JPH01197500A - ヒトモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮卒上二田月豆団 本発明は緑膿菌に対するヒトモノクローナル抗体とその
製造方法、及びその用途に関する。　具体的には血清型
別が異なる緑膿菌リボ多糖体の共通構造に対するヒトモ
ノクローナル抗体で、２種類以上の血清型別の緑膿菌に
対して結合性を示す事を特１枚とする。　更に、本発明
は、上記の如く２種類以上の血清型別の緑膿菌に対して
結合性を示すと同時に大腸菌、サルモ不う菌や緑膿菌の
リピドＡとも結合し、緑膿菌感染症の治療のみならず、
ダラム陰性菌によるエンドトキシンションクの治療剤と
しても有用であるヒトモノクローナル抗体に関する。

′ネーおよびＪ 細菌感染症の治療において問題となる病原菌は、抗生物
質の開発とともに変化している。すなわち、臨床上用い
られる抗生物質の種類の変化に伴い細菌感染症を引き起
こす細菌、いわゆる起炎菌が交代してきた。従来、低病
原性又は弱毒性と言われた細菌、なかでも特に緑膿菌（
ハ匹包副劇し憇匹れ笠紐）による感染例が増加し、緑膿
菌は近年、主要な病原菌の一つとなっている。緑膿菌感
染症は、免疫抑制剤の投与を受は免疫能の低下している
患者、又は癌患者や熱傷患者および新生児などの免疫不
全・低下症の患者において重篤な症状を引き起こし死に
至らしめる場合が多い細菌感染として知られている。

細菌感染を予防・治療する方法として、まず第一にあげ
られるのが、抗生物質および合成抗菌剤を用いた化学療
法である。ストレプトマイレン、カナマイシン、ペニシ
リンやセファロスポリンなど幾多の抗生物質が開発され
、その多くはブドウ球菌を代表とするほとんどのグラム
陽性球菌や、大腸菌などのダラム陰性菌に感受性を示し
、著明な臨床効果を示してきた。しかしながら、今日迄
の多くの研究開発にもかかわらす、緑膿菌に感受性を示
す薬剤は依然少ないのが現状であり、しかも、今日、感
受性を示すとされる薬剤でも、そのほとんどが、緑膿菌
に対してその増殖を単に阻害するいわゆる静菌的に作用
するのみで、殺菌力に欠けており、臨床の場において著
明な治療効果を示すに至っていない。細菌感染症を予防
および治療することができる療法として、免疫グロブリ
ン製剤の投与、いわゆる抗体療法があり、抗生物質療法
と併用される、又はそれに代わるものとして注目されて
いる。ウマやウサギ等の動物を能動的に免疫することに
よって抗体価の高い血清を得ることができ、その血清を
投与する抗体療法は、各種の動物を用いた実験的感染症
において著明な治療効果を示すことが多くの実験にて実
証されている。ヒト以外の動物由来の血清を用いた抗体
療法がヒトにおいても有効性を示すことは、ジフテリア
毒素や蛇毒の例で周知のことである。しかしながら、ヒ
ト以外の動物から得られた異種蛋白をヒト体内へ移入す
るこの方法は、アナフィラキソーや、その他のアレルギ
ー反応などの重篤な副作用を引きおこし一般細菌感染症
の治療法として採用されるに至っていない。かくして、
細菌に対して高い抗体力価を有し、細菌感染症の治療効
果の大きいヒト免疫グロブリンの開発が望まれている。

従来のヒト免疫グロブリン製剤は、健常人又は、細菌感
染既応患者から血液を採取し、既知の方法にて免疫グロ
ブリン画分を分取・精製した後に、ポリエチレングリコ
ール添加、蛋白分解酵素処理、スルホン化、ＤＥＡＥ−
カラムクロマトグラフィー等の、凝集物を除去する方法
により、筋肉注射用のみならず、静脈注射用に製剤化さ
れたものである。これらヒト免疫グロブリン製剤には、
ヒト以外の異種動物由来の免疫グロブリンを投与した時
に見られるアナフィラキシ−等の副作用は無い等の利点
をもつが、幾つかの欠点を持つ。第一に、細菌に対する
抗体価が低く、必ずしも十分な治療効果を期待しえない
。第二に、高力価の免疫グロブリンを大量に安定して供
給することが難しい。健常人ボランティアや患者より採
取された血液を材料に製造されており、高い力価の血清
を一定して入手することは極めて難しく、製造ロフト毎
に、抗体価が変動することがある。第三に、任意のヒト
の血液を材料に製造されることにより、免疫グロブリン
製剤にＪＩＢウィルスなどの肝炎ウィルスや＾ｄｕｌｔ
　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｉｅｕｋａｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ　（
ＡＴＬＶ。

１１ＴＬＶ）などが混入することがあり得る。以上の欠
点を克服する為には緑膿菌に対し強い感染防御能を有す
るヒトモノクローナル抗体を製造する事が望まれる。

抗体が細菌の表層へ結合すると、官女細胞による細菌の
ａ食が促進されたり（オンソニン化によるａ食能の促進
）、又は補体による細菌の溶解が惹起される。　抗体療
法のターゲントとなる緑膿菌の表層抗原としては、ＬＰ
Ｓ、外膜蛋白質、ヘン毛および綿毛が知られている。　
なかでもＬＰＳの構成成分で細菌表層の最も外側に位置
した０−抗原と呼ばれる〇−多糖体は特に抗原性が強く
、〇−抗原に対する抗体は一般に予防・治療効果が高い
。　〇−抗原の配列は多種多様で、現在、緑膿菌標準株
の〇−抗原に対して調製された抗血？ｎ又はマウスモノ
クローナル抗体を用いる事により、免疫学的反応性の差
異を利用して、緑膿菌が分類されている。　血清型と呼
ばれる分類である。

血清型分類には、氷量らによる分類（Ｊａｐａｎ、Ｊ。

Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、　４４．１．１９７４）の１〜１７
型、Ｆｉｓｈｅｒらによる分類（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、９８．８３５．１９６９）の１〜７型、日本緑膿菌
研究会血清型別検討委員会による分Ｖｊ　（Ｊａｐａｎ
、Ｊ、Ｅｘｐ、門ｅｄ、、　４６．３２９．１９７６）
のＡ〜Ｍ型、　Ｔｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ａｎｔ
ｉｇｅｎｉｃ　　ＴｙｐｉｎｇＳｙｓ　ｔｅｎ＋　（Ｉ
ＡＴＳ）による分類の１−１７型等が知られている。各
々の分類及びその相互関係を表１に示す（Ｊａｐａｎ、
Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、４６．３２９１９７６）。

表１　緑膿菌血清型別分類 Ｄ　　　　　　　　４　　　９ Ｅ　　　　　　　　５　　　１１　　　２Ｋ　　　　　
　　１２　　　１３ Ｌ　　　　　　　　　　　１４ Ｍ　　　　　　１５．１７ −　７．１２，１４．１７　− 本緑膿菌研究会血清型別検討委員会 本本国際抗原タイピングシステム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌＡｎｔｉｇｅｎｉｃ　Ｔｙｐｉｎｇ　Ｓｙｓｔ
ｅｍ　）緑膿菌〇−抗原は２〜５残基のオリゴ糖から成
る繰返し単位が重合した構造をしている。　血清型別間
で繰返し単位の構造は異なる。　ある１つの〇−抗原に
対する抗体は、その〇−抗原が属する血・清型の緑膿菌
に対しては強い感染防御・治療効果を示すが、その血清
型以外の緑膿菌に対しては効果の無い事が知られている
。

ＥＢウィイル形質転換法および細胞融合法によって特異
的な抗体を産生ずる細胞株を樹立し、永続的にヒトモノ
クローナル抗体を生産する方法は既に公知である。

緑膿菌リボ多糖体の〇−抗原に対するヒトモノクローナ
ル抗体を産生ずる細胞株を上記の方法で樹立する事は一
般的に知られている。具体的には特開昭６１−６９７９
６号公報には、緑膿菌による感染を受けた事の有る患者
の肺臓リンパ球をＥＢウィイルで形質転換せしめ、緑膿
菌〇−抗抗原特異的ヒトノックローナル抗体産生ずるＥ
Ｂウィイル形質転換細胞を得た事が開示されており、又
、特開昭６１−１５２２８１公報には扁桃腺炎Φ者の扁
桃腺細胞をポークライードマイトジェンで刺激した後、
マウスミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８〜旧株）
と融合させ緑膿菌〇−抗抗原特異的ヒトノックローナル
抗体産生ずるヒト−マウスハイブリドーマを得た事が開
示されている。

しかしながら上記の特許公開公報にて明らかにされてい
るヒトモノクローナル抗体は、個々の緑膿菌血清型にの
み特異的結合能を有し、その血清型以外の緑膿菌に対し
ては結合能を有さない、いわゆる血清型特異的なヒトモ
ノクローナル抗体に限定されるものである。

特開昭６２−１８７４１７号公報では［緑膿菌血清型に
対する交さ反応性かつ交さ防御性モノクローン性抗体」
が開示されている。これは、緑膿菌ＩＡＴＳ（国際抗原
タイピングシステム）血清型２．５および１６、更にフ
ィッシャーによる分類の血清型３および７へ交さ性を持
って結合しうるモノクローナル抗体の産生細胞の取得に
基づいている。

しかしながら、表１の緑膿菌血清型分類表（比較表）で
明らかなように、これらのＩＡＴＳ２．　５，１６゜お
よびフィッシャー３．７は日本緑膿菌研究会血清型別検
討委員会Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｃｏｍｍ１ｔｔｅｅによる
血清型別Ｂという一つの血清型に上柄されるものであり
特開昭６２−１８７４１７号公報に開示される抗体は、
依然として緑膿菌血清型別Ｂ特異的モノクローナル抗体
である。従って、該抗体は、臨床分離株の２０％又はそ
れ以下とのみしか結合せず、実用的には複数の血清型別
特異的モノクローナル抗体を必要とする。ダラム陰性菌
感染が進行すると、敗血症となり生命を高頻度でおびや
かす。その症状として、発熱、悪感、器官不全およびシ
ョックがある。敗血症性ショックはエンドトキシンショ
ックとも呼ばれるもので、大量のダラム陰性細菌の増殖
と死滅、抗生剤投与による細菌の破壊によって体内へ遊
離される細菌内毒素（エンドトキシン）として知られた
ＬＰＳ　（リポ多賽唐体）に起因する。

