NL8701554A - Monoklonale antilichamen voor pseudomonas aeruginosa flagella. - Google Patents

Description

«. s VO 9213

Monoklonale antilichamen voor Pseudomonas aeruginosa flagella.

De uitvinding heeft betrekking op de toepassing van immunologische technieken voor het verschaffen van nieuwe materialen, die bruikbaar zijn voor de diagnose en behandeling van bacteriêle infecties, in het bijzonder op de bereiding en toepassing van monoklonale anti-5 lichamen, die in staat zijn tot reactie met Pseudomonas aeruginosa flagella.

Gram-negatieve ziekten en de ernstigste complicaties daarvan, bijvoorbeeld bacteremie en endotoxemie, zijn de oorzaak van ernstige ziektegevallen en sterfte bij menselijke patiënten. Dit is in het bij-10 zonder het geval voor het gram-negatieve organisme Pseudomonas aeruginosa, dat in toenemende mate is geassocieerd met bacteriêle infecties, in het bijzonder nosocomiële infecties, gedurende de afgelopen 50 jaren.

De afgelopen decaden zijn antibiotica de aangewezen therapie geweest voor de bestrijding van gram-negatieve ziekten. De voortdurende 15 ernstige ziektegevallen en hoge mortaliteit, geassocieerd met gram- negatieve bacteriêle ziekte wijst echter op de beperkingen van de antibiotische therapie, in het bijzonder met betrekking tot P. aeruginosa.

{Zie bijvoorbeeld V.G. Andriole, J. Lab. Clin. Med. 94 (1978) 196-199).

Dit heeft geleid tot het zoeken naar alternatieve methoden voor preven-20 tie en behandeling.

Eén methode, die werd onderzocht, is de vermeerdering van het immuunsysteem van de gastheer door actieve of passieve immunisering.

Er is bijvoorbeeld geconstateerd dat actieve immunisering van mensen of proefdieren met uit gehele cellen bestaande bacteriêle vaccins of ge-25 zuiverde bacteriêle endotoxinen uit P. aeruginosa leidt tot de ontwikkeling van specifieke opsonische antilichamen, primair gericht tegen determinanten op de repeterende oligosaccharide-eenheden van de lipo-polysaccharide (EPS) moleculen, gesitueerd op het buitencelmembraan van P. aeruginosa (zie M. Pollack, Immunoglobulins: Characteristics and 30 Uses of Intravenous Preparations, biz. 73-79, U.S. Department of Health and Human Services, 1979). Dergelijke antilichamen, hetzij actief opgewekt of passief overgebracht, zijn beschermend gebleken tegen de lethale effecten van P. aeruginosa infectie in een variëteit van diermodellen (Pollack, zie boven) en in sommige preliminaire onderzoekingen met «701554 * *· ? -2- mensen (zie L.S. Young en M. Pollack, Pseudomonas aeruginosa, biz. 119-132, Hans Huber, 1980).

De genoemde rapporten doen vermoeden dat immunotherapeutische benaderingen zouden kunnen worden toegepast voor het voorkomen en behan-5 delen van bacteriële ziekte, veroorzaakt door P. aeruginosa, zoals door toediening van gecombineerde menselijke immuunglobulinen, die anti-lichamen tegen de infecterende stam of stammen bevatten. Menselijke immuunglobulinen worden hier gedefinieerd als dat gedeelte van gefrac-tioneerd menselijk plasma, dat verrijkt is aan antilichamen, waaronder 10 specifieke antilichamen tegen stammen van P. aeruginosa zijn vertegenwoordigd. In verband met bepaalde inherente beperkingen in het gebruik van menselijke immuunglobulinecomponenten blijft deze benadering tot behandeling van ziekte als gevolg van P. aeruginosa in onderzoek (zie bijvoorbeeld M. S. Collins en r.e. Roby, Am. J. Med. 76 (3A) (1984) 15 168-174, en tot nu toe zijn er geen handelsprodukten beschikbaar, waar in deze componenten zijn toegepast.

Eén van de beperkingen, verbonden met immuunglobulinecomposi-ties, is dat zij bestaan uit combinaties van monsters van duizend of meer donors, welke monsters zijn gekozen op de aanwezigheid van bijzon-20 dere anti-Pseudomonas antilichamen. De combinatie leidt tot een uitmid-deling van individuele antilichaamtiters, hetgeen op zijn best resul- · teert in bescheiden verhoging in de resulterende titer van de gewenste antilichamen.

Een andere beperking is dat het selectieproces zelf een kost-25 bare continue screening vereist van de donorcombinatie ter verzekering van produktconsistentie. Ondanks deze pogingen kunnen de immuunglobuline-produkten van batch tot batch en onder produkten uit verschillende geografische gebieden aanmerkelijke variaties vertonen.

Nog een andere beperking, inherent aan immuunglobulinecomposi-30 ties, is dat hun gebruik resulteert in gelijktijdige toediening van grote hoeveelheden van externe eiwitachtige stoffen, die virussen kunnen bevatten, zoals zulke, die onlangs geassocieerd bleken met Acquired Immune Deficiency Syndrome, of AIDS), met de mogelijkheid om nadelige biologische effecten te veroorzaken. De combinatie van lage titers van 35 gewenste antilichamen en een hoog gehalte aan externe stoffen kan dikwijls een beperking betekenen tot suboptimale niveaus van de hoeveelheid 8 7 0 1 5 3 4 -3- specifieke en derhalve gunstige immuunglobuline(s), die aan de patiënt kan worden toegediend.

In 1975 rapporteerden Kohier en Milstein hun ontdekking dat bepaalde muizecellijnen konden worden gefuseerd met muizemiltcellen 5 onder vorming van hybridomen, elk waarvan antilichamen van een enkele specificiteit kan afscheiden/ met name monoklonale antilichamen (G. Kohier en C. Milstein, Nature, 256 (1975) 495-497). Door de komst van deze technologie werd het mogelijk in sommige gevallen grote hoeveelheden uitstekend specifieke murine antilichamen voor een bepaalde IQ determinant of determinanten op antigenen te bereiden. Vervolgens werd het door toepassing van later ontwikkelde technologieën mogelijk menselijke monoklonale antilichamen te produceren (zie bijvoorbeeld het Amerikaanse octrooischrift 4.464.465).

Het wordt onderkend dat in sommige situaties monoklonale anti-15 lichamen van muizen of composities die zulke antilichamen bevatten problemen kunnen veroorzaken voor toepassing in mensen. Er is bijvoorbeeld gerapporteerd dat monoklonale antilichamen van muizen, gebruikt bij onderzoek voor de behandeling van bepaalde menselijke ziekten, een immuunreactie kunnen opwekken, die ze niet-effectief maakt (R.L. Levy 20 en R.A. Miller, Ann. Rev. Med. 34 (1983) 107-116). Het is echter mogelijk dat met recente vorderingen in recombinant DNA technologie, zoals de produktie van muis/mens monoklonale antilichamen deze problemen kunnen worden overwonnen. Ook zijn nu methoden voor de produktie van menselijke monoklonale antilichamen beschikbaar (zie Human Hybridomas en 25 Monoclonal Antibodies, Plenum Publishing Corp., 1985).

Een aantal groepen heeft gerapporteerd over de produktie onder toepassing van hybridoom en/of celtransformatietechnologie van monoklonale antilichamen, beschermend tegen P. aeruginosa infecties. Er zijn monoklonale antilichamen geproduceerd, die reactief zijn met diver-30 se epitopen van P. aeruginosa, waaronder enkel- en multi-serotype specifieke oppervlakepitopen, zoals gevonden in LPS moleculen van de bacteriën (zie bijvoorbeeld de Amerikaanse octrooiaanvragen 734.624 en 807.394). Ook werden beschermende monoklonale antilichamen bereid, specifiek voor P. aeruginosa exotoxine A (zie bijvoorbeeld de Amerikaanse 35 octrooiaanvrage 742.170).

8701554 ί $ -4-

Hoewel het gebruik van monoklonale antilichamen, specifiek voor het LPS gebied van P. aeruginosa of de exotoxinen van de bacterie, in bepaalde situaties voldoende bescherming kan geven, verdient het in het algemeen de voorkeur bredere beschermingsmogelijkheden te hebben. Zo zou 5 het voor de profylactische behandeling voor potentiële infecties in mensen de voorkeur verdienen één of meer antilichamen toe te dienen, die beschermen tegen een aantal P. aeruginosa stammen. Evenzo zou het in therapeutische toepassingen, waar de serotypen van de infecterende stammen, niet bekend zijn, de voorkeur verdienen een antilichaam of com-10 binatie van antilichamen toe te dienen, die effectief zijn tegen de meeste, zo niet alle, klinisch belangrijke P. aeruginosa serotypen, in het ideale geval door het verschaffen van antilichamen, die dwars door de traditionele serotypeschema's reactief zijn.

Eén aspect aan P. aeruginosa fysiologie, dat blijkt bij te 15 dragen aan de virulentie van het organisme, is motiliteit, een vermogen dat primair het resultaat is van de aanwezigheid van een flagellum (zie T. Montie e.a., Infect, and Immun. 38 (1982) 1296-1298).

P. aeruginosa wordt gekenmerkt door een enkele flagellum aan één einde van zijn staafvormige structuur. Modelstudies met muizen met brandwon-20 den hebben getoond dat een groter percentage muizen overleefde wanneer niet-motiele P. aeruginosa stammen in experimentele brandwonden werden geënt dan wanneer motiele stammen werden gebruikt (A. McManus e.a.,

Burns 6 (1980) 235-239 en T. Montie e.a. Infect, and Immun. 38 (1982) 1296-1298). Andere studies betreffende de pathogenese van P. aeruginosa 25 doen vermoeden dat dieren, geïmmuniseerd met flagella antigeenpreparaten, werden beschermd bij brandwonden en geïnfecteerd met motiele stammen van de bacterie (zie I. Holder e.a., Infect, and Immun. 35. (1982) 276-280).

Van belang is dat P aeruginosa flagella zijn bestudeerd door 30 serologisehe methoden en in twee antigene hoofdgroepen blijken te vallen, aangeduid als Hl en H2 door B. Lanyi (Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung.

17 (1970) 35-48) en als type a en type b door R. Ansorg (Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A, 242 (1978) 228-238). Serologisehe typering van flagella door beide laboratoria toonden dat Hl flagella (B. Lanyi, zie boven) of 35 flagella type b (R. Ansorg, zie boven) serologisch uniform was, d.w.z. dat geen subgroepen werden geïdentificeerd. Dit serologisch uniforme S701554 « * -5- flagellaire type zal worden aangeduid als type b. Het andere hoofd-antigen, H2 (B. Lanyi, zie boven) of type a flagella (R. Ansorg, zie boven) bevatte vijf subgroepen- Dit antigen zal worden aangeduid als flagella type a en de vijf subgroepen als aQ, a.,, aa^ en a^. De vijf 5 subgroepen van type a zijn uitgedrukt in variërende combinaties op diverse stammen van type a, die P. aeruginosa dragen met uitzondering van antigen a^. Het a^ antigen werd gevonden op elk type a flagella, hoewel de mate waarin tussen de stammen varieerde.

Een serotyperingsschema, gebaseerd op de warmtestabiele voor-10 naamste somatische antigenen van P. aeruginosa wordt aangeduid als het Habs schema, dat onlangs is opgenomen in het International Antigenic Typing System schema (zie Int. J. Syst. Bacteriol. S3 (1983) 256). De flagella typen van P. aeruginsa Habs referentiestammen zijn gekarakteriseerd door immunofluorescentie met polyklonale sera door R. Ansorg 15 (Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A, 242 (1978) 228-238) of door coagglu-tinatie (R. Ansorg e.a., J. Clin. Microbiol. 20 (1984) 84-88). Habs stammen 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 en 12 zijn flagella type b dragende stammen en Habs stammen 1, 6, 8 en 9 dragen type a flagella. Aldus zou een groot aantal stammen van P. aeruginosa mogelijkerwijze kunnen worden 20 herkend door een klein aantal monoklonale antilichamen, specifiek voor flagellaire proteïnen.

Er bestaat derhalve een aanmerkelijke behoefte aan monoklonale antilichamen, die kunnen reageren met epitopen op flagellaire proteïnen en in sommige gevallen ook bescherming bieden tegen meervoudige sero-25 typen van P. aeruginosa. Verder zouden sommige van deze antilichamen geschikt zijn voor gebruik als profylactische en therapeutische behandelingen van P. aeruginosa infecties, alsmede voor de diagnose van dergelijke infecties. De uitvinding voldoet aan deze behoeften.

Nieuwe cellijnen worden verschaft, die monoklonale antilichamen 30 kunnen produceren, die in staat zijn tot binding van flagella, aanwezig op de meeste stammen van P. aeruginosa bacterie. De monoklonale antilichamen reageren specifiek met epitopen op flagella-proteïnen van P. aeruginosa en kunnen onderscheiden tussen type a en type b flagella van de bacterie. Verder wordt een werkwijze verschaft voor de behande-35 ling van mensen, die gevoelig zijn voor infectie of reeds zijn geïnfecteerd met P. aeruginosa door toediening van een profylactische of thera- 5701554 > i -6- peutische hoeveelheid van een compositie, die ten minste één monoklonaal antilichaam of bindend fragment daarvan bevat, dat in staat is tot reactie met de flagella van P. aeruginosa stammen, welke compositie bij voorkeur tevens een fysiologisch aanvaardbare drager bevat. De compositie 5 kan ook één of meer van de volgende bestanddelen bevatten: verdere mono-klonale antilichamen, die in staat zijn tot reactie met P. aeruginosa exotoxine A; monoklonale antilichamen, die in staat zijn tot reactie met serotype determinanten op de LPS van P. aeruginosa; een gammaglobu-linefractie van menselijk bloedplasma; een gammaglobulinefractie van 10 menselijk bloedplasma, welk plasma kan zijn verkregen van een mens, die verhoogde spiegels van met P. aeruginosa reactieve immunoglobulinen vertoont; en één of meer antimicrobiële middelen. Verder worden klinische toepassingen van de monoklonale antilichamen verschaft, waaronder de vervaardiging van diagnostische pakketten.

15 De uitvinding heeft betrekking op nieuwe cellen, die in staat zijn tot produktie van monoklonale antilichamen en composities, die zulke antilichamen bevatten, welke composities in staat zijn tot selectieve onderkenning van de flagella, aanwezig op een aantal P. aeruginosa stammen, waar individuele antilichamen typisch één type P. aeruginosa 20 flagella onderkennen. De onderhavige cellen hebben identificeerbare chromosomen, waarin de kiem-lijn DNA daarvan of een precursorcel is herrangschikt voor codering van een antilichaam met een bindingsplaats voor een epitoop op een flagellair proteïne, dat gemeenschappelijk is onder bepaalde P. aeruginosa stammen. Voor type a flagellaire proteïnen kunnen 25 pan-reactieve monoklonale antilichamen worden geproduceerd; voor type b flagellaire proteïnen worden antilichamen omvat, die pan-reactief zijn of met ten minste ongeveer 70% van de flagella dragende stammen reageren. Deze monoklonale antilichamen kunnen worden toegepast op een ruime variëteit van manieren, waaronder diagnose en therapie.

30 De aldus verschafte monoklonale antilichamen zijn bijzonder ge schikt voor de behandeling of profylaxe van ernstige ziekten, veroorzaakt door P. aeruginosa. De oppervlakteprotelnen op de flagella van P. aeruginosa zouden beschikbaar zijn voor direkt contact door de anti-lichaammoleculen, daardoor waarschijnlijk de motiliteit van het orga-35 nisme inhibiterend en/of andere effecten, die gunstig zijn voor de geïnfecteerde gastheer vergemakkelijkend.

3701554 -7-

De bereiding vein monoklonaie antilichamen kan geschieden door immortalisering van een cellijn, die in staat is tot expressie van nucleinezuursequenties, die coderen voor antilichamen, specifiek voor een epitoop op de flagellaire proteïnen van stammen van P. aeruginosa.

