FI86377C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt aktiva humana monoklonala antikroppar eller deras bindande fragment. - Google Patents

Description

1 86377

Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten ihmisen monoklo-naalisten vasta-aineiden tai niiden sitoutuvien fragmenttien valmistamiseksi 5 Ristiviittaus aiheeseen liittyvään hakemukseen: Tämä hakemus on osittain jatkoa US-patenttihakemuk-seen 807 394, joka on jätetty 10. joulukuuta 1985,ja joka mainitaan tässä viitteenä.

Tämä keksintö koskee immunologisten menetelmien 10 käyttöä uusien materiaalien aikaansaamiseksi, jotka ovat käyttökelpoisia bakteeri-infektioiden oidossa, tarkemmin ilmaistuna ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden, joilla on kyky tunnistaa lukuisia Pseudomonas aeruginosa sero-tyyppejä, tuotantoa ja käyttöä.

15 Gram-negatiivisten bakteerien aiheuttama sairaus ja sen vakavimmat komplikaatiot, esimerkiksi bakteremia ja endotoksemia, aiheuttavat merkittävää sairastumista ja kuolleisuutta ihmispotilaissa. Tämä pätee erityisesti gram-negatiiviseen organismiin, Pseudomonas aeruginosaan, 20 joka on enenevässä määrin liittynyt bakteeri-infektioihin, erityisesti sairaalainfektioihin, viimeisten viidenkymmenen vuoden aikana.

Muutaman viimeisen vuosikymmenen aikana on gram-negatiivisten bakteerien aiheuttaman sairauden hoitoon ; 25 käytetty antibiootteja. Gram-negatiivisten bakteerien ai heuttamaan sairauteen liittyvä jatkuva suuri sairastuvuus ja kuolleisuus osoittaa kuitenkin antibioottihoidon rajoitukset erityisesti P. aeruginosan ollessa kyseessä. [Katso esimerkiksi Andriole, V.G., "Pseudomonas Bacteremia: Can 30 Antibiotic Therapy Improve Survival", J. Lab. Clin. Med. 94 (1978) ss. 196 - 199]. Tämä on ollut kimmokkeena vaihtoehtoisten ehkäisy- ja hoitomenetelmien etsimiselle.

Eräs harkinnan kohteena ollut menetelmä on isännän immuunijärjestelmän voimistaminen aktiivisella tai passii-35 visella immunisoinnilla. On esimerkiksi havaittu, että 2 86377 ihmisten tai koe-eläinten aktiivinen immunisointi P. aeru-ginosasta valmistetuilla kokosolubakteerirokotteilla tai puhdistetuilla bakteeriendotoksiineilla johtaa spesifisten opsonivasta-aineiden kehittymiseen/ jotka suuntautuvat 5 pääasiassa P. aeruginosan uloimmalla solukalvolla sijaitsevien lipopolysakkaridimolekyylien (LPS) toistuvien oli-gosakkaridiyksiköiden pinnalla olevia determinantteja vastaan (katso Pollack, M., Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations, toim. Alving, B.M. 10 ja Finlayson, J.S., U.S. Department of Health and Human Services 1979, ss. 73 - 79). Tällaisten vasta-aineiden, olivatpa ne sitten aktiivisesti synnytettyjä tai passiivisesti siirrettyjä, on osoitettu suojaavan P. aeruginosa -infektion tappavilta vaikutuksilta joukossa eläinmalleja 15 (Pollack, supra) ja joissain ihmisillä tehdyissä esitutkimuksissa (katso Young, L.s. ja Pollack, M., Pseudomonas aeruginosa, toim. Sabath, L., Hans Huber, 1980, ss. 119 - 132). Erityisen tärkeä näiden vasta-aineiden merkitykselle ihmisissä on lisäksi ollut se havainto, että P. ae-20 ruginosa -bakteremiapotilaissa vallitsee yhteys eloonjäämisen ja infektoivan kannan LPS-molekyylien vastaisten vasta-aineiden korkean lyhytaikaisen seerumipitoisuuden välillä [katso Pollack, H. ja Young, L.S., J. Olin. Invest. 63 (1979) ss. 276 - 286].

25 Edellä mainitut raportit viittaavat siihen, että immunoterapeuttisia lähestymistapoja voitaisiin käyttää P. aeruginosan aiheuttaman bakteerisairauden hoitoon, kuten antamalla yhdistettyjä ihmisen immunoglobuliineja, jotka sisältävät vasta-aineita yhtä tai useampaa infektoi-30 vaa kantaa vastaan. Ihmisen immunoglobuliinit määritellään tässä yhteydessä siksi fraktioidun ihmisplasman osaksi, joka on rikastunut vasta-aineiden suhteen, joiden joukossa on spesifisiä vasta-aineita P. aeruginosa -kannoille. Ihmisen immunoglobuliinikomponenttien käyttöön liittyvien 35 tiettyjen luontaisten rajoitusten vuoksi on tämä lähesty- 3 86377 mistäpä P. aeruginosan aiheuttaman sairauden hoitamiseksi edelleen tutkimuksen alaisena [katso esimerkiksi Collins, M.S. ja Roby, R.E., Am. J. Med. 76 (3A) (1984) ss. 168 - 174], eikä vielä ole saatavana kaupallisia tuotteita, 5 joissa käytettäisiin näitä komponentteja.

Eräs tällainen immunoglobuliinikoostumuksiin liittyvä rajoitus on se, että ne koostuvat yhdistetyistä näytteistä, jotka on saatu tuhannesta tai useammasta luovuttajasta ja jotka on esivalikoitu tiettyjen anti-Pseudomonas-10 vasta-aineiden läsnäolon perusteella. Tämä yhdistäminen johtaa yksittäisten vasta-aineiden pitoisuuksien keskiar-voistumiseen, joka parhaimmillaankin antaa tulokseksi vaatimattomia nousuja tuloksena olevassa haluttujen vasta-aineiden pitoisuudessa.

15 Toinen rajoitus on se, että itse esivalikointipro- sessi vaatii kallista, jatkuvaa luovuttajayhdistelmän tutkimista tuotteen yhtenäisyyden varmistamiseksi. Näistä toimenpiteistä huolimatta immunoglobuliinituotteet saattavat edelleen vaihdella huomattavasti erästä toiseen ja eri 20 maantieteellisiltä alueilta tulevien tuotteiden kesken.

Vielä eräs tällainen immunoglobuliinikoostumuksille luontainen rajoitus on se, että niiden käyttö johtaa ulkopuolisten proteiiniaineiden samanaikaiseen antamiseen suurina määrinä (joihin aineisiin voi kuulua viruksia, kuten 25 sellaisia, joiden on vähän aikaa sitten osoitettu liittyvän immuunikatoon, AIDS:iin), jotka aineet saattavat aiheuttaa biologisia haittavaikutuksia. Haluttujen vasta-aineiden pienet pitoisuudet ja ulkopuolisten aineiden suuri pitoisuus voivat yhdessä rajoittaa potilaalle annetta-30 vissa olevien yhden tai useamman spesifisen ja siten hyödyllisen immunoglobuliinin pitoisuuden usein optimaalista pienemmäksi.

Kirjallisuudessa esitetään joukko serotyypin mää-ritysohjelmia, joita voitaisiin käyttää anti-Pseudomonas-35 vasta-aineiden läsnäolon tutkimiseen solusupernatanteis- 4 86377 ta. Ohjelmat perustuvat pääasiassa tämän organismin läm-pöstabiileihin somaattisiin pääantigeeneihin (katso Zierdt, C.H. teoksessa Glucose Nonfermenting Gram-Negative Bacteria in Clinical Microbiology, toim. Gilardi, 5 G.L., CRC Press 1978, ss. 213 - 238). Serotyypitysohjel- mien lisääntyminen on tehnyt P. aeruginosan serologisten tutkimusten vertaamisen melko vaikeaksi ja siten tietyn järjestelmän valinta supernatanttien tutkimista varten näyttää jossain määrin sattumanvaraiselta. Tyypitysjärjes-10 telmien välistä sekavuutta on jokin aika sitten vähentänyt IATS-järjestelmä (the International Antigenic Typing Scheme), jota on ehdottanut the Subcommittee on Pseudomo-nadaceae of the International Commitee on Systematic Bacteriology rungoksi P. aeruginosan tarkempia serologisia 15 tutkimuksia varten. Tämä järjestelmä, joka sisältää 17 erilaista serotyyppiä, jotka merkitään IATS-tyyppi 1, IATS -tyyppi 2 jne., kattaa kaikki aiemmissa järjestelmissä identifioidut lämpöstabiilit somaattiset pääantigeenit. Katso Liu, P.V., Int. J. Syst, Bacteriol. 33 (1983) ss.

20 256 - 264, joka mainitaan tässä viitteenä.

Kehitettäessä suojaavia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat ristiin P. aeruginosa -kantojen kanssa, on edullista ottaa mukaan myös tyypitysohjelma, joka perustuu P. aeruginosan suojaaviin antigeeneihin.

: 25 Tällainen ohjelma on suunniteltu pyrittäessä kehittämään rokote kliiniseen käyttöön ja sitä kuvataan yksityiskohtaisesti julkaisussa Fisher, M.V. et ai., J. Bacteriol. 98 (1969) ss. 835 - 836. Tämä järjestelmä, jota yleensä kutsutaan Fisher-tyypitysjärjestelmäksi, luokittelee pääosan 30 tunnetuista P. aeruginosa -kannoista seitsemään tyyppiin, joista käytetään merkintöjä Fisher-immunotyyppi 1, Fisher-immunotyyppi 2 jne. IATS- ja Fisher-tyypitysjärjestelmien välistä korrelaatiota on selvitetty kirjallisuudessa (katso Liu, P.V. et ai., supra) ja se esitetään taulukossa I, 35 Kuten taulukosta I käy ilmi, ei ole olemassa vastaavia 5 86377

Fisher-immunotyyppejä tietyille IATS-serotyypeille, vaikka kukin Fisher-immunotyyppi vastaa tiettyä IATS-serotyyp-piä. IATS- ja Fisher-tyypitysjärjesteImien ollessa kyseessä kummallekin serotyypin määritysjärjestelmälle tärkeiden 5 antigeenideterminanttien uskotaan sijaitsevan P. aerugino-san pinta-LPS-molekyyleillä[Liu, P.V. et ai., supra; Ha-nessien, F. et ai., Nature 229 (1979) ss. 209 - 210].

Taulukko I

10

Pseudomonas aeruginosan IATS- ja Fisher-tyypitys-ohjelmien vertailu ja korrelointi IATS Fisher I 4 15 2 3 3 4 5 7 6 1 20 7 8 6 9 10 5 II 2 25 12 13 14 " 15 16 30 1?

Vuonna 1975 Kohler ja Milstein julkaisivat kehitys kelpoisen havaintonsa, jonka mukaan tiettyjä hiirisolu-linjoja voitiin fuusioida hiiren pernasoluihin, jolloin 35 syntyy hybridoomia, joista kukin erittää yhdelle aineelle 6 86377 spesifistä vasta-ainetta, ts. monoklonaalisia vasta-aineita [Kohler, G. ja Milstein, C., Nature 256 (1975) ss. 495 - 497]. Tämän tekniikan keksimisen myötä tuli mahdolliseksi tuottaa joissakin tapauksissa suuria määriä täysin spe-5 sifisiä hiiren vasta-aineita antigeeneillä oleville yhdelle tai useammalle determinantille. Tällaisilla hiiren mo-noklonaalisilla vasta-aineilla tai tällaisten vasta-aineiden koostumuksilla saattaa kuitenkin olla suuria haittapuolia ajateltaessa käyttöä ihmisissä, erityisesti otet-10 taessa huomioon se havainto, että käytettäessä hiiren monoklonaalisia vasta-aineita kokeilututkimuksissa ihmisen tietyn sairauden hoitoon niiden on usein havaittu herättävän imuunivasteen, joka tekee niistä tehottomia [Levy, R.L. ja Miller, R.A., Ann. Rev. Med. 34 (1983) SS. 107 -15 116].

Käyttämällä hybridoomatekniikkaa Sadoff et ai. ovat raporttinsa mukaan tuottaneet hiiren monoklonaalista IgM-ryhmän vasta-ainetta P. aeruginosan tietyn serotyypin LPS-molekyylien O-ketjudeterminanttia vastaan (Abstracts 20 of the 1982 Interscience Conference on Antimicrobial

Agents and Chemotherapy, nro 253). He ilmoittavat lisäksi, että tämä hiiren vasta-aine suojasi hiiret P. aeruginosan, joka oli samaa serotyyppiä kuin se, jota vastaan vasta-aineet suuntautuivat (ts. homologista serotyyppiä), 25 tappavalta hyökkäykseltä. Muutamissa myöhemmissä artik keleissa on esitetty yksityiskohtaisesti spesifisyydeltään erilaisten hiiren ja ihmisen monoklonaalisten anti-P. aeruginosa-LPS-vasta-aineiden kehittämistä; esimerkiksi Sawada, S. et ai., J. Inf. Dis. 150 (1984) ss. 570 -30 576; Sadoff, J. et ai., Antibiot. Chemother. 36 (1985) ss.