更に惹起物質の本体はＬＰＳ中のリピドＡであることが
明らかになっている。エンドキシンショックに対する予
防・治療法が無い現在、ショックによる死亡率は、約５
０％と高く、それに対する予防、治療法の開発が強く望
まれている。

Ｚｉｅｇｌｅｒらは、健常人に、熱殺菌した大腸菌Ｊ５
（Ｒｅ型ラフ変異株）をワクチンとして投与し、Ｊ５に
対する抗血清を調製した。そして、その抗血清が菌属症
によるショック死に対して有効であることを示した（Ｎ
ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ、　Ｍａｄ、、　３０７＋１
２２５−１２３０．１９８２）。その後、大腸菌Ｊ５や
ダラム陰性閑のコア・グリコリピドに対する各種の抗血
清およびモノクローナル抗体が実験動物試験又は臨床で
エンドトキシンショックに有効であることが示されてい
る。以下に、関連した出願明細書および報文のリストを
示す。

特公表昭６０−５０１２４２　（ＷＯ８４０４４５８）
　、特公表昭６１−５００３５５　（ＷＯ−８５０１６
５９）　、特開昭６１−７２８００　（ＥＰ１７４２０
４）　、特開昭６１−１３０３００゜Ｍｕｔｈａｒｉａ
　ｅｔ　ａｌ　：　Ｉｎｆ、Ｉｍｍｕｎ、４５．６３１
−６３６，１９８４　；Ｔｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ　：　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａ１１．＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、
　８２＋１７９０−１７９４．１９８５　；　Ｇｉｇｌ
ｉｏｔｔｉ　＆　５ｈｅｎｅｐ：　Ｊ、Ｉｎｆ。

Ｄｉｓ、１５１．１００５−１０１１．１９８５　；　
Ｂｒａｕｄｅ　ｅｔ　ａｌ　：　Ｊ。

Ｉｎｆ、Ｄｉｓ、１３６　（Ｓｕｐｐｌ）、　５１６７
−１７３．１９７７　；Ｎｅ１ｌｅｓａｎｄ　Ｎｉｓｗ
ａｎｄｅｒ　；　Ｉｎｆ、ｒｍｍｕｎ、４６．６７７−
６８Ｌ１９８４；Ｐｏ１ｌａｃｋ　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ、
　　Ｃ１１ｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、　　７２゜１８７４
−１８８１，１９８３；　　Ｙｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、
：Ｃｌ１ｎ、Ｒｅｓ、３０゜５２２八＋　　１９８２　
　；　　Ｙｏｕｎｇ　　ｅｔ　　ａ！　　：　　Ｃ１１
ｎ、　　Ｒｅｓ、　　３２＋５１８八、　１９８４゜　
従来の技術で得られる緑膿菌リボ多糖体の〇−抗原に特
異的な抗体は、その〇−抗原が分類される血清型の緑膿
菌に対してのみ予防・治療効果を有し、その他の血清型
の緑膿菌に対して予防・治療効果は認められない。従っ
て、緑膿菌感染症全体、すなわち、すべての血清型の緑
膿菌による感染を治療する為にはすべての血清型に対応
する少なくとも１３〜１７種類のモノクローナル抗体を
製造する必要がでてくる。その為には少なくとも１３〜
１７種類の血清型特異的なヒトモノクローナル抗体産生
株を樹立し、各々の細胞株を大量に培養し抗体を精製し
なければならず、産業的に応用していく場合に問題が多
い。　一つの血清型緑膿菌のみへ結合するのではなく、
複数又はすべての血清型菌へ結合し、複数の血清型緑膿
菌に対して予防・感染防御効果ををするヒトモノクロー
ナル抗体の開発が望まれる。

光訓しどＷ遥 こうした状況に鑑み、本発明者らは前述の問題点を改善
すべ（、緑膿菌感染症に有効なヒトモノクローナル抗体
及びそれを含む高力価ヒト免疫グロブリン、及びそれを
安定的かつ大量に製造する方法を確立するために鋭意研
究し、血清型別の異なる緑膿菌のＬＰＳにおいて共通な
化学構造を認識するヒト抗体産生株の樹立をヒ）Ｂリン
パ球を用いて試み、血清型別の異なる２種類以上のＬＰ
Ｓと反応し、複数の血清型緑膿菌に対し感染防御および
治療効果を有するヒトモノクローナル抗体を得た。　具
体的には、該モノクローナル抗体は、日本緑膿菌研究会
血清型別検討委員会の分類において血清型Ａ、Ｇ、Ｆお
よびＭに属する大半の緑膿菌へその血清型別の種類を問
わずに特異的に結合することを特徴とし、個々の血清型
別緑膿菌のみと反応する血清型別特異的なモノクローナ
ル抗体とは区別される。　また、上記特開昭６２−１８
７４１７号公報に開示される血清型別のサブグループに
交さするモノクローナル抗体とも区別される。

喋刷４」も欠す」巨り没 一ヒ述の如く、本発明は、上記の緑膿菌ＬＰＳの共通抗
原決定部位を認識するヒトの抗体、特に単一な抗原特異
性をもつモノクローナル抗体（！ｌｉ−性抗体）および
そのの生産方法に係わり、更に、該特異抗体を連続的に
産生じ得るヒト細胞株およびその取得方法並びにその細
胞を釦　■Ｌｒｏおよびｉｎ　　＋伏！培養することを
特徴とする特異抗体の装造方法に関する。　更には、緑
膿菌ＬＰＳの共通抗原決定部位に対する特異モノクロー
ナル抗体を少なくとも一種類含む、感染予防治療用のヒ
ト免疫グロブリン製剤に関するものである。

また、更に本発明は、上記の緑膿菌のＬＰＳにおいて共
通な化学構造を認識すると同時に、大腸菌、サルモ不う
や緑膿菌などに由来するグラム陰性菌由来のリピドＡと
も交叉反応する今迄に報告が無い特徴を有する新規な抗
体およびその製造方法、これを含む感染予防、治療剤を
提供する。

本発明によって得られる緑膿菌ＬＰＳの共通抗原決定部
位に対するヒトモノクローナル抗体とは、血清型が異な
る２種類以上、特定するに血清型Ａ。

Ｇ、　　ＦおよびＭ緑膿菌のＬＰＳにおいて共通な抗原
決定部位を認識する単一なヒト型の抗体、さらにはグラ
ム陰性菌由来のＬＰＳ中のりとドＡと交叉反応性を示す
抗体をさし、一つの抗体産生クローンから産生される。

該ヒトモノクローナル抗体は２つ以上の異なる血清型緑
膿菌又はそれに由来するＬＰＳに対して結合する能力（
結合活性）をもち、補体存在下での殺菌活性および好中
球マクロファージによる菌の亥食を促進する能力（オプ
ソニン活性）を有して、緑膿菌感染症を予防・治癒する
ことができる。　本発明の抗体のニブトープは、緑膿菌
血清型　Ａ、Ｇ、ＦおよびＭの菌株のＬＰＳに存在し、
それらＬＰＳ中のリビドＡ部位及び多糖部分に存在する
。

血清型とは、緑膿菌の各血清型別分類に対して作製され
た特異的に反応する抗血清又はマウスモノクローナル抗
体を用いた、免疫化学的反応の差異に基づく緑膿菌の分
類法で、ここでは日本緑膿菌研究会血清型別検討委員会
による分類を指す。

ＬＰＳとはリポ多ネＪ！体のことで、ダラム陰性細菌表
層の成分であり、脂質（リピドＡ）に２−ケト−３−デ
オキシオフトン酸、ヘプトース、燐酸等を構成成分とし
たコア部分が結合し、更にその先に〇−抗原と呼ばれる
多糖体側鎖が結合したものを指す。

０−抗原とはＬＰＳの構成成分であり２〜５個の単糖が
直鎖状に結合した繰返し単位が重合した構造を有する。

　それを構成する単糖の組成、配列、配位が血清型別毎
に異なり血清型別分類の基となっている。

上述の如く、本発明は、緑膿菌のＬＰＳの共通抗原決定
部位を認識すると同時に、ダラム陰性細菌由来のリピド
Ａに交叉反応するヒトモノクローナル抗体を提供する。

ここにおいて、グラム陰性菌由来のリピドＡに反応する
ヒトモノクローナル抗体とは、大腸菌、サルモネラ、緑
膿菌などのダラム陰性菌から単離・精製されたリピドＡ
へ特異的に認識する単一なヒト型の抗体を指す。　該ヒ
トモノクローナル抗体は、上述のように緑膿菌のＬＰＳ
の共通抗原決定部位に反応すると同時に、緑膿菌を含む
ダラム陰性菌のリピドＡに特異的に結合する能力（結合
活性）をもち、リピドＡによって引きおこされるマイト
ジェン活性、致死毒性やシュワルツマン反応などの生物
学的活性を中和する能力（中和活性）を持ち、ダラム陰
性細菌によるエンドドキシンショノクの治療・予防剤と
して有用である。　又、該ヒトモノクローナル抗体は大
腸菌やサルモネラから単離されたＬＰＳに対して、その
リピドＡ部位が露出している場合、例えば、ディープ・
ラフ型閑株のごとく、〇−抗原およびコア多糖の欠損し
た菌株由来の場合、そのＬＰＳに結合する。リピドＡ部
位が露出した菌体にも結合しうる。

リビドＡとは、ＬＰＳのうちの糖脂質（グリコリピド）
部分であり、ケトデオキシオフトン酸（ＫＤＯ）のケト
シト結合を酸で開裂することによってＬＰＳから分離・
精製される。β（１−Ｇ）ジサッカライドｌ、４゛　−
シリン酸エステルの骨格を有し、リピドＡ１モルあたり
４モルのβ−ヒドロキン酸（脂肪酸）を持つ。菌株によ
って、脂肪酸の種類、数や結合位置が異なり、多様性が
みられる。

