KR910008361B1 - 슈도모나스 이루지노사 항원형에 대한 교차면역 반응성 및 교차보호성 단일분지계 항체 - Google Patents

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Description

슈도모나스 이루지노사 항원형에 대한 교차면역 반응성 및 교차보호성 단일분지계 항체

본 발명은 세균감염을 진단 및 치료하는데 사용되는 신규의 물질을 제공하기 위한 면역학적 기술의 응용, 특히 슈도모나스 이루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)의 다수의 항원형을 인지할 수 있는 인체의 단일분지계 항체의 생산 및 이용에 관한 것이다.

그람-음성 질병 및 그 가장 심각한 합병증, 예컨대, 균혈증 및 내독혈증은 환자에 대단한 이환율 및 사망율의 원인이 되고 있다. 특히 이것은 과거 50년동안 세균감염, 특히 병원균감염과 함께 증가추세에 있는 그람음성균 슈도모나스 (P.) 이루지노사와 관계가 있다.

과거 몇 10년동안 항생제는 그람-음성 질병을 억제하는데 있어서 선택적인 치료작용을 나타냈다. 그러나 그람-음성균 질병에 관련된 계속적인 높은 이환율 및 사망율은 특히 P. 이루지노사에 관한 항생제치료의 한계점을 들어내게 되었다.(예를들어, Andriole, V.G., "Pseudomonas Bacteremia : Can Antibiotic Therapy Improve Survival?", J. Lab. Clin. Med. (1978) 94: 196-199). 이와같은 사실은 별도의 예방 및 치료방벙에 대한 연구를 촉진시켜 주었다.

이와 관련하여 생각된 한 방법은 능동 또는 피동적인 면역에 의한 숙주면역계의 증식방법이다. 예를들면, P. 이루지노사로부터 모든 세포 박테리아 왁진 또는 정제된 박테리아 내독소로써 인체 또는 실험동물의 활성면역화는 P. 이루지노사의 외부 세포막에 위치한 리포폴리삭카라이드 (LPS) 분자의 올리고삭카라이드단위를 반복하는 유전소에 대한것을 주로 나타낸 특수 옵소닌 항체의 개발을 유도하는 것으로 관찰되었다. (Pollack, M., Immunoglobulins : Characteristics and Uses of Intravenous Preparations, Alving, B. M. and Finlayson, J.S., eds, pp. 73-79, U.S. Department of Health and Human Services, 1979참조).

능동적으로 발생하거나 피동적으로 전이된 그러한 항체는 여러가지 동물모형 (상기 Pollack 참조) 및 인체 예비조사 (Young, L.S. and Pollack, M., Pseudomonas aeruginosa, Sabath, L., ed., pp. 119-132, Hans Huber, 1980 참조). 에서 P. 이루지노사 감염균의 치사작용에 대하여 보호작용을 나타냈다. 더구나 인체내에서 이들 항체의 특히 중요한 역할은 감염균주의 LPS 분자에 항체의 생존 및 높은 급성혈청가와 관계가 있는 P. 이루지노사균 혈증에 걸린 환자에서 발견되고 있었다.(Pollack, M., and Young, L. S., J. Clin Invest., 63 : 279-286, (1979) 참조).

상기 논문에서 면역요법의 감염균주에 대한 항체를 함유하는 울혈 인체면역 글로불린을 투여하는 것과 같은 P. 이루지노사로 인한 세균질병을 예방 및 치료하는데 이용될 수 있다고 제의하였다. 인체 면역글로불린은 여기서 P. 이루지노사의 균주에 특수한 항체에 해당하는 항체들간에 풍부한 인체혈장 유분으로 정의한다. 인체 면역글로불린을 이용함에 있어서 어떤 고유의 제한으로 인하여 P. 이루지노사로 인한 질병을 치료하는 방법은 연구과제로 남아있으며 (예를들어, Collins, M. S. and Roby, R.E., Am. J. Med., 76(3A) : 168-174, (1984) 참조), 아직까지 이들 성분들을 이용할 수 있는 제품들은 없다.

면역글로불빈 조성물과 관련하여 한가지 제한된것은 이들 조성물이 1천명 또는 그 이상의 급혈자로 부터 얻은 시료의 울혈로 구성되어 있다는 것이다. 이러한 시료는 특수한 향슈도모나스 항체의 존재로 인하여 미리 선택된 것이다. 이와같은 울혈은 필요한 항체에서 얻어진 역가에 있어서 가장 알맞게 증가하고 있는 각개체의 항체역가의 평균치에 도달하게 한다.

또 한가지 제한은 미리 선택된 자체의 방법은 지속적인 생산을 보장하기 위하여 급혈자의 울혈을 비용이 많이 요구되는 연속 스크린 처리를 필요로하고 있다는 것이다. 이러한 노력에도 불구하고 지금까지 면역글로불린 생성물은 각 묶음 또는 서로 다른 지역에서 얻은 제품들간에 상당한 변화가 생길 수 있다.

면역글로불린 조성물에 대한 또 다른 고유한 제한은 이들의 사용으로 역 생물학적 효과를 야기시키는 능력을 보유하고 있는 그외 대향의 단백질 물질 (최근에 나타나고 있는 후천성 면역결핍증후군 또는 AIDS에 관련된 비루스들을 포함할 수 있는) 을 동시에 투여하는 결과를 초래한다는 사실이다. 낮은 역가를 가진 필수항체와 그 외의 많은 물질을 혼합하는 것은 가끔 최적이하의 수준인 특정량으로 제할시킬 수 있으며 그래서 환자에 투여할 수 있는 유익한 면역글로불린을 제한시킬 수 있다.

1975년 콜러와 밀스타인씨는 어떤 새앙쥐 세포계가 각각 단일특성의 항체, 즉 단일분지계 항체를 분비하는 잡종계를 생성시키기 위하여 새앙쥐의 비장세포와 결합시킬 수 있다고 보고하였다.(Kohler, G., and Milstein, C., Nature, 256 : 495-497 (1975) 참조). 이러한 기술의 개발로 인하여 어떤 경우에는 특정유전소 또는 항원에 대한 유전소에 대량의 쥐과 동물의 특수 항체를 생산할 수 있게 되었다. 그런데 이러한 새앙쥐의 단일부지계 항체 또는 이러한 항체의 조성물은 어떤 인체질병의 치료에 대한 연구의 목적으로 사용할때 새앙쥐의 단일분지계 항체를 비효과적으로 되게하는 면역반응을 유도하는 것으로 관찰된 점으로 보아서 인체의 사용에 있어서 중요한 장애물이 될 수 있다.(Levy, R. L. and Miller, R. A., Ann. Rev. Med., 34 : 107-116, (1983) 참조).

잡종계 기술을 이용하여 사도프외 그의 공동연구자는 P. 이루지노사의 특정 항원형의 LPS 분자에 대한 산소측 사슬의 유전소에 향하게 하는 IgM 부류의 새앙쥐의 단일분지계 항체의 생산에 대하여 보고하였다. (Abstracts of 1982 Interscience Conference on Antimcrobial Agents and Chemotherapy, No. 253 참조). 다시말해서, 이들은 이와같은 쥐과 동물의 항체는 이 항체가 지향하는 형태와 같은 항원형 (즉, 동일 항원형)의 P. 이루지노사의 치명적인 도전으로 부터 쥐를 보호하였다고 보고하였다. 여러가지 후속 문헌들은 다양한 특성을 가진 새앙쥐 및 인체의 항 P. 이루지노사 LPS 단일분지계 항체의 개발에 대하여 상세히 설명하고 있다. 예를들면, Sawada, S., et al., J. Inf. Dis., 150 : 570-576, (1984); Sadoff, J., et al., Antibiot. Chemother., 36: 134-146, (1985) : Hancock, R., et al., Infect. Immun. 37 : 166-171(1982); Siadak, A. W. and Lostrom, M. E., in Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, Engleman, E. G., et al., eds., pp. 167-185, Plenum Publishing Corp. (1985) and Sawada, S. et al., J. Inf. Dis. 152 : 965-970, (1985) 등이 있다. 항 P. 이루지노사 LPS 항원형-특수인체 단일분지계 항체의 생산 및 면역요법의 이용에 대하여는 미합중국 특허출원 제734,624 및 제828,005호에 기재되어 있으니 참고하기 바란다.

감염이 단일 항원형을 추적할 수 있는 경우에 P. 이루지노사의 단일 항원형에 대하여 특수한 단일분지계 항체를 이용하는 이점이 있는 반면에 다른 여러가지 경우에는 적합하지 않다. 예를들면 인체에 강력한 세균감염으로 인한 질병치료에서 다수의 항원형에 대항하는 인체의 항체를 투여하는 것이 바람직하다. 이와 유사하게 감염균주의 항원형이 알려져 있지 않는 경우에 치료적 이용에 있어서, 대부분(전체가 아니면)의 임상학적으로 중요한 P. 이루지노사 항원형에 대하여 효과가 있는 인체의 항체를 투여하는 것이 바람직하다. 이론적으로 P. 이루지노사의 단일 항원형에 각각 특효한 인체에 단일분지계 항체의 혼합물은 여러가지 혈청을 보호하도록 제조할 수 있으며, 이러한 조성물은 개발하기가 어려우며 제조자의 입장에서 보면 비경제적이다.

따라서 P. 이루지노사의 다수 항원형을 보호할 수 있는 인체의 항 P. 이루지노사 단일부지계 항체를 분명히 필요로 한다. 또한 이들 항체는 P. 이루지노사 감염균의 예방 및 치료제로서의 용도에 적합하다.

신규의 세포계열은 P. 이루지노사의 다수개 (전체가 아님) IATS 항원형의 LPS 분자와 특히 반응할 수 있는 인체 단일분지계 항체를 생산할 수 있는 것이다. 이와같은 항체는 0, 1 또는 복수개의 면역형과 결합하는 피셔 면역형과 다양한 반응성을 갖는다. 이에 더하여 최소한 1개 이상의 단일분지계 항체 또는 P. 이루지노사 항원형과 교차면역 반응할 수 있는 결합체, 바람직하게는 생물학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물로 구성된 조성물의 예방 또는 치료량을 투여함으로써 P. 이루지노사에 감염되기 쉬운 또는 이미 감염된 사람을 치료하는 방법을 제공한다.

또한 이 조성물은 다음의 물질중에 1가지 또는 그 이상을 함유할 수 있다. 즉, P. 이루지노사의 또는 편모 또는 체외독소 A LPS에 대한 기타 항원형 또는 면역형 유전소와 반응할 수 있는 부가적인 인체 단일분지계 항체, 인체의 혈장으로 부터 얻은 감마 글로불린 유분, P. 이루지노사의 반응성인 면역글로불린의 높은 농도를 나타내는 인체로 부터 얻는 인체혈장으로 부터 얻는 감마 글로불린의 유분, 및 1가지 또는 그 이상의 항생체.