5 De gelmmortaliseerde cellijn kan een zoogdiercellijn zijn, die door oncogenesis, door transfectie, mutatie of dergelijke is getransformeerd. Dergelijke cellen omvatten myeloomlijnen, lymfoomlijnen, of andere cellijnen, die in staat zijn de expressie en secretie van het immuno-globuline of bindende fragment daarvan in vitro te ondersteunen. Het 10 immunoglobuline of fragment daarvan kan een natuurlijk voorkomend immunoglobuline zijn van een zoogdier, anders dan de voorkeursrauis of van menselijke bronnen, geproduceerd door transformatie van een lymfocyt, in het bijzonder een splenocyt, door middel van een virus of door fusie van de lymfocyt met een neoplastische cel, bijvoorbeeld een myeloom, 15 onder vorming van een hybridecellijn. Het splenocyt zal typisch worden verkregen uit een dier, dat geïmmuniseerd is tegen flagellaire antigënen of fragmenten daarvan, die een epitopische plaats bevatten. Immunise-ringsprotocols zijn algemeen bekend en kunnen aanmerkelijk variëren en toch effectief blijven. (Zie Golding, Monoclonal antibodies: Principles 20 and Practice, Academic Press (1983).

De hybridecellijnen kunnen worden gekloond en gescreened volgens conventionele technieken en antilichamen in de bovenstaande cel-vloeistof kunnen worden ontdekt, die in staat zijn.tot binding met P. aeruginosa flagellaire determinanten. Vervolgens kunnen de geschikte 25 hybridecellijnen worden gekweekt in groot-schalige cultuur of geïnjecteerd in de peritoneale caviteit van een geschikte gastheer voor pro-duktie van ascitesvloeistof.

In één belichaming van de uitvinding zijn de cellen getransformeerde menselijke lymf ocyten, die menselijke monoklonaie antilichamen 30 vormen, bij voorkeur beschermend in vivo, tot toegankelijke epitopen, specifiek voor ten minste één flagellair proteïne. De lymfocyten kunnen worden verkregen van menselijke donors, die blootgesteld zijn of geweest zijn aan de geschikte flagella-dragende stammen van P. aeruginosa. Een cel-gedreven transformatieproces, dat de voorkeur verdient, is in 35 detail beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.464.465.

3701554 -8-

Door het hebben van de antiliehamen volgens de uitvinding, waarvan bekend is dat zij specifiek zijn voor de flagellaire proteïnen, kunnen in sommige gevallen de bovenstaande vloeistoffen van volgende experimenten worden gescreened in een vergelijkend onderzoek met de 5 onderhavige monoklonale antiliehamen als middel voor identificatie van verdere voorbeelden van anti-flagellaire monoklonale antiliehamen.

Aldus kunnen hybridecellijnen gemakkelijk worden geproduceerd uit een variëteit van bronnen op basis van de beschikbaarheid van de onderhavige antiliehamen, die specifiek zijn voor de bijzondere flagellaire 10 antigenen.

Wanneer hybridecellijnen beschikbaar zijn, die antiliehamen produceren, die specifiek zijn voor de onderhavige epitope plaatsen, kunnen deze hybridecellijnen ook worden gefuseerd met andere neoplas- · tischè B-cellen, waarbij dergelijke andere B-cellen kunnen dienen als 15 recipiënten voor genome DNA codering voor de receptors. Terwijl neoplas-tische B-cellen van knaagdieren, in het bijzonder van muizen, het gebruikelijkst worden toegepast, kunnen andere species van zoogdieren worden gebruikt, zoals lagomorfa van runderen, schapen, paarden, varkens,, apen en dergelijke.

20 De monoklonale antiliehamen kunnen van elk der klassen of sub klassen van immunoglobulinen zijn, zoals IgM, IgD, ïgA, IgE of subklassen van IgG, bekend voor elke dierspecies. In het algemeen kunnen de · monoklonale antiliehamen intact of als bindingsfragmenten worden gebruikt, zoals Fv, Fab, F(ab')2, maar gewoonlijk intact.

25 De cellijnen volgens de uitvinding kunnen andere toepassingen vinden dan voor de direkte produktie van de monoklonale antiliehamen.

De cellijnen kunnen worden gefuseerd met andere cellen (zoals geschikte drug-gemerkte menselijke myeloma, muismyeloma of menselijke lymfoblas-toïde cellen), ter vorming van hybridomen, en aldus voorzien in de 30 transfer van de genen, die de monoklonale antiliehamen coderen, ook kunnen de cellijnen worden gebruikt als bron van de chromosomen, die de immunoglobulinen coderen, die kunnen worden geïsoleerd en volgens andere technieken dan fusie naar cellen kunnen worden overgebracht.. Verder kunnen de genen, die de monoklonale antiliehamen coderen, worden geïsoleerd 35 en gebruikt volgens recombinant DNA technieken voor de produktie van het specifieke immunoglobuline in een variëteit van gastheren. In het 3701554 *· * -9-

In het bijzonder kan door vorming van cDNA bibliotheken uit boodschapper RNA, een enkele cDNA kloon, coderend voor het immunoglobuline en vrij van intronen, worden geïsoleerd en geplaatst in geschikte prokaryotische of eukaryotische expressievectors en vervolgens in een gastheer worden 5 getransformeerd voor uiteindelijke massaproduktie (zie in het algemeen de Amerikaanse octrooischriften 4.172.124, 4.350.683, 4.363.799, 4.381.292 en 4.423.147; zie verder Kennett e.a., Monoclonal Antibodies, Plenum, New York (1980) en de daarin geciteerde referenties).

Meer specifiek kunnen in overeenstemming met hybride DNA tech-10 nologie de immunoglobulinen of fragmenten volgens de uitvinding worden geproduceerd in bacteriën of gist (zie Boss e.a., Nucl. Acid. Res. 12 3791 en Wood e.a., Nature 314, 446). Zo kan bijvoorbeeld de boodschapper RNA, overgedragen van de genen coderende voor de lichte en zware ketens van de monoklonale antilichamen, geproduceerd door een cellijn volgens 15 de uitvinding, worden geïsoleerd door differentiële cDNA hybridisering onder toepassing van cDNA uit andere BALB/c lymfocyten dan de onderhavige kloon. Het mRNA, dat niet hybridiseert, zal rijk zijn voor de boodschappen coderend voor de gewenste immunoglobulineketens. Voor zover noodzakelijk kan dit proces worden herhaald ter verdere verhoging van 20 de gewenste mRNA niveaus. De afgetrokken mRNA compositie kan dan in tegengestelde richting worden overgedragen ter verschaffing van.een cDNA mengsel, -dat verrijkt is voor de gewenste sequenties. Het RNA kan worden ge-hydrolyseerd met een geschikte RNase en het ssDNA kan dubbelstrengig worden gemaakt met DNA polymerase I en statistische primers, bijvoor-25 beeld statistisch gefragmenteerde kalfszwezerik DNA. Het Resulterende dsDNA kan dan worden gekloond door invoeging in een geschikte vector, bijvoorbeeld virusvectors, zoals lambda vectors of plasmide vectors, (zoals pBR322, pACYC184, enz.). Door ontwikkeling van sondes op basis van bekende sequenties voor de constante gebieden van de lichte en zwa-30 re ketens, kunnen de cDNA klonen met de gencodering voor de gewenste lichte en zware ketens worden geïdentificeerd door hybridisering.

Daarna kunnen de genen worden uitgesneden uit de plasmiden, gemanipuleerd ter verwijdering van overtollig DNA bovenstroom van de initiatie-code of constant gebied DNA, en vervolgens worden ingevoerd in een ge-35 schikte vector voor transformatie van een gastheer en uiteindelijke expressie van het gen.

8701554

«- V

-loop geschikte wijze kunnen zoogdiergastheren, (b.v. muizecellen) worden gebruikt ter behandeling van de keten (b.v. verbinden van de zware en lichte ketens) ter produktie van een intact immunoglobuline en verder desgewenst het immunoglobuline, vrij van de leidersequentie, af 5 te scheiden. Ook kan men unicellulaire microörganismen gebruiken voor de produktie van de twee ketens, waar verdere manipulatie nodig kan zijn ter verwijdering van de DNA sequenties, coderend voor de secretore leider en processignalen, terwijl voorzien wordt in een initiatiecode bij de 5' terminus van de sequentie, die voor de zware keten codeert.

10 Op deze. wi jze kunnen de immunoglobulinen worden bereid en behandeld teneinde te kunnen worden geassembleerd en glycosyleerd in andere cellen dan zoogdiercellen. Desgewenst kan elk van de ketens worden afgeknot teneinde tenminste het variabele gebied te behouden, welke gebieden dan kunnen worden gemanipuleerd ter verschaffing van andere immunoglobu-15 linen of fragmenten, specifiek voor de flagellaatepitopen.

De monoklonale antilichamen volgens de uitvinding zijn bijzonder nuttig wegens hun specificiteit voor antigenen over bijna alle P. aeruginosa varianten, die momenteel bekend zijn. Ook zijn sommige van de monoklonale antilichamen beschermend in vivo, waardoor zij kunnen 20 worden opgenomen in farmaceutische produkten, zoals antilichaamcombina-ties voor bacteriële infecties.

Monoklonale antilichamen volgens de uitvinding vinden ook een ruime variëteit van toepassingen in vitro. Zo kunnen bijvoorbeeld de monoklonale antilichamen worden gebruikt voor het typeren van micro-25 organismen, voor het isoleren van specifieke P. aeruginosa stammen, voor de selectieve verwijdering van P. aeruginosa cellen in een heterogeen mengsel van cellen, en dergelijke.

Voor diagnostische doeleinden kunnen de monoklonale antilichamen al dan niet voorzien zijn van een label. Diagnostische onderzoeken om-30 vatten typisch de detectie van de vorming van een complex door de binding van het monoklonale antilichaam aan het flagellum van het P. aeruginosa organisme. Indien niet voorzien van een label vinden de antilichamen toepassing in agglutinatie-onderzoeken. Verder kunnen antilichamen zonder label worden gebruikt in combinatie met andere, van een 35 label voorziene antilichamen (tweede antilichamen), die reactief zijn met het monoklonale antilichaam, zoals antilichamen, die specifiek zijn S 7 0 1 5 5 4 * i -11- voor immunoglobuline. Ook kunnen de monoklonale antilichamen direkt van een label worden voorzien. Er kan een ruime variëteit van labels worden gebruikt, zoals radionucliden, fluorescerende stoffen, enzymen, enzyme-substraten, enzymecofactors, enzyme-inhibitors, liganden (in het bijzon-5 der haptens), enz. Er zijn talrijke immunoassays beschikbaar en bij wijze vain voorbeeld omvatten sommige zulke beschreven in de Amerikaanse octrooi-schriften 3.817.827, 3.850.752, 3.901.654, 3.935.074, 3.984.533, 3.996.345, 4.034.074 en 4.098.876.

Gewoonlijk worden de monoklonale antilichamen volgens de uit-10 vinding gebruikt in enzyme-immunoassays, waar de onderhavige antilichamen of tweede antilichamen uit een andere species worden geconjugeerd aan een enzyme. Wanneer een monster, dat P. aeruginosa van een bepaald serotype, zoals menselijk bloed of lysaat daarvan, wordt gecombineerd met de onderhavige antilichamen, vindt binding plaats tussen de anti-15 lichamen en de moleculen, die de gewenste epitoop vertonen. Dergelijke cellen kunnen dan uit de ongebonden reagentia worden afgescheiden en kan een tweede antilichaam (voorzien van een enzymelabel) worden toegevoegd. Daarna wordt de aanwezigheid van het antilichaam-enzymeconju-gaat, dat specifiek aan de cellen gebonden is, bepaald. Ook kunnen andere 20 conventionele technieken worden toegepast, die de deskundige bekend zijn.

Ook kunnen pakketten worden verschaft voor gebruik met de onderhavige antilichamen voor detectie van B. aeruginosa in oplossingen of de aanwezigheid van P. aeruginosa flagellaire antigenen. Zo kan de onderhavige monoklonale antilichaamcompositie volgens de uitvinding 25 worden verschaft, gewoonlijk in een gelyofiliseerde vorm, 'hetzij op zichzelf, hetzij tezamen met verdere antilichamen, die specifiek zijn voor andere gram-negatieve bacteriën. De antilichamen, die geconjugeerd kunnen zijn met een label of ongeconjugeerd, worden in het pakket opgenomen met buffers, zoals Tris, fosfaat, carbonaat, enz., stabilisatoren, 30 biociden, inerte proteïnen, bijvoorbeeld runderserumalbumine, of derg.

In het algemeen zullen deze materialen aanwezig zijn in minder dan ongeveer 5 gew.%, berekend op de hoeveelheid actief antilichaam en gewoonlijk in een totale hoeveelheid van ten minste ongeveer 0,001 gew.%, berekend op de antilichaamconcentratie. Dikwijls zal het gewenst zijn 35 een inert versnijdingsmiddel of excipiëns op te nemen ter verdunning van de actieve ingrediënten, waarbij het excipiëns aanwezig kan zijn in 870 ? 534 i > -12- een hoeveelheid van 1-99 gew.% van de totale compositie. Wanneer een tweede antilichaam, dat in staat is tot binding van het monoklonale antilichaam, wordt toegepast zal dit gewoonlijk aanwezig zijn in een aparté. ampul. Het tweede antilichaam wordt typisch geconjugeerd aan 5 een label en samengesteld op analoge wijze als de hierboven beschreven samenstelling met het antilichaam.

De monoklonale antilichamen, in het bijzonder menselijke monoklonale antilichamen volgens de uitvinding kunnen ook worden opgenomen als componenten van farmaceutische composities, die een therapeutische 10 of profylactische hoeveelheid van ten minste één van de monoklonale antilichamen volgens de uitvinding met een farmaceutisch doelmatige drager bevatten. Een farmaceutische drager dient een verenigbare niet-toxische stof te zijn, die geschikt is om de monoklonale antilichamen aan de patiënt af te leveren. Steriel water, alcohol, vetten, wassen, 15 en inerte vaste stoffen kunnen als drager worden gebruikt. Farmaceutisch aanvaardbare hulpstoffen (buffermiddelen, dispergeermiddelen) kunnen « eveneens in de farmaceutische compositie worden opgenomen. Dergelijke composities kunnen een enkelvoudig monoklonaal antilichaam bevatten teneinde specifiek te zijn voor stammen van ëën flagellair type van 20 P. aeruginosa. Ook kan een farmaceutische compositie twee of meer monoklonale antilichamen bevatten onder vorming van een "cocktail". Zo zou bijvoorbeeld een cocktail, die monoklonale antilichamen tegen beide typen flagella of tegen groepen van de diverse P. aeruginosa stammen (b.v. verschillende serotypen) bevat, een universeel produkt zijn met 25 activiteit tegen de grote meerderheid van de klinische isolaten van de betrokken bacterie.

De molverhouding van de verschillende monoklonale antilichaam-componenten zal gewoonlijk niet meer dan een factor 10 verschillen, doorgaans niet meer dan een factor 5, en zal gewoonlijk in een molver-30 houding van ongeveer 1:1-2 tot elk van de andere antilichaamcomponenten zijn.

De monoklonale antilichamen volgens de uitvinding kunnen ook worden gebruikt in combinatie met bestaande bloedplasmaprodukten, zoals in de handel verkrijgbaar gammaglobulins en immuunglobulineprodukten, 35 gebruikt voor de profylactische of therapeutische behandeling van P. aeruginosa ziekte in mensen. Bij voorkeur wordt het plasma voor 570 1 55 4 % i -13- immuunglobulinen verkregen van menselijke donors, die verhoogde niveaus vertonen van immunoglobulinen, reactief met P. aeruginosa (zie in het algemeen het compendium "Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host”, Smer. J. Med. 76 (3a) (30 maart 1984), blz. 1-231).

5 De onderhavige monoklonale antilichamen kunnen worden gebruikt als afzonderlijk toegediende composities, gegeven in samenhang met antibiotica of antimicrobiële middelen. De antimicrobiële middelen kunnen typisch een anti-pseudomonale penicilline (b.v. carbenicilline) bevatten tezamen met een aminoglycoside (b.v. gentamicine, tobramycine en derg.), 10 maar ook kunnen talrijke verdere middelen (cefalosporinen), die de deskundige bekend zijn, worden gebruikt.