本発明の緑膿菌のＬＰＳの共通抗原決定部位と特異的に
反応する、さらにはダラム陰性菌のリビドＡと交叉反応
するヒトモノクローナル抗体を連続的に産生ずるヒト細
胞株は以下の方法によって取得することができる。

第一の方法としては、　生体内又は生体外にて緑膿菌（
生菌又はホルマリンや加熱による死菌菌体）、緑膿菌由
来のＬＰＳ、リビドＡ部位が露出したダラム陰性菌（生
菌又はホルマリンや加熱による死菌菌体）、好ましくは
大腸菌Ｊ５やサルモネラＲｅ、Ｒｄ、Ｒｅ変異株または
それらの菌に由来するＬＰＳ、リピドＡによって感作（
免疫）されたヒトリンパ球Ｂ細胞をエプスタイン・バー
（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウィルス（以下、ＥＢウ
ィイルと略）と混合することによって感染させ、連続的
に増殖する細胞へと形質転換（Ｌｒａｎｓｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ）させる。次いでクローン化する前の、又はクロ
ーン化された形質転換細胞から、上記の反応特異性を有
する抗体を産生ずる株を選別し試験管内（生体外）にて
連続的に細胞増殖し、かつ上記抗体を連続的に生産する
細胞株を樹立する。選別法として、緑膿菌血清型別の異
なる１７種の緑膿菌、大腸菌０−１１１：Ｂ４およびＪ
５からなる菌体スクリーニングパネルを用いたＥＬｒＳ
Ａを用いる。

さらには、緑膿菌、大腸菌０−１１１：Ｂ４およびＪ５
、サルモネラの野性株およびＲａ−Ｒｅｇ５異株由来の
Ｌ　Ｐ　Ｓ、リピドＡを抗原とするＥＬＩＳＡによって
選別する。

第二の方法として、緑膿菌（生菌又はホルマリンや加熱
σよる死菌菌体）、緑膿菌由来のＬＰＳ、リビドＡ部位
が露出したダラム陰性菌（生菌又はホルマリンや加熱に
よる死菌菌体）、好ましくは大腸菌ｊ５やサルモネラＲ
ｃ、Ｒｄ、、Ｒｅ変異株またはそれらの菌に由来するＬ
ＰＳ、リピドＡによって感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞
を骨髄腫細胞（ｍｙｅｌｏｍａ）又はＢリンパ芽球様細
胞（８１ｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ　ｃｅｌｌ）と細
胞融合することによって、試験管内にて連続的に細胞増
殖し、かつ上記抗ＬＰＳ特異抗体を連続的に産生ずる細
胞株を樹立する。

第三の方法として、第一の方法にて樹立された特異抗体
を産生ずるＥＢウィイル形質転換細胞を骨髄腫細胞又は
Ｂリンパ芽球様細胞とを細胞融合することによって試験
管内にて連続的に細胞増殖し、かつ上記抗ＬＰＳ特異抗
体を連続的に産生ずる細胞株を樹立する。これらの樹立
株を試験管内培養又はヌードマウスの腹腔などの生体内
にて培養することによって、培地又は腹水へ分泌された
抗体を精製することによって抗体を大量に製造する。

本発明に含まれるヒトモノクローナル抗体の製造方法を
以下の諸過程に分け、詳細に説明する。

■抗原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞の調製■無制限増
殖能力の賦与によるモノクローナルな特異抗体産生細胞
株の樹立 ■モノクローナルな特異抗体産生細胞株の堵養■培養液
からのモノクローナルな特異抗体の精製■モノクローナ
ルな特異抗体を含む高力価免疫グロブリン製剤の調製 上述のヒトのリンパ球Ｂ細胞とは、緑膿菌ＬＰＳさらに
はダラム陰性菌のリピドＡに対する抗体を産生ずるヒト
リンパ系細胞で、主として末梢血液よりリンフオンレン
プ、モノポリ分離液などのリンパ球分離液を用いた遠心
分離法によって分離されるが、各種疾患の診断および治
療の目的で摘出されたリンパ節、肺臓などの臓器や―帯
血由来のリンパ球Ｂ細胞を材料に用いることもできる。

緑膿菌による感染症を憑ったことがあり、生体内で感作
された既応症のヒト由来のリンパ球Ｂ細胞を用いること
が望ましい。あらかしめ、血清中の抗体価を測定するこ
とにより適切なリンパ球提供者を選別することができる
。又、別の方法として、緑膿菌症の有無を問わず、ヒト
リンパ球Ｂ細胞を採取し、試験管内にて不活化された、
緑膿菌、緑膿菌ＬＰＳ、リピドＡ部位が露出したダラム
陰性菌、好ましくは大腸菌Ｊ５やサルモネラＲｃ、Ｒｄ
、Ｒｅ変異株またはそれらのダラム陰性菌に由来するＬ
ＰＳやリビドＡとを混合することによって感作せしめる
ことができる。すなわち、抗原として不活化された上記
抗原をリンパ球Ｂ細胞に添加する。更にアメリカヤマゴ
ボウレクチン（ＰＷＭ）などの植物性レクチン、Ｃｏｗ
ａｎ　Ｉなどの菌体成分、又はヒトリンパ球の混合培養
液やＩＩＩ！！臓、胸腺細胞や請帯血細胞培養液など、
Ｂ細胞増殖因子およびＢ細胞分化因子等のリンフ才力イ
ン類を含む？８液を同時に、又はそれぞれの組み合わせ
で添加することによって試験管内にて抗原感作し、引き
続き抗体産生細胞へと増殖・分化させたヒトリンパ球Ｂ
型細胞を用いることができる。これらのヒトリンパ球Ｂ
細胞は、その細胞表面に抗体分子を有し、ある限られた
期間、少量の抗体を分泌することが可能であるが、無制
限に増殖することはできないことを特徴とする。

抗原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞を無制限、連続的に
増殖可能な細胞株とする方法として、本発明は基本的に
二種類の方法を含む。　第一〇方法は、抗原感作された
ヒトリンパ球Ｂ細胞をマーモセット細胞Ｂ９５−８から
調製されたＥＢウィイルと混合培養することによってＥ
Ｂウィイルをリンパ球Ｂ細胞に感染させる。好ましくは
、１細胞あたり２〜ｌ０ＴＤ５．のウィルスを混合する
。９６穴マイクロプレートの１ウヱルあたり０．５〜３
Ｘ１０’個の細胞を播種し、あらかじめ選別されたウシ
胎児、ウシ、ウマ又はヒト等の血清を２〜２０％（Ｖ／
Ｖ）にて含むＲＰＭ１１６４０又はＥａｇｌｅ’ｓ　Ｍ
ＥＭなとの通常の培地を用いて５〜１０％ＣＯ２存在下
、３２〜３７°Ｃにて、２〜５週間培養することによっ
て形質転換細胞（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｃｅｌｌ）
を得る。　培養中２〜４日毎に培地を半量ずつ交換する
。　必要に応して１〜２　Ｉｔ　ｇ　／　ｍｌのサイク
ロスポリンＡ、およびマイコプラズマの汚染を防ぐ抗生
物質や合成抗微生物薬を添加する。形質転換細胞は、感
染１０日以降、２０〜２００個の細胞集団として光学顕
微鏡下で観察され、非形質転換細胞と容易に区別し得る
。

充分に増殖された形質転換細胞を含むウェル（ｗｅｌｌ
）の培養液を酵素免疫法（ＥＬＴＳＡ）によって抗体価
をスクリーニングして抗体産生の認められるウェルを選
１尺し、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏＬｔｉｎｇ法によりＬ
ＰＳに対する特異性を確認する。その後、形質転換され
た細胞塊（クラスター）を含む／８液をピペットを用い
て軽く吸引・排出する操作を繰り返すことによってクラ
スターをほぐし、培地にて適切な細胞濃度に希釈し０．
５〜１００個細胞／ウェルとなるように９６穴マイクロ
プレートに播種培養するいわゆる限界希釈法（Ｌｉｎ＋
ｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）を用いる
か、又は軟寒天を利用してクローニングする。０．３６
〜０．４％（ｗ／ｖ）の軟寒天（Ｓｅａ　ｐｌａｑｕｅ
　　ａＢａｒｏＳｅが好ましい）に形質転換細胞約７Ｘ
１０’〜７Ｘ１０５個を培養プレート（３０ｍｍφ）へ
接種し、５％ＣＯ，，３７°Ｃにて培養する。ｌ細胞か
ら増殖してくるコロニーを得る。

クローニングの際に、ｆｅｅｄｅｒ　　１ａｙｅｒとし
てマウス腹腔内細胞、ヒト請帯血リンパ球又はＸ線照射
処理したマウス肺臓細胞を用いることが望ましい。

クローニングされた細胞株の培養上清の抗体価を１７種
の異なる血清型別緑膿菌、大腸菌○−１１１：Ｂ４やｊ
５の菌体を固相抗原としたＥＬＩＳＡ法、さらには、１
７種の異なる血清型別緑膿菌、大腸菌○−１１１：Ｂ４
およびＪ５、サルモネラの野性株およびＲａ　−Ｒｅ変
異株由来のＬＰＳ、リピドＡを固相抗原としたＥＬＩＳ
Ａ法にて測定し、特異抗体産生量の多い株を更に選別す
る。

このクローニング、抗体の高産土株の選別を２〜３回繰
り返し、増殖の速い、かつ特異抗体を安定的、大量に産
生ずる形質転換細胞株を選択し樹立する。

第二の方法は、抗原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞と骨
髄腫細胞とをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在
下に細胞融合する方法である。