134 - 146; Hancock, R. et ai., Infect. Immun. 37 (1982) ss. 166 - 171; Siadak, A.W. ja Lostrom, M.E. teoksessa

Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, toim. Engle-man, E.G. et ai., Plenum Publishing Corp., 1985, ss. 167 -35 185; ja Sawada, S. et ai., J. Inf. Dis. 152 (1985) ss.

7 86377 965 - 970.

Serotyyppispesifisten ihmisen monoklonaalisten an-ti-P. aeruginosa-LPS-vasta-aineiden tuotantoa ja imrauno-terapeuttista käyttöä kuvataan avoinna olevissa US-patent-5 tihakemuksissa 734 642 ja 828 005, jotka mainitaan tässä viitteenä.

Vaikka joissakin tilanteissa, kuten silloin kun infektio voidaan jäljittää yhden tietyn serotyypin aiheuttamaksi, voi olla tiettyjä etuja yhdelle P. aeruginosa-10 serotyypille spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden käytöstä, eivät ne olisi edullisia monissa muissa tilanteissa. Esimerkiksi ihmisten mahdollisten infektioiden ehkäisevissä hoidoissa olisi edullisempaa antaa yhtä tai useampaa ihmisen vasta-ainetta, joka antaa suojan useita 15 serotyyppejä vastaan. Vastaavasti terpauttisissa käyttö tarkoituksissa, joissa infektoivan (infektoivien) kannan (kantojen) serotyyppiä (serotyyppejä) ei tunneta, olisi edullista antaa yhtä tai useampaa ihmisen vasta-ainetta, joka on tehokas useimpia ellei kaikkia, kliinisesti tär-20 keitä P. aeruginosa -serotyyppejä vastaan. Vaikka teoriassa voitaisiin formuloida yhdistelmää ihmisen monoklonaali-sia vasta-aineita, joista kukin on spesifinen yhdelle P. aeruginosa -serotyypille, suojan antamiseksi erilaisia serotyyppejä vastaan, olisi tällainen koostumus vaikea - . 2 5 kehittää ja tuotannon kannalta katsottuna epätaloudelli nen valmistaa.

Siten on olemassa merkittävä tarve saada aikaan ihmisen monoklonaalisia anti-P. aeruginosa -vasta-aineita, joilla on kyky tunnistaa useita P. aeruginosa -serotyyppe-30 jä ja antaa suoja niitä vastaan. Näiden vasta-aineiden tulisi lisäksi soveltua käytettäviksi P. aeruginosa -infektioiden ehkäisevään ja terapeuttiseen hoitoon. Tämä keksintö tyydyttää nämä tarpeet.

Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti aktii-35 visten ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden tai niiden β 86377 sitoutuvien fragmenttien valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että viljellään ihmisen B-lymfo-syyteistä transformoimalla saatua jatkuvasti viljeltävissä olevaa solulinjaa ja otetaan talteen sen tuottamat mono-5 klonaaliset vasta-aineet, jotka reagoivat spesifisesti vähemmän kuin kaikkien mutta vähintään kahden Pseudomonas aeruginosan IATS-serotyypin kanssa, ja haluttaessa eristetään niiden sitoutuvat fragmentit.

Keksintö koskee myös uusia, jatkuvasti viljeltävis-10 sä olevia solulinjoja, jotka pystyvät tuottamaan ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on kyky reagoida spesifisesti P. aeruginosan useiden, muttei kaikkien, IATS-serotyyppien kanssa. Vasta-aineet reagoivat monella tavalla Fisher-immunotyyppien kanssa ja sitoutuvat nol-15 laan, yhteen tai useampaan immunotyyppiin. Keksinnön mukaisesti valmistettuja ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää hoidettaessa ihmistä, joka on alttiina P. aeruginosa -infektiolle tai jo saanut sen, antamalla profylaktinen tai terapeuttinen määrä koostumusta, 20 joka sisältää ainakin yhtä tällaista ihmisen monoklonaa-lista vasta-ainetta tai sen sitoutuvaa fragmenttia, jolla on kyky ristireagoida P. aeruginosa -serotyyppien kanssa, ja joka koostumus sisältää edullisesti myös fysiologisesti hyväksyttävää kantoainetta. Koostumus voi sisältää myös • . 25 yhtä tai useampaa seuraavista aineista: muita ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on kyky reagoida P. aeruginosan LPS:n muiden serotyyppi- tai immunotyyppi-determinanttien kanssa tai eksotoksiini r:n flagellojen kanssa; ihmisen veriplasman gammaglobuliinifraktiota ihmi-30 sen veriplasmasta, joka saadaan ihmiseltä, jolla P. aeruginosan kanssa reagoivien immunoglobuliinien taso on kohonnut; ja yhtä tai useampaa mikrobien vastaista ainetta.

: Tämä keksintö tarjoaa käytettäväksi uusia soluja, : · jolla on kyky tuottaa ihmisen monoklonaalisia vasta-ainei- 35 ta, joilla on kyky selektiivisesti tunnistaa useita 9 86377 P. aeruginosa -kantoja, jolloin yksittäiset vasta-aineet tyypillisesti tunnistavat P. aeruginosan useita IATS-sero-tyyppejä ja ei yhtään tai yhden tai useampia Fisher-immu-notyyppejä. Kyseessä olevissa soluissa on identifioitavis-5 sa olevia kromosomeja, joissa niiden tai esiastesolun so-lulinja-DNA on järjestäytynyt koodaamaan vasta-ainetta, jolla on sitoutumiskohta tietyille P. aeruginosa -serotyy-peille yhteiselle epitoopille. Näitä ihmisen monoklonaali-sia vasta-aineita voidaan käyttää monin tavoin diagnosoin-10 ti ja terapia mukaan luettuina (so. in vivo-suoja).

Tämän keksinnön mukaiset solut ovat tyypillisesti transformoituja ihmisen lymfosyyttejä, jotka tuottavat suojaavia ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita P. aeruginosan saavutettavissa olevia LPS-molekyylejä vastaan.

15 "Saavutettavissa olevalla" tarkoitetaan sitä, että LPS-molekyylit ovat fysikaalisesti saatavilla käyttöympäristössä suoraan vuorovaikutukseen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa. Siten aikaansaadut monoklonaaliset vasta-aineet ovat käyttökelpoisia P. aeruginosan aiheuttaman 20 vakavan sairauden hoitoon tai ehkäisyyn. P. aeruginosan ulomman kalvon LPS-molekyylit ovat käytettävissä suoraan kosketukseen vasta-ainemolekyylien kanssa ja mahdollistavat siten organismin komplementtivälitteisen hajoamisen ja/tai fagosytoosin. Lisäksi ne LPS-molekyylit, joita le-: 25 viää ulommasta kalvosta ympäristöön, ovat myös vapaita olemaan suorassa vuorovaikutuksessa vasta-ainemolekyylien kanssa ja eliminoituvat retikuloendoteliaalisen järjestelmän kautta.

Yksityiskohtaisemmin kuvattuna monoklonaalisten 30 vasta-aineiden valmistus voidaan toteuttaa keksinnön mukaisesti tekemällä pysyväksi P. aeruginosan useiden sero-tyyppien LPS-molekyyleiliä olevalle epitoopille spesifisiä vasta-aineita koodaavien nukleiinihapposekvenssien ilmentyminen. Monoklonaalisia vasta-aineita tuotetaan tyypilli-35 sesti transformoimalla soluohjatusti Epstein-Barr-viruk- 10 86377 sella (EBV:llä) B-lymfosyyttisolut, joita saadaan ihmis-luovuttajista, jotka ovat tai ovat olleet alttiina yhdelle tai useammalle asianmukaiselle P. aeruginosa -serotyypil-le. Siten tuotettuja vasta-aineita erittäviä solulinjoja 5 luonnehditaan jatkuvasti kasvaviksi lymfoblastoidisoluik- si, joilla on diploidinen karyotyyppi, jotka ovat Epstein-Barr-tuma-antigeenipositiivisia ja jotka erittävät monok-lonaalista vasta-ainetta, joka on IgG-, IgM-, IgA- tai IgD-isotyyppiä, mukaan luettuina erilaiset alatyypit, kulo ten IgGl, IgG2, IgG3 ja IgG4. Itse soluohjattua transfor-mointiprosessia kuvataan yksityiskohtaisesti US-patentti-julkaisussa 4 464 465, joka mainitaan tässä viitteenä. Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää kokonaisina tai fragmentteina, kuten Fv-, Fab- ja F(ag')2-fragment-15 teinä, tavallisesti kuitenkin kokonaisina.

Vasta-aineina tuottavia solulinjoja voitaisiin vaihtoehtoisesti tuottaa tekemällä solufuusio sopivalla lääkkeellä merkittyjen ihmisen myelooma-, hiiren myeloo-ma-, ihmis-hiiri-heteromyelooma- tai ihmisen lymfoblastoi-20 disolujen ja ihmisen B-lymfosyyttien kesken, jolloin saadaan ihmishybridisolulinjoja.

Tämän keksinnön mukaisilla solulinjoilla saattaa olla muutakin käyttöä kuin ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden suora tuotanto. Solulinjoja voidaan fuusioida ·.. 25 muihin soluihin (kuten sopivalla lääkeaineella leimattuihin ihmisen myelooma-, hiiren myelooma-, ihmis-hiiri-heteromyelooma- tai ihmisen lymfoblastoidisoluihin), jolloin saadaan hybridoomia ja sitä kautta mahdollisuus siirtää monoklonaalisia vasta-aineita koodaavia geenejä. Solulin-30 joja voidaan vaihtoehtoisesti käyttää lähteinä immunoglo-buliineja koodaaville geeneille, jotka voidaan eristää ja siirtää soluihin muilla menetelmillä kuin fuusioimalla. Monoklonaalisia vasta-aineita koodaavia geenejä voidaan V lisäksi eristää ja käyttää yhdistelmä-DNA-menetelmien mu- 35 kaisesti spesifisen immunoglobuliinin tuotantoon erilai- 11 86377 sissa isännissä. Erityisesti valmistamalla cDNA-kirjastoja lähetti-RNA:sta voidaan eristää yksittäinen cDNA-klooni, joka koodaa immunoglobuliinia eikä sisällä introneja, ja sijoittaa tämä soveltuvaan prokaryoottiseen tai eukaryoot-5 tiseen ilmentymisvektoriin, jolla sitten transformoidaan isäntä lopullista massatuotantoa varten.

Lymfoblastoidi- tai hybridisolulinjoja voidaan kloonata ja tutkia tavanomaisin menetelmin vasta-aineilla, joilla on kyky sitoutua solusupernatanteissa havait-10 tujen erilaisten P. aeruginosa -serotyyppien epitooppei-hin.Käyttämällä keksinnön mukaisesti valmistettuja vasta-aineita suoja-vasta-aineina seulonnassa alan ammattimiehen hyvin tuntemien menetelmien mukaan voidaan helposti eristää lisää monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat 15 samat antigeenideterminantit tai epitoopit.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää monella tavalla myös in vitro. Esimerkkeinä mainittakoon, että monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää diagnostisiin 20 tarkoituksiin, tyypitykseen, tiettyjen P. aeruginosa -kantojen eristämiseen, heterogeenisessa soluseoksessa olevien P. aeruginosa -solujen selektiiviseen poistamiseen tai vastaaviin tarkoituksiin.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja monoklo-·'· . 25 naalisia vasta-aineita voidaan myös sisällyttää komponenteiksi farmaseuttisiin koostumuksiin, jotka sisältävät terapeuttisen tai profylaktisen määrän ainakin yhtä tämän keksinnön mukaisesti valmistettua monoklonaalista vasta-ainetta yhdessä farmaseuttisesti tehokkaan kantajan kans-30 sa. Farmaseuttisen kantajan tulisi olla yhteensopiva, myr-kytön aine, joka soveltuu monoklonaalisten vasta-aineiden viemiseen potilaaseen. Kantajana voidaan käyttää steriiliä vettä, alkoholia, rasvoja, vahoja ja inerttejä kiinteitä aineita. Farmaseuttiseen koostumukseen voidaan sisällyttää : 35 myös farmaseuttisesti hyväksyttäviä apuaineita (puskuriai- i2 86377 neita, dispergointiaineita). Tällaiset koostumukset voivat sisältää yhtä monoklonaalista vasta-ainetta, jolloin niiden on tarkoitus olla spesifisiä kahdelle tai useammalle, muttei kaikille P. aeruginosa-serotyypeille. Farmaseutti-5 nen koostumus voi vaihtoehtoisesti sisältää kahta tai useampaa monoklonaalista vasta-ainetta, jolloin muodostuu "cocktail". Esimerkiksi cocktail, joka sisältää erilaisten P. aeruginosa -serotyyppien muodostamien ryhmien vastaisia ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita, olisi yleistuote, 10 joka on aktiivinen suurimman osan suhteen kliinisesti eristettyjä näytteitä, jotka sisältävät tätä nimenomaista bakteeria.