본 발명에 의하여 인체의 단일분지계 항체를 생산할 수 있는 새로운 세포 및 이러한 항체들로 구성된 조성물을 제공하며, 이러한 조성물은 적어도 다수개 및 어떤경우는 전체의 P. 이루지노사 균주를 선택적으로 인지할 수 있으며, 이때 각개의 항체는 P. 이루지노사의 IATS 항원형 다수와 피셔 면역형의 0,1, 또는 다수를 인지할 수 있다. 표제의 세포들은 이들로부터 얻은 미생물계 DNA 또는 선구세포가 어떤 P. 이루지노사 항원형들 사이에 일반적인 에피토프(epitope)에 대한 결합위치를 가진 항체를 부호를 붙여 배열한 확인할 수 있는 염색체를 갖는다. 이러한 인체의 단일분지계 항체들은 진단 및 치료(예컨대, 생체내에서의 보호)를 비롯한 여러가지 용도로 이용될 수 있다.

본 발명의 세포들은 대표적으로 P. 이루지노사의 영향을 받기쉬운 LPS 분자로 보호 인체 단일분지계 항체를 생성시키는 인체 변환 임파구이다. "영향을 받기 쉬운"이란 말은 LPS 분자가 단일분지계 항체와 상호직접 반응시키는데 사용하는 분위기에서 물리적으로 얻을 수 있다. 이렇게 얻는 단일분지계 항체는 P. 이루지노사로 인한 심한 질환을 치료 또는 예방하는데 사용된다. P.이루지노사의 외부막의 LPS 분자는 항체의 분자와 직접 접촉시키는데 이용할 수 있으며, 점진적인 병세호전 또는 미생물의 식작용을 촉진시킨다. 또한 외부막으로 부터 주위환경으로 확산된 LPS 분자는 항체분자와 직접 자유롭게 작용하며 세막내피 조직계를 통과하여 깨끗히 제거된다.

단일분지계 항체의 준비는 P. 이루지노사의 다중 항원형의 LPS 분자상의 에피토프를 위한 특수한 항체에 대하여 부호화한 핵신 서열의 식을 영원히 전함으로써 완수할 수 있다. 대표적으로 단일분지계 항체는 P. 이루지노사중의 적합한 항원형에 노출시킨 급혈자로 부터 얻은 B-임파균의 세포구축의 엡스타인-바비루스(EBV) 변형에 의하여 제조한다.

이와같이 제조한 세포계를 분비하는 항체는 이배체 핵형을 보유하는 계속 성장 임파아구증 세포가 엡스타인-바 핵 항원 양성이고 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4와 같은 여러가지 아형을 포함하는 IgG, IgM, IgA 또는 IgD 중복기준의 단일분지계 항체를 분비한다. 세포구축 변형법 자체는 미합중국 특허 제4,464,465호에 기재되어 있으니 참고하기 바란다. 단일분지계 항체는 상처가 없는 완전한 것, 또는 Fv, Fab, F(ab')₂와 같은 단편을 사용할 수 있으나, 통상 완전한 것을 사용한다.

양자택일의 방법으로 항체를 생산하는 세포계열은 적절한 약품모반 인체 골수종, 새앙쥐의 골수종, 인체-새앙쥐 복소 골수종간의 세포융합시켜 제조하거나 또는 인체에 임파아구증 세포를 인체의 B-임파군과 세포융합시켜 인체교잡 세포계열을 수득하는 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명 세포계열은 인체의 단일분지계 항체를 직접 생산하는 것외에 그 용도를 발견할 수 있다. 이 세포계열은 잡종계를 생산하기 위하여 기타세포(적절히 약품모판된 인체 골수종, 새앙쥐의 골수종, 인체-새앙쥐 복소 골수종 또는 인체 임파아구증과 같은)와 융합시킬 수 있으며, 그래서 단일분지계 항체를 암호화한 유전자의 변형체를 제공한다. 양자택일의 방법으로, 세포계열은 융합외에 다른 방법으로 세포를 단리시켜 변형시킬 수 있다. 이에 더하여 단일분지계 항체를 암호화한 유전자를 단리하여 여러가지 숙주내에서 특수면역글로불린을 생산하는 재결합 DNA 기술에 이용할 수 있다. 특히 메신저 RNA로 부터 cDNA 기록서를 준비하여, 면역글로불린에 대한 암호화 및 인트론(intron)이 없는 단일 cDNA 클론을 단리시켜 적당한 원시핵 또는 성숙핵 표현벡터에 배열시킨 후 이어서 최종적인 대량생산을 위한 숙주로 변형시킬 수 있다.

임파아구증 또는 잡종세포 계열은 세포 상징액중에서 검출된 상이한 P. 이루지노사 항원형의 에피토프와 결합할 수 있는 항체로써 무성생식시켜 공지의 기술에 의하여 선별할 수 있다.

항 슈도모나스 항체를 제공하기 위한 세포상징액을 선별하는데 사용될 수 있는 수많은 항원형 기전이 문헌에 기록되어 있다. 이 기전은 주로 미생물의 열안정성 주요신체 항원에 기초를 두고 있다 (Zierdt, C. H., in Glucose Nonfermenting Gram-Negative Bacteria in Clinical Microbiology, Gilardi, G. L., ed., CRC Press, pp. 213-238 (1978) 참조). 혈청군 기전의 증식은 상당히 비교하기 어려운 P. 이루지노사의 혈청학적 연구를 수행하였으며, 그래서 상징액을 여별하기 위한 어떤 일정한 장치를 임의로 선택한다. 최근혈정기구들간의 혼동은 P. 이루지노사의 더 깊은 혈청학적 연구를 위한 중추기관으로서 International Committee on Systematic Bacteriology의 슈도모나다시에(Pseudomonadaceae)에 관한 서브코미티에 의해서 제의된 국제 항원형을 결정하는 기구(IATS)의 창설에 의해 명백하게 되었다. IATS형1, IATS형2 등으로 표시된 17개의 항원형을 제공하는 이 기구는 상기 기구내에 확인된 모든 열안정성 주신체 항원을 에워싸고 있다. 이에 대하여는 Liu, P. V., Int. J. Syst. Bacteriol., 33 : 256-264, (1983)를 제고하기 바란다.

P. 이루지노사의 균주간의 교차면역 반응성을 가진 보호 단일분지계 항체를 개발함에 있어서, P. 이루지노사의 보호 항원을 기초로하는 형결정 기구를 통합하는 것이 또한 유익하다. 이러한 기구는 임상학적 용도로 왁진을 개발할 목적으로 창안되었으며 Fisher, M. W. et al. J. Bacteriol., 98 : 835-836, (1969)에 상세히 기재되어 있다. 이 기구는 피셔 형결정 기구로 통칭되며 대부분의 공지의 P. 이루지노사를 피셔 면역형1, 피셔 면역형2 등으로 표시되는 7가지 형으로 분류한다. IATS와 피셔 형결정 기구간의 상호관계가 분명해 졌으며, (상기 Liu, P. V., et al 참조) 다음 표 (I)에 나타나 있다. 표 (I)에 나타나 있는 바와 같이 각 피셔 면역형이 어떤 IATS 항원형에 해당하지만 어떤 IATS 항원형에 대응하는 피셔 면역형은 없다.

IATS 및 피셔 형결정 기구에 대한 양 항원형 결정기구에 해당하는 항원 유전소가 P. 이루지노사의 표면 LPS 분자상에 잔존하는 것으로 믿어진다.(상기 Liu. P.V. et al., Hanessien, F., et al., Nature, 229 : 209-210 (1979) 참조).

[표 I]

본 발명의 한가지 목적은 인체의 단일분지계 항체가 P. 이루지노사의 다수(전체가 아님)의 IATS 항원형에 존재하는 특히 리포폴리식카라이드와 결합할 수 있는 것을 제공하는 것이다. 이들 유전소은 예를 들어 2가지 또는 3가지 IATS 항원형 및 0,1 또는 최소한 2가지 이상의 피셔 면역형을 제공할 수 있다. 이러한 항체는 약간 또는 모든 인지된 항원형 및 면역형, 전형적으로 2 또는 그 이상의 항원형을 생체내에서 보호할 수 있다.

또한 본 발명의 단일분지계 항체는 생체외에서의 여러가지 용도를 발견할 수 있다. 실례를 들면 단일분지계 항체는 특수 P. 이루지노사 균주를 단리시키는데 또는 세포의 분균질 혼합물중에서 P. 이루지노사 세포를 선택적으로 제거시키는 것과같이 형을 결정하는데 이용될 수 있다.

진단을 목적으로 단일분지계 항체를 라벨을 붙이거나 붙이지 않을 수도 있다. 전형적으로 진단분석은 P. 이루지노사 미생물의 LPS에 단일분지계 항체의 결합을 통하여 복합체의 형성을 검출하는 작업을 수반한다. 라벨을 붙이지 아니한 경우의 항체는 교차분석에서의 용도가 발견되었다. 이에 더하여 라벨을 붙이지 아니한 항체는 면역글로불린에 특수한 항체와 같은 단일분지계 항체와 반응하는 기타 라벨을 붙인 항체(제2항체)와 혼합하여 사용될 수 있다.

양자택일의 방법으로 단일분지계 항체를 직접 라벨을 붙일 수 있다. 방사성 핵종, 형광물질, 효소, 효소기재, 효소 조인자, 효소 억제제, 배위자(특히 헵텐) 등과 같은 여러가지 라벨을 사용할 수 있다. 여러가지 면역분석 형태를 이용할 수 있으며 그 몇가지 실례를 들면 미합중국 특허 제3,817,827, 3,850,752, 3,901,645, 3,935,074 3,984,533, 3,996,345, 4,034,074 및 4,098,876호에 기재되어 있다.

통상적으로 본 발명의 단일분지계 항체는 표제의 항체, 또는 상이한 종류로부터 얻은 제이 항체가 효소에 결합되는 효소 면역분석에 이용된다.

사람의 혈액 또는 그 용해물과 같은 어떤 항원형의 P. 이루지노사를 함유하는 시료가 표제의 항체와 결합될 때 항체와 요구되는 에피토프를 나타내는 분자들간의 결합이 일어난다. 이때 이러한 세포들은 결합되지 않은 시약으로 부터 분리하여, 제2항체(효소라고 라벨을 붙임)를 첨가시킬 수 있다. 그 후에 특별히 세포에 결합시킨 항체-효소 결합체의 존재를 확인한다. 기타 본 기술분야에 숙련된 자들에 잘 알려진 기술도 사용될 수 있다.