用いられる骨髄腫細胞はＰ３Ｘ６３−Ａｇ　８　（Ｐ３
）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ　８．６５３などの、マウス骨髄
腫細胞由来のヒボキサンチン・グアニン・ホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴと略）欠如変異株、
又は、ヒト骨髄腫細胞Ｕ−２６６由゛来のＨＧＰＲＴ欠
如変異体など、又はＨＧ　Ｐ　Ｐ　Ｔの欠如したヒト・
マウスへテロミエローマＳＨＭ−Ｄ３３などを指す。

骨ｆｆ、ｆｉｌｌ！Ｔｌ細胞の代わりに、ヒトＢリンパ
芽球細胞由来のＨＧ　Ｐ　Ｐ　Ｔ欠如変異株を用いるこ
ともできる。

ＰＥＧとしては、ＰＥ（１，１，０００〜６．０００を
３０〜５０％＜Ｗ／ｖ）の濃度で用いる。　　レクチン
、ポリーＬ−リジンやＤＭＳＯなどを添加することによ
り融合効率を高めることもできる。融合方法は、マウス
細胞同志を融合し、マウスモノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドーマを取得したＫｏｈｌｅｒａｎｄ　Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ　らの方法（Ｎａｔｕｒｅ　２５６．４９
５１９７５）に準する。　簡単に記述すれば、抗原感作
されたヒトリンパ球Ｂ細胞とｌ−Ｉ　Ｇ　Ｐ　Ｐ　Ｔの
欠如した骨髄腫細胞とをｌＯ〜１：１の割合にて混合し
、３０〜５０％（ｗ　／　ｖ　）　Ｐ　Ｅ　Ｇ４０００
を０．５〜１分間に少量ずつ加え、１〜１０分間静置す
る。その後、５〜１０分間に９〜５０ｍ１の血清不合培
地を加える。更に培地を加え１０５〜ｌＯｈ個細胞／　
ｍｌの濃度に調製し、９６穴マイクロプレートにｌウェ
ルあたり２×１０’〜２Ｘ１０’個の細胞を播種する。

翌日、ヒボキサンチン・アミノプテリン・チミジン含有
培地（ＨＡＴ培地と略）、又はヒボキサンチン・アザセ
リン含有培地（ＨＡｚ培地と略）と半量交換し、５％Ｃ
Ｏ，，３２〜３７°Ｃにて培養する。約１０〜２０日間
断しいＤ　Ａ　Ｔ培地に、続いて約３〜５日間ヒボキサ
ンチン・チミジン含有培地（ＨＴと略）に、３日毎に半
量ずつ交換を続は約２〜３週間培養して、増殖して（る
コロニー、いわゆるハイブリドーマを得る。ＨＧＰＲＴ
欠如変異株を用いることなく、代謝阻害剤を組み合わせ
ることによってハイブリドーマを選択することも可能で
ある。ハイブリドーマの培養液の抗体価を前述のＥＬＩ
ＳＡ法によって測定し、上記の反応特異性を有する特異
抗体産生株を選別し、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎ
ｇ法により多糖体に対する特異性を確認する。限界希釈
法又は軟寒天法によって、２〜３回クローニングを繰り
返し、増殖の速い、特異抗体産生量の多い、安定した細
胞株を得る。抗原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞の代わ
りに、第一の方法によってＥＢウィイル形質転換された
細胞を用いることもできる。

以上、ＥＢウィイル形質転換法（ＥＢ　ｖｉｒｕｓｔｒ
ａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）又は細胞融
合法（ｃｅｌｌｆｕｓｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　；　ｈｙ
ｂｒｉｄｏｍａ　ｍｅＬｈｏｄ）を用いて、抗原怒作ヒ
トリンパ球Ｂ細胞より樹立された細胞株は、連続的に増
殖することができること、しかも、特異抗体を安定的に
、かつ大量に産生じ得ることを特徴とする。

これら樹立された形質転換細胞又はハイブリドーマ（０
，５〜５Ｘ１０’個細胞／ｍりを通常の動物細胞培養用
培地にてＣｏｗインキュヘーターを使用して２〜１０％
ＣＯ□、３２〜３７°Ｃの条件のもとて培養フラスコや
プレート等の容器内で静置培養又は回転培養する。特に
大量に培養する時は、動物細胞用に設計されたジャーフ
ァーメンタ−やホローファイバーシステム等を用いるこ
ともできる。通常の動物細胞培養用培地とは、ウシ胎児
、仔ウシ、ウシ、ウマおよびヒトなどの血清を２〜２０
％含有するＲＰＭ１１６４０．　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥ
Ｍ　ニ代表される培地、又は、インシュリン、トランス
フエリン、エタノールアミン、セレナイト、ウシアルブ
ミン、リピドなど細胞の増殖に必要な微量成分を含む無
血清培地を指す。

抗体の精製は通常の生化学的手法を組み合わせることに
よってなされる。すなわち、硫安沈澱分画法、エタノー
ル沈澱分画法、ＰＥＧ分画法、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過法、アフィニティクロマトグラフィー
、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動法等である。

　精製過程において、凝集物の形成や抗体活性の低下を
防ぐ工夫が必要である。　例えば、ヒト血清アルブミン
（Ｈ８Ａと略）を０．０５〜２％の程度で添加する。

その他グリシンやα−アラニンなどのアミノ酸類、特に
リジン、アルギニンやヒスチジンの塩基性アミノ酸、グ
ルコースやマンニトールなどの＃Ｍ類、塩化ナトリウム
などの塩類を添加することが好ましい場１合がある。　
　ＩｇＭ抗体の場合、特にａ果しやすいことが知られて
いる。　　β−プロピオニラクトンや無水酢酸などで処
理することは凝集を阻止することができ静脈内投与も可
能とする。

精製されたヒトモノクローナル抗体は、生物学的製剤の
製剤化に通常用いられる方法によって製剤化される。　
基本的には、メンブレンフィルター等による濾過除菌操
作の後に、安定化剤とともに滅菌バイアルに凍結乾燥さ
れる。

本ヒトモノクローナル抗体製剤は、細閉域染冶療・予防
剤として、緑膿菌ＬＰＳに対する１種類のヒトモノクロ
ーナル抗体より成ることも可能であるが、更に好ましく
は、緑膿菌ＬＰＳ分子の構造の異なる抗原決定部位を認
識しうる少なくとも２種類又はそれ以上のヒトモノクロ
ーナル抗体と混合して用いられる。又は緑膿菌外毒素や
エラスターゼ、プロテアーゼなどの緑膿菌外毒素や外膜
蛋白・内毒素構成成分などを認識する、従来型のヒト抗
体と混合して使用される。更には、緑膿菌以外の細菌、
ウィルス、真菌、原虫、癌細胞に対するヒト抗体に、本
発明によって得られる緑膿菌ＬＰＳに対するヒトモノク
ローナル抗体を添加して用いることができる。従来のヒ
ト免疫グロブリン製剤に、本発明によって得られるヒト
モノクローナル抗体を添加して、ＬＰＳに対する高力価
免疫グロブリン製剤とされる。

本発明によって得られるヒトモノクローナル抗体は、主
としてクラスＩｇＧおよびＩｇＭに属するがこれに限定
されたものでない。

本ヒトモノクローナル抗体は異なる２種以上の血清型緑
膿菌菌体に対して結合しく結合活性）、補体存在下で殺
菌活性を示しく補体殺菌活性）、好中球、マクロファー
ジによる緑膿菌の賞食作用を促進する活性（オプソニン
活性）を有し、異なる２種類以上の血清型緑膿菌による
実験的マウス感染症を単一な本発明のヒトモノクローナ
ル抗体の投与によって治癒する事ができる。

本ヒトモノクローナル抗体は緑膿菌血清型別標準株のう
ち緑膿菌１１０１００１（ＡＴＣＣ２７５７７）、１１
Ｄ１００６（ＡＴＣＣ２７５８２）　、ｌＩＤ１０２０
．１１０１０１５の菌体に対して特異的に結合する特徴
を有する。

更には、ダラム陰性菌のリビドＡにも合わせて結合する
ことができ、リビドＡによる生物学的活性（ｖｊ、凡作
用、シュワルツマン反応など）が中和される。。

本ヒトモノクローナル抗体は、大腸菌Ｒｃ変異株Ｊ　５
　（ＡＴＣＣ３９３５５）、サルモネラ・ミネソタのラ
フ型ＲｃＳＲｄ、Ｒｅ変異株および緑膿菌１１０１００
１（八ＴＣＣ２７５７７）由来の各々のＬＰＳに結合す
るが、大腸菌スムース型株０−１１１：Ｂ４、サルモネ
ラ・ミネソタのスムース型野性株、ラフ型Ｒａ　、　ｌ
’？ｂ変異株および緑膿菌１１０１００２（ＡＴＣＣ２
７５７＋３）　、ＰＡ　１０３由来のＬＩ’Ｓに結合し
ないことを特徴とする。

以上、本ヒトモノクローナル抗体は、従来の血清型別特
異的モノクローナル抗体、血清型サブグループ交さ反応
性モノクローナル抗体と区別されるものであり、１つの
モノクローナル抗体で複数の血清型別緑膿菌に結合し感
染症を治療できることは数少ない種類のモノクローナル
抗体で、はとんど又はすべての血清型の緑膿菌をカバー
できる点、極めて産業価値が高い、治療法のほとんどな
いエンドトキシンショックの予防・治療にも適用されう
る。本ヒトモノクローナル抗体のＵＱＨするエピトープ
は、ＬＰＳ中のりとドＡ部位と多糖部位である。認識さ
れる該多糖は、緑膿菌のある種の血清型別Ａ、Ｆ、Ｇ、
Ｍに限定される。現時点では、リビドＡ部位と該多糖部
位に共通する構造が存在するものと考えられる。

緑膿菌による感染症および、その細菌を含む混合細菌感
染症やダラム陰性菌によるエンドトキシンショックの治
療・予防に用いられる時、本ヒトモノクローナル抗体を
少なくとも１種類含むヒト免疫グロブリン製剤は、重症
の場合成人あたり１回１〜１０ｇ　、予防や通常の治療
の場合成人あたり１回０．２〜５ｇが投与される。ヒト
免疫グロブリン製剤は、本ヒトモノクローナル抗体を０
．５〜５００ｍｇ好ましくは５〜５０　ｍｇ含む。