Kiintoisia ovat profylaktiset ja/tai terapeuttiset monoklonaalisia vasta-aineita sisältävät koostumukset, 15 joilla on kyky reagoida ainakin kolmen, tavallisesti ainakin neljän ja tavallisimmin ainakin viiden iATS-sero-tyypin kanssa. Erityisen kiintoisia ovat monoklonaalisia vasta-aineita sisältävät koostumukset, jotka reagoivat vähintään noin seitsemän, edullisesti vähintään noin 20 10 - 14 ja jopa kaikkien 17 IATS-serotyypin kanssa. IATS- serotyyppien yhteydessä koostumukset reagoivat toivotusti vähintään kahden, tavallisesti vähintään kolmen ja tavallisimmin vähintään neljän ja jopa kaikkien seitsemän Fisher -immuunityypitysjärjestelmän immunotyypin kanssa.

25 Kukin koostumus sisältää vähintään yhtä, tavalli sesti vähintään kahta ja tavallisimmin vähintään kolmea vasta-ainetta, jolloin kukin vasta-aine reagoi vähintään ; - kahden, kolmen, neljän tai useamman, muttei kaikkien IATS- "Y serotyyppien kanssa. On toivottavaa, että läsnä on aina- 30 kin yksi monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu vähin-·'·* tään kahteen IATS-serotyyppiin ja yhteen tai useampaan, edullisesti vähintään kahteen, Fisher-immunotyyppiin.

Y·? On toivottavaa, että koostumuksessa olevien eri- Y laisten monoklonaalisten vasta-aineiden kokonaislukumäärä 35 on vähintään yksi ja korkeintaan noin puolet, usein 1/3 13 86377 IATS-serotyyppien, joiden kanssa koostumus reagoi, kokonaismäärästä.

Eri monoklonaalinen vasta-aine-komponenttien mooli-suhteiden ero on tavallisesti korkeintaan kymmenkertainen, 5 tavallisemmin korkeintaan viisinkertainen, ja kunkin vas-ta-ainekomponentin moolisuhde kuhunkin muuhun on yleensä noin 1:1 - 1:2.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavia ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää myös yhdis-10 tettyinä muihin monoklonaalisiin vasta-ainekoostumuksiin tai jo olemassa oleviin veriplasmatuotteisiin, kuten myynnissä oleviin gammaglobuliini- ja immunoglobuliinituottei-siin, joita käytetään ihmisten P. aeruginosa -sairauden profylaktiseen tai terapeuttiseen hoitoon. Immunoglobulii-15 nien ollessa kyseessä plasma otetaan edullisesti ihmisluo-vuttajista, joilla P. aeruginosan kanssa reagoivien immu-noglobuliinien taso on koholla. Katso yleisesitys Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host, Amer. J. Med. 76(3a) (30.3.1984) 1 - 231, joka mainitaan tässä 20 viitteenä.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää erikseen annettavina koostumuksina antibioottien tai mikrobien vastaisten aineiden annon yhteydessä. Mikrobien vastaisiin aineisiin 25 voi tyypillisesti kuulua anti-pseudomonaalinen penisillii- : ni (esimerkiksi karbenisilliini) yhdistettynä aminoglyko- sidiin (esimerkiksi gentamysiiniin, tobramysiiniin jne.), mutta lukuisia muitakin alan ammattimiesten tuntemia aineita (esimerkiksi kefalosporiineja) voidaan käyttää.

"V 30 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut ihmisen mo noklonaaliset vasta-aineet ja niitä sisältävät farmaseut-'·'·* tiset koostumukset ovat erityisen käyttökelpoisia oraali seen tai parenteraaliseen antoon. Farmaseuttisia koostu-muksia voidaan edullisesti antaa parenteraalisesti, ts.

: 35 ihon alle, lihaksensisäisesti tai laskimonsisäisesti.

14 86377

Voidaan käyttää monia erilaisia vesipohjaisia kantajia, esimerkiksi vettä, puskuroitua vettä, 0,4-%i:sta suolaliuosta, 0,3-%:ista glysiiniliuosta tms. Nämä liuokset ovat steriilejä eivätkä sisällä hiukkasmaista ainesta.

5 Nämä koostumukset voidaan steriloida tavanomaisin, hyvin tunnetuin sterilointimenetelmin. Koostumukset voivat sisältää farmaseuttisesti hyväksyttäviä apuaineita, joita tarvitaan fysiologisten olosuhteiden approksimointiin, kuten pH:n säätö- ja puskurlaineita, tonisuudensäätöaineita 10 tms. kuten natriumasetaattia, natriumkloridia, kaliumklo-ridia, kalsiumkloridia, natriumlaktaattia jne. Vasta-aineen pitoisuus näissä formuloissa voi vaihdella suuresti, ts. alle noin 0,5 %:sta, tavallisesti vähintään noin 1 %:sta, jopa 15 tai 20 %:iin, ja se valitaan pääasiassa 15 valitulle antomuodolle edullisten nestetilavuuksien, viskositeettien jne. perusteella.

Niinpä tyypillinen lihaksensisäisesti annettava farmaseuttinen koostumus voisi sisältää 1 ml steriiliä puskuroitua vettä ja 50 mg monoklonaalista vasta-ainetta. 20 Tyypillinen laskimoon tiputettava koostumus voisi sisältää 250 ml steriiliä Ringerin liuosta ja 150 mg monoklonaalista vasta-ainetta. Parenteraalisesti annettavien koostumusten varsinaiset valmistusmenetelmät ovat alan ammattimiesten tuntemia tai ilmeisiä heille ja niitä kuva-25 taan yksityiskohtaisemmin esimerkiksi teoksessa Reming-ton's Pharmaceutical Science, 15. p., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980, joka mainitaan tässä viitteenä.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut monoklonaa-30 liset vasta-aineet voidaan kylmäkuivata varastointia varten ja sekoittaa takaisin sopivaan kantajaan ennen käyttöä. Tämä menetelmä on osoittautunut tehokkaaksi tavanomaisten immunoglobuliinien yhteydessä ja voidaan käyttää alalla tunnettuja kylmäkuivaus- ja käyttöliuoksen sekoi-• 35 tusmenetelmiä. Alan ammattimiehet tietävät, että kylmäkui- is 86 377 vaus ja sekoitus uudelleen käyttöliuokseksi voivat johtaa vaihtelevanasteiseen vasta-aineen aktiivisuushäviöön (esimerkiksi tavanomaisten immunoglobuliinien yhteydessä IgM-vasta-aineilla on taipumus kärsiä suuremmista aktiivisuus-5 häviöistä kuin IgG-vasta-aineilla) ja että käyttömäärät saatetaan joutua säätämään tämän häviön kompensoivalla tavalla.

Koostumuksia, jotka sisältävät tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja ihmisen monoklonaalisia vasta-ai-10 neita tai niiden seoksen, voidaan antaa P. aeruginosa -infektioiden profylaktiseen ja/tai terapeuttiseen hoitoon. Terapeuttisessa käytössä potilaalle, joka on jo infektoitunut yhdellä tai useammalla P. aeruginosa -sero-tyypillä, annetaan riittävä määrä koostumuksia infektion 15 ja sen komplikaatioiden hoitamiseksi tai lievittämiseksi ainakin osittain. Tämän tuloksen aikaansaamiseksi riittävä määrä määritellään "terapeuttisesti tehokkaaksi annokseksi". Tähän käyttötarkoitukseen tehokkaat määrät riippuvat infektion vakavuudesta ja potilaan oman immuunijärjestel-20 män yleistilasta, mutta ne ovat yleensä alueella noin 1 - 200 mg vasta-ainetta/painokilo ja yleisemmin käytetään annoksia 5-25 mg/kg. Tulee pitää mielessä, että tämän keksinnön mukaisesti valmistettavia aineita voidaan yleensä käyttää vakavissa sairaustiloissa, ts. hengenvaa-25 rallisissa tai mahdollisesti hengenvaarallisissa tilan-teissä, erityisesti P. aeruginosan aiheuttamissa baktere-mioissa ja endotoksemioissa. Kun otetaan huomioon tämän keksinnön mukaisesti valmistetuilla ihmisen monoklonaali-silla vasta-aineilla saavutettava ulkopuolisten aineiden - 30 poissaolo ja "vieraan aineen" hylkimisten poissaolo, on tällaisissa tapauksissa mahdollista ja hoitavan lääkärin mielestä toivottavaa antaa merkittävä ylimäärä näitä vasta-aineita.

Profylaktisessa käytössä keksinnön mukaisesti val-: 35 mistettua vasta-ainetta tai niiden seosta sisältäviä i6 86377 koostumuksia annetaan potilaalle, joka ei vielä ole P. aeruginosan infektoima, jotta parannetaan potilaan vastustuskykyä tällaisen mahdollisen infektion suhteen. Tällainen määrä määritellään "profylaktisesti tehokkaaksi 5 annokseksi". Tässäkin käyttötarkoituksessa tarkka määrä riippuu potilaan terveydentilasta ja yleisestä immuuni-suustilasta, mutta se on yleensä 0,1 - 25 mg/kg, erityisesti 0,5 - 2,5 mg/kg.

Koostumuksia voidaan antaa hoitavan lääkärin valit- 10 semina annoksina ja hänen valitsemansa ohjelman mukaisesti. Farmaseuttisten formuloiden tulisi joka tapauksessa antaa riittävä määrä tämän keksinnön mukaisesti valmistettua yhtä tai useampaa vasta-ainetta potilaan hoitamiseksi tehokkaasti.

15 Esimerkki I

Esimerkki I valaisee menetelmiä IATS-serotyyppien 2, 5 ja 16 ja Fisher-immunotyyppien 3 ja 7 kanssa reagoivien ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden (IgM-isotyyp-pi) tuottamiseksi.

20 Ihmisen B-solujen lähteenä toimi ääreisverinäyte, joka oli saatu kystistä fibroosia sairastavalta potilaalta, jolla tiedettiin olevan krooninen P. aeruginosa -infektio. Yksitumaiset solut erotettiin verestä tavanomaisin sentrifugointimenetelmin Ficoll-Paquella [Boyum, A; Scand.

25 J. Clin. Lab. Invest. 21, Suppl. 97 (1968) 77 - 89) ja pestiin kahdesti kalsiumista/magnesiumista vapaassa fos-faattipuskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa (PBS).

Yksisoluiset solut puhdistettiin T-soluista käyttämällä muunnettua E-rosettimenettelyä. Lyhyesti kuvattuna - 30 solut suspendoitiin ensin pitoisuudeksi 1 x 107 solua/ml PBS:ään, joka sisälsi 20 % naudan sikiöseerumia (FCS), lämpötilassa 4 °C. 1 ml tätä suspensiota laitettiin sitten pyöreäpohjäiseen polystyreeniputkeen, jonka mitat olivat 17 x 100 mm ja johon lisättiin 1 x 109 2-aminoisotiouro- 35 niumbromidilla (AET) käsiteltyjä lampaan punasoluja, jot- 17 86377 ka olivat 10-%:isena (tilavuusprosenttia) liuoksena Isco-ven muunnetussa Dulbeccon väliaineessa (Iscoven väliaineessa) [Madsen, M. ja Johnson, H.E., J. Immun. Methods 27 (1979) 61 - 74]. Suspensiota sekoitettiin hyvin varovasti 5 5-10 min lämpötilassa 4 °C ja sitten E-rosettisolut poistettiin sentrifugoimalla 8 min Ficoll-Paquella kiihtyvyydellä 2 500 x g lämpötilassa 4 °C. E-rosettinegatii-viset yksitumaiset ääreisverisolut (E“PBMC), jotka muodostivat vyöhykkeen rajapinnalle, kerättiin, pestiin kerran 10 Iscoven väliaineella ja suspendoitiin takaisin samaan väliaineeseen, joka sisälsi 15 tilavuus-% FCS:ää, L-glut-amiinia (2 mmol/1), penisilliiniä (100 μq/ml), streptomysiiniä (lOO/jig/ml), hypoksantiinia (1 x 10-4 mol/1), ami-nopteriiniä (4 x 10“7 rool/1) ja tymidiiniä (1,6 x 10“5 15 mol/1). Tätä väliainetta kutsutaan tästedes HAT-väliai-neeksi.

E"PBMC:n soluohjattu transformointi tehtiin viljelemällä näitä soluja yhdessä transformoivan solulinjan kanssa. Transformoiva solulinja oli Epstein-Barr-tuma-an-20 tigeenipositiivinen (EBNA-positiivinen) ihmisen lymfoblas- toidisolulinja, joka oli saatettu GM 1500 -lymfoblastoidi-solulinjan etyylimetaanisulfonaatti (EMS)-mutageneesilla ja sitä seuraavalla valikoinnilla 6-tioguaniinin (30 Mg/ml) läsnäollessa, jolloin soluista tuli hypoksantiini-guanii-25 nifosforibosyylitransferaasin (HGPRT) suhteen vajaukselli-

sia ja siten HAT:lie herkkiä. Tämä solulinja on nimetty lA2-solulinjaksi ja talletettu the American Type Culture Collection -talletuslaitokseen (ATCC) 29. maaliskuuta 1983 ATCC-numerolla CRL 8119. Logaritmisen kasvun vaiheessa 30 olevat lA2-solut suspendoitiin HAT-vällaineeseen ja yhdistettiin sitten E-PBMC-soluihin suhteessa kahdeksan 1A2-solua/yksi E”PBMC-solu. Soluseos siirrostettiin kahdeksalle pyöreäpohjaiselle, 96-kuoppaiselle miktotiitterilevylle (Costar 3799) pitoisuudeksi 72 000 solua/kuoppa tilavuuden 35 ollessa 200 μΐ/kuoppa ja inkuboitiin lämpötilassa 37 °C

ie 86377 kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % C02:ta. Viljelmille annettiin lisäravintoa 5. ja 8. päivänä siirros-tuksen jälkeen korvaamalla puolet supernatant!sta tuoreella HAT-väliaineella. Soluja tarkkailtiin joka toinen päivä 5 käänteismikroskoopilla merkkien havaitsemiseksi solujen proliferaatiosta. 12 päivän kuluttua siirrostuksesta havaittiin, että 100 % kuopista sisälsi lisääntyviä soluja ja että useimmissa kuopissa soluja oli riittävän tiheässä, supernatanttien poistamiseksi ja tutkimiseksi anti-P. ae-10 ruginosa -vasta-aineen suhteen.