De monoklonale antilichamen en farmaceutische composities daarvan volgens de uitvinding zijn bijzonder geschikt voor orale of parenterale toediening. Bij voorkeur worden de farmaceutische composities parente-15 raai, met name subcutaan, intramusculair of intraveneus toegediend.

De uitvinding verschaft aldus composities voor parenterale toediening, die een oplossing van het monoklonale antilichaam of een cocktail daarvan bevatten, opgelost in een aanvaardbare drager, bij voorkeur een waterige drager. Er kan een variëteit van waterige dragers worden ge-20 bruikt, bijvoorbeeld water, gebufferd water, 0,4% zoutoplossing, 0,3% glycine en dergelijke. Deze oplossingen zijn steriel en in het algemeen vrij van deeltjesvormig materiaal. Deze composities kunnen worden gesteriliseerd volgens conventionele en bekende sterilisatietechnieken.

De composities kunnen farmaceutisch aanvaardbare hulpstoffen bevatten, 25 voor zover nodig ter benadering van fysiologische condities, zoals pH-regelaars en buffers, toxiteit-regelende middelen en dergelijke, bijvoorbeeld natriumacetaat, natriumchloride, kaliumchloride, calcium-chloride, natriumlactaat en dergelijke. De concentratie van het antilichaam in deze composities kan binnen ruime grenzen variëren, met name 30 van minder dan ongeveer 0,5%, gewoonlijk tenminste ongeveer 1% tot zoveel als 15. of 20 gew.% en wordt primair gekozen op basis van vloeistof-volumes, viscositeiten en dergelijke, die de voorkeur verdienen voor de gekozen toedieningsvorm.

Een typische farmaceutische compositie voor intramusculaire 35 injectie kan bijvoorbeeld 1 ml steriel gebufferd water en 50 mg mono-klonaal antilichaam bevatten. Een typische compositie voor intraveneuze 8701554 -14- injectie kan bijvoorbeeld 250 ml steriele Ringer's oplossing en 150 mg monoklonaal antilichaam bevatten. Feitelijke methoden voor de bereiding van parenteraal toedienbare composities zijn de deskundige bekend of duidelijk en zijn in meer detail beschreven in bijvoorbeeld Remington's 5 Pharmaceutical Science, 15d ed., Mack Publishing Company (1980).

De monoklonale antilichamen volgens de uitvinding kunnen worden gelyofiliseerd voor opslag en kunnen voor het gebruik in een geschikte drager worden gereconstitueerd. Deze techniek is effectief gebleken met conventionele immuunglobulinen, waarbij bekende lyofiliserings- en IQ reconstitutietechnieken kunnen worden toegepast. Het zou de deskundige duidelijk zijn dat lyofilisering en reconstitutie kunnen leiden tot verschillende mate van activiteitsverlies van het antilichaam (b.v. met conventionele immuunglobulinen neigen igM antilichamen tot groter activiteitsverlies dan igG antilichamen) en dat de gebruikte niveaus ter 15 compensatie kunnen moeten worden aangepast.

De composities, die de onderhavige monoklonale antilichamen of een cocktail daarvan bevatten, kunnen worden toegediend voor de profylactische en/of therapeutische behandeling van P. aeruginosa infecties.

Bij therapeutische toepassing worden composities toegediend aan één 20 patiënt, die reeds met één of meer P. aeruginosa serotypen is geïnfecteerd, in een voldoende hoeveelheid om de infectie en zijn complicaties te genezen of althans partieel tot staan te brengen. Een hoeveelheid, die voldoende is om dit te bereiken, wordt gedefinieerd als een "therapeutisch effectieve dosis". Hoeveelheden, die voor dit gebruik effectief 25 zijn,, zijn afhankelijk van de ernst van de infectie en de algemene toestand van het eigen immuunsysteem van de patiënt, maar bedragen in het algemeen ongeveer 1 tot ongeveer 200 mg antilichaam per kilogram lichaamsgewicht, waarbij gewoonlijk dosis van 5-25 mg per kilogram worden gebruikt. Bedacht moet worden dat de materialen volgens de uitvinding in 30 het algemeen zullen worden toegepast in ernstige ziektetoestanden, dat wil zeggen levensbedreigende of potentieel levensbedreigende situaties, in het bijzonder bateremie en endotoxemie, veroorzaakt door P. aeruginosa.

In profylactische toepassingen worden composities, die het onder-35 havige antilichaam of een cocktail daarvan bevatten, toegediend aan een patiënt, die nog niet door P. aeruginosa is geïnfecteerd, ter verbete- 870 1 554 -15- ring van de weerstand van de patiënt tegen een dergelijke potentiële infectie. Een dergelijke hoeveelheid wordt gedefinieerd als een "profylactisch effectieve dosis". Bij deze toepassing zijn de precieze hoeveelheden eveneens afhankelijk van de gezondheidstoestand van de pa-5 tiênt en zijn algemene immuniteitsniveau, maar bedragen in het algemeen 0,1-25 mg per kilogram, in het bijzonder 0,5-2,5 mg per kilogram.

Enkelvoudige of meervoudige toedieningen van de composities kunnen worden uitgevoerd met doses en volgens één patroon, dat door de behandelende arts wordt gekozen. In ieder geval dienen de farmaceuti-10 sche composities een hoeveelheid van de één of meer antilichamen volgens de uitvinding te verschaffen, die voldoende is om de patiënt effectief te behandelen of te beschermen.

VOORBEELD I

Voorbeeld I toont de methodologie, gebruikt voor de bereiding ^ van een monoklonaal antilichaam van de muis dat specifiek aan P. aeruginosa flagella wordt gebonden.

Drie-maanden-oude BALB/c muizen werden acht maal intraperito-neaal geïmmuniseerd met levensvatbare P. aeruginosa Fisher immunotype 1 en Fisher immunotype 2 (A.T.C.C. 27312 en 27313) bacteriën elke één tot 20 twee weken gedurende in totaal negen weken. De initiële bactenedoses 6 7 waren 8 x 10 en 1 x 10 organismen per muis voor respectievelijk

Fisher immunotype 1 en Fisher immunotype 2, en de dosis werd tijdens het verloop van de immuniseringen tot het 30- tot 60-voudige verhoogd.

Drie dagen na de laatste injectie werd de milt van één muis 25 aseptisch verwijderd en werd een enkelvoudige celsuspensie bereid door zacht roteren van het orgaan tussen de bevroren uiteinden van twee steriele glasplaatjes. Mononucleaire miltcellen werden in een 4:1 verhouding gecombineerd met logfase muizemyeloomcellen (NSI-1, verkregen van dr. C. Milstein, Molecular Research Council, Cambridge, Engeland) ^ en gefuseerd ter vorming van hybridomen volgens de procedure, beschreven in Infect. Immun. 36 (1982) 1042-1053. De uiteindelijke hybridecelsus- g pensie werd verdund tot een concentratie van 1,5 x 10 cellen per ml in RPMI-hybride-HAT (RPMI 1640, bevattende 15% hitte-geïnactiveerd foetaal kalfserum, 1 mM natriumpyruvaat, 100 pg/ml penicilline en streptomycine, 35 -4 -7 -5

1,0 x 10 M hypoxantine, 4,0 x 10 M aminopterine en 1,6 x 10 M

g thymidine), die 2,0 x 10 per ml vers bereide BALB/c thymocyten als 8701554 -16- voedercellen bevatte.

Het mengsel werd aangebracht op 96-putplaten (200 yl per put). De culturen werden gevoed door verwijdering en vervanging van 50% van het volume van elke put door verse RPMI-hybride-HAT elke twee tot drie 5 dagen. De bovenstaande cultuurvloeistof werd onderzocht op de aanwezigheid van anti-P. aeruginosa antilichamen door enzyme-gebonden immuno-sorbant assay (ELISA) wanneer de celgroei ongeveer 40% samenvloeiing in de putten bereikte, gewoonlijk binnen 7-10 dagen.

De bovenstaande cultuurvloeistoffen van de hybridecellen werden 10' gelijktijdig op buitenmembraanpreparaten van elk van de twee immuniserende bacteriën onderzocht. Buitenmembraanpreparaten werden geïsoleerd door een modificatie van de methode, beschreven in Infect. Immun. 36 (1982) 1042-1053. Bacteriën (P. aeruginosa Fisher immunotype 1 en Fisher immunotype 2) werden geënt in trypticase sojacultuurvloeistof 15 (TSB) en gedurende 16-18 uur bij 34°C gekweekt met beluchting in een rondwentelend schudbad. De bacteriën werden geoogst door centrifugeren en tweemaal gewassen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, 0,14 M NaCl, 3 mM KC1, 8 mM Na2HPC>4.7 H O, 1,5 mM KH2PC>4, PH 7,2), bevattende 150 trypsine-inhibiterende eenheden (T.I.U.) aprotinine per ml.

20 De korrel van de laatste centrifugering werd opnieuw gesuspen deerd is 0,17 M triethanolamine, 20 mM dinatriumethyleendiamine-tetra-azijnzuur (EDTA) en vervolgens op ijs gedurende 10 minuten gehomogeniseerd. De vaste stof werd gekorreld door centrifugeren van het homoge-naat bij 14.900 x g en geëcarteerd, en de bovenstaande vloeistof werd 25. opnieuw gecentrifugeerd zoals beschreven. De vaste stof werd andermaal geëcarteerd en de membranen werden gekorreld door centrifugeren van de bovenstaande vloeistof bij 141.000 x g gedurende 1 uur. De bovenstaande vloeistof werd geëcarteerd en de membraan-vaste stof werd overnacht bewaard bij 4°C in 10 ml PBS, bevattende 75 T.I.ü. aprotinine per ml.

30 De vaste stof werd de volgende dag opnieuw gesuspendeerd door vortice-ren en vervolgens bemonsterd en bewaard bij -70°C. Het proteïnegehalte van elk monster werd bepaald volgens de methode van Lowry e.a. (J. Biol. Chem. 193 (1951) 265-275).

De antigenplaten voor de ELISA werden als volgt geprepareerd.

35 De buitenmembraanpreparaten werden verdund tot 5 yg per ml proteïne in PBS en 50 yl van de oplossingen werd in elke put van 96-putplaten ge- 3701554 -17- bracht, afgesloten en overnacht bij 37°C geincubeerd. Ongebonden antigen werd uit de platen verwijderd en 100 μΐ 5 % (gewicht/volume) runder-serumalbumine (BSA) in PBS werd aan elke put toegevoegd, waarna de platen gedurende 1 uur bij 37°C werden geincubeerd.

5 Na verwijdering van het ongeadsorbeerde BSA werd de bovenstaande cultuurvloeistof (50 μΐ) uit elke put van de fusieplaten gekopieerd in overeenkomstige putten van antigenplaten en 30 minuten bij 37 °C geincubeerd. Het ongebonden antilichaam werd uit de putten verwijderd en de platen werden driemaal gewassen met 10 μΐ 1 % (gewicht/volume) BSA-PBS 10 per put. Vervolgens werd per put 50 μΐ op passende wijze verdund gebio-tinyleerde geite-anti-muis IgG aan elke put toegevoegd en 30 minuten bij 37°C geincubeerd. De platen werden driemaal gewassen zoals hierboven beschreven, waarna 50 μΐ van een tevoren gevormd avidine:gebio-tinyleerde mierikswortel peroxydasecomplex (Vectastain ABC Kit, Vector 15 Laboratories, Inc., Burlingame, CA), bereid volgens de specificaties van de fabrikant, aan de putten toegevoegd. Na 30 minuten bij kamertemperatuur werd het Vectastain reagens uit de putten verwijderd, waarna de putten op de beschreven wijze werden gewassen en per put 100 μΐ substraat o-fenyleendiamine (0,8 mg/ml in 0,1 M citraatbuffer, pH 5,0, ge-20 mengd met een gelijk volume van 0,03' % (volume/volume) werd toege voegd. Het substraat werd 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker geincubeerd, waarna de reacties werden beëindigd door toevoeging van 50 μΐ 3N H^SO^ per put.

Hybridoomcellen, die monoklonale antilichamen afscheidden, die 25· zich bonden aan één van de twee antigenpreparaten, werden opgespoord door meting van de absorptie bij 490 nm van de colorimetrische reacties in elke put op een Dynatech Model 580 MicroELISA reader. De cellen in een put, aangeduid Pa3 IVC2, produceerde antilichaam, dat zich alleen bond aan de Pisher Immunotype 2 antigenplaat. Deze put werd verder be-30 studeerd, zoals hieronder beschreven. Het monoklonale antilichaam en de klonale cellijn worden beide in de volgende tekst geïdentificeerd door de Pa3 IVC2 aanduiding. Pa3 IVC2 cellen uit de masterput werden gemini-kloneerd en gekloneerd door beperkende verdunningstechnieken, zoals beschreven in Infect. Immun. 36 (1982) 1042-1053.

35 Ascitesvloeistof, die het monoklonale antilichaam met hoge titer bevatte, werd bereid in CB6 muizen (BALB/c (vrouwelijk) x C57BL/6 5791554 -18- (mannelijk) F^) volgens procedures, beschreven in Infect. Ixnmun. 3j5 (1982) 1042-1053. Twee- tot drie-maanden-oude mannelijke CB6 F^ muizen werden intraperitoneaal geïnjecteerd met 0,5 ml Pristane (2, 5, 10, 14-tetramethylpentadecaan, Aldrich Chemical Co.) 10-21 dagen voor intra-5 peritoneale injectie met logfase Pa3 IVC2 cellen in RPMI. Elke muis 7 werd geïnjecteerd met 0,5-1 x 10 cellen m 0,5 ml. Na ongeveer twee weken werd de vloeistof, die zich had verzameld, elke twee tot drie dagen uit de muizen verwijderd. De concentratie van antilichaam in de ascitesvloeistof werd bepaald door agarosegelelektroforese, en alle 10: ascites die 5 mg/ml of meer antilichaam bevatte werd samengevoegd, be monsterd en bevroren bij -70°C.

Bovenstaande cultuurvloeistof van de gekloonde Pa3 IVC2 cellijn werd onderzocht door ELISA, zoals hierboven beschreven, op buitenmem-braanpreparaten van alle zeven P. aeruginosa Fisher immunotypestammen 15 (A.T.C.C. 27313-27318), P. aureofaciens (A.T.C.C. 13985) en Klebsiella pneumoniae (A.T.C.C. 8047), alle bereid zoals hierboven beschreven. Antilichaam PA3 IVC2, gebonden aan de buitenmembraanpreparaten van P. aeruginosa Fisher immunotypen 2, 6 en 7 en niet aan andere Fisher immunotypen, P. aureofaciens of K. pneumoniae.

20 Het specieke antigen, geïdentificeerd door het antilichaam Pa3 IVC2 werd geïdentificeerd door radioimmuunprecipitatie. Deze omvat in het kort het incuberen van antigenen, die van een radialabel zijn voorzien, met Pa3 IVC2 antilichaam en een deeltjesvormige bron van proteïne A, hetgeen resulteert in de vorming van onoplosbare antilichaam:antigen 25 complexen. Deze complexen worden gewassen ter verwijdering van niet- specifiek gebonden antigen, waarna de complexen worden gedissocieerd en gescheiden in een polyacrylamidegel. De in het gel gevonden overwegende radioactieve species worden daarbij geïdentificeerd als de corresponderende antigenen, waaraan het antilichaam Pa3 IVC2 zich bindt.

30 Monsters (25 yg) van oplosbare P. aeruginosa Fisher immunotypen 2, 3, 4 en 5 buitenmembraanpreparaten werden radioactief gemerkt in 125 vaste fase met I met behulp van Iodo-gen (Pierce Chemical Co) (Biochem. Biophys. Res. Commun. 80 (1978) 849-857; Biochemistry 17 (1978) 4807-4817). Deze procedure resulteerde in de jodering van blootgestelde 35 tyrosineresidu1 s van de meeste, zo niet alle proteïnen in de buitenmembraanpreparaten.