以上、詳しく述べたように、本発明によって得られるヒ
トモノクローナル抗体は、同抗原に対して高い抗体価を
有し、マウス実験的感染症の系で優れた治療効果を示す
ことが、第一の特徴である。

その他、ヒト由来の蛋白であることより、異種蛋白の投
与時にみられるアナフィラキシ−等の副作用の少ないこ
とが期待されるし、特定の細胞より生産・精製される抗
体であることより、不特定多数のヒト血液より製造され
た従来の免疫グロブリン製剤にくらべ、未知のバイオバ
ザードが混入してくる可能性の低いことが特徴である。

又、本モノクローナル抗体の製造方法としては、生体外
で、大量に、高力価の特異抗体を安定して製造すること
が特徴であり、従来のヒト血液より製造する方法に（ら
べ高力価など生物活性の点で、安定的供給ができるなど
品質管理の点で優れる。

次にに実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれのみに限定されないことは言うまでも
ない。

実施例１ ＥＢウィイル形質転換法によるヒトモノクローナル抗体
産生株の樹立 （］）ＥＢウィＪレスを８液の調製およびそのウィルス
価の検定 ＥＢウィイルを産生放出しているマーモセット細胞Ｂ９
５−８を、ウシ胎児血清（以下ＦＣ３と略）を容量比と
して１０％含有するＲＰＭ１１６４０培地に６．５Ｘ１
０’細胞／　ｍｌの割合にて懸濁し、培養フラスコＴ−
７５（Ｃｏｒｎｉｎｇ　１２５１１０）を用いて５％Ｃ
Ｏ２３７°Ｃの条件のもと４日間静置培養した。　培養
上清を採取し低速遠心機（トミー精工ＲＳ　−２０８Ｈ
）を用いて２．ＯＯＯｒｐｍ　（ローターＴＳ−７）　
、１０分間遠心分離し、およびそれに引き続いてその上
清を０．４５μメンブレンフイルター（マイレクス５Ｌ
ＨＡ０２５０Ｓ）にて濾過した。　その濾液をセラムチ
ューブ（住友ベークライトＭ　Ｓ−４５０５）に分注し
、−８０°Ｃに保存、必要時適宜溶解しヒトリンパ球の
ＥＢウィイルによる細胞形質転換（トランスフォーメー
ション）の実験に用いた。　ＥＢウィイル溶液のウィル
ス価はヒト末梢血リンパ球を指示細胞としてり、　Ｊ、
　Ｍｏ５ｓ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｈ，Ｐｏｐｅの方法（Ｊ、
　Ｇｅｎｅｒａｌ　　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　、　１’１２
３３（１９７２）に準して行なった。すなわち１５％Ｆ
Ｃ３含有ＲＰＭ１１６４０培地に懸濁されたヒト末梢血
リンパ球（１０６細胞／　ａｎ　）を９６ウエルマイク
ロプレート　（住友ヘークライト）に１ウエルあたり１
００〃ｊｌ！ずつ分注した。その後１０°〜１０７の範
囲にて前述の培地にて１０倍系列希釈されたＥＢウィイ
ル溶液を２０μ２ずつ添加し５％ＣＯ□、３７°Ｃにて
培養した。３日毎に１／３容雇の培地を交換し３週間後
、光学顕微鏡を用いて形質転換された細胞像の有無を調
べた。各希釈段階あたり６ウエルを用いて試験し形質転
換率を求めた。５０％の細胞を形質転換するに要する最
高希釈度を各希釈段階の形質転換率からＲｅｅｄａｎｄ
　’Ｍｕｅｎｃｈ法にて推計学的に求めその中のウィル
ス量をＩ　ＴＤＳ。とし逆算して元の試料中のウィルス
■をＴＤ、。数で表わした。ウィルスｉｔ　１０’〜１
０’　ＴＤ２゜／　ｍｌのＥＢウィイル液を得た。

（２）ＥＬＩＳＡによる抗緑膿菌抗体価の測定抗緑膿菌
表層抗原抗体価の測定は以下の方法で行なった。波長６
００ｎｍにおける吸光度が０．２となる様に緑膿菌を燐
酸緩衝液（ｐＨ１，２、組成ＮａＣ１（８ｇ／Ｅ　）、
ＫＣＩ　（０，２ｇ／　ｌ　）、ＮａＨＰｏ、　１２１
１２０　（２，９９ｇ／　ｆｆ１）およびにＨｚＰＯａ
（０，２ｇ／ｊり　　：　Ｐ　Ｂ　Ｓと略）へ懸濁し、
９６ウエルマイクロプレート（フアシヨン１３９１２）
（マイクロブレートと略）に１ウェル当り５０μｌずつ
分注、２．００Ｏｒｐｍ１５分間遠沈した。２％グルク
ールアルデヒドを１ウェル当り５０μ尼ずつｊＫ加し菌
体をマイクロプレートに固定した。

マイクロプレートから菌体溶液を除去した後３％ウシ血
清アルブミン（以下ＢＳＡと略称する）ＰＢＳ溶液を１
ウエルあたり１２０μｉずつ分注し３７°Ｃにて３０分
間インキュベートすることにより菌体の未吸着部分をブ
ロッキングした。マイクロプレートを抗原吸着プレート
として以後の操作に用いた。　必要に応じてこの段階で
一２０°Ｃに保存した。アッセイ前に抗原吸着プレート
を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ　　（以下ＰＢ
ＳＴと略）で３回洗滌した。　その後１％ＢＳＡ含有Ｐ
ＢＳＴを１ウエルあたり５０ｕｌｔ分注、必要に応じ１
％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで適宜希釈した試料（血清腹水又
は培養上清）を１ウエルあたり５０μ２加え、３７°Ｃ
で２時間インキュベートした。　その後試料を除去し、
ＰＢＳＴで３回洗滌した。　続いて第２抗体液を１ウエ
ルあたり１００μｌずつ加え、３７°Ｃで２時間インキ
ュベートした。　第２抗体として１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
で５００〜１　、０００倍希釈したホスファターゼ標識
アフィニティ精製抗ヒト免疫グロブリン抗体（Ｋｉｒｋ
ｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂ、　Ｉｎｃ、）
を用いた。ＩｇＧ、ＩｇＭ抗体価の測定にはそれぞれホ
スタフアーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体
を用いた。第２抗体を除去し、ＰＢＳＴで３回洗滌後、
発色基質溶液（３ｍｇ　　のＰ−ニトロフェニルリン１
−２−ナトリウム塩をｌｄのＮａＮ＊（０，２ｍｇ／１
ｆｆｉ１り　ＭｇＣ１ｇ　・６１ｈＯ（０，１ｍｇ／ｄ
）を含む１０％ジェタノールアミン緩衝？ａ　ｐＨ９，
１に？８解した水溶液）を１ウエルあたり　１００μβ
ずつ加え、３７°Ｃで反応させた。４５分間反応後、３
Ｎ　Ｎａ０ｔｌを１ウエルあたり２０μｉずつ加えるこ
とにより反応を停止した。反応後の００．。、をマルチ
スキャン（ＴｉｔｅｒＬｅｋ）で測定した。

（３）ヒト末梢血からのリンパ球の調製血清中の複数の
血清型緑膿菌に対する抗体価が高かったヒトの末梢血１
００ｍｆｆ１を採取した。遠心管（住友ベークライト、
５０ｍ！容積）に１５ａ＋ｆｆｉのモノポリ分離液（Ｆ
ｌｏｗ　Ｌａｂ、）を入れ、その上に更に末梢血２０戚
を静かに重層した。　低速遠心機（トミー精よりＳ−２
０Ｂ１１）を用い２．５０Ｏｒｐｍ　（ロークーＴＳ−
７）で室温１５分間遠心分離し赤血球とリンパ球を分離
した。リンパ球を含む部分を回収し、１０％ＦＣ３含有
ＢＰＭ１１６４０培地（以下培地と略）で２回洗滞した
後、細胞数を計算した。その結果１．２Ｘ１０’ケのリ
ンパ球を得た。

（４）　Ｅ　Ｂウィルス形質転換法による抗緑膿菌ＬＰ
Ｓ抗体産生株の樹立 ヒト末梢血リンパ球２Ｘ１０’ｌｌｌ胞を２ｄの培地に
懸濁し前述のＥＢウィイル液１０ｄ　（ウィルス量１０
’　　ＴＤｓｏ／＃ｆｆ１）を加え５％ｃｏ、、　３７
°Ｃにて２時間インキュベートした。

ＥＢウィイルの感染したヒトリンパ球を１５％牛脂児血
清、１０％ＮＣＴＣ１０９組織培養培地およびペニシリ
ン（１００１１／ｄ）　、ストレプトマイシン（１００
μｇ／ｍｌ　）　、アルギニン（０，２＋ｍｇ／ａｄ）
、オキザロ酢酸（０，１５ｍｇ／　ｍ）、ピルビン酸ナ
トリウム（０，０５−ｇ／ｄ）、ウシインシュリン（０
，２［１／ｄ）を含むダルベツコ改変イーグル最小培地
（以後細胞株樹立用培地と略す）に懸濁しく約２Ｘ１０
Ｓ細胞／−）、あらかじめマウス腹腔浮遊細胞（約ｌＸ
ｌ０’細胞／ウエル）を入れておいた２４穴培養プレー
トに１ウェル当り　０．５ｍｆｆ１ずつ播種した。培養
１週間後から３日毎に半量ずつ新鮮な細胞株樹立培地と
交換し、約１ケ月後に細胞を回収して細胞融合に用いた
。

（５）　Ｅ　Ｂウィルス形質転換細胞を用いた細胞融合
ＭＯＰＣ−２１ラインに由来しＨＧＰＰＴ　（ヒポキサ
ンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ
）を欠如するマウスＢＡＬＢ／Ｃミエローマ細胞、Ｐ３
　Ｘ　６３−４ｇ８．６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８
０）を細胞株樹立用培地で継代培養しておき、そのうち
ｌ×１０’細胞をイーグル最小培地にて３回洗浄した。