또한 P. 이루지노사 감염을 검출하는데 표제의 항체와 같이 사용하기 위하여 또는 P. 이루지노사 항원용으로 적합한 용기를 제공할 수 있다. 그래서 본 발명의 단일분지계 항체 조성물은 단독 또는 기타 그람음성균에 부각적인 항체 특효제와 혼합하여 통상 동결건조시킨 상태로 제공될 수 있다. 라벨에 접합시킨 또는 접합시키지 아니한 항체는 그 용기에 트리스(Tris), 인산염, 탄삼염 등과 같은 완충액과 함께 넣는다. 통상적으로 이들 물질은 활성 항체의 양을 기초로하여 약 5% 이하로 존재하며, 통상 항체농도를 기초로하여 전체량의 최소한 약 0.001중량%로 존재한다. 종종 활성성분을 희석시키기 위하여 불활성 증량제또는 부형제를 포함시킬 필요가 있으며, 이때 부형제는 전체 조성물의 약 1-99중량%로 존재할 수 있다. 단일분지계 항체와 결합시킬 수 있는 제2항체를 사용하면 이것은 통상적으로 별도의 유리병에 넣어둔다. 제2항체는 라벨을 접착시켜 두는것이 보통이며 상기 항체형성과 같은 방법으로 형성된다.

또한 본 발명의 단일분지계 항체는 약리학적으로 유효한 담체와 함께 본 발명의 단일분지계 항체들중에 최소한 1가지 이상을 치료 또는 예방에 맞는 양을 함유하는 약리학적 조성물을 가진 성분들로서 혼합시킬 수 있다. 약리학적 담체는 환자에 단일분지계 항체를 전달하는데 편리한 비독성 물질이어야 한다. 소독수, 알코올, 비장, 왁스 및 불활성 고체 등을 담체로설 사용할 수 있다. 또한 약리학적으로 허용되는 첨가제(완충제, 분산제)를 상기 제약 조성물에 혼합시킬 수 있다. 이러한 조성물은 P. 이루지노사 항원형중의 2또는 그이상 (전체는 아님) 에 특효를 갖도옥 단일분지계 항체를 함유할 수 있다. 양자택일의 방법으로 제약조성물은 "칵테일"을 형성하기 위하여 2 또는 그 이상의 단일분지계 항체를 포함할 수 있다. 예를들면 여러가지 P. 이루지노사 항원형군에 대항하는 인체 단일분지계 항체를 함유하는 칵테일은 특수균의 임상적 단리물중의 대다수에 대하여 활성을 가진 일반적인 생성물이다.

흥미로운 것은 최소한 3가지 이상의 IATS 항원형, 통상 4가지 이상, 더 일반적인 것은 5가지 이상의 IATS 항원형과 반응할 수 있는 예방 또는 치료학적인 단일분지계 항체 조성물이다. 더 흥미로운 것은 최소한 약 7, 최소한 약 10-14 이상 및 미만인것이 바람직하며 모두 17가지의 IATS 항원형을 포함하는 것과 반응하는 단일분지계 항체 조성물이다. IATS 항원과의 결합에 있어 조성물이 최소한 2 이상, 통상 3 이상, 더 보편적인 것은 4 이상 및 그 미만인 것이 바람직하며 모두 7가지의 피셔 면역형 결정기구를 포함하는 것과 반응하는 것이 요망된다.

각 조성물은 최소한 1가지이상, 통상 2가지이상, 더 보편적인 것은 3가지이상의 항체를 포함하며, 이때 각 항체는 적어도 2, 3, 4 또는 그 이상(전체는 아님) 의 IATS 항원형과 반응한다. 최소한 2가지 IATS 항원형과 1 또는 그 이상의 피셔 항원형, 바람직하게도 2가지 이상의 면역형과 결합하는 1가지 이상의 단일분지계 항체인 것을 요구한다.

조성물중의 서로 다른 단일분지계 항체의 전체수는 최소한 1 이상 및 조성물과 반응하는 IATS 항원형의 전체수와 같은 또는 약 1/2 이하, 가끔 전체의 1/3 이하인 것이 요망된다.

여러가지 단일분지계 항체 조성의 몰비율은 통상 10인 수를 벗어나지 아니하며 더 보편적인 것은 5인 수를 벗어나지 않고, 기타 각 항체성분과 약 1:1-2의 몰비를 갖는 것이 보통이다.

또한 본 발명의 인체 단일분지계 항체는 인체에 P. 이루지노사 질병의 예방 또는 치료에 사용되는 산업적으로 수득할 수 있는 감마 글로불린 및 면역 글로불린 제품과 같은 기타 단일분지계 항체 조성물 또는 기존 혈장제품과 혼합하여 사용할 수 있다.

바람직하게는 면역 글로불린을 위하여 혈장은 P. 이루지노사의 반응하는 면역글로불린을 높은 농도로 함유하는 급혈자에서 얻는다. 일반적인 일람표 "Intravenous Immune Globulin and Compromised Host, " Amer. J. Med., 76(3a), March 30, 1984, pgs 1-231를 참조하기 바란다.

본 발명의 단일분지계 항체는 항생제또는 살균제와 혼합하여 만든 조성물을 분리 투여하는 방법으로 사용할 수 있다. 전형적으로 살균제는 항 슈도모날 페니실린 (예, 카르베니실린)과 아미노글리코시 (예, 겐타마이신, 토브라마이신 등) 과 혼합한 것을 포함할 수 있으나 본 기술분야에 통상의 지식을 가진자에 잘 알려진 여러가지 첨가제(예, 세팔로스포린)도 이용될 수 있다.

본 발명의 인체 단일분지계 항체 및 그 제약조성물은 경구 또는 비경구 투여방법으로 사용된다. 바람직한게는 제약조성물을 비경구, 즉 피하조직, 근육 또는 정맥내에 투여할 수 있다. 그래서 본 발명은 허용되는 담체, 바람직하게는 수성담체중에 용해시킨 인체 단일분지계 항체의 용액 또는 그 칵테일로 구성되는 비경구 투여 조성물을 제공한다. 여러가지 수성담체를 사용할 수 있는데, 예컨데, 물, 완충액, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 등이 있다. 이들 용액을 살균하였으므로 통상 어떤 특수물질이 포함되지 않는다.

이들 조성물은 통상의 잘 알려진 살균방으로 살균한다. 조성물은 예를들어 초산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 젖산나트륨 등과 같은 pH 조절 및 완충제, 독성 조절제등과 같은 생리적 조건에 요구되는 것과 같은 약리학적으로 허용되는 보조물질을 포함할 수 있다. 이들 조성물중에 항체의 농도는 약 0.5%이하, 통상 약 1% 또는 약 1% 이상에서 15 또는 20중량%까지 광범위하게 변화할 수 있으며 주로 유량, 점도 등을 기초로하여 선택되며 선택된 투여형태에 따르는 것이 바람직하다.

그래서 근육내 주사용으로 대표적인 제약조성물은 1ml 살균완충액과 단일분지계 항체 50mg을 함유하도록 제조할 수 있다. 대표적인 정맥 주입용 조성물은 살균 링거(Ringer)용액 250ml와 단일분지계 항체 150mg을 함유하도록 제조할 수 있다. 비경구적 투여 조성물을 제조하는 실질적인 방법은 본 기술분야에 숙련된 자들에 잘 알려져 있으며, 예를들면 Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvnia (1980)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 단일분지계 항체는 냉동건조시켜 저장하여 사용하기 전에 적당한 담체를 제조성할 수 있다. 이러한 기술은 통상의 면역굴로불린으로써 효과를 나타내는 것으로 나타났으며 공지의 동결건조 및 재조성 기술이 이용될 수 있다. 동결건조 및 재조성법은 항체 활성의 상실율을 변화시킬 수 있고 (예컨대, 통상의 면역굴로불린으로 IgM 항체는 IgG 항체보다 더 큰 활성을 갖는 경향이 있다) 사용량은 보급량에 따라 조절하여야 한다는 사실은 본 기술분야에 숙련된 자들에 의해서 인식될 것이다.

본 인체 단일분지계 항체 또는 그 칵테일을 함유하는 조성물은 P. 이루지노사 감염의 예방 및 (또는) 치료의 목적으로 투여할 수 있다. 치료적 이용에 있어서 조성물은 감염균 또는 그 합병증을 치료하거나 최소한 부분적으로 억제하는데 충분한 양으로 1 또는 그 이상의 P. 이루지노사 항원형으로 이미 감염된 환자에 투여된다. 이것을 수행하는데 정확한 양을 "치료의 유효량"이라고 정의한다

이 용도에 유효량을 환자자신의 면역계통의 일반적 상태 및 감염정도에 따라 달라진다. 그러나 체중 매 Kg당 항체 약 1-200mg이 사용되며 체중 매 Kg당 5-25mg 정도 더 사용된다. 일반적으로 본 발명의 물질은 중증환자에 사용될수 있으며 P. 이루지노사로 인하여 특히 균혈증 및 내독혈증으로 생명을 위협하거나 크게 위독한 상태인 환자에 사용될 수 있다는 사실에 주목해야 한다. 이러한 경우에, 본 발명의 인체 단일분지계 항체에 의해서 성취된 여분의 물질이 존재하지 않고 "외래물질"을 배척하지 않는다는 점에서 이들 항체를 상당한 과량으로 투여할 수 있으며 치료의사에 따라서 필요하게 느낄수도 있다.

예방목적에 사용에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그 칵테일을 함유하는 조성물은 잠재적 감염균에 대하여 환자의 저 항성을 증대시켜 주기위하여 P. 이루지노사에 의하여 감염되어 있지 않은 환자에 투여된다. 이때 투여량은 "예방적 유효투여량"으로 정의한다. 이러한 용도에서 정확한 양은 환자의 건강상태 및 일반적인 면역수준에 따라 달라지나 통상적으로 0.1-25mg/Kg, 특히 0.5-2.5mg/Kg범위내이다.

조성물의 단일 또는 다중투여는 치료의사에 의해서 선택된 투여농도 및 형태에 따라 수행될 수 있다. 어떤 경우이던간에 제약 제제형태는 환자를 효과적으로 치료한는데 충분한 양의 본 발명의 항체를 제공하여야만 된다. 본 발명의 항체에 대한 시험을 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

실시예 1은 IATS 항원형 2.5및 16과 피셔 면역형 3 및 7과 반응하는 인체 단일분지계 항체(IgM 중복기준)의 생산방법을 나타낸 것이다.

