KR910002373B1

KR910002373B1 - 슈도모나스 에루기노사 편모에 대한 단일클론항체

Info

Publication number: KR910002373B1
Application number: KR1019870007069A
Authority: KR
Inventors: 이. 로스트롬 마크; 더불유. 시아닥 앤토니; 죠안 로속 매
Original assignee: 제네틱 시스템스 코오포레이션; 이삭 쟈코브스키
Priority date: 1986-07-03
Filing date: 1987-07-03
Publication date: 1991-04-20
Also published as: BE1000743A3; IT8721163A0; LU86938A1; DK336687A; IE60888B1; ES2013321A6; IE871769L; FR2601458B1; GB8715347D0; GB2192185A; IL83047A; IT1221940B; GB2192185B; IL83047A0; SE506421C2; DK336687D0; JPS63102697A; SE8702734D0; CH677796A5; JP2639422B2

Abstract

내용 없음.

Description

슈도모나스 에루기노사 편모에 대한 단일클론항체

본출원은 1986년 7월 3일자 출원한 미국특허출원 제881,984호의 부분계속출원인, 1986년 12월 4일자 출원한 미국특허출원 제946,554호의 부분계속출원인데, 이들 두출원 내용을 참고로 여기에 포함시켰다.

본 발명은 박테리아 감염을 진단하고 치료하는데 유용한 신규물질을 제공하기 위한 면역학적 기술의 응용에 관한 것이며, 특히 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas Aeruginosa) 편모를 인식할 수 있는 단일클론 항체의 생산 및 적용에 관한 것이다.

그람-음성질병과 그 대부분의 연속 합병증, 예컨데, 균혈증과 내독소증은 사람 환자들에 있어서 심각한 이병율 및 사망율의 원인이 된다. 이것은 특히 지난 5년 이상 박테리아성감염, 특별히 병원감염과 더욱 관련이 있는 그람-음성 세균 슈도모나스 에루기노사의 진성이다.

지난 수십년간 항생제는 그람-음성 질환의 억제를 위하여 선택적 치료를 해왔다. 그러나, 그람-음성의 박테리아성 질병과 관련되는 계속적인 높은 이병율과 높은 사망율은 특히 피. 에루기노사에 관한 항생제 치료의 한계점을 시사하는 것이다(참조, 예, 앤드리올, 브이. 쥐., "슈도모나스 균혈증 : 항생제의 치료가 생존을 개선할 수 있을까?" 저널레버레토리 클리닉 메디신[1978] 94 : 196-199). 이것으로 인하여 예방 및 치료의 대체 방법에 관한 연구를 자극했다.

고찰된 한가지 방법은 능동적이거나 수동적인 면역에 의하여 숙주의 면역 시스템을 증가시키는 것이다. 예컨데, 전체 세포 박테리아성 왁진들이나 피. 에루기노사에서 얻은 정제된 박테리아성 내독소로 인간이나 실험동물을 능동적으로 면역시키는 것은 피. 에루기노사의 외부 세포막에 위치한 지방 다당류(LPS) 분자들의 반복되는 과당류 단위들에 의하여 최초에는 결정인자들로 되는 특수 옵소닌 항체를 발현시켜 주게 된다(참조, 미국 보건후생성, 1979, 폴락 엠. 면역 글로불린 : 정맥내 제제의 특성 및 용도, 알 빙, 비. 엠. 과핀레이손, 제이. 에스. 출판 73-79면). 능동적으로 발생되던 수동적으로 전이되던 그와 같은 항체들을 여러가지 동물 모델(상기한, 폴락)과 몇가지 인간에 의한 예비조사에서 피. 에루기노사 감염의 치명적인 영향에 대한 보호성이 있는 것으로 나타났다(참조, 영. 엘. 에스 및 폴락엠., 슈도모나스 에루기노사, 사바드, 엘, 출판 119-132, 한스후버, 1980).

상기 보고는, 이를테면, 감염 균주(들)에 대한 항체들을 함유하고 있는 수집한 인간 면역 글로불린을 투여하여, 피. 에루기노사로 인한 박테리아 질병을 예방 및 치료하기 위한 면역 치료학적 접근이 이용될 수 있다는 것을 시사하고 있다. 인간 면역 글로불린은, 여기에서, 분류된 인간혈장의 일부로서 정의 되는데, 이것은 항체에 충분히 들어 있으며, 그것들은 피. 에루기노사의 균주에 대한 특수항체로 표시된다. 인간 면역 글로블린 성분을 사용하는데서 어떤 고유한 제한때문에 피. 에루기노사로 질병의 치료에 대한 이런 접근은 조사중인 상태로 남아있고(참조, 예컨데, 콜린, 엠. 에스. 와 로비, 알. 이., 아메리칸 저널메디신., 76(3A) : 168-174, [1984]) 어쨌든 지금까지는 이들 성분을 이용하는 유용한 상업적 제품은 없다.

면역 글로불린 조성에 관련되는 한가지 그런 제한은 그것들이 천개나 그 이상의 공여체에서 얻은 시료의 저장소로 구성되며, 그런 시료는 특수한 항-슈도모나스 항체의 존재를 알기 위해 미리 선택된다는 것이다. 이런 저장법은 기껏해야, 그결과 얻은 필요한 항체의 역가를 적절하게 증가시켜주는 결과를 얻게되는 각개 항체의 역가를 고르게 해준다.

또다른 제한은 그 자체의 예비 선택 과정은 제품의 농도를 보증하기 위하여 공여체 저장소(풀)을 값비싸고 연속적인 선별(스크린)을 해야할 필요가 있다는 것이다. 이런 영향에도 불구하고, 면역 글로불린 제품은 여전히 뱃치와 뱃치간에 또 서로 다른 지리적 영역에서 얻은 제품들간에 현격한 변이성을 가질 수 있다.

면역 글로불린 조성에서 또다른 그런 고유한 제한은 그것들을 사용하면 불리한 생물학적 효과를 나타내는 잠재력을 가지는 외래의 단백질성 물질(최근에 후천적 면역 결핍증, 또는 AIDS와 관련이 있는 것으로 나타난 것들과 같은 바이러스가 포함될 수도 있다)을 대량으로 일시에 투여하는 결과가 된다는 것이다. 저역가의 필요한 항체와 외부 물질의 높은 성분을 혼합한 것은 가끔 덜 적절한 수준으로 특수한 양까지 제한할수 있어서 환자에게 투여할 수 있는 유익한 면역 글로불린(들)을 제한할 수도 있다.

1975년에 콜러와 밀스테인은 어떤 생쥐 세포주들을 생쥐 비장세포와 융합시켜 잡종 종양을 만들수 있으며 이것들 각각은 단일 특성의 항체, 즉 단일클론항체를 분비하게 된다고 그들의 발전적인 발견을 보고했다(콜러, 쥐. 및 밀스테인, 씨. 자연, 256 : 495-497[1975]). 이 기술의 출현으로, 몇가지 경우에, 특수한 결정인자나 항원에 의한 결정인자에 대량의 멋지고 특수한 쥐의 항체를 생성하도록 하는 것이 가능하게 되었다. 뒤이어서, 후에 개발된 기술을 사용하여, 인간의 단일클론항체를 생성도 가능하게 되었다[참조, 예, 미국특허 제4,464,465호, 본원에 참고로 포함).

몇가지 상황에서는 생쥐의 단일클론항체들이나 그 항체들의 조성물들은 인간에게 사용하기 위해서는 문제들이 있을 수도 있다는 것이 인식되어 있다. 예컨데, 어떤 인간 질병의 치료를 위한 시험적 연구에서 사용한 생쥐의 단일클론항체는 그것들을 효과가 없게 하는 면역 반응을 유발시킬 수 있다는 것이 보고된 바 있다(레비, 알. 엘., 및 밀러, 알. 에이., 에뉴얼 리뷰메디신., 34 : 107-116[1983]). 그러나 최근의 재결합성 DNA 기술, 이를테면, 정체가 불확실한 생쥐/인간 단일 항체의 생성과 같은 기술의 진보에 따라, 이들 문제들은 줄어들고 있다. 또한 인간 단일클론항체의 생산 방법은 지금 이용 가치가 있다(참조, 인간 잡종종양과 단일클론항체, 엥겔만, 이. 쥐. 등이 출판, 플레눔 출판공사[1985] 본원에 참고로 소개).

잡종종양과/또는 세포 형질변형 기술을 사용하여, 수많은 그룹들이 피. 에루기노사 감염에 대하여 보호성이 있는 단일클론항체들을 생성한 보고가 있다. 박테리아의 엘피에스(LPS) 분사들에서 찾아낸것들과 같은 단일 및 다수-혈청형에 특수한 표면 에피토프를 포함하여, 슈도모나스 에루기노사의 여러가지 에피토프와 반응하는 단일클론항체들이 생산됐다(참조, 예컨데, 대개 계류중인 미국특허출원 제734,624 및 807,394에 지적되어 있고 참고로 본원에 소개). 또한 슈도모나스 에루기노사 에소톡신 에이(A)에 대하여 특성을 가진 보호성이 있는 단일클론항체가 생산됐다(참조, 예. 대개 미국특허출원 제742,170에 지적되어 있고 본원에 참고로 소개).

슈도모나스 에루기노사의 엘피에스(LPS)영역이나, 박테리아의 액소톡신에 대한 특수성이 있는 단일클론항체를 이용하면 몇가지 상황에서 충분한 보호를 받게되는 반면, 일반적으로는 광범위한 보호 능력을 갖는 것이 바람직하다. 예컨데, 인간의 잠재적 감염을 예방적으로 처치함에 있어서는 다수의 슈도모나스 에루기노사 균주에 대한 보호성이 있는 항체나 항체들을 투여하는 것이 바람직할 것이다. 이와 유사하게, 감염되는 균주(들)의 혈청형(들)이 알려지지 않은 치료적용에 있어서는, 이상적으로는 전형적인 혈청형을 형성하는 조직과는 엇갈리게 반응하는 항체들을 제공하여, 전부는 아니지만 대부분의 임상적으로 중요한 슈도모나스 에루기노사에 대하여 영향을 미치는 항체나 항체들의 혼합물을 투여하는 것이 바람직하다.

세균의 발명력 영향을 미치는 것으로 알려진 슈도모나스 에루기노사의 한가지 특징은, 최초에 편모의 존재로부터 발생하는 능동성과 능력이다(참조, 몬티. 티., 등[1982], 감염 및 면역, 38 : 1296-1298). 슈도모나스 에루기노사는 그것의 막대기형 구조의 한쪽끝에 단일의 편모를 가지는 것이 특징이다. 태운 생쥐의 모델을 연구한 결과는 능동적인 균주를 이용했을때 보다 비-능동적인 슈도모나스 에루기노사 균주들을 실험적으로 태운 물체에 접종시켰을때 더 많은 백분율의 생쥐들이 생존해 있었다는 것을 보여주었다(멕마누스, 에이. 등[1980], 태운물질, 6 : 235-239 및 몬티에, 티. 등[1982], 감염과 면역, 38 : 1296-1298). 피. 에루기노사의 병원론에 관한 또다른 연구는 편모 항원 제제로 면역된 동물은 태웠을때와 능동적인 박테리아균주로 감염시켰을때 보호된다고 주장했다(참조, 홀더, 아이. 등[1982], 감염과 면역, 35 : 276-280).

중요한 것으로는, 피. 에루기노사 편모를 혈청학적 방법으로 연구하여 비. 란이에 의하여 H1과 H2라고 지칭하는 것(1970 악타 마이크로비올 아카데미 소사이어티, 훙, 17 : 35-48)과 안소르그, 알에 의한 타입 a와 타입 b(1978 zbl, Bart. Hyg. I. Abt. Orig. A. 242 : 228-238)라고 지칭되는 두가지 중요한 항원그룹으로 구분한 것으로 보고된 바 있다. 양 실험실에 의한 편모의 혈청학적으로 정해진 타입은 H1 편모(상기한 란이. 비.)나 편모 타입 b(상기한 안소르그. 알)는 혈청학적으로 균일한 것으로 나타났다. 즉 소집단은 확인된 바 없다. 이러한 혈청학적으로 균일한 편모 타입은 타입 b라고 부르기로 한다. 다른 한가지 중요한 항원, H2(상기한 란이. 비.)나 타입 a편모(상기한 안소르그. 알.)은 다섯개의 소집단을 함유하고 있었다. 이 항원은 편모 타입 a라고 부르기로 하며 그 다섯가지 소집단들은 a0, a1, a2, a3 및 a4이다. 타입 a의 다섯가지 소집단은 항원 a0를 제외하고는 피. 에루기노사를 내포하는 타입 a의 상이한 균주들에 의해 다양한 결합으로 발현된다. a0 항원은 모든 타입 a편모에 의해서 발견되었다. 그렇지만 그것이 발현된 정도는 균주들간에 다양하다.

피. 에루기노사의 열에 안정한 중요 체항원에 근거한 혈청형 기구는 Habs기구(scheme)라고 부르기로 하는데, 이 기구는 최근에 국제항원 타입시스템 기구에 가입되었다(참조, 리우, 인터내쇼날 시스테믹 박테리올, 33 : 256[1983]). 피. 에루기노사 Hab 대조 균주들의 편모 타입들은 알. 안소르그에 의한 다중 클론혈청에 의한 면역 형광(1978.Zbl, Bark. Hyg., I. Abt. Orig. A. 242 : 228-238)에 의하여서나 슬라이공동응집(안소르그, 알. 등, 1984. 임상적 미생물잡지 20 : 84-88)에 의한 특성이 있다. Habs 균주들 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 및 12는 균주들을 내포하고 있는 편모 타입 b이며, Habs 균주들 1, 6, 8 및 9는 타입 a편모를 내포하고 있다. 그래서, 수많은 균주들의 피. 에루기노사는 편모 단백질에 대하여 특수한 소량의 단일클론항체들에 의해서 인식이 가능할 수도 있다.

따라서, 편모 단백질에 있는 에피토프와 반응할 수 있는 단일클론항체의 절실한 필요성이 있고, 몇가지 경우에는, 또 피. 에루기노사의 다중 혈청형에 대해서 보호성을 줄 수 있는 단일클론항체의 필요성이 절실하다. 더우기, 이들 항체중 어떤것은 피. 에루기노사 감염의 예방학적 및 치료학적 치료제로서는 물론이고 그 감염의 진단제로도 사용하는데 적당하여야 한다. 본 발명은 이런 필요성을 충족시켜 준다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다. 본 발명은 슈도모나스에루기노사(Pseudomonas Aeruginosa)박테리아중의 대부분의 균주에 존재하는 편모에 결합할 수 있는 단일클론항체들을 생산할 수 있는 신규 세포수를 제공하는 것이다. 단일클론항체는 특별히 피. 에루기노사의 편모 단백질에 있는 에피도프와 반응하고 그 박테리아의 타입 a와 타입 b로 구분할 수 있다. 이외에도, 본 발명은 피. 에루기노사 균주의 편모와 반응할 수 있는 적어도 한개의 단일클론항체나 그것의 결합 단편으로 구성되는 조성물이나, 또한 바람직하기는 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 그 조성물을 예방적양이나 치료적 양을 투여하여 감염에 민감한 사람이나 이미 피. 에루기노사로 감염된 사람을 치료하는 방법을 제공한다. 이 조성물은 또한 다음 것들중 어느 한가지 이상과 하나 이상의 살균약제를 포함할 수도 있다. 피. 에루기노사 엑소톡신 A와 반응할수 있는 추가의 단일클론항체들 ; 피. 에루기노사의 LPS에 있는 혈청형 결정인자와 반응할 수 있는 단일클론항체들 ; 인간혈액의 혈장에서 나온 감마 글로블린 유분 ; 혈장을 피. 에루기노사와 반응성이 있는 높은 수준의 면역 글로불린을 나타내는 사람에게서 얻을 수 있는 사람의 혈액 혈장에서 얻은 감마 글로불린 유분 또한 본 발명은 진단용기를 포함하여 단일클론항체의 임상적 용도를 제공한다.