前項で形質転換して得られたＥＢウィイル形質転換細胞
２Ｘ１０’細胞をイーグル最小培地にて３回洗滞し１０
７ケのミエローマ細胞を遠心管（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃２５
３３０）内にて混合して４００　Ｘ　ｇで７分間遠心し
ペレットとしたこのペレットにｌｄのＰ　Ｅ　０４００
０（４５％ＰＢＳ溶液、メルク社）を１分間に遠心管を
回転座せながら、更にピペットにて撹拌しつつ添加後、
室温にて１分静置した。　　５分間に９−のイーグル最
小培地を加え希釈した後、３７°Ｃにて１時間保温した
。　遠心後のペレットを細胞株樹立川培地１００ｄに！
ｇ濁しｌウェル当り１：Ｘ１０’ケのミエローマ細胞と
なるよう９６ウヱルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ＃
３０４０）に分注した。同時にｆｅｅｄｅｒ　１ａｙｅ
ｒとして３Ｘ１０’細胞／ウエルとなるようマウスＢ　
Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ牌臓肺臓を各ウェルに添加した。このマ
イクロプレートを５％ＣＯｔ、３７°Ｃにて培養し翌日
より２〜３日ごとに選択培地にて半量を培地交換した。

融合約２週間後、増殖のみられたウェルの培養上清につ
いてＥＬ　Ｉ　ＳＡにより複数の血清型の緑膿菌に対す
る抗緑膿菌菌体抗体産生の有無を調べた。その中から抗
体価の比較的高いウェル中の融合細胞（ハイブリドーマ
）を拡大培養すると同時に限界希釈法（ｌｉｍｉｔｉｎ
ｇｄｉｌｕｔｉｏｎ）によりクローン化した。　約２週
間後、クローンの培養上清についてＥＬＩＳＡ法により
複数の緑膿菌に対して結合する、共通抗原決定部位に対
する抗体であることを確認した。　そのクローンを２４
穴培養プレート（ＭＳ−３０２４０、住友ベークライト
）、Ｔ〜２５培養フラスコ（＃２５１００、コーニング
）、Ｔ−７５培養フラスコに＃２５１１０；コーニング
）を用い拡大培養した。　同クローンをハイブリドーマ
ＦＫＦ−１Ｆ３と命名し、工業技術院微使物工業技術研
究所に微工研菌寄第９７８４号として寄託した。

ヒトモノクローナル抗体ＦＫＦ−１Ｆ３はＩｇＭ（μ、
に）であった。

実施例２．　ＦＫｒ’−１Ｆ３が認識する抗原の解析（
１）緑膿菌リボ多糖体（Ｌ　Ｐ　Ｓ）の調製緑膿菌ＬＰ
Ｓの調製はりｅｓｔｐｈａｌらの方法（Ｉｎ”Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉ
ｓＬｒｙ’　ｖｏｌ、　５゜ｐ、８３−９１．　Ａｃａ
ｄｅｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、、　（１９６５）
）に準じて行なった。すなわち４ｇの湿菌体を６５〜６
８°Ｃに加温した４５％フェノールで処理した後、１０
°Ｃ以下に冷却、３０００ｒｐｍ　１５分遠心分離し、
水層にＬＰＳを抽出した。　水層を水に対し透析、フェ
ノールを除いた後減圧濃縮しＬＰＳミセルを形成せしめ
、それを超遠心にかけＬＰＳを回収した。　Ａ型標準株
＋１０１００１．　Ｅ型菌株Ｐ　ＡｌＯ３，Ｇ株標準株
＋１０１０２０のＬＰＳ各々２ｍｇを得た。使用した緑
膿菌菌体は東京大学医科学研究所菌株保存施設より分与
された。

なおＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）からも入手可能であ
る。

（２）ウェスタンプロット法による抗原の解析緑膿菌Ａ
型、Ｅ型ＬＰＳを小室らの方法（第３３回毒素シンポジ
ウム予講集、ρ、９４〜９９、大阪、（１９８６）　）
によりデオキシコール酸（ＤＯＣ，）／ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動後、ゲルをトランスファーバッファー
（２５ｍＭ　）リス・　１９２ｍＭグリシンｐＨ８，３
，２０％（Ｖ／Ｖ）メタノール）に４℃−夜浸漬した。

　次いでデュラボラ膜（ミリポア）に室温にてトランス
ファーし、２％カゼイン含有ＰＢＳで室温、１時間イン
キュベートすることによりブロッキングした。　更に０
．１％ＢＳＡ、１０％ＦＣ３含有ＴＢＳで室温、１時間
インキュベートすることによりブロッキングされたデュ
ラボア膜をＦＫＦ−１Ｆ３培養上清及びコントロールと
してＥ型〇−抗原を認識する特異的なヒトモノクローナ
ル抗体ｌｌｌ−００６（［ｇ　Ｍ　）の各々の水１ｆｌ
Ｗｔを３７°Ｃ１時間、続いて４°Ｃ−夜インキユベー
トした。

０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０含有Ｔ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ８
，０）でニトロセルロース膜を５回洗浄した後、第２抗
体（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅａｎ　２０含有ＰＢ
Ｓにて３．０００倍希釈されたベルオキシターゼ標識抗
ヒトイムノグロブリン抗体）と３７°Ｃ１時間インキュ
ベートした。

同様に０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０含有Ｐ　Ｂ　Ｓ　（
ｐＨ８，０）で５回洗浄後、発色試薬（０，５ｍｇ／１
ｌｌｆｆｉクロロナフトール、２０％メタノール、０．
０８％１１□Ｏ１を含むＰ　Ｂ　Ｓ、　ｐＨ７゜５）を
添加し発色させた。その結果、Ａ型録膿菌ＬＰＳを電気
泳動したレーンにおいて、ヒトモノクローナル抗体ＦＫ
Ｆ−１Ｆ３との反応で、ハシゴ状に発色したバンド群を
認めた。しかしながらＥ型録膿菌ＬＰＳを電気泳動した
レーンでは何ら反応しなかった。一方コントロールの旧
−００６ではＥ型ＬＰＳを電気泳動したレーンでハシゴ
状のバンドを認めたが他のレーンにおいては発色は認め
られなかった。

実施例３．　　ヒトモノクローナル抗体ＦＫＰ−１Ｆ３
のＥＬＩＳＡによる結合スペクトラムの検討（１）　　
緑膿菌血清型別標準株との結合性ＦＫＦ−１Ｆ３と緑膿
菌血清型標準株との反応を実施例１−（２）の項に記載
のごと＜　　ＥＬＩＳＡ法で調べた（表２）、菌株は東
京大学医科学研究所菌株保存施設より分与を受け、ハー
トインフュージョン寒天培地又はハートインフュージョ
ンブイヨン培地を用いて培養した。

血清型別　　　　　菌株　　　結合活性（００４０５）
　”Ａ　　　　　　　１１０１００１　　　　０．６Ｂ
　　　　　　　１１０１００２　　　　　０Ｂ　　　　
　　　１１０１００７　　　　　０Ｂ　　　　　　　１
１０１０１３　　　　　０Ｂ１１ｏ５００４０ ＣＩＩＤ１０２１０ ＤＩＴＤ１００４０ Ｅ　　　　　　　　　　ＩｒＤ１１３０　　　　　　　
　０ｐ　　　　　　　Ｉ　ｒｏ１００６　　　　０．４
Ｇ　、　　　　　　１１０１０２０　　　　０．４＋＋
　　　　　　　１１０１００９　　　　　０ｒｌｌＤ１
０１００ Ｊ　　　　　　　ｌＩＤ１ｏ１１　　　　　０ＫＩＩ０
１０１２０ Ｌ　　　　　　　１１０５１４１　　　　　０門　　　
　　　１１０５０１８　　　　０．ＩＭ　　　　　　　
ｒｒＤ１０１５　　　　０．３＊　ＥＬＩＳＡにおける
呈色反応（４５分間）後の吸光度Ａ型、Ｆ型、Ｇ型およ
びＭ型の緑膿菌血清標準株へ選択的に結合した。

（２）緑膿菌臨床分離株との結合性 ＦＫＦ−１Ｆ３はＡ型、Ｆ型、Ｇ型、Ｍ型の緑膿菌血清
型標準株と結合する事が判明した。そこで、臨床上高頻
度で分離されるＡ型、Ｃ型に関し、臨床分離株各々１９
株との反応を調べた。その結果Ａ型臨床分ｋＩ株１４株
（７４％）、Ｇ型臨床分刈株１０株（５３％）と結合し
た（表３及び４）。

表３．　ＰＫＦ−１Ｆ３のＡ型臨床分離株との結合性菌
株　　　結合活性（００４０５）” ５Ｐ６７４５　　　　　０．８ ＳＰ６７４６　　　　　１．０ ＳＰ６７８３　　　　　１．２ ＳＰ６８１８　　　　　２．５ ＳＰ６８３０　　　　　０．６ ＳＰ６８４０　　　　　２．４ ＳＰ６７８３　　　　．１．３ ＳＰ９７１０　　　　　２．０ ＳＰ９７１１　　　　　１．６ ＳＰ９７３１　　　　　０．１ ＳＰ９７６２　　　　　０．１ ＳＰ９７６３　　　　　０．１ ＳＰ９７６８　　　　　１．６ ＳＰ６７８３　　　　　２．１ ＳＰ１００２９　　　　１．４ ＳＰ１００４０　　　　０．２ ＳＰ１００６０　　　　０．６ ＳＰ１０６１８　　　　１．７ ＳＰ１０６７６　　　　０．２ ＊　ＥＬＩＳＡにおける呈色反応（４５分間）後の吸光
皮表４　、　ＦＫＦ−１Ｆ３のＧ型臨床分離株との結合
性菌株　　　結合活性（００４０５）“ ５Ｐ９７０４　　　　　１．７ ＳＰ９７０９　　　　　１．６ ＳＰ９７１２　　　　　０．１ ＳＰ９７１４　　　　　１．４ ＳＰ９７１７　　　　　　０ ＳＰ９７１８　　　　　０．８ ＳＰ９７３８　　　　　０．７ ＳＰ９７８５　　　　　１．１ ＳＰ９７４３　　　　　１．８ ＳＰ９７９２　　　　　０．１ ＳＰ９７５５　　　　　０．１ ＳＰ９７６１　　　　　　０ ＳＰ９７６７　　　　　１．３ ＳＰ９７７２　　　　　　０ ＧＮ１１１８７　　　　　０ ＴＬ２３７８　　　　　１．７ ＴＬ２４２４　　　　　　０ ＳＰ６７８８　　　　　１．３ ＳＰ６７８３　　　　　Ｏ，３ 幸ＥＬＩＳＡにおける呈色反応（４５分間）後の吸光度
又、緑膿菌の慢性気道感染症に多く検出されるＭ型に関
し臨床分離株２０株との反応を調べた結果、菌株入手先
により片寄りが認められ、１０〜９０％のｐｎ臨床分離
株結合した（表５）。

