FR2601458A1 - Anticorps monoclonaux contre les flagelles de pseudomonas aeruginosa - Google Patents

Abstract

DES LIGNEES CELLULAIRES ONT ETE PRODUITES, QUI SECRETENT DES ANTICORPS MONOCLONAUX CAPABLES DE SE LIER AUX PROTEINES FLAGELLAIRES DE SOUCHES SELECTIONNEES DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA. ON A CONSTATE QUE QUELQUES-UNS DE CES ANTICORPS ETAIENT PROTECTEURS CONTREDES ATTAQUES LETALES DE P. AERUGINOSA. SONT COMPRISES DES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES CONTENANT CES ANTICORPS QUI PEUVENT ENTRER DANS DES COMBINAISONS AVEC D'AUTRES ANTICORPS MONOCLONAUX, DES FRACTIONS DE PLASMA SANGUIN ET DES AGENTS ANTIMICROBIENS ET LES UTILISATIONS PROPHYLACTIQUES ET THERAPEUTIQUES DE CES COMPOSITIONS DANS LE TRAITEMENT DES INFECTIONS. AVANT LE DEPOT DE CETTE DEMANDE, LES LIGNEES CELLULAIRES CONTINUES TRANSFORMEES PAF4 IVE8, FAE6 IIG5, 20H11 ET 21B8, DECRITES ICI, ONT ETE DEPOSEES A L'AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION ET ONT LEUR A DONNE RESPECTIVEMENT LES DESIGNATIONS HB 9129, HB 9130, CRL 9300, CRL 9301, RESPECTIVEMENT.

Description

260 1458

ANTICORPS MONOCLONAUX CONTRE LES FLAGELLES DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA

La présente invention a pour objet l'application de techniques immunologiques pour procurer de nouvelles substances utiles au diagnostic et au traitement d'infections bactériennes et, plus particulièrement, elle a pour objet la préparation et l'application d'anticorps monoclonaux capables

de reconnaître les flagelles de Pseudomonas aeruginosa.

Les maladies gram-négatives et leurs complications les plus sérieuses, c'est-à-dire bactérémie et endotoxémie, sont la cause d'une morbidité et d'une mortalité significatives chez les humains. Ceci est particulièrement vrai d'un organisme gram-négatif, le Pseudomonas aeruginosa, qui a été de plus en plus associé à des infections bactériennes, notamment

à des infections hospitalières, ces cinquante dernières années.

Pendant ces quelques dernières décennies, les antibiotiques ont été la thérapeutique de choix pour la maîtrise des maladies gram-négatives. La persistance d'une morbidité élevée 20 et d'une mortalité élevée associées à ces maladies bactériennes négatives est cependant indicative des limites d'une thérapeutique par les antibiotiques, notamment en ce qui concerne le P. aeruginosa (voir par exemple, Andriole V.G., "Pseudomonas Bacteremia: Can Antiobiotic Therapy Improve 25 Survival?", J. Lab. Clin. Med. (1978) 94/196-199). Ceci a

poussé à chercher d'autres méthodes de prévention et de traitement.

L'une des méthodes qui a été envisagée est l'amélioration du système immunitaire d'un hôte par immunisation active 30 ou passive. Il a, par exemple, été observé que l'immunisation active des humains ou des animaux d'expérience par des vaccins bactériens à base de cellule entière ou des endotoxines bactériennes purifiées provenant de P. aeruginosa, conduisait au développement d'anticorps opsoniques spécifiques orientés surtout contre des déterminants des motifs répétitifs d'oligosaccharide des molécules de lipopolysaccharide (LPS) situées à l'extérieur de la membrane cellulaire du P. aeruginosa (voir Pollack M., Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations, Alving B.M., and Finlayson J.S., eds. pp. 73-79, U.S. Department of Health and Human Services, 1979). De tels anticorps, qu'ils soient engendrés de façon active ou transférés de façon passive, se sont avérés représenter une protection contre les effets létaux d'une infection par le P. aeruginosa chez toute une série de modèles animaux 15 (Pollack, voir ci-dessus) et dans quelques investigations préliminaires sur des êtres humains (voir Young L.S. et Pollack M., Pseudomonas aeruginosa, Sabath L., ed., pp. 19132,

Hans Huber, 1980).

Les rapports ci-dessus suggèrent que l'on pourrait utiliser des approches immunothérapeutiques pour prévenir et traiter des maladies bactériennes dues au P. aeruginosa, par exemple en administrant des immunoglobulines humaines associées contenant des anticorps contre la(les) souche(s) infectante(s). Les immunoglobulines humaines sont définies ici comme représentant cette partie de plasma humain fractionné enrichie en anticorps parmi lesquels sont représentés des

anticorps spécifiques vis-à-vis des souches de P. aeruginosa.

A cause de certaines limitations inhérentes à l'utilisation de composants d'immunoglobulines humaines, cette approche du traitement de maladies dues au P. aeruginosa reste le sujet d'études (voir, par exemple, Collins M.S. et Roby R.E., Am. J. Med., 76(3A)/168-174, 1984), et jusqu'à maintenant, il n'y a pas dans le commerce de produits disponibles utilisant ces composants. L'une des limitations associées aux compositions d'immunoglobulines est qu'elles sont constitués par la réunion d'échantillons provenant de mille donneurs ou plus, ces échantillons ayant été présélectionnés pour déceler la

présence d'anticorps anti-Pseudomonas particuliers. Cette réunion conduit à l'établissement d'une moyenne entre les titres individuels en anticorps et conduit au mieux à des 5 accroissements modestes dans le titre obtenu en anticorps recherchés.

Une autre limitation est que le processus de présélection lui-même nécessite un criblage coûteux et permanent de l'ensemble des donneurs pour garantir la permanence du pro10 duit. En dépit de ces efforts, les immunoglobulines produites peuvent encore présenter une extrême variabilité d'un lot à l'autre, et entre des produits provenant de diverses régions géographiques. Une autre des limitations inhérente aux compositions des 15 immunoglobulines est encore que leur utilisation conduit à l'administration simultanée de quantités importantes de substances protéinées extérieures (qui peuvent comprendre des virus, tels que ceux qui se sont récemment révélés être associés au syndrome d'immunité déficitaire acquis, ou SIDA), présentant le risque potentiel d'occasionner des effets biologiques néfastes. La combinaison de titres faibles en anticorps recherchés et d'une teneur élevée en substances extérieures peut souvent limiter à des niveaux inférieurs à l'optimum la

quantité d'immunoglobuline(s) spécifique(s) et donc bénéfi25 que(s) que l'on peut administrer à un patient.

En 1975, Kohler et Milstein ont décrit leur découverte de base selon laquelle certaines lignées de cellules de souris pouvaient être fusionnées avec des cellules de rates de souris pour créer des hybridomes dont chacun pouvait sécréter des anticorps d'une spécificité unique, c'est-à-dire des anticorps monoclonaux (Kohler G. et Milstein C., Nature, 256/495-497, 1975). A l'avènement de cette technologie, il est devenu dans

quelques cas possibles de produire des quantités importantes d'anticorps de souris extrêmement spécifiques vis-à-vis d'un 35 déterminant ou de déterminants particuliers des antigènes.

Ultérieurement, en utilisant une technologie développée par la

suite, il est devenu possible de produire des anticorps mono-

clonaux humains (voir, par exemple, le brevet U.S. n 4 464 465,

incorporé ici à titre de référence).

Il faut reconnaître que dans quelques situations, des anticorps monoclonaux de souris ou des compositions basées sur ces anticorps peuvent présenter des problèmes d'utilisation chez les humains. Il a été, par exemple, indiqué que des anticorps monoclonaux de souris, utilisés à titre d'essais dans des études de traitement de certaines maladies humaines, pouvaient déclencher une réponse immunitaire qui les.rendait 10 non efficaces (Levy R.L. et Miller R.A., Ann. Rev. Med., 34/107-116 (1983) . Cependant, en s'appuyant sur les progrès récents dans la technique de recombinaison de l'ADN, par exemple pour la préparation d'anticorps monoclonaux de souris/humains chimériques, on a pu réduire la portée de ces problèmes. Des méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux humains sont donc maintenant disponibles (voir Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, Engleman E.G. et coll., eds., Plenum Publishing Corp. (1985), incorporé ici à titre de référence). En utilisant la technique des hydribomes et/ou de transformation des cellules, un certain nombre de groupes ont décrit la préparation d'anticorps monoclonaux donnant une protection contre les infections par le P. aeruginosa. Ont été préparés des anticorps monoclonaux réactifs avec divers épi25 topes du P. aeruginosa, y compris les épitopes superficiels spécifiques uni- sérotype et multi-sérotype tels que ceux trouvés dans les molécules de LPS des bactéries (voir, par exemple, les demandes de brevets U.S. n 734 624 et 807 394 en de la même cessionnaire, incorporées ici toutes les deux à titre de référence). Ont également été préparés des anticorps monoclonaux protecteurs spécifiques de l'exotoxine A du P. aeruginosa (voir, par exemple, la demande de brevet U.S. n0 742 170 de la même demanderesse incorporée ici à titre de référence). Bien que l'utilisation d'anticorps monoclonaux spécifiques de la région LPS du P. aeruginosa ou des exotoxines de bactéries puissent procurer une protection suffisante dans quelques cas, il est généralement préférable de disposer d'une protection plus large. Par exemple, dans le traitement prophylactique d'infections potentielles chez des êtres humains, il serait préférable d'administrer un anticorps ou des anticorps protecteurs contre toute une série de souches de P. aeruginosa. De même, dans des applications thérapeutiques o le(s) sérotype(s) de la(des) souche(s) affectante(s) n'est (ne sont) pas connu(s), il serait préférable d'administrer un anticorps ou une association d'anticorps efficace contre la 10 plupart, des sérotypes de P. aeruginosa, sinon tous, présentant une importance clinique, idéalement en réalisant des anticorps réactifs dans les schémas de sérotypage traditionnel. L'un des aspects de la physiologie du P. aeruginosa dont 15 on a montré qu'il contribuait à la virulence de l'organisme est sa motivité, capacité provenant surtout de la présence d'un flagelle (voir Montie T. et coll, (1982), Infect. and Immun., 38/1296-1298). Le P. aeruginosa se distingue en ce qu'il possède un flagelle unique à l'une des extrémités de sa 20 structure en forme de batonnet. Des études sur des modèles de souris brûlés ont montré qu'il survivait un plus grand pourcentage de souris lorsque des souches de P. aeruginosa non motiles étaient inoculées dans des brûlures expérimentales que si l'on utilisait des souches motiles. (McManus A. et coll.,

(1980), Burns, 6/235-239 et Montie T. et coll., (1982), Infect.

and Immun., 38/1296-1298). D'autres études sur la pathogénèse du P. aeruginosa ont attiré l'attention sur le fait que des animaux immunisés avec des préparations d'antigène de flagelle

étaient protégés lorsqu'ils étaient brûlés et infectés avec 30 des souches motiles des bactéries (voir Holder I. et coll.

(1982), Infect. and Immun., 35/276-280).

Les flagelles de P. aeruginosa ont fait l'objet d'études importantes par des méthodes sérologiques et il a été indiqué qu'ils tombaient dans deux groupes antigènes majeurs désignés 35 par H1 et H2 par B. Lanyi (1970, Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung., 17/35-48) et par type a et type b par Ansorg R. (1978, Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A, 242/228-238). Le typage sérologique des flagelles par les deux laboratoires a montré que les flagelles HI (Lanyi B, voir ci-dessus) ou les flagelles de type b (Ansorg R., voir ci-dessus) étaient sérologiquement uniformes, c'est-à- dire qu'aucun sous-groupe n'a été identifié. 5 Ce type flagellaire sérologiquement uniforme sera désigné sous le nom de type b. L'autre antigène majeur, le H2 (Lanyi B., voir ci-dessus) ou flagelle de type a (Ansorg R., voir cidessus) contient cinq sous-groupes. Cet antigène sera désigné sous le nom de flagelle type a et les cinq sous-groupes seront 10 désignés ao, a, a a2, a3 et a4. Les cinq sous-groupes du type a sont exprimés dans diverses combinaisons sur différentes

souches de P. aeruginosa portant du type a à l'exception de l'antigène a0. L'antigène a0 a été trouvé sur tous les flagelles de type a, bien que le degré auquel il est exprimé 15 varie entre les souches.

Un schéma de sérotypage basé sur les antigènes somatiques majeurs stables à la chaleur du P. aeruginosa est désigné sous le nom de schéma de HABS, qui a été récemment introduit dans le schéma de système de typage d'antigène international 20 (voir Liu, Int. J. Syst. Bacteriol., 33/256, 1983). Les types de flagelles des souches de référence HABS du P. aeruginosa ont été caractérisés par immunofluorescence à l'aide de sérums

polyclonaux par R. Ansorg (1978, ZbL. Bakt. Hyg., I. Abt.

Orig. A, 242/228-238) ou par coagglutination sur lamelles (Ansorg R. et coll., 1984, J. Clin. Microbiol., 20/84-88). Les souches de HABS 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 et 12 sont des souches portant des flagelles du type b et les souches de HABS 1, 6, 8 et 9 portent des flagelles de type a. Ainsi, un grand nombre de souches de P. aeruginosa pourrait éventuellement être

reconnu par un petit nombre d'anticorps monoclonaux spécifiques de protéines flagellaires.

Il existe par conséquent un besoin important d'anticorps monoclonaux capables de réagir avec des épitopes de protéines flagellaires et, dans quelques cas, de procurer également une 35 protection contre des sérotypes multiples de P. aeruginosa. En outre, quelques uns de ces anticorps pourraient convenir à l'utilisation dans des traitements prophylactiques et thérapeutiques d'infections occasionnées par le P. aeruginosa aussi bien que pour le diagnostic de ces infections. La présente

invention satisfait à ces besoins.

On réalise des nouvelles lignées de cellules qui peuvent produire des anticorps monoclonaux capables de se lier aux flagelles présents sur la plupart des souches de bactéries de P. aeruginosa. Les anticorps monoclonaux réagissent spécifiquement avec des épitopes de protéines flagellaires du P. aeruginosa et peuvent opérer une distinction entre les flagelles de type a et de type b des bactéries. En outre, on 10 met au point une méthode de traitement d'un être humain susceptible d'infection ou déjà infecté par du P. aeruginosa en administrant une quantité prophylactique ou thérapeutique d'une composition comprenant au moins un anticorps monoclonal ou un fragment de liaison de celui-ci capable de réagir avec 15 les flagelles des souches de P. aeruginosa, la composition comprenant également de préférence un support physiologiquement acceptable. La composition peut également contenir un ou plusieurs des produits suivants: anticorps monoclonaux supplémentaires capables de réagir avec l'exotoxine A du P. aeruginosa; 20 anticorps monoclonaux capables de réagir avec des déterminants de sérotypes du LPS de P. aeruginosa; une fraction de gammaglobuline provenant de plasma de sang humain; une fraction de gamma-globuline provenant de plasma de sang humain, dans laquelle le plasma peut être obtenu à partir d'un être humain 25 présentant des niveaux élevés d'immunoglobulines réactives

avec le P. aeruginosa; et un ou plusieurs agents antimicrobiens.