8701554 -19-

Ter vermindering van niet-specifieke binding van de buitenmem- braanantigenen aan antilichaam Pa3 IVC2, werden de radioactief gemerkte 6 preparaten (5 x 10 tellingen per minuut per analyse) eerst 1 uur bij 4°C géïncubeerd met BALB/c normaal muizeserum (1:40 uiteindelijke ver-5 dunning). Vervolgens werd bovenstaande vloeistof (0/5 ml) van de Pa3 IVC2 cultuur, die het Pa3 IVC2 antilichaam bevatte, aan elk buitenmem-braanmonster toegevoegd. Na incubatie van antigen en antilichaam gedurende 1 uur bij 4°C werd de proteine-A bron, IgGSORB (0,095 ml per monster) (The Enzyme Center, Ine., Boston, MA) toegevoegd, waarna nog 10 30 minuten bij 4°C werd gexncubeerd (J. Immunol. 115 (1975) 1617-1622).

IgGSORB werd bereid volgens de specificaties van de fabrikant en vlak voor het gebruik werden niet-specifieke reacties voorkomen door blokkering van potentieel reactieve plaatsen met cultuurmedia door tweemaal wassen van het IgGSORB met RPMI-hybride (RPMI-hyride-HAT media exclusief • 15 HAT).

De antigen-antilichaam-IgGSORB complexen werden 10 minuten bij 4°C gecentrifugeerd bij 1500 x g, tweemaal gewassen met fosfaat-RIPA buffer (10 mM fosfaat, pH 7,2, 0,15 M NaCl, 1,0 % (volume/volume)

Triton X-100, 1,0 % (gewicht/volume) natriumdeoxycholaat, 0,1 % 20 (gewicht/volume) natriumdodecylsulfaat (SDS), en 1,0 % (volume/volume) aprotinine); tweemaal met een buffer met hoog zoutgehalte (0,1 M Tris-HC1, pH 8,0, 0,5 M LiCl, 1 % (volume/volume) beta-mercaptoêthanol); en eenmaal met lysisbuffer (0,02 M Tris-HCL, pH 7,5, 0,05 M NaCl, 0,05 % (volume/volume) Nonidet P-40) (Proc. Natl. Acad. Sci., ü.S.A. 76 25 (1979) 4479-4483). Antigen, gebonden aan het complex, werd vrijgèsteld door incubatie gedurende 10 minuten bij 95°C met monsterbuffer (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 2 % (gewicht/volume) SDS, 2 % (volume/volume) beta-mercaptoêthanol en 20 % (volume/volume) glycerol) en verzameld in de bovenstaande vloeistof na centrifugeren bij 1500 x g gedurende 10 min.

30 De bovenstaande vloeistof monsters werden aangebracht op 14 % polyacrylamidegels, bevattende SDS bereid volgens de methode van B. Lugtenberg e.a. (FEBS Lett. 58 (1978) 254-258), zoals gemodificeerd door Hancock en Carey (J. Bacteriol. 140 (1979) 902-910) en de anti-genen werden in het gel gescheiden door elektroforese overnacht bij een 35 constante spanning van 50 V. Na fixatie van het gel in 40 % (volume/ volume) methanol, 10 % (volume/volume) azijnzuur en' 5 % (volume/volume) 870 1 55 4 -20- glycerol overnacht, werd het via een Biorad geldroger (Richmond, CA) gedroogd op Whatman 3 MM papier. Het gedroogde gel werd bedekt met kunststof wikkel en blootgesteld aan Kodak X-AR film gedurende 18 uur bij kamertemperatuur.

5 Resultaten van dit experiment toonden dat Pa3 IVC2 zich bond aan slechts één antigen in het buitenmembraanpreparaat van P. aeruginosa Fisher immunotype 2 en niet aan enig ander antigen, aanwezig in de andere buitenmembraanpreparaten. Het molecuulgewicht (MW) van het antigen in het gel was ongeveer 53.000 dalton, bepaald door vergelijking 14 10. van. zijn mobiliteit met die van C-gemerkte protelnestandaards (fosfo-rylase B, MW 92.500; BSA, MW 69.000; ovalbumine, MW 46.000; koolzuur-anhydrase, MW 30.000; cytochrome C, MW 12.000), die in hetzelfde gel werden gescheiden. Het molecuulgewicht van dit antigen correleerde met het molecuulgewicht van flagelline, het proteïne van de flagella van 15 P. aeruginsoa (Infect. Immun. 35 (1982) 281-288).

Verder werd Pa3 IVC2 onderzocht volgens ELISA onder toepassing van P. aeruginosa Habs stammen 1-12 (A.T.C.C. 33348-33359), gefixeerd met ethanol op 96-put microtiterplaten. De antigenplaten werden als volgt geprepareerd.

20 Overnachtvloeistofculturen van elk organisme werden gecentri fugeerd, tweemaal gewassen met PBS en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in PBS tot een van 0,2 O.D. eenheden. De verdunde bacteriën werden - 660 in putten gebracht (50 μΐ per put) en vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur gecentrifugeerd bij 1500 x g. Het PBS werd geaspi-25 reerd en vervolgens werd ethanol (95%) aan de putten toegevoegd gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Nadat de ethanol uit de putten was verwijderd werden de platen aan de lucht gedroogd en vervolgens tot het gebruik bedekt en bewaard bij 4°C.

De resultaten van de ELISA proeven, uitgevoerd als hierboven 30 beschreven, toonden dat Pa3 IVC2 zich bond aan ethanol-gefixeerde Habs stammen 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 en 12. Dit specificiteitspatroon toonde dat Pa3 IVC2, gebonden aan type b flagella van P. aeruginosa (Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A 242 (1978) 228-238; J. Clin. Microbiol, 20 (1984) 84-88). Op basis van deze toekenning van specificiteit aan monoklonaal 35 Pa3 IVC2 dragen de P. aeruginosa referentiestammen, Fisher immunotype 2, Fisher immunotype 6 en Fisher immunotype 7 type b flagella. Uit de voor- 8701S54 -21- gaande experimentele gegevens werd geconcludeerd dat Pa3 1VC2 zich specifiek bindt aan P. aeruginosa flagelline type b.

In vivo beschermende activiteit van Pa3 XVC2

Er werden dierproeven uitgevoerd om te bepalen of monoklonaal 5 antilichaam Pa3 IVC2 een muis zou beschermen, bedreigt met meervoudige LDg0 van levende P. aeruginosa bacterie. Het gekozen model was het gebrande muismodel (J. Trauma 23 (1983) 530-534). Aan groepen van muizen werd een ernstige brandwond gegeven volgens het beschreven protocol en vervolgens onmiddellijk bedreigt met 5-10 LD^'s van Fisher immunotype 7. 10 Vóór de brandwond en de bedreiging werd monoklonaal antilichaam intra-peritoneaal toegediend als ascites met hoge titer (0,2 ml intraperito-neaal). In de met Pa3 IVC2 behandelde dieren werd geen toename van het aantal overlevenden waargenomen in vergelijking met de dieren, die geen antilichaam ontvingen.

15 VOORBEELD II

Voorbeeld II toont de methodologie voor de bereiding van een muizehybridoomcellijn, die een muizemonoklonaal antilichaam produceert tegen P. aeruginosa flagelline type b, dat in vivo beschermend is.

Volwassen vrouwelijke BALB/c muizen werden eerst intraperito- 20 neaal geïnjecteerd met levenskrachtige P. aeruginosa Fisher immunotype 6 0 (A.T.C.C. 27317) (8 x 10 organismen), twee weken later gevolgd door een -injectie van levensvatbare P. aeruginosa Fisher immunotype 5 0 (A.T.C.C. 27316) (4 x 10 organismen). Tijdens de daarop volgende periode van twee weken werden levensvatbare P. aeruginosa Fisher immunotype 5 25 en Fisher immunotype 6 tezamen toegediend in twee injecties per week.

De dosis van elk organisme werd verhoogd, zodanig dat de uiteindelijke dosis het tienvoudige was van de begindosis. Vier dagen na de laatste levensvatbare baGterie-injectie werd een laatste injectie gegeven van P. aeruginosa Fisher immunotype 6 buitenmembraanpreparaten (50 yg pro-30 teïne), bereid volgens J. Bacteriol. 136 (1978) 381-390). Drie dagen na de laatste immunisering werd van één muis de milt verwijderd en werden de miltcellen geprepareerd voor hybridisering op de in voorbeeld I beschreven wijze.

Bovenstaande cultuurvloeistoffen van de hybridoomcellen werden 35 onderzocht op de aanwezigheid van anti-P. aeruginosa antilichamen door ELISA op de dag 10 na de fusie volgens de in voorbeeld I beschreven 6701554 -22- procedures, behalve dat het antigen voor de ELISA platen bestond uit levensvatbare bacteriën, geïmmobiliseerd in de putten van de 96-puts microtiterplaten. De platen werden als volgt geprepareerd.

Vijftig microliter poly-L-lysine (PLL) (1 ug/ml in PBS) werd 5 toegevoegd aan elke put van de 96-putplaten en 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Ongeadsorbeerd PLL werd verwijderd en de putten werden driemaal gewassen met PBS. De overnacht in TSB gegroeide bacterie-culturen werden éénmaal gewassen met PBS en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in PBS tot O.D. ^ - 0,2. Vijftig microliter van de bacte- 10.-· riële suspensies werd toegevoegd aan elke put van de plaat en 1 uur bij 37°C met rust gelaten om te binden. Ongebonden bacteriën werden verwijderd, waarna de putten driemaal werden gewassen met zoutoplossing-Tween (0,9 % (gewicht/volume) NaCl, 0,05 % (volume/volume) Tween-20).

Niet-specifieke binding van de antilichamen werd geblokkeerd 15 door toevoeging van 200 μΐ/put blokkeringsbuffer (PBS, bevattende 5 % (gewicht/volume) niet-vette droge melk, 0,01 % (volume/volume) Anti-foam A (Sigma) en 0,01 % (gewicht/volume) thimerosal) aan de putten en incubatie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Overmaatblokkeringsbuf-fer werd verdreven en de putten werden driemaal gewassen met zoutoplos-20 sing-Tween, zoals eerder beschreven.

Bovenstaande cultuurvloeistoffen (50 yl) werden gekopieerd in de corresponderende putten van de analyseplaten en 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. De bovenstaande cultuurvloeistoffen werden verwijderd en de putten werden vijfmaal met zoutoplossing-Tween gewassen.

25 Een enzyme-geconjugeerd tweede trapantilichaam (mierikswortel- peroxydase-geconjugeerde geiteanti-muis IgG + IgM) werd verdund in PBS, bevattende 0,1 % (volume/volume) Tween-20 en 0,2 % (gewicht/volume) BSA volgens eerder uitgevoerde titraties, waarna 50 yl van het reagens werd toegevoegd aan elke put en 30 minuten bij kamertemperatuur werd 30 geïncubeerd. De overmaat reagens werd verwijderd; de putten werden vijfmaal gewassen in zoutoplossing-Tween; per put werd 100 yl o-fenyleen-diaminesubstraat toegevoegd, waarna 30 minuten werd geïncubeerd zoals beschreven in voorbeeld I. De reacties werden beëindigd zoals vermeld in voorbeeld I en vervolgens afgelezen bij A^^ op een Bio-Tek 35 EL-310 Automated EIA'Plate Reader.

8701554 -23-

Volgens de beschreven methoden werden de bovenstaande cultuur-vloeistoffen van de fusie onderzocht op de aanwezigheid van antilichamen, die zich bonden aan P. aeruginosa Fisher immunotypen 1, 2, 3 of 4, maar niet aan controleplaten, geprepareerd door dezelfde PLL en blokkerings-5 procedure, maar zonder bacteriën. Bovenstaande vloeistoffen, die anti-lichaam bevatten, dat zich bond aan één van deze vier Fisher immunotypen, werden een tweede maal onderzocht met elk van de zeven Fisher immunotypebacteriën afzonderlijk. Antilichaam aanwezig in de bovenstaande vloeistof van één put, PaF^ IVE8, bond zich alleen aan 10 . P^ aeruginosa Fisher immunotypen 2, 6 en 7« Cellen uit put PaF4 IVE8 werden gekloond door beperkende verdunningsmethoden, zoals beschreven in voorbeeld I. Het monoklonale antilichaam en de klonale cellijn uit deze put worden beide in de volgende tekst geïdentificeerd door de aanduiding PaF4 IVE8. Monoklonale antilichaam-bevattende ascitesvloëistof 15 met hoge titer werd gegenereerd zoals beschreven in voorbeeld I, behalve dat BALB/c muizen werden gebruikt in plaats van CB6F^.

Specificiteit van PaF4 IVE8

Een onderzoek, uitgevoerd ter indentificatie van het antigen, gebonden door monoklonaal antilichaam PaF4 IVE8 was indirekte immuno-20 fluorescentie op bacteriële organismen. Elk van de zeven referentie

Fisher immunotypen van P. aeruginosa plus een niet-geflagelleerde stam van P. aeruginosa (PA103, A.T.C.C. 29260, J. Bacteriol. 62 (1951) 377-389) en Escherichia coli (G.S.C. A25) werden overnacht bij 37QC in TSB gegroeid. De bacteriën werden gecentrifugeerd en vervolgens twee-25 maal gewassen in PBS. Elke stam werd opnieuw gesuspendeerd in PBS tot een O.D.-__ =2,2.

660 nm

De bacteriële suspensies werden vervolgens verder verdund 1:150-en monsters van 20 μΐ werden geplaatst in individuele putten van Carlson glaasjes en op het glaasje gedroogd bij 4Ö°C. Bovenstaande cultuurvloei-30 stoffen (25 μΐ) van PaF4 IVE8 werden op de glaasjes in een vochtigheids-kamer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op de gedroogde bacterie-monsters geïncubeerd. Ongebonden antilichaam werd van de glaasjes afgewassen door dompeling van de glaasjes in gedestilleerd water.

Nadat de glaasjes werden gedroogd werd fluoresceïne-isothio-35 cyanaat (FITC)-geconjugeerde geit anti-muis IgG + IgM (25 μΐ per put van een 1:40 verdunning in PBS) gedurende 30 minuten bij kamertempera- 6701554 -24- tuur in een bevochtigde kamer in het donker op de glaasjes geincubeerd. De glaasjes werden opnieuw in gedestilleerd water gewassen, gedroogd en vervolgens bedekt met een dekglas, gemonteerd met glycerol in PBS (9:1). De glaasjes werden met een fluorescentiemicroscoop bezichtigd.

5 Fluorescerende kleuring werd alleen waargenomen bij P. aeru ginosa Fisher immunotypen 2, 6 en 7 en vertoonde een sinusoidaal patroon (lijn) uitgaande van slechts ëên einde van de organismen. Dit is consistent met de morfolofie en lokatie van de enkele polaire flagellum van deze bacteriën.

10 De reactie van PaF4 IVE8 met flagella werd bevestigd door immunovloeianalyse. Buitenmembraanantigenen van P. aeruginosa Fisher immunotype 6 (zie voorbeeld I) werden gescheiden door elektroforese in een 14% polyacrylamidegel, dat SDS bevatte, zoals beschreven in voorbeeld I, behalve dat de elektroforese werd uitgevoerd gedurende 5 uur 15 bij een constant amperage van 80 mA. Voorgekleurde molecuulgewichtsmar-keringsmiddelen (lysozyme, MW 14.300; beta-lactoglobuline, MW 18.400; alfa-chymotrypsinogeen, MW 25.700; ovalbumine, MW 43.000; runderserum-albumine, MW 68.000; fosforylase B, MW 97.400; en myosine, MW 200.000) werden in hetzelfde polyacrylamidegel opgenomen.

20 Antigenen werden overnacht bij 4°C bij een constant amperage van 200 mA uit het polyacrylamidegel overgedragen op een nitrocellulosemem-braan (NCM) (0,45 μιη) in een Tris-glycine-methanolbuffer (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 76 (1979) 4350-4354), bevattende 0,05% (gewicht/vo-lume) SDS. Na de overdracht werd het NCM gedurende 1 uur bij kamertem-25 peratuur geincubeerd in 0,05% (volume/volume) Tween-20 in PBS (PBS-Tween) (J. Immunol. Meth. 55 (1982) 297-307). Bij deze behandeling en alle volgende behandelingen werd de schotel, die het NCM bevatte, geplaatst op een schommelplatform teneinde verdeling van de oplossing over het gehele NCM te verzekeren.