본 발명의 실시예를 들어 더욱 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 본 발명에 따르면, 단일클론항체들을 생성할 수 있는 신규 세포들과 그런 항체들로 구성되는 조성물을 제공하는데, 그 조성물은 다수의 피. 에루기노사 균주에 존재하는 편모를 선택적으로 인식할 수 있으며 여기에서 각각의 항체들은 전형적으로 피. 에루기노사 편모의 한가지 타입을 인식한다. 본 발명 세포는 인지할 수 있는 염색체들을 가지는데 여기에서그들에게서 나온 세균주 DNA나 전구물세포는 어떤 피. 에루기노사 균주간의 보통 편모 단백질에 있는 에피토프와의 결합 부위를 갖는 항체를 코드화하기 위해서 재배열했다. 타입 a편모 단백질들로 인해, 범-반응성 단일클론항체들을 생산할 수 있고 ; 타입 b편모 단백질때문에 범-반응성이 있거나 균주들을 내포하고 있는 편모의 적어도 약 70%와 반응하는 항체들을 포함한다. 이들 단일클론항체들은 진단과 치료를 포함한 폭넓은 여러가지 방법으로 사용될 수 있다.

이와 같이 얻어진 단일클론항체들은 특히 피. 에루기노사로 인하여 발생한 극심한 질환의 치료나 예방에 유용하다. 피. 에루기노사의 편모상에 있는 표면 단백질은 항체 분자들에 의하여 직접 접촉에 유효하며, 그래서 세균의 능동성을 억제하고/또는 감염 숙주에 유익한 또다른 효과를 촉진하는 것 같다.

단일클론항체의 제조는 피. 에루기노사의 복합균주들중 편모 단백질 상에 있는 에피토프에 관하며 특성이 있는 항체를 부호화하는 헥산 사슬을 발현할 수 있는 세포주를 불멸화시켜서 달성할 수 있다. 그 불멸화된 세포주는 종양형성을 통하여, 형질 도입이나, 둘연변이, 또는 이와 유사한 것에 의해서 형질 변형된 포유동물 세포주일 수 있다. 그 세포들은 골수종주, 임파종주, 또는 시험관내에서, 면역 글로불린이나 그 결합 단편의 발현과 분비를 지원할 수 있는 다른 세포주들을 포함한다. 면역 글로불린이나 단편은 바람직한 생쥐나 사람의 출처외에 자연적으로 발생하는 다른 포유동물의 면역 글로불린 일 수 있는데, 출처가 사람일때는 임파구 세포, 특히 비세포를 형질변환시키거나, 바이러스에 의하거나, 임파구 세포를 종양세포 잡종 세포수를 생성하는 골수종과 융합시켜서 생성한다. 전형적으로, 비세포(지라세포)는 에피토프 부위를 함유하는 편모 항원이나 이것의 단편에 대하여 면역된 동물로부터 얻는다.

면역 공정 성적표는 잘 알려져 있고 아직도 남아있는 효과가 현저하게 다양할 수 있다(참조, 골딩. 단일클론항체 : 원리 및 실시, 아카데미 프레스 뉴욕[1983], 참고로 본원에 소개함).

잡종세포주를 통상의 기술에 따라 클론화하여 스크린하고 피. 에루기노사 편모 결정인자에 결합할 수 있는 그 세포상징액내의 항체를 탐지했다. 그 다음 적절한 잡종 세포주를 대규모 배양으로 생육시키거나 복수증 유액을 생산하기 위해 적절한 숙주의 복강공동에 주사할 수 있다.

본 발명의 구체적 예로서, 그 세포들은 적어도 한개의 편모 단백질에 관하여 특성이 있는 접촉하기 쉬운 에피토프들에서 인간의 단일클론항체, 바람직하기는 생체내에서 보호성이 있는 항체를 생성하는 인간의 임파구 세포를 형질 변경시킨다. 그 임파구 세포는 피. 에루기노사의 적절한 편모-내포균주에 노출되거나 노출된 인간 공여체에시 얻을 수 있다. 바람직한 세포-유도된 형질변형 공정은 미국특허 제4,464,465에서 상세하게 설명되어 있고 참고로 본원에도 소개한다.

편모 단백질들에 관하여 특성이 있는 것으로 알려진 본 발명 항체들을 갖는 덕분으로, 몇가지 경우에 추가되는 항-편모 단일클론항체의 예를 확인하는 한가지 방법으로서 주되는 단일클론항체에 의한 경쟁시험에서 차후 실험의 상징액을 스크린할 수 있다. 그러므로 잡종 세포주는 특수한 편모항원에 특성이 있는 항체의 유효성을 기준한 각종 출처에서 쉽게 생산할 수 있다.

택일적으로는, 주 에피토프 부위들에 관해 특수성이 있는 항체를 생성하는 잡종 세포주가 유용성이 있을 경우, 이들 잡종 세포주는 다른 종양 B-세포와 융합될 수 있는데, 이때 그와 같은 다른 B-세포는 수용체를 부호화하는 게눔성 DNA를 위한 수용체로서 역할을 한다. 설치류, 특히 쥐의 종양 B-세포들이 보통 거의 대부분 이용되는 반면, 라고모르파(lagomorpha), 소, 양, 말, 돼지, 조류등과 같은 또다른 포유동물 종류가 채택될 수도 있다.

단일클론항체는 IgM, IgD, IgA, IgE 또는 동물의 각각의 종에 대하여 알려진 IgG의 아강과 같은 강이나 아강의 면역 글로불린중 어느 것일 수 있다. 일반적으로, 단일클론항체는 원상태로 사용되거나 Fv, Fab, F(ab') 2와 같은 결합 단편들로서 이용되기도 하지만 보통은 원형대로 사용된다.

본 발명 세포주는 단일클론항체의 직접적인 생산에 관한 것외에도 다른 용도가 있음을 알 수 있다. 그 세포주는 또다른 세포들(이를 테면 적당하게 약물-흔적이 있는 사람의 골수종, 생쥐의 골수종, 또는 사람의 임파아구종 세포들)과 융합되어 잡종종양을 생성할 수 있고 그래서 단일클론항체를 코드화하는 유전자의 전이를 일으키게 한다.

택일적인 것으로, 세포주들을 면역 글로불린을 코드화 하는 염색체의 근원으로서 사용할 수 있고 그것은 단리시켜서 융합외의 다른 기술들에 의하여 세포들로 전이시킬 수 있다. 그외에, 단일클론항체를 코드화하는 유전자를 단리시켜 여러가지 숙주들에 있는 특수한 면역 글로불린의 생산에 관한 재결합성 DNA 기술에 따라서 사용될 수도 있다. 특히, 메신저 RNA에서 cDNA 라이브라리를 제조하므로서, 면역 글로불린을 부호화하고 인트론이 없는 단일 cDNA 클론을 단리시켜 적당한 원시핵이나 성숙핵의 발현 벡타에 넣은 다음 최종적인 벌크 생산을 위해 숙주로 형질 변형시킨다(참조, 일반적으로 미국특허 제4, 172, 124 ; 4, 350, 683 ; 4, 363, 799 ; 4, 381, 292 및 4, 423, 147 또한 켄네트등의 단일클론항체 플레눔, 뉴욕[1980]과 거기에 인용된 문헌, 이 모든것을 참고로 여기에 소개한다).

특히, 잡종 DNA 기술에 따라, 본 발명의 면역 글로불린이나 단편들을 박테리아나 효모에서 생성시킬 수 있다(참조, 보스등 헥산연구 12 : 3791과 우드등의 자연 314 : 446, 이들 둘다 참고로 여기에 소개한다). 예를 들면, 본 발명의 세포주에 의해 생성된 단일클론항체의 가볍고, 무거운 사슬에 대하여 부호화한 유전자로부터 전사된 메신저 RNA를 주된 클론 외의 다른 BALB/C 임파구 세포에서 나온 cDNA를 채택한 상이한 cDNA 교잡으로 단리시킬 수 있다. 교잡하지 않은 mRNA는 필요한 면역 글로불린 사슬을 부호화한 메시지가 충분히 들어있다. 목적하는 mRNA 수준을 더욱 증가시키기 위해서 필요한 만큼 이 공정을 반복할수 있다. 그때 제외한 mRNA 조성물은 목적하는 사슬에 충분히 들어 있는 cDNA 혼합물을 얻기 위해서 역-전사시킬 수 있다. RNA는 DNA 폴리머라제 I과 임의 프라이머들, 예컨데, 임의로 분절한 송아지 흉선 DNA로 이중-가닥이 되게 만든 적절한 RNASE와 SSDNA로 가수분해시킬 수 있다. 그 다음 그 결과 생긴 dsDNA를 적절한 벡타, 예컨데 람다 벡타나 플라스미드 벡타(pBR 322, pACYC184등과 같은)와 같은 바이러스 벡타에 삽입시켜서 클론화시킬 수 있다. 가벼운 사슬과 무거운 사슬의 일정한 엉역에 관한 공지된 사슬을 기준으로 한 탐침을 발전시키므로서, 목적하는 가벼운 체인과 무거운 체인을 부호화한 유전자를 가진 이들 cDNA 클론들을 잡종번식시켜서 확인할 수 있다. 그후, 그 유전자 들을 플라스미드로 부터 절제하고 초기 코돈이나 일정한 영역의 DNA에서 나온 불필요한 DNA 상류를 제거하기 위해 조작한 다음 숙주의 형질변형과 유전자의 최종 발현을 위한 적절한 벡타에 도입할 수 있다.

편의상, 원상태의 면역 글로불린을 생성하기 위해서 또 필요하면 선두 사슬없는 면역 글로불린을 분비하도록 그 체인(예, 무거운 체인과 가벼운 체인을 합쳐서)을 진행시키는데 포유동물 숙주(예, 생쥐 세포)를 이용할 수 있다.

택일적으로는, 두개의 체인을 생성하기 위해 단세포 미생물을 이용할 수도 있는데, 이때 무거운 체인을 부호화한 사슬의 5'말미에 초기 코돈을 제공하는 한편 분비전구물 및 진행 신호를 부호화한 DNA 사슬을 제거하기 위해서는 다시 조작을 해야할 필요가 있다. 이런 방법으로, 면역 글로불린을 제조하여 포유동물 세포를 제외한 다른 세포들에 수집되어 글리코실화 되도록 진행시킬 수 있다. 필요하면, 적어도 변이할 수 있는 영역을 유지하도록 그 체인의 각각의 끝을 절단할 수가 있는데 그 영역은 그때 편모가 있는 에피토프에 특성을 가진 단편들이나 다른 면역 글로불린을 제공토록 조작할 수 있다.

본 발명의 단일클론항체들은, 대부분의 피. 에루기노사 변종에 엇갈리는 항원들에 대한, 그것들의 특성이 현재 알려져 있기 때문에 특히 유용하다. 또한 몇가지 단일클론항체들은 생체내에서 보호성이 있는데, 박테리아 감염을 위한 항체 결합과 같은 제약제품에 혼합할 수도 있다.

본 발명의 단일클론항체는 또한 시험관내에서 여러가지 폭넓은 이용도를 찾을 수 있다. 실시예의 목적으로는, 단일클론항체들은 미생물 타입을 정하는데, 특수한 피. 에루기노사 균주들을 단리시키는데, 세포들의 이종 혼합물이나 이와 유사한 것에서 피. 에루기노사 세포를 선택적으로 제거하는데 이용할 수 있다.

진단 목적으로는, 단일클론항체 라벨 표시를 할수도 있고 않을 수도 있다. 전형적으로는, 진단분석은 피. 에루기노사 세균의 편모에 단일클론항체의 결합을 통하여 복합체의 형성을 탐지하는 것을 필요로 한다. 라벨 표시가 없을때에는, 그 항체들은 응집 반응 분석에서 사용된다는 것을 알 수가 있다. 이외에도, 라벨 표시없는 항체들은, 면역 글로불린에 관하여 특성이 있는 항체들과 같은 단일클론항체와 반응하는 다른 라벨 표시된 항체들(제2의 항체들)과 혼합하여 사용할 수 있다.

택일적인 방법으로, 단일클론항체는 직접적으로 라벨 표시를 할 수 있다. 방사성 핵종, 형광, 효소, 효소기질, 효소조인자, 효소억제제, 배위자(특히 합텐)등과 같은 여러가지 폭넓은 라벨을 이용해도 좋다. 수많은 타입의 면역분석이 유효하며 실예의 목적으로, 몇가지는 미국특허번호 3,817,827 ; 3,850,752 ; 3,901,654 ; 3,935,074 ; 3,984,533 ; 3,996,345 ; 4,034,074 ; 및 4,098,876에서 설명되어 있는 것들이 포함되며 이들 모두는 참고로 여기에 소개된다.

보통, 본 발명의 단일클론항체들은 상이한 종에서 나온 주 항체들이나 제2의 항체들을 효소에 접합시키는 효소면역 분석에서 이용된다. 사람의 혈액이나 그 용해질과 같은 혈청타입의 피. 에루기노사를 함유하는 시료가 주항체와 결합될때, 그 결합은 필요로 하는 에피토프를 나타내는 항체들이나 이들 분자들간에시 일어난다. 그때 그와 같은 세포는 미결합된 시약으로 분리시켜서 제2의 항체(효소로 라벨 표시가 된)를 첨가해도 좋다. 그후, 세포에 특별히 결합된 항체-효소 접합물의 존재를 검사한다. 본 기술에 숙련된자들에게 잘 알려진 다른 통상적인 기술이용될 수도 있다.