Sont en outre prévues des utilisations cliniques des anticorps monoclonaux y compris la préparation de kits pour diagnostics.

En accord avec la présente invention, on réalise de nouvelles cellules capables de produire des anticorps monoclonaux et des compositions comprenant ces anticorps, ces compositions étant capables de reconnaître sélectivement les flagelles présents sur toute une série de souches de P. aeruginosa, les anticorps individuels reconnaissant de façon caracté35 ristique un type de flagelle de P. aeruginosa. Les cellules en référence possèdent des chromosomes identifiables dans lesquels l'ADN de la lignée de germes provenant de ces cellules ou d'une cellule précurseur s'est réarrangé pour coder un anticorps possédant un site de liaison d'un épitope d'une protéine flagellaire commune à certaines souches de P. aeruginosa. Pour typer une protéine flagellaire, on peut préparer des anticorps monoclonaux pan-réactifs; et pour typer des protéines flagellaires de type b, on peut préparer des anticorps qui sont panréactifs ou réagissent avec au moins environ 70% des souches portant les flagelles. Ces anticorps

monoclonaux peuvent être utilisés de toute sorte de façons, y 10 compris au diagnostic et à la thérapeutique.

Les anticorps monoclonaux ainsi préparés sont particulièrement utiles dans le traitement ou la prophylaxie de maladies sérieuses occasionnées par le P. aeruginosa. Les protéines superficielles des flagelles du P. aeruginosa se15 raient disponibles pour une entrée en contact direct avec les molécules d'anticorps, inhibant ainsi la motilité de l'organisme et/ou facilitant l'obtention d'autres effets bénéfiques

aux hôtes infectés.

Les anticorps monoclonaux peuvent se préparer par immor20 talisation d'une lignée de cellules capable d'exprimer des séquences d'acide nucléique qui codent pour des anticorps spécifiques d'un épitope de protéines flagellaires de souches multiples de P. aeruginosa. La lignée de cellules immortalisées peut être une lignée de cellules de mammifère qui a été 25 transformée par oncogénèse, par transfection, mutation, ou équivalent. Ces cellules comprennent les lignées de myélomes, les lignées de lymphomes ou d'autres lignées cellulaires capables de supporter l'expression et la sécrétion de l'immunoglobuline ou d'en lier les fragments in vitro. L'immunoglobuline 30 ou fragment peut être une immunoglobuline existant à l'état naturel d'un mammifère autre que les souris ou humains généralement employés, préparée par transformation d'un lymphocyte, notamment une cellule de rate, au moyen d'un virus ou par fusion du lymphocyte avec une cellule néoplasique, par exemple 35 un myélome, pour produire une lignée de cellules hybrides. De façon caractéristique, la cellule de rate (splénocyte) sera obtenue à partir d'un animal immunisé contre des antigènes flagellaires ou des fragments de ceux-ci contenant un site

épitopique. Les protocoles d'immunisation sont bien connus et ils peuvent varier considérablement tout en restant efficaces.

(Voir, Golding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, N.Y., 1983, cité ici à titre de référence). Les lignées de cellules hydrides peuvent être clonées et criblées selon des techniques classiques et l'on peut détecter dans les surnageants de cellules des anticorps capables de se lier aux déterminants flagellaires de P. aeruginosa. On peut 10 alors faire pousser les lignées de cellules hybrides appropriées dans une culture à grande échelle ou les injecter dans la cavité péritonéale d'un h6te approprié pour la production

de fluide ascitique.

Dans un mode de réalisation de la présente invention, 15 les cellules sont des lymphocytes humains transformés qui produisent des anticorps monoclonaux humains, de préférence protecteurs in vivo, vis-à-vis d'épitopes accessibles spécifiques d'au moins une protéine flagellaire. Les lymphocytes peuvent être obtenus chez des donneurs humains qui sont ou qui 20 ont été exposés aux souches porteuses de flagelles appropriées de P. aeruginosa. Un processus de transformation entraîné par une cellule que l'on préfère est décrit en détail dans le

brevet U.S. ne 4 464 465, incorporé ici à titre de référence.

Grâce au fait que l'on dispose des anticorps selon la présente invention, connus pour être spécifiques des protéines flagellaires, on peut dans quelques cas cribler les surnageants d'expériences ultérieures dans un essai comparatif avec les anticorps monoclonaux considérés comme moyens d'identifier des exemples supplémentaires d'anticorps monoclonaux antifla30 gellaires. Ainsi, on peut facilement préparer des lignées cellulaires hybrides à partir de toute une série de sources sur la base de la disponibilité des anticorps selon la présente

invention spécifiques des antigènes flagellaires particuliers.

Ou encore, lorsque sont disponibles des lignées cellu35 laires hybrides produisant des anticorps spécifiques des sites épitopiques en référence, ces lignées cellulaires hybrides peuvent être fusionnées avec d'autres cellules-B néoplasiques, ces autres cellules-B pouvant servir comme receveurs de l'ADN génomique codant pour les récepteurs. Bien que les cellules-B néoplastiques de rongeurs, notamment celles de souris soient celles que l'on utilise le plus communément, on peut employer 5 celles d'autres espèces de mammifères, par exemple de lagomorphes, de bovins, d'ovins, d'équidés, de porcins, d'oiseaux, etc. Les anticorps monoclonaux peuvent faire partie de n'importe laquelle des classes ou des sousclasses d'immunoglobulines, telles que par exemple IgM, IgD, IgA, IgE ou des sous10 classes d'IgG connues pour chaque espèce d'animaux. Généralement, les anticorps monoclonaux peuvent s'utiliser intacts ou sous la forme de fragments de liaison, par exemple sous la forme de Fv, Fab, F(ab')2, mais on les utilise habituellement intacts. Les lignées cellulaires selon la présente invention peuvent trouver une autre utilisation que la production directe des anticorps monoclonaux. Les lignées cellulaires peuvent être fusionnées avec d'autres cellules (par exemple des myélomes humains, des myélomes de souris ou des cellules lympho20 blastoides humaines convenablement marquées par un médicament) pour produire des hybridomes et-ainsi réaliser le transfert de gènes codant les anticorps monoclonaux. Ou encore, on peut utiliser les lignées cellulaires comme source de chromosomes codant les immunoglobulines que l'on peut isoler et transférer 25 aux cellules par des techniques autres que la fusion. En outre, les gènes codant les anticorps monoclonaux peuvent être isolés et utilisés en accord avec des techniques de recombinaison de l'ADN pour la préparation de l'immunoglobuline spécifique de toute une série d'hôtes. Notamment, en préparant des 30 bibliothèques d'ADNc à partir d'ARN messager, on peut isoler un clone d'ADNc unique, codant pour l'immunoglobuline et exempt d'introns, et le placer dans des vecteurs d'expression prokaryote et eukaryote convenables et ensuite le transformer

en un hôte destiné finalement à une production de masse.

(Voir, généralement, les brevets U.S. n0 4 172 124; 4 350 683; 4 363 799; 4 381 292 et 4 423 147. Voir également Kennett et coll., Monoclonal Antibodies, Plenum, New York (1980), et les références qui y sont citées, toutes étant incorporé ici à

titre de référence).

Plus spécifiquement, selon la technologie de l'ADN hybride, les immunoglobulines ou leurs fragments selon la présente invention peuvent être préparés dans des bactéries ou des levures. (Voir, Boss et coll., Nucl. Acid. Res., 12/3791 et Wood et coll., Nature, 314/446, incorporés tous les deux ici à titre de référence). Par exemple, l'ARN messager transcrit à partir de gènes codant pour les chaînes légères et 10 lourdes des anticorps monoclonaux préparés par une lignée cellulaire selon la présente invention, peut être isolé par une hybridation différentielle d'ADNc employant de l'ADNc

provenant de lymphocytes BALB/c autres que le clone considéré.

L'ARN messager qui n'hybride pas sera riche pour les messages 15 codant des chaînes d'immunoglobuline recherchée. Si nécessaire, ce processus peut être répété pour améliorer encore les niveaux recherchés en ARN messager. La composition d'ARN messager soustraite peut alors faire l'objet d'une transcription inverse pour procurer un mélange d'ADNc enrichi en séquences souhaitées. 20 L'ARN peut être hydrolysé à l'aide d'une ARNase appropriée et d'ADNss conformé en une double hélice à l'aide d'ADN polymérase I et de matrices aléatoires, par exemple, de l'ADN de thymus de veau fragmenté au hasard. L'ADNds obtenu peut alors cloné par insertion dans un vecteur approprié, par exemple des 25 vecteurs à base de virus, par exemple des vecteurs lambda ou des vecteurs plasmides (tels que par exemple pBR322, pACYC184, etc.). Grâce au développement de sondes basé sur des séquences connues pour les régions constantes des chaînes lourdes et légères, ces clones d'ADNc possédant le gène codant pour les 30 chaînes légères et lourdes souhaitées peuvent être identifiés par hybridation. Ensuite, les gènes peuvent être excisés des

plasmides, manipulés pour en éliminer la partie d'ADN en amont superflue pour le codon d'initiation ou la région constante de l'ADN et être ensuite introduit dans un vecteur approprié pour 35 la transformation d'un h8te et l'ultime expression du gène.

On peut commodément employer des h&tes de mammifères (par exemple des cellules de souris) pour traiter la chaîne (par exemple joindre les chaînes légères et les chaînes lourdes) et produire une immunoglobuline intacte et, en outre, sécréter l'immunoglobuline exempte de séquence initiatrices (leader), si on le souhaite. Ou encore, on peut utiliser des micro-organismes unicellulaires pour produire les deux chaînes, une manipulation ultérieure pouvant être nécessaire pour éliminer les séquences d'ADN codant l'initiateur de sécrétion et traitant les signaux tout en réalisant un codon d'initiation au 5' terminal de la séquence qui code pour la chaîne lourde. De cette façon, on peut préparer les immunoglobulines et les traiter de 10 façon à les assembler et les glycosyler dans des cellules autres que des cellules de mammifère. Si on le souhaite, chacune des chaînes peut être tronquée de façon à retenir au moins la région variable, et ces régions peuvent ensuite être

manipulées pour procurer d'autres immunoglobulines ou fragments 15 spécifiques des épitopes flagellées.

Les anticorps monoclonaux selon la présente invention sont particulièrement utiles à cause de leur spécificité pour les antigènes de pratiquement toutes les variantes de P. aeruginosa actuellement connues. De même, quelques uns parmi les anticorps monoclonaux sont protecteurs in vivo, ce qui permet leur incorporation dans des produits pharmaceutiques, par exemple des combinaisons d'anticorps destinées au

traitement des infections bactériennes.

Les anticorps monoclonaux selon la présente invention peuvent également y trouver toute une série d'utilisations in vitro. A titre d'exemple, on peut utiliser les anticorps monoclonaux pour le typage d'un microorganisme, pour la séparation de souches spécifiques de P. aeruginosa, pour l'élimination sélective de cellules de P. aeruginosa dans un 30 mélange hétérogène de cellules, etc. A des fins de diagnostic, les anticorps monoclonaux peuvent être soit marqués, soit non marqués. De façon caractéristique, les essais de diagnostic impliquent la détection de la formation d'un complexe par la liaison de l'anticorps monoclonal aux flagelles du P. aeruginosa. Lorsqu'ils sont non marqués, les anticorps trouvent une utilisation dans des essais d'agglutination. En outre, les anticorps non marqués peuvent être utilisés en combinaison avec d'autres anticorps

marqués (anticorps seconds) réactifs avec l'anticorps monoclonal, par exemple des anticorps spécifiques de l'immunoglobuline.

Ou encore, les anticorps monoclonaux peuvent être marqués directement. On peut employer toute une série de marqueurs tels que par exemple des radioéléments, des agents fluorescents, des enzymes, des substrats d'enzyme, des cofacteurs d'enzyme, des inhibiteurs d'enzyme, des ligands (notamment des haptènes), etc. De nombreux types d'immuno-essais sont dispo10 nibles et, à titre d'exemple, ils comprennent ceux décrits dans les brevets U.S. 3 817 827; 3 850 752; 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533, 3 996 345; 4 034 074 et 4 098 876, tous

incorporés ici à titre de référence.

Les anticorps monoclonaux selon la présente invention 15 sont utilisés dans des immuno-essais enzymatiques, les anticorps en référence, ou les anticorps seconds provenant d'une espèce différente, étant conjugués à une enzyme. Lorsqu'un échantillon contenant du P. aeruginosa d'un certain sérotype, par exemple de sang humain ou d'un lysat de celui-ci, est 20 combiné avec les anticorps en référence, il se produit une liaison entre les anticorps et ces molécules qui présentent l'épitope recherché. Ces cellules peuvent alors être séparées des réactifs non liés et l'on peut ajouter un second anticorps (marqués avec une enzyme). Après cela, la présence du conjugué 25 anticorps-enzyme spécifiquement lié à la cellule est déterminée. On peut également utiliser d'autres techniques classiques

bien connues des spécialistes.

On peut également réaliser des kits à utiliser avec les anticorps en référence pour la détection du P. aeruginosa dans 30 des solutions ou la présence d'antigènes flagellaires de P. aeruginosa. Ainsi, l'anticorpsmonoclonal en référence, objet de la composition selon la présente invention, peut être fourni, habituellement sous une forme lyophilisée, soit seul, soit en conjonction avec d'autres anticorps spécifiques d'au35 tres bactéries gram-négatives. Les anticorps, qui peuvent être conjugués à un marqueur ou non conjugués, sont compris dans les kits en même temps que des tampons, tels que par exemple tris, phosphate, carbonate, etc., des stabilisants, des biocides, des protéines inertes, par exemple de l'albumine de sérum bovin, etc. En général, ces substances seront présentes en quantité inférieure à environ 5% en poids par rapport à la quantité d'anticorps actifs et présents habituellement en quantité totale d'au moins 0,001% en poids, basée à nouveau sur la concentration en anticorps. Il sera fréquemment souhaitable d'inclure un agent d'extension ou excipient inerte pour diluer les ingrédients actifs, l'excipient pouvant être pré10 sent en quantité d'environ 1 à 99% en poids par rapport au poids total de la composition. Lorsque l'on emploie un anticorps second capable de se lier à l'anticorps monoclonal,

celui-ci sera habituellement présent dans une fiole séparée.

L'anticorps second est typiquement conjugué à un marqueur et 15 il entre dans la formulation de façon analogue à celle des

formulations d'anticorps décrites ci-dessus.