Supernatanteista tutkittiin anti-P. aeruginosa-vasta-aineiden läsnäolo käyttämällä ELISA-menetelmää [enzyme linked immunosorbent assay, Engvall, E.,__55 (1977) 193 - 200]. Antigeenilevyt olivat tasapohjaisia, 15 96-kuoppaisia mikrotiitterilevyjä (Immulon II, Dynatech), joiden kuopat sisälsivät erilaisia kuopan pohjalle adsorboituja eläviä bakteereja. Bakteerien adsorboimiseksi muoviin inkuboitiin 50 μΐ/kuoppa poly-L-lysiiniä (PLL) (1 μg/ml PBS:ssä, pH 7,2) 30 min huoneen lämpötilassa.

20 Sitten adsorboitumaton PLL poistettiin, levyt pestiin kerran PBS:llä, kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 μΐ pestyä bak-teerisuspensiota (OD660 = 0,2) PBS:ssä ja levyjä inkuboitiin yksi tunti lämpötilassa 37 °C. Adsorboitumattomat bakteerit poistettiin pesemällä levyt kolmesti Tweeniä si-25 sältävällä fysiologisella suolaliuoksella (0,9 % NaCl, 0,05 tilavuus-% Tween-20). Tutkimuksessa käytetyt erilaiset antigeenilevyt olivat: (1) P. aeruginosa-Fisher-immu-notyyppien 1, 2 ja 4 seos (ATCC-nrot 27312, 27313 ja 27315); (2) P. aeruginosa-Fisher-immunotyyppien 3, 5, 6 ja 30 7 seos (ATCC-nrot 27314, 27316, 27317 ja vastaavasti 27318); ja (3) mikrotiitterilevy ilman bakteereja.

ELISA aloitettiin suojaamalla ensin levyt suojaus-puskurilla [200 μΐ/kuoppa, PBS, pH 7,2, joka sisälsi 5 % (paino/tilavuus) rasvatonta kuivamaitoa, 0,01 tilavuus-% : 35 Antifoam A:ta (Sigma) ja 0,01 % (paino/tilavuus) timerosa- i9 86377 lia], käsittelyaika 60 min huoneen lämpötilassa. Suojauksen jälkeen levyt pestiin kolmesti Tweeniä sisältävällä fysiologisella suolaliuoksella. Kaikkiin kuoppiin laitettiin sitten 50 μΐ PBSrää, pH 7,2, joka sisälsi 0,1 % 5 Tween-20:tä ja 0,2 % (paino/tilavuus) naudan seerumialbu-miinia (BSA). Viljelylevyjen kuoppien supernatantit repli-kasiirrostettiin vastaaviin antigeenilevyjen kuoppiin (50 μΐ/kuoppa) ja levyjä inkuboitiin 30 min huoneen lämpötilassa. Sitten supernatantit poistettiin, kuopat pestiin 10 kolmesti Tweeniä sisältävällä fysiologisella suolaliuoksella ja kuoppiin lisättiin 50 μΐ asianmukaisella tavalla laimennettua piparjuuriperoksidaasiin (HRP) liitettyä vuohen anti-ihmis-(IgG + IgM)-vasta-ainetta (American Qualex International nro A1114 + nro A1124). Tässä esimerkissä 15 HRP-(vuohen anti-IgG):n ja RP-(vuohen anti-IgM):n lopullinen laimennussuhde oli 1:5 000 ja vastaavasti 1:3 000 PBS:ssä, pH 7,2, joka sisälsi 0,05 % Tween-20:tä ja 0,1 % BSA:ta. Kun oli inkuboitu 30 min huoneen lämpötilassa, ylimääräiset entsyymiin liitetyt vuohen vasta-aineet pois-20 tettiin ja kuopat pestiin kolmesti Tweeniä sisältävällä fysiologisella suolaliuoksella. Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 μΐ substraattia (0,8 mg/ml o-fenyleenidi-amiinidihydrokloridia 100 mM sitraattipuskurissa, pH 0,5 ja 0,03 % H202:a deionisoidussa vedessä, sekoitetaan yhtä 25 suuret tilavuudet juuri ennen levylle siirtämistä). Kun oli inkuboitu pimeässä 30 min, kaikkiin kuoppiin lisättiin 50 μΐ 3 N H2S04:a reaktioiden pysäyttämiseksi. Viljelysu-pernatantit, jotka sisälsivät levyllä olevan antigeenin kanssa reagoivia vasta-aineita, detektoitiin vastaavissa . 30 kuopissa tapahtuvan värinkehityksen avulla ja reaktion voimakkuus määritettiin kvantitatiivisesti mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 490 nm Bio-Tek EL-310-mikro-ELISA-lukulaitteella.

Viljelysupernatanttien analysointi edellä kuvatulla ' 35 menetelmällä johti kahden kuopan (1C1 ja 2H12) identi- * · 20 86377 fiointiin, jotka sisälsivät anti-P. aeruginosa-vasta-ai-neita, jotka reagoivat Fisher-immunotyyppejä 3, 5, 6 ja 7 sisältävän levyn kanssa, mutta eivät Fisherimmunotyyppejä 1, 2 ja 4 sisältävän eivätkä bakteerittoman levyn kanssa.

5 Jotta saataisiin identifioiduksi tunnistetut yksi tai useampi nimenomainen Fisher-immunotyyppi, valmistettiin kustakin immunotyypistä antigeenilevyt, jotka sisälsivät vain yhtä Fisher-immunotyyppiä olevia PLL-kiinnitettyjä bakteereja. ELISA-kokeen tekeminen edellä kuvatulla taval-10 la yksittäisiä immunotyyppejä sisältävillä levyillä kuopista 1C1 ja 2H12 saaduille viljelysupernatanteille osoitti, että nämä kaksi kuoppaa sisälsivät vasta-ainetta, joka oli spesifinen sekä Fisher-immunotyypille 3 että 7. Samanlainen ELISA, joka tehtiin sarjalla P. aeruginosa -IATS-15 tyyppikantoja (saatiin ATCCrsta ja sisälsi nrot 33348 - 33364), osoitti, että kuopissa 1C1 ja 2H12 ollut vasta-aine reagoi spesifisesti IATS-kantojen 2, 5 ja 16 kanssa.

Kuopissa 1C1 ja 2H12 olleiden yhden tai useamman reagoivan vasta-aineen isotyyppi määritettiin muuten sa-20 manlaisella ELISA-määrityksellä kuin spesifisyystesteissä, mutta HRP-(vuohen anti-ihmis-IgG):tä ja HRP-(vuohen anti-ihmis-IgM)itä käytettiin yksittäisinä toisen vaiheen rea-gensseina eikä yhdistettyinä. Kuoppien 1C1 ja 2H12 yhden tai useamman vasta-aineen positiivinen reaktio Fisher-im-:·. 25 munotyyppien 3 ja 7 kanssa havaittiin vain anti-IgM-rea- '. . gensseilla, mikä osoittaa, että kunkin kuopan merkityksel- linen yksi tai useampi vasta-aine on IgM-isotyyppiä.

Sen määrittämiseksi, aiheuttiko anti-Fisher-immuno-tyyppi 3 ja 7 reaktiomallin yksi vai useampi kuoppien 1C1 *.7.· 30 ja 2H12 vasta-aihe (ts. yksi vasta-aine, joka reagoi sekä Fishcr-immunotyypin 3 että 7 kanssa, vai kaksi vasta-ainetta, joista toinen reagoi Fisher-immunotyypin 3 ja toinen Fisher-immunotyypin 7 kanssa), viljeltiin kummankin kuopan soluja pienenä tiheytenä, ja tutkittiin lisääntyviä soluja ·. 35 sisältävistä kuopista vasta-aineaktiivisuus erillisillä ·;;; Fisher-immunotyyppi 3 ja Fisher-immunotyyppi 7 -bakteeri- * · 2i 86377 antigeenilevyillä. Alaviljely tehtiin 96-kuoppaisilla pyö-reäpohjaisilla levyillä tiheytenä 5 solua/kuoppa kaikkiaan 100 Ml:ssa HAT-vällainetta, josta puuttuu aminopteriini-komponentti (HT-väliaine). Transformoimattomia, HAT:lie 5 herkkiä lymfoblastoidisoluja lisättiin kaikkiin kuoppiin 500 solua/kuoppa syöttösoluiksi. Neljän päivän kuluttua siirrostuksesta kaikkiin kuoppiin lisättiin 100 μΐ HAT-väliainetta syöttösolujen tappamiseksi selektiivisesti. Kuoppiin lisättiin 9. päivänä siirrostuksen jälkeen lisä-10 ravintoa korvaamalla puolet supernatantista HAT-väliai-neella. Sen jälkeen kuoppiin lisättiin samalla tavalla 4-5 päivän välein HT-väliainetta, kunnes lymfoblastoidi-solujen tiheys kuopissa oli riittävä supernatantin analysoimiseksi ELISA:11a. Tutkittaessa yksittäistä Fisher-im-15 munotyypin 3 ja Fisher-immunotyypin 7 antigeeniä sisältävillä levyillä kaikki supernatantit, jotka reagoivat Fisher-immunotyypin 3 kanssa, reagoivat myös Fisher-immunotyypin 7 kanssa, mikä osoittaa, että yksi vasta-aine aiheutti aktiivisuuden kummankin Fisher-immunotyypin suh-20 teen. Tutkittaessa sattumanvaraisesti valittuja superna-tantteja IATS-kantojen 2, 5 ja 16 kanssa niiden havaittiin reagoivan kaikkien kolmen kannan kanssa yksittäisten kantojen sijasta, mikä edelleen tukee sitä päätelmää, että yksi vasta-aine ristireagoi Fisher-immunotyyppien 3 ja 7 25 ja IATS-kantojen 2, 5 ja 16 kanssa.

Kuoppien 1C1 ja 2H12 spesifistä vasta-ainetta tuottavien solujen kloonaus toteutettiin tekemällä kunkin kuopan soluille useita rajalaimennuskloonauksia, kunnes kaikki edellä mainitulla ELISA-ohjelmalla analysoidut klooni-30 supernatantit antoivat tulokseksi positiivisten reaktion Fisher-immunotyyppien 3 ja 7 ja IATS-kantojen 2, 5 ja 16 kanssa. Kloonauksessa käytettiin syöttösoluja edellä ala-viljelyn yhteydessä kuvatulla tavalla. Tällä tavalla saatiin kaksi kloonattua, transformoitua ihmissolulinjaa (1C1 ·. 35 ja 2H12) , jotka ovat jatkuvia (kuolemattomia) ja jotka ;;; molemmat erittävät Fisher-immunotyyppien 3 ja 7 ja IATS- 22 86377 kantojen 2, 5 ja 16 kanssa reagoivaa ihmisen monoklonaa-lista vasta-ainetta. Tässä esimerkissä käytetään solulin-jasta ja sen tuottamasta vasta-aineesta samaa merkintää.

Esimerkki II

5 Esimerkki II valaisee menetelmiä IATS-serotyyppien 2, 5 ja 16 ja Fisher-immunotyyppien 3 ja 7 kanssa reagoivan ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen (IgG-isotyyppi) tuottamiseksi. Tuotanto-ohjelmat ovat suurin piirtein samanlaiset kuin esimerkissä I. Lyhyesti ilmaistuna ihmisen 10 B-solujen lähteenä toimi ääreisverinäyte, joka saatiin kystistä fibroosia potevalta potilaalta, jolla oli ollut krooninen P. aeruginosa -infektio. Yksisoluiset solut erotettiin muuten esimerkissä I kuvatulla tavalla, mutta käytettiin 1,6 ml PBS-suspensiota 1,6 x 109 AET-käsitellyn 15 lampaan punasolun kanssa. Soluohjattu transformointi tehtiin myös samalla tavalla seuraavin poikkeuksin: 12- ja E'PBMC-solujen suhde oli 7,5; käytettiin 15 levyä, joissa solutiheys oli 17 000/kuoppa; viljelmille annettiin lisä-ravintoa 6. ja 10. päivänä siirrostuksen jälkeen; ja 16 20 päivän kuluttua siirrostuksesta lähes kaikki kuopat sisälsivät lisääntyviä soluja.