주변 혈액시료는 인체 B세포의 근원체로서의 역확을 하는 P. 이루지노사로 만성감염균을 보유하고 있는 공지의 낭포성 섬유증 환자로 부터 얻었다. 단핵세포는 피콜-패커(Ficoll-Paque)에 대한 표준 원심분리기술에 의해서 혈액으로 부터 분리하여(Boyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest. (1986) 21 : Suppl.97, 77-89 참조) 칼슘/마그네슘-유리 인산염 완충염수(PBS)내에서 두차례 세척하였다.

단핵세포는 개선된 E-로젯트법을 이용하여 T-세포를 감소시킨다. 간단히 말해서 먼저 세포를 4℃의 송아지 태아혈청(FCS)을 함유하는 PBS 중에 1×10

세포/ml의 농도로 현탁시켰다. 이 현탁액 1ml이스코브의 개량 둘배코의 배지(이스코브의 배지)중의 10%(v/v) 용액으로 부터 1×10⁹2-아미노-이소티오우로늄 브로마이드(AET)로 처리한 양의 적혈구를 첨가시킨 17×100mm 폴리스티렌제둥근 바닥시험관에 넣었다.(Madsen, M. and Johnson, H. E., J. Immun. Methods(1979) 27 : 61-74 참조). 이 현탁액을 4℃에서 5-10분동안 매우 서서히 혼합하고 E-로젯트 세포는 4℃에서 2500xg로 8분동안 피콜-패커상에서 원심분리 시켜 제거하였다. 내면에 밀집된 E-로젯트 음성주변 혈액 단일핵 세포(E￣PBMC)을 수집하여 이스코브의 배지에서 한차례 세척하고 15%(v/v)FCS, L-글루타민(2mmo1/1), 페니실린(100IU/ml), 스크렙토마이신(100㎍/ml), 히포크샅틴(1×10^-4M), 아미노프테틴(4×10^-7M) 및 티미딘(1.6×10^-5M)을 함유하는 같은 현탁액에서 재현탁시켰다.

E￣PBMC의 세포구축 변형은 이들 세포를 변형세포계와 공동 배양시킴으로써 수행된다. 변형세포계는 GM 1500 임파아구중 세포계의 에틸 메탄술포네이트(EMS) 돌연변이 유발에 의해서 유도되어 세포 히포크탄신-구아닌 포스포리보실전이효소(HGPRT) 부족으로 힌하여 HAT에 예민하게 되는 30㎍/ml 6-티오구아닌의 존재하에 선정하므로 에스타인바 핵 항원(EBNA) 양성 인체 임파아주증 세포계였다.

이 세포계는 1A2 세로계로 명명되었으며 A. T. C. C. 제CRL8119호로 1982. 3. 29자 아메리칸 타입 컬츄어 콜렉션(A.T.C.C.)에 기탁되었다. 대수 성장상내의 1A2 세포를 HAT 배지에 현탁시켜 8 1A2 세포/EPBMC의 비율로 E￣PBMC와 혼합하였다. 세포 혼합물을 200㎕/well의 체적으로 72, 000 세포/well의 농도로 8 둥근 밑면 96-well 마이크로타이터판 (Costar 3799)내에서 엷은 판상으로 하여 6% CO₂를 함유하는 습한 공기중에서 37℃로 배앙하였다. 배양균은 5일과 8일뒤에 상징액의 반을 신선한 HAT 배지로 대체시켰다. 웰은 세포중식의 표시로 변환된 현미경에서 매일 관찰하였다. 12일이 지난후 증식세포를 함유한 웰의 100%가 중식세포로 채워졌으며 이 웰의 대부분에 세포는 항 P. 이루지노사 항체를 위하여 상징액을 제거하여 시험하는데 충분한 밀도로 유지되었다.

상징액은 효소결합 면역분석 (ELISA) 기술 (Engvall, E., (1977) 55 : 193-200 참조)을 이용하여 항 P. 이루지노사 항체의 존재에 대하여 선별하였다. 평평한 밑면의 96-웰 마이크로타이터판(Immulon Ⅱ, Dynatech) (웰은 여러가지 박테리아를 함유함) 으로 구성된 항원판은 웰의 밑면에 흡수되었다. 플라스틱에 박테리아의 흡수를 촉진시키기 위하여 폴리-L-리신(PLL)의 50㎕/well (PBS, PH 7.2중의 1㎍/ml)을 실온에서 30분동안 배양하였다. 그후 흡수되지 않은 PLL은 날려버리고 판은 PBS로써 한차례 세척하여 PBS중에 세척한 세균 현탁액(OD₆₆₀=0.2)50㎕을각 웰에 첨가시켜 판을 37℃에서 1시간동안 배양시켰다. 흡수되지 않은 세균은 염수-트윈(소금 0.9%, 트윈-20 0.05%(v/v)으로 세차례 판을 세척하여 제거하였다. 다음과 같은 여러가지 항원판을 선별하는데 사용되었다. 즉, (1) P. 이루지노사 피셔 면역형 1,2, 및 4(ATCC 제27312, 27313, 27315호)의 혼합물, (2) P. 이루지노사 피셔 면역형 3,5,6 및 7(각각 ATCC 제27314, 27316, 27317, 27318호)의 혼합물, 및 (3) 세균을 갖지 않는 마이크로타이터판.

ELISA는 실온에서 60분동안 불록킹 완충제[비지방분유 5%(w/v), 안티폼 A (시그마) 0.01%(v/v) 및 티메로살 0.01%(w/v)을 함유하는 PBS, pH 7.2] 200㎕/well로써 판을 먼저 블록킹함으로써 개시되었다. 블록킹후에 판을 염수-트윈으로 3차례 세척하였다. 트윈-20 0.1%와 소의 혈청알부민(BSA) 0.2%(w/v)을 함유하는 PBS (pH 7.2) 50㎕을 모든 웰에 넣었다. 배양판의 웰로부터 얻은 상징액은 항원판에 대응하는 웰(50㎕/well) 내에서 레플리카(replica) 판상체로 만들고 이 판을 실온에서 30분 동안 배양하였다. 그 후 상징액을 제거하고 웰은 염수-트윈으로써 3차례 세척하여 이 웰에 염소 항 인체 IgG+IgM(American Qualex International #A1114+#A1124) 결합한 적당히 희석시킨 고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 50㎕를 첨가시켰다. 실례를 들면 HRP-염소항-IgG 및 HRP-염소 항-IgM은 트윈-20 0.05%와 BSA 0.1%를 함유하는 PBS(pH 7.2)에 각각 1 : 5000 및 1 : 3000로 최종 희석시켜 사용하였다. 실온에서 30분간 배양시킨 후 염소 항체가 결합된 여분의 효소를 제거시킨 뒤 웰을 염수-트윈으로 세차례 세척하였다. 기재 100㎕(판체로 하기 직전에 같은 체적으로 혼합시킨 탈이온화된 H₂O중에 H₂O₂0.03%를 첨가시킨 스트르산염 완충액(pH 5.0) 100mM중에 O-페닐렌디아민 디히드로 클로라이드 0.8mg/ml)를 각 웰에 첨가시켰다. 암실에서 30분동안 배양한 후 3N H₂SO₄50㎕을 모든 웰에 첨가시킨 결과 반응이 종료되었다.

판상의 항원과 반응하는 항체를 함유하는 배양 상징액은 대응하는 웰중에서 양성색채 현상에 의해서 검출하였으며 반응의 강도는 Bio-Tek EL-310 마이크로 ELISA 리더상에 490nm에서 흡수율을 측정하여 평가하였다.

상기 방법에 의한 배양 상징액의 분석에 의하여 피셔 변역형 3,5,6 및 7판(그러나 피셔면역형 1,2 및 4판또는 무세균판은 아님)과 반응하는 항-P. 이루지노사 항체를 함유하는 2개의 웰을 학인하였다. 특정 피셔면역형을 확인하기 위하여 단 1개의 피셔면역형의 PLL-고정세균을 함유하는 항원판을 각 면역형에 따라 상기와 같은 방법으로 제조하였다. 각 면역형 판체상의 웰 1C1 및 2H12로 부터 배양 상징액으로 상기와같은 ELISA 분석을 수행함으로써 이들 2개의 웰이 피셔 면역형 3 및 7에 특정된 항체를 함유하고 있다는 사실을 알게되었다.

P. 이루지노사 형결정 균주(ATCC 제33348-33364호로 부터 얻은) 의 IATS 패널상에서 수행된 유사한 ELISA로 웰 1C1 및 2H12내의 항체가 특히 IATS 항체 2, 5 및 16과 반응한다는 사실을 알려주었다.

웰 1C1 및 2H12중의 반응성 항체의 중복기준을 HRP-염소 항 인체 IgG 및 HRP-염소 항 인체 IgM을 각각 제2단계 시약으로서 사용(혼합한것은 제외)하는 것을 제외하고 상기 특성시험과 유사한 ELISA 분석으로 측정하였다. 피셔 면역형 3 및 7과 웰 1C1 및 2H12중의 항체의 양성반응은 각 웰내의 해당하는 항체에 대하여 IgM 중복기준을 나타내는 항-IgM 시약만으로 관찰되었다.

항 피셔 면역형 3 및 7반응형태가 웰 1C1 및 2H12중의 1 또는 그 이상의 항체에 기인한다는 사실을 결정하기 위하여(즉,피셔 면역형 3 및 7 또는 2가지 항체와 반응하는 1항체, 피셔 면역형과 반응하는 1항체 및 피셔 면역형 7과 반응하는 그 외의 항체) 양 웰로 부터 세포들을 저밀도로 2차 배양하여 증식세포를 함유하는 웰은 별도의 피셔 면역형 3과 피셔 면역형 7 세균 항원판상에서 항체활성에 대하여 분석하였다. 2차 배양은 아미노프테린성분(HT-배지) 이 결핍된 HAT 배지 100㎕중에 5세포/well의 밀도로 96-웰 둥근 밑면판에서 수행되었다. 비변형 HAT-반응 임파아구증 세포는 공급세포로서 500세포/well의 밀도로 모든 웰에 포함시켰다. 판상체로 만든 5일후에 HAT 배지 100㎕를 모든 웰에 첨사시켜서 공급 세포들을 선택적으로 죽였다. 다시 웰에 HAT 배지로 상징액의 반을 대체시켜 판상체로 만든 9일후에 공급하였다. 그후 유사한 방법으로 ELISA에 의해서 상징액 분석을 위하여 충분한 임파아구증 세포밀도를 유지할 때까지 HT-배지로써 매 4-5일에 웰을 공급하였다. 각 피셔 면역형 3과 피셔 면역형 7항원판상에서 분석할 때 피셔 면역형 3과 반응하는 모든 상징액은 또한 한 항체가 2가지 피셔 면역형에 대하여 활성에 응답할 수 있다는 사실을 나타내는 피셔 면역형과 반응하였다. IATS 균주 2, 5 및 16에 대하여 분석시 불규칙적으로 선택된 상징액은 각각의 균주를 제외한 모두 3가지 균주와 반응한다는 사실이 반견되었으며, 더구나 1항체가 피셔 면역형 3 및 7과 IATS 균주 2,5및 16과 교차면역 반응한다는 결론을 뒷받침하여 주었다.