30 Na 1 uur werd de PBS-Tween oplossing afgegoten en werd PaF4 IVE8 ascites (verdund 1:1000 in PBS-Tween) toegevoegd en met het NCM gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geincubeerd. Het NCM werd vervolgens vijfmaal, steeds 5 minuten, gewassen met PBS-Tween ter verwijdering van ongebonden antilichaam- Alkalische fosfatase-geconjugeerde geit 35 anti-muis IgG + IgM (Tago, Ine.) werd verdund volgens de specificaties van de fabrikant en met het NCM gedurende 1 uur bij kamertemperatuur 8701554 i i -25- gelncubeerd. Het NCM werd vijfmaal op de beschreven wijze gewassen, waarna substraat-bevattend broomchloorindolylfosfaat en nitrablauw tetra-zolium (Sigma) bereid zoals beschreven in Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.

80 (1983) 4045-4049) werd toegevoegd en 10-20 minuten bij kamertempera-5 tuur gelncubeerd. De reactie werd beëindigd door wegwassen van het substraat met gedestilleerd water.

De resultaten van dit experiment toonden dat PaF4 IVE8 zich specifiek bond aan een enkel antigen met een molecuulgewicht van 53.00 dalton in het buitenste membraanpreparaat. De resultaten van het 10 indirekte immunofluorescentie-onderzoek en immunovloeien tonen dat PaF4 IVE8 zich bindt aan de flagella van P. aeruginosa.

Het flagellatype, dat PaF4 IVE8 onderkende werd door ELISA bepaald. Habs stammen 1-12 (A.T.C.C. 33348-33359) werden elk gebonden aan putten van 96-puts microtiterplaten (Linbro) met PLL, waarna de ELISA 15 werd uitgevoerd zoals eerder in dit voorbeeld beschreven. De bron van

PaF4 IVE8 antilichaam was bovenstaande cultuurvloeistof. Positieve reacties werden waargenomen in putten, die Habs stammen 2, 3, 4, 5, 7, 10, * 11 en 12 bevatten, waaruit blijkt dat PaF4 IVE8 zich bindt aan type b flagella. De beschermingsgegevens in vivo worden gepresenteerd in voor-20 beeld IV.

VOORBEELD III

Voorbeeld III toont de methodologie voor de bereiding v.an een muizehybridoomcellijn, die een monoklonaal antilichaam produceert, dat reactief is met anti-P. aeruginosa flagella type a, dat beschermend is 25 in vivo.

De lymfoldecelbron voor de fusie was een milt uit een geïmmuniseerde BALB/c muis,die in de loop van een periode van zes weken viermaal intraperitoneaal was geïnjecteerd met gezuiverd type a flagella (10-20 ug proteïne) uit Habs stammen 6 en 8 (A.T.C.C. 33353 en 33355). Flagella 30 werden gezuiverd volgens de methode, beschreven in Infect. Immun. 35 (1982) 281-288, met dit verschil dat de laatste centrifugering van flagella was bij 100.000 x g gedurende 1 uur in plaats van 40.000 x g gedurende 3 uur. Een tweede modificatie, die voor sommige procedures werd toegepast, was de flagella van de bacterie te scheiden gedurende 35 30 seconden in een menger in plaats van 3 minuten (Infect. Immun. 49 (1985) 770-774).

£721554 -26-

Proteïneconcentraties van elk preparaat werden bepaald met de Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad) en de aanwezigheid van verontreinigend lipopolysaccharide (LPS) werd bepaald door meting van het KDO gehalte (Anal. Biochem. 85 (1978) 595-601). De molecuulgewichten van de fla-5 gellaprotelnen werden bepaald door vergelijking van hun migratie in een SDS pölyacrylamidegel met de migratie van standaardprotelnemerkers (BRL) (zie voorbeeld II). Het molecuulgewicht van Habs 6 flagelline was 51.700 dalton en dat van Habs 8 flagelline 47.200 dalton. Deze waarden stemmen overeen met die van Infect. Immun. 49 (1985) 770-774.

10. Fusie van splenocyten uit flagelline-geïmmuniseerde muizen en NS-1 myeloomcellen werd drie dagen na de laatste immunisering uitgevoerd, zoals beschreven in de voorbeelden I en II. Toen de hybridoom-cellen groeiden tot een samenvloeiing van ongeveer 40% (dag 7) werden de bovenstaande cultuurvloeistoffen gekopieerd in overeenkomstige putten 15 van drie verschillende antigenplaten, PLL-gebonden P. aeruginosa Fisher immunotype 1 (zie voorbeeld II voor de bereiding) en formaline-gefixeer-de Habs 6 en Habs 9.

De bacteriën voor de formaline-gefixeerde antigenplaten werden gegroeid, gewassen en verdund zoals beschreven voor PLL-gebonden anti-20 genplaten. Verdunde bacteriën (0,2 O.D.-eenheden bij Agg^) werden toegevoegd aan individuele putten (50 μΐ per put) van Linbro 96-puts microti terplaten, waarna de platen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur werden gecentrifugeerd bij 1200 x g. De bovenstaande vloeistoffen werden uit de putten verwijderd en 75 μΐ 0,2%'s (volume/volume) formaline in 25· PBS werd aan elke put toegevoegd en gedurende 15 minuten*bij kamertemperatuur geïncubeerd. Nadat de formaline uit de putten was verwijderd, werden de platen aan de lucht gedroogd en tot het gebruik bij 4°C bewaard. Formaline bracht geen wijziging in de antigeniciteit van de flagella, zoals blijkt uit het vermogen van anti-flagella antisera tot 30 agglutinatie van met formaline behandelde organismen (Acta Microbiol.

Acad. Sci., Hung. 17 (1970) 3548). P. aeruginosa Fisher immunotype 1 stam werd als controle gebruikt, omdat deze stam niet-geflagelleerd was, zoals bij beitskleuring bleek (Manual of Clin. Microbiol. (1985) ed. Amer. Soc. Microbiol., blz. 1099). Hybridecellen in de put, aangeduid als 35 FA6 11(35 produceerde een antilichaam, dat zich bond aan Habs 6 en Habs 9 (beide flagella type a dragende stammen), maar niet aan Fisher immunotype 1.

8701554 -27-

Cellen uit de put FA6 IIG5 werden in een subcultuur gekweekt en gekloond zoals beschreven in de vorige voorbeelden. Het monoklonale antilichaam en de klonale cellijn uit deze put worden in het hiernavolgende verder aangeduid als FA6 IIG5. Ascites werd geproduceerd in BALB/c muizen, 5 zoals beschreven in voorbeeld II.

Specificiteit van FA6 IIGS

De specificiteit van het antilichaam FA6 IIG5 werd bepaald door indirekte immunofluorescentie en immunovloeiing. De indirekte immuno-fluorescentie werd in wezen uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld II 10 met de volgende modificaties.

Bacterieculturen, die overnacht waren gegroeid op trypticase-soja-agar bij 30°C werden van de platen verwijderd met wattenstaafjes en opnieuw gesuspendeerd in PBS tot een Aggg van 0,2 0.D.-eenheden. Formaline (0,37% (volume/volume) in PBS eindconcentratie) werd aan de 15 suspensie onder wervelen toegevoegd. Na incubatie bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten werden de bacteriën 1:12 verdund in PBS, waarna 20 μΐ van de suspensie werd geplaatst in individuele putten van Carlson glaasjes. Na droging werden de glaasjes geprepareerd voor bezichtiging, zoals beschreven in voorbeeld II. De bron van antilichaam was boven-20 staande cultuurvloeistof van de FA6 IIG5 cellijn.

Fluorescerende kleuring door het FA6 IIG5 antilichaam werd alleen waargenomen met P. aeruginosa stammen, die type a flagella dragen en bij geen. die type b dragen. Het waargenomen fluorescentiepatroon was een sinusoldaal lijnpatroon, hetgeen toont dat het FA6 IIG5 zich aan de 25 flagella bond. Het fluorescentiesignaal werd versterkt door behandeling van de bacteriën met formaline, maar de behandeling was niet nodig om de flagellaire kleuring met het antilichaam zichtbaar te maken.

Immunovloeiing werd uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld II.

De bronnen van flagella type a antigenen waren de gezuiverde flagellaire 30 preparaten (zie dit voorbeeld). Antigenen werden gescheiden in 10% poly-acrylamidegels, die SDS bevatten (Nature 227 (1970) 680-685) en overgedragen op een NCM. Preparaten van FA6 IIG5, hetzij bovenstaande cultuurvloeistof, hetzij ascites verdund 1:1000, werden met het NCM tot reactie gebracht en de reactie werd ontdekt met een geschikt enzyme-geconju-35 geerd reagens en enzymesubstraat, zoals beschreven in voorbeeld II.

570 1 55 4.

-28-

De immunovloeiing toonde dat FA6 IIG5 zich specifiek bond aan het 51.700 MW flagelline van Habs 6 en het 47.200 MW flagelline van Habs 8.

Bevestiging dat FA6 IIG5 alleen met flagella type a reageerde en niet met type b werd verkregen door ELISA, waarin Habs stammen 1-12 5 individueel werden gebonden met PLL aan de putten van Linbro 96-puts microtiterplaten. Het antilichaam bond zich alleen aan Habs stammen 1, 6, 8 en 9, die de enige flagella type a dragende stammen van de 12 zijn (J. Clin. Microbiol. 20 (1984) 84-88). Onderzoek betreffende bescherming in vivo wordt gepresenteerd in voorbeeld IV.

10 VOORBEELD IV

Voorbeeld IV toont de bescherming van muizen, die passief zijn geïmmuniseerd met antilichamen PaF4 IVE8 en FA6 IIG5 tegen bedreiging met P. aeruginosa in het gebrande muismodel.

De anti-flagella monoklonale antilichamen werden in het gebrande 15 muizemodel beproefd volgens de methode, beschreven in J. Trauma 23 (1983) 530-534. Voor het beschermingsonderzoek werden alle antilichamen gezuiverd door proteïne A-Sepharose chromatografie (Immunochemistry 15 (1978) 429-436) en gedialyseerd in PBS buffer. De voor de dierproeven gebruikte flagella type a dragende stam was P. aeruginosa PA220 (van 20 dr. James Pennington, Boston) en de flagella type b stam was de referentie P. aeruginosa Fisher immunotype 2 (A.T.C.C. 27313).

Per muis werd 1-2 uur voor het branden en de bedreiging 40 ug gezuiverd monoklonaal antilichaam intraveneus toegediend. Onmiddellijk na de branding ontvingen de dieren 0,5 ml koude PBS subeschar, die de 25 bedreigende bacteriën bevatte. De bedreigingsdosis was ongeveer 10 LD^J s voor elk organisme. De resultaten van de dierproeven zijn vermeld in de tabellen A en B.

8701554 -29-

TABEL· A

Beschermingsonderzoek van een anti-flagella type a ^ monoklonaal antilichaam in het gebrande muizemodel.

% overleving per dag2

Behandeling 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MFA6fXIG5lla 100 100 100 100 100 90 90 80 80 b" 100 20 10 10 10 10 10 10 10

PaF4 IVES

Niet-specifiek anti- LPS monoklonaal 100 40 30 20 10 10 10 10 10 antilichaam PBS, zonder 7 7 .- 80 80 80 80 80 80 80 80 80 bacteriën 1 Muizen werden subeschar bedreigd met ongeveer 10 LD^^'s van P. aeruginosa PA 220.

2 ...

Het percentage rs gebaseerd op de overleving van muxzen m uit 10 dieren bestaande groepen, met uitzondering van de PBS alleen controlegroep, die uit 5 muizen bestond. De dagen worden geteld na het branden van de bedreiging.

.3 7 C * 55 4 -30-

TABEL B

Beschermingsonderzoek van een anti-flagella type b ^ monoklonaal antilichaam in het gebrande muizemodel.

% overleging per dag1

Behandeling 123456789

AnpaF41I^8la b' 100 100 90 90 90 90 90 90 90

AnFA6fIIG5lla ^ 100 20 10 10 10 10 10 10 10

Niet-specifieke anti- LPS monoklonaal 100 20 20 20 20 20 20 20 20 antilichaam poe zoTifipy z' ^ ·- · 100 100 100 100 100 100 100 100 100 bacteriën

Muizen werden subeschar bedreigd met ongeveer 10 LD^'s van P. aeruginosa Fisher immunotype 2.

8701554

Zie voetnoot 2 bij tabel A.

-31-

Zeer significante overleving werd waargenomen in muizen, die waren behandeld met het anti-a antilichaam of anti-b antilichaam en vervolgens bedreigd met het corresponderende antigen. Omgekeerd stierf 80-90% van de onbehandelde, maar bedreigde muizen of dieren, behandeld 5 met een niet-passend anti-flagellair monoklonaal antilichaam of niet-specifiek anti-LPS antilichaam. Het onvermogen van het anti-flagella type a antilichaam om muizen van een dodelijke bedreiging van flagella type b dragende P. aeruginosa Fisher immunotype 2 te beschermen, en het onvermogen van het anti-flagella type b antilichaam om muizen te be-10 schermen tegen een dodelijke bedreiging van type a dragende P. aeruginosa PA220, bevestigde in vivo de specificiteit van de antilichamen, die in vitro was aangenomen. Overleving van gebrande, maar niet geïnfecteerde muizen toonde dat de brandwond zelf niet dodelijk was.

VOORBEELD Y

15 Voorbeeld V toont de extensieve kruisreactiviteit van PaF4 IVE8 en Fa6 IIG5 met P. aeruginosa klinische isolaten, waaruit de klinische bruikbaarheid van deze antilichamen voor de immunotherapie van P. aeruginosa infecties blijkt.

Klinische isolaten werden verkregen uit ziekenhuizen en klinie-20 ken. De isolaten waren afkomstig van een variëteit van isolatieplaatsen, waaronder bloed, wonden, ademhalingswegen, urine en oren. In totaal werden 157 isolaten onderzocht.

PaF4 IVE8 bond zich specifiek aan 34 klinische isolaten (22%), terwijl het flagella type a antilichaam, FA6 IIG5, zich bond aan 102 25 klinische isolaten (65%), dus in totaal 136 van 157 isolaten (87%).

Van de 21 stammen, die door geen van beide antilichamen werden herkend, waren 19 niet-geflagelleerd, zoals bij beitskleuring bleek- Beide antilichamen in combinatie bonden zich derhalve aan 136 van 138 (98%) ge-flagelleerde klinische isolaten, hetgeen eerdere rapporten bevestigt 30 (Zbl. Bakt. Hyg., I Abt. Orig. A 242 (1978) 228-238).

VOORBEELD VI

Voorbeeld VI toont methoden voor de produktie van menselijke monoklonale antilichamen, die zich binden P. aeruginosa tybe b flagella.

35 Een perifeer bloedmonster van een individu, geïmmuniseerd met een hoog moleculair polysaccharidepreparaat (Infect. Immun. 45 (1984) 309) diende als bron van B cellen.

370 1 554 ψ ·* -32-

Mononucleaire cellen werden uit het bloed afgescheiden volgens stan-daardcentrifugeringstechnieken op Ficoll-Paque (Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (1968) 77) en tweemaal gewassen in calcium/magnesium-vrije fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).

5 De mononucleaire cellen werden verarmd aan T-cellen onder toe passing van een gemodificeerde E-rozetprocedure. De cellen werden eerst 7

opnieuw gesuspendeerd tot een concentratie van 1 x 10 cellen/ml in PBS

van 4°C, bevattende 20% foetaal kalfserum (FCS). Van deze suspensie werd 1 ml geplaatst in een 17 x 100 ml polystyreen rondbodembuis, waaraan g 10 1 x 10 met 2-amino-isothiouroniumbromide (AET)-behandelde rode schape- bloedcellen werd toegevoegd uit een 10%'s (volume/volume) oplossing in Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (Iscove's medium) (zie J. Immun. Methods 27 (1979) 61). De suspensie werd 5-10 minuten zeer zacht bij 4°C gemengd, waarna de E-rozetcellen werden verwijderd door centrifu-15 geren op Ficoll-Paque gedurende 8 minuten bij 2500 x g bij 4°C. E-rozet-negatieve perifere mononucleaire bloedcellen (E PBMC), die zich verenigden aan het grensvlak, werden verzameld en eenmaal gewassen in Iscove's medium, en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in hetzelfde medium, bevattende 15% (volume/volume) FCS, L-glutamine (2 mxnol/1) penicilline -4 20 (100 lü/ml), streptomycine (100 ug/ml), hypoxanthine (1 x 10 M), amino- -7 -5 pterine (4 x 10 M) en thymidine (1,6 x 10 M). Dit medium wordt verder aangeduid als HAT-medium.