Les anticorps monoclonaux, notamment les anticorps monoclonaux humains selon la présente invention, peuvent aussi être incorporés comme composants de compositions pharmaceu20 tiques contenant une quantité thérapeutique ou prophylactique d'au moins l'un des anticorps monoclonaux selon la présente invention, en même temps qu'un support pharmaceutiquement efficace. Un support pharmaceutique doit être l'une quelconque des substances non toxiques, compatibles, convenant à l'admi25 nistration des anticorps monoclonaux aux patients. On peut utiliser comme support l'eau stérile, l'alcool, les matières grasses, les cires et des solides inertes. Des adjuvants pharmaceutiquement acceptables (agents tampons, agents de dispersion) peuvent également être incorporés dans la composi30 tion pharmaceutique. Ces compositions peuvent contenir un anticorps monoclonal unique de façon à être spécifique de souches d'un type flagellaire de P. aeruginosa. Ou encore, une composition pharmaceutique peut contenir deux ou plus de deux anticorps monoclonaux pour former un "coktail". Par exemple, 35 un coktail contenant des anticorps monoclonaux contres les deux types de flagelles ou contre des groupes des diverses souches de P. aeruginosa (par exemple de différents sérotypes) représenterait un produit universel ayant une activité contre la grande majorité des isolats cliniques de cette bactérie particulière. Le rapport molaire des divers composants d'anticorps monoclonal ne diffère habituellement pas de plus d'un facteur de 10, plus habituellement pas de plus d'un facteur de 5, et il est habituellement dans un rapport d'environ 1/1 à 1/2 par

rapport à chacun des autres composants de l'anticorps.

Les anticorps monoclonaux selon la présente invention peuvent également être utilisés en combinaison avec des pro10 duits de plasma sanguin, tels que par exemple des produits de gamma-globuline et d'immunoglobuline disponibles dans le commerce utilisés dans le traitement prophylactique ou thérapeutique des maladies occasionnées par le P. aeruginosa chez les êtres humains. De préférence, en ce qui concerne les 15 immunoglobulines, le plasma sera obtenu à partir d'êtres humains présentant des niveaux élevés en immunoglobulines réactives avec le P. aeruginosa. (Voir en général le compendium "Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host",

Amer. J. Med., 76(3a), 30 mars 1984, pp. 1-231, incorporé ici 20 à titre de référence).

Les anticorps monoclonaux selon la présente invention peuvent être utilisés sous la forme de compositions administrées séparément en conjonction avec des agents antibiotiques ou antimicrobiens. Typiquement, les agents antimicrobiens 25 peuvent comprendre une pénicilline antipseudomonale (par exemple carbénicilline) en conjonction avec un aminoglycoside (par exemple gentamicine, tobramycine, etc.), mais on peut également utiliser de nombreux autres agents (par exemple

céphalosporines) bien connus des spécialistes.

Les anticorps monoclonaux et leurs compositions pharmaceutiques selon la présente invention sont particulièrement utiles pour l'administration orale ou parentérale. De préférence, les compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par voie parentérale, c'est-à-dire par voie sous-cutanée, 35 intramusculaire ou intraveineuse. Ainsi, la présente invention procure des compositions pour l'administration parentérale qui comprennent une solution de l'anticorps monoclonal ou un

coktail d'anticorps monoclonaux dissous dans un support accep-

table, de préférence un support aqueux. On peut utiliser toute une série de supports aqueux, par exemple de l'eau, de l'eau tamponnée, une solution saline à 0,4%, glycine à 0,3%, etc. Ces solutions sont stériles et généralement exemptes de matières particulaires. Ces compositions peuvent être stérilisées par des techniques classiques de stérilisation bien connues. Les compositions peuvent contenir des substances auxiliaires pharmaceutiquement acceptables nécessaires pour créer des conditions physiologiques approximatives telles que, par exemple, par ajustement du pH et à l'aide d'agents tampons, des agents d'ajustement de la toxicité, etc., par exemple acétate de sodium, chlorure de sodium, chlorure de potassium, chlorure de calcium, lactate de sodium, etc. La concentration en anticorps dans ces formulations peut varier largement, c'est-à-dire d'au moins environ 0,5%, habituellement au moins d'environ 1% jusqu'à 15 ou 20% en poids, et on les choisira

surtout en se basant sur les volumes de fluides, les viscosités, etc., de préférence en vue du mode particulier d'administration choisie.

Ainsi, une composition pharmaceutique typique pour injection intramusculaire pourrait être préparée de façon à contenir 1 ml d'eau tamponnée stérile et 50 mg d'anticorps

monoclonal. Une composition typique pour injection intraveineuse pourrait être préparée de façon à contenir 250 ml de 25 solution stérile de Ringer et 150 mg d'anticorps monoclonal.

Les méthodes effectives de préparation de compositions pouvant être administrées par voie parentérale sont connues ou évidentes pour les spécialistes et elles sont décrites avec plus de détail par exemple dans Remington's Pharmaceutical Science, 30 15ème édition, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania

(1980), incorporé ici à titre de référence.

Les anticorps monoclonaux selon la présente invention peuvent être lyophilisés en vue de leur stockage et reconstitués dans un support convenable avant l'utilisation. Il s'est 35 avéré que cette technique était efficace avec des immunoglobulines classiques et on peut employer des techniques de lyophilisation et de reconstitution connues dans l'état de la technique. Les spécialistes apprécieront que la lyophilisation et la reconstitution peuvent, conduire dans une certaine mesure à une perte d'activité de l'anticorps (par exemple, avec des immunoglobulines classiques, les anticorps IgM tendent à donner une plus grande perte d'activité que les anticorps IgG) et qu'à titre de compensation, on peut avoir à modifier les

niveaux d'utilisation.

Les compositions contenant les anticorps monoclonaux selon la présente invention ou un cocktail de ces anticorps peuvent être administrées pour le traitement prophylactique 10 et/ou thérapeutique des infections occasionnées par le P. aeruginosa. En application thérapeutique, les compositions sont administrées à un patient déjà infecté par un ou plusieurs sérotypes de P. aeruginosa en quantité suffisante pour guérir ou au moins partiellement stopper l'infection et ses complications. Une quantité adéquate pour y arriver est définie comme une "dose thérapeutiquement efficace". Des quantités efficaces dans cette utilisation vont dépendre de la sévérité de l'infection et l'état général du système immunitaire propre du patient, mais elles sont généralement comprises entre environ I et environ 200 mg d'anticorps par kg de poids du corps, des doses comprises entre 5 et 25 mg/kg étant plus communément utilisées. Il faut garder à l'esprit que les produits selon la présente invention peuvent généralement être employés dans des conditions de maladie sérieuses, c'est-à25 dire des situations o la vie est menacée ou potentiellement menacée, notamment dans des bactérémies ou endotoxémies,

occasionnées par le P. aeruginosa.

Dans les applications prophylactiques, les compositions contenant l'anticorps ou un coktail d'anticorps selon la présente invention sont administrées à un patient qui n'est pas encore infecté par le P. aeruginosa pour améliorer la résistance de ce patient à cette infection potentielle. Cette quantité est définie comme étant une "dose prophylactiquement efficace". Dans cette utilisation, les quantités précises dépendent à nouveau de l'état de santé du patient et de son niveau général d'immunité, mais elles sont généralement comprises entre 0, 1 et 25 mg/kg, notamment entre 0,5 et

2,5 mg/kg.

Des administrations simples ou multiples des compositions peuvent être effectuées à des niveaux de dosage et selon des schémas à choisir par le médecin traitant. En tout cas, les formulations pharmaceutiques doivent procurer une quantité de l'anticorps ou des anticorps selon la présente invention suffisante pour traiter ou réaliser une prophylaxie efficace

du patient.

PARTIE EXPERIMENTALE

EXEMPLE 1

L'exemple 1 démontre la méthodologie utilisée pour

préparer un anticorps monoclonal de souris qui se lie spécifiquement aux flagelles de P. aeruginosa.

Des souris BALB/c âgées de trois mois sont immunisées par voie intrapéritonéale huit fois à l'aide de bactéries viables d'immunotype de Fisher 1 et d'immunotype de Fisher 2 de P. aeruginosa (A.T.C.C. e27312 et e27313), toutes les unes à deux semaines pendant un total de neuf semaines. Les doses initiales de bactéries sont de 8 x 106 à 1 x 107 organismes par souris pour les immunotype de Fisher 1 et immunotype de Fisher 2 de P. aeruginosa respectivement, et l'on augmente la

dose de 30 à 60 fois au cours des immunisations.

Trois jours après la dernière injection, on retire aseptiquement la rate d'une souris et l'on prépare une suspension de cellules uniques par rotation ménagée de l'organe 25 entre les extrémités congelées de deux lamelles de verre stériles. Les cellules mononucléaires de rate sont combinées dans un rapport 4/1 avec des cellules de myélome de souris en phase log (NSI-1, obtenu chez le Docteur C. Milstein, Molecular Research Council, Cambridge, England) et fusionnées pour créer 30 des hybridomes selon le mode opératoire décrit par Tam et coll. (1982, Infect. Immun. 36/1042-1053). La suspension finale de cellules hybrides est diluée à une concentration de 1,5 x 106 cellules par ml dans du RPMI-hybride-HAT (RMPI 1640 [Gibco, Grand Island, NY] contenant 15% de sérum de veau fétal 35 inactivé à la chaleur, 1 mmole de pyruvate de sodium, 100 pg/ml de pénicilline et de streptomycine, 1,0 x 10-4 M d'hypoxanthine, 4,0 x 10-7 M d'aminoptérine et 1,6 x 10-5 M de thymidine) contenant 2,0 x 106 par ml de thymocytes de BALB/c fraîchement

préparées à titre de cellules d'alimentation.

Le mélange est mis sur plaques (200 g1 par puits) dans des plaques à 96 puits (%3596, Costar, Cambridge, MA). Les cultures sont entretenues par enlèvement et remplacement de 5 50% du volume de chaque puits par du RMPIhybride-HAT frais tous les deux ou trois jours. On teste les surnageants de culture pour détecter la présence d'anticorps anti-P. aeruginosa par un essai immunosorbant lié à une enzyme (ELISA) lorsque la croissance de la cellule atteint approximativement 10 40% de confluence dans les puits, habituellement en 7 à

jours.

Les surnageants des cellules hybrides sont testés simultanément sur des préparations de membranes extérieures provenant de chacune des deux bactéries immunisantes. Les préparations de membranes extérieures sont isolées selon une

modification de la méthode de Tam et coll. (1982, Infect.

Immun., 36/1042-1053), incorporé ici à titre de référence. Les bactéries (P. aeruginosa immunotype de Fisher 1 et immunotype de Fisher 2) sont inoculées dans du bouillon de soja trypti20 case (TSB) et on les cultive pendant 16 à 18 heures à 340C avec aération dans un bain secoué par giration. On récolte les bactéries par centrifugation et on les lave deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, NaCl 0,14 M, KCl 3 mM, Na2HPO4-7H20 8 mM, KH2PO4 1,5 mM, pH 7,2) contenant 25 150 unités inhibitrices de trypsine (T.I.U.) aprotinine par ml

(Sigma, St Louis, MO).

Le gâteau provenant de la centrifugation finale est remis en suspension dans de la triéthanolamine 0,17 M, de l'acide éthylènediamine tétraacétique disodique 20 mM (EDTA) 30 et ensuite homogénéisé sur de la glace pendant 10 minutes. Les débris sont reprécipités à partir de l'homogénéisat à 14 900 x g et on les jette, et le surnageant est de nouveau centrifugé comme ci-dessus. Le gâteau est à nouveau jeté et les membranes sont mises en pastilles à partir du surnageant par centrifuga35 tion à 141 000 x g pendant une heure. On jette le surnageant et les pastilles membranaires sont stockées pendant la durée d'une nuit à 4 C dans 10 ml de PBS contenant 75 T.I.U. d'aprotinine par ml. Le jour suivant, les pastilles sont remises en suspension au vortex et on les divise ensuite en parties aliquots et on les stocke à -70 C. La teneur en protéine de chacune est déterminée par la méthode de Lowry et coll. (1951,

J. Biol. Chem., 193/265-275).

Les plaques d'antigènes pour l'essai ELISA sont préparées de la façon suivante: les préparations de membranes extérieures sont diluées à 5 Fg par ml de protéine dans du PBS et 50 4l des solutions sont mises sur plaques dans chacun des puits de plaque à 96 puits (Linbro e76-031-05, Flow Laboratories, 10 Inc., McLean, VA), scellées et incubées pendant la durée d'une nuit à 37 C. L'antigène qui n'a pas été lié est retiré de la plaque et 100 4l d'albumine de sérum bovin (BSA) à 5% (p/v) dans du PBS est ajouté à chaque puits et l'on incube les

plaques pendant une heure à 37eC.

Après élimination du BSA non absorbé, les surnageants de culture (50 il) provenant de chaque puits des plaques de fusion sont reportés puits pour puits dans les puits correspondants de plaques d'antigène et incubés pendant 30 minutes à 37 C. L'anticorps non lié est retiré des puits et on lave les 20 plaques trois fois avec 100 il de BSA-PBS à 1% (p/v) par puits. Ensuite, 50 pl par puits d'IgG anti-souris de chèvre traité au bioétain et dilué de façon appropriée (Tago, Inc., Burlingame, CA) sont ajoutés à chaque puits et on incube pendant 30 minutes à 37 C. Les plaques sont lavées trois fois 25 comme on l'a décrit ci-dessus et ensuite on ajoute au puits pl d'un complexe préformé avidine/peroxydase de réfort traité au bio-étain (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA) préparé selon les spécifications du fabricant. Après 30 minutes à la température ambiante, le réactif de Vectastain est retiré des puits, on lave les puits comme ci-dessus et ensuite, on ajoute 100 41 par puits de substrat o-phénylènediamine (0,8 mg/ml dans un tampon de citrate 0,1%, pH 5,0, mélangé avec un volume égal de H 202 à 0,03% (v/v). On incube le substrat pendant 30 minutes à la température ambiante dans l'obscurité et l'on termine ensuite

les réactions par addition de 50 4l/puits de H2SO4 3N.

Les cellules d'hybridomes sécrétant des anticorps monoclonaux qui se lient à l'une ou l'autre des préparations d'antigène sont localisées par mesure de l'indice d'absorption à 490 nim des réactions colorimétriques dans chaque puits sur un lecteur MicroELISA modèle 580 (Alexandria, VA). Les cellules d'un puits, désignées sous le nom de Pa3 IVC2, produi5 sent un anticorps qui ne se lie qu'à la plaque de l'antigène de l'immunotype 2 de Fisher. On poursuit l'étude de ce puits comme décrit ci-dessQus. L'anticorps monoclonal et la lignée de cellules clonées provenant de ce puits sont tous les deux identifiés sous la désignation de Pa3 IVC2 dans le texte qui 10 suit. Les cellules de Pa3 IVC2 provenant d'un puits maître sont mini-clonées et clonées par des techniques de dilution limitantes, telles que celles décrites par Tam et coll. (1982,

Infect. Immun., 36/1042-1053).

Du fluide ascitique contenant un anticorps monoclonal 15 d'un titre élevé est préparé dans des souris CB6 F1 (BALB/c (femelle), x C57BL/6 (male) F1) selon les modes opératoires

décrits par Tam et coll. (1982, Infect. Immun., 36/1042-1053).