용액속의 피. 에루기노사 또는 피. 에루기노사 편모 항원의 존재를 탐지하기 위해서 주 항체와 함께 사용할 소형 용기도 본 발명에서 제공될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 주 단일클론항체 조성물을, 보통은 동결 건조된 형태로, 단독으로나 다른 그람-음성 박테리아에 특성이 있는 추가 항체들과 함께 제공될 수 있다. 라벨 표시된 것과 라벨 표시되지 않은 것에 접합될 수 있는 항체들은 트리스, 인산염, 탄산염등과 같은 완충제, 안정제, 살균제, 불활성 단백질 예컨데, 소의 혈청알부민 또는 이와 유사한 것들과 함께 용기에 포함시킨다. 일반적으로 이들 물질은 활성항체의 양을 기준으로 약 5% 중량이하로 존재하게 되고, 보통은 다시 항체 농도를 기준으로 적어도 총량 약 0.001% 중량으로 존재한다. 종종, 활성 성분들을 희석할 불활성 팽창제나 부형제를 포함하는 것이 바람직한데, 이때 부형제는 총 조성물중 약 1 내지 99% 중량으로 존재할수 있다. 단일클론항체에 결합할 수 있는 제2의 항체가 채택될 경우에, 이것은 보통 별도의 작은 병에 넣는다. 제2의 항체는 전형적으로 라벨에 접합시켜 위에서 설명한 항체 형성방법과 유사한 방법으로 제제한다.

본 발명의 단일클론항체, 특히, 사람의 단일클론항체들도 역시 제약적으로 허용되는 담체와 함께 본 발명의 적어도 한개의 단일클론항체의 치료나 예방적 양을 함유하는 제약조성물중의 성분들로서 혼합될 수 있다. 제약적 담체는 환자에게 단일클론항체를 투여하기에 알맞는 어떤 혼화할 수 있는 비독성 물질이어야 한다. 살균수, 알콜, 지방류, 왁스류 및 불활성 고체들이 담체로서 사용될 수 있다. 계약적으로 허용되는 보조제들(완충제, 분산제)도 제약적 성분으로서 혼합될 수 있다. 그런 성분들은 피. 에루기노사의 한가지 편모타입의 균주들에 대해 특성을 나타내도록 단일의 단일클론항체를 함유할 수 이다. 택일적으로, 제약적 조성물은 두개이상의 단일클론항체를 함유하여 "칵테일"을 형성할 수 있다. 예컨데, 편모의 두가지 타입이나 여러가지 피. 에루기노사 균주(예, 상이한 혈청형)의 그룹에 대한 단일클론항체를 함유하는 칵테일은 그 특수 박테리아들의 아주 중요한 임상적 단리물에 대한 활성을 가진 보편적인 생성물이어야 한다.

여러가지 단일클론항체의 몰비는 보통 10이상의 인자, 더욱 보편적으로는 5이상이 아닌 인자까지는 서로 다르지 않으며, 보통 다른 항체 조성물의 각각에 대하여 약 1 : 1-2의 몰비가 된다.

본 발명의 단일클론항체는 또 존재하고 있는 혈액혈장 생성물과 혼합하여 사용할 수도 있다. 그 혈액혈장 생성물은 상업상 이용가치가 있고 사람의 피. 에루기노사 질병의 예방 및 치료적 처치에 사용되는 감마 글로불린과 면역 글로불린 제품과 같은 것들이다. 바람직하기는, 면역 글로불린에 있어서, 그 혈장은 피. 에루기노사와 반응하는 높은 수준의 면역 글로불린을 나타내는 사람의 공여체들로부터 얻게된다.(참조, 일반적으로, "경맥내 면역 글로불린과 손상된 숙주" 개요, 76(3a), 1984년 3월 30일 1-231 페이지, 참조로 여기에 소개함).

주된 단일클론항체들이 항체나 살균제와 함께 만들어진 별도로 투여하는 조성물로서 사용할 수 있다. 전형적으로, 살균제는 아미노 배당체(예, 젠타미신, 토브라마이신등)과 함께 항-슈도모나스성 페니실린(예, 카르베니실린)을 포함할 수도 있지만 이 기술에 능통한 사람들에게는 잘 알려진 수많은 부가제(예, 세팔로스포린)도 채택될 수 있다.

본 발명의 단일클론항체와 이것의 제약적 조성물은 특히 경구나 비경구 투여용으로 유용하다. 바람직하기는 제약적 조성물은 비경구, 즉 피하로, 근육내로, 또는 정맥내로 투여할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 허용되는 담체, 좋기는 담체 수용액에 녹인 단일클론항체나 이것의 칵테일 용액으로 구성되는 비경구 투여용 조성물을 제공한다. 여러가지 담체 수용액, 예컨대, 물, 완충된 물, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신 및 이와 유사한 것들을 사용할 수 있다. 이들 용액은 무균이며 일반적으로 입자물질이 없다. 이들 조성물은 통상적이면서, 잘 알려진 살균 기술에 의해서 살균시킬 수 있다. 이 조성물들은 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제와 이와 유사한 것들과 같은 생리학적 조건에 접근하는데 필요한 만큼의 제약으로 허용되는 보조물질, 예컨대 초산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 젖산나트륨등이 포함될 수 있다. 이들 제제에서 항체의 농도는 폭넓게 다양할 수 있는데, 즉 약 0.5% 이하에서 부터, 보통은 약 1%나 적어도 약 1%에서 부터 15%중량이나 20%중량 정도까지 다양하며 원래는 유체 용량, 점도등을 기준으로 하여 선택되는데, 바람직하기는 선택된 특수 투여 형태에 따라 선택된다.

그러므로, 전형적인 근육내 주사용 제약 조성물은 1ml 무균 완충수와 50mg의 단일클론항체를 포함하도록 제조할 수 있다. 전형적인 정맥내 주입용 조성물은 250ml의 무균의 링거스 용액과 150mg의 단일클론항체를 함유하도록 제조할 수 있다. 비경구로 투여할 수 있는 조성물을 실제 제조하는 방법은 공지되어 있거나 이 기술에 능통한 사람들은 분명히 알 수 있으며 또 예컨대, 레밍톤스 파머 슈티칼 사이언스 15판, 멕출판사, 펜실바니아주 이스톤(1980)에 더욱 상세히 설명되어 있으며 이것은 참고로 여기에 소개했다.

본 발명의 단일클론항체들은 저장하기 위해 동결 건조시켜서 사용하기전에 적당한 담체에로 재조성할 수 있다. 이 기술은 통상의 면역 글로블린에 효과가 있는 것으로 나타났으며 기술적으로 공지된 동결 건조 및 재조성 기술이 채택될 수도 있다. 동결 건조 및 재조성으로 인하여 항체의 성능 손실의 정도를 변화시킬 수 있고(예, 통상의 면역 글리불린에 의하여 IgM 항체들은 IgG 항체들보다 더 큰 성능 손실을 갖게되는 경향이 있다) 사용 정도는 보정하기 위해서 조절될 수 있다는 것은 본 기술에 능통한 사람이라면 명백히 알 수 있다.

본 단일클론항체들이나 이것의 칵테일을 함유하는 조성물들은 피. 에루기노사 감염의 예방 및 치료를 위한 처치에 투여될 수 있다. 치료적 적용으로는, 조성물들을 감염과 그 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 억제하기에 충분한 양으로, 한가지 이상의 피. 에루기노사 혈청타입으로 이미 감염된 환자에게 투여한다. 이것을 달성하기에 적절한 양을 "치료학적으로 효과적인 투여량"이라고 정의한다. 이 용도에 효과적인 양은 감염의 심각성과 그 환자 자신의 면역 시스템의 전체적인 상태에 의존하지만 일반적으로는 체중 kg당 약 1 내지 약 200mg의 범위이며 보다 통상적으로 사용되기는 제중 kg 당 5 내지 25mg의 투여량이다. 본 발명의 물질은 일반적으로 극심한 질환상태, 즉 생명이-절박한 상태이거나 잠재적으로 생명이-절박한 상태, 특히 피. 에루기노사로 인한 균혈증과 내독소증(endotoxemia)에 이용될 수 있다는 것을 명심해야 한다.

예방적 응용으로는, 본 발명 항체나 그것의 칵테일을 함유하는 조성물을 그런 잠재적인 감염에 대한 환자의 저항성을 높이기 위해서 피. 에루기노사에 의하여 미리 감염되지 않은 환자에게 투여한다. 그 양은 "예방학적으로 효과적인 투여량"이라고 정의한다. 이 용도에서 상세한 양은 다시 환자의 건강상태와 전체 면역정도에 의존하지만 일반적으로는 kg 당 0.1 내지 25mg의 범위, 특히 kg 당 0.5 내지 2.5mg의 범위이다.

이 조성물의 단일투여 또는 복합투여는 치료하는 의사에 의해 선택되는 투여정도나 모형에 따라 실시될수 있다. 어쨌든, 제약적 제제는 환자를 효과적으로 치료하거나 예방하기에 충분한 본 발명의 항체(들)의 양이 공급되어야 한다.

실험

[실시예 1]

실시예 1은 특별히 피. 에루기노사 편모에 결합하는 쥐의 단일클론항체를 제조하는데 이용하는 방법을 설명한 것이다.

3개월된 BALB/C 생쥐를 일주 내지 2주 마다 총 9주 동안 생존 가능한 피. 에루기노사 휘셔 면역형 1과 휘셔 면역형 2(A.T.C.C. # 27312와 # 27313) 박테리아로 복강내로 8회 면역시켰다. 초기 박테리아 투여량은 피. 에루기노사 휘셔 면역형 1과 휘셔 면역형 2 각각에 대하여 생쥐 마리당 8×10⁶과 1×10⁷개의 세균이었고, 1회 투여량은 면역 과정중에 30 내지 60배 증가시켰다.

마지막 주사 3일후, 생쥐의 비장을 무균 상태로 제거하여 두개의 살균 유리 슬라이드를 얼리는 마지막에 그 장기를 부드럽게 회전시켜서 단일세포 현탁액을 제조했다. 비장의 단핵 세포들을 로그상의 생쥐 골수종세포(영국 캠브리지 닥터 씨. 밀스테인의 분자 연구회에서 얻은 NSI-1)와 4 : 1 비율로 혼합하고 탬등이 설명한 공정(1982 감염과 면역, 36 : 1042-1053)에 따라 잡종종양을 만들기 위해서 융합시켰다. 최종 잡종 세포 현탁액을 공급세포인 신선하게 제조한 BALA/C 흉선세포 ml 당 2.1×10⁶개를 포함한 RPMI-잡종-HAT(15% 열에-불활성인 태아 송아지 혈청, 1mM 초성포도산 나트륨, 100μg/ml의 페니실린과 스트렙토마이신, 1.0×10^-4M 히포크산틴, 4.0×10^-7M 아미노 프로테인 및 1.6×10^-5M 티미딘을 함유하는 PRMI 1640[기브코, 그랜드 아일랜드, 뉴욕])에 ml 당 1.5×10⁶개의 세포가 들어있는 농도로 희석시켰다.

그 혼합물을 96-웰 플레이트(마이아미주 캠브리지, 코스타, # 3596)에 깔았다. 배양물을 2일 내지 3일마다 신선한 RPMI-잡종-HAT로 각 웰중 50% 용량을 제거하고 교체하여 공급한다. 배양 상징액을 세포성장이 보통 7-10일 이내에 웰 내에서 거의 40% 융합에 도달했을효소-결합된 면역 소르반트 분석(ELISA)에 의하여 항-피. 에루기노사 항체의 존재를 분석했다.

잡종세포의 배양 상징액을 두가지 면역 박테리아의 각각에서 나온 외부막 제제에 관하여 동시에 분석했다. 외부막 제제는 탐등의 방법을 변형시켜서 단리하였다(1982 감염과 면역, 36 : 1042-1053). 이것을 참고로 여기에 소개한다. 박테리아(피. 에루기노사 휘셔 면역형 1과 휘셔 면역형 2)를 트립티 케이스 콩육즙 배지(TSB)에 접종시키고 선회하는 진탕 욕조에서 공기를 주입하면서 34℃에서 16-18시간 동안 생육시켰다. 그 박테리아를 원심 분리하여 수거하고 ml당 150트립신 억제단위(T.I.V.)아프로티닌을 함유하는 인산염으로 완충시킨 식염수(PBS, 0.14M NaCl, 3mM KCl, 8mM Na₂HPO₄-7H₂O, 1.5mM KH₂PO₄, pH7.2)로 두번 세척하였다(미조리주, 세인트루이스, 시그마).

최종원심분리하여 생긴 펠렛을 0.17M 트리에타놀아민, 20mM 디소듐 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)에 재현탁시킨 다음 10분간 얼음위에서 균질화시켰다. 그 균질물에서 나온 부스러기를 14,900×g으로 펠릿화하여 버렸다. 상징액을 위에서와 같이 다시 원심 분리하였다. 펠렛을 다시 버리고, 1시간 동안 141,000×g으로 원심분리하여 상징액에서 생긴 막을 펠릿화시켰다. 상징액을 버리고 막 펠릿을 75T.I.U. 아프로틴/ml를 함유하는 10ml TBS에서 4℃로 하룻밤 저장하였다.

다음 그 펠렛을 와동시키면서 재현탁시킨 다음 부분표본을 얻어 -70℃에서 저장했다. 각각의 단백질 성분을 로우리 등의 방법(1951 저널 비오로지칼 케미스트리, 193 : 265-275)으로 측정했다.

ELISA에 관한 항원판을 다음과 같이 제조했다. 그 외곽막의 제제를 PBS내의 단백질 ml당 5μg까지 희석시키고 96-웰 플레이트의 각 웰(버지니아주, 맥클린, 플오우 레보라토리스, 인코퍼레이션, 리브로 #76-031-05)에 넣고 밀봉하여 37℃에서 하룻밤 배양시켰다. 미결합된 항원을 플레이트로부터 튀겨 버리고 PBS에 5%(w/v)소의 혈청 알부민(BSA)이 들어있는 용액 100μl을 각 웰에 첨가하고 그 플레이트를 37℃로 1시간 동안 배양시켰다.

흡착되지 않은 BSA를 튀겨버린후, 그 융합 플레이트의 각 웰에서 얻은 배양 상징액(50μl)을 항원 플레이트의 상응하는 웰속에 다시 반복하여 깔고 37℃로 30분간 배양시켰다. 미결합된 항체를 그 웰들에서 튀겨버리고 그 플레이트들을 웰당 1%(w/v)BSA-PBS의 100μl로 3번 세척했다. 다음은 비오티닐화한 양 항-생쥐 IgG(캘리포니아주, 벌링감, 타고 인코퍼레이션)을 희석시킨 웰당 약 50μl을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 30분간 배양시켰다. 플레이트를 위에서 설명한 대로 3번 세척한 다음, 제조업자의 명세서에 따라 미리 제조한 아비딘 : 비오티닐화된 고추냉이 과산화효소 복합체(캘리포니아주, 블링감, 벡타 라보라토리스 인크., 벡타스테인 ABS용기)을 그 웰들에 첨가하였다. 실온에서 30분후, 벡타스테인 시약을 그 웰들에서 튀겨내고 웰들을 위에서 처럼 세척한 다음, 100μl/기질웰, 0-페닐렌디아민(0.8mg/ml의 0.1M 구연산 완충용액, pH 5.0을 동일량의 0.03%[v/v]H₂O₂과 혼합한]을 첨가하였다. 기질을 실온에서 어둡게 하여 30분간 배양한 다음 추가로 50μl/3N H₂SO₄의 웰을 추가하여 그 반응을 종료시켰다.