Cel-gedreven transformatie van de E PBMC werd tot stand gebracht door co-cultivering van deze cellen met een transformerende cellijn.

25' De transformerende cellijn was een Epstein-Barr nucleair antigen (EBNA) positief menselijke lymfoblastoidecellijn, afgeleid door ethylmethaan-sulfonaat (EMS) mutagenese van de GM 1500 lymfoblastoidecellijn, gevolgd door selectie in tegenwoordigheid van 30 yg/ml 6-thioguanine om de cellen hypoxanthine-guaninefosforibosyltransferase (HGPRT) deficiënt en aldus 30 HAT-gevoelig te maken. Deze cellijn wordt aangeduid als de 1A2 cellijn en werd gedeponeerd bij de American Type Culture Collection (A.T.C.C.) op 29 maart 1982 onder A.T.C.C. No. CRL 8119. 1A2 cellen in logaritmische groeifase werden gesuspendeerd in HAT-medium en vervolgens gecombineerd met de E PBMC1s in een verhouding van vijftien 1A2 cellen per PBMC. 35 Het celmengsel werd geplateerd in dertig rondbodem 96-puts microtiter-platen (Costar 3799) bij een concentratie van 32.000 cellen/put in een 870 1 554 -33- volume van 200 μΐ per put, en gelncubeerd bij 37°C in een bevochtigde atmosfeer, die 6% C02 bevatte. De culturen werden gevoed op de dagen 5 en 8 na het plateren door vervanging van de helft van de bovenstaande vloeistof met vers HAT-medium. Zestien dagen na het plateren vertoonde 5 100% van de putten prolifererende cellen en in de meeste van de putten waren de cellen van voldoende dichtheid voor verwijdering en beproeving van bovenstaande vloeistoffen op anti-P. aeruginosa antilichamen.

Bovenstaande vloeistoffen werden gescreend, op de aanwezigheid van anti-P. aeruginosa antilichamen onder toepassing van de ELISA-10 techniek, zoals beschreven in voorbeeld II met de volgende modificaties. Een combinatie van de zeven Fisher immunotype referentiestammen (A.T.C.C. 27312-27318) (A-__ = 0,2 O.D.-eenheden) werd gebonden aan DOÜ platbodem 96-puts microtiterplaten (Immulon II, Dynatech) voorbehandeld met poly-L-lysine, gelncubeerd en gewassen zoals beschreven in voor-15 beeld II. Na blokkering van niet-specifieke bindingsplaatsen en wassen van de platen werd per put 50 μΐ PBS, bevattende 0,1% (volume/volume) Tween-20 en 0,2% (gewicht/volume) BSA toegevoegd. Bovenstaande cultuur-vloeistoffen werden vervolgens gekopieerd door plateren in de corresponderende putten van assayplaten en in controleplaten, die werden behan-20 deld met PLL en geblokkeerd, maar geen bacteriën bevatten. Na incubatie en wassen werden enzyme-geconjugeerde tweede-trapantilichamen (50 μΐ per put), mierikswortelperoxydase-geconjugeerde geit anti-mens IgG en geit anti-mens IgM, op passende wijze verdund in PBS, bevattende 0,1% (volume/volume) Tween-20 en 0,2% (gewicht/volume) BSA, aan de putten toe-25 gevoegd en werd de assay voltooid zoals beschreven in voorbeeld II.

Bovenstaande vloeistoffen, die antilichaam bevatten, dat zich bond aan de combinatie van Fisher immunotypen, maar niet aan de controleplaat, werden een tweede maal onderzocht onder toepassing van elk van de zeven Fisher immunotype bacteriën afzondelijk. Antilichaam aanwezig in 30 de bovenstaande vloeistof van één put, 20H11, bond zich alleen aan P. aeruginosa Fisher immunotypen 2, 6 en 7. De cellen werden herhaaldelijk onderworpen aan subcultuur bij afnemende lage celdichtheden, totdat alle putten met groei antilichaam afscheidden. De cellijn en het monoklonale antilichaam (IgM isotype) worden beide in het hiernavolgende aangeduid 35 als 20H11.

8701554 -34-

Een tweede transformatie werd uitgevoerd, waarbij de bron van B cellen afkomstig was van het perifere bloed van een blaasfibrose-patiënt, waarvan bekend was dat hij een chronische P. aeruginosa infectie had. E PBMC's werden bereid als hierboven beschreven en gecoculti-5 veerd met de transformerende cellijn, 1A2, in een verhouding van 72 1A2 cellen per E PBMC. Het celmengsel werd geplateerd in vijftien rondbodem 4 96-puts microtiterplaten in een concentratie van 7,4 x 10 cellen per put en vervolgens gekweekt zoals boven.

Bovenstaande vloeistoffen werden 16 dagen na het plateren van 10 de transformatie onderzocht volgens ELISA op de aanwezigheid van anti- P. aeruginosa antilichamen. De assay werd uitgevoerd als beschreven voor de vorige transformatie, behalve dat de combinatie van P. aeruginosa stammen, gebruikt voor de eerste screening, was samengesteld uit Fisher immunotype referentiestammen F2, F4, F6 en F7 (A.T.C.C. 27313, 27315, 15 27316 en 27317) en drie klinische isolaten van de Genetic Systems

Corporation Organism Bank (GSCOB), die verschillende LPS immunotypen en flagellatypen hadden. Het klinische isolaat PSA 1277 (GSCOB) draagt type a flagella en Fisher immunotype 1 LPS; het tweede isolaat PSA G98 (GSCOB) draagt type a flagella en Fisher immunotype 3 LPS? en de derde, PSA F625 20 (GSCOB) draagt type b flagella en Fisher immunotype 5 LPS. Dit mengsel van referentiestammen en klinische isolaten zal worden aangeduid als dë P. aeruginosa geflagelleerde combinatie. Bovenstaande vloeistoffen, die antilichaam bevatten dat zich bond aan platen, die de P. aeruginosa geflagelleerde combinatie bevatten, maar niet aan de met PLL-beklede con-25^ troleplaten, werden volgens ELISA een tweede maal onderzocht op de individuele stammen van de combinatie. Eén put, 3C1, bond zich aan referentiestammen F2, F6 en F7 en aan het klinische isolaat F625.

Klonen van de 3C1 cellijn geschiedde door eerst de cellen te onderwerpen aan subcultuur in twee· ronden van lage-dichtheidsubcultuur, 30 eerst bij 20 cellen per put van 96-puts platen, gevolgd door kweken bij 2 cellen per put. Formeel klonen van de specifieke antilichaam-produce-rende cellen geschiedde door plateren van de cellen bij een dichtheid van ongeveer 1 cel/put in 72-puts Terasaki platen in een volume van 10 lil HAT-medium zonder de aminopterinecomponent (HT-medium) per put.

35 De platen werden 2-3 uur in een incubator geplaatst om de cellen te laten bezinken naar de bodem van de putten en werden vervolgens microsco- 8701554 -35- pisch onderzocht door twee individuen voor putten,.die een enkele cel bevatten. De putten werden dagelijks gevoed met HT-medium en toen de uitgroei voldoende was werden de cellen overgebracht naar een 96-puts rondbodemplaat. Alle putten met uitgroei werden onderzocht volgens 5 ELISA op P. aeruginosa stammen, die type b flagella droegen, en alle bleken het geschikte antilichaam te produceren. De cellijn en het mono-klonale antilichaam (IgM isotype) worden in het volgende aangeduid als 3C1.

Het door 20H11 en 3C1 geïdentificeerde antigen was flagellair, 10 zoals getoond door indirekte immunofluorescentie en immunovloeiing.

De technieken werden in principe zoals beschreven in voorbeelden II en III toegepast. Voor het indirekte immunofluorescentie-onderzoek werden P. aeruginosa stammen met type b flagella, referentie Fisher immuno-typen F2, F6 en F7 (A.T.C.C. 27313, 27317 en 27318) en een stam met type 15 a flagella, referentie Fisher immunotype 4 (A.T.C.C. 27315) geprepareerd als beschreven in voorbeeld III. Het flagellatype van de referentie-stammen werd bepaald door typering met de muizemonoklonale antilichamen PaF4 IVE8 en FA6 IIG5. De glaasjes werden geprepareerd voor inspectie, zoals beschreven in voorbeeld II. De bronnen van beide antilichamen 20 waren bovenstaande cultuurvloeistoffen en het FITC-geconjugeerde reagens was FITC-geconjugeerd geit anti-mens Ig (polyvalent) 1:100 verdund in PBS, bevattende 0,5% (gewicht/volume) rundergammaglobulinen (Miles Scientific, Cat. No. 82-041-2) en 0,1% (gewicht/volume) natriumazide als conserveringsmiddel.

25 Fluorescerende kleuring door de 20H11 en 3C1 antilichamen werd alleen waargenomen met P. aeruginosa stammen met type b flagella en niet met de flagella type a dragende stam, referentie Fisher immunotype 4.

Het waargenomen fluorescentiepatroon was een sinusoxdaal lijnpatroon, uitgaande van één uiteinde van de bacterie, hetgeen toonde dat de anti-30 lichamen zich bonden aan de flagella van de bacterie.

Immunovloeiing werd uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld II. Gezuiverde type b flagella van de P. aeruginosa referentiestammen Fisher immunotype 2 (A.T.C.C. 27313) en gezuiverde flagella type a van referentiestammen Habs 6 en Habs 8 (A.T.C.C. 33353 en 33355) werden bereid zo-35 als in voorbeeld III beschreven. Antigenen werden gescheiden in een 10% polyacrylamidegel (zie voorbeeld III) en overgedragen op een NCM.

57 ö155 4 -36-

Bovenstaande cultuurvloeistoffen, bevattende 20H11 of 3C1 antilichamen, bovenstaande cultuurvloeistof bevattende een niet-specifiek menselijk antilichaam en cultuurmedia werden met het NCM geïncubeerd en de reactie werd ontdekt met een alkalisch fosfatase-geconjugeerd geit anti-mens Ig 5 (polyvalent), verdund in PBS bevattende 0,05% (volume/volume) Tween-20. Enzymesubstraat werd bereid zoals beschreven in voorbeeld II. De immuno-vloeiing toonde dat beide antilichamen zich bonden aan het 53.000 MW flagellineprotelne van Fisher immunotype 2 en niet aan het 51.700 MW flagellineproteïne van Habs 6 noch aan het 47.200 MW flagellineprotelne 10 van Habs 8. Er werd geen reactie waargenomen met het niet-specifieke menselijke antilichaam of met de cultuurmedia.

Verdere bevestiging dat antilichamen 20H11 en 3C1 zich alleen bonden aan type b flagella en niet aan type a werd verkregen door ELISA, waarin Habs stammen 1-12 individueel werden gebonden met PLL aan de put-15 ten van Immulon 96-puts microtiterplaten. De antilichamen bonden zich alleen aan Habs stammen 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 en 12, die type b dragende stammen zijn (J. Clin. Microbiol. 20 (1984) 84).

VOORBEELD VII

Voorbeeld VII toont methoden voor de produktie van een menselijk 20 monoklonaai antilichaam, dat zich bindt aan P. aeruginosa type a flagella.

Een perifeer bloedmonster van een individu, geïmmuniseerd met een hoogmoleculair polysaccharidepreparaat (Infect. Immun, 34 (1981) 461) diende als bron van B cellen. De mononucleaire cellen werden uit 25 het bloed afgescheiden en vervolgens verarmd aan T-celleii, zoals beschreven in voorbeeld VI. Daarna werden de cellen bevroren in FCS, bevattende 10% dimethylsulfoxyde in een vloeibare stikstofdamptank. Op een latere datum werden de cellen snel tot 37°C ontdooid, éénmaal gewassen in Iscove's medium en opnieuw gesuspendeerd in HAT-medium. Cel-gedreven 30 transformatie werd tot stand gebracht door co-cultivering van de E PBMC's met 1A2 cellen in een verhouding van 30 1A2 cellen per E PBMC. Het cel-mengsel werd geplateerd in 30 96-puts weefselcultuurplaten in een concentratie van 62.000 cellen per put. De zevende dag na het plateren werden de culturen gevoed door vervanging van de helft van het volume met 35 HAT-medium. Op de veertiende dag na het plateren werd celproliferatie waargenomen in 100% van de putten en bovenstaande vloeistoffen werden uit de putten verwijderd en onderzocht.

8701554 -37-

De bovenstaande vloeistoffen werden volgens ELISA onderzocht op de aanwezigheid van anti-P. aeruginosa antilichamen door gebruik van de geflagelleerde P. aeruginosa combinatie en PLL-behandelde platen als controle, zoals beschreven in voorbeeld VI. Bovenstaande vloeistoffen, 5 die antilichamen bevatten, die zich bonden aan de geflagelleerde combinatie, maar niet aan de PLL controleplaten, werden opnieuw onderzocht op de individuele bacteriestammen van de geflagelleerde combinatie.

Eên put, 21B8, bevatte antilichaam dat zich bond aan PSA 1277, PSA G98 en referentie Fisher immunotype 4, dat wil zeggen de drie stammen van 10 : de geflagelleerde combinatie, die type a flagella dragen.

Klonen van de 21B8 cellijn geschiedde zoals beschreven in voorbeeld VI voor de 3C1 cellijn met de volgende modificaties in de formele kloningstrap. Nadat de putten van de Terasaki platen waren onderzocht op de aanwezigheid van slechts één enkele cel, werd elke cel van de 15 Terasaki plaat overgebracht naar één individuele put van een 96-puts rondbodemcultuurplaat in een volume van 100 μΐ HAT-medium zonder de aminopterinecomponent (HT-medium). In alle putten werden niet-transfor-merende HAT-gevoelige lymfoblastoxdecellen opgenomen in een dichtheid van 500 cellen/put als voedingscellen. Vijf dagen na het plateren werd 20 100 μΐ HAT-medium aan de putten toegevoegd om de voedingscellen selec tief te doden. Op de dagen 7 en 9 na het plateren werden de putten opnieuw gevoed door vervanging van de helft van de bovenstaande vloeistof door HAT-medium. Vervolgens werden de cellen gevoed met HT-medium, totdat de cellen van voldoende dichtheid waren om de aanwezigheid van anti-25 lichaam volgens ELISA te ontdekken. Alle putten met uitgroei produceerden antilichaam, dat zich bond aan flagella type a dragende P. aeruginosa stammen. De cellijn en het monoklonale antilichaam (IgG^ isotype) worden in het volgende beide aangeduid als 21B8.

Het door 21B8 geïdentificeerde antigen was flagella, zoals ge-30 toond door indirekte immunofluorescentie en immunovloeiing {zie voorbeeld VI voor beschrijvingen van de technieken). Fluorescerende kleuring door het 21B8 antilichaam werd alleen waargenomen met P. aeruginosa referentiestam Fisher immunotype 4 (A.T.C.C. 27315), dat type a flagella draagt, en niet met P. aeruginosa referentiestam immunotype 2 (A.T.C.C. 35 27313) dat type a flagella draagt. Het waargenomen fluorescentiepatroon was een sunusoldaal lijnpatroon, uitgaande van een uiteinde van de 8701354 -38- bacterie, tonend dat het antilichaam was gebonden aan de flagella van de bacterie.

