항체를 단독으로 또는 배합하여 녹농균 감염증의 예방 및 치료제로서 인체 및 동물에 사용함으로써 녹농균 감염증을 예방 및 치료하기 위한 것이다. 인체의 항체생성세포(B세포)는 엡스타인-바르 바이러스(이하, EB 바이러스로 약칭한다)로 감염되어 형질전환(이하, EB 바이러스 형질전환으로 약칭한다)을 행하며, 인체의 항체생성 세포는 인체 또는 동물에서 유도된 무한증식능을 가진 세포, 예를들면 암세포에 융합되어 무한증식능을 가진 세포집단을 산출한다. 이 세포집단으로부터, 효소면역분석 및 클로닝법을 사용하여 혈청형이 다른 복수의 녹농균과의 반응성을 가지는 단일한 인체 단일 클론항체를 생성하는 세포주를 선별한다. 이어서, 이 세포를 배양하고, 이 배양용액으로부터 통상의 방법, 예를들면 칼럼 크로마토그래피, 전기영동, 침전, 추출 등에 의해 혈청형이 다른 녹농균과의 반응성을 가지는 단일한 인체 단일 클론항체를 정제한다. 정제된 인체 단일 클론항체는 단독 또는 임의의 첨가물을 첨가하여 액상제제 또는 동결건조 제제로서 녹농균 감염증의 예방 및 치료용으로 제공할 수 있다.
[구체적인 설명]
1. 사용된 녹농균
본 발명에서는 편의상 일본국 녹농균 연구회 주최의 혈청혈별 검토위원회의 혈청형별 분류법에 따라 사용된 녹농균을 분류하였다. 표 1에 도시한 A형 내지 M형에 속한 균주를 사용하였다.
A형 내지 M형에 속하는 대부분의 숙주는 미합중국 모식균 배양수집소(American Type Culture Collection(ATCC)) 및 동경 대학의 과학연구소(University of Tokyo, Institute of Medical Science)로부터 입수할 수 있다.
2. 인체 단일 클론항체의 제조
본 발명에 의한 녹농균의 O-항원과 복수적으로 반응하는 인체 단일 클론항체, 즉 녹농균의 LPS의 O-다당류 사슬에 대한 인체 단일 클론항체는 EB 바이러스 형질전환법, 세포융합법 등에 의해 제조할 수 있다.
EB 바이러스 형질전환법에 의한 본 발명의 인체 단일 클론항체의 제조는, (1) 인체항체 생성세포(인체 B세포)를 제조하고, (2) 인체항체 생성세포를 EB 바이러스로 감염시켜서 형질전환을 행하고, (3) 혈청형이 다른 복수의 녹농균과 반응할 수 있는 항체의 분비를 검출하고, (4) 형질전환된 세포집단으로부터 단일한 세포주를 선별(이하, 이 조작을 경우에 따라서 클로닝으로 약칭한다)하고, (5) 이 세포주를 배양하고, (6) 배양물로부터 인체 단일 클론항체를 정제하여 행할 수 있다.
다음은 각 공정을 상세히 설명한다.
(1) 항체생성세포의 제조
본 발명의 방법에 사용된 인체의 항체생성세포(B세포)는 녹농균에 대한 항체를 생성할 수 있는 건강한 사람, 또는 과거에 녹농균 감염증에 걸린 사실이 있는 환자로부터 채취한 말초혈액, 림프절, 편도선 또는 비장으로부터, 또는 분만시의 탯줄혈액으로부터 공지의 방법을 이용하여 산출할 수 있다. 혈액 또는 상기 조직들로부터 산출된 인체항체 생성세포(B세포)의 분리 및 농축은 Ficoll-Conray등의 세포 분획액을 사용하는 비중원심분리법, E로셋형성법, 패닝법 등을 배합하여 효율적으로 행할 수 있다.
(2) 형질전환
EB 바이러스에 의한 인체항체 생성세포(B세포)의 형질전환은 공지의 방법(예를들면, Nature, 269, 420-422(1977))에 의거하여 실시할 수 있다.
B 95-8 세포(감염성 EB 바이러스를 생성하는 마르모셋 백혈구에서 유도된 세포)를 20% 송아지 태아혈청(이하, FCS로 약칭한다)을 함유하는 RPMI 1640배지(이하, 경우에 따라서 배양용액으로 약칭한다)내에서 배양한다. 정지상태로 약 7일 경과한후 배양 상청액을 원심분리하여 비루스 용액을 얻는다[Proc. Jap. Soc. Immunol., 4, 399-401(1974)]. 이어서, 방법(1)에서 얻은 인체항체 생성세포(B세포)를 원심분리하고, 흡인법으로 상청액을 제거하며 산출된 펠릿에 EB 바이러스 용액을 첨가하여 분산시킨후, 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 1시간동안 배양한다. 배양후, 원심분리하고, 흡인법으로 상청액을 제거한후, 세포밀도가 1×105내지 5×105/ml가 되도록 펠릿에 배양용액을 첨가하여 세포를 분산시킨다. 세포분산액을 24웰 배양플레이트 또는 96웰 배양플레이트의 각 웰에 분할 주입한후, 5%의 이산화탄소 존재하에 37℃에서 2 내지 4주동안 배양한다. 배양기간중, 배양용액의 절반을 새로운 배양용액으로 교환하는 것이 바람직하다.
(3)항체의 검출
혈청형이 다른 복수의 녹농균과의 반응성을 가지는 항체의 검출은 일반적으로 방사선 면역시험법, 효소면역시험법(Kodansha Publishing Co., Ltd.(1983)에 의해 간행된 "단일 클론항체", P144 등)에 의해 행할 수 있다. 본 발명에서는 효소 면역시험법을 이용한다. 즉, 혈청형이 다른 복수의 녹농균의 0.3% 포르말린 처리균세포 또는 LPSs를 각각 멤브레인 필터에 고정시키고, 용기내에서 세포배양 상청액을 일정시간동안 반응시킨후, 효소가 결합된 토끼의 항-인체항체와 반응시켜서 효소반응에 의한 기질의 착색화 정도에 의해 목적항체의 생성유무와 생성량을 측정하는 도트-면역결합 시험법(이하, DIBA로 약칭한다. Anal. Biochem., 119, 142-147(1982))을 이용한다. 필요에 따라 인체의 면역글로불린형에 특이적이 효소결합항-인체항체를 이용하여 면역글로불린형을 결정할 수 있다.
(4) 클로닝
세포증식 세포집단이 확인된 각 웰의 배양상청액을 전술한 효소결합면역 흡착분석법(이하, ELISA 법으로 약칭한다) 등에 의해 시험하여 목적항체가 존재하는 웰을 선별한다. 이어서, 이 웰내의 세포를 연질 한천법(Soft Science Publishing Co. 에 의해 간행된 "조직배양 응용 연구법", p 289, (1985)등) 또는 제한희석법(Kodansha Publishing Co., Ltd. (1983)에 의해 간행된 "단일 클론항체", p 73, (1983)등)에 의해 클로닝을 행한다. 클로닝에 의해 세포의 성장이 확인된후, 전술한 ELISA에 따라 재차 분석을 행한다. 1 내지 수회의 클로닝에 의해 목적항체를 분비할 수 있는 단일 클론 세포주를 얻을 수 있다.
(5) 형성된 세포주의 배양
방법(4)에 의해 형성된 세포주를 통상의 배지를 사용하여 배양할 수 있다. 예를들면, 전술한 배양용액, 일반적인 저혈청 배지 또는 무혈청 배지를 사용할 수 있다.
(6) 인체 단일 클론항체의 정제
배양용액으로부터 본 발명에 의한 인체 단일 클론항체의 정제는 황산암모늄염석법, 겔여과법, 이온교환수지 크로마토그래피법 등의 비특이적 정제법, 항원 또는 인체 단일 클론항체에 친화성을 가지는 물질(예를들면, 단백질 A, 항-인체 면역글로불린항체 등)에 고정된 담체를 사용하는 친화성 크로마토그래피법과 같은 공지방법을 병행하여 행할 수 있다.
세포융합법에 의한 본 발명의 인체 단일 클론항체의 제조는 공지방법(Plenum Press에 의해 간행된 "단일 클론항체", P 363)에 의해 행할 수 있다.즉, 인체 단일 클로항체(1) 인체항체 생성세포(인체 B세포등)을 제조하고, (2) 무한증식능을 가지는 세포에 인체항체 생성세포를 세포융합하고, (3) 혈청형이 다른 복수의 녹농균과 반응할 수 있는 항체의 분비를 검출하고, (4) 하이브리도마 세포콜로니로부터 단일 세포주를 선별하고, (5) 세포주를 배양한후, (6) 배양액으로부터 인체 단일 클론항체를 정제한다.