두개 항원 제제중 어느 한쪽에 결합된 단일클론항체를 분비하는 잡종종양 세포들을 다이나텍 모델 580마이크로 ELISA기록계(버지니아주, 알렉산드리아)로 각 웰에서 비색 반응의 490nm에서의 흡광도를 측정하여 알아냈다. Pa3 IVC2로 명명된 한개 웰내의 세포들은 휘셔 면역타입 2항원 플레이트에만 결합되는 항체를 생산했다. 다시 이 웰을 아래에서와 같이 연구했다. 이 웰에서 얻은 단일클론항체와 클론세포주는 둘다다음 텍스트에서 Pa3 IVC2으로 지적하여 확인했다. 마스터 웰에서 얻은 Pa3 IVC2 세포들을 미니-클론화시키고 탐등에 의해서 설명된 것과 같은 희석 기술을 제한하여 클론화시켰다(1982, 감염 및 면역 ; 36 : 1042-1053).

탐등에 의하여 설명된 공정들(1982, 감염 및 면역, 36 : 1042-1053)에 따라 CB6 F₁생쥐(BALB/C[암놈]×C57BL/6[숫놈]F₁)에서 고역가를 나타내는 단일클론항체를 함유하는 복수증 유액을 제조했다.

2 내지 3-개월된 숫놈의 CB6 F₁생쥐를 RPMI의 로그상 Pa3 IVC2 세포들로 복강내로 주사하기 10-21일전에 0.5ml 프리스탄(위스콘신주, 밀워키, 알드리치 케미칼 캄파니, 2, 6, 10, 14-테트라메틸펜타데칸)으로 복강내 주사하였다. 각각의 생쥐를 0.5ml내에 0.5-1×10⁷세포들을 포함한 액으로 주사했다. 약 2주일후, 모아진 유액을 매 2일 내지 3일마다 그 쥐들에게서 제거했다. 복수증 유액속의 항체농도를 아가로스겔 전기영동으로 측정하고 (캘리포니아주, 브리아, 파라곤, 벡크만 인스트루먼트, 인크.), 5mg/ml나 그 이상의 항체를 함유한 모든 복수증을 모아, 부분표본을 얻고 -70℃에서 냉각시켰다.

단일클론항체에 의해서 결합된 분자표적의 특징

모두가 위에서 설명한대로 제조된 모두 7개의 피. 에루기노사 휘셔 면역타입 균주(A.T.C.C. 27312-27318), 피. 아우레오패시엔스(P.aureofaciens)(A.T.C.C. 13985) 및 클레브시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae)(A.T.C.C. 8047)로부터 얻은 외곽막 제제에 관하여 위에서 설명한 대로 ELISA법으로 클론화한 Pa3 IVC2세포주에서 얻은 배양 상징액을 분석하였다. 항체 Pa3 IVC2는 피. 에루기노사 휘셔 면역타입 2, 6 및 7의 외곽막 제제에 결합되었고 다른 휘셔 면역 타입, 피. 오우레오패시엔스나 케이. 뉴모니에에는 결합하지 않았다.

항체 Pa3 IVC2에 의하여 확인된 특수항원을 방사선 면역 제제로 확인했다. 간단히 말해서, 이 분석은 Pa3 IVC2 항체와 불용성인 항체 : 항원 복합체를 형성하게 되는 단백질 A의 미립자원으로 방사선 라벨 표시가 된 항원을 배양시키는 것이 포함된다. 이들 복합체를 어떤 비특수성의 결합항원을 제거하기 위해서 세척한 다음 그 복합체를 폴리아크릴 아미드겔 속에서 해리시켜 분리하였다. 그 겔에서 찾아낸 우수한 방사성의 종을 항체 Pa3 IVC2가 결합하는 그 상응하는 항원(들)인 것으로서 확인했다. 가용성 피. 에루기노사휘셔 면역타입 2, 3, 4 및 5의 외부막 제제들의 부분표본(25μg)을 요도-겔을 사용하는¹²⁵I가 들어있는 고체상에서 방사선 라벨표시를 했다(일리노이주, 록폴드, 피스케미칼 캄파니)(후레이커 및 스펙, 1978 생화학 및 생물리학 연구위원회, 80 : 849-857 : 마크웰과 폭스, 1978, 생화학, 17 : 4807-4817). 이 공정은 결국 외부막 제제들에 함유된 모든 단백질이 아니라면 대부분의 노출된 티로신 잔류물을 요오드화했다.

항체 Pa3 IVC2에 외부 막 항원들의 비특징적 결합을 줄이기 위하여 방사선 라벨 표시된 제제들(5×10⁶카운티/분/분석)을 먼저 BALB/C 정상 생쥐 혈청(1 : 40 최종희석)으로 4℃에서 1시간 동안 배양시켰다. Pa3 IVC2 항체를 함유하는 Pa3 IVC2 배양 상징액 (0.5ml)을 그때 각각의 외부막 시료에 첨가했다. 항원과 항체를 1시간 동안 4℃에서 배양시킨 후, 단백질 근원, IgGSORB(0.095ml/시료)(마이아미주, 보스톤, 더 엔짐센터 인크)를 첨가하여 다시 30분간 4℃에서 배양했다(케슬러, 에스. 더블유 1975 면역학지, 115 : 1617-1622). IgGSORB를 거쳐 제조자의 제조명세서에 따라 제조하고 비특성 반응을 이용하기 직전에 RPMI-잡종(HAT를 제외한 RPMI-잡종-HAT 배양기)으로 IgGSORB를 두번 세척하여 배지로 잠재적인 반응성부위를 차단시켜서 보호한다.

항원-항체-IgGSORB복합체들을 1500×g으로 10분간 4℃에서 펠릿화하여 인산염 -RIPA 완충액(10mM 인산염, pH 7.2, 0.15M Nacl, 1.0%[v/v]트리톤 ×-100, 1.0g[w/v]소듐디옥시클로레이트, 0.1%[w/v]소듐 도데실 슬페이트[SDS], 와 1.0%[v/v]아프로티닌)으로 두번 세척하고, 고염도 완충액(0.1M 트리스-HCl, pH 8.0, 0.5M LiCl, 1%[v/v]베타-머캅토 에타놀)로 두번 세척하여 용해질 완충액(0.02M 트리스-HCl, pH 7.5, 0.05M Nacl, 0.05%[v/v]노니데트 p-40)으로 1번 세척했다(로트 슈네이드등의, 1979, 프로세스포 내쇼날 아카데미 소사이어티, 미국, 76 : 4479-4483).

복합체에 결합된 항원시료 완충액, (0.125M 트리스-HCl, pH 6.8, 2%[w/v]SDS, 2%[v/v]베타-머캅토에타놀 및 20%[v/v]글리세롤)으로 95℃에서 10분간 배양시켜서 방출시키고 10분간 1500×g으로 원심분리후 상징액에서 수거하였다.

그다음 그 시료 상징액을 한코크와 카레이(1979, 저널 박테리올, 140 : 902-910, 여기에 참고로 소재)에 의해 변형시킨 바와 같은 비.루그텐베르그 등의 방법(1978 FEBS 레트, 58 : 254-258)의 방법에 따라 제조한 SDS를 함유하는 14% 폴리아크릴 아미드 겔에 공급하고 50v 일정 전압으로 하룻밤 전기 영동시켜서 그 겔에서 항원을 분리해 냈다. 40%(v/v)메타놀, 10%(v/v)초산 및 5%(v/v)글리세롤에서 하룻밤 동안 그 겔을 고정시킨 후, 그것을 비오라드 겔건조기(켈리포니아 리치몬드)를 통하여 왓트만 3MM 페이퍼에서 건조시켰다. 그 건조시킨 겔을 플라스틱 랩으로 덮고 코닥 X-AR 필름에 18시간 동안 실온으로 노출시켰다.

이 실험의 결과는 Pa3 IVC2는 피. 에루기노사 휘셔 면역타입 2만의 외부 막 제제내에 있는 단하나의 항원에만 결합하고, 다른 외부막 제제에 존재하는 어떤 항원에도 결합하지 않는다는 것을 예증해주었다. 그 겔에 있는 항원의 분자량(MW)는 동일한 겔에서 분리시킨¹⁴C-라벨 표시된 표준 단백질(포스포릴아제 B, 92,500분자량 ; BSA, 69,000 분자량 ; 오발부민, 46,000분자량 ; 카보닉안하이드라제, 30,000분자량 ; 시토크롬 C 12,000MW)(마이아미주, 보스톤시, 뉴잉글랜드 뉴클리어)의 것과 그 운동성을 비교하여 측정한 바로는 약 53,000달톤이었다. 이 항원의 분자량은 편모의 분자량과 관련이 있고, 그 단백질은 몬티에등이 보고하고 (1982, 면역 및 감염, 35 : 281-288)여기에 참고로 소개한 바와 같은 피. 에루기노사의 편모로 구성되어 있다.

이외에도, Pa3 IVC2를 에타놀로 96-웰 미세적정 플레이트에 고정시킨 피 . 에루기노사 Habs 균주들 1-12(A.T.C.C. 33348-33359)를 사용하여 ELISA로 시험했다. 항원 플레이트를 다음과 같이 제조했다.

하룻밤 동안의 각각의 세균의 육즙 배양물을 펠렛화하고, PBS로 두번 세척한 다음 PBS에 0.2 O.D 유니트의 A660까지 재현탁시켰다. 희석시킨 박테리아를 웰에 깔고 (50μl/웰) 실온에서 15분간 1500×g으로 원심분리시켰다. PBS를 흡인시킨 다음 에타놀(95%)을 실온에서 15분간 그 웰들에 첨가했다. 에타놀을 그 웰에서 틀어낸 후 그 플레이트를 공기 건조시킨 다음 덮혀서 사용시까지 4℃로 보관했다.

위에서 설명한 바와 같이 실시한 ELISA 시험의 결과는 Pa3 IVC2는 에타놀-고정된 Habs 균주 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 및 12에 결합된 것으로 나타났다. 이런 특수성의 패턴은 Pa3 IVC2가 피. 에루기노사의 타입 b편모에 결합했음을 지적하는 것이다(안소르그, 알. 1978, Zbl, Bakt, Hyg. I. Abt. Orig. A. 242 : 228-228 ; 안소르그, 알등의 1984 임상학적 미생물잡지 20 : 84-88, 둘다 참고로 여기에 소개). 단일클론의 Pa3 IVC2에 대한 이런 특수성의 지적을 기준하면, 피. 에루기노사 대조균주들, 휘셔 면역타입 2, 피셔 면역타입 6 및 휘셔 면역타입 7은 타입 b 편모를 하고 있다. 전술한 실험데이타로부터, Pa3 IVC2는 특별히 피. 에루기노사 편모 타입 b에 결합한다는 결론이 지워진다.

Pa3 IVC2의 생체내 보호작용

단일클론항체 Pa3 IVC2가 살아있는 피. 에루기노사 박테리아의 복합 LD 50의 값으로 도전한 생쥐를 보호하게 되는가를 결정하고져 동물실험을 실시했다. 선택된 모델은 화상당한 쥐 모델이었다(콜린, 엠.에스.와로비, 알.이. 1983 저널 트로머(외상), 23 : 530-534, 여기에서 참고로 소개). 본 명세서에서 화상당한 쥐는 에루기노사 감염된 쥐를 의미한다. 생쥐의 그룹은 그 저자의 공적 성적표에 따라 심하게 화상당한 것을 택한 다음 즉시 5-10 LD 50의 값의 휘셔 면역타입 7로 도전시켰다. 화상당하게 하고 도전시키기 전에 고역가를 나타내는 복수(0.2ml복강내로)로서 단일클론항체를 복강내 투여했다. 항체를 받지 않은 것과 비교하여 Pa3 IVC2로 처리된 동물에서는 생존수가 증가되지 않은 것으로 관찰됐다.

[실시예 2]

실시예 2는 생체내에서 보호성이 있는 피. 에루기노사 편모 타입 b에 대해 쥐의 단일클론 항체를 생성하는 쥐의 잡종종양 세포주의 제조방법을 설명한 것이다.

성숙한 암놈의 BALB/C 생쥐들을 살아있는 피. 에루기노사 휘셔 면역타입 6(A.T.C,C. No. 27317)(8×10⁶세균수)로 복강내로 먼저 주사한 다음 두주일후 살아있는 피. 에루기노사 휘셔 면역타입 5(A.T.C.C. No. 27316)(4×10⁶세균수)로 주사하였다. 계속하여 2주 동안, 살아있는 피. 에루기노사 휘셔 면역타입 5와 휘셔 면역타입 6를 함께 주 일회씩 두주내에 투여했다. 최종 투여량이 최초 투여량보다 10배가 되도록 각 세균의 1회 투여량을 증가시켰다. 알.이.더블유.한콕크와 에이취.니카이도의 방법(1978 저널.박테리올., 136 : 381-390)에 따라 제조한 피. 에루기노사 휘셔 면역타입 6외부막 제제(50μg 단백질)의 최종주사를 마지막 살아있는 박테리아 주사후 5일만에 실시했다. 마지막 면역후 3일만에 비장을 한마리의 생쥐에서 떼내서 비장세포를 실시예 1에서 설명한 대로 잡종 번식용으로 제조했다. ELISA 플레이트용 항원이 96-웰 미립 적정 플레이트의 웰내에서 면역된 살아있는 박테리아인 것을 제외하고는, 실시예 1에서 언급한 공정들에 따라 10일후의 -융합에 관하여 ELISA에 의한 항-피. 에루기노사 항체의 존재를 확인하기 위해서 잡종 종양세포의 배양 상징액들을 분석하였다.

50마이크로리터 폴리-엘-리신(PLL)(1μg/ml의 PBS용액)(미조리주, 세인트루이스, 시그마 # P-1524)을 96-웰 플레이트(린브로)의 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분간 배양하였다. 비 흡착된 PLL을 틀어내고 그 웰을 PBS로 세번 세척했다. TSB에서 하룻밤 생육시킨 박테리아 배양액을 PBS로 한번 세척한 다음 O.D. 660nm= 0.2까지 PBS에 재현탁시켰다. 박테리아 현탁액 50마이크로리터를 그 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 결합되도록 했다. 미결합된 박테리아를 그 플레이트를 틀어서 제거한 다음 염수-트윈(0.9%[w/v]NaCl, 0.05%[w/v]트윈-20)으로 3회 세척하였다.

항체의 특수성이 없는 결합은 그 웰에 차단 완충액(5%[w/v]비-지방 건조밀크, 0.01%[w/v]안티폼 A[미조리주, 세인트루이스 시그마]와 0.01%[w/v]티메로솔) 200μl/웰을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양시켜서 보호했다. 과잉 보호되는 완충액은 제거하고 그 웰들을 앞서 설명한대로 식염수-트윈으로 3회 세척했다.