웰 1C1 및 2H12로 부터의 특이 항체-생산 세포의 무성생식은 상기 ELISA프로토콜에 의해 분석된 모든 무성생식체 상징액이 피셔 면역형 3 및 7과 IATS 균주 2.5및 16과의 양성 빈응을 초래할때까지 각 웰로 부터의 세포를 몇회의 한계희석을 행함으로써 수행하였다. 무성생식에는 상기한 바와같이 부배양을 위해 피더(feeder) 세포를 사용하였다. 이러한 방법으로, 수립(불멸)적이고 피셔 면역형 3 및 7과 IATS 균주 2,5 및 16과 반응성인 인체 단일분지계 항체를 각각 분비하는 2가지 무성생식 형질전환 인체 세포주 1C1(KCTC 8257P. 1987년 6월 10일 한국과학기술원에 기탁되고 ATCC CRL 8941에 해당하는 세포주)과 2H12를 얻었다. 이 실시예에서 세포주와 이 세포주가 생산하는 항체는 동명칭을 붙인다).

[실시예 2]

실시예 2는 IATS 항원형 2,5 및 16및 피셔 면역형 3 및 7과 만응하는 인체 단일분지계 항체(IgG 중복기로)의 생산방법을 제시한다. 생산공정은 근복적으로 실시예 1과 동일하다. 간단히 주변 혈액시료는 인체 B세포에 대한 원천으로서 P. 이루지노사 만성 감염균을 가진 공지의 낭포성 섬유증 환자로 부터 얻었다. 단핵세포를 PBS 현탁액 1.6ml를 1.6×10

AET 처리양적혈구 현탁액과 함께 사용하는 것을 제외하고 실시예 1에서 설명된 것과 같이 분리하였다. 또한 세포구축 변형은 1A2 세포/well E￣PBMC의 비율이 7.5이고, 17,000 세포/well인 15개의 판을 사용하여 배양균을 판상으로 만만후 6일 및 10일후에 공급하고, 판상체로 만든후 16일이 지난뒤에 거의 모든 웰이 증식세포를 함유하는 것을 제외하고는 상기와 같이 수행하였다.

특수 항체에 대한 배양 상징액의 선별은 전술한 것과 같이 수생하였으며 피셔 면역형 3,5,6 및 7판(그러나 피셔 면역형 1,2및 4판 또는 비세균성판은 아님) 과 반응하는 항체를 포함하는 1개의 웰(9D1)을 정하게 되었다. 각 면역형 또는 항원형 세균 항원판상에서 9D1 배양 상징액으로 상기 ELISA 분석은 수행은 2가지 피셔 면역형 3 및 7과 IATS 균주 2,5 및 16에 특수한 항체를 보여주었다. 실시예 1에 따라 행한 후속적인 연구로 웰 9D1 중에서 항체특성이 IgG 중복기준 항체를 분비하는 단일 무성생식에 기여할 수 있다는 사실을 알게 되었다.

[실시예 3]

실시예 3은 본 발명의 몇몇 항체의 항원특성을 보여주는 것이다.

단일분지계 항체 1C1, 2H12및 9D1이 같은 항원표적과 반응하여 특성에 있어서 동일하다는 사실을 결정하기 위하여 부가적인 분석을 시행하였다. 첫째 항체를 대비균주의 패널과 P. 이루지노사의 임상 단리물에 대하여 ELISA 중에서 비교하였다. ELISA 공정기록은 다음의 변경사 항을 제외하고는 위에서와 같다. 즉, (1) 박테리아 대신 PLL 피복판에 흡수시키고 그 판의 웰의 밑면에 에탄올로 고착된 여러가지 종류의 전체 박세균을 포함하였다. PBS중에서 세척한 세균현탁액(OD₆₆₀=0.2) 50㎕을 웰내에 첨가시키고, 500xg으로 20분동안 판을 원심분리시켜 PBS를 흡입시키고 에탄올 75㎕를 10분동안 첨가시킨 뒤 에탄올을 제거하고, 공기건조시켜 제조하였다. 항원판상에 포함된 것은 IATS 균주 2,5,11 및 16(각각 ATCC 제33349, 33352, 33358, 및 33363호)과 항원형 2,5,16 또는 이들 항원형의 혼합물로서 ELISA (전술한)와 제조자의 주의사항에 따라 디프코[미시간주 디트로이트시 소재] 박토-슈도모나스 이루지노사 항혈청으로 2가지 모두 점착시켜 형성된 16가지 임상 분리물이었다. (2) 토끼의 항결정 항혈청을 1 :250으로 희석한 항 IATS 16을 제외하고 PBS 중에 1 : 500으로 희석하여 사용하였다. 1C1, 2H12 및 9D1 항체를 함유하는 배양상징액을 순수하게 사용하였다. (3) 제2 단계 시약으로서 1 : 500으로 희석한 바이티닐화 단백질 A(B-2001, 벡터 라보라토리스, 인코포레이티드, 켈리포니아주 버얼링게임시 소재) 및 1: 500으로 희석한 바오티닐화 염소 항인체 Ig(4703, 타고 인코포레이티드, 켈리포니아주 버얼링게임 소재)을 각각 토끼 및 인체 항체의 검출용으로 사용하였다. 시약 50㎕을 적당한 웰에 첨가시키고 실온에서 30분간 배양시켜 결합되지 아니한 시약은 제거시키고 웰을 3차레 세척하였다. 미리 만든 아비딘 : 바이오티닐화 고추냉이 퍼옥시다제복합체(벡타스타인 ABC 키트, 벡터 라보라토리스, 인코포레이티드,켈리포니아 버얼링게임 소재) 50㎕을 각 웰에 첨가시켰다. 실온에서 30분 배양시킨 후 여분의 백타스타인 ABC 시약을 제거시키고 기재를 첨가시키기 전에 다시 웰을 3차례 세척하였다.

다음 표(Ⅱ)에 표시된 것과 같이 분석결과는 항체 1C1과 9D1이 IATS 2,5 또는 16항원형과 같은 형태의 모든 임상분리물과 반응하고,항체 2H12는 이러한 3가지 분리물과 반응되지 않는다는 사실을 보여주었다. 이 사실은 항체 2H12가 1C1 또는 9D1에 의해서 인지된 것으로 부터 상이한 에피토르를 인지하였고 2가지 에피토프는 대부분(전체는 아님)의 IATS 항원형 2,5 또는 16에 해당되는 임상분리물에 대하여 분명히 대응하게 표현된 것으로 추정하였다.

[표 Ⅱ]

a(+)=ELISA 반응 매우 약한 양성

또한 이 데이타는 항체 1C1과 9D1에 의해서 인지된 분자목표물이 IATS 항원형 2,5 또는 16에 속하는 형상이 나타나는 반면에 항체 2H12에 의해서 인지된 목표물은 이러한 문리물이 2차군에 표현되는 P. 이루지노사의 모든 임상문리물로 나타나게 된다는 사실로 추정되었다.

1C1, 2H12 및 9D1항체가 상이한 항원 또는 이와 다른것과 반응하는지에 대하여 결정하기 위하여 이러한 에피토프를 가진 항원에서 서로 다은 에피토프는 대부분(전부가 아님) IATS 2,5 및 16 항원형 상에 표현하고 면역오염분석을 행하였다. IATS 균주 2,5 및 16일간에 분배된 항원성은 명백히 열안정성 항원에 기인되고(상기 Liu, P.V. 외 공동연구자 연구보고 참조) 열안정성은 전술한 리포폴리삭카라이드 분자의 특성에 있기 때문에 IATS 균주 2,5,16 및 11로부터 LPS 제제는 분석용 항원제로서 선택된다. 조제의 LPS는 60℃의 염수중에서 추출에 의한 대표적인 균주로 부터 제조하였다. (Orskov, F. et al., Acta. Path. Microbiol. Scand. (1971) Section B 79 : 142-152 참조). 각 항원형으로 부터 2-케토-3-데옥시오토네이트(KDO) 함량에 의해서 결정되는 LPS의 10 마이크로그람(Karkhanis, Y.D., et al., Anal. Biochem.(1979) 85 : 595-601 참조)으로 10-20% 그레디언트 겔 상에서 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE) (Hancock, R.E.W. and Carey, A.M., J. Bacteriol. (1977) 140 : 901-910 참조) 을 실시하였다.

분리된 분자종은 다른 곳에서 기술된 바와 같이 겔로부터 니트로셀룰로오즈 분리막(NCM)으로 변형시키고(Towbin, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1979) 76 : 4350-4354 참조) NCM 반점은 PBS-트윈중에서 1시간동안 불록킹시켰다(Barreiger, B., et al., J. Immunol. Meth. (1982) 55 : 297-307 참조) 상기 반점을 1C1, 2H12또는 9D1 세포계열로 부터 분리된 배양상징액 20㎖중에 1시간동안 실온에서 배양시켰다. 5시간후에 PBS-트윈중에서 헹구어내어 각 NCM 반점은 알탈리성 포스파타제-결합 염소 항인체 IgG+IgA+IgM(Zymed)의 1 : 1000 또는 1 : 1500 희석액중에서(PBS-트윈중에) 25℃로 1시간 동안 배양시켰다. 그후 항원- 항체 상호작용이 Leary et al., Proc. Natl. Acad., Sci. USA (1983) 80 : 4045-4049에 기재된 니트로 블로테느라졸륨/5-보로모-4-크로로-3인돌일 포스페이트(NBT-BBCIP)기재 30㎖중에 25℃로 15-20분동안 상기 반점을 배양시킴으로써 보여지게된 후 상기 반점을 PBS-트윈중에서 5분씩 5차례 세척하였다. 칼라현색은 탈이온화된 물에서 반점을 수차례 세척함으로서 중지되었다.