(1) 항체생성세포의 제조
세포융합에 사용되는 항체생성세포로서, 전술한 EB 바이러스 형질전환법에서와 같은 항체생성세포를 사용할 수 있다. 또한, 전술한 EB 바이러스 형질전환법에 의해 산출되어 클로닝전에 목적항체를 분비할 수 있는 EB 바이러스 형질전환 세포집단, 또는 클로닝에 의해 산출된 단일한 EB 바이러스 형질전환 세포주를 사용할 수 있다. 또한, 인체항체 생성세포(B세포)를 포크위드미토겐(PWM)을 첨가한 배양용액중에서 수일간 배양하여 항체생성세포를 증식시킴으로써 세포융합을 행할 수 있다.
(2) 세포융합
인체 B세포 하이브리도마를 제조함에 있어서, 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 배양용액(HAT 배지), 또는 하이포크산틴 및 아자세린을 함유하는 배양용액(HA 배지)에 대한 감수성을 가지며 무한증식능을 가진 인체의 골수종, 유사 골수종세포, 림프아세포 또는 유사 림프아세포를 세포융합의 파트너세포로 사용하는 것이 바람직하다. HAT 배지에 민감한 쥐의 골수종세포도 파트너세포로서 사용할 수 있다.
예를들면, 파트너세포인 쥐의 골수종세포, P 3-NS 1/1-Ag 4.1(약칭.NS-1)는 EB 바이러스에 의한 형질전환후 목적항체의 생성이 확인된 웰의 세포 또는 말초혈액 등으로부터 항체생성세포와 약 1 : 1 내지 1 : 10 의 비율로 혼합한다. 세포융합용 배지(50% 폴리에틸렌글리콜 및 10% 디메틸설폭사이드를 함유하는 RPMI 1640 배지 등)를 혼합물에 첨가한후, 공지방법으로 세포를 융합한다. 이어서, 융합된 하이브리도마만의 증식에 적합한 HAT-와바인 배양용액에, 세포밀도가 1×105내지 5×106/ml가 되도록 세포를 분산시킨다. 세포분산액을 24웰 또는 96웰 배양플레이트에 분할주입한 후 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 약 2 내지 약 4주동안 배양한다. 배양기간중, 3 내지 5일마다 HAT-O 배지의 절반을 새로운 HAT-O 배지로 교환하는 것이 바람직하다. 이 경우에, 쥐의 복강침출 세포등이 공급세포로서 공존한다면, 하이브리도마의 중식이 가속화 될 수 있다.
또한, 파트너세포인 인체 림프아세포, MHP-315와, EB 바이러스 형질전환 세포주 또는 말초혈액 등에서 분리된 항체생성세포를 약 1 : 1 내지 1 : 10의 비율로 혼합하고, 전술한 바와 같이 세포융합을 행한후, HA-와바인 배양용액(전술한 HA배지, HA-O 배지보다 와바인을 더 함유하는 배양용액)에 세포를 분산시키고 배양하여 하이브리도마를 제조할 수 있다.
파트너세포로서는 쥐에서 유래된 x63, P3 U1, x63.653, SP 2/0등 및 유체에 유래된 SKO-007, GM 1500 등을 사용할 수 있다.
(3) 항체의 검출
하이브리도마의 명료한 증식이 확인된 웰에 대하여, 전술한 EB 바이러스 형질전환법과 유사한 방식으로 효소 면역시험법에 의해 혈청형이 다른 복수의 녹농균과의 반응성을 나타내는 항체를 검출한다.
(4) 클로닝
EB 바이러스 형질전환법에서 설명한 바와 같이, 클로닝을 반복하여 단일세포주를 산출한다.
(5) 형성된 세포의 배양
상기 EB 바이러스 형질전환법에서 설명한 바와 같이, 적합한 배양용액에 단일세포주를 배양할 수 있다.
(6) 항체의 정제
상기 EB 바이러스 형질전환법에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 인체 단일 클론항체를 배양용액으로부터 정제할 수 있다.
3. 인체 단일 클론항체 제제의 제조
녹농균의 O-항원과 복수적으로 반응하는 인체의 단일 클론항체는 단독으로, 또는 통상 사용되는 첨가제 또는 부형제를 혼합하여 액상제제 또는 동결건조 제제로서 사용할 수 있다. 실제의 녹농균 감염증의 예방 및 치료시에, 본 발명의 인체 단일 클론항체는 단독으로 또는 2종 이상의 단일 클론항체의 혼합물 상태로 사용할 수 있으며, 인체 단일 클론항체는 녹농균에 대한 다른 인체 단일 클론항체 및/또는 인체 면역글로불린 제제와의 혼합물 상태로 사용할 수도 있다. 특히, 혼합제제를 제조하는 경우에, 본 항체를 사용함으로써 항체의 감염억제 범위를 확대시킬 수 있기 때문에, 혼합할 인체 단일 클론항체 종류의 수를 감소시킬 수 있다.
본 발명에 의한 인체 단일 클론항체의 용량 및 투여경로는 적당히 선택할 수 있으나, 용량은 체중 1kg당 0.01 내지 10mg이 바람직하며, 투여경로는 피내, 피하, 근육내, 정맥내 투여등이 가능하다.
4. 실시예
이하 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하였다.
실시예 1: EB 바이러스 형질전환법에 의한 인체 단일 클론항체의 제조
(1) 항원의 제조
일본국 녹농균 연구회 형별검토위원회의 혈청형별 분류법(A형 내지 M형)에 따라 하기의 표 1에 도시한 숙주로부터 항체분석에 사용되는 균세포 및 LPS를 제조하였다.
[표 1]
Figure kpo00002
* 표 1에 예시한 A형 내지 M형에 속하는 녹농균의 균주중, ( )내의 ATCC 균주와 IID균주는 각각 미합중국 모식균 배양수집소(American Type culture Collection)와 동경대학의학과 연구소에 보존되어 있으며 제3자에 자유롭게 분양된다.
각 녹농균 균주를 37℃의 영양한천배지(니슈 파마슈티칼 코오포레이숀, 리미티드)중에서 하룻밤동안 배양하였다. 증식된 세포집단을 수집하고 생기식염액에 현탁하여 세포현탁액을 제조하였다. 0.5ml의 세포현탁액을 플라스크당 150ml의 Homma 등의 합성배지[Tanamoto등, J.Biochem., 83, 711-718(1987)가 담긴 sakaguti 플라스크에 접종한후, 37℃에서 16시간동안 진탕 배양하였다. 배양후, 최종농도가 0.3%가 되도록 포르말린을 플라스크에 첨가하고, 실온에서 1시간동안 방치하였다. 최종적으로 원심분리(12,000×g, 30분)에 의해 세포를 수집하였다. 생리식염액과 증류수 순서로 세정한후, 세포를 동결건조하여 포르말린 처리 건조세포를 얻었다. 각 혈청형 녹농균 LPS는 동결건조전에 20g의 포르말린 처리습윤 세포를 출발물질로 하여 고온페놀추출법["면역실험조작법", P 2037, 일본 면역학회편(1987)]에 따라 정제하여 산출하였다. 각 혈청형의 녹농균의 포르말린 처리세포로부터의 LPSs 수율(건조중량)은 25 내지 75mg이었다.
(2) EB 바이러스 용액의 제조
EB 바이러스를 생성 방출하는 B 95-8 세포를 밀도가 3×105/ml가 되도록 20% FCS(이하, 경우에 따라서 배양용액으로 약칭한다)를 함유하는 RPMI 1640 배지에 현탁한 후, 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 정지 배양시켰다. 정지상태로 약 7일간 경과한 후 배양상청액을 원심분리(800×g,10분)에 의해 수집하였다. 기공크기가 0.45마이크론인 멤브레인 필터(millipore)를 통해 여과시킨 후, 여액을 형질전환 실험용 EB 바이러스 용액으로 사용하였다.
(3) 인체항체 생성세포(림프구)의 제조
건강한 사람으로 부터 채취한 헤파린처리 말초혈액 50ml에 동량의 RPMI 1640 배지를 첨가한 후 2배로 희석하였다. 이어서, 희석액의 절반을 Ficoll-Paque(Phamacia)상에서 희석하여 계면이 교란되지 않도록 한후, 실온에서 원심분리(400×g, 30분)하였다. 원심분리 후, 계면층을 패스터피펫을 사용하여 취출하고 동량의 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 원심분리(250×g, 10분)하였다. 침전된 세포를 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지에 현탁하였다. 원심분리 조작을 1회 더 반복하여 인체항체 생성세포(림프구)의 펠릿(세포수 : 5×107)을 산출하였다.
(4) EB 비루스에 의한 형질전환
인체항체 생성세포 5×107개에 (2)에서 제조한 비루스용액 50ml를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양후, 원심분리(250×g, 10분)에 의해 세포를 수집하였다. 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지에 세포를 분산시켰다. 밀도를 5×105/ml로 조절한 후, 96웰 평저 배양플레이트에 현탁액을 0.1ml씩 첨가하고 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 정지배양하였다. 4일후, 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지 0.1ml를 배양용액에 첨가한 후, 4 또는 5일 마다 배양용액의 절반을 새로운 배양용액으로 교환하였다. (5)에 예시한 항체검출방법에 의해 녹농균과의 반응성이 확인된 웰의 세포를 24웰 배양플레이트에서 확대 배양하였다.