배양 상징액(50μl)을 분석 플레이트들의 그에 상응하는 웰에 반복하여 판상으로 깔고 30분간 실온에서 배양시켰다. 그 배양 상징액을 그 플레이트들을 틀어서 제거하고 그 웰들을 식염수-트윈으로 5회 세척했다.

효소-접합시킨 제2단계 항체(고추냉이 과산화수소효소-접합시킨 양 항-생쥐 IgG+IgM)(캘리포니아블링감, 타고 인크.)를 앞서 측정한 적정법에 따라 0.1%(v/v)트윈-20과 0.2%(w/v) BSA를 함유하는 PBS로 희석시킨 다음 50μl의 시약을 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분간 배양시켰다. 과잉의 시약을 제거하고 ; 웰들을 식염수-트윈으로 5번 세척하고 ; 100μl/웰의 0-페닐렌디아민 기질을 첨가하여 실시예 1에서 설명된 바와 같이 30분간 배양시켰다. 실시예 1에서 언급한 바와 같이 반응을 종료한 다음 BiO-Tek EL-310 자동화 EIA플레이트 기록계에 의하여 A 490nm에서 읽었다.

상기 설명한 방법으로, 융합에서 얻은 배양 상징액을 피. 에루기노사 휘셔 면역타입 1, 2, 3 혹은 4에는 결합하지만, 동일한 PLL과 보호공정으로 제조된 조정 플레이트에는 결합하지 않으며 그러나 박테리아가 없는 항체의 존재에 관하여 분석했다. 이들 4가지 휘셔 면역 타입중 어느것에 결합된 항체를 함유하는 상징액을 7개의 휘셔 면역타입 박테리아의 각각을 별도로 사용하여 제2회째 분석을 했다. 한개의 웰에서 얻은 상징액에 존재하는 항체, PaF4 IVE8은 피. 에루기노사 휘셔 2.6 및 7에만 결합했다. 웰 PaF 4 IVE8에서 나온 세포들은 실시예 1에서 설명한 바와 같은 희석 방법을 제한시켜서 클론화하였다. 이 웰에서 얻은 단일클론항체와 클론 세포주는 둘다 다음 텍스트에서 명명한 PaF4 IVE8에 의하여 확인되었다. 고역가의 단일클론항체-함유 복수역을, BALB/C 생쥐들을 CB6F1 대신에 사용한 것외에, 실시예 1에서 설명한대로 만들었다.

PaF4 IVE8의 특수성

단일클론항체 PaF4 IVE8(ATCC HB 9129, KFCC 10484, 1988. 1. 4.에 한국종균협회 기탁)에 의하여 결합된 항원을 확인하기 위해서 실시한 한가지 분석은 박테리아성 세균에 관하여 직접적인 면역형광이었다.

피. 에루기노사(PA 103, A.T.C.C. 29260, 레이프손, 1951, 저널 박테리올, 62 : 377-389)과 대장균(G.S.C. A25)의 비편모 균주를 포함하여 피. 에루기노사중의 7가지 대조 휘셔 면역타입의 각각을 TSB에서 37℃로 하룻밤 생육시켰다. 그 박테리아를 원심 분리시켜 펠릿화한 다음 PBS로 두번 세척했다. 각 균주를 O.D. 660nm=2.2까지 PBS에 재현탁시켰다.

그다음 그 박테리아 현탁액을 다시 1 : 150으로 희석시키고 20μl의 시료를 칼손 슬라이드(칼손 사이언티픽 인코포레이션, 일리노이주 피오톤)의 각각의 웰에 놓고 40℃로 그 슬라이드를 건조시켰다. PaF4 IVE8(ATCC HB 9129, KFCC 10484)의 배양 상징액 (25μl)을 습도 조절실내의 슬라이드에 있는 건조된 박테리아 시료에서 실온으로 30분간 배양시켰다. 미결합된 항체를, 증류수에 그 슬라이드를 담구어서 씻어냈다.

슬라이드를 건조후, 형광 이소티오시아네이트(FITC)-접합 양 항-생쥐 IgG+ IgM(PBS로 25μl웰의 1 : 40로 희석)(켈리포니아 블링감, 타고)을 그 슬라이드상에서, 어두운 습도 조절실내에서 실온으로 30분간 배양시켰다. 슬라이드를 다시 증류수로 세척하고 건조한 다음 글리세롤의 PBS용액(9 : 1)로 덮힌 덥게 유리로 덮었다. 슬라이드들을 형광 현미경으로 관찰했다.

형광 염색을 피. 에루기노사 휘셔 면역타입 2, 6 및 7에 관하여서만 관찰하고 세균의 한쪽끝에서만 나타나는 우묵한 형태(선)인가를 관찰했다. 이것은 이들 박테리아의 단일 극편모의 형태 및 위치와 일치했다.

편모와 PaF₄IVE8(ATCC HB 9129, KFCC 10484)의 반응은 면역 반점 분석으로 확인했다. 피. 에루기노사 휘셔 면역 타입 6에서 나온 외부막 항원 (실시예 1)을, 전기영동이 80m Amps일정 암페어수로 5시간동안 실시되는 것외에, 실시예 1에서 설명한대로 SDS를 함유하는 14% 폴리 아크릴 아미드겔로 전기영동시켜 분리했다. 미리 염색된 분자량 표시물들(리소짐, 14,300(MW ; 베타-락토글로불린, 18, 400MW ; 일파-키모트립시노겐, 25,700MW ; 오발부민, 43,000MW ; 소의 혈청 알부민, 68,000MW ; 포스포릴라제 B, 97,400MW ; 및 미오신, 200,000MW)(BRL, 메릴랜드주, 게이터스버그)이 동일한 폴리아크릴아미드 겔내에 포함된다.

항원들을 폴리아크릴아미드 겔에서 0.05%(w/v) SDS를 함유하는 트리스-글리신-메타놀 완충액(토우빈등(1979), 프로세스 포 네쇼날 아카데미 사이언스, 미합중국, 76 : 4350-4354)중의 니트로 셀루로즈막(NCM)(0.45μm, 슈레이져 앤드 슈엘 인코포레이션, 뉴햄프셔, 킨)으로, 4C에서, 200mA의 일정한 암페어수로 하룻밤 동안 전이시켰다. 전이후, NCM을 0.05%(v/v) 트윈-20의 PBS(PBS-트윈)용액(베테이거, 비. 등의, 1982, 면역학적 방법잡지, 55 : 297-307)에서, 1시간 동안 실온으로 배양시켰다. 이 과정 및 모든 후속과정 동안, NCM을 함유한 접시를 전체 NCM위에 용액이 확실히 분산되도록 흔들리는 플랫폼에 놓았다.

1시간 후, PBS-트윈 용액을 따루어내고 PaF4 IVE8(ATCC HB 9129, KFCC 10484)복수(PBS-트윈으로 1 : 1000으로 희석)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 NCM으로 배양시켰다. 그다음 NCM을 미결합된 항체를 제거하기 위하여 PBS-트윈으로, 각 5분간씩 5회 세척했다. 알카리성 포스파타제-접합된 양의 항생쥐 IgG+IgM(타고인크)을 제조업자의 명세서에 따라 희석시키고 NCM으로 1시간 동안 실온에서 배양시켰다. NCM을 위에서 설명한 바와 같이 5회 세척하고 리아티등이 설명한 것처럼 제조한(1983 프로세스포내쇼날 아카데미 소사이어티, 미합중국, 80 : 4045-4049) 브로모클로로인들릴인산염과 니트로블루테트라졸륨(미조리주, 센트루이스, 시그마)을 함유하는 기질을 첨가하고 실온에서 10-20분간 배양시켰다. 증류수로 기질을 세척해내고 반응을 종료했다.

이 실험의 결과는 PaF4 IVE8가 특별히 외부 막 제제내에서 53.000달톤의 분자량을 가진 단일 항원에 결합되는 것으로 나타났다. 직접 면역 형광 분석과 면역반점 분석의 결과는 PaF4 IVE8가 피. 에루기노사의 편모 결합하는 것으로 나타났다.

PaF4 IVE8(ATCC HB 9129, KFCC 10484)이 인식된 편모타입을 ELlSA로 측정했다. Habs 균주들, 1-12(A.T.C.C. #33348-33359)는 PLL과, 이 실시예의 앞에서 설명한 바와 같이 실시된 ELISA가 들어있는 96-웰 미세-적정 플레이트(린브로)의 웰들에 각각 결합되었다. PaF4 IVE8(ATCC HB 9129, KFCC 10484)항체의 출처는 배양 상징액이었다. 양성 반응들은 Habs 균주 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 및 12를 함유하는 웰들내에서 나타났다. 그래서 PaF4 IVE8(ATCC HB 9129, KFCC 10484)은 타입 b편모에 결합한다는 것을 시사한다. 생체내 보호데이타는 아래의 실시예 4에 나타나 있다.

[실시예 3]

실시예 3은 항-피. 에루기노사 판모형태 a와 반응하여 생체내에서 보호되는 단일클론 항체를 생성하는 쥐과의 하이브리도마 세포주를 제조하는 방법을 나타내고 있다.

융합을 위한 임파성 세포원은 햅스 균주 6과 8(A.T.C.C. # 33353과 33355)로부터 얻은 정제된 형태 a편모(10-20μg 단백질)를 6주이상 동안 4번에 걸쳐 복강내로 주사해서 면역시킨 BALB/C 쥐로부터 얻은 비장이었다. 편모를 3시간 동안 40,000×g 대신에 1시간 동안 100,000×g에서 최종원심분리한 것을 제외하고는 티.시.몬티에 등의 방법(1982, Infect. Immun., 35 : 281-288)에 따라 편모를 정제했다. 어떤 공정에 채택된 두번째 변형은 3분 보다는 혼합기에서 30초 동안 세균으로부터 편모를 절단하는 것이다.(알리손등, 1985, Infect. Immun. 49 : 770-774).

각 조제의 단백질 농도는 바이오-라드 단백질 분석(바이오-라드, 리치몬드, CA)으로 결정하고 지질다당류(LPS)를 오염시키는 존재는 KDO 함유량을 측정하여 분석했다(카르카니스, 와이.디. 등 1978, Anal. Biochem., 85 : 595-601).

편모단백질의 분자량은 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서의 이동과 표준단백질 표식(BRL)의 이동을 비교하여 결정했다(실시예 2 참조). 햅스 6 편모의 분자량은 51,700달톤이었으며 햅스 8의 분자량은 47,200달톤이었다. 이 값들은 제이.에스.알리손 등에 의해 얻어진 값(1985, Infect. Immun., 49 : 770-774)과 동일했다.

플라겔린(flagellin)이 면역된 쥐의 비세포와 NS-1 골수종세포의 융합은 실시예 1과 2에서 나타낸 것처럼 최종면역한지 3일후에 실시했다. 하이브리도마 세포가 거의 40% 군집으로 성장했을 때(7일), 배양균 상징액을 그에 상응하는 3개의 다른 항원 플레이트 웰(well)인, PLL-결합된 피. 에루기노사 피시어 면역형태 1(제조는 실시예 2 참조)와 포르말린 고정된 햅스 6 및 햅스 9 속으로 븍사-살포했다.

포르말린 공정된 항원 플레이트에서 성장한 세균을 세척하고 PLL-결합된 항원 플레이트에 대해 언급한 것과 같이 희석했다. 희석된 세균(A 660에서 0.2 O.D. 단위)을 각각 린브로 96-웰 마이크로-타이허 플레이트의 웰(웰당 50μl)에 첨가한 다음 그 플레이트를 실온에서 20분 동안 1200×g에서 원심분리시켰다. 상징액을 웰에선 가볍게 덜어내고 PBS에 있는 0.2%(v/v)포르말린 75μl를 각 웰에 첨가하고 실온에서 15분 동안 배양했다.

포르말린을 웰에서 가볍게 덜어내고 플레이트를 공기 건조시키고 사용할 때까지 4℃에서 저장했다. 포르말린-시험된 유기체를 접합시키는 항-편모항 혈청의 능력에 의해 나타난 바와 같이 포르말린은 편모의 항원성을 변형시키지 않는다.(라니, 비., 1970, Acta Microbiol. Acad. Sci., 훈그., 17 : 35-48). 피. 에루기노사 피시어 면역형태 1균주는 착색염료로 염색함으로써 나타난 바와 같이 편모가 없기 때문에 대조 표준으로 삼았다.(Manual of Clin. Microbiol., 1985, 레네테, ed. Amer. Soc. Microbiol., 와시., 디.시., 피. 1099). 웰속에 있는 FA6 IIG5(KFCC-10485로 1988년 1월 4일 한국종균협회에 기탁)로 지정된 하이브리드 세포는 햅스 6과 햅스 9(편모형태 a를 갖는 균주)에는 결합하지만 피시어 면역형태 1에는 결합하지 않는 항체를 생성했다.

웰로부터 얻은 FA6 IIG5(ATCC HB 9130, KFCC 10485, 1988. 1. 4. 한국종균협회에 기탁) 세포를 2차 배양하고 앞의 실험에서 서술한 바와 같이 클로운화시켰다. 이 웰로부터 온도단일클론항체와 클론세포주 두개를 다음 본문에서 FA6 IIG 5으로 명명했다. BALB/C 쥐는 실시예 2에서 서술된 복수(腹水)를 생성했다.

FA6 IIG5의 특성

항체 FA 6 IIG5(ATCC HB 9130, KFCC 10485, 1988. 1. 4. 한국종균협회에 기탁)의 특성은 2차 면역형광법과 이뮤노블럿팅법(immunoblotting)에 의해 결정했다. 2차 면역 형광법은 다음의 변형과 함께 실시예 2에서 서술된 것으로 반드시 행했다.

30℃의 트립티케이스 콩한천 배지상에서 하룻밤 성장시킨 세균배양을 면솜으로 플레이트에서 제거하여 PBS에서 0.2 O.D단위의 A660까지 재현탁시켰다. 와동시키면서 포르말린(PBS 최종농도의 0.37%[v/v])을 현탁액에 첨가했다. 실온에서 15분 동안 배양한 다음 세균을 PBS에시 1 : 12로 희석하고 이 현탁액 20μl를 칼손(Carlson)슬라이드의 각각의 웰에 놓았다. 건조시킨 다음, 실시예 2에서 서술된 바와 같이 관찰하기 위해서 슬라이드를 준비했다. 항체원은 FA6 IIG5 세포주로부터 얻은 배양균 상징액이었다.

FA6 IIG5(ATCC HB 9130, KFCC 10485)항체에 의한 형광염색은 형태 a 편모를 함유한 피. 에루기노사 균주에서만 관찰되었으며 형태 b편모를 함유하는 것에서는 없었다. 관찰된 형광성 형태는 FA6 IIG5가 편모에 결합되어 있는 것을 나타내는 정현주이였다. 형광시그날은 세균을 포르말린으로 처리함으로써 향상될 수 있으나 이 처리가 항체를 갖는 편모염색을 관찰하는데 요구되지는 않는다.