表５．　ＦＫＦ−１Ｆ３のＭ型臨床分離株との結合性菌
株　分離場所５分離年度　結合活性（００４０５）　”
ＳＰ９７３８　　　　　　　　　　０．１ＳＰ９７３０
　　　　　　　　　　０．１ＳＰ９７４４　　　　　　
　　　　０．１ＳＰ９７４８　　　東京周辺　　　　０
．４ＳＰ９７４９　　　　　　　　　　０．１ＳＰ９７
５２　　１９８４年　　　　　０．１ＳＰ９７７５　　
　　　　　　　　　０ＳＰ１００６７　　　　　　　　
　１．１ＳＰ１０６７５　　　　　　　　　０．１ＳＰ
６７６３　　　　　　　　　　１．０ＳＰ６７６４　　
　　　　　　　　０・９ＳＰ６７６５　　　　　　　　
　　０．９ＳＰ６７８２　　　　　　　　　　１・２Ｓ
Ｐ６７９４　　　京都周辺　　　　１．０ＧＮ６８３３
　　　　　　　　　　０．６ＴＬ６８５２　　１９８４
年　　　　　１．１ＴＬ６８９０　　　　　　　　　　
０．１ＳＰ６８９２　　　　　　　　　　１・１ＳＰ６
８９５　　　　　　　　　　０・８ＳＰ６９０８　　　
　　　　　　　０．８傘ＥＬＩＳＡにおける呈色反応（
１５分間）後の吸光度実施例４．　ヒトモノクローナル
抗体ＦＫＦ−１Ｆ３の大腸菌Ｊ５への結合性 ＦＫＦ−１Ｆ３の大腸菌Ｒｃ型変異株Ｊ５との反応性を
実施例１−（２）の項に記載のごと＜ＥＬＩＳＡ法で調
べた（表５）。　大腸菌Ｊ　５　（ＡＴＣＣ３９３５５
　）はハートインフュージョン寒天培地を用いて培養し
た。

表６　　ＦＫＦ−１Ｆ３の大腸菌Ｊ５との結合性菌　株
　　　　　　　　　　総合性（Ｏｆｔ、。、）大腸菌　
Ｊ　５　　　　　　　　　０．３緑膿菌　１１［１１０
０１（陽性対照）０．６（＝）Ｏ ＦＫＦ−１Ｆ３は陽性対照である緑膿菌■１０１００１
（血清型別Ａ）と強く、大腸菌Ｊ５では弱く結合した。

実施例５．　競合実験による結合選択性の検討ＦＫＦ−
１Ｆ３は、緑膿菌１１０１００１　（血清型別Ａ）およ
びＴＩＤ　１０２０　（血清型別Ｇ）の菌体へ結合する
ことが確認されたので、更に結合特異性を実施例１−（
２）のごとく菌体プレートを用いたＥＬＩＳＡにおける
競合反応系で調べた。競合物質として緑膿菌ｒｒ［ｌ　
１００１　（Ａ）　、ｒｌｆｌ　１００２　（Ｂ　）　
、ＰＡ１０３（Ｅ）および１１０１０２０　（Ｇ　）　
、大腸菌０１１１　ｉＢ４およびＪ５のそれぞれのＬＰ
３５０μｇ／ｄを用いた。（）は血清型別を示す、結果
を表７に示す。

表７ 抗原プレート　競合物質（ＬＰＳ）の由来　００．。。

〃　Ｐ＾１０３　　　　２．４ （−）　　　　　　　　　２．３ ＃　　ＰＡ１０３　　　　０．９ ＃　　１１０１０２０　　　０．７ （−）　　　　　　　　　０．９ 緑膿菌ｒｒｏ　１ｏｏｉおよびＩＩＤ　１０２０の両方
の菌体プレートにおいて、！１０１００１由来のＬＰＳ
が強くＦＫＦ−１Ｆ３の結合を阻害した。１１０１０２
０由来のＬＰＳも弱い阻害活性を示したが、他のＬＰＳ
は阻害活性が無いか、又は極めて弱いものであった。

実施例６．　ヒトモノクローナル抗体ＦＫＦ−１Ｆ３の
緑膿菌由来リボ多ｔＪ！ＬＰ、Ｓに対する結合性縁ｍｖ
Ｍ由来Ｌ　Ｐ　Ｓ　（Ｉ　ｔｔ　ｇ／ｍｌ）　、７オス
７ｙチジルコリン（５μｇ／ｌｌ１１）、コレステロー
ル（２゜５ｔｔｇ／ｍＡ＞　をエタノールに溶解・混合
した溶液を１穴あたり１０μｌずつ９６穴プレートに添
加し、３７°Ｃに２時間放置することにより乾燥させた
。その後、１００μ！の３％ＢＳＡ−ＰＢＳを添加し、
室温にて２時間反応させてプロフキングすることによっ
てＬＰＳを抗原とする抗原プレートを作製した（にａｎ
ｎａｇｉ　＆　ｌｌａｋｏｍｏｒｉ　：　Ｉｎ　Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ１＃僻ｕｎｏｌｏＨｉｃａｌ　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　：ｎ　Ｂｉｏ＋５ｅｄｉｃａｌ　５ｃ
ｉｅｎｃｅｐｐ−１１７，１〜１１７．２０＋　１９８
６．　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。

０ｘｆｏｒｄ）　ｅ ＥＬＩＳＡは、ＰＢＳＴの代わりに０．５％ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳを用いた以外は実施例１−（２）のごとく行った。

結果を表８に示す。

緑膿菌１１０１００１　（血清型別Ａ）由来のＬｒ’Ｓ
と強く結合した。又、緑膿菌ＴＩ０１０２０　（血清型
別Ｇ）由来のＬＰＳとも弱く結合した。

実施例７．　ヒトモノクローナル抗体ＦＫＦ−１Ｆ３の
サルモネラ菌由来ＬＰＳおよびリピドＡに対する結合性 ＥＬＩＳＡにおける競合反応によってサルモネラ・ミネ
ソタの一連のＬＰＳに対する結合を検討した。競合物質
としてＬＰＳおよびリビドＡを２゜５μ−１２５μ門の
濃度で抗体と混和、３７°Ｃ１１時間インキュベートし
た後、緑膿菌１１０１００１菌体を固定した９６穴プレ
ートでＥＬＴＳＡを行い、阻害の割合を測定した。サル
モネラ・ミネソタのＬＰＳおよびリビドＡは、高精製Ｌ
Ｐ、Ｓキット（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）を用いた。結果を表
９に示す。この結果ＦＫＦ−１Ｆ３はリピドＡおよびラ
フ型（Ｒｃ、、Ｒｄ、　Ｒｅ）　Ｌ　Ｐ　Ｓと強く結合
することが示された。

表９　サルモネラ・ミネソタ　リボ多糖体およびリピド
Ａに対する結合性 ０．２５ａＭ２５μ河 Ｒｅ　　　　　　Ｏ，０３０ 実施例８．　ヒトモノクローナル抗体ＦＫＦ−１Ｆ３の
各種グラム陰性菌リピドＡに対する結合性各種ダラム陰
性菌すビドＡとＦＫＦ−１Ｆ３の結合を実施例７と同様
にＥＬ［ＳＡを用いた阻害実験によって行った。

大腸菌Ｊ５由来リピドＡ、　サルモネラ・ティフィムリ
ウムＲｅ−ｍｕｔａｎｔ由来リピドＡ（すｉｂｉＴｍｍ
ｕｎｏｃｈｅｍ、　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、、　Ｈ
ａ＋ｗｉｌｔｏｎ、　ＭＴ）、サルモネラ・ミネソタＲ
５９５由来リピドＡ　（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、　）を用いた
。緑ＩＪＩＩＩ０１００１のＬＰＳおよびリビドＡは、
以下の方法によって調製した。リボ多糖はＷｅｓｔｐｈ
ａｌとＪａｎｎの方法即ち、４５％熱フェノールによっ
て抽出した水溶性画分を臭化セチルトリメチルアンモニ
ウム（Ｃｅｔａｖｌｏｒ＠、半井化学）で脱核酸の後、
エタノール沈澱を標品とした（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃａｒ
ｂｏｈｙｄｒ。

Ｃｈｅｍ、、　５．８３−９１．１９６５）。リビドＡ
はＬＰＳを１％酢酸で１００°Ｃ，９０ｍ１ｎ加水分解
後、クロロホルムによって抽出したものをリビドＡ標品
とした（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５２．３３１
−３４３．１９７５）。

実験はサルモネラ・ミネソタＲ５９５由来リビドＡをコ
ートしたプレートを用いて実施例７と同様に５０μｇ／
ｒｒｄｌのリビドＡを競合物質としてＥＬＩＳＡを行っ
た。結果を表１０に示す。表１０からＦＫＦ−Ｉ　Ｆ３
は各種のダラム陰性菌のリピドＡに結合することが示さ
れた。