Spesifisten vasta-aineiden tutkiminen viljelysu-pernatanteista tehtiin kuvatulla tavalla ja se johti yhden kuopan (9D1) löytämiseen, joka sisälsi vasta-ainetta, joka 25 reagoi Fisher-immunotyyppejä 3, 5, 6 ja 7 sisältävän levyn kanssa, muttei Fisher-immunotyyppejä 1, 2 ja 4 sisältävän eikä bakteerittoman levyn kanssa. Kuvatun ELISA-määrityk-sen tekeminen yksittäisen immunotyypin tai serotyypin bak-teeriantigeeniä sisältävillä levyillä käyttämällä 9Dl-vil-: 30 jelmän supernatanttia osoitti vasta-aineen, joka oli spe sifinen kummallekin Fisher-immunotyypille 3 ja 7 samoin kuin IATS-kannoille 2, 5 ja 16. Esimerkin I mukaisesti tehdyt jatkokokeet osoittivat, että kuopassa 9D1 havaittu vasta-ainespesifisyys liittyi yhteen klooniin, joka eritti 35 IgG-isotyypin vasta-ainetta.

23 86377

Esimerkki III

Esimerkki III osoittaa joidenkin tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen vasta-aineiden antigeenispesifi-syyden.

5 Sen määrittämiseksi, reagoivatko vasta-aineet 1C1, 2H12 ja 9D1 saman antigeenikohteen kanssa ja ovatko ne siten identtisiä, tehtiin lisäkokeita. Vasta-aineita verrattiin ensin ELISA:ssa käyttämällä sarjaa referenssikan-toja ja kliinisesti eristettyjä P. aeruginosa -näytteitä. 10 ELISA-ohjelraa oli edellä kuvatun kaltainen seuraavin muunnoksin: 1) PLL-päällystettyjen levyjen pinnoille adsorboitujen bakteerien sijasta levyn kuopat sisälsivät erilaisia kokonaisia bakteereja, jotka oli kiinnitetty etanolilla kuopan pohjaan. Levyt preparoitiin lisäämällä kuoppiin 15 50 μΐ pestyjen bakteerien suspensiota (OD660 = 0,2) PBS:ssä, sentrifugoimalla levyjä 20 min kiihtyvyydellä 500 x g, imemällä pois PBS, lisäämällä 75 μΐ etanolia 10 min:n ajaksi, poistamalla etanoli ja ilmakuivaamalla sitten. Antigeenilevyillä olivat IATS-kannat 2, 5, 11 ja 20 16 (ATCC-nrot 33349, 33352, 33358 ja vastaavasti 33363) ja 16 kliinisesti eristettyä näytettä, jotka oli ennalta tyypitetty sekä agglutinoimalla Difcon (Detroit, Michigan) Bacto-Pseudomonas aeruginosa -antiseerumin kanssa valmistajan ohjeiden mukaisesti että ELISA:11a (tässä kuvatulla 25 tavalla) serotyypeiksi 2, 5, 16 tai näiden serotyyppien yhdistelmäksi; 2) kanin tyypitysantiseerumeja käytettiin laimennettuina suhteessa 1:500 PBS:llä lukuun ottamatta anti-IATS 16-vasta-ainetta, joka laimennettiin suhteessa 1:250. Viljelysupernatantit, jotka sisälsivät 1C1-, 2H12-30 ja 9Dl-vasta-aineita, käytettiin sellaisinaan; 3) toisen vaiheen reagensseina käytettiin biotinyloitua proteiini A:ta (B-2001, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) laimennettuna suhteessa 1:500 ja biotinyloitua vuohen an-ti-ihmis-Ig:tä (4703, Tago, Inc., Burlingame, CA) laimen-35 nettuna suhteessa 1:500 kanin ja vastaavasti ihmisen vasta-aineiden detektointiin. 50 μΐ reagenssia lisättiin 24 86377 asianmukaisiin kuoppiin, sitoutumaton reagenssi poistettiin, kun oli inkuboitu 30 min huoneen lämpötilassa, ja kuopat pestiin kolmesti. Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 μΐ ennalta muodostettua avidiinin ja biotinyloidun 5 piparjuuriperoksidaasin kompleksia (Vectastain ABC Kit,

Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Kun oli inkuboitu 30 min huoneen lämpötilassa, ylimääräinen Vectastain ABC -reagenssi poistettiin ja kuopat pestiin uudelleen kolmesti ennen substraatin lisäämistä.

10 Kuten taulukossa II esitetään, kokeen tulokset osoittivat, että vaikka vasta-aineet 1C1 ja 9D1 reagoivat jokaisen kliinisesti eristetyn näytteen kanssa, joka oli tyypitetty IATS 2, 5 tai 16 -serotyypiksi, ei vasta-aine 2H12 reagoinut kolmen tällaisen näytteen kanssa. Tämä 15 viittaa siihen, että vasta-aine 2H12 tunnisti eri epitoo-pin kuin 1C1 ja 9D1 ja että nämä kaksi epitooppia esiintyvät ilmeisesti rinnakkaisina useimmissa muttei kaikissa kliinisesti eristetyissä näytteissä, jotka vastaavat IATS-serotyyppejä 2, 5 tai 16.

20

Taulukko II

Difcon Bacto-P. aeruginosa -antiseerumien ja ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden 2H12, 1C1 jaa 9D1 25 reagointi tyyppikantojen ja kliinisesti eristettyjen P. aeruginosa -näytteiden kanssa

Tyyppikanta tai Kaniini Ihminen kliinisesti eris-_ _ 30 tetty näyte IATS IATS IATS IATS MAb MAb MAb _Ct2 0t5 ot!6 all 2H12 1C1 9D1 IATS 2 +-- - + + + IATS 5 ( + )3+- - + + + IATS 16 (+)3 (+)3 + - + + + 35 IATS 11 --- + ___ 25 86 3 7 7

Taulukko II jatkuu

Tyyppikanta tai Kaniini Ihminen kliinisesti eris-_ _ tetty näyte IATS IATS IATS IATS MAb MAb MAb 5 _ot2 a5 αΐβ all 2H12 1C1 9D1 A523 + + - + + + B406 + + ( + )3 - + + + C27 + + - + + + D26 + + - + + + 10 F155 + + + - + + + F225 + (+)3 + - + + + F250 + + - - + + + F253 + - + + + F255 + + - - + + 15 F256 + - + + F396 + + + - + + + H217 + + + - + + + H218 + + - + + + H219 + - + + + 20 H220 + + - + + + H221 + + - + + (+)a = ELISA-reaktio hyvin heikosti positiivinen.

25 Tulokset viittasivat lisäksi siihen, että vasta- aineiden 1C1 ja 9D1 tunnistama molekyylikohde oli todennäköisesti läsnä kaikissa kliinisesti eristetyissä P. aeruginosa -näytteissä, jotka voitiin tyypittää kuuluviksi IATS-serotyyppiin 2, 5 tai 16, kun taas vasta-aineen 2H12 30 tunnistama kohde esiintyi tällaisten eristettyjen näytteiden alaryhmässä.

Sen määrittämiseksi, reagoivatko 1C1-, 2H12- ja 9Dl-vasta-aineet erilaisten antigeenien vai vaihtoehtoisesti saman antigeenin eri epitooppien kanssa, jolloin 35 nämä epitoopit esiintyisivät useammissa muttei kaikissa 26 86377 IATS 2, 5 ja 16-serotyypeissä, tehtiin immunoblottausana-lyysi. Koska IATS-kantojen 2, 5 ja 16 yhteinen antigeeni-syys on ilmeisesti lämpöstabiilien antigeenien aiheuttama (Liu, P.V. et ai., supra) ja koska lämpöstabiilisuus on 5 aiemmin mainittu lipopolysakkaridimolekyylien luontainen ominaisuus, valittiin IATS-kannoista 2, 5 ja 16 tehdyt LPS-preparaatit analysoitaviksi antigeenipreparaateiksi. Raaka-LPS valmistettiin tyyppikannoista uuttamalla fysiologisella suolaliuoksella lämpötilassa 60 °C [Orskov, F. 10 et ai., Acta. Path. Microbiol. Scand. Section B 79 (1971) 142 - 152]. Kunkin serotyypin LPSrlle (10 μg, määritettynä 2-keto-3-deoksioktonaatti(KDO) -sisällön perusteella) [Karkhanis, Y.D. et ai., Anal.Biochem. 85(1978) 595 - 601] tehtiin natriumdodekyylisulfaattipolyakyyliamidigeeli-15 elektroforeesi (SDS-PAGE) [Hancock, R.E.W. ja Carey, A.M., J. Bacteriol. 149 (1977) 901 - 910] geelillä, jossa vallitsi pitoisuusgradientti 10 —> 20 %. Erottuneet molekyy-lilajit siirrettiin geeliltä nitroselluloosakaIvoon (NCM) kirjallisuudessa kuvatulla tavalla [Towbin, H. et ai., 20 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979) 4350 - 4354] ja NCM-kalvoa suojattiin pitämällä yksi tunti Tweeniä sisältävässä PBS:ssä [Batteiger, B. et ai., J. Immunol. Meth. 55 (1982) 297 - 307]. Sitten kalvoja inkuboitiin yksi tunti huoneen lämpötilassa 20 mltssa käytettyä viljelysuperna-25 tanttia, joka saatiin solulinjasta 1C1, 2H12 tai 9D1. Ku-. . takin NCM-kalvoa huuhdottiin 5 min Tveeniä sisältävällä PBS:llä ja inkuboitiin sitten yksi tunti 25 °C:ssa alkali-seen fosfataasiin liitetyn vuohen anti-ihmis-(IgG + IgA + IgM):n (Zymed) kanssa, joka oli laimennettu suhteessa 30 1:1 000 tai 1:1 500 PBS-Tween-seoksella. Kalvoja pestiin sitten 5 min PBS-Tweenissä, minkä jälkeen antigeeni-vasta-ainevuorovaikutukset visualisoitiin inkuboimalla kalvoja ' 15 - 20 min lämpötilassa 25 °C 30 ml:ssa nitrosininentet-

ratsolium/5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatti (NBT-BCIP) -35 substraattia Leary et ai.'n [Proc. Natl. Acad. Sei. USA

27 86377 80 (1983) 4045 - 4049] kuvaamalla tavalla. Värin kehittyminen pysäytettiin huuhtomalla kalvo useaan kertaan de-ionisoidulla vedellä.

Näillä kolmella vasta-aineella saadut kalvokuviot 5 olivat selvästi erilaiset. Vasta-aine 2H12 tunnisti pääasiassa lyhyen sarjan säännöllisin välimatkoin esiintyviä (ts.tikapuumainen kuvio) pienimolekyylipainoisia molekyylejä serotyypeistä 2, 5 ja 16 valmistetuissa antigeeni- preparaateissa. Tämä vasta-aine tunnisti myös heikosti 10 joitakin säännöllisin välimatkoin esiintyviä suurempia molekyylejä. Serotyypistä 11 tehdyllä LPS-preparaatilla ei havaittu reaktiota. Immunoblottausanalyysin toistaminen käyttämällä LPS-preparaatteja, jotka oli käsitelty ennalta proteinaasi K:11a lämpötilassa 60 °C proteiiniantigee-15 nien tuhoamiseksi, ei muuttanut kuvioita. Pienimolekyy-lipainoiset vyöhykkeet vastasivat tarkalleen LPS-molekyy-lien pienempiä muotoja, jotka oli visualisoitu samalla tavalla tehdyllä SDS-PAGE-geelielektroforeesilla, jossa antigeenejä ei siirretty NCMtään vaan värjättiin spesifi-20 sesti LPS:n läsnäolon toteamiseksi [Tsai, C.M. ja Frasch, C.E., Anal. Biochem. 119 (1982) 115 - 119], paitsi että hopealla värjätyn geelin alin vyöhyke (joka vastaa ydinaluetta + LPS:n lipidi A:ta) ei tullut tunnistetuksi. Vasta-aine 1C1 tunnisti saman sarjan säännöllisin välimatkoin 25 esiintyviä pieniä molekyylejä serotyypeistä 2, 5 ja 16 mutta ei serotyypistä 11 tehdyistä antigeenipreparaateis-ta, vaikka reaktion intensiteetti ei ollut yhtä suuri kuin 2H12:lla. Tämä vasta-aine tunnisti kuitenkin lisäksi myös voimakkaasti sarjan säännöllisin välimatkoin esiintyviä • 30 suurempia molekyylejä serotyypeistä 2, 5 ja 16, mikä yhdessä tunnistettujen pienempimolekyylipainoisten vyöhykkeiden kanssa johti selviin, täysin tikapuumaisiin kuvioihin. Antigeenipreparaattien esikäsittely proteinaasi K:11a ei muuttanut näitä kuvioita. Kuviot vastasivat tälläkin 35 kertaa tikapuumaisia vyöhykekuvioita, joita havaittiin 28 8 6 3 7 7 LPS-spesifisesti värjätyillä geeleillä (ts. ne näyttivät vastaavan toisiaan vyöhyke vyöhykkeeltä), paitsi että ydintä + lipidi A:ta vastaava vyöhyke ei tullut tunnistetuksi. Vasta-aineella 9D1 oli samanlainen reaktiokuvio 5 kuin vasta-aineella 1C1 IATS-kantojen 2, 5 ja 16 mutta ei IATS-kannan 11 suhteen. Tälläkään kertaa eri LPS-prepa-raattien hopeavärjätyn geelin tikapuukuvion alimmainen vyöhyke ei tullut tunnistetuksi, eikä LPS-preparaattien esikäsittely proteinaasi K:11a muuttanut kokonaiskuviota. 10 Nämä havainnot osoittivat yhdessä, että serotyyppien 2, 5 3a 16 LPS oli vasta-aineiden 2H12, 1C1 ja 9D1 tunnistama mo1ekyy1ikohde.