(5) 항체의 검출
세포증식이 확인된 웰에 대하여, 효소 면역용 매분석법으로 분류된 DIBA법에 의해 배양상청액중 녹농균에 대한 인체 단일 클론항체의 존재여부를 측정하였다. 96웰 평저 배양플레이트의 배양상청액의 경우는 각 웰의 배양상청액 0.1ml를 96웰 U형 바닥의 멀티플레이트중에서 13개 혈청형 녹농균의 포르말린 처리된 각 건조세포의 도트당 0.4μg의 혼합물이 고정된 그리드-프린티드 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터(3.1㎟)와 반응시켰다. 24웰 배양플레이트의 배양상청액의 경우는 각 웰의 배양상청액 0.2ml를 48웰 배양플레이트중에서 A형 내지 F형의 6종과 G형 내지 M형의 7종의 녹농균으로부터의 포르말린 처리 건조세포가 서로 다른 위치에 고정된 그리드-프린티드 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터(6.2mm×9.3mm)와 반응시켰다. 실온에서 2시간 반응한 후 페록시다제 표식된 토끼의 항-인체 면역글로블린(DAKO)과 2시간동안 반응시키고, 기질로서 4-클로로-1-나프톨을 사용하여 발색시켰다. 육안관찰에 의해 항원이 고정된 니트로셀룰로오스 멤브레인상에 발색이 확인된 경우를 항체산성이 양성이라고 판정하였다.
(6) 클로닝
항체 검출법에 의해 혈청형이 다른 복수의 녹농균과의 반응성이 확인된 웰의 세포를 6cm디쉬에 옮겼다. 6cm디쉬에서 증식된 세포를 연질한천법에 의해 클로닝하였다. 우선, 혈구계산기를 사용하여 정확한 세포의 수를 측정한 후, 밀도가 1×106/ml가 되도록 세포현탁액을 제조하고 세포현탁액 0.1ml를 0.3% 아가로스(SeaPlaque agarose, FMC)를 함유하는 배양용액 30ml에 첨가한 후, 이들을 혼합하였다. 이어서, 세포와 0.3% 아가로스를 함유하는 배양용액 3ml를 0.5% 아가로스를 함유하는 배양용액 4ml를 미리분할 주입하여 고화시킨 6cm디쉬에 분할 주입하여 고화시켰다(각 웰당 10디쉬). 세포가 분할 주입된 6cm디쉬를 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 정지배양하였다. 3 내지 5주후, 세포를 연질한천중에서 증식하여 세포 콜로니가 육안으로 인지되었으며, 이 단계에서 각 세포집단을 배양용액이 웰당 0.1ml분할 주입된 96웰 평저 배양 플레이트의 각 웰 패스터피펫을 사용하여 옮긴 후 배양하였다. 2일 후, 0.1ml의 배양용액을 첨가하고, 다시 2일후, 세포증식이 확인된 웰에 대하여 배양상청액중의 녹농균에 대한 인체 단일 클론항체의 존재여부를 DIBA법으로 측정하였다. 항체 생성이 양성으로 판단된 웰의 세포는 24웰 배양플레이트에서 확대 배양하였다. 3일후, 24웰 배양플레이트의 웰에 대하여, 배양상청액중의 녹농균에 대한 인체 단일 클론항체의 존재여부를 DIBA법으로 측정하였다. 전술한 조작을 반복한 후, 복수의 혈청형의 녹농균과 반응할 수 있는 항체를 생성한다고 판단되는 웰의 세포에 대하여 클로닝을 행하였다.
이렇게함으로써, 일본 복농균연구회의 형별검토위원회의 혈청형별 분류중 I형과 D형의 혈청형에 대한 교차반응성을 가지는 인체 단일 클론항체 HPs 1(IgM)을 생성할 수 있는 EB 바이러스 형질전환 세포주 MP 5035 및 일본 녹농균연구회의 형별검토위원회의 혈청형별 분류중 E형과 E형의 F혈청형에 대한 교차반응성을 가지는 인체 단일 클론항체 HPs 2(IgM)을 생성할 수 있는 EB 비루스 형질전환 세포주 MP 5038을 얻었다. MP 5035 및 MP 5038은 일본국 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 FERM BP-1598 및 FERM BP-1596으로 기탁되었다(1988.8.12일자, 한국과학기술원에 KCTC 8396 P 및 8397 P호로 수탁).
(7) 세포주의 배양 및 항체의 정제
인체 단일 클론항체 HPs 1 및 HPs 2를 생성할 수 있는 2종의 EB 바이러스 형질전환 세포주를 각각 플리스크(바닥면적 175㎠)를 사용하여 0.5% 소혈청 알부민(이하, BSA로 약칭한다)를 함유하는 RITC 55-9배지[Exp.Cell Res., 138, 127-134(1982)]중에서 배양하였다. 배양물을 원심분리(400×g,30분)하여 상청액을 취하고, 50% 황산암모늄 침전법과 Sephacryl S-300(Pharmacia) 컬럼을 사용하는 분획법에 의해 항체를 정제하였다. HPs 1을 생성하는 EB 비루스 형질전환 세포주를 배양하여 취득한 배양용액 250ml로부터, IgM 분획 2.5mg을 얻었고, HPs 2를 생성하는 EB 바이러스 형질전환 세포주를 배양하여 취득한 배양용액 2ℓ로부터 IgM 분획 76mg을 얻었다.
[실시예 2]
[EB 바이러스 형질전환법에 의한 인체 단일 클론항체의 제조 Ⅱ]
EB 바이러스에 의한 형질전환은 녹농균이 감염된 환자로부터 채취한 말초혈액을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 같이 실시하였다. 인체항체 생성세포의 펠릿(세포수 : 1.4×107)을 헤파린 처리 말초혈액 25ml로부터 얻었다. 연질한천 클로닝을 2회 행하여 일본국 녹농균 연구회 형별검토위원회의 혈청형별 분류중 A형과 L형의 혈청형에 대해 교차반응성을 가지는 인체 단일 클론항체 HPs 4(IgM)을 생성하는 EB 바이러스 형질전환 세포주 MP 4091과 일본국 녹농균연구회 형별검토위원회의 혈청형별 분류중 G형과 H형의 혈청형에 대해 교반반응성을 가지는 인체 단일 클론항체 HPs 5(IgM)을 생성하는 EB 바이러스 형질전환 세포주 MP 5050을 산출하였다. MP 5050은 일본국 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 FERM BP-1600로 기탁하였다(1988.8.12자, 한국과학기술원에 KCTC 8398 P호로 수탁).
실시예 1(7)에서와 동일한 세포를 배양하였다. HPs 4를 생성하는 EB 바이러스 형질전환 세포주 MP 4091을배양하여 취득한 배양용액 250ml로부터 IgM 분획 2.5mg을 얻었다. HPs 5를 생성하는 EB 바이러스 형질전환 세포주 MP 5050을 배양하여 취득한 배양용액 450ml로부터 IgM 분획 8.6mg을 얻었다.
[실시예 3]
[EB 바이러스 형질전환법에 의한 인체 단일 클론항체의 제조 Ⅲ]
다른 건강한 사람으로부터 채취한 말초혈액을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 같이 EB 바이러스에 의한 형질전환을 실시하였다. 인체항체 생성세포의 펠릿(세포수 : 2.8×107)을 헤파린 처리 말초혈액 25ml로부터 얻었다. 연질한천 클로닝을 2회 행하여 일본국 녹농균 연구회 형별검토위원회의 혈청형별 분류중 A형 및 F형의 혈청형에 대해 교차반응성을 가지는 인체 단일 클론항체 HPs 7(IgM)을 생성하는 EB 바이러스 형질전환 세포주 MP 5046을 산출하였다. MP 5046은 일본국 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 FERM BP-1599로 기탁되었다(1988.8.12자, 한국과학기술원에 KCTC 8399 P호로 수탁).
실시예 1(7)에서와 동일하게 세포를 배양하였다. HPs 7을 생성하는 EB 바이러스 형질전환 세포주 MP 5046을 배양하여 취득한 배양용액 300ml로 부터 IgM분획 4.1mg을 얻었다.
[실시예 4]
[하이브리도마법에 의한 인체 단일 클론항체의 제조]
(1) 인체항체 생성세포(B세포)의 제조
실시예 1(3)에서와 같이, 건강한 사람으로부터 채취한 헤파린 처리 말초혈액 50ml로부터 인체항체 생성세포의 펠릿(세포수 : 4.6×107)을 얻었다. 펠릿에 실시예 1(2)에서 제조한 비루스용액 46ml를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양후, 배양용액을 원심분리(250×g,10분)에 의해 수집한 세포에 첨가하여 세포밀도가 1×105/ml가 되도록 현탁하였다. 현탁액을 2개의 플라스크(바닥면적 : 175㎠)에 분할 주입한 후 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 정지배양하였다. 5일후, 각 배양용액 50ml를 첨가하고, 다시 5일이 경화한후, 원심분리에 의해 세포를 수집하였다.