Immunovloeiing werd uitgevoerd zoals in voorbeeld II beschreven. Gezuiverde type a flagella van de P. aeruginosa referentiestam Habs 6 5 (A.T.C.C. 33353) en gezuiverde flagella type b van de P. aeruginosa referentiestam Fisher immunotype 2 (A.T.C.C. 27313) werden bereid zoals in voorbeeld III beschreven. Antigenen werden gescheiden in een 10% polyacrylamidegel (zie voorbeeld III) en overgedragen op een NCM. Bovenstaande cultuurvloeistoffen, bevattende 21B8 of een niet-specifiek men- 10. selijk antilichaam en cultuurmedia werden tot reactie gebracht met het NCM en de reactie werd ontdekt met een alkalisch fosfatase-geconjugeerd geit anti-mens Ig (polyvalent) en enzymesubstraat, zoals beschreven in voorbeelden II en VI. De immunovloeiing toonde dat het 21B8 antilichaam zich alleen bond aan het 51.700 MW flagellineproteïne van Habs 6 en niet 15 aan het 53.000 MW flagellineproteïne van Fisher immunotype 2. Geen reactie werd waargenomen met het niet-specifieke menselijke antilichaam of de cultuurmedia.

VOORBEELD VIII

Voorbeeld VIII toont bescherming van muizen, die passief zijn 20 geïmmuniseerd met menselijke anti-flagella antilichamen, 20H11, 3C1 en 21B8, tegen bedreiging met P. aeruginosa in het gebrande muizemodel.

De menselijke anti-flagella monoklonale antilichamen werden beproefd in het gebrande muizemodel (zie voorbeeld IV). 21B8 en 20H11 antilichamen werden bereid door precipitatie van bovenstaande cultuur-25· vloeistoffen, gegenereerd uit de respectievelijke cellijnen met ammonium-sulfaat (50% uiteindelijke concentratie) (Selected Methods in Cellular Immunology, San Francisco, 1980, 279-286). Het precipitaat werd gesolu-biliseerd in PBS, overnacht bij 4°C gedialyseerd tegen PBS en dan steriel gefiltreerd alvorens aan dieren te worden toegediend. De bron van anti-30 licham 3C1 en het niet-specifieke anti-LPS antilichaam, dat bij het onderzoek als negatieve controle werd gebruikt, was bovenstaande cultuur-vloeistof. Als positieve controle voor elk onderzoek werd het geschikte gezuiverde monoklonale muize-antilichaam PaF4 IVE8 of FA6 IIG5 opgenomen.

35 De flagella type a dragende stam, die bij de dierproeven werd gebruikt, was het klinische isolaat PSA A522 (GSC0B), dat in staat is 8701554 -39- tOt expressie van Fisher immunotype 1 LPS, en de flagella type b stam was klinisch isolaat PSA A447 (GSCOB), dat in staat tot expressie van Fisher immunotype 6 LPS. De menselijke antilichamen (0,45 ml) werden voorgemengd met de bacteriën (meer dan 5 DD^g's in 0,05 ml) en subeschar 5 geënt, onmiddellijk nadat de brandwond was veroorzaakt. De resultaten van de dierproeven zijn vermeld in tabellen C, D en E.

3701554 J * -40-

TABEL· C

Beschermingsonderzoek van het menselijke anti-flagella type a monoklonale antilichaam 21B8 in het gebrande muizemodel.

% overleving per dag3

Behandeling 123456789

Sj;£la3ella a' 100 100 100 100 88 88 88 88 88

Menselijke anti- a.00 100 100 100 100 100 100 100 100 flagella a, 21B8

Menselijke anti- 100 00000000 flagella b, 21B8 PBS 100 25 12 12 12 12 12 12 12

Muizen werden subeschar bedreigd met meer dan 5 LD^^'s van P. aeruginosa PSA A522.

2 % overleving was gebaseerd op het aantal overlevende muizen • per groep van 8 dieren. De dagen zijn vanaf het branden en bedreigen.

3 Gezuiverd antilichaam (10 pg in 0,45 ml PBS) werd voorgemengd met de bacteriën en na het branden en bedreigen subeschar toegediend.

8701554 -41-

TABEL D

Beschermingsondezoek van het menselijke anti-flagella type ^ b monoklonale antilichaam 20H11 in het gebrande muizemodel.

% overleving dag2

Behandeling 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Muize anti-flagella b, 100 1Q0 1Q0 1(J0 100 100 100 1Q0 1QQ

PaF4 IVE81

Menselijke anti- ioo 100 100 100 100 100 100 100 100 flagella b, 20H11

Menselijke anti- 100 0 0 0 0 0 0 0 0 flagella a, 21B8

Media 80 00000000 ^ Muizen werden subeschar bedreigd met meer dan 5 's van P. aeruginosa klinisch isolaat, PSA A447.

2 % overleving was gebaseerd op het aantal overlevende muizen per groep van 5 dieren. De dagen zijn vanaf het branden en Bedreigen.

8701554

Zie voetnoot 3 bij tabel C.

3 * -42-

TABEL E

Beschermingsonderzoek van het menselijke anti-flagella type^ b monoklonale antilichaam 3C1 in het gebrande muizemodel.

2 % overleving per dag

Behandeling 123456789

Muize anti-flagella b, 1Q0 100 100 100 100 100 100 100 i00

PaF4 IVE83

Menselijke anti" 100 ioo 80 80 80 80 80 80 80 flagella b, 3C1

Niet-specifiek anti- LPS monoklonaal 100 00000000 antilichaam 1 Muizen werden subeschar bedreigd met meer dan 5 LD^^'s van PSA A447.

2 % overleging was gebaseerd op het aantal overlevende muizen in groepen van 5 dieren. De dagen zijn na het branden en bedreigen.

^ Gezuiverd antilichaam (40 pg) werd 2 uur vóór het branden en bedreigen intraveneus toegediend.

8701554 -43-

Zeer significante overleving werd waargenomen in muizen, die behandeld waren met het anti-flagella type a antilichaam of met ëën van de twee anti-flagella type b antilichamen, en vervolgens bedreigd met het corresponderende antigen. Omgekeerd stierf 88-100% van de onbehan-5 delde, maar bedreigde muizen, of muizen behandeld met een niet-passend anti-flagellair monoklonaal antilichaam of niet-specifiek anti-LPS antilichaam. Zoals werd waargenomen met de monoklonale muize-antilichamen (zie voorbeeld IV) beschermen de menselijke anti-flagella antilichamen specifiek tegen lethale bedreiging alleen met de organismen, die het 10 . overeenkomstige flagellatype dragen, dat wil zeggen dat het menselijke anti-flagella type a antilichaam bescherming verleende tegen lethale bedreiging met het flagella type a dragende organisme en niet het type b, en dat de anti-flagella type b antilichamen muizen beschermden, die waren bedreigd met flagella type b dragende stammen, maar niet het 15 type a dragende organisme-VOORBEELD IX

Voorbeeld IX toont de dwars-reactiviteit van de menselijke anti-flagella antilichamen 20H11, 3C1 en 21B8 met P. aeruginosa klinische isolaten.

20 P. aeruginosa klinische isolaten (115), verkregen van zieken huizen en klinieken en voornamelijk geïsoleerd van brandwonden en bloed, werden geïdentificeerd als dragende flagella type a of type b door typering met de monoklonale muize-antilichamen FA6 IIG5 of PaF4 IVE8 (zie voorbeelden II, III en V). Van de klinische isolaten werden vijf-25 - en-vijftig geïdentificeerd als dragende type a flagella door reactie met het monoklonale muize-antilichaam FA6 IIG5, en 59 werden geïdentificeerd als type b dragend door hun reactie met het monoklonale muize-antilichaam PaF4 IVE8.

De dwars-reactiviteit van het anti-flagella type a menselijke 30 monoklonale antilichaam 21B8 was extensief. Het antilichaam herkende 54 van de 56 flagella type a dragende klinische isolaten (96%). De dwars-reactiviteit van 20H11 met de isolaten, die type b flagella dragen, was eveneens extensief: 20H11 herkende alle 59 isolaten (100%). Daarentegen bond het andere anti-flagella type b monoklonale antilichaam, 3C1, 35 slechts 43 van de 59 isolaten (73%). Deze resultaten tonen dat 20H11 zich bindt aan een pan-reactief epitoop (d.w.z. een epitoop, aanwezig 8701554 * * -44- op ten minste 95% van de geflagelleerde P. aeruginosa stammen) , terwijl 3C1 zich bindt aan een epitoop dat niet op alle type b flagellinemoleculen aanwezig is. Zelfs hoewel het flagella type b antigen serologisch uniform is wanneer geanalyseerd met polyklonale antisera, tonen de dwars-reacti-5 viteitspatronen van 20H11 en 3C1 verrassenderwijze, dat de type b flagella ten minste twee afzonderlijke epitopen heeft, die door monoklonale antilichamen kunnen worden geïdentificeerd.

De extensieve dwars-reactiviteit van antilichamen 21B8 en 20H11 met p. aeruginosa klinische isolaten toont de bijzondere klinische bruik-10 baarheid van deze antilichamen in de immunotherapie van P. aeruginosa infecties.

VOORBEELD X

Voorbeeld 10 toont methoden voor de produktie van een ander menselijk monoklonaal antilichaam, dat zich bindt aan P. aeruginosa 15 type b flagella, alsmede de beschermende activiteit van dat antilichaam tegen bedreiging met P. aeruginosa in het gebrande muizemodel.

Een getransformeerde cellijn werd bereid en gekloond op de in voorbeeld VII beschreven wijze, behalve dat het getransformeerde cel-mengsel werd geplateerd op 20 96-puts weefselcultuurplaten in een con-20 centratie van ongeveer 2250 E PBMC per put. De bovenstaande vloeistoffen werden eerst onderzocht volgens ELISA aan de geflagelleerde combinatie, zoals beschreven in voorbeeld VI, behalve dat Fisher immunotype 2 en 4 referentiestammen in de combinatie ontbraken. Positieve putten werden vervolgens onderzocht op elk van de stammen in de geflagelleerde 25' combinatie, inclusief Fisher immunotype 2 en 4. De uiteindelijk geïsoleerde cellijn en het monoklonale antilichaam (IgG isotype) worden in het hiernavolgende aangeduid als 12D7.

Het 12D7 menselijke monoklonale antilichaam toonde extensieve dwars-reactiviteit met anti-flagella type a isolaten, herkennende 54 ' 30 van de 56 beproefde flagella type a dragende klinische isolaten (96%).

De beschermende activiteit van het 12D7 monoklonale antilichaam wordt in tabel F getoond. Het beschermingsonderzoek werd uitgevoerd op de in voorbeeld IV beschreven wijze, behalve dat de bedreigende dosis 1 LD^q0 bedroeg en .dat de bedreigende stam 16.24 was, een klinisch isolaat, 25 uitdrukkende Fisher immunotype 2 LPS en type a flagella.

8701554 -45-

TABEL· F

Beschermingsonderzoek van het menselijke anti-flagella type^ a monoklonale antilichaam 12D7 in het gebrande muizemodel.

% overleving per dag1

Behandeling^ 123456789

Menselijke antx- 100 3.00 100 100 100 100 100 100 100 flagella ar 12D7

Menselijke aati- 90 90 90 90 90 90 90 90 90

Fisher 2 LPS, 2H9

Mmze anti-flagelia 100 10q 100 100 100 100 100 100 100 a, 11G5

Menselijke anti- 25 2 25 flagella b, 15F4 1 Muizen werden subeschar bedreigd met 1 LD^qQ (950 CPU) van P. aeruginosa 1624.

2 % overleving was gebaseerd op het aantal overlevende muizen per groep van 10 dieren, behalve de 15F4 groep, die 8 dieren bevatte. De dagen zijn vanaf het branden en bedreigen.

3

Gezuiverd antilichaam (50 pg in 0,5 ml PBS) werd i.p. toegediend 8701554 uur vóór het branden en bedreigen.

> « -46-

VOOKBEELD XI

Voorbeeld XI toont de produktie van een menselijk monoklonaal antilichaam, dat reactief is met flagella b type P. aeruginosa en de bescherming van muizen, die passief zijn geïmmuniseerd met dit anti-5 lichaam tegen bedreiging met P, aeruginosa in het gebrande muizemodel.

Een getransformeerde cellijn werd bereid en gekloond op de in voorbeeld X beschreven wijze, behalve dat de transformatieverhouding van de 1A2 tot B cellen ongeveer 60:1 bedroeg en dat het getransformeerde celmengsel werd geplateerd op 15 platen in een concentratie van onge-1.0 veer 1930 E PBMC per put. Ook werden de cellen onderzocht in een combinatie van P. aeruginosa stammen, omvattende G98 (Fisher 3 immunotype, flagella type a) en 1739 (een klinisch isolaat van Fisher 5 immunotype, flagella type b), en bevestigd op een andere combinatie van P.' aeruginosa stammen; 1277, G98, 1739 en Fisher immunotypen F2, F4, F6 en F7.

15 De uiteindelijk geïsoleerde cellijn en het afgescheiden monoklonale antilichaam (IgG^ isotype) worden in het volgende aangeduid als 2B8.

Een immunofluorescentie-onderzoek, uitgevoerd met 2B8, was positief op een flagella type b, Fisher 2 immunotypestarn, maar negatief in een flagella type a, Fisher immunotype 4 referentiestam. Bij klinische 20 isolaatbeproeving 59/59 (100%) van geflagelleerde type b isolaten was het resultaat positief.

De beschermende activiteit van 2B8 wordt getoond in tabel G.

Het beschermende onderzoek werd uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld X, behalve dat klinisch isolaat F164 (Fisher immunotype 4, 25 flagella type b) voor de bedreiging werd gebruikt.

370 f554 -47-

TABEL G

Beschermingsonderzoek van het menselijke anti-flagella typ| b monoklonale antilichaam 2B8 in het gebrande muizemodel- % overleging per dag2

Behandeling 12345 6 789

Menselijke anti- g 100 gg 89 gg gg gg gg gg 8g flagella b, 2b8

Muize anti-flagella 1οσ χ00 100 100 100 100 90 90 90 b, PaF4 IVE8

Muize anti—Fisher 2 LPsV VH34 90 20 20 20 20 20 20 20 20

Muizen werden subeschar bedreigd met 1 (1Q5 cfü) van P. aeruginosa F164.

2 % overleving was gebaseerd op het aantal overlevende muizen per groep van 10 dieren, behalve de groep 2B8, die 9 dieren bevatten-De dagen zijn vanaf’ het branden en bedreigen.

2 Gezuiverd antilichaam (50 pg in 0,5 ml PBS) werd i.p. toegediend 2 uur vóór het branden en bedreigen.

4

Gezuiverd antilichaam (5 pg in 0,5 ml PBS) werd i.p. toegediend 2 uur vóór het branden en bedreigen.

d/01554

VOORBEELD XII

-48-

Voorbeeld XII toont de produktie van een ander menselijk mono-klonaal antilichaam, dat reactief is met flagella b type P. aeruginosa, en de bescherming van muizen, die passief met dit antilichaam zijn ge-5 immuniseerd tegen bedreiging met P. aeruginosa in het gebrande muize-model.

Een getransformeerde cellijn werd bereid en gekloond op de in voorbeeld VII beschreven wijze met de volgende uitzonderingen. Een ander individu werd geïmmuniseerd (Infect. Immun. 45 (1984) 309) en diende als 10 bron van B cellen, en het plateringsniveau van E PBMC bedroeg ongeveer 2000 cellen per put. De screening geschiedde op gecombineerd Fisher 1-7 immunotypen. De uiteindelijk geïsoleerde cellijn en het afgescheiden monoklonale antilichaam (IgG1 isotype) worden in het volgende beide aangeduid als 14C1.

15 Bij klinische beproeving bleken 59/59 (100%) van geflagelleerde type b isolaten positief met 14C1. Het beschermingsonderzoek werd uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld XI en de resultaten zijn vermeld in tabel H.

870 1 554 4- J; -49-TABEL Η

Beschermingsonderzoek van het menselijke anti-flagella type^ b monoklonale antilichaam 14C1 in het gebrande muizemodel.

— % overlevenden per dag

Behandeling 123456789

Menselijke anti- 100· ioo 100 100 100 90 90 90 90 flagella b, 14C1 MU^ZS, 100 100 100 100 100 100 100 100 100 b, PaF4 IVE8 , 100 40 20 20 20 20 20 20 20

Fisher 2 LPS, VH3 1 Muizen werden subeschar bedreigd met 1 LD^Q0 (90 CFü) van P. aeruginosa F164.