A des souris CB6 F1 mâles âgées de deux à trois mois, on injecte par voie intrapéritonéale 0,5 Ml de Pristane (2, 6, 10, 14-tétraméthylpentadécane, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) 10 à 21 jours avant l'injection intrapéritonéale de ceIlules de Pa3 IVC2 en phase log dans du RPMI. A chaque souris, on injecte de 0,5 à 1 x 107 cellules dans 0,5 ml. Apres approximativement deux semaines, le fluide qui s'est accumulé est 25 prélevé dans les souris tous les deux ou trois jours. La

concentration en anticorps dans le fluide ascitique est déterminée par électrophorèse sur gel d'agarose (Paragon, Beckman Instruments, Inc. Brea, CA) et tous les ascites qui contiennent 5 mg/ml ou plus d'anticorps sont rassemblés, répartis en 30 parties aliquots et congelés à -70 C.

Caractérisation de la cible moléculaire liée à l'anticorps monoclonal Le surnageant de cellules provenant de la lignée cellulaire Pa3 IVC2 clonée est testé par la méthode ELISA telle que 35 décrite ci-dessus, sur des préparations de membrane extérieure - provenant de chacune des sept souches d'immunotype de Fisher de P. aeruginosa (A.T.C.C. 27312 à 27318), P. aureofaciens (A.T.C.C. 13985) et Klebsiella pneumoniae (A.T.C.C. 8047), toutes préparées comme décrit ci-dessus. L'anticorps Pa3 IVC2 se lie aux préparations de membrane extérieure des immunotypes 2, 6 et 7 de Fisher de P. aeruginosa et non aux autres immunotypes

de Fisher, P. aureofaciens ou K. pneumoniae.

L'antigène spécifique identifié par l'anticorps Pa3 IVC2 est identifié par radio-immunoprécipitation. En bref, cette analyse implique l'incubation d'antigènes radio-marqués en présence d'anticorps Pa3 IVC2 et l'utilisation d'une source particulaire de protéines A qui conduit à la formation de complexes anticorps/antigènes insolubles. Ces complexes sont lavés pour éliminer tout antigène non spécifiquement lié et ensuite les complexes sont dissociés et séparés dans un gel de polyacrylamide. Les espèces radio-actives prédominantes trouvés dans le gel sont ainsi identifiées comme étant le ou 15 les antigènes correspondant(s) auxquels se lie l'anticorps

Pa3 IVC2.

Des parties aliquots (25 Fg) de préparations de membrane extérieure d'immunotypes 2, 3, 4 et 5 de Fisher de P. aeruginosa sont radio-marquées en phase solide par 125I à l'aide de 20 l'iodogène (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) (Fraker and Speck, 1978, Biochem. Biophys. Res. Commun., 80/849-857; Markwell and Fox, 1978, Biochemistry, 17/4807-4817). Ce mode opératoire conduit à l'ioduration de résidus de tyrosine

exposée de la plupart sinon de toutes les protéines contenues 25 dans les préparations de membrane extérieure.

Pour diminuer la liaison non spécifique des antigènes de membrane extérieur à l'anticorps Pa3 IVC2, les préparations marquées (5 x 106 comptages par minute par essai) sont tout d'abord incubées pendant une heure à 40C en présence de sérum 30 de souris normal BALB/c (dilution finale 1/40). Du surnageant (0,5 ml) de culture de Pa3 IVC2 contenant l'anticorps Pa3 IVC2

est alors ajouté à chaque échantillon de membrane extérieure.

Après incubation de l'antigène et de l'anticorps pendant 1 heure à 4 C, la source de protéine A, IgGSORB, (0,095 ml par 35 échantillon), (The Enzyme Center, Inc., Boston, MA) est ajoutée et incubée pendant encore 30 minutes à 4 C (Kessler, S.W., 1975, J. Immunol., 115/1617-1622). L'IgGSORB est préparé selon les spécifications du fabricant et, juste avant l'utilisation, on empêche les réactions non spécifiques par blocage des sites potentiellement réacteurs à l'aide de milieu de culture par lavage de l'IgGSORB deux fois avec du RPMI-hybride (milieu

RPMI-hybride-HAT excluant le RAT).

Les complexes antigène-anticorps-IgGSORB sont pastillés à 1 500 x g pendant dix minutes à 4 C, lavés deux fois avec du tampon phosphate-RIPA [phosphate 10 mM, pH 7,2, NaCl 0,15M, Triton X-100 à 1,0% (v/v), déoxycholate de sodium à 1,0% (p/v), dodécylsulfate de sodium à 0,1% (p/v) (SDS) et aproti10 nine à 1,0% (v/v)]; deux fois avec un tampon à-teneur en sel élevée [Tris-HC1 0,1%, pH 8,0, LiCl 0,5M, béta-mercaptoéthanol à 1% (v/v)]; et une fois avec du tampon de lyse [Tris-HC1 0,02M, pH 7,5, NaCl 0,05M, Nonidet P-40 à&0,05% (v/v)] (Rohrschneider et coll., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 15 76/4479-4483). L'antigène lié au complexe est libéré par incubation en présence du tampon d'échantillon [Tris-HCl 0,125M, pH 6,8, SDS à 2% (p/v), béta-mercaptoéthanol à 2% (v/v) et glycérol à 20% (v/v)] à 950C pendant dix minutes et

recueilli dans le surnageant après centrifugation à 1 500 x g 20 pendant dix minutes.

Les échantillons de surnageant sont ensuite appliqués à des gels de polyacrylamide à 14% contenant du SDS préparé selon la méthode de B. Lugtenberg et coll. (1978, FEBS Lett., 58/254-258) tel que modifié par Hancock et Carey (1979, J. Bacteriol., 140/902-910, incorporé ici à titre de référence), et les antigènes sont séparés dans le gel par électrophorèse pendant la durée d'une nuit à une tension constante de 50 V. A la suite de la fixation du gel dans du méthanol à % (v/v), de l'acide acétique à 10% (v/v) et du glycérol à 5% 30 (v/v) pendant la durée d'une-nuit, on le sèche sur papier Whatman 3MM en passant par un sécheur sur gel Biorad (Richmond, CA). Le gel sec est couvert d'une enveloppe de plastique et exposé à un film Kodak X-AR pendant 18 heures à la température ambiante. Les résultats de cette expérience illustrent que le Pa3 IVC2 ne se lie qu'à un seul antigène dans la préparation de membrane extérieure de l'immunotype 2 de Fisher de P. aeruginosa et non à aucun autre antigène présent dans les autres préparations de membrane extérieure. Le poids moléculaire (PM) de l'antigène dans le gel est d'environ 53 000 daltons, ceci étant déterminé par comparaison de sa mobilité avec celle de protéines standards marquées au 14C (phosphorylase B: PM 92 500; BSA: PM 69 000; ovalbumine: PM 46 000, anhydrase carbonique: PM 30 000, cytochrome C: PM 12 000) (New England Nuclear, Boston, MA) qui ont été séparées dans le même gel. Le poids moléculaire de cet antigène est corrélé avec le poids moléculaire de la flagelline, protéine constituant les fla10 gelles de P. aeruginosa, ceci étant indiqué par Montie et coll. (1982, Infect. Immun., 35/281-288), incorporé ici à

titre de référence.

En outre, le Pa3 IVC2 a été examiné par ELISA en utilisant des souches de HABS P. aeruginosa 1 à 12 (A.T.C.C. 33348 15 à 33359) fixées à l'éthanol sur des plaques de microtitrage à 96 puits. Les plaques d'antigène sont préparées de la façon suivante. Pendant la durée d'une nuit, les bouillons de culture de chaque organisme sont pastilles, lavés deux fois à l'aide de 20 PBS et ensuite remis en suspension dans du PBS à une A660 de

0,2 unité D.O. (densité optique). Les bactéries diluées sont mises sur plaques dans des puits (50 g1 par puits) et ensuite centrifugées à 1 500 x g pendant 15 minutes à la température ambiante. On aspire le PBS et ensuite on ajoute de l'éthanol 25 (95%) au puits pendant 15 minutes à la température ambiante.

Après élimination de l'éthanol des puits, les plaques sont séchées à l'air et ensuite recouvertes et stockées à 4"C

jusqu'à utilisation.

Les résultats des tests ELISA effectués comme décrit 30 ci-dessus montrent que le Pa3 IVC2 se lie aux souches de RABS 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 et 12 fixées à l'éthanol. Ce modèle de spécificité indique que le Pa3 IVC2 se lie aux flagelles de type b du P. aeruginosa (Ansorg R., 1978, Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A, 242/228-238; Ansorg R. et coll., 1984, J. Clin. 35 Microbiol, 20/84-88, incorporés tous les deux ici à titre de référence). Sur la base de cette attribution de spécificité au Pa3 IVC2 monoclonal, les souches de référence du P. aeruginosa, immunotype 2 de Fisher, immunotype 6 de Fisher et immunotype 7 de Fisher, portent des flagelles de type b. D'après les données expérimentales qui précèdent, on conclut que le Pa3 IVC2 se

lie spécifiquement à la flagelline de type b du P. aeruginosa.

Activité protectrice in vitro du Pa3 IVC2 Des expériences sur animaux sont réalisées pour déterminer si l'anticorps monoclonal Pa3 IVC2 peut protéger une souris attaquée par des LD50 multiples de bactéries vivantes 50 de P. aeruginosa. Le modèle choisi est le modèle de souris brûlé (Collins M.S. et Roby R.E., 1983, J. Trauma, 23/530-534, 10 incorporé ici à titre de référence). Des groupes de souris sont atteintes d'une brûlure sérieuse selon le protocole de l'auteur et ensuite immédiatement attaqués par 5 à 10 LD50 d'immunotype 7 de Fisher. L'anticorps monoclonal est administré par voie intrapéritonéale sous la forme d'ascites de titre élevé (0,2 ml par voie intrapéritonéale) avant la brûlure et l'attaque. Aucun accroissement n'est observé dans le nombre de

survivants chez les animaux traités au Pa3 IVC2 par comparaison à ceux qui n'ont pas reçu d'anticorps.

EXEMPLE 2

L'exemple 2 démontre la méthodologie de préparation d'une lignée de cellules d'hybridomes de souris en produisant un anticorps monoclonal de souris orienté vers le type b de

flagelline de P. aeruginosa qui est protecteur in vivo.

A des souris BALB/c femelles adultes, on injecte tout 25 d'abord, par voie intrapéritonéale, de l'immunotype 6 de Fisher de P. aeruginosa viable (A.T.C.C. n 27317) (8 x 106 organismes), ce que l'on fait suivre deux semaines plus tard d'une injection d'immunotype 5 de Fisher de P. aeruginosa viable (A.T.C.C. n 27316) (4 x 106 organismes). Pendant la période ultérieure de deux semaines, on administre de l'immunotype 5-de Fisher et l'immunotype 6 de Fisher de P. aeruginosa viable en même temps dans deux injections hebdomadaires. La dose de chaque organisme est augmentée de telle sorte que la dose finale soit dix fois plus importante que la dose initiale. 35 Une injection finale de préparations de membrane extérieure d'immunotype 6 de Fisher de P. aeruginosa (50 pg de protéine) préparées selon la méthode de R.E.W. Handcock et H. Nikaido (1978, J. Bacteriol., 136/381-390) est administrée quatre jours après la dernière injection de bactéries viables. Trois jours après la dernière immunisation, on retire la rate d'une

souris et l'on prépare les cellules de rate destinées à l'hybridation comme décrit dans l'exemple 1.

On essaye les surnageants de culture dans les cellules hydridomes pour détecter la présence d'anticorps anti-P. aeruginosa par ELISA le jour n 10 après la fusion selon les modes opératoires décrits dans l'exemple 1 sauf que l'antigène des

plaques ELISA est représenté par des bactéries viables, immo10 bilisées dans les puits de plaques de microtitrage à 96 puits. Les plaques sont préparées de la façon suivante.

Cinquante microlitres de poly-L-lysine (PLL) (1 lg/ml dans du PBS) (Sigma eP-1524, St Louis, MO) sont ajoutés à chaque puits de plaques de 96 puits (Linbro) et on incube 15 pendant 30 minutes à la température ambiante. Le PLL non adsorbé est éliminé et les puits sont lavés trois fois à l'aide de PBS. Les cultures bactériennes que l'on a laissé croître pendant la durée d'une nuit dans du TSB sont lavées une fois à l'aide de PBS et ensuite remises en suspension dans 20 du PBS jusqu'à D.O.660nm = 0,2 (densité optique). Cinquante microlitres des suspensions bactériennes sont ajoutés à chaque puits de la plaque et on les laisse se lier à 37 C pendant une heure. Les bactéries non liées sont éliminées en secouant les plaques et on lave ensuite les puits trois fois à l'aide 25 d'une solution saline Tween [NaCl à 0,9% (p/v), Tween-20 à

0,5% (v/v)].

Une liaison non spécifique des anticorps est bloquée par addition de 200 pl/puits de tampon de blocage [poudre de lait écrémé à 5% (p/v) contenant du PBS, antimousse A à 0,01% (v/v) 30 (Sigma, St Louis, MO) et thimérosal à 0,01% (p/v)] dans les puits et incubation pendant une heure à la température ambiante. Le tampon de blocage en excès est éliminé et on lave les puits trois fois à l'aide de solution saline de Tween comme

décrit ci-dessus.

Les surnageants de culture (50 p1) sont reportés puits pour puits dans les puits correspondants des plaques d'essai et incubés à la température ambiante pendant 30 minutes. Les surnageants de culture sont éliminés en secouant les plaques et on lave les puits cinq fois à l'aide de solution saline de Tween. Un anticorps de seconde étape conjugué à une enzyme (peroxydase de raifort-IgG + IgM anti-souris de chèvre conju5 gué) (Tago, Inc. Burlingame, CA) et dilué dans du Tween-20 à 0,1% (v/v) contenant du PBS et du BSA à 0,2% (p/v) selon les dosages déterminés ci-dessus, et ensuite 50 gl du réactif sont ajoutés à chaque puits et laissés à incuber pendant 30 minutes à la température ambiante. On chasse le réactif en excès; on 10 lave les puits cinq fois dans de la solution saline de Tween; et 100 gl par puits de substrat d'o-phénylènediamine sont ajoutés et on incube pendant 30 minutes comme décrit dans l'exemple 1. On termine les réactions comme indiqué dans

l'exemple 1 et on procède ensuite à la lecture à A490 nm sur 15 un lecteur de plaques EIA automatisé Bio-Tek EL-310.

A l'aide des méthodes décrites ci-dessus, on essaye les surnageants de culture provenant de la fusion pour détecter la présence d'anticorps qui se lie aux immunotypes 1, 2, 3 ou 4 de Fisher de P. aeruginosa mais non aux plaques témoin prépa20 rées par le même mode opératoire de PLL et de blocage mais sans bactérie. Les surnageants contenant des anticorps qui se lient à l'un quelconque de ces quatre immunotypes de Fisher sont testés une seconde fois en utilisant séparément chacune des sept bactéries d'immunotypes de Fisher. L'anticorps présent 25 dans le surnageant d'un seul puits, le PaF4 IVES, ne se lie qu'aux immunotypes 2, 6 et 7 de Fisher du P. aeruginosa. Les cellules provenant du puits PaF4 IVE8 sont clonées par des méthodes de limitation de dilution, comme décrit dans l'exemple 1. L'anticorps monoclonal et la lignée de cellules clonées 30 provenant de ce puits sont tous les deux identifiés par la désignation PaF4 IVE8 dans le texte qui suit. Du fluide ascitique contenant l'anticorps monoclonal à titre élevé est produit, comme décrit dans l'exemple 1, sauf que l'on utilise des souris

BALB/c au lieu de CB6 F1.