(2) 세포융합
EB 바이러스 형질전환 세포와 쥐의 골수종 세포주 NS-1을 RPMI 1640 배지로 각각 세정하였다. 50ml들이 플라스틱제 원심분리 튜브내에서 1.3×108개의 EB 바이러스 형질전환 세포와 1.3×108개의 쥐의 골수종 세포를 서로 혼합시켰다. 혼합된 세포를 원심분리(175×g,10분)하였다. 상청액을 버리고 약하게 진동시켜서 세포를 유리시켰다. 세포를 함유하는 원심분리 튜브에 50% 폴리에틸렌 글리콜(M.W.1500,Wako Junyaku) 및 10% 디메틸설폭사이드를 보충한 RPMI 1640 배지 0.5ml를 서서히 첨가하였다. 원심분리 튜브를 서서히 회전시키면서, 세포를 융합시켰다. 2분후, RPMI 1640 배지 10ml를 첨가하였다. 서서히 교반한후, 원심분리(175×g,10분)을 행하였다. 원심분리후, 상청액은 버리고 2×10-4M 히포크산틴, 0.176μg/ml의 아미노 프테린, 13μg/ml의 티미딘, 5μM의 와바인 및 20% FCS를 함유하는 RPMI 1640배지(이하, HAT-O 배양용액으로 약칭한다)를 첨가하여 밀도가 1×106/ml인 세포현탁액을 제조하였다. 웰당 0.1ml의 현탁액을 96웰 평저 배양플레이트에 주입한후 5%의 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 정지배양하였다. 4일후, 0.1ml의 HAT-O 배양용액을 첨가하고, 4 내지 5일 마다 배양용액의 절반을 새로운 HAT-O배양용액과 교환하였다.
(3) 항체의 검출
세포증식이 확인된 웰에 대하여, 배양상청액중 녹농균에 대한 인체 단일 클론항체의 존재여부를 실시예 1(5)에서와 같이 DIBA법으로 측정하였다. 96웰 평저 배양플레이트중의 배양상청액 0.1ml를 RPMI 1640 배지로 2배 희석하여 48웰 배양플레이트내에서 A형 내지 F형의 6종과 G형 내지 M형의 7종의 녹농균의 포르말린 처리건조세포가 다른 위치에 고정된 2매의 그리드프린티드 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터(6.2mm×9.3mm)와 반응시켰다.
(4) 클로닝
3% 글리코겐(Tokyo Kasei Kogyo)을 함유하는 인산염 완충염수(이하, PBS로 약칭한다)를 쥐(Balb/c)에 미리 복강투여하고, 4일후에 복강내 침출세포를 수집하여 1×105/ml 밀도의 세포현탁액 을 제조한후, 각 웰당 0.1ml의 세포현탁액이 분할주입된 96웰 평저배양 플레이트를 제조하였다. 이어서, 항체검출법에 의해 복수의 혈청형의 녹농균에 대한 반응성이 확인된 웰의 세포를 각각 수집하였다. 혈구계산기를 사용하여 정확한 세포수를 계산하고 HAT-O 배양용액에 분산시켜서 20/ml 및 200/ml의 세포현탁액을 제조하였다. 전술한 쥐의 복강내 침출세포가 분할 주입된 96웰 평저 배양플레이트의 각웰의 상청액을 제거하고, 0.1ml씩 첨가한 후 5%의 이산화탄소 존재하에 37℃에서 정지배양하였다. 4일후, 0.1ml의 HAT-O 배양용액을 첨가하고, 4 내지 5일 마다 배양용액의 절반을 새로운 HAT-O 배양용액으로 교환하였다. 7 내지 14일후 세포증식이 확인된 웰에 대하여, 배양 상청액중 녹농균에 대한 인체 단일 클론항체의 존재여부를 DIBA법에 의해 측정하였다. 복수의 혈청형의 녹농균과 반응할 수 있는 항체를 생성하는 것으로 판정된 웰의 세포에 대해서는 전술한 조작을 반복하여 클로닝을 행하였다. 이렇게함으로써, 일본국 녹농균연구회 형별검토위원회의 혈청형별 분류중 D형 및 I형에 대해 교차반응성을 가지는인체 단일 클론항체 HPs 6(IgM)를 생성하는 하이브리도마 세포주 MP 4092를 얻었다.
(5) 세포주의 배양과 항체의 정제
96웰 평저 배양플레이트에서 충분히 증식된 하이브리도마 세포를 점차적으로 확대 배양하고, 1ι의 교반기내에서 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지 500mι를 사용하여 배양을 행하였다. 배양용액을 원심분리(400×g,30분)하여 상청액을 취하여, 50% 황산암모늄 염석법과 Protein A-Sepharose 4B(Pharmacia)칼럼을 사용하는 분획법에 의해 정제하여 IgG 5mg을 얻었다.
[실시예 5]
[하이브리도마에 의한 인체 단일 클론항체의 제조 Ⅱ]
(1) 2-아미노에틸 이소티오우로늄 히드로브로마이드(이하, AET로 약칭한다)-처럼 염소적혈구 세포의 제조
50ml들이 플라스틱제 원심분리 튜브에 염소적혈구 세포(Nihon Biotest Laboratory 이하, SRBC로 약칭한다)의 현탁액 5ml을 주입하고, 젤라틴 베로날 완충액(이하, GVB로 약칭한다) 20ml를 첨가하였다. 충분히 교반한 후, 혼합물을 원심분리(1,600×10분)하였다. 상청액을 흡인제거하고, 침전된 SRBD를 GVB 20ml에 현탁하였다. 원심분리 조작을 3회 더 반복하였다. 얻어진 약 1ml의 SRBC 펠릿에 4ml의 0.143MAET 수용액을 첨가하여 펠릿을 현탁하였다. 때때로 교반하면서, 현탁액을 37℃에서 15분동안 반응시켰다. 반응 종료직후, 반응혼합물에 빙냉 GVB 20ml를 첨가하였다. 충분히 교반한후, 원심분리(1,600×g,10분)를 행하였다. 상청액을 흡인제거하고 침전물은 GVB 20ml에 현탁하였다. 원심분리 조작을 3회 더 반복하였다. AET-처리 SRBC를 2×108/ml의 밀도로 GVB에 현탁하고 사용할때까지 빙냉하에 보관하였다.
(2) 인체항체 생성세포(B세포)의 제조
교통사고로 병원에 입원하여 외상치료후 약 3개월이 경과하여 녹농균에 대한 면역가가 높은 건강한 사람으로부터 채취한 헤파린 처리 말초혈액 25ml를 동량의 모노-폴리 용해배지(Flow)상에서 계면이 교란되지 않도록 중층 시킨 후 실온에서 원심분리(350×g,30분)하였다. 원심분리후, 계면층 부분의 세포함유액을 패스터 피펫을 사용하여 취출하고, 이것에 동량의 20% FCS-함유 RPMI 1640배지를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 원심분리(350×g, 10분)하였다. 침전된 세포를 다시 20% FCS-함유 RPMI 1640배지에 현탁하였다. 원심분리 조작을 1회 더 반복하여 인체림프 구획분의 펠릿(세포수 : 5×107)를 얻었다.
이어서, 얻어진 인체림프 구분획을 4ml의 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지에 현탁하여 밀도가 5×106/ml인 현탁액을 제조하였다. 50ml들이 8개의 플라스틱제 원심분리 튜브에 각각 0.5ml의 현탁액을 분할 주입하고, 각 원심분리 튜브에(1)에서 제조한 AET-처리 SRBC 현탁액 1ml를 첨가하였다. 충분히 교반한 후, 혼합물을 원심분리(20×g, 2분)하였다. 원심분리후, 4℃에서 2시간 정치시켜서 로셋형성 반응을 행하였다. 반응종료후, 1.5ml의 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지를 첨가하고 패스터 피펫을 사용하여 펠릿을 서서히 파괴하였다. 로셋이 형성된 세포현탁액을 수집하고, 50ml들이 플라스틱제 원심분리 튜브에 주입된 20ml의 모노폴리용해 배지상에 계면이 교란되지 않도록 중층시킨 후 원심분리(350×g,30분)하였다. 원심분리후, 계면층의 세포함유 액체를 패스터 피렛를 사용하여 분취한후, 이것에 동량의 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지를 첨가하였다. 원심분리 조작을 2회 더 반복하여 인체항체 생성세포(B세포)의 펠릿(세포수 : 1.0×107)을 얻었다.
인체항체 생성세포(B세포)의 펠릿을 20ml의 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지에 현탁하였다. 현탁액의 밀도가 5×105/ml가 되도록 하였다. 이 현탁액에 1/200 용량의 포크위드 미토겐(PWM)(Gibco)를 첨가하였다. 혼합물을 플라스크(바닥면적 75㎠)에 주입한 후, 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에 6일동안 정지배양하였다.