2 % overleving was gebaseerd op het aantal overlevende muizen per groep van 10 dieren, behalve de PaF4 IVE8 groep, die 9 dieren bevatte- De dagen zijn vanaf het branden en bedreigen.

3

Gezuiverd antilichaam (50 ug in 0,5 ml PBS) werd i.p. toegediend 2 uur vóór het branden en bedreigen.

8701554 -50- üit het voorgaande zal duidelijk zijn dat de cellijnen volgens de uitvinding middelen verschaffen voor de produktie van monoklonale antilichamen en fragmenten daarvan, die reactief zijn met P. aeruginosa flagella en dwars-beschermend tegen diverse P. aeruginosa stammen. Ver-5 rassenderwijze werd een aantal monoklonale antilichamen geïsoleerd, die reactief waren met verschillende epitopen op elk type flagella. De antilichamen volgens de uitvinding maken het mogelijk, dat profylactische en therapeutische composities economischer en gemakkelijker worden geproduceerd voor toepassing tegen infecties, veroorzaakt door de meeste 10 P. aeruginosa stammen. Verder verschaffen de cellijnen antilichamen, die toepassing vinden in immuno-onderzoek en andere bekende procedures.

17 91554

Claims (32)

1. Compositie, omvattende een monoklonaal antilichaam of bindend fragment daarvan, in staat tot specifieke reactie met flagella van Pseudomonas aeruginosa bacteriën.

1. Compositie, omvattende een monoklonaal antilichaam of bindend fragment daarvan, in staat tot specifieke reactie met flagella van Pseudomonas aeruginosa bacteriën.

2. Compositie volgens conclusie 1, waarin het monoklo- 5 nale antilichaam of bindende fragment daarvan de motiliteit van de bacteriën inhibiteert.

2. Compositie volgens conclusie 1, waarin het monoklonale anti-5 lichaam of bindende fragment daarvan de motiliteit van de bacteriën inhibiteert.

3. Compositie volgens conclusie 1, waarin het mono-klonale antilichaam of bindende fragment daarvan in vivo beschermend is.

3. Compositie volgens conclusie 1, waarin het monoklonale antilichaam of bindende fragment daarvan in vivo beschermend is.

4. Compositie, omvattende een monoklonaal antilichaam, dat in staat is tot specifieke reactie met een flagellair proteïne-epitoop van Pseudomonas aeruginosa.

4. Compositie, omvattende een monoklonaal antilichaam, dat in staat 10 is tot specifieke reactie met een flagellair proteine-epitoop van Pseudomonas aeruginosa.

5. Compositie volgens conclusie 4, waarin het monoklonale antilichaam in staat is de binding te blokkeren aan de epitoop 15 van monoklonale antilichamen, geproduceerd door cellijnen, aangeduid als A.T.C.C. Accession Numbers HB9129, HB9130, CEL 9300 en CEL 9301.

5. Compositie volgens conclusie 4, waarin het monoklonale antilichaam in staat is de binding te blokkeren aan de epitoop van monoklonale antilichamen, geproduceerd door cellijnen, aangeduid als

6. Compositie, omvattende één of meerdere monoklonale antilichamen, waarin een eerste monoklonaal antilichaam in 20 staat.is tot reactie met een epitoop van type a of type b flagella van Pseudomonas aeruginosa. c ,· u 1 ï o 4 545 r - -

6. Cellijn, die een monoklonaal antilichaam produceert, dat in staat is tot specifieke reactie met type a of type b Pseudomonas aeruginosa flagella.

7. Compositie volgens conclusie 6, waarin een tweede monoklonaal antilichaam in staat is tot reactie met een type flagella dat niet reactief is ten opzichte van het eerste monoklonale antilichaam.

7. Cellijn volgens conclusie 6, waarin het monoklonale antilichaam 20 in vivo beschermend is tegen Pseudomonas aeruginosa.

8. Compositie volgens conclusie 6, waarin het eerste antilichaam een humaan monoklonaal antilichaam is.

8. Cellijn volgens conclusie 7, die een hybridecellijn is.

9. Compositie volgens conclusie 6, waarin ten minste een van de monoklonale antilichamen in vivo beschermend is.

9. Cellijn volgens conclusie 6, die menselijke monoklonale anti lichamen produceert.

10. Compositie volgens een van de conclusies 1, 4, 6 of 8, 10 verder omvattende een gammaglobuline fractie van humaan bloedplasma en/of een antibioticum.

10. Cellijn volgens conclusie 6, die één van A.T.C.C. Accession

11. Farmaceutische compositie, omvattende een compositie volgens een van de conclusies 1, 4, 6 of 8, alsmede een fysiologisch aanvaardbare drager.

11. Werkwijze voor het produceren van monoklonale antilichamen, die specifiek zijn voor flagellaire proteïnen van Pseudomonas aeruginosa en in staat tot behandeling of voorkoming van Pseudomonas aeruginosa 30 infecties, met het kenmerk, dat ten minste één van de cellijnen van conclusie 10 wordt gekweekt en de antilichamen worden gewonnen.

12. Farmaceutische compositie ten gebruike voor de be handeling of preventie van een Pseudomonas aeruginosa infectie, welke compositie een monoklonaal antilichaam, reactief met een flagellair proteïne van Pseudomonas aeruginosa en in vivo beschermend, een antimicrobieel middel, een gamma -20 globuline fractie van humaan bloedplasma en een fysiologisch aanvaardbare drager omvat.

12. Werkwijze ter behandeling van een mens, die vatbaar is voor bacteremie en/of septicemie, met het kenmerk, dat aan de mens een profylactische of therapeutische hoeveelheid wordt toegediend van mono- 35 monoklonale antilichamen, geproduceerd volgens conclusie 11. 8701554 -52-

13. Farmaceutische compositie volgens conclusie 12, waarin het antilichaam een humaan monoklonaal antilichaam is en de gammaglobuline fractie van humaan bloedplasma verkregen is 25 van mensen die verhoogde concentraties vertonen van 8 7 0 1 S 5 4" -*7- immunoglobulinen die reactief zijn ten opzichte van Pseudomonas aeruginosa bacteriën en/of produkten daarvan.

13. Compositie, omvattende een monoklonaal antilichaam of fragment daarvan, dat reactief is met een epitoop, die in staat is tot binding aan een monoklonaal antilichaam, geproduceerd volgens conclusie 11.

14. Farmaceutische compositie, omvattende ten minste twee monoklonale antilichamen, elk specifiek reactief met een 5 verschillend type van Pseudomonas aeruginosa flagellair proteïne en geschikt voor behandeling of voorkoming van Pseudomonas aeruginosa infecties.

14. Farmaceutische compositie, omvattende ten minste twee monoklo-5 nale antilichamen, elk specifiek reactief met een verschillend type van Pseudomonas aeruginosa flagellair proteïne en geschikt voor behandeling of voorkoming van Pseudomonas aeruginosa infecties.

15. Compositie volgens conclusie 14, waarin ten minste één van de monoklonale antilichamen een humaan monoklonaal 10 antilichaam is.

15. Compositie volgens conclusie 14, waarin ten minste één van de monoklonale antilichamen een menselijk monoklonaal antilichaam is.

15 A.T.C.C. Accession Numbers HB9129, HB9130, CRL 9300, CEL 9301, CEL 9422, CEL 9423 en CEL 9424.

16. Compositie volgens conclusie 14, verder bevattende ten minste één humaan monoklonaal antilichaam, dat in staat is tot reactie met ten minste één serotypische determinant op een lipopolysaccharidemolecuul van Pseudomonas aeruginosa 15 en/of een monoklonaal antilichaam, dat reactief is met exotoxine A.

16. Compositie volgens conclusie 14, verder bevattende ten minste één menselijk monoklonaal antilichaam, dat in staat is tot reactie met ten minste één serotypische determinant op een lipopolysaccharide-molecuul van Pseudomonas aeruginosa en/of een monoklonaal antilichaam, dat reactief is met exotoxine A.

17. Werkwijze ter behandeling van een mens, die vatbaar is voor bacteremie en/of septicemie, met het kenmerk, dat aan de mens een profylactische of therapeutische hoeveel- 20 heid wordt toegediend van een compositie volgens één der cocnlusies 1, 6, 8, 12, 14 of 15.

17. Werkwijze ter behandeling van een mens, die vatbaar is voor bacteremie en/of septicemie, met het kenmerk, dat aan de mens een pro-- fylactische of therapeutische hoeveelheid wordt toegediend van een compositie volgens één der conclusies 1, 6, 8, 12, 14 of 15.

18. Cellijn, die een monoklonaal antilichaam produceert, dat in staat is tot specifieke reactie met type a of type b Pseudomonas aeruginosa flagella.

18. Cellijn, die een monoklonaal antilichaam produceert, dat in 20 staat is tot specifieke reactie met type of type b Pseudomonas aeruginosa flagella.

19. Cellijn volgens conclusie 18, waarin het monoklonale -? Λ antilichaam in vivo beschermend is tegen Pseudomonas aeruginosa.

19. Cellijn volgens conclusie 18, waarin het monoklonale antilichaam in vivo beschermend is tegen Psudomonas aeruginosa.

20. Cellijn volgens conclusie 19, die een hybridecellijn is.

20. Cellijn volgens conclusie 19, die een hybridecellijn is.

21. Cellijn volgens conclusie 18, die humane monoklonale antilichamen produceert.

21. Cellijn volgens conclusie 18, die menselijke monoklonale anti lichamen produceert.

22. Cellijn volgens conclusie 18, die ëén van A.T.C.C. Accession Numbers HB9129, HB9130 of CRL 9300 en CRL 9301 is.

22. Cellijn volgens conclusie 18, die één van A.T.C.C. Accession Numbers HB9129, HB9130 of CRL 9300 en CRL 9301 is.

23. Werkwijze voor het produceren van monoklonale anti- 10 lichamen, specifiek voor flagellaire proteïnen van Pseudomonas aeruginosa en geschikt voor behandeling of voorkoming van Pseudomonas aeruginosa infecties, met het kenmerk, dat ten minste een van de cellijnen van conclusie 22 wordt gekweekt en de antilichamen worden gewonnen.

23. Werkwijze voor het produceren van monoklonale antilichamen, 30 specifiek voor flagellaire proteïnen van Pseudomonas aeruginosa en geschikt voor behandeling of voorkoming van Pseudomonas aeruginosa infecties, met het kenmerk, dat ten minste één van de cellijnen van conclusie 22 wordt gekweekt en de antilichamen worden gewonnen.

24. Werkwijze ter behandeling van een mens, die vatbaar is voor bacteremie en/of septicemie, met het kenmerk, dat aan de mens een profylactische of therapeutische hoeveelheid wordt toegediend van monoklonale antilichamen, geproduceerd volgens conclusie 23. 2Q 25. Monoklonaal antilichaam of fragment daarvan, dat reactief is met een epitoop, die in staat is tot binding aan een monoklonaal antilichaam, geproduceerd volgens conclusie 23.

24. Werkwijze ter behandeling van een mens, die vatbaar is voor 35 bacteremie en/of septicemie, met het kenmerk, dat aan de mens een profylactische of therapeutische hoeveelheid wordt toegediend van monoklonale antilichamen, geproduceerd volgens conclusie 23. 8701554 -53-

25. Monoklonaal antilichaam of fragment daarvan, dat reactief is met een epitoop, die in staat is tot binding van een monoklonaal antilichaam, geproduceerd volgens conclusie 23.

25 Numbers HB9129, HB9130, CEL 9300, CRL 9301, CRL 9422, CRL 9423 en CRL 9424 is.

26. Compositie, omvattende een monoklonaal antilichaam 25 of fragment daarvan, dat reactief is met een epitoop, die in Ö 7 ft -1 % “ P *ö ƒ V i -J 4 _s-5_ staat is tot binding aan een monoklonaal antilichaam, gepro- . duceerd volgens conclusie 23.

26. Compositie, omvattende een menselijk monoklonaal antilichaam, 5 dat specifiek reactief is met een epitoop, aanwezig op Pseudomonas aeruginosa flagella.

27. Compositie, omvattende een humaan monoklonaal anti-lichaam, dat specifiek reactief is met een epitoop, aanwe- 5 zig op Pseudomonas aeruginosa flagella.

27. Compositie volgens conclusie 26, waarin het epitoop aanwezig is op type a of type b flagella, maar niet beide.

28. Compositie volgens conclusie 26, waarin de epitoop aanwezig is op type a of type b flagella, maar niet beide.

28. Compositie volgens conclusie 26, waarin de epitoop wordt ver-10' toond door tenminste ongeveer 70% van type b flagella.

29. Compositie volgens conclusie 26, waarin de epitoop wordt vertoond door ten minste ongeveer 70% van type b 10 flagella.

29. Compositie volgens conclusie 26, waarin de epitoop uitsluitend door type b flagella wordt vertoond.

30. Compositie volgens conclusie 26, waarin de epitoop uitsluitend door type b flagella wordt vertoond.

30. Compositie volgens conclusie 29, waarin het antilichaam panreactief is.

31. Compositie volgens conclusie 29, waarin het anti-lichaam panreactief is.

31. Werkwijze ter behandeling van een mens, die vatbaar is voor bacteriële infecties, met het kenmerk, dat aan de mens een profylactische of therapeutische hoeveelheid van een monoklonaal antilichaam wordt toegediend, dat in staat is tot binding aan het flagellum van Pseudomonas aeruginosa, in combinatie met êên of meer van: een propy-20 lactische of therapeutische hoeveelheid van een monoklonaal antilichaam, dat in staat is tot reactie met pseudomonas aeruginosa exotoxine A; een monoklonaal antilichaam, dat in staat is tot reactie met ten minste êên serotype determinant op een lipopolysaccharidemolecuul van Pseudomonas aeruginosa; een gammaglobulinefractie van menselijk bloed-25. plasma; een gammaglobulinefractie van een menselijk bloedplasma, dat verhoogde niveaus vertoont van immunoglobulinen, die reactief zijn met Pseudomonas aeruginosa en/of produkten daarvan; of een antimicrobieel middel.

32. Monoklonaal antilichaamcompositie met dezelfde bindingsspecifi-30 citeit als êên van de monoklonale antilichamen, aangeduid als FA6 IIG5, Pa3 IVC2, PaF4 IVE8, 20H11 en 21B8.

33. Monoklonaal antilichaam volgens conclusie 32, geconjugeerd met een label, dat in staat is een waarneembaar signaal te leveren.

34- Monoklonaal antilichaam volgens conclusie 33, waarin het label 35 fluorescerend is of een enzyme. 870 1 554 -54-

35. Werkwijze ter bepaling van de aanwezigheid van Pseudomonas aeruginosa in een monster, met het kenmerk, dat het monster wordt gecombineerd met een monoklonaal antilichaam, dat reactief is met Pseudomonas aeruginosa flagella en complexvorming wordt waargenomen.

36. Pakket voor gebruik voor ontdekking van de aanwezigheid van Pseudomonas aeruginosa bacteriën, bevattende een monoklonale antilichaam-compositie, die ten minste één monoklonaal antilichaam bevat, dat reageert met een type-specifiek flagellair proteïne van de bacterie, en labels voor het verschaffen van een waarneembaar signaal, covalent ge-10 bonden aan het antilichaam of gebonden aan tweede antilichamen, die reactief zijn met het monoklonale antilichaam. 8701554 — ύ VEREENIGDË OCTROOIBUREAUX O.A. Nr. 8701554 *s^srav£nhace(holland) Beh. bij schrijven dd. 25 augustus 1987 Ln/657

32. Werkwijze ter behandeling van een mens, die vatbaar is voor bacteriele infecties, met het kenmerk, dat aan de mens een profylactische of therapeutische hoeveelheid van een monoklonaal antilichaam wordt toegediend, dat in staat is tot binding aan het flagellum van Pseudomonas aeruginosa, 20 in combinatie met één of meer van: een propylactische of therapeutische hoeveelheid van een monoklonaal antilichaam, dat in staat is tot reactie met ten minste één serotype determinant op een lipopolysaccharidemolecuul van Pseudomonas aeruginosa; een gammaglobulinefractie van humaan bloedplasma; 25 dat verhoogde niveaus vertoont van immunoglobulinen, die