3가지 항체로서 얻어진 반점의 모양이 상당히 차이가 있었다. 항체 2H12는 항원형 2,5 및 16의 항원제제의 정규공간을 차지한(즉, 사닥다리 모양) 저분자량의 분자가 현저하게 인지되었다. 또한 약간의 정규공간을 가진 고분자량의 분자가 희미하게 인지되었다. 항원형 11로부터 얻은 LPS 제제에 대한 어떠한 반응도 관찰되지 않았다. 단백질 항원을 파괴시키기 위하여 60℃에서 프로테이나제K로써 미리 처리한 LPS 제제를 사용하여 면역반점 분석을 반복실시한 결과 형태의 변화가 생기지 않았다. 저분자량의 밴드는 은색겔(중심부에 LPS의 리피드 A를 합친것으로 나타남)이 인지되지 않는 것을 제외하고 항원이 NCM으로 전환되지 않고 LPS의 존재로 인하여 채색된(Tasi, C.M. and Frasch, C.E., Anal. Biochem. (1982) 119 : 115-119 참조) 유사한 SDS-PAGE겔중에 나타난 작은형태의 LPS 분자에 해당하였다. 항체 1C1은 반응의 강도가 2H12에서와 같이 강하지는 않지만 항원형 2,5 및 16(11은 아님)의 항원제제들 사이에 정규공간을 가진 같은 계열의 저분자량의 분자를 인지하였다. 그러나 이에 더하여 이 항체 또는 일정한 인지된 저분자량의 밴드와 혼합하여 뚜렷하고 완전한 사닥다리 모양의 밴드를 생성시키는 항원형 2,5 및 16에 대한 일련의 정규공간을 가진 고분자량의 분자가 분명히 인지되었다. 이 모양은 프로테이나제K를 가진 항원제제를 미리 처리하였으나 아무런 변화도 생기지 않았다. 다시 이 모양은 중심부와 리피드 A를 합친것을 나타내는 밴드가 인지되지 않는것을 제외하고 LPS-특수색채 겔에 관찰된(즉,이들이 밴드에 해당하는 밴드로 나타나게 됨) 사닥다리 모양의 밴드형에 해당하였다. 항체 9D1은 IATS 2,5 및 16균주(11은 아님)에 대한 항체 1C1와 같이 반응형태를 가졌다.

다시말하면 상이한 LPS 제제의 은색겔의 사닥다리 모양의 저부밴드가 인지되지 않았으며 전체모양은 LPS 제제를 프로테이나아제K로써 예비처리 하였으나 아무런 변화도 생기지 않았다. 종합해서 말하면 이와같은 관찰은 항원형 2,5 및 16의 LPS가 2H12, 1C1 및9D1 항체에 의해서 인지된 분자 목표물이였다는 사실을 보여주었다.

[실시예 4]

실시예 4는 본 발명의 항체들중의 하나가 보호작용을 갖는다는 사실을 보여주는 것이다.

항체 1C1의 생체네에서의 보호능력을 평가하기 위하여 새앙쥐로써 동물보호 연구를 실시하였다. 먼저 1C1 항체를 포화 인산암모늄(최종농도 50%)으로써 침전시켜 소모된 배양상징액에서 농축시켰다.(Good, A. H., et al., Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell, B.B. and Shiigi, S.M., eds., W. J. Freeman Co., San Francisco, CA, 279-286 (1980) 참조). 침전된 물질은 PBS에 대하여 강력히 투석시킨 최소량의 살균수에 넣고 살균여과 시켰다. 소극적인 대비방법으로서 IATS 균주 11의 ,LPS에 대하여 인체 단일분지계 항체 특효약을 생산하는 또다른 변형 인체세로계열(6F11-ATCC 제CRL8562호)로 부터 소모된 배양상징액을 같은 방법으로 처리하였다.

20내지 22g의 체중을 가진 BALB/c 암컷 새앙쥐를 각각 30마리씩 2개군으로 나누었다. 각 군에 있는 모든 새앙쥐를 농축시킨 1C1또는 6F11 항체 0.5㎖로써 각각 복강 (ip)내에 접종시켰다. 6시간후에 2개의 군 각각을 10마리씩 3개군으로 다시 나누어 각각 10마리로 구성된 군을 각각 IATS균주 2,5 또는 11의 5LD₅₀을 함유하는 생균현탁액 0.3㎖로써 ip에 투여하였다. 세균현탁액을 대수상 성장상태의 육즙 배양균으로 부터 제조하였으며 이 세균으로 부터 원심분리하여 PBS중에서 두차례 세척하고 PBS중에 적당한 밀도로 재현탁시켰다. 각각 4 또는 5마리의 새앙쥐들로 구성된 대조군에 PBS 0.5㎖로써 직장내 주입시킨뒤 6시간후에 같은 항원형 5LD₅₀으로 직장내에 투여하였다. 세균을 투여한 후에 동물을들 5일마다 한번씩 관찰하였다.

다음 표(Ⅲ)에서 알 수 있는 바와 같이 항체 1C1은 양 IATS 2 및 IATS 5 항원형의 치사량 투여에 대한 특수하고 확실하게 보호하여 주었다. 그러나 IATS 11항원형은 그러하지 않았다. 모든 비보호 동물중에 일반적인 경로로 세균의 투여로 내독소 쇼크기간이 변화되었으며 통상적으로 죽음을 동반하였다. 소극적 대조동물에 주어진 비균질의 항체(6F11)는 다음 표(Ⅲ)에 주서 "a"에 기록된 증상에 특징지워진 쇼크기간이 연장되었다. 이들 동물중에 몇마리는 항체 제제중에 다같이 농축시킨 가능한 비 항체 성분에 의하여 회생시켰다. 그런데 보호균질의 항체를 수용한 동물은 내도혈증의 증상을 아주 조금밖에 나타내지 않았다. 이와같은 증상은 접종후 24시간내에 사라졌으며 그후 동물은 나머지 5일동안의 관찰기간동안 건강을 회복하였다.

[표 Ⅲ]

a 특수보호가 행해지지 않는 경우이며 감염균으로 회복은 균질의 항체와 감염균주들간에, 즉 IATS 2 또는 5를 가진 1C1 및 IATS 11을 가진 6F11간에 나타나 있는것과 같이 현저한 차이가 생겼다. 후자의 경우에 동물에 세균을 투여한 뒤 통상 24시간후에 완전히 회복하였다. 그런데 특수한 경우가 아닌 생쥐는 보통 상태로 회복하기 전에 몇일동안 급성감염 현상을 나타냈다.(즉, 설사, 각피 눈꺼플, 주름진 모피, "구부린"현상 및 느린동작). 이러한 비특수보호는 PBS만을 투여한 모든동물이 죽었으므로 분명히 다함께 농축시켜 동물내에 주입시킨 비항체 성분에 기인된다.

같은 공정을 이용하여 새앙쥐의 군이 피셔 균주 2,3 또는 7을 투여하여 5일동안 관찰하는 제2 실험을 행하였다. 다음 표(Ⅳ)에서 알 수 있는 바와같이 다시 항체 1C1은 피셔 면역형 3과 7로 치명적으로 감염된것을 특수하고 확실하게 보호해 주었으나 피셔 면역형 2에 대해서는 효과가 없었다.

[표 Ⅳ]

a 표제(Ⅲ)의 주서에서 기재된 바와같이 대부분의 생존동물은 특수보호를 시행하지 않은 것이다.

[실시예 5]

실시예 5는 P. 이루지노사의 IATS 항원형 4와 11 및 피셔 면역형 2와 반응하는 인체 단일분지계 항체의 보호방법을 제공한다. 실시예에 기재된 항체를 단리. 특성화 및 분석하기 위하여 어떤 변화를 줄 필요가 있는 것을 제외하고는 실시례 1-4에 기재된 방법을 반복 실시하였다. 다음은 공정에 있어서의 변화 및 기술된 단일분지계 항체로써 얻은 결과이다.

인체 B 세포의 근원은 먼저 피셔 면역형 3으로 부터 단리시킨 고분자량의 폴리삭카리이드 제제로써 면역화시킨 개체이다(Pier, G.B., et al., Infec. Immun. [1984] 45 : 309-313, 참조).

E￣PBMC의 세포 구축변형은 변형세포계 1A2와 함께 이들 세포들을 배양시킴으로써 완수되었다. 대수성장 상태의 1A2 세포는 HAT 배지에 현탁시켜 15 1A2세포/E￣PBMC를 혼합하였다. 이세포 혼합율은 200㎕/well의 체적의 62,000 세포/well의 농도로 14 미이크로타이터판에 넣고 판상체를 만들었다. 배양균을 판상체로 만든 다음 7일과 11일 후에 공급하고 15일까지 100% 증식세포를 포함하는 웰을 관찰하였다.

항 P. 이루지노사 항체의 존재를 선별해 내기 위하여 다음과 같이 구성되는 2개의 항원판을 사용하였다. 즉, (1) P. 이루지노사 피셔 면역형 1 내지 7(각각 ATCC 제27312호, 제27313호, 제27314호, 제27315호, 제27316호, 제27317호, 및 제27318호)의 혼합물과 (2) 세균을 포함하지 않은 PLL 처리 마이크로타이터판.

상기 실시예의 방법에 의한 배양상징액의 분석으로 피셔 면역형 1-7판(균이 결핍된 PLL 처리판은 아님)과 반응하는 항 P. 이루지노사 항체를 포함하는 약 100웰이 확인되었다. 인지된 특수한 피셔 면역형을 확인하기 위하여 항원판을 판의 각 행렬이 단 한개의 피셔 면역형의 PLL 고정세균을 함유하도록 상기와 같이 구성하였다. ELISA는 피셔 면역형 2에 대하여 특수한 항체를 포함하는 수많은 웰을 확인하여 얻은 새로운 항원판상의 원주세트에 넣은 각 항 P. 이루지노사 양성 웰로 부터 얻은 배양 상징액으로 상기와 같은 방법으로 실시하였다. 항 피셔 면역형 2 항체의 혈청학적 특성에 대하여 더 자세히 분석하기 위하여 상징액을 별도의 웰에 P. 이루지노사의 각각 17 IATS 항원형을 포함하도록 구성한 항원판상의 유사한 ELISA 중에서 시험하였다. 이 분석의 결과는 상징액의 대부분은 웰 6D6 중의 한 상징액이 IATS 하원형 4, 11, 13 및 14에 대하여 교차반응 특성을 나타내지만 IATS 항원형 11에 대하여 특효하다는 사실을 입증하였다.

항 IATS 항원형 4, 11, 13 및 14의 반응형태가 웰 6D6중의 1 또는 다수개의 항체에 의하여 결정된다는 사실을 입증하기 위하여 웰 6D6로 부터 얻은 상징액을 다시 나누어 각각 IATS 항원형 4, 7(소극적 대비), 11, 13 및 14를 흡착시켜 흡착된 상징액을 상기 ELISA 분석에 따라 5 IATS 항원형 각각의 PLL 공정세균에 대하여 시험하였다. 흡착은 얼음위에서 반시간동안 같은양의 상징액으로 포장된 세균 덩어리를 재현탁시킨 뒤 원심분리에 의하여 세균으로 부터 상징액을 분리시켜 수행하였다. 이 분석의 결과는 흡착된 IATS 항원형 4와 11은 각각에 대한 항체 활성을 내지만 IATS 항원형 7, 13 또는 14에 대하여는 항체특성을 나타내지 않는다는 사실을 보여주었다. 이와같은 사실은 IATS 항원형 4와 11과 교차반응하는 최소한 1개 이상의 웰 6D6중에 최소한 2가지 이상의 상이한 항 P. 이루지노사 하체가 존재한다는 사실을 보여준 것이다.