이뮤노블랏팅은 실시예 2에서 서술된 바와 같이 행해졌다. 편모 형태 a항원의 근원은 정제된 편모 조제였다(본 실시예를 참조). 항원은 SDS가 포함된 10% 폴리아크릴아미드겔에서 분리하고 (라엠리, 유.케이., 1970 Nature [London], 227 : 680-685), NCM으로 옮겼다. 배양균 상징액이나 또는 1 : 1000으로 희석된 복수인 FA6 IIG5(ATCC HB 9130, KFCC 10485)의 조제를 NCM과 반응시키고, 그 반응을 적절한 효소가 결합된 시약과 실시예 2에서 서술된 효소 기질로 감지했다. 이뮤노블랏은 FA6 IIG5(ATCC HB 9130, KFCC 10485)가 햅스 6의 51,700MW 편모와 햅스 8의 47,200MW 편모에 특수하게 결합하고 있음을 나타내었다.

FA6 IIG5(ATCC HB 9130, KFCC 10485)가 편모형태 a와만 반응하며 형태 b와는 반응하지 않는 다는 것은 ELISA에 의해 확인되었으며, 여기서 햅스균주 1-12는 PLL과 함께 각각 96-웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트의 웰에 결합했다. 항체는 12개의 균주중 단지 편모 형태 a를 갖는 균주인 햅스균주 1, 6, 8 및 9에만 결합했다.(참조, 안소르그, 알. 등, 1984 J. clin, Microbiol., 20 : 84-88). 생체내에서의 보호연구는 다음의 실시예 4에 나타내었다.

[실시예 4]

실시예 4는, 화상 당한 쥐 모델에서 피. 에루기노사의 공격에 대해 PaF4 IVE8(ATCC HB 9129, KFCC 10484) 항체와 FA6 IIG5(ATCC HB 9130, KFCC 10485) 항체로 수동적으로 면역된 쥐의 보호를 나타내고 있다.

항-편모 단일클론 항체는 화상당한 쥐 모델에서 엠.에스.콜린과 알.이.로비의 방법에 따라 시험했다(1983 J. Trauma, 23 : 530-534). 보호 연구를 하기 위해서, 모든 항체를 단백질 A-세파로스 크로마토그래피로 정제하고(에이.피.엘 등, 1978, mmunochemistry, 15 : 429-436) PBS 완충액속으로 투석했다. 동물시험에 사용된 편모형태 a를 함유한 균주는 피. 에루기노사 PA220(제임스 페닝톤 박사로부터 얻음, 보스튼 MA)이었으며 편모형태 b 균주는 참조 피. 에루기노사 피시어 면역형태 2(A.T.C.C #27313)이었다.

화상을 입히기 한시간 내지 2시간 전에 정맥내로 쥐당 미생물 40개의 정제된 단일클론 항체를 매투여하고 공격을 했다. 화상후, 즉시, 동물들에게 공격 세균이 포함된 차가운 PBS 서버에스카(subeschar)를 주었다. 공격투여량은 각 미생물에 대해 약 10 LD 50 이었다. 동물시험의 결과가 표 I과 표 II에 나타나있다.

[표 1]

1. 쥐는 거의 10 LD₅₀의 피. 에루기노사 PS 220으로 공격받은 서브에스카(subeschar)이다.

2. 퍼센트는 PBS 대조표준 집단을 제외하고, 5마리의 쥐로 구성되는 10개의 동물집단에서의 쥐의 생존수를 기초로 했다. 날짜는 화상입힌후 공격을 한 것이다.

[표 2]

1. 쥐는 거의 10 LD₅₀의 피. 에루기노사 피시어 면역형태 2로 공격받은 서브에스카(subeschar)이다.

현저하게 생존을 나타낸 쥐는 항-a 항체나 항-b 항체로 처리된 다음 그에 상응하는 항원의 공격을 받은 것이었다. 역으로, 처리되지 않고 공격을 받은 쥐나 적합하지 않은 항편모 단일클론 항체 또는 비특이성 항-LPS 항체로 처리된 동물의 80-90%가 죽었다. 피. 에루기노사 피시어 면역형태 2를 함유한 편도형태 b의 치명적인 도전으로부터 쥐를 보호하는데 있어 항-편모형태 a 항체가 무능력하다는 것과 피. 에루기노사 PA 220를 갖는 편모형태 a의 치명적인 도전으로부터 쥐를 보호하는데 있어 항-편모형태 b 항체가 무능력하다는 것은 시험관내에서 관찰된 항체의 특성을 생체내에서 확인한 것이다. 화상은 당했으나 감염되지 않은 쥐가 생존했다는 것은 화상 그 자체가 치명적인 것은 아님을 가리킨다.

[실시예 5]

실시예 5는 피. 에루기노사 감염의 면역요법에 있어 항체의 임상적 유용성을 가리키는 피. 에루기노사 임상분리물과 PaF4 IVE8(ATCC HB 9129, KFCC 10484) 및 FA6 IIG5(ATCC HB 9130, KFCC 10485)과의 광범위한 교차 반응성을 나타낸다.

임상분리물은 병원과 진료소로부터 얻었다. 분리물은 여러 분리부위 즉, 혈액, 상처, 기도, 요(尿) 및 귀로부터 얻었다. 총 157개의 분리물을 시험했다.

157개의 분리물중 총 136개의 분리물(87%)에 대하여서, PaF4 IVE8은 34개의 임상분리물에 특징적으로 결합(22%)한 반면에, 편모형태 a 항체인 FA6 IIG5는 102개의 임상분리물에 결합(65%)했다. 어떤 항체에 의해서도 인식되지 않은 21개 균주중 19개는 착색염료 염색법에 의해 편모가 없는 것으로 나타났다. 따라서, 두항체가 편모가 있는 임상분리물 138개중 136개(98%)에 결합했다는 것은 이전의 연구를 확증하는 것이다(참조, 알, 안소르그, 1978, Zbl, Bakt Hyg., I. Abt. Orig. A, 242 : 228-238).

[실시예 6]

실시예 6은 피. 에루기노사 형태 b 편모에 결합하는 사람의 단일클론 항체를 생성하는 방법을 나타내었다.

고분자량의 다당류조제(피어등., 1984, Infect. Immun., 45 : 309)로 면역된 사람으로부터 취한 말초혈액 샘플이 B세포원으로 사용되었다. 피콜-파그상의 표준 원심분리법(보윰(1968) Scand. J. Clin. Lab. Invest., 21 : 7)에 의해서 혈액으로부터 단핵세포를 분리하고 칼슘/마그네슘이 없는 인산염으로 완충된 염류(PBS)에서 두번 세척했다.

단핵세포는 변형된 E-로제팅(rosetting) 공정으로 T-세포를 고갈시켰다. 간략하게 말하면, 세포를 4℃에서 먼저 20%의 태아종아리 혈청을 포함하는 PBS에서 1×10⁷세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 그다음 이 현탁액의 1ml를 17×100mm 폴리스티렌의 바닥이 둥근 튜브에 넣고, 여기에 이스코브의 변형된 둘베코 배양기(이스코브의 배양기)(매드센과 존슨(1979) J. Immun. Methods, 27 : 61)에 있는 10%(v/v) 용액으로부터 얻는 1×10⁹의 2-아미노-이소티오우로니움 브로마이드(AET) 처리된 양의 적혈세포를 첨가했다. 현탁액을 4℃에서 5-10분 동안 매우 천천히 혼합한 다음 4℃의 2500×g에서 8분 동안 피콜-파규상에서 원심 분리 시켜서 E-로제트된 세포를 분리했다. 계면에서 띠모양을 하고 있는 E-로제트 음성 말초혈액 단핵세포(E-PBMC)를 수거하고 이스코브의 배양기에서 한번 세척한 다음 15%(v/v) FCS, L-글루타민(2mmol/l), 페니실린(100IV/ml), 스트렙토마이신(100μg/ml), 하이포잔틴(1×10^-5M), 아미노페트린(4×10^-7M) 및 티미닌(1.6×10^-5M)이 포함된 PBS에서 재현탁했다. 이 배양기는 이하에서 HAT-배양기라고 한다.

E-PBMC의 세포-드라이번(driven) 형질전환은 이들 세포를 형질전환 세포주와 함께 공동배양시켜서 얻었다. 형질전환 세포주는 GM 1500 임파구 세포주를 에틸 메탄-설포네이트(ENS) 돌연변이시킨 다음 30μg/ml 6-티오구아닌 존재하에서 선택하여 세포를 히포크산틴-구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT)가 부족하게 함으로써 HAT 민감성을 갖게 유도된 엡스테인-바(Epstein-Barr) 핵항원(EBNA) 양성 사람의 임파구 세포주이다. 이 세포주는 1A2 세포주라고 명명하고 1982년 3월 29일 A.T.C.C.번호 CRL 8119로 미국균주보존협회(A.T.C.C.)에 기탁했다. 대수증식기에 있는 1A2 세포를 HAT-배지에서 현탁시킨 다음 PBMC당 15배율의 1A2 세포를 E-PBMC와 결합시켰다. 세포혼합물을 웰당 200μl의 체적에서 32,000세포/웰 농도로 바닥이 둥근 96-웰 마이크로 타이터 플레이트(Costar 3799) 30개 속에 뿌리고 6% CO₂를 포함한 가습 대기중의 37℃에서 배양했다. 5일 및 8일 지난 플레이트상의 상징액 반을 신선한 HAT-배양기로 대치함으로써 배양균에 영양을 공급했다. 살포한지 16일후에, 웰이 모두 증식세포를 포함했고 웰의 대부분에서 세포들이 제거하기에 충분한 밀도였으며 항-피. 에루기노사 항체에 대한 상징액 시험에도 적합했다.

상징액의 항-피. 에루기노사 항체 존재여부를 알기 위해서 실시예 2에서 서술된 ELlSA법을 사용한 다음 변형시켰다. 7개의 피시어 면역형태 관련 균주(A.T.C.C.Nos.27312-27318)의 풀(pool)(A 660=0.2 O.D 단위)이 폴리-L-리신으로 전 시험된 바닥이 편평한 96-웰 마이크로타이터플레이트(Immulon II, Dynatech)에 결합하고 있었으며, 배양하고 실시예 2에서 서술된 바와같이 세척했다. 비특이성 결합 부위를 차단한 후 플레이트를 세척하고, 0.1%(v/v)의 트윈-20과 0.2%(w/v)의 BSA를 포함한 PBS 50μl를 웰당 첨가했다. 그다음 배양 상징액(50μl)을 이에 상응하는 분석 플레이트의 웰속으로 복사-플래이팅하고 PLL로 처리되고 차단되었으나 세균을 포함하지 않은 대조표준 플레이트속에도 복사-플레이팅했다. 배양한 다음 세척하고, 효소가 결합된 두번째 단계의 항체(웰당 50ml). 양고추냉이 과산화물이 결합된 염소 항-사람의 IgG 및 0.1%(v/v) 트윈-20과 0.2%(w/v) BSA가 첨가된 PBS에서 적당히 희석된 염소항-사람의 IgM을 웰에 첨가하고 실시예 2에서 나타낸 바와같이 분석했다.

피시어 면역형태의 풀(pool)에 결합하지만 대조표준 플레이트에는 결합하지 않은 항체를 포함한 상징액을 각각 7개의 피시어 면역형태 세균을 사용하여 두차례 분석했다. 한 웰로부터 얻은 상징액에 있는 항체인 20H11은 단지 피. 에루기노사 피시어 면역형태 2와 6 및 7에만 결합했다. 성장 세포를 갖는 모든 웰이 항체를 분비할때까지 세포밀도를 저하시키면서 반복해서 세포를 2차 배양 했다. 세포주와 단일클론 항체(IgM동형상)는 모두 다음의 본문에서 20H11로 명명했다.

두번째 형질전환에서, B세포원은 만성적인 피. 에루기노사 감염으로 알려진 남포섬유증 환자의 말초 혈액으로부터 얻어서 행했다. E-PBMC's는 상기 한다고 제조했으며 형질전환 세포주인 1A2와 E-PBMC당 72 1A2 세포의 비율로 공동 배양했다. 세포 혼합물을 웰당 7.4×10×세포의 농도로 바닥이 둥근 96-웰 마이크로타이터 플래이터속에 뿌리고 상기한 대로 배양했다.

형질전환체를 플레이트한지 16일 후에 항-피. 에루기노사 항체의 존재 여부를 확인하기 위해서 상징액을 ELISA로 분석했다. 분석은, 처음의 스크리닝을 위해 사용된 피. 에루기노사 균주의 풀(pool)이 피시어 면역형태 관련균주, F2, F4, F6 및 F7(A.T.C.C.Nos.27313, 27315, 21316 및 27317)로 구성되며, 유전체계조합 유기체 은행(GSCOB)으로부터 얻은 상이한 LPS 면역형태와 편모형태를 갖는 임상 분리물을 제외하고는 앞의 형질전환에서 서술한 것으로 행해졌다. 임상분리물 PSA I277(GSCOB)는 형태 a 편모와 피시어 면역형태 1LPS를 함유하며 ; 두번째 분리물 PSA G98(GSCOB)는 형태 a 편모와 피시어 면역형태 3LPS를 함유하고 ; 세번째인 PSA F625(GSCOB)는 형태 b 편모와 피시어 면역형태 5LPS를 함유한다. 관련 균주와 임상분리물의 혼합물은 피. 에루기노사 편모가 있는 풀로써 언급될 것이다. 피. 에루기노사 편모가 있는 풀을 포함한 플레이트에는 결합하지만 PLL-피복된 대조표준 플레이트에는 결합하지 않는 항체가 포한된 상징액을 풀의 각균주상에서 2번 ELISA로 분석했다. 한웰인 3C1은 관련 균주 F2, F6 및 F7에 결합하고 임상분리물 F625에 결합했다.

3C1 세포주의 클로닝은 처음에는 96웰 플레이트의 웰당 20세포를 배양한 다음 웰당 2개의 세포를 배양해서 행했다. 특수한 항체 생성 세포의 정식클로닝은 아미놉테린이 없는 HAT-배양기(HT-배양기)의 10μl/well 체적에서 72-웰 테라사키 플레이트(Nunc # 1-36538)내 약 1세포/웰의 농도로 세폴르 플레이트하여 행했다. 이 플레이트를 배양기속에 2-3시간 동안 넣어두어서 세포가 바닥에 안치되게 한 다음 하나의 단 세포가 포함된 웰에 대해서 두사람이 현미경으로 기록했다. 웰에는 매일 HT-배양기로 영양 공급을 하였으며, 생성물이 현저할때 세포를 96-웰의 바닥이 둥근 플레이트로 옮겼다. 생성물을 갖는 모든 웰을 형태 b 편모를 갖는 피. 에루기노사 균주상에서 ELISA로 분석했으며, 모두 적절한 항체를 생성함이 발견되었다. 세포주와 단일클론 항체(IgM 동형상)는 둘다 다음의 본문에서 3C1으로 명명한다.