Esimerkki IV

Esimerkki IV osoittaa erään tämän keksinnön mukai-15 sesti valmistetun vasta-aineen suojaavan vaikutuksen.

Vasta-aineen 1C1 suojaavan tehon in vivo toteamiseksi tehtiin eläinten suojauskokeita hiirillä. lCl-vas-ta-aine konsentroitiin ensin käytetystä viljelysuperna-tantista seostamalla kyllästetyllä ammoniumsulfaattiliuok-20 sella (loppupitoisuus 50 %) (Good, A.H. et ai, Selected Methods in Cellular Immunology, toim. Mishell, B.B. ja Shiigi, S.M., W.J. Freeman & Co, San Francisco, CA, 1980, ss. 279 - 286). Saostunut materiaali sekoitettiin mahdollisimman pieneen määrään steriiliä vettä, dialysoitiin 25 perusteellisesti PBS:ää vastaan ja steriilisuodatettiin.

Negatiiviseksi vertailunäytteeksi käsiteltiin samalla tavalla viljelysupernatanttia, joka saatiin eräästä transformoidusta ihmissolulinjasta (6F11, ATCC-nro CRL 8562), joka tuottaa IATS-kannan 11 LPS:lie spesifistä monoklonaa- 30 lista vasta-ainetta.

BALB/c-naarashiiret, jotka painoivat 20 - 22 g, jaettiin kahteen 30 hiiren ryhmään. Kaikki molempien ryh-: mien hiiret inokuloitiin intraperitoneaalisesti 0,5 ml:11a konsentroitua 1C1- tai 6Fll-vasta-ainetta. Kuuden tunnin 35 kuluttua kumpikin ryhmä jaettiin kolmeen 10 hiiren ala- 29 86377 ryhmään ja kaikille kunkin 10 hiiren ryhmän jäsenille annettiin yksitellen intraperitoneaalisesti 0,3 ml elävien bakteerien suspensiota, joka sisälsi 5 x LD5Q-määrän IATS-kantaa 2, 5 tai vastaavasti 16. Bakteerisuspensiot valmis-5 tettiin logaritmisessa kasvuvaiheessa olevasta liemivilje-lystä, josta bakteerit erotettiin sentrifugoimalla, pestiin kahdesti PBSrllä ja suspendoitiin takaisin sopivaksi tiheydeksi PBS:ään. Vertailuryhmiin, jotka koostuivat neljästä tai viidestä hiirestä, injektoitiin intraperitoneaa-10 lisesti 0,5 ml PBSrää ja kuuden tunnin kuluttua 5 x LD5Q-määrä samoja serotyyppejä. Eläimiä seurattiin viisi päivää bakteeri-infektoinnin jälkeen.

Kuten taulukossa III esitetään, vasta-aine 1C1 antoi spesifisen ja merkittävän suojan tappavaa määrää vas-15 taan sekä IATS 2 että IATS 5 -serotyyppejä muttei IATS 11-serotyyppiä vastaan. Bakteeri-infektointia seuraavaan tyypilliseen tapahtumasarjaan liittyi kaikilla suojaamattomilla eläimillä vaihtelevan pituinen endotoksinen shokki, jota seurasi tavallisesti kuolema. Pelkkää PBS:ää saaneet 20 vertailueläimet kävivät läpi akuutin endotoksisen shokin ja kuolivat kaikki nopeasti. Negatiivisilla vertailueläi-millä, joille annettiin ei-homologista vasta-ainetta (6F11), esiintyi pitkittyneempi shokkijakso, jolle olivat luonteenomaisia taulukon III alahuomautuksessa "a" luetel-25 lut oireet. Jotkut näistä eläimistä toipuivat lopulta, mahdollisesti vasta-ainepreparaatteihin rinnan väkevöityneen ei-vasta-ainekomponentin ansiosta. Suojaavaa homologista vasta-ainetta saaneissa eläimissä esiintyi kuitenkin vain vähäisiä endotoksemiaoireita. Nämä oireet hävisivät 30 24 tunnin kuluessa inokuloinnista, ja eläimet näyttivät terveiltä loppuajan viiden päivän tarkkailujaksosta.

30 86377

Taulukko III

Ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen 1C1 suojaus-vaikutuksen IATS-serotyyppejä 2 ja 5 vastaan osoittaminen in vivo 5

Monoklonaalinen Eloonjääneiden lkra/infektoitujen eläin-vasta-aine ten lkm 5 vrk:n kuluttua infektoinnista _IATS 2:11a IATS 5:llä IATS ll:llä 1C1 8/10 10/10 3/10a 10 6F11 0/10 l/10a 10/10 PBS 0/4 0/4 0/4 aNiissä tapauksissa, joissa havaittiin epäspesifinen suojaus, toipuminen infektiosta oli selvästi erilainen 15 kuin se, mikä havaittiin homologisten vasta-aineiden ja infektoivien kantojen kesken, ts. lCl:llä IATS 2:n tai 5:n kanssa ja 6Fll:llä IATS ll:n kanssa. Viimeksi mainituissa tapauksissa toipuminen oli suurin piirtein täydellinen, ja eläimet näyttivät normaaleilta 24 tunnin kuluttua baktee-20 ri-infektoinnista. Epäspesifisissä tapauksissa eläimissä esiintyi kuitenkin merkkejä akuutista infektiosta (ts ripuli, ruvettuneet silmäluomet, takkuinen turkki, "kumara" profiili ja hidas liikkuminen) useita päiviä ennen palautumista normaalitilaan. Tällainen epäspesifinen suojaus 25 aiheutuu ilmeisesti ei-vasta-ainekomponenteista, joita rikastuu mukaan ja tulee siten injektoiduiksi eläimiin, sillä kaikki pelkkää PBS:ää saaneet eläimet kuolivat.

Käyttämällä samaa ohjelmaa tehtiin toinen koe, jossa hiiriryhmät infektoitiin Fisher-kannoilla 2, 3 tai 7 ja :: 30 niitä tarkkailtiin viisi päivää. Kuten taulukossa IV esitetään, antoi vasta-aine lei tälläkin kertaa spesifisen ja merkittävän suojan muutoin tappavaa Fisher-immunotyyppi 3 ja 7 -infektiota vastaan, mutta oli tehoton Fisher-immuno-tyyppiä 2 vastaan.

35 3i 86 377

Taulukko IV

Ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen 1C1 suojaus- vaikutuksen Fisher-immunotyyppejä 3 ja 7 vastaan osoittaminen in vivo 5

Ihmisen monoklo- Eloonjääneiden lkm/infektoitujen eläin-naalinen vasta- lkm 5 vrk:n kuluttua infektoinnista aine_Fisher 3:11a Fisher 7:llä Fisher 2:11a 1C1 10/10 10/10 l/10a 10 6F11 0/10 7/103 10/10 PBS 0/5 0/5 0/5 aEloonjääminen mitä todennäköisimmin epäspesifisen suojauksen ansiosta, kuten taulukon III alaviitteessä kuva-15 taan.

Esimerkki V

Esimerkki V kuvaa menetelmää P. aeruginosan IATS-serotyyppien 4 ja 11 ja Fisher-immunotyypin 2 kanssa reagoivan ihraisen monoklonaalisen vasta-aineen valmistusta. 20 Toistettiin muuten esimerkeissä I - IV kuvattu menettely, mutta oli välttämätöntä tehdä tiettyjä muunnoksia tässä esimerkissä kuvattavan vasta-aineen eristämiseksi, karak-terisoimiseksi ja tutkimiseksi. Seuraavassa esitetään tehdyt muutokset menettelyihin ja tässä kuvattavalla mono-25 klonaalisella vasta-aineella saadut tulokset.

Ihmisen B-solujen lähteenä oli henkilö, joka oli aiemmin immunisoitu suurimolekyylipainoisella polysakkari-dipreparaatilla, joka oli eristetty Fisher-immunotyyppistä 3 (Pier, G.B., et ai., Infect. Immun. 45 (1984) 309 - 313, 30 joka mainitaan tässä viitteenä).

E“PBMC:n soluohjattu transformointi tehtiin viljelemällä näitä soluja yhdessä transformoivan solulinjan 1A2 kanssa. Logaritmisen kasvun vaiheessa olevat lA2-solut suspendoitiin HAT-vällaineeseen ja yhdistettiin sitten 35 E~PBMC-soluihin suhteessa 15 lA2-solua/yksi E~PBMC-solu.

32 86377

Soluseos siirrostettiin 14 mikrotiitterilevylle pitoisuudeksi 62 000 solua/kuoppa tilavuuden ollessa 200 μΐ/kuop-pa. Viljelmiin lisättiin ravintoa päivinä 7 ja 11 siirros-tuksen jälkeen ja havaittiin, että päivään 15 mennessä 5 kaikki kuopat sisälsivät lisääntyviä soluja.

Anti-P. aeruginosa-vasta-aineiden läsnäolon tutkimiseksi käytettiin kahta antigeenilevyä, jotka olivat: (1) levy, joka sisälsi P. aeruginosa-Fisher-immunotyyppien 1-7 seosta (ATCC-nrot 27312, 27313, 27314, 27315, 27317 10 ja vastaavasti 27318); ja (2) PLL-käsitelty, bakteereja sisältämätön mikrotiitteri-levy.

Analysoimalla viljelysupernatantit edellä olevien esimerkkien mukaisella menetelmällä identifioitiin noin 15 100 kuoppaa, jotka sisälsivät anti-P. aeruginosa-vasta- aineita, jotka reagoivat Fisher-immunotyyppejä 1-7 sisältävän levyn kanssa muttei PLL-käsitellyn, bakteereja sisältämättömän levyn kanssa. Jotta saataisiin identifioiduksi tunnistetut yksi tai useampia Fisher-immunotyyp-20 pejä, konstruoitiin edellä kuvatulla tavalla antigeenile-vyjä, joissa kukin rivi sisälsi vain yhtä Fisher-immuno-tyyppiä olevia, PLLrllä kiinnitettyjä bakteereja. Tehtiin edellä kuvatulla tavalla ELISA-määritys, jossa kustakin anti-P. aeruginosa-positiivisesta kuopasta saatua viljely-25 supernatanttia laitettiin riveittäin uusille antigeenile- vyille, jolloin identifioitiin joukko kuoppia, jotka sisälsivät Fisher-immunotyypille 2 spesifistä vasta-ainetta. Jotta saataisiin tarkemmin analysoiduksi Fisher-immunotyy-pin 2 vastaisten vasta-aineiden serologinen spesifisyys, 30 tutkittiin supernatantit samanlaisella ELISA-määrityksel- lä, joka tehtiin antigeenilevyillä, jotka sisälsivät kutakin P. aeruginosan 17 IATS-serotyypistä erillisissä kuopissa. Tämän kokeen tulokset osoittivat, että suuri enemmistö supernatanteista oli spesifinen IATS-serotyypille 35 11, vaikka yksi supernatantti, kuopassa 6D6 oleva, olikin 33 86377 ristireaktiivisesti spesifinen IATS-serotyypeille 4, 11, 13 ja 14.

Jotta saataisiin määritetyksi, aiheutuiko IATS-serotyyppien 4, 11, 13 ja 14 vastainen reaktioinani yh-5 destä vai useammasta, kuopassa 6D6 olevasta vasta-aineesta, adsorboitiin lisänäytteitä kuopan 6D6 supernatantista erikseen IATS-serotyyppien 4, 7 (negatiivinen vertailunäy-te), 11, 13 ja 14 kanssa ja testattiin adsorboituneet su-pernatantit sitten kutakin viittä IATS -serotyyppiä ole-10 villa, PLL-kiinnitetyillä bakteereilla edellä esitetyllä ELISA-menetelmällä. Adsorboinnit tehtiin suspendoimalla tiivistetty bakteerisolupelletti takaisin yhtä suureen tilavuuteen supernatanttia yhden tunnin ajaksi jäähautees-sa, minkä jälkeen supernatantti erotettiin bakteereista 15 sentrifugoimalla. Tämän kokeen tulokset osoittivat, että IATS-serotyypit 4 ja 11 adsorboivat toistensa vastaista vasta-aineaktiivisuutta mutta eivät aktiivisuutta IATS-serotyyppejä 7, 13 eikä 14 vastaan. Tämä osoitti, että kuopassa 6D6 esiintyi ainakin kahta erilaista anti-P. ae-20 ruginosa-vasta-ainetta, joista ainakin yksi ristireagoi IATS-serotyyppien 4 ja 11 kanssa.