웰 6D6로 부터 적당한 항체 생산세포의 단리 및 무성생식은 3단계로 수행한다. 제1 단계는 20세포/well로 세포를 저밀도 이차배양시킨 다음 저밀도의 이차배양에 상당한는 제1 20 세포/well 단계에서 생성된 항 IATS 항원형 4+11 양성웰로 부터 얻는 세포의 저밀도 이차배양(5 세포/well)의 또다른 단계를 포함한다. 2차배양의 각 단계는 아미노프테린 성분(HT-배지)를 부족되게한 전체 100㎕의 HAT 배지중에 상기 밀도의 96-웰의 둥근밑면을 가진 판에서 수행되었다. 변형되지 않은 HAT 반응 임파아구증 세포를 공급세포로서 500 세포/well의 밀도로 모든웰에 포함시켰다. 4일후 판체로 만든 HAT 배지 100㎕을 공급세로를 선택적으로 죽이기 위하여 모든웰에 첨가시켰다. 다시 웰은 HAT 배지로써 상징액의 반을 대체시킴으로써 9일후 판체로 만든것에 공급되었다. 그후 유사한 방법으로 웰이 이미 설명한 ELISA에 의해서 상징액 분석에 충분한 임파아구증 세포밀도를 가질때까지 웰을 HT-배지로써 4-5일마다 공급하였다.

각 분석물에서 IATS 항원형 4와 반응하는 상징액은 IATS 항원형 11과 피셔 면역형 2와도 반응하였다. 이에 더하여 IATS 항원형 13과 14에 대한 항체활성은 잃게되므로 더 빠르게 특성문제를 확인할 수 있다.

특수항체 생성세포의 정식 무성생식은 세포를 매우 낮은 밀도로(1/well) 10㎕/well 체적의 72-웰 테라시끼판(Nunc #1-36538)에 넣어 먼저 판상으로 형성하여 수행하였다. 판을 3시간동안 항온기에 넣고 세포를 판체의 밑면에 침전되게한 다음 단일세포를 함유하는 웰에 대하여 2개의 상이한 개체에 의하여 현미경으로 채점을 하였다.

이들 각 세포를 96-웰의 둥근바닥 플레이트의 웰에 피더세포와 함께 넣고 저밀도 부배양을 위해 상기 방법으로 배양시켰다. ELISA 프로토콜로 분석하자 모든 무성생식물로 부터 얻은 상징액은 항-IATS 항원형 4 및 11에 대해 양성이었다.

이와 같은 방법에 의해 계속 생육하고(불멸임) 피셔 면역형 2와 반응하고 IATS 항원형 4 및 11과 교차 반응하는 인체 단일분지계 항체를 분비하는 무성생식 형질전환 인체 세포주 6D6(KCTC 8293P; 1987년 10월 17일자로 한국과학기술원에 기탁되고 ATCC CRL 8293P에 해당)을 얻었다. 이 실시예에서, 세포주 및 이것이 생산하는 항체에 동명칭를 붙인다(즉, 6D6). 웰 6D6중의 항체의 이소타입은 HRP-염소 항-인체-IgG와 HRP-염소 항-인체 IgM을 배합사용하지 않고 2단계로 각각 사용한것을 제외하고 상기 특이성시험과 유사한 ELISA 분석으로 결정하였다. 피셔 면역형 2 및 IATS 항원형 4 및 11과 양성반응하는, 웰 6D6중의 항체는 오직 항-IgM 시약의 경우에서만 관찰되었다. 이는 이 항체가 IgM 이소타입임을 입증하는 것이다.

6D6 항체에 의해서 인지되는 분자종의 생화학적 특성화는 피셔 면역형 2와 IATS 항원형 4 및 11로 부터 LPS 제제를 분석용 항원제제로서 선택하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3에 기재된 것과 같은 면역반점분석에 의하여 수행되었다. 피셔 면역형 1로 부터 얻은 LPS 제제는 소극적인 대비물로서 포함시켰다.

분석하기 전에 조제의 각 LPS 제제는 해리 완충액에서 1 : 1로 희석하여[0.125M Tris, 4%(w/v) 나트륨 도세실 술페이트(SDS), 20%(v/v) 글리세롤, 10%(v/v)

-메르캅토에탄올, 0.4%(w/v) 브롬페놀 불루, pH 6.8] 5분동안 욕탕 고주파 분해시켰다. 시료중의 단백질양을 줄이기 위하여 프로테이나제K(Img/ml, 수용액)를 효소대 LPS의 비율이 40%(w/w)되게 각 시료에 첨가하고 60℃에서 2시간동안 항온기에 넣은 뒤 1시간후에 5분 욕탕 고주파 분해단계에 들어갔다. 그 후 시료를 5분동안 100℃로 가열하고 마이크로퓨즈에서 2분동안 원심분리시켰다.

각 세균균주로 부터 LPS 10㎍으로 표시되는 정제된 시료는 상기 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)법을 시행하였다. 분리된 분자종은 NCM으로 이송시킨 후 NCM을 6D6 세포계열로 부터 분리된 배양상징액 10㎖중의 실온에서 2시간동안 항온기에 넣어 두었다. 잔유공정은 전술한 것과 같다.

긍정적인 결과는 피셔 면역형 2, IATS 항원형 4 또는 IATS 항원형 11 LPS를 함유하는 트랙(track)에서만 나타났다. 피셔 면역형 2와 LATS 항원형 11트랙에서 항체 6D6은 은색겔(중심부와 LPS의 리피드 A를 나타냄)이 인지되지 않는 것을 제외하고 항원이 NCM에 이송되지 않는 유사한 형상의 SDS-PAGE 겔중에 나타난 소형 LPS 분자에 해당하는 짧은 정규공간을 가진(즉,사닥다리형) 저분자량의 분자를 인지하였다. 그러나 LPS의 존재를 확인하기 위하여 특히 채색한 것을 대신 사용하였으나 대비하기 위하여 IATS 항원형 4 LPS를 함유하는 레인에서 항체 6D6은 고분자량의 벤드들 간에 일어나는 대부분의 격렬한 반응으로 겔의 전체길이를 거의 다 뻗힌 정규공간을 가진 완전한 밴드를 인지하였다. 다시말하면 이 모양은 중심과 리피드 A를 나타내는 밴드가 인식되지 않는것을 제외하고 LPS 특수채색 겔에 관찰된 사닥다리형 밴딩모양에 해당하였다(즉, 이들은 밴드에 대한 해당하는 밴드로 나타났다). 이와 같은 데이타는 LPS의 O-측쇄는 피셔 면역형 2와 IATS 항원형 4와 11상의 항체 6D6에 의해서 인지된 분자 목표물이였다는 사실을 명백히 보여주었다.

항체 6D6의 생체내에서의 보호능력을 분석하기 위하여 쥐로써 동물보호 연구를 시행하였다. 우선 6D6 항체를 포화 황산암모늄(최종농도 50%)로 침전시켜 소비된 배양상징액으로 부터 농축시켰다. 침전된 물질을 최소량의 살균수에 넣고 PBS에 대하여광범위하게 투석하여 살균 여과하였다. 소극적 대비로서 피셔 면역형 1의 LPS에 대한 인체 단일분지계 항체 특효약을 생산하는 또다른 변형 인체 세포계열(C5B7-ATCC 제CRL8753호)로 부터 소비된 상징액을 같은 방법으로 처리하였다. 이와 유사한 적극적인 대비로서 피셔 면역형 2 및 IATS 항원형 11의 LPS에 대한 인체 단일분지계 항체 특효약으로 생산하는 변형된 인체세포계열 6F11(ATCC 제CRL8562호)로 부터 소비된 배양 상징액을 농축시켰다.

체중 20g과 22g 사이의 스위치-웹스터 암컷 새앙쥐들을 각각 20마리씩 3군으로 나누었다. 각 군의 모든 새앙쥐를 농축시킨 6D6, C5B7 또는 6F11 항체 0.5㎖로써 복강내의 (ip) 경로에 의하여 각각 접종시켰다. 6시간 후에 3개군을 각각 5마리씩 5군으로 다시 분할하여 각각 5마리로 구성된 군을 각각 피셔면역형 1,피셔 면역형 2, IATS 항원형 4 또는 IATS 항원형 11의 8LO₅₀을 함유하는 생세균 현탁액 0.3㎖로써 ip에 투여하였다. 세균 현탁액을 실시예 4에서 기재된 방법과 같이 제조하였다. 세균을 투여한 후 동물을 5일동안 관찰하였다. 그 결과는 다음표(Ⅴ)와 같다.

[표 Ⅴ]

표(Ⅴ)에서 알 수 있는 바와 같이 항체 6D6은 피셔 면역형 2,IATS 항원형 4 및 IATS 항원형 11(피셔 면역형 1은 아님)의 치사량 투여에 대하여 특수하고 분명하게 보호해 주었다.

[실시예 6]

실시예 6은 이루지노사의 IATS 항원형 6과 13 및 피셔 면역형 1과 반응하는 인체 단일분지계 항체를 제조하는 방법을 제한다. 본 실시예에 기재된 항체를 단리, 특성화 및 분석하기 위하여 어떤 변화를 줄 필요가 있는 것을 제외하고는 기재된 방법을 실시예 1 내지 실시예 5에서 반복 시행하였다. 다음은 공정에 있어서의 변화이며 그 결과는 여기에 기재된 단일분지계 항체로써 얻었다.

인체 B 세포의 근원은 피셔 면역형 2로부터 분리된 폴리삭카라이드 제제로써 미리 면역화시킨 개체였다.(Pier et al., Infec. Imm. 34 : 461(1981) 참조). 전술한 바와 같이 E￣PBMC를 수집한 후 액체 질소 증기탱크내에서 10%(v/v) DMSO를 함유하는 FCS중에서 세포를 동결시켰다.

이들 세포를 37℃에서 신속히 녹인다음 이스코브의 배지에서 1차례 세척하고 HAT 배지에서 재현탁시켰다. 세포 구축변형은 15 1A2 세포/E￣PBMC의 비율로 이루어졌다. 세포혼합물은 78,500 세포/well 농도의 20 마이크로타이터판으로 판체화하였다. 배양균을 판체로 만든 후 3-5일 마다 공급하였으며 11일되는 날에 웰의 100%가 증식세포를 포함하고 있는 것으로 관찰되었다.