(3) 세포 융합
쥐(Bald/c)에 PBS 함유 2.5% 글리코겐을 마리당 0.5ml씩 복강내 투여하고 4일후 복강내 침출세포를 수집하였다. 별도로 제조한 쥐의 비장세포와 함께 상기 세포를 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지에 현탁하여 각각 밀도가 5×105/ml 및 1×106/ml인 세포현탁액을 제조하였다. 각 웰당 0.1ml의 각 세포현탁액이 분할 주입된 96웰 평저 배양플레이트(이하, 공급플레이트로 약칭한다)를 제조하였다.
PWM-처리 인체항체 생성세포(B세포)와 인체림프 아구상 세포 MHP-315를 각각 RPMI 1640배지로 세정하였다. 50ml들이 플라스틱제 원심분리 튜브에서 5×107개의 인체항체 생성세포(B세포)와 동수의 인체림프 아구상세포를 서로 혼합시켰다. 혼합된 세포를 원심분리(175×g,10분)하였다. 상청액을 제거하고 세포는 FCS가 제거된 RPMI 1640배지에 현탁하였다. 원심분리 조작을 2회 더 반복하였다. 원심분리후, 패스터 피펫을 사용하여 가능한한 많은 상청액을 제거하여 세포 펠릿을 제조하였다. 펠릿을 서서히 진동시켜서, 세포를 약간 유리시켰다. 이어서, 이것에 0.3ml의 융합시약(50% 폴리에틸렌 글리콜 4000과 10% 디메틸설폭사이드를 함유하는 PBS용액)을 첨가하였다. 원심분리 튜브를 90초 동안 서서히 회전시켰다. 90초후, 20ml의 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지를 서서히 첨가하였다. 2분이 더 경과한후, 상기 배지 20ml를 첨가하여 세포를 서서히 분산시켰다. 세포 융합후에 원심분리(175×g,10분)에 의해 세포를 펠릿화하였다. 펠릿을 20% FCS-함유 RPMI 1640배지에 분산시켜서 밀도를 1×106/ml로 조절하였다. 공급플레이트의 각 웰의 상청액을 제거한후, 각 웰당 0.1ml의 세포분산액을 첨가하여 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 정지 배양하였다.
24시간후, 4×10-4M의 히포크산틴, 2μg/ml의 아자세린 및 10μM의 와바인을 함유하는 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지를 각 웰당 0.1ml씩 첨가하였다. 이어서, 3 내지 4일 마다 배양용액의 절반을 2×10-4M의 히포크산틴, 1μg/ml의 아자세린 및 5μM의 와바인을 함유하는 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지(이하, HA-O 배양용액으로 약칭한다)로 교환하였다.
(4) 항체의 검출
약 4 내지 5주후, 세포증식이 확인된 웰에 대하여, 배양상청액중 녹농균에 대한 인체 단일 클론항체의 존재여부를 실시예 1(5)에서와 같이 DIBA법으로 측정하였다.
(5) 클로닝
항체 검출법에 의해 복수의 혈청형의 녹농균에 대한 반응성이 확인된 웰의 세포를 각각 수집하였다. 혈구 계산기를 사용하여 정확한 세포의 수를 계산하고 HA-O 배양용액에 분산하여 20개 세포수/ml 및 200개 세포수/ml의 세포 현탁액을 제조하였다. 전술한 공급플레이트의 각 웰의 상청액을 제조한후, 0.1ml씩을 첨가하여 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 정지배양하였다. 4일후, 0.1ml의 HA-O 배양용액을 첨가하고, 3 내지 4일마다 배양용액의 절반을 새로운 HA-O 배양용액과 교환하였다. 약 2 내지 4주후 세포증식이 확인된 웰에 대하여, 배양상청액중 녹농균에 대한 인체 단일 클론항체의 존재여부를 DIBA법에 의해 측정하였다. 복수의 헐청형의 녹농균에 대한 반응성을 가지는 항체를 생산한다고 판정된 세포는 전술한 조작을 반복하여 클로닝을 행하였다. 이렇게 함으로써, 일본국 녹농균 연구회 형별검토위원회의 혈청형별 분류중 E형 및 F형에 대해 각각 교차반응성을 가지는 인체 단일 클론항체 HPs 8(IgM)을 생성하는 하이브리도마 세포주MP 4095를 얻었다. MP 4095는 일본국 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 FERM P-9750으로 기탁하였다.
(6)세포주의 배양과 항체의 정제
96웰 평저 배양플레이트에서 충분히 증식된 하이브리도마 세포주 MP 4095를 점차적으로 확대배양하고, 200ml의 NYSF 404 무혈청배지[Yabe, Tissue Culture, 11, 458(1985)]를 사용하여 4개의 플라스크(바닥면적 175㎠)에서 배양하였다. 배양물을 원심분리(400×g,20분)하여 상청액 190ml를 얻었다. 공극경이 0.22μ인 멤브레인 필터를 통해 상청액을 여과하였다. 여액은 0.025M 인산염 완충액(pH 6.8)으로 완충시킨 Mono Q칼럼(Pharmacia)에 2ml/min의 유속으로 흡착시켰다. 흡착후, 동량의 상기 환충액과 0.3 M 인산염 완충액(pH 6.5)과의 혼합물로 칼럼을 세정하였다. 세정후, IgM 분획을 0.3 M 인산염 완충액 (pH 6.5)로 용출하였다. 배양 상청액 190ml로 부터, IgM 항체 1mg을 얻었다.
[실시예 6]
[하이브리도마법에 의한 인체 단일 클론항체의 제조 Ⅲ]
(1) 인체항체 생성세포의 제조
인체항체 생성세포로서는 실시예 1에서 산출한 인체 단일 클론항체 HPs 1(IgM)을 생성하며, 일본국 녹농균연구회 형별검토위원회의 혈청형별 분류중 I형 및 D형에 대해 교차반응성을가지는 EB 바이러스 형질전환 세포주 HPs 1(IgM)을 사용하였다. MP 5035는 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지를 사용하여 플라스크(바닥면적 175㎠)에서 배양하였다. 대수증식기의 세포를 원심분리에 의해 수집하여 하이브리도마의 제조에 사용하였다.
(2) 세포융합
형질변환 세포주 MP 5035 및 인체림프 아구상세포주 MHP-315를 FCS가 제거된 RPMI 1640 배지로 각각 세정하였다. 50ml들이 플라스틱제 원심분리 튜브에서 1.3×108개의 형질전환 세포와 동수의 인체림프 아구상 세포를 서로 혼합하였다. 혼합된 세포를 원심분리(175×g,10분)하였다. 상청액을 제거하고 침전된 세포를 FCS가 제거된 RPMI 1640 배지에 현탁하였다. 원심분리조작을 2회 더 반복하였다. 원심분리후, 패스터 피팻을 사용하여 가능한한 많은 상청액을 제거하여 세포펠릿을 제조하였다. 팰릿을 서서히 진동시켜서 세포를 약간 유리하였다. 이것에 융합시약(50% 폴리에틸렌 글리콜을 400과 10% 디메틸설폭사이드를 함유하는 PBS) 0.3ml를 첨가하였다. 원심분리튜브를 실온에서 90초 동안 서서히 회전시켰다. 90초후, 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지 20ml를 서서히 첨가하였다. 2분이 더 경과한후, 상기 배지 20ml를 첨가하여 세포를 서서히 분산시켰다. 세포융합후, 원심분리(175×g,10분)에 의해 세포를 펠릿화하였다. 펠릿을 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지에 분산시킨후 밀도를 1×106개/ml로 조절하였다. 공급플레이트의 각 웰의 상청액을 제거한후, 각 웰당 0.1ml의 세포현탁액을 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 정지배양하였다.
24시간후, 4×10-4M의 히포크산틴, 2μg/ml의 아자세린 및 10μM 와바인을 함유하는 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지를 각 웰당 0.1ml씩 첨가하다. 이어서, 3 내지 4일마다 배양용액의 절반을 2×10-4M의 히포크산틴, 1μg/ml의 아자세린 및 5μM의 와바인을 함유하는 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지(HA-O 배양용액)으로 교환하였다.
(3) 항체의 검출
약 4 내지 5주후 세포증식이 확인된 세포에 대하여, 배양상청액중 녹농균에 대한 인체 단일 클론항체의 존재여부를 실시예 1(5)에서와 같이 DIBA법으로 측정하였다.