Spécificité du PaF4 IVE8 L'un des essais effectué pour identifier l'antigène lié à l'anticorps monoclonal PaF4 IVE8 est l'immunofluorescence indirect sur des organismes bactériens. Chacun des sept immunotypes de Fisher de référence de P. aeruginosa, plus une souche non flagellée de P. aeruginosa (PA103, A.T.C.C. 29260, Leifson, 1951, J. Bacteriol., 62/377-389) et Escherichia coli 5 (G.S.C. A25) sont cultivés pendant la durée d'une nuit à 37 C dans du TSB. Les bactéries sont pastillées par centrifugation et ensuite lavées deux fois dans du PBS. Chaque souche est

remise en suspension dans du PBS jusqu'à une D.O.660n. = 2,2.

Les suspensions bactériennes sont ensuite encore diluées 10 à 1/150 et des échantillons de 20 4l sont placés dans des puits individuels de lamelles de Carlson (Carlson Scientific Inc., Peotone, IL) et séchés sur la lamelle à 40 C. Les surnageants de culture (25 gl) de PaF4 IVE8 sont incubés sur les échantillons bactériens séchés sur les lamelles dans une

chambre humidifiée à la température ambiante pendant 30 minutes. L'anticorps qui ne s'est pas lié est éliminé par lavage des lamelles en plongeant les lamelles dans l'eau distillée.

Après séchage des lamelles, de l'IgG + IgM anti-souris de chèvre conjugué à l'isothiocyanate de fluoresceine (FITC) 20 (25 gl par puits d'une dilution 1/40 dans du PBS) (Tago, Burlingame, CA) est incubé sur les lamelles pendant 30 minutes à la température ambiante dans une chambre humidifiée et à l'obscurité. Les lamelles sont à nouveau lavées dans de l'eau distillée, séchées et ensuite recouvertes d'une lamelle de couverture montée à l'aide de glycérol dans du PBS (9[1). Les

lamelles sont examinées au microscope à fluorescence.

Une tâche fluorescente n'est observée que sur les immunotypes 2, 6 et 7 de Fisher de P. aeruginosa et l'on observe un schéma (une ligne) sinosoldal émanant d'une extrémité

seulement des organismes. Ceci est cohérent avec la morphologie et l'emplacement du flagelle polaire unique de ces bactéries.

La réaction du PaF4 IVE8 avec les flagelles est confirmée par une analyse par immunotâche. Les antigènes de membrane 35 extérieure d'immunotype 6 de Fisher de P. aeruginosa (voir Exemple 1) sont séparés par électrophorèse dans un gel de polyacrylamide à 14% contenant du SDS, comme décrit dans l'exemple 1, sauf que l'on procède à l'électrophorèse pendant heures à une intensité constante de 80 mAmps. Des marqueurs de poids moléculaire pré-tâchés (lysozyme: PM 14 300, bétalactoglobuline: PM 18 400, alpha-chymotrypsinogène: PM 25 700, ovalbumine: PM 43 000, albumine de sérum bovin: PM 68 000, phosphorylase B: PM 97 400, et myPM osine: 200 000) (BRL, Gaithersburg, MD) sont inclus dans le même gel de polyacrylamide. Les antigènes sont transférés du gel de polyacrylamide à une membrane de nitrocellulose (NCM), (0,45 Fm, Schleicher & Schuell, Inc. , Kenn, NH) dans un tampon de Tris-glycine-méthanol (Towbin et coll., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 76/4350-4354) contenant du SDS à 0, 05% (p/v) pendant la durée d'une nuit à 4 C à une intensité constante de 200 mA. Après transfert, on incube la membrane de nitrocellulose dans du 15 Tween-20 à 0,05% (y/v) dans du PBS (PBS-Tween) (Batteiger B. et coll., 1982, J. Immunol. Meth., 55/297-307) pendant une heure à la température ambiante. Pour cette étape et toutes les étapes ultérieures, le plateau contenant la membrane de nitrocellulose est placé sur une plateforme bascu20 lante pour garantir la distribution de la solution sur la

totalité de la membrane de nitrocellulose (NCM).

Après une heure, la solution de PBS-Tween est renversée et l'on ajoute des ascites de PaF4 IVE8 (dilution 1/1000 dans du PBS-Tween) et on incube en présence de la NCM pendant une heure à température ambiante. La NCM est ensuite lavée cinq fois, 5 minutes chaque fois, à l'aide de PBS-Tween pour éliminer l'anticorps qui ne s'est pas lié. De l'IgG + IgM anti- souris de chèvre conjugué à une phosphatase alcaline (Tago, Inc.) est dilué selon les spécifications du fabricant 30 et on incube en présence de la NCM pendant une heure à température ambiante. La NCM est lavée cinq fois comme décrit ci-dessus et le substrat contenant du phosphate de bromochloro-indolyle et du nitrobleu tétrazolium (Sigma, St Louis, MO) préparé comme décrit par Leary et coll. (1983, Proc. Natl. 35 Acad. Sci., U.S.A., 80/4045-4049) est ajouté et incubé pendant10 à 20 minutes à la température ambiante. On termine la réaction en éliminant le substrat par lavage à l'aide d'eau distillée. Les résultats de cette expérience montre que le PaF4 IVES se lie spécifiquement à un seul antigène d'un poids moléculaire 53 000 daltons dans la préparation de membrane extérieure. Les résultats de l'essai indirect par immunofluorescence et par immunotâche démontrent que le PaF4 IVE8 se lie au flagelle de P. aeruginosa. Le type de flagelle que reconnaît le PaF4 IVE8 est déterminé par la méthode ELISA. Des souches de HABS 1 à 12 (A.T.C.C. e33348 à 33359) sont liées chacune aux puits de plaques de microtitrage à 96 puits (Linbro) en présence de PLL et le test ELISA est mis en oeuvre comme décrit ci-dessus dans cet exemple. La source d'anticorps PaF4 IVE8 est constituée de surnageant des cultures. On note des réactions positives dans les puits contenant des souches de habs 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 15 et 12, ce qui indique que le PaF4 IVE8 se lie aux flagelles de type b. Les données de protection in vivo sont présentées

ci-dessus dans l'exemple 4.

EXEMPLE 3

L'exemple 3 démontre la méthodologie de préparations d'une lignée de cellules d'hybridomes de souris produisant un anticorps monoclonal réactif avec le type a de flagelle

d'anti-P. aeruginosa, c'est-à-dire protecteur in vivo.

La source de cellules lymphoYdes destinée à la fusion est une rate provenant d'une souris BALB/c immunisée à la25 quelle on a injecté quatre fois par voie intrapéritonéale pendant une période de six semaines du type a purifié d'un flagelle (10 à 20 Fg de protéine) provenant de souches 6 et 8 de HABS (A.T.C.C. %33353 et 33355). Les flagelles sont purifiés selon la méthode de T.C. Montie et coll. (1982, Infect. 30 Immun. , 35/281-288, incorporé ici à titre de référence) à l'exception que la centrifugation finale des flagelles est effectuée à 100 000 x g pendant une heure au lieu de 40 000 x g pendant trois heures. Une deuxième modification adoptée dans quelques modes opératoires est de cisailler les flagelles des 35 bactéries pendant 30 secondes dans un mélangeur plutôt que pendant 3 minutes (Allison et coll., 1985, Infect. Immun.,

49/770-774).

Les concentrations de protéines dans chaque préparation sont déterminées par l'essai de protéine Bio-Rad (Bio-Rad, Richmond, CA) et la présence de lipopolysaccharide (LPS) contaminant est évaluée en mesurant la teneur en KDO

(Karkhanis Y.D. et coll., 1978, Anal. Biochem., 85/595-601).

Les poids moléculaires des protéines de flagelles sont déterminés par comparaison de leur migration dans un gel de polyacrylamide SDS avec la migration de marqueurs protéiniques standards (BRL) (voir exemple 2). Le poids moléculaire de la flagelline 6 de HABS est de 51 700 daltons et celle de la 10 flagelline 8 de HABS est de 47 200 daltons. Ces valeurs

concordent avec celles obtenues par J.S. Allison et coll.

(1985, Infect. Immun., 49/770-774, incorporé ici à titre de référence). La fusion de cellules de rate (splénocytes) provenant de 15 souris immunisées à la flagelline et de cellules de myélome NS-1 est effectuée trois jours après la dernière immunisation, comme décrit dans les exemples 1 et 2. Lorsque les cellules d'hybridomes accèdent à une confluence d'approximativement 40% (jour n 7), les surnageants de culture sont 20 reportés puits pour puits dans des puits correspondants de trois plaques d'antigènes, immunotype 1 de Fisher de P. aeruginosa lié au PLL (voir exemple 2 pour sa préparation) et HABS 6 et HABS 9 fixés à la formaline. ' Les bactéries des plaques d'antigènes fixés à la forma25 line sont cultivées, lavées et diluées comme décrit pour des plaques d'antigènes liées au PLL. Les bactéries diluées (unités de D.O. 0,2 à A660) sont ajoutées dans les puits individuels (50 pl par puits) de plaques de microtitrage à 96 puits de Linbro et les plaques sont ensuite centrifugées à 1 200 x g 30 pendant 20 minutes à la température ambiante. Les surnageants sont éliminés des puits et 75 pI de formaline à 0,2% (v/v) dans du PBS sont ajoutés à chaque puits et on incube pendant minutes à la température ambiante. Apres élimination de la formaline hors des puits, on sèche les plaques à l'air et on 35 les stocke à 40C jusqu'à utilisation. La formaline n'altère pas l'antigénicité des flagelles, ceci étant démontré par l'aptitude des anti-sérums anti-flagelles à agglutiner les organismes traités à la formaline (Lanyi B., 1970, Acta Microbiol. Acad. Sci., Hung., 17/35-48). Une souche d'immunotype 1 de Fisher de P. aeruginosa est incluse à titre de témoin parce que cette souche est non flagellée comme l'indique une tâche au colorant mordant (Manual of Clin. Microbiol., 1985, Lennette, ed. Amer. Soc. Microbiol., Wash., D.C., p. 1099). Les cellules hybrides du puits nommé FA6 IIG5 produisent un anticorps qui se lie à HABS 6 et HABS 9 (deux

souches portant des flagelles de type a) mais non à l'immunotype 1 de Fisher.

Les cellules provenant du puits FA6 IIG5 sont postcultivées et clonées comme décrit dans les exemples précédents. L'anticorps monoclonal et la lignée de cellules clonées provenant de ce puits sont tous les deux identifiés par la

désignation FA6 IIG5 dans le texte qui suit. Les ascites sont 15 produites dans des souris BALB/c, comme décrit dans l'exemple 2.

Spécificité du FA6 IIG5 On détermine la spécificité de l'anticorps FA6 IIG5 par immunofluorescence indirect et immunotàche. L'immunofluores20 cence indirecte est mise en oeuvre essentiellement comme on l'a décrit dans l'exemple 2 avec cependant les modifications suivantes. Les cultures bactériennes que l'on a laissé croître pendant la durée d'une nuit sur de l'agar-agar de soja trypticase 25 à 30 C sont enlevées des plaques à l'aide de mèches de coton et remises en suspension dans du PBS jusqu'à une A660 de 0,2 unité D.O. De la formaline (à 0,37% (v/v) dans la concentration finale de PBS) est ajoutée à la suspension avec agitation par vortex. Après une incubation de 15 minutes à la température ambiante, les bactéries sont diluées 1/12 dans du PBS et 20 g1 de cette suspension sont placés dans des puits

individuels de lamelles de Carlson. Après séchage, les lamelles sont préparées pour examen comme on l'a décrit dans l'exemple 2.

La source d'anticorps est du surnageant de culture provenant de 35 la lignée de cellules FA6 IIG5.

Une tâche fluorescente produite par l'anticorps FA6 IIG5 n'est observée qu'avec les souches de P. aeruginosa portant des flagelles de type a et pour aucune de celles portant des flagelles de type b. Le schéma de fluorescence observé est un schéma en ligne sinosoidale indiquant que le FA6 IIG5 s'est lié aux flagelles. Le signal fluorescent est amélioré par traitement des bactéries à la formaline mais le traitement n'est pas nécessaire pour visualiser les tâches flagellaires

en présence de l'anticorps.

L'immunotâche est mise en oeuvre comme décrit dans l'exemple 2. Les sources d'antigènes de flagelle de type a sont les préparations flagellaires purifiées (voir cet exem10 ple). Les antigènes sont séparés dans des gels de polyacrylamide à 10% contenant du SDS (Laemmli, U.K., 1970, Nature (London), 227/680-685) et transférés sur une membrane de méthylnitrocellulose (NCM). On fait réagir les préparations de FA6 IIG5, que ce soit du surnageant de culture ou des ascites 15 diluées 1/1000 avec la NCM et l'on détecte la réaction à l'aide d'un réactif conjugué avec une enzyme appropriée et un substrat enzymatique comme décrit dans l'exemple 2. L'immunotâche illustre que le FA6 IIG5 se lie spécifiquement à la

flagelline de PM 51 700 du HABS 6 et à la flagelline de PM 20 47 200 du HABS 8.

La confirmation du fait que le FA6 IIG5 ne réagit qu'avec des flagelles de type a et non de type b est obtenue par un test ELISA dans lequel des souches 1 à 12 de HABS sont liées individuellement avec du PLL aux puits de plaques de microtitrage à 96 puits de Linbro. Les anticorps ne se lient qu'aux souches 1, 6, 8 et 9 de HABS qui sont les seules souches portant des flagelles de type a parmi les douze (voir, Ansorg. R. et coll. , 1984, J. CLin. Microbiol., 20/84-88,

incorporé ici à titre de référence). Les études de protection 30 in vivo sont présentées dans l'exemple 4 suivant.

EXEMPLE 4

L'exemple 4 démontre la protection de souris immunisées passivement à l'aide d'anticorps PaF4 IVE8 et FA6 IIG5 contre

des attaques par le P. aeruginosa dans un modèle de souris 35 brûlée.