Asianmukaista vasta-ainetta tuottavien kuopan 6D6 solujen eristäminen ja kloonaus tehtiin kolmessa vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa alaviljeltiin soluja pienenä 25 tiheytenä (20 solua/kuoppa) ja tehtiin toinen pienitiheyk-sinen alaviljely (5 solua/kuoppa) soluille, joita saatiin anti-IATS-serotyypit 4+11 -positiivisesta kuopasta, joka oli muodostunut ensimmäisessä pienitiheyksisessä alavilje-lyssä (20 solua/kuoppa). Kukin alaviljely tehtiin 96-kuop-30 paisilla, pyöreäpohjaisilla levyillä mainittuna tiheytenä kaikkiaan 100 μΐιβββ HAT-väliainetta, josta puuttui ami-nopteriinikomponentti (HT-väliaine). Kaikki kuoppiin lisättiin transformoimattomia, HAT-herkkiä lymfoblastoidiso-luja syöttösoluiksi tiheydeksi 500 solua/kuoppa. Neljän 35 vrk:n kuluttua viimeisestä siirrostuksesta kaikkiin kuop- 34 8 6 3 7 7 piin lisättiin 100 μΐ HAT-vällainetta syöttösolujen tappamiseksi selektiivisesti. Soluille annettiin lisäravintoa uudelleen 9 vrk:n kuluttua siirrostuksesta korvaamalla puolet supernatantista HAT-väliaineella. Sen jälkeen so-5 luille lisättiin samalla tavalla ravintoa 4-5 vrk:n välein lisäämällä HAT-vällainetta, kunnes kuopissa vallitsi riittävä lymfoblastoidisolutiheys supernatantin analysoimiseksi ELISA:11a edellä kuvatulla tavalla.

Supernatantit, jotka reagoivat IATS-serotyypin 4 10 kanssa, reagoivat kussakin kokeessa myös IATS-serotyypin 11 ja Fisher-immunotyypin 2 kanssa. Lisäksi IATS-serotyyp-pien 13 ja 14 vastainen vasta-aineaktiivisuus oli hävinnyt, mikä vahvistaa aiemmat spesifisyysmääritelmät.

Spesifistä vasta-ainetta tuottavat solut kloonat-15 tiin siirrostamalla ensin solut hyvin pieneksi tiheydeksi (laskennan mukaan yksi solu/kuoppa) 72-kuoppaisille Tera-saki-levyille (Nunc nro 1-36538) tilavuuden ollessa 10 μΐ/kuoppa. Levyt sijoitettiin inkubaattoriin kolmeksi tunniksi, jotta solut pääsivät asettumaan levyn pohjalle, 20 ja tutkittiin sitten mikroskooppisesti kahden eri henkilön toimesta yhden solun sisältävien kuoppien toteamiseksi. Kukin näistä soluista sijoitettiin sitten yksitellen 96-kuoppaisen, pyöreäpohjäisen levyn kuoppiin yhdessä syöttö-solujen kanssa ja tehtiin viljely edellä pienitiheyksisen 25 alaviljelyn yhteydessä kuvatulla tavalla. Kaikkien syntyneiden kloonien supernatantit olivat positiivisia IATS-serotyyppejä 4 ja 11 vastaan edellä kuvatulla ELISA-mene-telmällä tutkittaessa.

Täten saatiin kloonattu transformoitu ihmissolu-30 linja, joka kasvaa jatkuvasti (on kuolematon) ja erittää ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta, joka reagoi Fisher-immunotyypin 2 kanssa ja on ristireaktiivinen IATS-serotyyppien 4 ja 11 kanssa. Tässä esimerkissä solulin-jasta ja sen tuottamasta vasta-aineesta käytetään samaa 35 merkintää (ts. 6D6).

35 86377

Kuopan 6D6 sisältämän vasta-aineen isotyyppi määritettiin muuten samanlaisella ELISA-menetelmällä kuin edellä kuvattujen spesifisyystestien yhteydessä, mutta toisen vaiheen reagenssina käytettiin HRP-(vuohen anti-ihmis-5 IgG):tä ja HRP-(vuohen anti-ihmis-IgM):ää erikseen eikä yhdistettyinä. Kuopan 6D6 vasta-aineen positiivinen reaktio Fisher-immunotyypin 2 ja IATS-serotyyppien 4 ja 11 kanssa havaittiin vain anti-IgM-reagenssilla, mikä osoittaa, että tämä vasta-aine on IgM-isotyyppiä.

10 6D6-vasta-aineen tunnistaman molekyylilajin bioke miallinen karakterisointi tehtiin immunoblottausanalyy-sillä muuten edellä esimerkissä 3 kuvatulla tavalla, mutta analyysissä käytettäviksi antigeenipreparaateiksi valittiin Fisher-immunotyypistä 2 ja IATS-serotyypeistä 4 ja 15 11 tehdyt LPS-preparaatit. Fisher-immunotyypistä 1 tehty LPS-preparaatti otettiin mukaan negatiiviseksi vertailu-näytteeksi .

Kukin epäpuhdas LPS-preparaatti laimennettiin ennen analyysiä suhteessa 1:1 hajotuspuskurilla [0,125 mol/1 20 Tristiä, 4 % (paino/tilavuus) natriumdodekyylisulfaattia (SDS), 20 tilavuus-% glyserolia, 10 tilavuus-% , 0-mer-kaptoetanolia, 0,4 % (paino/tilavuus) bromifenolisinistä, pH 6,87] ja sonikoitiin hauteessa 5 min. Näytteissä olevien proteiinien hajottamiseksi lisättiin kuhunkin näyt-25 teeseen proteinaasi K -liuosta (1 mg/ml vedessä) entsyymi-määrän ollessa 40 paino-% LPS:n määrästä, ja inkuboitiin 60 °C:ssa 2 tuntia sonikoiden hauteessa 5 min:n ajan yhden tunnin inkuboinnin jälkeen. Sitten näytteitä pidettiin 5 min 100 °C:n lämpötilassa ja sentrifugoitiin 2 min mik-30 rosentrifugissa.

Selkeytetyille näytteille, jotka vastasivat 10 mg LPS:ää kustakin bakteerikannasta, tehtiin SDS-polyakryy-liamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) edellä kuvatulla tavalla. Kun erotettu molekyylilaji oli siirretty NCM:ään, 35 inkuboitiin NMC:iä kaksi tuntia huoneen lämpötilassa yh- 36 86377 dessä 6D6-solulinjan käytetyn viljelysupernatantin kanssa. Menettely oli muuten edellä kuvatun kaltainen.

Positiivisia tuloksia havaittiin vain niillä kaistoilla, jotka sisälsivät Fisher-immunotyypin 2, IATS-sero-5 tyypin 4 tai IATS-serotyypin 11 LPS:ää. Fisher-immunotyyp-piä 2 ja lATS-serotyyppiä 11 vastaavilla kaistoilla vasta-aine 6D6 tunnisti lyhyen sarjan säännöllisin välimatkoin (tikapuumaisesti) esiintyviä pieniä molekyylejä, jotka vastaavat täsmälleen LPS-molekyylien pienempiä muotoja, 10 jotka saatiin näkyviin samalla tavalla suoritetussa SDS-PAGE:ssa, jossa antigeenejä ei siirretty NCM:ään, vaan värjättiin spesifisesti LPS:n läsnäolon toteamiseksi; ainoa ero oli se, ettei hopeavärjätyllä geelillä esiintyvää alinta vyöhykettä (joka vastaa ydinaluetta + LPS:n lipidi 15 A:ta) tunnistettu. IATS-serotyypin 4 LPS:ää sisältävällä kaistalla vasta-aine tunnisti sitä vastoin täyden sarjan säännöllisin välimatkoin sijaitsevia vyöhykkeitä, jotka kattoivat lähes koko geelin pituuden; intensiivisimmät reaktiot tapahtuivat suurempia molekyylipainoja vastaavis-20 sa vyöhykkeissä. Kuvio vastasi tälläkin kertaa tikapuumai-sta vyöhykekuviota, joka havaittiin LPS-spesifisesti värjätyllä geelillä (ts. kuviot vastasivat toisiaan vyöhyke vyöhykkeeltä) ; ainoa poikkeus oli se, ettei ydintä + lipidi A:ta edustavaa vyöhykettä havaittu. Nämä tulokset 25 osoittavat selvästi, että LPS:n O-sivuketju oli molekyyli-kohde, jonka vasta-aine 6D6 tunnisti Fisher-immunotyypillä 2 ja IATS-serotyypeillä 4 ja 11.

Vasta-aineen 6D6 suojausvaikutuksen in vivo toteamiseksi tehtiin eläinten suojauskokeita hiirillä. Vasta-30 aine 6D6 konsentroitiin ensin käytetystä viljelysuperna-tantista saostamalla kyllästetyllä ammoniumsulfaattiliuok-sella (loppupitoisuus 50 %) . Saostettu materiaali liuotet-: tiin takaisin mahdollisimman pieneen määrään steriiliä vettä, dialysoitiin perusteellisesti PBS:ää vastaan ja 35 steriilisuodatettiin. Negatiiviseksi vertailunäytteeksi 37 86 3 77 käsiteltiin samalla tavalla käytetty viljelysupernatant-ti, joka saatiin toisesta transformoidusta ihmissolulin-jasta (C5B7, ATCC-nro CRL 8753), joka tuottaa Fisher-immu-notyypin 1 LPS:lle spesifistä ihmisen monoklonaalista vas-5 ta-ainetta. Positiiviseksi vertailunäytteeksi väkevöitiin samalla tavalla käytettyä viljelysupernatanttia, joka saatiin transformoidusta ihmissolulinjasta 6F11 (ATCC-nro CRL 8562), joka tuottaa Fisher-immunotyypin 2 ja IATS -sero-tyypin 11 LPSrlle spesifistä ihmisen monoklonaalista vas-10 ta-ainetta.

Swiss-Webster-naarashiiret, jotka painoivat 20 - 22 g, jaettiin kolmeen 20 hiiren ryhmään. Kaikki kunkin ryhmän hiiret inokuloitiin intraperitoneaalisesti 0,5 ml:11a konsentroitua vasta-ainetta 6D6, C5B7 tai 6F11. 15 Kukin kolmesta ryhmästä jaettiin kuuden tunnin kuluttua neljään viiden hiiren alaryhmään ja kunkin viiden hiiren ryhmän jäsenet infektoitiin intraperitoneaalisesti 0,3 ml:11a eläviä bakteereja sisältävää suspensiota, joka sisälsi 8 x LD50-annoksen Fisher-immunotyyppiä 1, Fisher-20 immunotyyppiä 2, IATS-serotyyppiä 4 tai vastaavasti IATS- serotyyppiä 11. Bakteerisuspensiot valmistettiin edellä esimerkissä IV kuvatulla tavalla. Bakteeri-infektoinnin jälkeen eläimiä tarkkailtiin 5 vrk. Tulokset olivat seu-raavat.

25

Taulukko V

Ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen 6D6 suojaus-vaikutuksen Fisher-immunotyyppiä 2 ja IATS-sero-tyyppejä 4 ja 11 vastaan osoittaminen in vivo 30

Ihmisen mono- Eloonjääneiden lkm/tutkittujen lkm klonaalinen 5 vrk:n kuluttua infektoinnista vasta-aine Fisher l:llä Fisher 2:11a IATS 4:llä IATSll:llä 6D6 0/5 5/5 4/5 5/5 35 6F11 0/5 5/5 0/5 5/5 C5B7 5/5 1/5 0/5 0/5 38 86377

Kuten taulukosta V ilmenee, vasta-aine 6D6 antoi spesifisen ja merkittävän suojan Fisher-immunotyypillä 2, IATS-serotyypillä 4 ja IATS-serotyypillä 11 tehtyä tappavaa infektointia vastaan, muttei Fisher-immunotyyppiä l 5 vastaan.

Esimerkki VI

Esimerkki VI valaisee menetelmää ihmisen mono-klonaalisen vasta-aineen, joka reagoi P. aeruginosan IATS-serotyyppien 6 ja 13 ja Fisher-immunotyypin 1 kanssa, valio mistamiseksi. Toistettiin muuten esimerkeissä I - V kuvattu menettely, mutta oli välttämätöntä tehdä tiettyjä muutoksia tässä esimerkissä kuvattavan vasta-aineen eristämiseksi, karakterisoimiseksi ja tutkimiseksi. Seuraavassa esitetään menettelyihin tehdyt muutokset ja tässä kuvat-15 tavalla monoklonaalisella vasta-aineella saadut tulokset.

Ihmisen B-solujen lähde oli henkilö, joka oli aiemmin immunisoitu suurimolekyylipainoisia polysakkarideja sisältävällä preparaatilla, joka oli eristetty Fisher-immunotyypistä 2 (Pier et ai., Infect. Immun. 34 (1981) 20 461). Kun oli kerätty E”PBMC edellä kuvatulla tavalla, solut jäädytettiin FCS:ssa, joka sisälsi 10 tilavuus-% DMS0:ta, nestetyppisäiliössä. Nämä solut sulatettiin myöhemmin nopeasti lämpötilassa 37 °C, pestiin kerran Iscoven väliaineella ja suspensoitiin HAT-väliaineeseen. Soluoh-25 jattu transformointi tehtiin suhteessa 15 lAl-solua/yksi E“PBMC-solu. Soluseos siirrostettiin 20 mikrotiitterilevyl-le pitoisuudeksi 78 500 solua/kuoppa. Viljelmille annettiin lisäravintoa 3-5 vrk:n välein, ja 11 vrk:n kuluttua havaittiin, että kaikki kuopat sisälsivät lisääntyviä so-30 luja.