20H11과 3C1에 의해 확인된 항원은 간접적인 면역 형광법과 이뮤노블랏팅에 의해 밝혀진 편모이었다. 이 기술은 실시예 2와 3에서 서술된 것으로 기본적으로 행해졌다. 형태 b 편모를 갖는 피. 에루기노사 균주인 참조 피시어 면역형태 F2, F6 및 F7(A.T.C.C.Nos.27313, 27317 및 27318)을 형태 b 편모를 갖는 균주인 참조 피시어 면역형태 4(A.T.C.C.No.27315)를 분석하기 위한 간접적인 면역 형광분석은 실시예 3에서 서술된 것으로 행했다. 참조 균주의 편모형태는 쥐과의 단일클론 항체, PaF4 IVE8(ATCC HB 9129, KFCC 10484) 및 FA6 IIG5(ATCC HB 9130, KFCC 10485)으로 조사해서 결정했다. 슬라이드는 실시예 2에서 서술한대로 제조했다. 두 항체원은 배양균 상징액이며 FITC-결합된 시약은 방부제로써 0.5%(w/v)의 소의 감마 글로불린(Miles Scientific, Cat. No. 82-041-2, Naperville, IL)과 0.1%(w/v)의 소디움아지드가 첨가된 PBS에서 1 : 100으로 희석된 FITC-결합된 염소항-사람 Ig(다가임)(Tago, Burlingaml, CA)이었다.

20H11과 3C1 항체에 의한 형광염색은 형태 b 편모를 갖는 피. 에루기노사에서만 관찰되었으며 편모형태 a를 갖는 균주인 관련 피시어 면역형태 4에서는 관찰되지 않았다. 관찰된 형광형태는 항체가 세균의 편모에 결합했음을 나타내는 세균의 한끝에서 부터 방사하는 정현의 선모양이었다.

이뮤노블랏팅은 실시예 2에서 서술된 바와같이 행했다. 피. 에루기노사 참조균주 피시어 면역형태 2(A.T,C.C. No.27313)으로부터 얻은 정제된 형태 b 편모와 참조균주 햅스 6와 햅스 8(A.T.C.C. Nos.33353 및 33355)로부터 얻은 정제된 편모형태 b는 실시예 3에서 서술된 바와같이 제조했다. 10% 폴리아크릴아미드겔(실시예 3참조)에서 항원을 분리하고 NCM으로 옮겼다.

20H11이나 3C1 항체가 포함된 배양상징액과 비-특이성 사람의 항체가 포함된 배양상징액 및 배양균배지는 NCM으로 배양했으며 반응은 0.05%(v/v)의 트윈 20이 첨가된 PBS에서 희석된 알카리성의 포스파테제가 결합된 염소항-사람 Ig(다가임)(Tago, Burlingame, CA)로 감지한다. 효소기질은 실시예 2에서 서술한 바와같이 제조했다. 이뮤노블랏에서, 두개의 항체가 피시어 면역형태 2의 53,000MW 편모단백질에는 결합하지만 햅스 6의 51,700MW 편모단백질과 햅스 8의 47,200MW 편모단백질에는 결합하지 않는다는 것이 예증되었다. 비-특이성 사람의 항체나 배양균 배지에서는 어떤 반응도 관찰되지 않았다.

20H11 항체과 3C1 항체는 편모형태 b에만 결합하며 편모형태 a에는 결합하지 않는다는 부가적인 확증이 ELISA에 의해 얻어졌는데, 여기서 햅스 균주 1-12는 PLL과 함께 이뮬론 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 결합했다. 항체들은 편모형태 b를 갖는 균주인 햅스균주 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 및 12에만 결합했다(안소르그등, (1984) J. Clin, Microbiol. 20 : 84).

[실시예 7]

실시예 7은 피. 에루기노사 a 형태 편모에 결합하는 사람의 단일클론 항체를 생산하는 방법을 나타낸다.

고분자량의 다당류 조제(피어등, (1981) Infect. Immun., 34 : 461)로 면역된 사람의 말초혈액 샘플이 B세포원으로 주어졌다. 혈액으로부터 단일클론 세포를 분리한 후 실시예 6에서 나타낸 바와같이 T-세포를 고갈시켰다. 그 다음 세포를 액체질소가스 탱크내 10%의 디메틸설폭사이드가 첨가된 FCS에서 냉각했다. 그다음날 세포를 37℃에서 빠르게 녹이고, 이스코보의 배양기에서 한번 세척하고 HAT-배양기에서 재현탁했다. E PBMC당 30 1A2 세포 비율로 E-PBMC와 1A2 세포를 공동 배양하여 세포-드라이번 형질전환을 행했다. 세포혼합물을 웰당 62,000 세포의 농도로 30개의 96-웰 조직 배양 플레이트 속에 뿌렸다. 살포한지 7일후에 체적의 1/2을 HAT-배양기로 대체해서 배양균에 영양을 공급했다. 살포후 15일째 날에 웰의 100%에서 세포증식이 관찰되었으며 상징액을 웰에서 제거하여 분석했다.

상징액에 항-피. 에루기노사 항체가 존재하는지 알기 위해서 실시예 6에서 서술된 바와같이 PLL-처리된 플레이트를 대조표준으로 하고 편모가 있는 피. 에루기노사 풀을 사용하여 ELISA로 분석했다. 편모가 있는 풀에는 결합하지만 PLL 대조표준 플레이트에는 결합하지 않는 항체가 있는 상징액을 편모가 있는 풀의 각 세균 균주상에서 다시 분석했다. 한웰인 21B8(ATCC CRL 9301, KFCC 10486, 1988. 1. 4. 한국종균협회기탁)은 PSA I277, PSA G98 및 참조 피시어 면역형태 4에 결합하는 항체를 갖고 있었으며 이들 세균주는 a 형태 편모를 함유한 편모가 있는 풀의 균주이다.

21B8(ATCC CRL 9301, KFCC-10486) 세포주의 클로닝은 정상적인 클로닝 단계에 다음의 변형이 첨가된 3C1 세포주에 대해 실시예 6에서 서술된 것과 같이 행해졌다. 테라사키 플레이트의 웰을 단지 하나의 단세포의 존재에 대해서만 기록한 다음 각세포를 테라사키 플레이트에서 아미노 프테린 싱분이 없는 100μl HAT-배양기(HT-배양기) 체적내의 바닥이 둥근 96-웰 배양플레이트의 각 웰로 옮겼다. 영양공급 세포로서는 형질전환되지 않고 HAT-민감한 임파구 세포를 500세포/웰의 밀도로 모든 웰에 넣었다. 살포한지 5일 후에, 영양공급 세포를 선택적으로 죽이기 위해서 웰에 100μl의 HAT-배지를 첨가했다. 살포 7일과 9일째에 상징액의 1/2을 HAT-배지로 대체해서 웰에 영양을 공급했다. 그다음 ELISA에 의해 항체의 존재가 감지될 만큼 충분한 세포밀도가 될때까지 세포에 HT-배지로 영양을 공급했다. 생성물을 갖는 모든 웰은 편모 형태 a를 함유한 피. 에루기노사 균주에 결합하는 항체를 생성했다. 세포주와 단일클론 항체(IgG, 동형상)는 둘다 다음 본문에서 21B8(ATCC CRL 9301, KFCC 10486)로 명명했다.

21B8(ATCC CRL 9301, KFCC 10486)에 의해 확인된 항원은 간접 면역 형광법과 이뮤노블랏팅에 의해 나타난 편모이었다(기술에 관해서는 실시예 6참조). 21B8(ATCC CRL 9301, KFCC 10486)에 의한 형광 염색은 형태 a 편모를 갖는 피. 에루기노사 참조 균주 피시어 면역형태 4(A.T.C.C. No. 27315)에서만 관찰되었으며 형태 b 편모를 갖는 피. 에루기노사 참조균주 면역형태 2(A.T.C.C. No. 27313)에서는 관찰되지 않았다. 관찰된 형광형태는 항체가 세균의 편모에 결합하는 것을 가리키는 세균의 한끝으로부터 방사하는 정현의 선모양이었다.

이뮤노블랏팅은 실시예 2에서 서술된 바와같이 행해졌다. 피. 에루기노사 참조균주 1햅스 6(A.T.C.C. No. 33353)으로부터 얻은 정제된 형태 a 편모와 피. 에루기노사 참조균주 피시어 면역형태 2(A.T.C.C. No. 27313)으로부터 얻은 정제된 편모형태 b는 실시예 3에서 서술된 바와같이 제조되었다. 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 항원을 분리하고(실시예 3 참조) NCM에 옮겼다. 21B8(ATCC CRL 9301, ATCC 10486)이나 비-특이성 사람의 항체가 포함된 배양상징액 및 배양균배지는 NCM과 반응시키고 실시예 2와 실시예 6에서 나타낸 바와같이 알카리성 포스파타제가 결합된 염소 항-사람 Ig(다가임)과 효소기질로 감지했다. 이뮤노블랏에서, 21B8(ATCC CRL 9301, KFCC 10486) 항체는 단지 햅스 b의 51,700MW 편모단백질과 결합하여 피시어 면역형태 2의 53,000MW 편모형태에는 결합하지 않는다는 것에 예증되었다. 비-특이성 사람의 항체나 배양균 배지에서는 어떤 반응도 관찰되지 않았다

[실시예 8]

실시예 8은 화상당한 쥐 모델에서 피. 에루기노사의 공격에 대해 사람의 항-편모 항체인 20H11, 3C1 및 21B8(ATCC CRL 9301, KFCC 10486)로 수동적으로 면역된 쥐의 보호를 나타낸다.

사람의 항-편모 단일클론 항체를 화상당한 쥐 모델에서 시험했다(실시예 4참조). 21B8(ATCC CRL 9301, KFCC 10486)과 20H11 항체는 각각의 세포주로 부터 야기된 배양균 상징액을 황산 암모늄(50% 최종농도)으로 침전시켜 제조했다(군등, Selected Methods in Cellula Immunology, 미쉘, 비.비., 와 쉬기, 에스.엠.eds., 더불유.제이.프레만 ＆군., 샌프란시코, CA, 1980, 279-286). 침전물을 PBS에 용해하고, 4℃에서 하룻밤 동안 PBS에 대해 투석한 다음 살균여과해서 동물에 투여했다. 연구에서 음성 대조표준으로 사용된 3C1 항체원과 비-특이성 항-LPS 항체원은 배양 상징액이었다. 각 연구에 있어 양성 대조표준에는 잘 정제된 쥐의 단일클론 항체인 PaF4 IVE8(ATCC HB 9129, KFCC 10484) 또는 FA6 IIG5(ATCC HB 9130, KFCC 10485)가 포함되었다.

동물시험에서 사용된 편모형태 a를 갖는 균주는 피시어 면역형태 1LPS를 발현하는 임상분리물 PSAA522(GSCOB)이고, 편모형태 b 균주는 피시어 면역형태 6LPS를 발현하는 임상분리물 PSAA447(GSCOB)이었다. 사람의 항체(0.45ml)를 세균(0.05ml 내 5LD 100's 이상)으로 전혼합하고 화상후 즉시 접종된 서브에서카를 투여했다. 동물 시험의 결과를 표 III, IV와 V에 나타내었다.

[표 3]

1. 쥐는 거의 50 LD₁₀₀이상의 피. 에루기노사 PSA A522으로 공격받는 서브에스카(subeschar)이다.

2. 퍼센트는 생존수는 8개의 동물집단에서의 쥐의 생존수를 기초로 했다.

날짜는 화상입힌후 공격을 한 것이다.

3. 정제된 항체(0.45ml PBS에서 10μg)를 세균으로 전-혼합하고 화상후에 서브에스카를 투여하고 공격했다.

[표 4]

1. 쥐는 거의 50 LD₁₀₀이상의 피. 에루기노사 임상분리물인, PSA A477으로 공격받는 서브에스카(subeschar)이다.

2. 퍼센트는 생존수는 5개의 동물집단에서의 쥐의 생존수를 기초로 했다.

날짜는 화상입힌후 공격을 한 것이다.

[표 5]

1. 쥐는 거의 50 LD₁₀₀이상의 PSA A477으로 공격받는 서브에스카(subeschar)이다.

날짜는 화상입힌후 공격을 한 것이다.

3. 정제된 항체(40μg)를 화상당하기 전에 두시간 간격으로 공격했다.

항-편모형태 a 항체로 처리되거나 두개의 항-편모형태 b중 어느 것으로 처리되고 그에 상응하는 항원으로 공격받은 쥐에서는 매우 현저한 생존을 나타내었다. 역으로, 처리되지 않았으나 공격받은 쥐나 또는 적합하지 않은 항-편모 단일클론 항체나 비특이성 항-LPS 항체로 처리된 쥐의 88%-100%가 죽었다. 쥐의 단일클론 항체에서 나타난 바와 같이(실시예 4 참조) 사람의 항-편모 항체는 그에 상응하는 편모형태를 갖는 유기체의 치명적인 공격에 대해서만 특이하게 보호했다. 즉, 사람의 항-편모형태 a 항체는 편모형태 a를 갖는 유기체의 치명적인 공격에 대해서는 보호하지만 편모형태 b를 갖는 유기체의 공격에 대해서는 그렇지 않으며, 항-편모형태 b 항체는 편모형태 b를 갖는 균주의 공격을 받은 쥐는 보호하지만 편모형태 b를 갖는 유기체의 공격에 대해서는 그렇지 않았다.

[실시예 9]

실시예 9는 사람의 항-편모항체 20H11, 3C1 및 21B8(ATCC CRL 9301, KFCC 10486)과 피. 에루기노사 임상분리물과의 교차-반응성을 나타낸다.

피. 에루기노사 임상분리물(115)은 병원과 진료소로부터 얻었으며 일차적으로 화상상처와 혈액으로부터 분리했고, 쥐의 단일클론 항체인 FA6 IIG5(ATCC HB 9130, KFCC 10485) 또는 PaF4 IVE8(ATCC HB 9129, KFCC 10484)과 조사함으로써 편모형태 a나 편모형태 b를 함유함이 확인되었다(실시예 2, 3, 5 참조). 쥐의 단일클론 항체인 FA6 IIG5(ATCC HB 9130, KFCC 10485)와 59와의 반응에 의해 편모형태 a를 갖는다고 확인된 55개의 임상분리물들은 쥐의 단일클론 항체인 PaF4 IVE8(ATCC HB 9129, KFCC 10484)과의 반응에 의해 편모형태 b를 갖는다는 것이 확인되었다.

항-편모형태 a 사람의 단일클론 항체인 21B8(ATCC CRL 9301, KFCC 10486)의 교차반응성은 항체가 56개의 편모형태 a를 함유하는 임상분리물중 54개(96%)를 인식할만큼 광범위했다. 편모형태 b를 갖는 분리물과 20H11과의 교차반응성도 광범위했는데, 20H11은 59개의 분리물 모두(100%)를 인식했다. 이와는 대조적으로, 다른 항-편모형태 b 단일클론 항체인 3C1은 59개의 분리물중 단지 43개(73%)에만 결합했다. 이 결과는, 20H11은 전-반응 에피토프에 결합하는(즉, 편모가 있는 피. 에루기노사 균주중 적어도 약 95%에 에피토프가 존재한다) 반면에, 3C1은 모든 편모형태 b 분자상에 존재하는 것만은 아닌 에피토프에 결합한다는 것을 나타내고 있다. 비록 편모형태 b 항원을 다클론 항혈청으로 분석했을때 혈청학적으로 균일했으나, 놀라웁게도 20H11과 3C1의 교차 반응성 형태는 편모형태 b가 단일클론 항체에 의해 확인될 수 있는 단독의 에피토프를 적어도 2개 갖는다는 것을 나타내었다.