(4) 클로닝
항체검출법에 의해 D형 및 I형의 혈청형의 녹농균에 대한 반응성을 가지는 항체의 존재가 확인된 웰의 세포를 각각 수집하였다. 혈구계산기를 사용하여 정확한 세포의 수를 계산하고 HA-O 배양용액에 분산시켜서 20개 세포수/ml 및 200개 세포수/ml의 세포분산액을 제조하였다. 공급플레이트(각 플레이트)의 각 웰의 상청액을 제거한후, 각 웰당 0.1ml씩을 접종하여 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 정지배양하였다. 4일후, 0.1ml의 HA-O 배양용액을 첨가하고, 3 내지 4일마다 배양용액의 절반을 새로운 HA-O 배양용액으로 교환하였다. 2 내지 4주후 세포증식이 확인된 웰에 대하여, 배양상청액중 녹농균에 대한 인체 단일 클론항체의 존재여부를 DIBA법에 의해 측정하엿다. D형과 I형의 형청형 녹농균에 대한 반응성을 가지는 항체를 생성한다고 판단된 세포는 전술한 조작을 반복하여 클로닝를 하였다. 이렇게 2회 클로닝 함으로써, 일본국 녹농균연구회 형별검토위원회의 혈청형별 분류중 E형과 F형에 대해 교차반응성을 가지는 인체 단일 클론항체 HPs 9(IgM)을생성하는 하이브리도마 세포주 MP 5082를 얻었다. 96웰 평저 배양플레이트에서 충분히 증식된 세포는 점차적으로 확대배양하였다.MP 5082는 일본국 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 FERM P-9745로 기탁하였다.
(5) 세포주의 배양 및 항체의 정제
하이브리도마 세포주 MP 5082는 세포밀도가 3×105/ml인 NYSF 404 무혈청 배지 200ml에 현탁하였다. 현탁액을 4개의 플라스크(바닥면적 175㎠)에 분할주입 한후 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 정지배양하였다. 배양개시 4일후에 배양용액을 원심분리(400×g,20분)하여 상청액 190ml를 얻었다. 배양상청액으로부터, 실시예 5(6)에서와 같이 Mono Q칼럼에 의해 항체를 정제하였다. 배양상청액 190ml로 부터, 1.7mg의 IgM 항체를 얻었다.
[실시예 7]
[하이브리도마법에 의한 인체 단일 클론항체의 제조 Ⅳ]
인체항체 생성세포로서, 인체 단일 클론항체 HPs 2(IgM)을 생성하고 일본국 녹농균연구회 형별검토위원회의 혈청형별 분류중 E형과 F형에 대한 교차반응성을 가지는 실시예 1에서 수립된 EB 바이러스 형질전환 세포주 MP 5038을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 6에서와 같이 인체항체 생성세포와 인체에서 유래된 림프 아상구 세포주 MHP-315와의 세포융합을 행하였다. 우선, MP 5038을 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지를 사용하여 플라스크(바닥면적 175㎠)에 배양하였다. 원심분리법에 의해 대수증식기의 세포를 수집하여 하이브리도마를 생성하는데 사용하였다. 1.0×108개의 EB 바이러스 형질전환 세포와 동수의 인체림프 아상구세포와의 세포융합을 행한후, 실시예 6에서와 같이 클로닝을 행하였다. 이렇게 함으로써, 일본국 녹농균연구회 형별검토 위원회의 혈청형 분류중 E형과 F형에 대한 교차반응성을 가지는 인체 단일 클론항체 HPs 10(IgM)을 생성하는 하이브리도마 세포주 MP 5064를 얻었다. MP 5064는 일본국 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 FERM P-9751로 기탁되었다. 하이브리도마 세포주 MP 5064는 3×105/ml의 밀도로 NYSF 404 무혈청 배지 350ml에 현탁하였다.
현탁액을 7개의 플라스크(바닥면적 : 175㎠)에 분할주입한후 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 정지배양하였다. 배양개시 4일후, 배양용액을 원심분리(400×g, 20분)하여 상청액 330ml를 얻었다. 배양상청액으로부터, 실시예 5(6)에서와 같이 Mono Q 칼럼에 의해 헝체를 정제하였다. 배양상청액 300ml로부터, 7.7mg의 IgM을 얻었다.
[실시예 8]
[하이브리도마법에 의한 인체 단일 클론항체의 제조 Ⅴ]
인체항체 생성세포로서, 인체 단일 클론항체 HPs 5(IgM)을 생성하고 일본국 녹농균연구회 형별검토위원회의 혈청형별 분류중 G형과 H형에 대한 교차반응성을 가지는 실시예 2에서 수립된 EB 바이러스 형질전환 세포주 MP 5050을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 6에서와 같이 인체항체 생성세포와 인체에서 유래된 림프아 세포주 MHP-315와의 세포융합을 행하였다. 우선, MP 5050을 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지를 사용하여 플라스크(바닥면적 175㎠)에 배양하였다. 원심분리법에 의해 대수증식기의 세포를 수집하여 하이브리도마를 생성하는데 사용하였다. 1.3×108개의 EB 바이러스 형질전환 세포와 동수의 인체림프 아세포와의 융합을 행한후, 실시예 6에서와 같이 클로닝을 행하였다.
이렇게함으로써, 일본국 녹농균연구회 형별검토위원회의 혈청형 분류중 G형과 H형에 대한 교차반응성을 가지는 인체 단일 클론항체 HPs 11(IgM)을 생성하는 하이브리도마 세포주 MP 5104를 얻었다.
MP 5104는 일본국 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 FERM P-9753으로 기탁되었다. 하이브리도마 세포주 MP 5104는 3×105/ml의 밀도로 NYSF 404 무혈청 배지 500ml에 현탁하였다. 현탁액을 10개의 플라스크(바닥면적 : 175㎠)에 분할주입한후 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 정지배양하였다. 배양개시 4일후, 배양용액을 원심분리(400×g, 20분)하여 상청액 470ml를 얻었다. 배양상청액으로부터, 실시예 5(6)에서와 같이 Mono Q칼럼에 의해 항체를 정제하였다. 배양상청액 450ml로부터, 9.8mg의 IgM항체를 얻었다.
[실시예 9]
[하이브리도마법에 의한 인체 단일 클론항체의 제조 Ⅵ]
인체항체 생성세포로서, 인체 단일 클론항체 HPs 7(IgM)을 생성하고 일본국 녹농균연구회 형별검토위원회의 혈청형별 분류중 A형과 F형에 대한 교차반응성을 가지는 실시예 3에서 수립된 EB 바이러스 형질전환 세포주 MP 5046을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 6에서와 같이 인체항체 생성세포와 인체에서 유래된 림프아 세포주 MHP-315와의 세포융합을 행하였다. 우선, MP 5046을 20% FCS-함유 RPMI 1640 배지를 사용하여 플라스크(바닥면적 175㎠)에 배양하였다. 원심분리법에 의해 대수증식기의 세포를 수집하여 하이브리도마를 생성하는데 사용하였다.
1.3×108개의 EB 바이러스 형질전환 세포와 동수의 인체림프아세포와의 융합을 행한후, 실시예 6에서와 같이 클로닝을 행하였다. 이렇게함으로써, 일본국 녹농균 연구회 형별검토위원회의 혈청형 분류중 A형과 F형에 대한 교차반응성을 가지는 인체 단일클론항체 HPs 12(IgM)을 생성하는 하이브리도마 세포주 MP 5075를 얻었다. MP 5075는 일본국 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 FERM P-9752로 기탁되었다. 하이브리도마 세포주 MP 5075는 3×105/ml의 밀도로 NYSF 404 무혈청 배지 550ml에 현탁하였다. 현탁액을 11개의 플라스크(바닥면적 : 175㎠)에 분할주입한후 5% 이산화탄소의 존재하에 37℃에서 정지배양하였다. 배양개시 4일후, 배양용액을 원심분리(400×g, 20분)하여 상청액 530ml를 얻었다. 배양상청액으로부터, 실시예 5(6)에서와 같이 Mono Q컬럼에 의해 항체를 정제하였다. 배양상청액 530ml로부터, 13.4mg의 IgM을 얻었다.
[실시예 10]
[인체 단일 클론항체와 LPS, Ra 및 지질 A와의 반응성]
실시예 1 내지 9에서 얻은 인체 단일 클론항체와 각 혈청형의 녹농균의 LPS, LPS의 공통구조 영역만을 가지는 Ra주에서 유래된 LPS및 지질 A와의 반응성을 실시예 1에서 설명한 DIBA법에 의해 측정하였다. 각 혈청형의 녹농균 LPS로서는, 실시예 1에서 제조한 것중 하나를 사용하였다. Ra(Salmonella minnesota R60)주에서 유래된 LPS및 지질 A로서는 시판(List Biological Laboratories Inc.)되는 것들을 사용하였다. 이 결과는 표 2에 도시한다.
각 인체 단일 클론항체는 LPS의 공통구조 부분이지만 각 혈청형의 녹농균 LPS와 특이적으로 반응하는 Ra또는 지질 A와는 반응하지 않는다. 따라서, 이들이 LPS의 O-다당류 사슬을 인식하는 인체 단일 클론항체임이 명백하게 되었다.
[표 2]
각 혈청형 LPS에 대한 항체의 반응성
[혈청형]
Figure kpo00003
[실시예 11]
[인체 단일 클론항체와 LPS의 교차반응성 Ⅰ]
실시예 1에서 얻은 인체 단일 클론항체 HPs1및 HPs2와 녹농균의 O-다당류 사슬, 즉 O-항원과의 교차반응성을 LPS로 피복된 플레이트를 사용하여 효소면역 용매분석법(ELISA)에 의해 측정하였다.