Les anticorps monoclonaux anti-flagelles sont testés sur le modèle de souris brûlée selon la méthode de M.S. Collins et R.E. Roby (1983, J. Trauma, 23/530-534, incorporé ici à titre $l ia 'o*anbvllB a a nLLq savdu s91dmoo luos snoç I i 9s7 *9T1nos bulD ap gnilisuoD isa Tnb Sqd ap u;oumg adnoiS -Eas np uoplda>xal vi Sú i %mB'uu xlp o;p sadno2 sp suBp synos sap aiAns el %ns gsBq Isa a2eluananod a- I i I isvsoutraas ci ap On oT luama&leurXodde xed auqsa.snos sagnbelly wos ssanos sa i; I; I i o i 1 1 i i I I 1 i i 08 i 08 i 0 8 i 08;08 t iX;leq SUs'a; i i à O;O;Ol i O i i O i I; I;Obsas UO z01 30- i 01 i01 z01 Ioz 10c 10î 1 001 i aOflogdsuou3 i; i i i i i i i I S'i-TlUW IUOIZOUOM sdloo$uy i;; i i i; ;; i i i i01 101 0I 0I i il i 0 i 0l i 0; 000 i 9SI 4 &a 0q ailaiisi-l0u0 i i i i i i i i i i i i i 08 i 08 1 06 i 06 i 00 i 000 i 001 i 001 00 1 DI 9Yv 'e allauel-luv 1;; I ';; i i i; 6; 8 i L i 9 i i V i i Z; I i ----------------------------------------------------; i Uama:l-!Ull i mno asd aAins ap % i i; ia9tDtq sranos op aeIpoui el ns allaBel;-t-ue e edKI ep lieuolououi sdaoo-cue unp uo;oe;4oid ap apn;a I nRfZ *II la I xneelwqe sel suep sqquesgad 4uos xneumus slwssa sep se;lnsga s'I aemsuuefibo enbeqo anod 0SaU 01 uoiAua e S aeWfi9 sa enbve;e,p esop w1 an'buee,p saragoeq sel qumueluoo pFo=a Sua eeIqcsa-snos ap Im 5'0 obaez Inlue.1 'eanlolq el sqide queuwaerpgumI 'aube;;e,l la eani9q el ueAe seaUnaq xnap no aun esneuieûaeiuu a!oa zed stanos anbeqo e sgasrutuipe juos 9T;gand lvUOlzOUou sdioorque,p saunmmaefiootu aqueaeno 01 *(EîELZ% XD-D-L-Y) esouibniae 'a op.ars a ap z adAjounumui aouea;ag etI;sa q adAq ep aeleb-l; un queqaod aqonos w-e a (kS 'uo4sog 'uoiButuuea seuwr inaeooa al zaqo ep) OZZya esoubniae 'a esqonos we qsa xnemue ans stessa set suwp eastiîtn e adAz ap alae5it; un jue;zod aqonos eIq *sa op S uodmUe. un suep sgsA1iep:e (aoueig;ga ap aaqi$ e loi gaodzoour 9ú-6Zt/ST 'rsuiaesqoounumI '8L61 '1IlOo la ''a Aa) as -oetQdesauT$9oad ans aTqdebBo;eumoaqo xwd sqT;tind quos sdloo -nque sel snoq 'uorqeoao.d ap sapni, sel anod f(alouoa;aJ ap 8a5L 09Z ap sanb:utID selIOsi sol DzAe SII 9Va np 4a 8AI t&a np;ueluzodmi aeastola 9; Arqo-eaQI ee a:luouxp 9 alduaxaq s aqwaxa *aleql sed qsa.u euigui-elle aed aanju)aq el anb enbipu; sae9oegur uou siuw sag9igq s$Inos sep amAans eq *Oa4TA Ur sgAàasqo SdzODorue sap OA:A UF 9TDFO9ds eI luazoqotoo e adAi ap saIlaiel; sap jueiaod OZzad esou6nae -a el ed eIigl anbene aunp szfnos sap aBiaozd e q adA4 ap atliebI; -T;ue sdzoorque.1 op apn4F4deurT;e q adA; op salabet;0 sep queQlod esouifnlae 'a p zaqs:a ap Z adAlounuautI aed aluel enbe;;e aunp stinos sep zof9;oad er al;eHlabeT;-Tque e adKi ap sdaoorque1t ap apnkf;deur1' *;ualnam anb5;rDods uou Sal-ltue sdaoDq;ue un no quepuodsarzoD uou az=eîabiel; -T;ue euolououom sdloDotue un aed aTfnsua s9;e:zr 'sgnbe4e Sz steui s9;Tezu uou xneuTue no st:nOS sap %06 V 08 Op 'a2leuzuoD nf 'iuepuodsaezoo auQb:uuel aed sagnbe;e 4elnsu qs q- Tque sdloDtque1l no e-t;ue sdlxoDt;ueQ1 DOaVe segqTuzq 94;uo inb s.Inos sel ZaqD agAa4asqo.sa aque4odmr S9ai afAlns aun oz .anbs;s -4a aaninlq sgldv spdmoo iuos sano; s; sTsnos bul ap gnilsuoa isa Inb Sgd ap uiomgo: adnoi Lnas np uoiFdaoxa,1t i; i xno mue xcp ap sadnoag sap suBp s9.mnos sap alAns w arns mseq sa aelsuaoainod a; i isoulnias '& ap aatqDs$ ap; Z ad4lounmsp (ri 01:luamaA$ilmxoadde asd aaeqzsa-snos sagnbe:l:uo ainos s; mos sa-i i; I i; i; i i i; ; i i 001 i 00 i 001 i 001 001 i 00 1 00 i 001; 00I O açlaglq sues ' S i I i i;; i i i; i Z OZ O; 0OZ i oz 0Z i oz i o 001i anbl;;;gds uou 1 i; i; i;; i i i S"l-Tilue IUOtaOUOou sdiootluY i i; i i i i i i i i i01 I 1 O1 i0 01 i 01 1 01 OZ i 001 i SoII 9'v l allajsl;- ilu i ;; ;; i; i I i i i106 1 06 1 06 1 06 1 06 i 06 1 06 i 00 I001 t 8aAI;tue 'q alialvi}-tluV i i i;; i i i i i 1 i i i i i i i; i i t i à 6 i 8 i 1 i 9; S;; i t i Z I i; -------------------------------------------- ----....:---; luaual'Bl.; i:mino isd alans ap %; i I i SI 0I S iagiD[q s. anos ap alQPOui al Ins attaBQe;-tque

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8 c 0 9 g

P. aeruginosa, ce qui indique l'utilité clinique de ces anticorps dans l'immunothérapie des infections par le P. aeruginosa.

Les isolats cliniques sont obtenus dans les hôpitaux et les cliniques. Les isolats proviennent de toute une série de 5 sites d'isolation, y compris le sang, les blessures, le système respiratoire, l'urine et les oreilles. Ont été examinés

un total de 157 isolats.

Le PaF4 IVE8 s'est lié spécifiquement à 34 isolats cliniques (22%) tandis que l'anticorps de flagelle de type a, 10 le FA6 IIG5, s'est lié à 102 isolats cliniques (65%), soit un total de 136 isolats sur 157 (87%). Sur les 21 souches qui n'ont pas été reconnues par l'un ou l'autre des anticorps, 19 n'étaient pas flagellées comme le montre un essai de tâche par colorant au mordant. De ce fait, les deux anticorps en combi15 naison se sont liés à 136/138 (sensiblement 98%) des isolats cliniques flagellés, ce qui confirme les rapports antérieurs (voir, R. Ansorg, 1978, Zbl. Bakt. Hyg., I Abt. Orig. A,

242/228-238, incorporé ici à titre de référence).

EXEMPLE 6

L'exemple 6 démontre des méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux humains qui se lient aux flagelles de type b

de P. aeruginosa.

Un échantillon de sang périphérique d'un individu immunisé par une préparation de polysaccharide à poids moléculaire 25 élevé (Pier et coll., 1984, Infect. Immun., 45/309) a servi de source de cellules B. Des cellules mononucléaires sont séparées du sang par des techniques standards de centrifugation sur Ficoll-Paque (Boyum, 1968, Scand. J. Clin. Lab. Invest.,

21/77) et lavées deux fois dans une solution saline tamponnée 30 exempt de phosphate calcium/magnésium (PBS).

Les cellules mononucléaire sont débarrassées de cellules T en utilisant une procédure de E-rosette modifiée. En bref, les cellules sont d'abord remises en suspension à une concentration de 1 x 107 cellules/ml dans du PBS contenant 20% 35 de sérum de veau fétal (FCS) à 40C. 1 ml de cette suspension est alors placé dans un tube à fond rond en polystyrène de 17 x 100 mm dans lequel on ajoute 1 x 109 cellules de sang rouge de mouton traitées par du bromure de 2-amino-isothiouronium (AET) dans une solution à 10% (v/v) dans du milieu de Dubelcoo modifié Iscove (milieu d'Iscove) (Madsen and Johnson, 1979, J. Immun. Methods, 27/61). La suspension est très modérément mélangée pendant 5 à 10 minutes à 4WC et les cellules modifiées E-rosettes sont alors enlevées par centrifugation sur FicollPaque pendant 8 minutes à 2 500 x g à 4 C. Les cellules mononucléaires de sang périphérique négatives au E-rosette (E PBMC) s'agglutinant à l'interface sont collectées et lavées 10 une fois dans du milieu d'Iscove et remises en suspension dans ce même milieu contenant 15% de FCS (v/v), de la L-glutamine (2 mmoles/1), de la pénicilline (100 UI/ml), de la streptomycine (100 pg/ml), d'hypoxanthine (1 x 10-4 M), aminoptérine

(4 x 10-7 M) et thymidine (1,6 x 10-5 M). Ce milieu est ci15 après désigné sous le nom de milieu HAT.

* La transformation entraînée par une cellule du E-PBMC est accomplie en cocultivant ces cellules en présence d'une lignée de cellules transformantes. La lignée de cellules transformantes est une lignée de cellules lymphoblastoldes 20 humaines positives de l'antigène nucléaire d'Epstein-Barr (EBNA) dérivée par une mutagénèse au méthanesulfonate d'éthyle (EMS) de la lignée de cellules lymphoblastoides GM 1500 suivie par une sélection en présence de 30 pg/ml de 6-thioguanine

pour rendre les cellules déficientes en hypoxanthine-guanine 25 phosphoribosyle transférase (HGPRT) et donc sensibles au HAT.

Cette lignée de cellules est désignée sous le nom de lignée de cellules 1A2 et elle a été déposée à l'American Type Culture

Collection (A.T.C.C.) le 29 mars 1982 sous le n A.T.C.C.

CRL 8119. Des cellules de 1A2 en phase de croissance logarith30 mique sont mises en suspension dans du milieu HAT et ensuite combinées avec le E PBMC dans un rapport de 15 cellules de 1A2 par PBMC. Le mélange de cellules est mis sur plaque dans plaques de microtitrage à 96 puits, à fond rond (Costar 3799) à une concentration de 32 000 cellules/puits dans un volume de 200 pl par puit, et incubé à 370C dans une atmosphère humidifiée contenant 6% de CO2. Les cultures sont entretenues les jours 5 et 8 après la mise sur plaque par remplacement de la moitié du surnageant par du milieu HAT frais. Seize jours après la mise sur plaque, 100% des puits contiennent des cellules proliférantes et dans la plupart des puits, les cellules ont une densité suffisante pour être retirées et pour que l'on teste, dans les surnageants, la présence d'anticorps anti-P. aeruginosa. On crible les surnageants pour détecter la présence d'anticorps anti-P. aeruginosa en utilisant la technique ELISA, telle que décrite dans l'exemple 2, avec les modifications suivantes. Un ensemble des sept souches de référence 10 d'immunotype de Fisher (A.T.C.C. n0 27312 à 27318) (A660 = 0,2 unité D.O.) sont liées à des plaques de microtitrage à 96 puits à fond plat (Immulon II, Dynatech) prétraitées à l'aide de poly-L-lysine, incubées et lavées comme décrit dans l'exemple 2. Après blocage des sites de liaison non spécifi15 ques et lavage des plaques, 50 1 de PBS contenant 0,1% (v/v) de Tween-20 et 0,2% (p/v) de BSA sont ajoutés dans chaque puits. Les surnageants de culture (50 g1) sont ensuite reportés puits pour puits dans les puits correspondants de plaques d'essai et dans des plaques témoin qui ont été traitées avec du PLL et bloquées mais ne contiennent pas de bactéries. Après incubation et lavage, des anticorps de seconde étape conjugués à une enzyme (50 1 par puits} de l'IgG anti-humain de chèvre et de l'IgM anti-humain de chèvre conjugués à une peroxydase de raifort, diluée de façon appropriée dans du PBS contenant 0,1% (v/v) de Tween-20 et 0,2% (p/v) de BSA, sont ajoutés dans les puits et l'essai terminé comme on l'a décrit dans

l'exemple 2.

Les surnageants contenant l'anticorps qui se lie à l'ensemble des immunotypes de Fisher mais non à la plaque témoin sont testés une deuxième fois en utilisant séparément

chacune des bactéries des sept immunotypes de Fisher. L'anticorps présent dans le surnageant d'un puits, le 20H11, ne se lie qu'aux immunotypes 2, 6 et 7 de Fisher du P. aeruginosa.

Les cellules sont recultivées à répétition à des densités de 35 cellules de moins en moins faibles jusqu'à ce que tous les puits présentant une croissance sécrètent de l'anticorps. Les lignes de cellules et l'anticorps monoclonal (isotype IgM) sont tous les deux identifiés par la désignation 20Hll dans le

texte qui va suivre.

On effectue une seconde transformation dans laquelle la source des cellules B est représentée par le sang périphérique d'un patient souffrant de fybrose cystique connu pour avoir subi une infection chronique par le P. aeruginosa. Des E PBMC sont préparés comme décrits ci- dessus et co-cultivés en présence de la ligne de cellules transformantes 1A2, à un taux de 72 cellules 1A2 par E-PBMC. Le mélange de cellules est déposé 10sur quinze plaques de microtitrage à 96 puits à fond rond, à une concentration de 7,4 x 104 cellules/puits et cultivé comme ci-dessus. Les surnageants sont testés par un test ELISA pour détecter la présence d'anticorps anti-P. aeruginosa seize jours 15 après la mise de la transformation sur plaques. L'essai est effectué comme décrit pour la transformation préalable sauf que l'ensemble de souches de P. aeruginosa utilisé pour le criblage initial était composé de souches de référence d'immunotype de Fisher, F2, F4, F6 et F7 (A.T.C.C. n0 27313, 27315, 20 27316 et 27317) et de trois isolats cliniques provenant de la Banque d'organismes Genetics Systems Corporations (GSCOB) présentant différents immunotypes LPS et différents types de flagelles. L'isolat clinique PSA 1277 (GSCOB) porte des flagelles de type a et du LPS d'immunotype 1 de Fisher; le deu25 xième isolat, le PSA G98 (GSCOB), porte des flagelles de type a et du LPS d'immunotype 3 de Fisher, et le troisième, le PSA F625 (GSCOB), porte des flagelles de type b et du LPS d'immunotype 5 de Fisher. Ce mélange de souches de référence et d'isolats cliniques sera désigné sous le nom d'ensemble 30 flagellé de P. aeruginosa. Les surnageants contenant des anticorps qui se lient aux plantes contenant l'ensemble flagellé de P. aeruginosa mais non aux plaques témoin revêtues de PLL, sont testés une seconde fois par le test ELISA sur les souches individuelles de l'ensemble. Un puits, le 3C1, se lie 35 aux souches de référence F2, F6 et F7 et à l'isolat

clinique F625.