ELISA 기술을 이용하여 항 P. 이루지노사 항체들의 존재에 대하여 상징액을 선별하기 위하여 항원판은 P. 이루지노사 피셔 면역형 1-7[각각 임상분리물PSA 1277(Genetic Systems Corporation Organism Bank("GSCOB")), ATCC 27313, PSA G98(GSCOB), ATCC 27315, PSA F625(GSCOB), ATCC 27317 및 ATCC 27318]의 혼합물로 구성하였다. 또한 무균 PLL 처리 마이크로타이터판이 그 선별기내에 사용되었다.

상기 방법에 의한 배양 상징액의 분석을 피셔 면역형 1-7판(세균이 결핍된 PLL 처리판은 제외)과 반응하는 항 P. 이루지노사 항체를 함유하는 약 200웰을 확인하게 되었다. 2 또는 그 이상의 IATS 항원형과 반응하는 항체를 함유하는 이들 웰을 확인하기 위하여 상기와 같이 항체를 구성하며 여기서 판의 칼럼은 1개의 IATS 항원형만으로 된 PLL 고정세균을 함유하였다. 전술한 바와같이 각 항 P. 이루지노사 양성웰의 확장배양에서 얻은 상징액으로 ELISA를 수행하였다. 상징액을 새로운 항원판상의 행렬에 놓고 다중 항원형 6과 13에 대하여 특수한 항체를 포함하였다. 이 웰로부터 얻은 상징액은 7가지 피셔 면역형에 대하여 ELISA에 의한 시험을 실시하였을때 실시예 5에서와 같이 8H7의 항체가 피셔 면역형 1에 대하여 특효약이었다는 사실을 보여주었다.

항 IATS 항원형 6과 13의 반응형태가 웰 8H7의 다중 항체중의 한가지에 기인되었다는 사실을 확인하기 위하여 추가로 분할시킨 상징액을 각각 IATS 항원형 6,13 및 17(소극적 대비)에 흡착시킨 다음 흡착된 상징액을 상기 ELISA 분석법에 따라서 3가지 IATS 항원형 각각의 PLL 고정세균에 대하여 시험하였다. 그 결과는 흡착된 IATS 항원형 6과 13이 서로서로에 대한 항체활성을 나타낸다는 사실을 보여 주었다. 흡착된 IATS 항원형 17은 IATS 6 또는 13에 대한 아무런 활성도 나타내지 않았다. 이 데이타는 항 IATS 항 원형 6 및 13의 반응양상이 웰 8H7로 부터 얻는 단일 항체에 기인된다는 사실을 입증해 주었다.

웰 8H7로 부터 항체 생성세포의 단리 및 무성생식은 상기 실시예 5에서 설명된 3단계로 수행되었다. 이러한 방법에 의하여 연속적으로 생육하고(즉, 불멸임) 피셔 면역형 1과 반응성이며 IATS 하원형 6 및 13과 교차반응하는 인체 단일분지계 항체를 생산하는 무성생식 형질전환 인체 세포주 8H7(KCTC 8294P; 1987년 10월 17일자로 한국과학기술원에 기탁되고 ATCC CRL 9258에 해당)을 얻었다. 이 실시예에서, 세포주 및 이것이 생산하는 항체에는 동일 명칭인 8H7를 붙인다. 실시예 Ⅴ에서 설명된 것과 유사한 방법으로 이용하여, 웰 8H7중의 항체의 이소타입은 IgM으로 결정되었다.

8H7 항체에 의하여 인지된 분자종의 생화학적 특성화는 피셔 면역형 1과 IATS 항원형 6 및 13으로 부터 얻은 LPS 제제가 분석용 항원체제로서 선택된 것을 제외하고 상기 실시예 3과 5에 기재된 것과같이 면역반점 분석에 의해서 완수되었다. IATS 항원형 10에서 얻은 LPS 제제는 소극적인 대비방법으로 포함시켰다.

상기 면역반점은 분석을 시펴 면역형 1, IATS 항원형 6 또는 IATS 항원형 13 LPA를 함유하는 NCM 트랙에서만이 긍정적인 결과로 나타났다. 피셔 면역형 1과 IATS 항원형 6트랙에서 항체 8H7 겔의 전체길이에 가깝게 펼친 정규공간을 가진 (즉,사닥다리형) 일련의 밴드를 인지하였다. 이들 밴드는 항원이 NCM으로 이송되지 않는 유사한 SDS-PAGE 겔중에 나타난 것과 같은 LPS 분자의 복합 분자량 형태였으나 LPS의 존재를 확인하기 위하여 특히 착색한 것을 대신 사용하였다. IATS 항원형 13 LPS를 함유하는 레인에서 항체 8H7은 겔의 중간 내지 고분자량 범위에 한정된 정규공간을 가진 더 짧은 계열의 밴드를 인지하였다. 다시말해서 인지된 밴드가 채색된 겔중에서 최고 및 최저 분자량 형태의LPS가 웨스턴 반점내에서 잘 인지된 것으로 나타나지 않았다는 사실을 제외하고 LPS-특수채색된 겔 내에서 관측된 것에 해당하였다. 이들 데이타는 LPS가 피셔 면역형 1과 LATS 항원형 6 및 13상읜 항체 8H7에 의하여 분자목표물이였다는 사실을 명배히 보여주었다.

항체 8H7의 생체내의 보호능여글 분석하기 위하여 상기 실시예 4 및 5에 기재된 것과 같이 새앙쥐로써 동물보호 연구를 시행하였다. 소극적인 대비로 피셔 면역형 2의 LPS에 대하여 인체 단일분지계 항체 특효약을 생산하는 또다른 변형 인체 세로계열(6H11-ATCC 제CRL8652호)로 부터 소비된 배양 상징액을 같은 방법으로 처리하였다. 적극적인 대비로 피셔 면역형 1과 LATS 항원형 6의 LPS에 대하여 인체 단일분지계 항체 특효약을 생산하는 변형된 인체세포 계열 C5B7(ATCC 제CRL8753호)로 부터 소비된 배양 상징앵을 사용하였다.

최종 20g과 22g 사이의 스위스 웹스터 암컷 새앙쥐를 각각 30마리씩 3개군으로 나누었다. 각군에 있는 모든 새앙쥐를 농축시킨 8H7, 6F11,또는 C5B7 항체 0.5㎖로써 복강내(ip)에 접종시켰다. 4시간후에 3개군 각각을 다시 10마리씩 3개군으로 분할하여 각 10마리의 새앙쥐군을 각각 IATS 6(피셔 면역형 1에 해당됨)을 표시하는 임상분리물(A522)의 9.4LD₅₀, IATS 13 대비 항원형 5LD₅₀또는 IATS 11(피셔 면역형 2에 해당) 대비 항원형 10LD₅₀을 함유하는 생균 현탁액 0.3㎖로써 ip에 투여하였다. 세균현탁액을 상기 실시예 4와 같이 제조하였다. 세균을 투여한 후 동물을 5일동안 관찰하였다. 그 결과는 다음과 같다.

[표 Ⅵ]

상기 표(Ⅵ)에서 알 수 있는 바와 같이 항체 8H7은 IATS 항원형 6(IATS 항원형 11은 아님)의 시사량 투여에 대하여 특수하고 분명하게 보호해 주었다. IATS 항원형 13에 대한 보호정도가 약하다. 그러나 항원형 6의 분리물과 비교할 경우 이 단리물에 대한 LD₅₀(각각 3×10

군 형성단위 및 2.6×10

군 형성단위)을 필요로 하는 비교적 많은 수의 미생물에 의해서 표현될 수 있다. 별도의 시험에서 항체 8H7은 IATS 13 분리물 3.5LD₅₀을 투여한 5마리의 새앙쥐중 5마리 모두와 IATS 6 분리물을 투여한 5마리 새앙쥐중 5마리 모두를 보호하였다.

이상과 같이 본 발명의 세포계열은 여러가지 P.이루지노사 IATS 항원형에 대하여 교차변역반응 및 교차보호하는 단일분지계 항체 및 그의 단편을 제공한다. 이것은 대부분(전체가 아님)의 P.이루지노사 균주에 의한 감염균에 대하여 효율적인 예방 및 치료용 조성물을 더 쉽게 개발할 수 있게 하였다. 이에 더하여 본 발명은 명확하게 이해시키기 위하여 실시예를 들어 자세히 설명하였지만 첨부된 특허청구의 범위내에서 변경 및 개선이 이루어질 수 있다는 사실을 인식해야 할 것이다.

Claims (7)

1. 슈도모나스 이루지노사의 IATS 항원형 2 및 5와 피셔 면역형 3 및 7에 대해 보호적임을 특징으로 하는, 항체 2H12 및 9D1을 제외한 인체 단일분지계 항체 또는 생리적으로 활성인 그의 결합단편.
2. 제1항에 따른 항체 및 생리적으로 허용되는 담체로 구성되는 것이 특징인 슈도모나스 이루지노사의 감염을 치료 또는 예방하는데 사용되는 제약조성물
3. 제1항에 있어서, KCTC 8257P 세포주에 의해 생산되는 단일분지계항체와 반응하는 에피토프와 반응성이며, 슈도모나스 이루지노사의 IATS 항원형 2 및 5와 피셔 면역형 3 및 7에 대해 보호적임을 특징으로하는 인체 잔일분지계 항체 또는 그의 결합단편.
4. 제1항에 따른 항체와 상기 항체에 공유결합되거나 또는 상기 항체와 반응성인 제2의 항체에 결합되어 검색가능한 신호를 낼수 있는 라벨로 구성됨을 특징으로하는, 슈도모나스 이루지노사의 존재를 검색하는데 사용되는 키트.
5. 제1항에 따른 항체와 인체혈장 면역그로불린으로부터 얻은 감마 글로불린 유분 항 미생물제및 생리적으로 허용되는 담체로 구성된 슈도모나스 이루지노사의 감염을 치료 또는 예방하는데 사용되는 제약조성물.
6. 제1항에 따른 항체를 인간을 제외한 표유동물로부터의 시료와 결합시키고, 복합체 형성을 검색하는것을 특징으로하는, 인간을 제외한 표유동물로부터 수득된 시료중의 슈도모나스 이루지노사의 존재를 검색하는 방법.
7. 제1항에 따른 항체를 포함하는 2가지 이상의 인체 단일분지계 항체와 향미생물제, 인체혈장으로부터의 감마 글로불린 유분, 및 생리적으로 허용되는 담체로 구성된 슈도모나스 이루지노사의 감염을 치료 또는 예방하는데 사용되는 제약조성물.