21B8(ATCC CRL 9301, KFCC 10486)과 20H11과 피. 에루기노사 임상분리물의 광범위한 교차반응성은 피. 에루기노사 감염의 면역요법에서 이 항체들의 임상적 유용성을 가리킨다.

[실시예 10]

실시예 10은 피. 에루기노사 형태 b 편모에 결합하는 또다른 전형적인 사람의 단일클론 항체를 생성하는 방법뿐 아니라 화상당한 쥐 모델에서 피. 에루기노사의 공격에 대한 항체의 보호작용도를 나타낸다.

형실전환된 세포 혼합물을 웰당 약 2250E-PBMC의 농도로 20개의 96-웰 조직 배양플레이트에 뿌리는 것을 제외하고는 실시예 7에서 서술된 바와 같이 형질 전환된 세포주를 제조하고 클로운화했다. 피시어 면역형태 2와 4 참조 균주를 풀에서 제거하는 것 이외에는 실시예 6에서 서술된 바와 같이 먼저 상징액을 편모가 있는 풀상에서 ELISA로 분석했다. 계속해서 피시어 면역형태 2와 4를 포함하는 편모가 있는 풀내의각 균주상에서 양성 웰을 분석했다. 마지막으로 분리된 세포주와 단일클론 항체(IgG 동형상)는 둘다 다음 본문에서 12D7로 명명했다.

12D7 사람의 단일클론 항체는 항-편모 a 형태의 분리물과의 광범위한 교차-반응성을 나타내는데, 즉 시험된 56개의 편모형태 a를 함유한 임상분리물중 54개(96%)를 인식했다. 12D7 단일클론항체의 보호작용도를 표 VI에 나타내었다. 보호연구는, 공격 투여량이 1LD 100이고 공격 균주가 피시어 면역형태 2 LPS와 형태 a 편모를 발현하는 임상분리물인 I624인 것을 제외하고 실시예 4에서 서술된 것으로 행해졌다.

[표 6]

1. 쥐는 1 LD₁₀₀(950 CFU)의 피. 에루기노사 I624로 공격받는 서브에스카(subeschar)이다.

2. 퍼센트는 생존수는 N=8인 15F4 집단을 제외한 10동물의 그룹에 대한 쥐의 생존수를 기초로 했다. 날짜는 화상입힌후 공격을 한 것이다.

3. 화상 2시간전에 정제된 항체(0.5ml PBS에서 50μg)를 투여하고 공격했다.

[실시예 11]

실시예 11은 편모형태 b 피. 에루기노사와 반응하는 사람의 단일클론 항체의 생성과, 화상당한 쥐 모델에서 피. 에루기노사의 공격에 대해서 이 항체로 수동적으로 면역된 쥐의 보호를 나타낸다.

B 세포형질전환제에 대한 1A2 비가 약 60 : 1이며 형질전환된 세포혼합물을 웰당 약 1930 E-PBMC의 농도로 15개 플레이트상에 뿌린다는 것을 제외하고는 실시예 10에서 서술된 것과 같이 형질전환된 세포주를 제조하고 클로운화했다. 또한, 세포를 G98(피시어 3 면역형태, 편모형태 a)과 I739(피시어 5 면역형태의 임상분리물, 편모형태 b)으로 이루어진 피. 에루기노사 균주의 풀상에서 분석하고, 피. 에루기노사 균주의 다른 풀, 즉 I277, G98, I739 및 피시어 면역형태 F2, F4, F6 및 F7상에서 확인했다. 최종적으로 분리된 세포주와 분리된 단일클론 항체(IgG, 동형상)는 둘다 다음 본문에서 2B8로 명명했다.

2B8로 행해진 면역 형광분석은 편모형태 b인 피시어 면역형태 균주에서는 양성이었으나 편모형태 a인 피시어 면역형태 4 참조 균주에서는 음성이었다. 임상분리물 시험에서, 편모가 있는 형태 b 분리물의 59/59(100%)가 양성을 나타내었다.

2B8의 보호작용도를 표 7에 나타내었다. 보호연구는, 임상분리물 F164(피시어 면역형태 4, 편모형태 b)를 공격용으로 사용한 것 이외에는 실시예 10에서 서술한 것과 같이 행했다.

[표 7]

1. 쥐는 1 LD₁₀₀(105 CFU)의 피. 에루기노사 F624로 공격받는 서브에스카(subeschar)이다.

2. 퍼센트는 생존수는 N=9인 2B8 집단을 제외한 10동물의 그룹에 대한 쥐의 생존수를 기초로 했다. 날짜는 화상입힌후 공격을 한 것이다.

4. 화상 2시간전에 정제된 항체(0.5ml PBS에서 5μg)를 투여하고 공격했다.

[실시예 12]

실시예 12은 편모형태 b 피. 에루기노사와 반응하는 다른 사람의 단일클론 항체의 생성과, 화상당한 쥐모델에서 피. 에루기노사의 공격에 대해서 이 항체로 수동적으로 면역된 쥐의 보호를 나타낸다.

형질전환된 세포주의 제조와 클론화는 다음의 예외를 제외하고는 실시예 7에서 서술한 바대로 행했다. 각각의 사람들을 면역시키고(피어등, (1984) 45 : 309) B 세포원을 공급했으며, E-PBMC의 살포수준은 웰당 당 2000 세포이었다. 피시어 1-7 면역형태 풀상에서 선별(screening)했다. 마지막으로 분리된 세포주와 분비된 단일클론 항체(IgG₁동형상)는 둘다 다음 본문에서 14C1로 명명했다.

임상시험에서 14C1(ATCC CRL 9424, KFCC-10487, 1988. 1. 4. 한국종균협회에 기탁)과의 시험으로 편모가 있는 b형태 분리물의 59/59(100%)으로 양성을 나타내었다. 보호연구는 상기 실시예 11과 같이 행했으며, 그 결과를 표 8에 나타내었다.

[표 8]

1. 쥐는 1 LD₁₀₀(90 CFU)의 피. 에루기노사 F164로 공격받는 서브에스카(subeschar)이다.

2. 퍼센트는 생존수는 N=9인 PaF4 IVE8(ATCC HB 9129, KFCC 10484)집단을 제외한 10동물의 그룹에 대한 쥐의 생존수를 기초로 했다.

날짜는 화상입힌후 공격을 한 것이다.

전술한 것으로부터, 본 발명의 세포주가 피. 에루기노사 편모와 반응하며 여러가지 피. 에루기노사 균주에 대해서 교차 보호하는 단일클론 항체 및 단편을 생성하는 방법을 제시한다는 것을 알 수 있다. 의외로, 각 형태의 편모상의 상이한 에피토프와 반응하는 단일클론 항체가 많이 분리되었다. 본 발명의 항체는 대부분의 피. 에루기노사 균주로 인한 감염에 대해 사용되는 예방조성물 및 치료조성물을 더 경제적이며 쉽게 생성할 수 있게 한다. 부가적으로, 세포주는 면역분석 및 다른 잘 공지된 공정에서의 용도가 발견된 항체를 제시한다.

이해를 명확하게 하기 위해서 본 발명을 예증과 실시예를 들어 다소 상세하게 서술했으나, 부가된 특허청구범위내에서 어떤 변화 및 변형을 시행하게 될 것이다.

Claims

슈도모나스 에루기노사 세균 편모와 특이하게 반응할 수 있는 단일클론 항체.
제1항에 있어서, 세균의 운동성을 억제하는 단일클론 항체.
제1항에 있어서, 생체내에서 보호성 있는 단일클론 항체.
슈도모나스 에루기노사의 편모 단백질 에피토프와 특이하게 반응할 수 있는 단일클론 항체.
제4항에 있어서, A.T.C.C. 수탁번호 HB 9129(KFCC-10484), HB 9130 (KFCC-10485), CRL 9301(KFCC-10486) 또는 CRL 9424(KFCC-10487)로 명시된 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체의 에피토프에 결합하는 것을 차단할 수 있는 단일클론 항체.
첫번째 단일클론 항체가 편모형태 a 또는 b의 슈도모나스 에루기노사의 에피토프와 반응할 수 있는 2개의 단일클론 항체를 함유하는 조성물.
제6항에 있어서, 두번째 단일클론 항체가 첫번째 단일클론 항체와 반응하지 않는 편모형태와 반응할수 있는 조성물.
제6항에 있어서, 첫번째 단일클론 항체가 사람의 단일클론 항체인 조성물.
제6항에 있어서, 단일클론 항체중 하나 또는 두개가 생체내에서 보호성 있는 조성물.
제6항 또는 제8항에 있어서, 사람의 혈장으로부터 얻은 감마 글로블린 단편 또는 항생제를 추가로 함유하는 조성물.
제6항 또는 제8항에 따르는 조성물 및 생리학적으로 허용되는 담체를 함유하는 제약학적 조성물.
슈도모나스 에루기노사의 편모 단백질과 반응하며 생체내에서 보호성 있는 단일클론 항체, 항균제, 사람의 혈장으로부터 얻은 감마 글로블린 단편 및 생리학적으로 허용되는 담체로 이루어진 슈도모나스 에루기노사 감염을 치료하거나 예방하는데 유용한 제약학적 조성물.
제12항에 있어서, 항체가 사람의 단일클론 항체이며 사람의 혈장으로부터 얻은 감마 글로블린 단편이 슈도모나스 에루기노사 세균 또는 이들의 생성물과 반응성 있는 높은 농도의 이뮤노글리블린을 나타내는 사람으로부터 수득되는 제약학적 조성물.
각각 다른 형태의 슈도모나스 에루기노사 편모단백질과 특이하게 반응하며, 슈도모나스 에루기노사 감염을 치료하거나 예방할 수 있는 두개의 단일클론 항체를 함유하는 제약학적 조성물.
제14항에 있어서, 하나 또는 2개의 단일클론 항체가 사람의 단일클론 항체인 조성물.
제14항에 있어서, 슈도모나스 에루기노사의 지질다당류 분자상의 하나 또는 2개의 혈청형 결정인자와 반응할 수 있는 하나 또는 2개의 사람의 단일클론 항체 또는 외독소 A와 반응성 있는 단일클론 항체를 추가로 함유하는 조성물.
균혈증 또는 폐혈증에 걸리기 쉬운 사람에게 제6항, 제8항, 제12항, 제14항 및 제15항중 어느 한항에 따른 조성물을 예방 또는 치료량만큼 투여함을 특징으로 하며,이러한 사람을 처치하는 방법.
슈도모나스 에루기노사 편모형태 a 또는 슈도모나스 에루기노사 편모형태 b와 특이하게 반응할 수 있는 단일클론 항체를 생성하는 세포주.
제18항에 있어서, 단일클론 항체가 생체내에서 슈도모나스 에루기노사에 대해 보호성 있는 세포주.
제19항에 있어서, 잡종 세포주인 세포주.
제18항에 있어서, 사람의 단일클론 항체를 생성하는 세포주.
제18항에 있어서, A.T.C.C. 수탁번호 HB 9129(KFCC-10484), HB 9130 KFCC-10485), CRL9301(KFCC-10486) 및 CRL 9424(KFCC-10487)중의 하나인 세포주.
제22항의 세포주중 하나 이상을 배양시키고, 슈도모나스 에루기노사의 편모단백질에 대해 특이적이며 슈도모나스 에루기노사 감염을 치료하거나 예방할 수 있는 단일클론 항체를 회수함을 특징으로 하여, 상기 항체를 생성시키는 방법.
균혈증이나 폐혈증에 걸리기 쉬운 사람에게 제23항에 따라 생성된 단일클론 항체를 예방 또는 치료량만큼 투여함을 특징으로 하여, 이러한 사람을 처치하는 방법.
제23항에 따라 생성된 단일클론 항체에 결합할 수 있는 에피토프와 반응성 있는 단일클론 항체.
슈도모나스 에루기노사 편모에 존재하는 에피토프와 특이한 반응성이 있는 사람의 단일클론 항체.
제26항에 있어서, 에피토프가 편모형태 a 또는 편모형태 b에는 존재하지만 두형태 모두에는 존재하지 않는 사람의 단일클론 항체.
제26항에 있어서, 에피토프가 약 70% 이상의 편모형태 b에 의해 표시되는 사람의 단일클론 항체.
제26항에 있어서, 에피토프가 편모형태 b에 의해서만 표시되는 사람의 단일클론 항체.
제29항에 있어서, 전(全)-반응성 있는 사람의 단일클론 항체.
세균감염에 걸리기 쉬운 사람에게 슈도모나스 에루기노사 균체외 독소 A와 반응할 수 있는 단일클론 항체의 예방량이나 치료량 ; 슈도모나스 에루기노사의 지질다당류 분자상의 하나 이상의 혈청형 결정인자와 반응할 수 있는 단일클론 항체 ; 사람의 혈장으로부터 얻은 감마 글로블린 단편 ; 슈도모나스 에루기노사 또는 이의 생성물과 반응성 있는 높은 농도의 이뮤노글로블린을 나타내는 사람의 혈장으로부터 얻은 감마글로블린 단편 ; 및 항균제중의 하나 또는 그 이상과 함께 슈도모나스 에루기노사의 편모에 결합할 수 있는 단일클론 항체를 예방 또는 치료량만큼 투여함을 특징으로 하여, 이러한 사람을 처치하는 방법.
PaF4 IVE8(ATCC HB 9129, KFCC-10484), FA6 IIG5(ATCC HB 9130, KFCC-10485), 21B8(ATCC CRL 9301, KFCC-10486) 및 14C1(ATCC CRL 9424, KFCC-10487)로 명시된 단일클론 항체들중 어느 하나와 동일한 결합-특이성을 갖는 단일클론 항체.
제32항에 있어서, 감지할 수 있는 신호를 제공할 수 있는 라벨(label)에 접합된 단일클론 항체.
제33항에 있어서, 라벨이 형광제 또는 효소인 단일클론 항체.
슈도모나스 에루기노사 편모와 반응성 있는 단일클론 항체와 샘플을 결합하고 복합체 형성을 감지함을 특징으로 하여, 샘플에서 슈도모나스 에루기노사의 존재를 측정하는 방법.
슈도모나스 에루기노사 세균의 형태 특이성 편모단백질과 반응하는 하나 또는 2개의 단일클로날 항체, 및 상기 각 항체와 공유 결합되거나 상기 각 단일클론 항체와 반응성 있는 두번째 항체와 공유 결합되는 감지할 수 있는 신호를 제공하는 라벨을 함유하는 단일클론 항체 조성물로 이루어진 슈도모나스 에루기노사 세균의 존재감지용 키트.