실시예 1에서 제조한 녹농균 LPS를 탄산염 완충액(pH 9.6)에 용해하여 농도가 2μg/ml가 되도록 하였다. ELISA용 96웰 플레이트(Greiner)의 각 웰에 LPS 용액 50μl를 분할주입하고, 37℃에서 2시간동안 방치하여 고정시켰다. 고정후, 용액을 제거하고 2% BSA-함유 탄산염 완충액으로 블록시켰다. 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS에 용해된 각 항체(25ng/ml)용액을 동량의 녹농균 LPS용액 (50μg/ml)의 2배 희석계열 희석액과 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 반응용액 50μl를 상기 LPS-고정 96웰 플레이트의 각 웰에 분할주입하고 실온에서 1.5시간동안 반응시켰다. 웰을 0.05% Tween 20-함유 PBS로 세정한후, 퍼록시다제-표식된 토끼의 항-인체 면역글로불린(500배 희석액) 50μl와 함께 실온에서 1.5시간동안 반응을 행하였다. 0.005% Tween 20-함유 PBS로 세정한후, 10mg/ml의 2,2'-아지노비스(30에틸벤즈티아졸린 설폰산)(ABTS)을 함유하는 시트르산염 완충액 50μl와 0.003%의 과산화수소와 함께 실온에서 30분동안 반응을 행하였다. 414nm의 파장에서의 흡광도를 측정하고, 흡광도로부터 각 항체와 플레이트에 고정된 LPS와의 결합에 대한 각 녹농균 LPS의 억제율을 측정하였다.
제 1 도에 도시한 바와같이, I형 녹농균의 LPS로 피복된 플레이트에 대한 HPs1의 결합은 I형과 D형 녹농균의 LPS에 의해 억제되나 A형 녹농균의 LPS에 의해 억제되지 않는다. 즉 HPs1은 I형과 D형의 2개의 O-항원을 공통으로 인식하는 단일클론항체임이 확인되었다. 제 2 도에 도시한 바와같이, F형 녹농균 LPS로 피복된 플레이트에 대한 HPs2의 결합은 E형과 F형 녹농균의 각 LPS에 의해 억제되나 D형 녹농균의 LPS에 의해 억제되지 않는다. 즉, HPs2는 E형과 F형의 2개의 O-항원을 공통으로 인식하는 단일 클론항체임이 확인되었다.
[실시예 12]
[인체 단일 클론항체와 LPS의 교차반응성 Ⅱ]
실시예 2 내지 5에서 얻은 인체 단일 클론항체와 녹농균의 O-항원과의 교차반응성은 실시예 11에서와 같이 LPS로 피복된 플레이트를 사용하여 ELISA에 의해 시험하였다. 제 3 도에 도시한 바와같이, A형 녹농균의 LPS로 피복된 플레이트에 대한 HPs4의 결합은 A형 및 L형 녹농균의 LPS에 의해 억제되며, 제 4 도에 도시한 바와같이, H형 녹농균의 LPS로 피복된 플레이트에 대한 HPs5의 결합은 G형과 H형 녹농균의 LPS에 의해 억제되며, 제 5 도에 도시한 바와같이, E형 녹농균의 LPS로 피복된 플레이트에 대한 HPs6의 결합은 E형과 F형 녹농균의 LPS에 의해 억제되며, 제 6 도에 도시한 바와같이, A형 녹농균의 LPS로 피복된 플레이트에 대한 HPs7의 결합은 A형과 F형 녹농균의 LPS에 의해 억제되며, 제 7 도에 도시한 바와같이, E형 녹농균의 LPS로 피복된 플레이트에 대한 HPs8의 결합은 E형과 F형 녹농균의 LPS에 의해 억제된다. 이와같은 결과로부터 HPs4, HPs5, HPs6, HPs7 및 HPs8은 각각 A형 및 L형, G형 및 H형, E형 및 F형, A형 및 F형, E형 및 F형의 2개의 O-항원을 공통으로 인식하는 인체 단일 클론항체임이 확인되었다.
[실시예 13]
[인체 단일 클론항체와 LPS와의 교차반응성 Ⅲ]
실시예 6 내지 9에서 얻은 인체 단일 클론항체 HPs9, HPs10, HPs11 및 HPs12와 녹농균의 O-항원과의 교차반응성은 실시예 11에서와 같이 LPS로 피복된 플레이트를 사용하여 ELISA에 의해 시험하였다.
I형 녹농균의 LPS로 피복된 플레이트에 대한 HPs9의 결합은 D형 및 I형 녹농균의 LPS에 의해 억제된다. E형 녹농균의 LPS로 피복된 플레이트에 대한 HPs10의 결합은 E형 및 F형 녹농균의 LPS에 의해 억제된다. H형 녹농균의 LPS로 피복된 플레이트에 대한 HPs11의 결합은 G형 및 H형 녹농균의 LPS에 의해 억제된다. A형 녹농균의 LPS로 피복된 플레이트에 대한 HPs12의 결합은 A형 및 F형 녹농균의 LPS에 의해 억제된다. 이와같은 결과로부터 HPs9, HPs10, HPs11 및 HPs12는 각각 D형 및 I형, E형 및 F형, G형 및 H형, A형 및 F형의 2개의 O-항원을 공통으로 인식하는 인체 단일 클론항체임이 확인되었다.
[실시예 14]
녹농균에 대한 다형핵세포의 살균효과에 대한 인체 단일 클론항체의 촉진효과시험
녹농균에 대한 쥐의 다형핵세포의 살균효과에 대한 실시예 1에서 얻은 인체 단일 클론항체 HPs2의 촉진효과를 시험하였다.
2.5%(W/V) 글리코겐을 함유하는 PBS를 생후 8 내지 12주된 쥐(Balb/C, 암컷)에 한 마리당 2ml씩 복강내 투여하였다. 5시간후, 다형핵세포를 함유하는 복강내 침출세포를 쥐 14마리로부터 채취하였다. 다형핵세포를 함유하는 복강내 침출세포를 빙냉하에 Hank's용액으로 2회 세정하고, 1×107/ml의 밀도를 가지도록 10mM의 HEP ES-함유 Hank's염 용액(이하, HBSS로 약칭한다)에 분산시켜서 사용할때까지 빙냉하에 저장하였다. E형 녹농균 PA 103 및 F형 녹농균 IID 1006을 각각 영양 한천에 접종한후, 37℃에서 20시간동안 배양하였다. 증식된 세포집단을 스크랩하여 생리식염용액에 현탁하였다. 상기 용액으로 2회 세정한후, 균세포를 HBSS에 현탁하여 540nm의 파장에서 흡광도가 0.12가 되도록 하였다. 제조된 균세포 현탁액은 사용할때까지 빙냉하에 보관하였다. 보체로서는, 기니아피그 정상혈청(동결건조보체, 일본 바이오테스트 연구소)을 HBSS로 5배 희석한 용액을 사용하였다.
빙냉하에서, 균세포 현탁액 각 10μl를 플라스틱 시험관(Falcon)에 분할주입하고, HPs2 40μl를 HBSS에 의해 25μg/ml, 2.5μg/ml 및 0.025μg/ml의 농도로 조절한후, 10μl의 보체용액을 첨가하였다.
이 혼합물을 충분히 혼합하였다. 이어서, 다형핵세포(호중구)를 함유하는 복강내 침출세포 현탁액을 혼합물에 첨가하였다. 충분히 혼합한후 37℃에서 2시간동안 회전진탕배양(200rpm)을 행하였다. 배양종료후, 각 시험관에 빙냉수 900ul를 첨가하여 다형핵세포를 삼투압으로 파괴시켰다. 각 시험관에서 100ul씩을 분취하여 HBSS로 10배, 100배 및 1000배 희석하였다. 각 희석액을 10ul씩 영양한천 플레이트(3매의 디쉬)에 접종한후 37℃에서 18시간동안 배양하였다. 영양한천 플레이트에 형성된 세포집단의 수를 계측하여 잔존하는 균세포수를 계산하였다. 대조군에서는 각 첨가용액 대신에 HBSS를 첨가하였다. 제 3 도 및 제 4 도에 도시한 바와같이, HPs2는 보체 존재하에서 혈청형이 다른 E형과 F형 녹농균에 대한 다형핵세포의 살균활성을 촉진하였다.
[표 3]
E형 녹농균(PA 103)에 대한 살균활성
Figure kpo00004
* 출발시=6×105세포집단 형성수 (CFU)/ml
[표 4]
F형 녹농균(IID 1006)에 대한 살균활성
Figure kpo00005
* 출발시=2.5×105세포집단 형성수 (CFU)/ml
[실시예 15]
[녹농균감염에 대한 인체 단일 클론항체의 보호활성시험 Ⅰ]
실시예 1 내지 5에서 얻은 인체 단일 클론항체 HPs1, HPs2, HPs3 HPs5, HPs6, HPs7, 및 HPs8의 녹농균 감염에 대한 보호활성을 시험하였다. 생후 8 내지 12주된 쥐(Balb/c, 암컷) 5 내지 10마리로 이루어진 군에 1마리당 각 인체 단일 클론항체 50ng, 500ng, 5μg 및 50μg을 함유하는 인체 단일 클론항체용액 0.2ml씩을 복강내 투여하였다. 2시간후, 각 균주 IID 1001(A형), IID 1004(D형), PA 103(E형), E 7(F형), P 28(G형), IID 1009(H형), IID 1010(I형) 및 IID 1014(L형)의 균현탁액을 복강내 투여하였다.