Le clonage de la lignée de cellules 3C1 est accompli tout d'abord en recultivant les cellules dans deux tournées de culture de faible densité, tout d'abord à 20 cellules par puits de plaques à 96 puits, suivi d'une culture à deux cellules par puits. Un clonage formal des cellules produisant l'anticorps spécifique est effectué en déposant les cellules 5 sur plaques à une densité d'environ 1 cellule/puits dans des plaques de Terasaki à 72 puits (Nunc e1-36538) dans un volume de 10 il/puits de milieu HAT manquant de composant aminoptérine (milieu HT). Les plaques sont placées dans un incubateur pendant 2 à 3 heures pour laisser les cellules se déposer au fond des puits et elles sont ensuite évaluer microscopiquement par deux individus pour déceler les puits contenant une cellule unique. Les cellules sont entretenues chaque jour avec du milieu HT et, lorsque la croissance est suffisante, les cellules sont transférées sur une plaque à 96 puits à fond rond. 15 Tous les puits présentant une croissance sont testés par le

test ELISA sur des souches de P. aeruginosa portant des flagelles de type b et l'on constate que toutes produisent l'anticorps approprié. La lignée de cellules et l'anticorps monoclonal (isotype IgM) sont tous les deux identifiés dans le 20 texte qui va suivre par la désignation 3C1.

L'antigène identifié par 20Hll et 3C1 consiste en flagelles comme le montrent l'immunofluorescence indirecte et l'immunotâche. Les techniques sont mises en oeuvre fondamentalement comme décrit dans les exemples 2 et 3. Pour l'essai 25 d'immunofluorescence indirect, des souches de P. aeruginosa portant des flagelles de type b, référence immunotypes F2, F6 et F7 de Fisher (A.T.C.C. n 27313, 27317 et 27318) et une souche portant des flagelles de type a, référence immunotype 4 de Fisher (A.T.C.C. n 27315), sont préparées comme décrit 30 dans l'exemple 3. Le type de flagelles des souches de référence est déterminé par typage à l'aide des anticorps monoclonaux de souris, PaF4 IVE8 et FA6 IIG5. Les lamelles sont préparées pour leur examen comme décrit dans l'exemple 2. Les sources des deux anticorps sont des surnageants de culture et 35 le réactif conjuguéFITC est une Ig (polyvalente) anti-humaine de chèvre conjuguée-FITC (Tago, Burlingame, CA) diluée à 1/100 dans du PBS contenant 0,5% (p/v) de gammaglobuline bovine (Miles Scientific, Cat. n 82-041-2, Naperville, IL) et 0,1%

(p/v) d'azoture de sodium comme agent de préservation.

L'obtention d'une tâche fluorescente par les anticorps H11 et 3C1 ne s'observe qu'avec des souches de P. aeruginosa 5 portant des flagelles de type b et non avec la souche portant des flagelles de type a, référence immunotype 4 de Fisher. Le schéma de fluorescence observé est constitué d'un schéma en

ligne sinusoïdale émanant de l'une des extrémités des bactéries, ce qui indique que les anticorps se lient aux flagelles 10 des bactéries.

L'immunotache est mise en oeuvre comme décrit dans l'exemple 2. Un flagelle de type b purifié provenant des immunotype 2 de Fisher des souches de référence de P. aeruginosa (A.T.C.C. né 27313) et un flagelle de type a 15 purifié provenant de souche de référence HABS 6 et HABS 8 (A. T.C.C. né 33353 et 33355) sont préparés comme décrit dans l'exemple 3. Les antigènes sont séparés dans un gel de polyacrylamide à 10% (voir exemple 3) et transférés sur une membrane de NCM. Les surnageants de culture contenant des anti20 corps 20Hll ou 3C1, du surnageant de culture contenant un anticorps humain non spécifique et des milieux de culture sont incubés en présence de la NCM et la réaction est détectée à l'aide d'une Ig (polyvalente) anti-humaine de chèvre conjuguée à une phosphatase alcaline (Tago, Burlingame, CA) diluée dans 25 du PBS contenant 0,05% (v/v) de Tween-20. Du substrat d'enzyme est préparé comme décrit dans l'exemple 2. L'immunotâche illustre que les anticorps se lient tous les deux à la protéine de la flagelline de PM: 53 000 de l'immunotype 2 de Fisher et non à la protéine de flagelline de PM: 51 700 de l'HABS 6 ni à 30 la protéine de flagelline de PM: 47 200 de l'HABS 8. Aucune

réaction n'est observée ni avec l'anticorps humain non spécifique ni avec les milieux de culture.

Une confirmation supplémentaire de ce que les anticorps 20Hll et 3C1 ne se lient qu'aux flagelles de type b et 35 non pas à ceux de type a est obtenue par un test ELISA dans lequel des souches HABS 1 à 12 sont liées individuellement en présence de PLL aux puits de plaques de microtitrage à 96 puits Immulon. Les anticorps ne se lient qu'aux souches 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 et 12 de HABS, qui sont des souches portant des flagelles de type b (Ansorg et coll. (1984) J. Clin.

Microbiol., 20/84).

EXEMPLE 7

L'exemple 7 démontre des méthodes de préparation d'un anticorps monoclonal humain qui se lie aux flagelles de type a

de P. aeruginosa.

Un échantillon de sang périphérique provenant d'un individu immunisé à l'aide d'une préparation de polysaccharide

de poids moléculaire élevé (Pier et coll. (1981) Infect.

Immun., 34/461) sert de source de cellules B. Les cellules mononucléaires sont séparées dans le sang et ensuite débarrassées des cellules T, comme on l'a décrit dans l'exemple 6. Les 15 cellules sont ensuite congelées dans du FCS contenant 10% de

diméthylsulfoxide dans un réservoir à vapeur d'azote liquide.

Plus tard, les cellules sont dégelées rapidement à 37eC, lavées une fois dans un milieu formé d'Iscove et remises en suspension dans du milieu HAT. Une transformation entraînée par une cellule est accomplie par co- culture du E PBMC en même temps que des cellules de 1A2 à raison de 30 cellules de 1A2 par E PBMC. Le mélange de cellules est déposé dans 30 plaques de culture tissulaire à 96 puits à une concentration de 62 000 cellules/puits. Les cultures sont entretenues le septième jour après dépôt sur plaques par remplacement de la moitié du volume par du milieu HAT. On observe une prolifération de cellules dans 100% des puits le quatorzième jour après dépôt sur plaques, et on enlève les surnageants des puits et

on les teste à ce moment là.

Les surnageants sont testés par le test ELISA pour détecter la présence d'anticorps anti-P. aeruginosa en utilisant l'ensemble de P. aeruginosa flagellé et les plaques traitées au PLL à titre témoin, comme on l'a décrit dans l'exemple 6. Les surnageants contenant des anticorps qui se lient à l'ensemble flagellé mais non aux plaques témoin au PLL sont à nouveau testés sur des souches individuelles de bactéries de l'ensemble flagellé. Un puits, le 21B8, contient des

260-1458

anticorps qui se lient au PSA 1277, au PSA G98 et à 1'immunotype 4 de Fisher de référence, qui sont les trois souches

de l'ensemble flagellé qui porte des flagelles de type a.

Le clonage de la lignée de cellules 21B8 s'accomplit comme décrit dans l'exemple 6 pour la lignée de cellules 3C1 avec les modifications suivantes dans l'étape formelle de clonage. Après que l'on ait examiné dans les puits des plaques de Terasaki la seule présence d'une cellule unique, chaque cellule est transférée de la plaque de Terasaki à un puits 10 individuel d'une plaque de culture à 96 puits à fond rond, dans un volume de 100 g1 de milieu HAT dépourvu de composant aminoptérine (milieu HT). Des cellules de lymphoblastoSdes sensibles au HAT non transformantes sont comprises dans tous les puits à une densité de 500 cellules/puits comme cellules 15 d'entretien. Cinq jours après dépôt sur la plaque, on ajoute p1 de milieu HAT dans les puits pour tuer sélectivement les cellules d'entretien. Les puits sont à nouveau entretenus les jours 7 et 9 après la mise sur plaques par remplacement de la moitié du surnageant par du milieu HAT. Les cellules sont 20 alors alimentés à l'aide de milieu HT jusqu'à ce que les cellules aient une densité suffisante pour détecter la présence d'anticorps par le test ELISA. Tous les puits présentant une croissance produisent un anticorps qui se lie aux souches de P. aeruginosa portant des flagelles de type a. La lignée cellulaire et l'anticorps monoclonal (isotype IgG1) sont tous

les deux identifiés dans le texte qui va suivre par la désignation 21B8.

L'antigène identifié par la dénomination 21B8 est une flagelle comme le montrent l'immunofluorescence indirect et

l'immunotâche (voir l'exemple 6 pour la description des techniques). L'obtention d'une tâche fluorescente par l'anticorps 21B8 ne s'observe qu'avec l'immunotype 4 de Fisher de la

souche de référence du P. aeruginosa (A.T.T.C. n0 27315) qui porte des flagelles de typé a et non avec l'immunotype 2 de la 35 souche de référence de P. aeruginosa (A.T.C.C. n 27313) qui porte des flagelles de type a. Le schéma de fluorescence observé est constitué d'un schéma en ligne sinusoïdale émanant de l'une des extrémités des bactéries, ce qui indique que

l'anticorps se lie aux flagelles des bactéries.

L'immunotâche est mise en oeuvre comme on l'a décrit dans l'exemple 2. Des flagelles de type a purifiés provenant de la souche HABS 6 de référence de P. aeruginosa (A.T.C.C. n0 33353) et de flagelles de type b purifiés provenant de l'immunotype 2 de Fisher de la souche de référence de P. aeruginosa (A.T.C.C. n 27313) sont préparés comme décrit dans l'exemple 3. Les antigènes sont séparés dans du gel de 10 polyacrylamide à 10% (voir exemple 3) et transférés sur une NCM (membrane de nitrocellulose). Les surnageants de culture contenant soit du 21B8, soit un anticorps humain non spécifique, et des milieux de culture sont mis en réaction avec la NCM et la réaction est détectée à l'aide d'une Ig (polyva15 lente) anti-humaine de chèvre conjuguée à une phosphatase alcaline et un substrat d'enzyme, comme on l'a décrit dans les exemples 2 et 6. L'immunotâche montre que l'anticorps 21B8 ne se lie qu'à la protéine de flagelline de PM: 21 700 du HABS 6 et non à la protéine de flagelline de PM:53 000 de l'immuno20 type 2 de Fisher. Aucune réaction n'est observée ni avec l'anticorps humain non spécifique, ni avec les milieux de culture.

EXEMPLE 8

L'exemple 8 montre la protection de souris immunisées 25 passivement par des anticorps humains anti-flagelles, 20Hll, 3C1 et 21B8, contre l'attaque par du P. aeruginosa sur un

modèle de souris brûlée.

Les anticorps monoclonaux humains anti-flagelle sont testés sur le modèle de souris brûlée (voir exemple 4). Les 30 anticorps 21B8 et 20H11 sont préparés par précipitation de surnageants de culture produits à partir des lignées de cellules respectives, en présence de sulfate d'ammonium (concentration finale 50%) (Good et coll., Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell B.B et Shiigi S.M., eds., W.J. Freeman et Co., San Francisco, CA, 1980, 279-286). Le précipité est solubilité dans du PBS, dialysé contre du PBS pendant la durée d'une nuit à 4 C et ensuite soumis à une filtration stérile avant administration aux animaux. La source la SaTasgilq sal DAtv q2uvIqm;9d:sa (Sqj aP lm $uvp Sri OTS) 9T j1nd sdiooTluv,q; i i *anbse,i la etlII.iq sI SIdw sado sdmouos sinoj saq 'xnem; ; -}uB 3Tnq ap adnoi2 aed selutsa.mns ssanos ap aiqmou eI arns gssq ise a9wuaalnod aq;4 t zzsv ysa esouTiuSa 'à ap 00(1 S ap Snld aeAA aievasa.snos sagnbeie luos sainos sol I i i i i i i z i i i i i i i i i i I i i i Z o U i oU;U oZ* i oio iSoIoo 100!l;lu iTmu ssaoz i i i i i i i i i i i 001 i 001 i 001 i 001 i 0 01 i 0 01 i 001 i q alla -UuTSlu uTmnq gtH0Z i i i i i i i i i I i i i i i à i i i i i sTmos; 4 o*r.4 or 4 o*r 4 o-r 4 or 4 or. oo t or oo.4 e elIe2s!;-tlue u;semnq 9Itll i i i i i i i i i i i i i it; 88 i 88; 88; 88 i OOI i OOI i OOI i OOI i ap aIIateIt-$lu SS0II 9 S i i i i I i i i i i i ú i; i i i i;;;; i i i i 6 i i ú i 9 i 5 i t i Z i I i &À. L.................... .............'a995

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8 S L 09Z

Un taux de survie très important est observé chez des souris que l'on a traité avec l'anticorps de type a antiflagelle ou l'un ou l'autre des deux anticorps anti-flagelles de type b et attaquées ensuite avec les antigènes correspon5 dants. Au contraire, de 88 à 100% des souris non traitées mais attaquées ou de celles traitées avec un anticorps monoclonal anti-flagellaire non correspondant ou un anticorps LPS non spécifique sont mortes. Comme on l'a observé avec les anticorps monoclonaux de souris (voir exemple 4), les anticorps 10 humains anti- flagelles protègent spécifiquement contre une attaque létale seulement vis-à-vis des organismes portant les flagelles de type correspondant, c'est-à-dire l'anticorps humain anti-flagelle de type a procure une protection contre une attaque létale par un organisme portant des flagelles de 15 type a et non du type b et les anticorps anti-flagelles de type b protègent des souris qui ont été attaquées avec des

souches portant des flagelles de type b mais non avec l'organisme portant des flagelles de type a.

EXEMPLE 9

L'exemple 9 démontre la réactivité croisée des anticorps humains antiflagelles, 20H11, 3C1 et 21B8, avec les isolats

cliniques de P. aeruginosa.

Les isolats cliniques (115) de P. aeruginosa obtenus dans des hôpitaux et dans des cliniques, isolés surtout à partir de blessures par brûlure et de sang, sont identifiés comme portant des flagelles de type a ou de type b par typage à l'aide d'anticorps monoclonaux de souris, FA6 IIG5 ou PaF4 IVE8 (voir exemples 2, 3 et 5). Cinquante cinq des isolats cliniques sont identifiés comme portant des flagelles de 30 type a par leur réaction avec l'anticorps monoclonal de souris FA6 IIG5 et 59 sont identifiés comme portant des flagelles de type b par leur réaction avec l'anticorps monoclonal de souris, le PaF4 IVE8. La réactivité croisée de l'anticorps monoclonal humain anti-flagelle de type a, le 21B8, est impor35 tante en ce sens que l'anticorps reconnaît 54 sur les 56 isolats cliniques portant des flagelles de type a (96%). La réactivité croisée du 20H11 avec les isolats portant des flagelles de type b-est également importante en ce sens que le Hll reconnaît tous les 59 isolats (100%). Au contraire, l'autre anticorps monoclonal anti-flagelle de type b,le 3C1, ne se lit qu'à 43 sur les 59 isolats (73%). Ces résultats démontrent que le 20Hll se lie à un épitope pan-réactif (c'est-à-dire & un épitope présent sur au moins 95% des souches flagellées de P. aeruginosa), tandis que le 3C1 se lie à un épitope qui n'est pas présent sur toutes les molécules de flagelline de type b. Même bien que l'antigène de flagelle de type b soit sérologiquement uniforme lorsqu'il est analysé par 10 des anti-sérums polyclonaux (Lanvi B., voir ci-dessus, et Ansorg R, voir ci-dessus), les schémas de réactivité croisée du 20H11 et du 3C1 montrent de façon surprenante que les flagelles de type b ont au moins deux épitopes séparés que

l'on peut identifier par des anticorps monoclonaux.