Anti-P. aeruginosa-vasta-aineiden läsnäolon toteamiseksi supernatanteista ELISA-menetelmällä käytettiin antigeenilevyä, joka sisälsi P. aeruginosa-Fisher-immuno-tyyppien 1-7 seosta (kliinisesti eristetty näyte PSA 35 1277 (Genetic Systems Corporation Organism Bank, "GSCOB"), 39 8 6 s 17 ATCC 27313, PSA G98 (GSCOB), ATCC 27315, PSA F625 (GSCOB), ATCC 27317 ja vastaavasti ATCC 27318). Kokeessa käytettiin myös PLL-käsiteltyä mikrotiitterilevyä, joka ei sisältänyt bakteereja.

5 Analysoimalla viljelysupernatantit edellä kuvatulla menetelmällä identifioitiin noin 200 kuoppaa, jotka sisälsivät anti-P. aeruginosa-vasta-aineita, jotka reagoivat Fisher-immunotyyppejä 1-7 sisältävän levyn mutta eivät PLL-käsitellyn, bakteerittoman levyn kanssa. Jotta saatai-10 siin identifioiduksi kuopat, jotka sisälsivät kahden tai useamman IATS-serotyypin kanssa reagoivaa vasta-ainetta, muodostettiin edellä kuvatulla tavalla antigeenilevyt, joissa levyjen rivit sisälsivät vain yhtä IATS-serotyyppiä olevaa, PLL-kiinnitettyä bakteeria. Kussakin anti-P. aeru-15 ginosa-positiivisessa kuopassa olevan lisätyn viljelmän supernatantille tehtiin ELISA-määritys edellä kuvatulla tavalla. Supernatantit laitettiin riveittäin uusille anti-geenilevyille, jolloin identifioitiin joukko kuoppia, jotka sisälsivät useiden IATS-serotyyppien kanssa reagoivaa 20 vasta-ainetta. Yksi kuoppa, josta käytetään merkintää 8H7, sisälsi IATS-serotyypeille 6 ja 13 spesifistä vasta-ainetta. Kun tästä kuopasta saatu supernatantti tutkittiin ELISA:11a 7 Fisher-immunotyypin suhteen esimerkissä V kuvatulla tavalla, havaittiin, että kuopan 8H7 vasta-aineet 25 olivat spesifisiä Fisher-immunotyypilie 1.

Jotta saataisiin määritetyksi, aiheutuiko IATS-serotyyppien 6 ja 13 vastainen reaktioinani useista kuopasta 8H7 olevista vasta-aineista, adsorboitiin lisänäytteitä supernatantista erikseen IATS-serotyyppien 6, 13 ja 17 30 (negatiivinen vertailunäyte) kanssa ja adsorboituneet supernatantit tutkittiin sitten kutakin kolmea IATS -sero-tyyppiä olevilla, PLL-kiinnitetyillä bakteereilla edellä kuvatulla ELISA-menetelmällä. Tulokset osoittivat, että IATS-serotyypit 6 ja 13 adsorboivat toistensa vastaista 35 vasta-aineaktiivisuutta. IATS-serotyyppi 17 ei adsorboi- 40 86377 nut IATS 6:n eikä IATS 13:n vastaista aktiivisuutta. Nämä tulokset osoittavat, että IATS-serotyyppien 6 ja 13 vastainen reaktioinani aiheutui yhdestä kuopan 8H7 sisältämästä vasta-aineesta.

5 Kuopan 8H7 sisältämien, vasta-ainetta tuottavien solujen eristäminen ja kloonaaminen tehtiin kolmessa vaiheessa suurin piirtein edellä esimerkissä V kuvatulla tavalla. Täten saatiin aikaan kloonattu transformoitu ihmis-solulinja, joka kasvaa jatkuvasti (ts. on kuolematon) ja 10 erittää ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta, joka reagoi Fisher-immunotyypin 1 kanssa ja reagoi ristiin IATS-sero-tyyppien 6 ja 13 kanssa. Tässä esimerkissä käytetään solu-linjasta ja sen tuottamasta vasta-aineesta samaa merkintää 8H7. Esimerkissä V kuvatulla menettelyllä määritettiin 15 kuopan 8H7 vasta-aineen isotyypiksi IgM.

Vasta-aineen 8H7 tunnistaman molekyylilajin biokemiallinen karakterisointi tehtiin imunoblottausanalyysillä muuten esimerkeissä III ja V kuvatulla tavalla, mutta analyysissä käytettäviksi antigeenipreparaateiksi valittiin 20 Fisher-immunotyypistä 1 ja IATS-serotyypeistä 6 ja 13 tehdyt LPS-preparaatit. IATS-serotyypistä 10 saatua LPS-pre-paraattia käytettiin negatiivisena vertailunäytteenä.

Saatujen immunokaIvojen analysointi osoitti positiivisia tuloksia vain niissä NCM-kaistoissa, jotka sisäl-25 sivät Fisher-immunotyypin 1, IATS-serotyypin 6 tai IATS-serotyypin 13 LPS:ää. Fisher-immuniotyyppiä l ja IATS-serotyyppiä 6 vastaavilla kaistoilla vasta-aine 8H7 tunnisti sarjan säännöllisin välein (ts. tikapuumaisesti) sijaitsevia vyöhykkeitä, jotka kattoivat lähes koko geelin 30 pituuden. Nämä vyöhykkeet vastasivat tarkalleen LPS-mole-kyylien monia eri molekyylipainomuotoja, jotka näkyivät samalla tavalla tehdyssä SDS-PAGE:ssa, jossa antigeenejä ei siirretty NCMtään vaan värjättiin spesifisesti LPS:n --· läsnäolon toteamiseksi. IATS-serotyypin 13 LPSrää sisäl- 35 tävällä kaistalla vasta-aine 8H7 tunnisti lyhyemmän sar- 4i 86377 jän säännöllisin välein esiintyviä vyöhykkeitä, jotka olivat keskinkertaisia - suuria molekyylipainoja vastaavalla geelialueella. Tunnistetut vyöhykkeet vastasivat tälläkin kertaa asemaltaan vyöhykkeitä, joita havaittiin LPS-spesi-5 fisesti värjätyllä geelillä: värjätyllä geelillä näkyvät LPS:n pieni- ja suurimolekyylisimmät muodot eivät kuitenkaan tulleet hyvin tunnistetuiksi Western-blotanalyysissä. Tulokset osoittavat selvästi, että molekyylikohde, jonka vasta-aine 8H7 tunnisti Fisher-immunotyypillä 1 ja IATS-10 serotyypeillä 6 ja 13, oli LPS.

Vasta-aineen 8H7 suojausvaikutuksen in vivo toteamiseksi tehtiin suojauskokeita hiirillä edellä esimerkeissä IV ja V kuvatulla tavalla. Negatiiviseksi vertailunäyt-teeksi käsiteltiin samalla tavalla viljelysupernatantti, 15 joka saatiin eräästä transformoidusta ihmissolulinjasta (6F11, ATCC-nro CRL 8652), joka tuottaa Fisher-immunotyy-pin 2 LPS:lie spesifistä ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta. Positiivisena vertailunäytteenä käytettiin transformoidusta ihmissolulinjasta C5B7 (ATCC-nro CRL 8753), 20 joka tuottaa ihmisen monoklonaalista Fisher-immunotyypin 1 ja IATS-serotyypin 6 LPS:lie spesifistä vasta-ainetta, saatua käytettyä viljelysupernatanttia.

Swiss-Webster-naarashiiret, jotka painoivat 20-22 g, jaettiin kolmeen 30 hiiren ryhmään. Kaikki kunkin ryh-25 män hiiret inokuloitiin yksitellen intraperitoneaalisesti 0,5 ml:11a konsentroitua vasta-ainetta 8H7, 6F11 tai C5B7. Neljän tunnin kuluttua kukin kolmesta ryhmästä jaettiin kolmeen 10 hiirestä koostuvaan alaryhmään ja kunkin 10 hiiren ryhmän jäsenet infektoitiin intraperitoneaalisesti 30 yksitellen 0,3 ml:11a eläviä bakteereja sisältävää suspensiota, joka sisältää 9,4 x LD5Q-annoksen kliinisesti eristettyä näytettä (A522), joka edustaa IATS-serotyyppiä 6 (vastaa Fisher-immunotyyppiä 1), 5 x LDS0-annoksen IATS-vertailuserotyyppiä 13 tai 10 x LD5Q-annoksen IATS-ver-35 tailuserotyyppiä 11 (vastaa Fisher-immunotyyppiä 2). Bak- 42 86377 teerisuspensiot preparoitiin edellä esimerkissä 1 IV kuvatulla tavalla. Eläimiä tarkkailtiin 5 vrk bakteeri-in-fektoinnin jälkeen. Tulokset olivat seuraavat.

5 Taulukko VI

Ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen 8H7 suojaus-vaikutuksen IATS-serotyyppejä 6 ja 13 vastaan osoittaminen in vivo 10 Ihmisen monoklonaa- Eloonjääneiden lkm/tutkittujen lkm linen vasta-aine 5 vrk:n kuluttua infektoinnista _IATS 6:11a IATS 13:11a IATS 11:11¾ 8H7 9/10 6/10 1/10 C5B7 9/10 0/10 0/10 15 6F11 0/10 2/10 10/10

Kuten taulukosta VI ilmenee, vasta-aine 8H7 antoi spesifisen ja merkittävän suojan IATS-serotyypillä 6, muttei IATS-serotyypillä 11 tehtyä tappavaa infektointia vas-20 taan. IATS-serotyypin 13 vastainen suoja oli heikompi, mutta se voidaan selittää sillä, että tätä organismia tarvitaan suhteellisen suuri lukumäärä, jotta saavutettaisiin LD5Q-arvo, verrattuna serotyyppiin 6 (3 x 107 ja vastaavasti 2,6 x 106 pesäkkeenmuodostusyksikköä). Vasta-aine 25 8H7 suojasi erillisessä kokeessa kaikki viisi hiirtä, jot ka oli infektoitu 3,5 x L05Q-annoksilla IATS-13, ja kaikki viisi hiirtä, jotka oli infektoitu IATS-6:lla.

Edellä esitetyn perusteella todetaan, että tämän keksinnön mukaiset solulinjat tuottavat ihmisen mono-30 klonaalisia vasta-aineita ja niiden fragmentteja, jotka ovat ristireagoivia ja ristisuojaavia erilaisia P. aerugi-nosan IATS-serotyyppejä vastaan. Tämä antaa paremman mahdollisuuden kehittää profylaktisia ja terapeuttisia koostumuksia, jotka voivat olla tehokkaita useimpien, ellei 35 kaikkien, P. aeruginosan kantojen aiheuttamia infektioita 43 86377 vastaan. Solulinjat tuottavat lisäksi vasta-aineita, joille löytyy käyttöä immuunimäärityksissä ja muissa tunnetuissa menetelmissä.

Vaikka tätä keksintöä on kuvattu jossain määrin 5 yksityiskohtaisesti valaisevalla ja esimerkinomaisella tavalla sen ymmärtämisen helpottamiseksi, on selvää, että siihen voidaan tehdä tiettyjä muutoksia ja muunnoksia liitteenä olevien patenttivaatimusten piiristä poikkeamatta .

10

Claims (6)

44 86377

1. Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden tai niiden sitoutuvien 5 fragmenttien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään ihmisen B-lymfosyyteistä transformoimalla saatua jatkuvasti viljeltävissä olevaa solulinjaa ja otetaan talteen sen tuottamat monoklonaaliset vasta-aineet, jotka reagoivat spesifisesti vähemmän kuin kaikkien mutta vähin- 10 tään kahden Pseudomonas aeruginosan IATS-serotyypin kanssa, ja haluttaessa eristetään niiden sitoutuvat fragmentit.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut vasta-aineet antavat in 15 vivo -suojan ainakin kahta IATS-serotyyppiä vastaan.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut vasta-aineet eivät reagoi Pseudomonas aeruginosan minkään Fisher-immunotyypin kanssa.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että mainitut vasta-aineet reagoivat Pseudomonas aeruginosan yhden Fisher-immunotyypin kanssa.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainituilla vasta-aineilla on kyky 25 reagoida Pseudomonas aeruginosan kahden tai useamman Fisher-immunotyypin kanssa.

6. Jatkuvasti viljeltävissä oleva solulinja, tunnettu siitä, että sen ATCC-nro on CRL 8941, 9171 tai 9258 ja että se erittää ihmisen monoklonaalisia vasta-ai- 30 neita, jotka reagoivat spesifisesti vähemmän kuin kaikkien mutta vähintään kahden Pseudomonas aeruginosan IATS-sero-tyypin kanssa. 45 86377