대조군에는 인체 단일 클론항체 대신에 생리식염수만을 투여하였다. 각 혈청형의 녹농균을 심장침출 한천 플레이트 배지에 접종한후 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 증식된 균세포 집단을 스크랩하였다. 생리식염수로 희석한후, 5% 뮤신을 첨가하여 균투여량이 쥐 1마리당 50% 치사량(LD50값)의 3 내지 15배가 되도록 조절하였다. 녹농균을 투여하고 7일 경과한후, 각 투여군의 쥐의 생존률을 기준으로 50% 유효 투여량(ED50값)을 측정하였다. 표 5에 도시한 바와같이, 인체 단일 클론항체는 각각 반응특이성을 나타내는 2종의 다른 혈청형의 녹농균 감염에 대해 보호활성이 높은 것으로 나타났다.
[표 5]
Figure kpo00006
Figure kpo00007
[실시예 16]
[녹농균감염에 대한 인체 단일 클론항체의 보호활성 시험 Ⅱ]
실시예 1에서 얻은 인체 단일 클론항체의 녹농균 감염에 대한 보호활성을 항체 주사기간를 변화시켜서 시험하였다. 생후 8주된 쥐(Balb/c, 암컷) 10 마리로 이루어진 군에 1마리당 0.2μg의 HPs2를 함유하는 용액 0.2ml를 복강내 투여하였다. PA 103(E형)의 균현탁액을 항체주사 24시간 및 2시간전, 주사와 동시에, 주사1시간 및 4시간 후에 복강내 투여하다. 대조군에는 인체 단일 클론항체 대신에 생리식염 용액만을 투여하였다. 실시예 15에서와 같이, 즉 생리식염 용액으로 희석한후 균현탁액을 제조하고, 5% 뮤신을 첨가하여 균투여량이 쥐 1마리당 LD50의 8배가 되도록 조절하였다. 녹농균을 투여한후, 3일째의 쥐의 생존률을 측정하였다. 표 6에 도시한 바와같이, HPs2는 균용액 투여 4시간후 주사한 경우를 제외하고는 반응 특이성을 나타내는 E형 녹농균 감염에 대한 보호활성을 나타내었다. 이러한 결과로부터, HPs2는 녹농균 감염에 대해 예방효과는 물론 치료효과를 가짐이 명백해졌다.
[표 6]
Figure kpo00008
[실시예 17]
[동결건조제제의 제조]
실시예 1에서 얻은 HPs2를 1mg/ml의 농도로 0.2%(w/v) 인체혈청 알부민(Calbio)을 함유하는 PBS에 용해하였다. 공극경이 0.22μ인 멤브레인 필터를 통해 용액을 여과하여 살균시켰다. 여액을 1ml씩 바이알에 분할 주입하고 동결 건조시켜서 동결건조 제제를 제조하였다. 제제를 증류수에 재용해하고, 녹농균에 대한 항체가를 측정하였으며, 그 활성을 유지시켰다.
[발명의 효과]
본 발명에 의한 인체 단일 클론항체를 단독으로 또는 둘이상을 조합하거나 다른 인체항체와 조합하여 사용함으로써, 녹농균 감염증에 대한 탁월한 예방 및 치료효과를 달성할 수 있다.
본 발명에서 주목할만한 것은, 다른 혈청형의 녹농균간의 교차반응성을 가지는 단일한 인체 단일 클론항체에 의해 인식된 항원이 혈청형 특이 항원부위인 O-다당류 사슬에 존재하며 인체 단일 클론항체가 극히 낮은 농도 및 낮은 용량으로 녹농균 감염증에 대한 예방 및 치료효과를 발휘한다는 사실을 본 발명자들이 최초로 발견했다는 것이다. 본 발명자들은 또한 단독 사용으로도 보호스펙트럼을 확대시킬 수 있기 때문에 녹농균의 O-항원에 대한 인체 단일 클론 항체를 함유하는 제제의 제조시에 혼합해야하는 인체 단일 클론항체의 종류를 감소시킬 수 있음을 발견하였다.
일본국 특허출원 제155398/1986호에는, Homma의 분류법에 의한 혈청형 2,7 및 13의 균에 대해 반응성을 나타내는 인체 단일 클론항체가 기술되어 있기는 하지만, 단일 클론항체에 의해 인식된 모든 박테리아는 일본국 녹농균연구회 형별검토위원회의 혈청형별 분류 및 Lanyi의 분류에 의해 동일혈청형으로 분류되어있다. 인체 단일 클론항체는 단순히 동일혈청의 아계를 인식하는 항체인 것으로 간주되나, 본 발명에서 설명한 다른 혈청형의 복수의 녹농균을 공통으로 인식하는 단일한인체 단일 클론항체와는 성질이 다르다.
본 발명에서 사용한 녹농균의 혈청형간의 교차반응성을 나타내는 항은 인체 단일 클론항체가 반응성을 나타내는 복수의 녹농균이 종래 혈청형 분류방법의 한 혈청형만으로 분류되지 않는 경우에 대한 것이다. 인체 단일 클론항체가 반응성을 나타내는 복수의 녹농균이 한 특정 혈청형 분류법만의 복수의 혈청형으로 분류되는 경우, 이러한 경우는 녹농균의 혈청형간의 교차반응성을 나타내는 것으로 간주하지 않으며, 인체 단일 클론항체가 단순히 동일 혈청형의 아계와 반응하는 것으로 본다.
또한, 본 발명의 인체 단일 클론항체의 경우, 면역글로불린의 종류는 IgM 또는 IgG 또는 IgA 일수도 있다.
[PCT 규칙 13.2에 의거하여 기탁된 미생물]
기탁기관 : 통상 산업성 공업기술원 미생물 공업기술연구소
주소 : 일본국, 이바라키켄, 츠쿠바시, 하가시 1초메, 1-3
수탁번호 및 기탁일자 :
1. FERM P-9745 1987. 12. 7
2. FERM P-9750 1987. 12. 9
3. FERM P-9751 1987. 12. 9
4. FERM P-9752 1987. 12. 9
5. FERM P-9753 1987. 12. 9
6. FERM BP-1596 1987. 12. 7
7. FERM BP-1598 1987. 12. 9
8. FERM BP-1599 1987. 12. 9
9. FERM BP-1600 1987. 12. 9

Claims (15)

  1. 녹농균의 O-항원에 대하여 복수적으로 반응할 수 있는 인체 단일 클론항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 녹농균이 A형 및 F형, A형 및 L형, D형 및 I형, E형 및 F형과 G형 및 H형인 인체 단일 클론항체.
  3. FERM BP-1598, BP-1596, BP-1600, BP-1599, P-9750, P-9745, P-9751, P-9753 또는 P-9752에 의해 산생되는 인체 단일 클론항체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한항의 인체 단일 클론항체를 산생하는 자기 복제 세포 및 그 세포에서 유래되는 세포주.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 자기 복제 세포가 Epstein-Barr 바이러스 형질 전환 세포인 자기 복제 세포 및 그 세포에서 유래된 세포주.
  6. 제 4 항에 이써서, 상기 자기 복제 세포가 하이브리도마인 자기 복제 세포 및 그 세포에서 유래된 세포주.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 하이브리도마가 무한증식능을 가진 세포 및 인체에서 유래된 항체 산생세포의 하이브리도마인 하이브리도마 및 그 하이브리도마에서 유래된 세포주.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 무한증식능을 가진 세포가 인체에서 유래된 세포인 하이브리도마 및 그 하이브리도마에서 유래된 세포주.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 무한증식능을 가진 세포가 동물에서 유래된 세포인 하이브리도마 및 그 하이브리도마에서 유래된 세포주.
  10. 제 7 항 내지 제 9 항중 어느 한항에 있어서, 상기 항체 산생세포가 정상 림프세포인 하이브리도마 및 그 하이브리도마에서 유래된 세포주.
  11. 제 7 항 내지 제 9 항중 어느 한항에 있어서, 상기 항체 산생세포가 바이러스 형질전환세포인 하이브리도마 및 그 하이브리도마에서 유래된 세포주.
  12. FERM BP-1598, BP-1596, BP-1600, BP-1599, P-9750, P-9745, P -9751, P-9753 또는 P-9752인 자기 복제 세포 및 그들로부터 유래된 세포주.
  13. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한항에 의한 적어도 하나의 인체 단일 클론항체를 포함하는 녹농균 감염중의 예방 및 치료조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한항에 의한 적어도 하나의 인체 단일 클론항체를 포함하는 액상제제.
  15. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한항에 의한 적어도 하나의 인체 단일 클론항체를 포함하는 동결 건조제제.
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