La réactivité croisée importante des anticorps 21B8 et Hll sur les isolats cliniques de P. aeruginosa est une indication de l'utilité clinique particulière de ces anticorps en immunothérapeutique des infections occasionnées par le

P. aeruginosa.

EXEMPLE 10

L'exemple 10 démontre des méthodes de préparation d'un autre anticorps monoclonal humain exemplaire qui se lie aux flagelles de type b de P. aeruginosa aussi bien que l'activité

protectrice de l'anticorps contre une attaque par le 25 P. aeruginosa chez un modèle de souris brûlée.

Une lignée de cellules transformées est préparée et clonée essentiellement comme on l'a décrit dans l'exemple 7, sauf que le mélange de cellules transformées est déposé sur plaques de culture de tissu à 96 puits, à une concentration 30 d'environ 2 250 E-PBMC par puits. Les surnageants sont initialement testés par un test ELISA sur l'ensemble flagellé comme on l'a décrit dans l'exemple 6, sauf que les souches d'immunotype de Fisher de références 2 et 4 sont absentes de l'ensemble. Les cellules positives sont ultérieurement testés 35 sur chacune des souches de l'ensemble de Fisher, y compris les immunotypes 2 et 4 de Fisher. La lignée de cellules finalement isolées et l'anticorps monoclonal (isotype IgG) sont tous les *agiaq s:=nos ep alspou un ans usour6nae el aed anbeqqQ.1 o.ZauoD sdiooc;ue qDo ap apts8. V 1queuieAtssvd saegsunumut szinos sep uo;;oload et a q adA4 ap allabel; un queizod nsoubnIae 'a np Da&e gTea uti Uminq teuolououo i sdiootrue un,p uoleleadgid el aquouigp I aldumexe,1 i i j tanbeag,l ia ainIjUq eI juaew saiaq xna p aleguo; -;zpdexiut a8o.ied 9SglsuTmpe Isa (Sqd ap lm S'0 suep Sl OS) 913}1nd sdiooD,;us I i '*anbBTe ia ainUxq sade i sglduoo uos snor sa' *xnwalue a ap gnl!isuoa lSl adnoal e anod Ines xnuqmue xtp i ap adnoa2 ied saiueAlA$ns sanos ap aiqmou al ins gseq lsa aTains ap a2Ssuaanod aq i 00Ii '3Z9I esoultuaa 'd ap (AD 0O6) Cr0 T aaAs axeqasa- snos sagnbsus Iuos ssnos sa i i I i i i i i i i i i i I i i SZ; S; SZ; SZ; ;; iS'LE; OOT T q alIOtll3-$Iue uLemnq 301i; i 001; OO 001 i 001; 001 i 001; I; 001 i 001 i sainos ap alaell -$l ug çS9 11 i i i i i i i i i i i 1 06;06 i06 1 06;06;06;06 106 1 06 I Sdl Z Oqslà-}llu uTenq 6HZ i i 001 i 001 i001 i 001 i001 1; 001 0 I 001 i 001 i e allatuel-Tlus u$ nq L/1 i i i i; ; ; i i i a i 6; 8 i / i 9 i S i E7 3 i Z i T 1 i;. ..............--.

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1 Les souris sont attaquées sous-eschare avec 1 LD (105 CFU) de P. aeruginosa F164.

! 100 2 Le pourcentage de survie est basé sur le nombre de souris survivantes par groupe de! dix animaux sauf pour le groupe 2B8 constitué de 8 animaux. Les jours sont comptés! -! après brûlure et attaque.! !! ! L'anticorps purifié (50 pg dans 0,5 ml de PBS) est administré par voie intrapéri-! ! tonéale deux heures avant la brûlure et l'attaque.! !!

! L'anticorps purifié (5 pg dans 0,5 ml de PBS) est administré par voie intrapéritonéale deux heures avant la brûlure et l'attaque.

I! !!

EXEMPLE 12

L'exemple 12 démontre la production d'un autre anticorps monoclonal humain réactif avec du P. aeruginosa portant des flagelles de type b et la protection de souris passivement

immunisées à l'aide de cet anticorps contre une attaque par du 20 P. aeruginosa sur un modèle de souris brûlée.

Une lignée de cellules transformées est préparée et clonée essentiellement comme on l'a décrit dans l'exemple 7 avec cependant les exceptions suivantes. Un individu différent est immunisé (Pier et coll. (1984) 45/309) et sert de source 25 de cellules B, et le niveau de dépôt sur la plaque de E-PBMC est d'environ 2 000 cellules par puits. Les criblages sont effectués sur des immunotypes de Fisher 1 à 7 rassemblés. La

lignée de cellules finalement isolée et l'anticorps monoclonal sécrété (isotype IgG1) sont tous les deux désignés sous le nom 30 de 14C1 dans le texte qui va suivre.

Dans le test clinique, 59/59 (100%) des isolats flagellés de type b donnent un test positif avec le 14C1. Les études de protection sont exécutées comme décrites pour l'exemple 11 ci-dessus et sont représentées sur le tableau VIII. 35 sui; xnE alduiaxaep a uo;eZrqsnll-jp aaIT4 ? sIul9p sanblanb DaA a2eTOp,9;îe uo;ueOaAur ajuasgsd el anb uaq -snuuoo uarq saro; ú -elgdo sepoui saaqnQp suep;a svessa-ounumi sael suep suot4 estIrn sap quaAnoaq mnb sdioorque sap qua:nDoad saielnllao saguBri sae I 'alno ua 'souibnaae * ap saqonos sap;lednld el xsd saguuoisoDDo suoDoa;uz sap a4uooD asiTIn e sanb -îTnedzaq4 qa sanbToeiulqdoad suor4Tsoduoo ap aIo7e; snid $a 0a enbtwouoog snid uoqealedgad aun quaqqau&ad UOiqUaAux auasusd el uolas sd=oorque sae saellaiel; ap ad ; anbfqo ap sadoi -Tde squaei;;Tp DoAe s;T;oega xnuuoloouou sdloDoTuu,p axquiou utreao un 9Iost e uo 'a4ueualdans uobe; aa esour6nzae a ap saqonos sasaaAlp alquoo e9seolD uorqDaeold aun queuuop Sz ea esouibnae a d ap saTiabil; sap DaAe s;Tqosel squauiBex; sanal ap;a xneuoTzouou sdloorque,p uorqvavdgad ap suaXoui sap qua=nooad uo;quaAut aquas9ad eI uotas salnllao ap sagub -Fl sael anb eaDrogidde uo 'apQogad inb ao ap arqaed v oz anbel-9 Ia a n-LUq soade sgIdmoz; uos sano sl xmneamue 6 aP pnr1suoo 8aI 9ie adnaI a- nod gnes xnamnue xçp; ap adnomS aud saue&tans s-snos ap azqmou aL ans gseq asa a;ans ap aZeTuaanod al 001 "à aa i sou2n1au 'd aP (M3 06) OO I ap snld oeAn aelaqsa-snos sagnbeae iuos s9inos sl i i i i i i i i i i i i; i i OZ i OZ i ozi OZ i OZ i OZ i OZ i 0; i 00; l uTeunq Sa'lz Zaqlsi&-$lu úA i ;;;;;; i i i i i i i ti i i i i i i s$anos i i 001 i 001 i 001 001 i 00O i 001 I 00I i 001; 001 i ap q alla2el;-Ilue ?SRAI +&e 1; i i i i i i i i i i i 06 i 06; 06 i 06 i 001 001 i 001; 001 i 001 i q allase"l-Taue uVumlq-i3I;i i i i i i i i i i i ; . i i i i; i i ' i 6 i 8 i i 9 S I i I I i iÀ -......................-- .--- luamlT;llT m i ino .ad a-tans ap % t; i i; o-r S iagUiq ssanos ap alapom ael ans allafel;-T4ue uleunq q ad ap 1Dt IwTuoIDouoUx sdaoozueI.1 ap uorqa;eold ap apnqg IIIA filrLa 8 St O 9 z 2601458 53 de clarté et la compréhension, il est évident que certains changements et certaines modifications peuvent être apportés

tout en restant dans le cadre des revendications qui vont

suivre.

Claims (28)

REVENDICATIONS

1.- Une composition comprenant un anticorps monoclonal

ou un fragment de liaison de celui-ci capable de réagir spécifiquement avec des flagelles de bactéries Pseudomonas aeruginosa.

2.- Une composition selon la revendication 1, dans laquelle l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments de

liaison inhibe la motilité de la bactérie.

3.- Une composition selon la revendication 1, dans

laquelle l'anticorps monoclonal ou son fragment de liaison est 10 protecteur in vivo.

4.- Une composition comprenant un anticorps monoclonal capable de réagir spécifiquement avec un épitope protéinique

flagellaire de Pseudomonas aeruginosa.

5.- Une composition selon la revendication 4, dans lequel l'anticorps monoclonal est capable de bloquer la liaison sur l'épitope d'anticorps monoclonaux préparés par l'une des lignées cellulaires désignées par les numéros d'accession

A.T.C.C. HB9129, HB9130, CRL 9300, CRL 9301, CRL 9422, CRL 9423

et CRL 9424.

6.- Une lignée cellulaire qui produit un anticorps monoclonal capable de réagir spécifiquement avec des flagelles

de Pseudomonas aeruginosa de type a ou de type b.

7.- Une lignée cellulaire selon la revendication 6, dans

laquelle l'anticorps monoclonal est protecteur in vivo contre 25 le Pseudomonas aeruginosa.

8.- Une lfgnée cellulaire selon la revendication 6,

consistant en une lignée cellulaire hybride.

9.- Une lignée cellulaire selon la revendication 6, qui

produit des anticorps monoclonaux humains.

10.- Une lignée cellulaire selon la revendication 6, représentée par l'une de celles désignées par les numéros d'accession A.T.C.C. HB9129, HB9130, CRL 9300, CRL 9301,

CRL 9422, CRL 9423 ou CRL 9424.

11.- Un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux spécifique de protéines flagellaires de Pseudomonas aeruginosa et capable de traiter ou de prévenir des infections occasionnées par le Pseudomonas aeruginosa, cette méthode consistant à cultiver au moins l'une des lignées cellulaires selon une

quelconque des revendications 6 à 10 et à en récupérer les

anticorps.

12.- Une composition comprenant un anticorps monoclonal ou un fragment réactif de celui-ci avec un épitope qui est capable de se lier à un anticorps monoclonal préparé selon la

revendication 11.

13.- Une composition pharmaceutique pour traiter un patient susceptible d'être atteint d'une bactérémie et/ou d'une septicémie, comprenant au moins deux anticorps monoclonaux réagissant chacun de façon spécifique avec un type différent de protéine flagellaire de Pseudomonas aeruginosa et capable de traiter ou de prévenir des infections dues à

Pseudomonas aeruginosa.

14.- Une composition selon la revendication 13 dans laquelle au moins l'un des anticorps monoclonaux est un

anticorps monoclonal humain.

15.- Une composition selon la revendication 13 contenant en outre au moins un anticorps monoclonal humain susceptible de réagir avec au moins un déterminant de serotype présent sur une molécule de lipopolysaccharide de Pseudomonas aeruginosa et/ou d'un anticorps monoclonal réagissant avec l'exotoxine A.

16.- Une composition pour le traitement d'un patient susceptible d'être atteint d'une bactérémie et/ou d'une septicémie, qui consiste en une quantité utile du point de vue prophylactique ou thérapeutique d'une composition selon une

quelconque des revendications 1 à 5 ou 12 à 15.

17.- Un anticorps monoclonal ou fragment de celui-ci,

réactif avec un épitope capable de se lier à un anticorps 30 monoclonal produit selon le procédé de la revendication 11.

18.- Une composition comprenant un anticorps monoclonal humain spécifiquement réactif avec un épitope présent sur des

flagelles de P. aeruginosa.

19.- Une composition selon la revendication 18, dans laquelle l'épitope est présent sur des flagelles de type a ou

de type b mais non sur les deux types.

20.- Une composition selon la revendication 18 ou 19, dans laquelle l'épitope est présent sur au moins 70% des

flagelles de type b.

21.- Une composition selon une quelconque des revendications 18 à 20, dans laquelle l'épitope est présent seulement

sur des flagelles de type b.

22.- Une composition selon la revendication 21, dans

laquelle l'anticorps est pan-réactif.

23.- Une composition de traitement d'un patient susceptible d'&tre atteint d'une infection bactérienne comprenant une quantité prophylactique ou thérapeutique d'un anticorps 10 monoclonal capable de se lier aux flagelles de Pseudomonas aeruginosa, en combinaison avec au moins l'un des produits suivants: une quantité prophylactique ou thérapeutique d'un anticorps monoclonal capable de réagir avec l'exo15 toxine A de Pseudomonas aeruginosa; un anticorps monoclonal capable de réagir avec au moins un déterminant de sérotype présent sur une molécule de lipopolysaccharide de Pseudomonas aeruginosa; une fraction de gammaglobuline provenant de plasma de 20 sang humain; une fraction de gammaglobuline provenant de plasma de sang humain présentant des niveaux élevés d'immunoglobulines réactives avec du Pseudomonas aeruginosa et/ou des produits de celui-ci;

ou un agent antimicrobien.

24.- Une composition d'anticorps monoclonal présentant la même spécificité de liaison que l'un quelconque des anticorps monoclonaux désignés sous le nom de FA6 IIG5, Pa3 IVC2,

PaF4 IVES, 20H11, 21B8.

25.- Un anticorps monoclonal selon la revendication 24,

conjugué à un marqueur capable de procurer un signal détectable.

26.- Un anticorps monoclonal selon la revendication 24

ou 25, dans lequel le marqueur est un agent fluorescent ou une 35 enzyme.

27.- Un procédé de détermination de la présence de Pseudomonas aeruginosa dans un échantillon qui consiste à réunir cet échantillon avec un anticorps monoclonal réactif avec des flagelles de Pseudomonas aeruginosa et à détecter la

formation d'un complexe.

28.- Un kit à utiliser dans la détection de la présence de bactéries Pseudomonas aeruginosa, ce kit comprenant une composition d'anticorps monoclonal contenant au moins un anticorps monoclonal, cet anticorps réagissant avec une protéine spécifique d'un type flagellaire de cette bactérie et des marqueurs procurant un signal détectable lié par covalence

à cet anticorps ou lié à des seconds anticorps réactifs avec 10 chacun de ces anticorps monoclonaux.