リピドＡ　　　　　　　　　　ＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４゜
、）（−）　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．
０７実施例９．緑膿菌ＬＰＳへの結合性 緑膿菌１１０１００１　Ｌ　Ｐ　Ｓへの結合性を、大腸
菌およびサルモネラ・ミネソタのＬＰＳと比較した。

実験は実施例８に従ってサルモネラ・ミネソタＲ５９５
のリピドＡをコートしたプレートを用いてＰ。

ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＩＩＤ　１００１の１ｎｔａｃ
ｔ　　Ｌ　Ｐ　ＳとリピドＡ（実施例日参照）、大腸菌
及びサルモネラ・ミネソタのスムース型ＬＰＳ、リピド
Ａを競合物質としてＥＬＩＳＡを行った。競合物質濃度
は５０μｇ／−である。結果を表１１に示した。リピド
Ａではいずれの菌由来のものでも結合するが、スムース
型リボ多糖では緑膿菌でのみ結合が見られた。スムース
型ＬＰＳで結合が見られないのは、水溶液中ではＬＰＳ
がミセルを形成しており、多糖部分の立体障害により、
リビドＡ部分が露出していないためと考えられる。緑膿
菌においては、リピドＡ以外にも抗体結合部位のあるこ
とを示す。

表１１ 競合物’！ｒ　　　　　　　　　　　ＥＬＩＳＡ値（０
０４１１５）（−）　　　　　　　　　　　　　　　　
１．１２実施例１０．ＦＫＦ−１Ｆ３とキチンの結合Ｔ
’ｅｎｇらは既に抗大腸菌Ｊ５ＬＰＳヒト単りローン性
抗体（ＩｇＭ）を得ている（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２．１７９０−１７９４．
１９８５）。この報文で、この抗体がキチン（Ｎ−アセ
チルグルコサミンホモポリマー）と結合することを示し
ている。本例ではＦＫＦ−１Ｆ３とキチンの結合を検討
した。サルモネラ・ミネソタＲ５９５由来リピドＡをコ
ートしたプレートを用いてＥＬＩＳＡによる阻害実験を
実施例日と同様に行った。競合物質とし、て用いたキチ
ンはカニ甲出来粉末状（半井化学、京都）を用いた。結
果を表１２に示す。　ＦＫＦ−１Ｆ３はキチンとの交差
反応が見られずＴｅｎｇらのヒト抗大腸菌Ｊ５リポ多糖
抗体とはエピトープを異にする。

表１２ 競合物質　　　　　　　　ＥＬＩＳＡ４直（００４゜、
）（−）　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０７
実施例１１．ＬＰＳの多糖部分の単離及び分画と抗原の
解析 （１）緑膿菌ＬＩＤ　１００１株ＬＩ’Ｓの多糖部分の
単雛及び分画 緑膿菌１１０１００１株のＬＰＳから　Ｗｉ　Ｉｋｉｎ
ｓｏｎとＧａ１ｂｒａｉｔｈの方法（Ｓ、Ｇ、Ｗｉｌｉ
ｎｓｏｎ　＆　Ｌ、Ｇａ１ｂｒａｉｔｈ。

Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　５２．３３１　（１９７
５））により多糖部分を単認及び分画を行った。すなわ
ち、ＬＰＳ　（１０ｍｇ　）をＬＯｍｌの１％酢酸に溶
解し、１００℃で９０分の条件で加水分解した後、遊離
したリピドＡをクロロホルムとの分配によって除いた。

得られた水溶性画分を５０ＩｗＭピリジン・酢酸緩衝液
（ｐｌ＋　５．５）で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ■−
Ｇ５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。

Ｕｐｐｓａｌａ）のデキストランを担体とするカラムク
ロマトグラフィー（カラムサイズｌＸ７０ｃｍ）によっ
て分画した。多糖、セミラフ型コアオリゴ糖及びラフ型
コアオリゴ糖の溶出位置は以下に示す比色定量法で検出
した。中性糖はフェノール・硫酸法 （Ｍ、Ｄｕｂｏｉｓ、　ｅｔａｌ、、　Ａｎａｌ、　Ｃ
ｈｅＩａ、　２８．３５０．１９５６）。

アミノ糖は試料を２規定硫酸で、１００’Ｃ，２時間加
水分解した後Ｍ８ＴＩ＋（３−メチル・２−ベンゾチア
ゾリノンヒドラゾン塩酸塩）法（Ａ、Ｔｓｕｊｉ　ｅｔ
ａｌ、、　ＣｈｅＩＩＩ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、
、　１７２１７．１９６９）によった、多糖、セミラフ
型コアオリゴ糖及びラフ型コアオリゴ糖はそれぞれの両
分を凍結乾燥し回収した。（２）　　ヒトモノクローナ
ル抗体ＦＫＦ−１Ｆ３の多糖画分への結合 ＥＬＪＳＡにおける競合反応によって、実施例１２−　
（１）で得られた、緑ｉｌｌ菌１１０１００１株由来の
多糖、セミラフ型ニアオリゴ糖及びラフ型オリゴ糖各画
分とＦＫＦ−１Ｆ３の競合を検討した。ＥＬＩＳＡにお
ける競合反応は実施例７のごとく行った。

競合物質の量は、実施例１２−（＋）にあるフェノール
・硫酸法により、中性糖２０ｎｍｏｌ相当を用いた。結
果を表１３に示す。

以上の結果と実施例２−（１）のウェスタンブロッティ
ングからＦＫＦ−１Ｆ３の認識するエピトープはリピド
Ａ以外に緑膿菌の一部の菌株では多糖部分にも存在する
ことが示された。

実施例１２　ヒトモノクローナル抗体ＦＫＦ〜１Ｆ３に
よるマウス実験的緑膿菌感染症の治療効果（１）血清型
Ｇ緑ＭＭ菌による感染に対する治療効果緑膿菌臨床分離
株５Ｐ６７８８　（Ｇ型）　　１．２Ｘ１０’、６゜２
　ＸＩＯ’細胞をＩＣＲ−ｓｌｃマウス（４週令、雄、
１群１０匹）の腹腔内に接種した。　　１時間後にヒト
モノクローナル抗体ＦＫＦ−１Ｆ３　（０，１μｇ）を
腹腔内に投与した。　　１週間後の生残率をもって治療
効果を判定した。

表１４．　ＦＫＦ−１Ｆ３のＧ型臨床分離株５Ｐ６７８
Ｂに対するＦＫＦ−１Ｆ３　０．１μｇ／ｈｅａｄ　　
１００　　　　１００Ｎｏ　ｎ　ｅ　　　　　−２０３
０ その結果を表６に示す、　　ＦＫＦ−１Ｆ３投与群では
１．２ＸＩＯ’、又は６．２Ｘ１０’ＣＰＵ／マウスの
接種菌量の系で金側が生残し、感染治療効果が認められ
た。

（２）血清型Ａ型録膿菌による感染に対する治療効果緑
膿菌臨床分離株５Ｐ６８１Ｂ　（Ａ型）　　３．７Ｘ１
０’〜７．３　Ｘ　１０’細胞を５％ムチンＩＣＲ−ｓ
ｌ’ｃマウス（４週令、雄、１群１０匹）の腹腔内に接
種した。１時間後にヒトモノクローナル抗体ＦＫＦ−１
Ｆ３（０，１μｇ）を腹腔内に投与した。　　１週間後
の生残率をもって治療効果を判定した。　表７に示すご
と＜　ＦＫＦ−１Ｆ３投与群では１．５　Ｘ　１０’Ｃ
ＦＵ／マウスの接種菌量の系で治療効果が認められた。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）緑膿菌の複数であるがすべてではない血清型別菌
   のＬＰＳに特異的に反応するヒトモノクローナル抗体
2. （２）日本緑膿菌研究会血清型別検討委員会によって分
   類される血清型別Ａ、Ｇ、ＦおよびＭの緑膿菌のＬＰＳ
   に共通する抗原決定基を認識することを特徴とする、第
   １請求項記載のヒトモノクローナル抗体
3. （３）抗原決定基がＬＰＳ中の多糖類であることを特徴
   とする第２請求項記載のヒトモノクローナル抗体
4. （４）グラム陰性菌由来のリピドＡに交叉反応すること
   を特徴とする第１、第２又は第３請求項記載のヒトモノ
   クローナル抗体
5. （５）大腸菌、サルモネラ菌および緑膿菌由来のリピド
   Ａに交叉反応することを特徴とする第４請求項記載のヒ
   トモノクローナル抗体
6. （６）大腸菌変異株Ｒｃ変異株に反応することを特徴と
   する第５請求項記載のヒトモノクローナル抗体
7. （７）大腸菌Ｒｃ変異株Ｊ５（ＡＴＣＣ３９３５５）に
   反応することを特徴とする第６請求項のヒトモノクロー
   ナル抗体
8. （８）ＩｇＭであることを特徴とする第１、第２、第３
   、第４、第５、第６または第７請求項記載のヒトモノク
   ローナル抗体
9. （９）ヒトモノクロナール抗体ＦＫＦ−１Ｆ３
10. （１０）第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、
    第８または第９請求項記載のヒトモノクローナル抗体を
    含む細菌感染症および／又はグラム陰性菌によるエンド
    トキシンンショック予防・治療剤
11. （１１）第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７ま
    たは第８請求項記載のヒトモノクローナル抗体を産生す
    るエプスタイン・バー（ＥＢ）ウィルス形質転換細胞株
    およびそれに由来する子孫細胞株
12. （１２）エプスタイン・バー（ＥＢ）ウィルス形質転換
    細胞を含むヒトＢリンパ球と骨髄腫細胞（ミエローマ）
    との細胞融合によって得られ、第１、第２、第３、第４
    、第５、第６、第７または第８請求項記載のヒトモノク
    ローナル抗体を産生するハイブリドーマおよびそれに由
    来する子孫細胞株
13. （１３）ハイブリドーマＦＫＦ−１Ｆ３およびそれに由
    来する子孫細胞株
14. （１４）第１１、第１２または第１３請求項記載の抗体
    産生細胞を細胞培養し、その培養上清より抗体を回収、
    精製することから成るヒトモノクローナル抗体の製造方
    法