AT395591B - Humaner monoklonaler antikoerper, verfahren zu dessen herstellung, arzneimittel und hybridzelle - Google Patents

Description

AT 395 591B

Die Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper auf Pseudomonas aeruginosa (im folgenden bezeichnet als „P. aeruginosa“ oder „PA“), dessen Herstellung und Verwendung sowie Hybridzellinien. Insbesondere betrifft sie einen humanen monoklonalen Antikörper, der eine bei Lipopolysacchariden in P. aeruginosa verschiedener Serotypen übliche Struktur erkennen kann, und eine Bindungsfähigkeit an P. aeruginosa von zwei oder mehr 5 Serotypen besitzt, sowie dessen Herstellung und Verwendung.

Der humane monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung besitzt, wie vorstehend angegeben, eine Bindungsfähigkeit an P. aeruginosa von zwei oder mehr Serotypen und auch an Lipid A von Gram-negativen Bakterien, insbesondere Bakterien, die zu Escherichia, Salmonella und Pseudomonas gehören, so daß er geeignet ist zur Verhinderung und Behandlung infektiöser Erkrankungen, die von P. aeruginosa verursacht werden, und auch von 10 Endotoxin-Schock, der von Gram-negativen Bakterien verursacht wird.

Bakterien, die infektiöse Erkrankungen verursachen, i. e. prophlogistische Bakterien, variieren mit derEntwick-lung und dem Wechsel von klinisch verwendeten Antibiotika. Als Ergebnis davon können infektiöse Erkrankungen durch Bakterien zunehmen, die ursprünglich nur eine geringe Pathogenität oder Virulenz besaßen. P. aeruginosa sind derzeit eine der wesentlichen pathogenen Bakterien, die infektiöse Erkrankungen hervorrufen, deren ernsthafte IS Symptome häufig zum Tode der Patienten fuhren, insbesondere dann, wenn deren immunologische Widerstandsfähigkeit aufgrund einer dauernd«! Verabreichung von Immunsuppressiva gering ist, nämlich Patienten, die an Krebs erkrankt sind oder Verbrennungen oder dergleichen haben.

Unter den präventiven und therapeutischen Methoden gegen bakterielle Infektionen ist die Chemotherapie unter Verwendung von Antibiotika oder antimikrobiellen Agenzien am bedeutendsten. Es wurden hierzu verschiedene 20 Antibiotika entwickelt, einschließlich Streptomycin, Kanamycin, Penicillin, Cephalosporin, etc., die gegen fast alle

Gram-positiven Bakterien (z. B. Staphylococci) und Gram-negativen Bakterien (z. B. E. coli) wirken und einen überzeugenden klinischen Effekt hervorrufen. Es gibt jedoch nur wenige medizinische Produkte, die gegen P. aeruginosa wirksam sind. Auch diese medizinischen Produkte wirken auf P. aeruginosa nur bakteriostatisch und nicht bakteriozis. Sie können daher das Wachstum von P. aeruginosa verhindern, zeigen jedoch klinisch keinen 25 bemerkenswerten therapeutischen Effekt

Eine weitere präventive oder therapeutische Methode stellt die Antikörper-Therapie dar, die die Verabreichung von Immunglobulin umfaßt Dieses Verfahren wird oft in Kombination miteiner Chemotherapie durchgeführt; heute gilt es auch als ein Ersatz für die Chemotherapie. Ein Serum mit hohem Antikörpertiter kann durch aktive Immunisierung von Tieren, wie Pferden oder Kaninchen, «halten werden; die Antikörper-Therapie erfolgt unter 30 Verabreichung von einem solchen Serum. Die damit zu «zielenden bedeutenden therapeutischen Wirkungen hat man an experimentellen Infektionen an verschiedenen Tieren bestätigt Im Falle von Diphtherietoxin und Vipertoxin weiß man, daß die Antikörper-Therapie unter Verwendung von Seren, die von Tieren stammen, auch am Menschen äußerst wirksam ist. Die Einführung eines heterogenen Proteins, das von Ti«en stammt, in einen menschlichen Körper führt jedoch zu einem ernsthaften Nebeneffekt, wie ein« Anaphylaxe oder zu anderen allergischen 35 Reaktionen. Es ist daher äußerst wünschenswert, ein menschliches Immunglobulin mit einem hohen Antikörpertiter gegen Bakterien zu entwickeln, das einen deutlichen th«apeutisch«i Effekt geg«i bakterielle Infektionen zeigt.

Konventionelle humane Immunglobulin-Präparationen gewinnt man durch Sammeln von Blut von gesunden Personen oder von Bakterien-infizierten Patienten, wobei das Blut ein« Fraktionierung unterworfen wird, um eine Immunglobulinffaktionzu«halten;dieselmmunglobulinfiaktion wird g«einigt und durch Zugäbe vonEthyl«iglykol 40 agglutinierendes Material entfernt; darauf folgt eine Behandlung mit Protease; Sulfonisierung; DEAE-Säulenchromatographie, etc., sowie die Formulierung des «hältenen Produktes zu intramuskulär oder intravenös injizierbaren Präparationen. Diese Präparationen erweisen sich als geeignet, indem sie nicht zu ein« Anaphylaxe oder einem anderen Nebeneffekt führen, wie man ihn bei d« Verabreichung von Immunoglobin, das von Tieren stammt, beobachtet Sie haben jedoch einige Nachteile. Einer d« Nachteile ist daß ihr Antikörpertiter gegen 45 Bakterien so niedrig ist daß eine ausreichende therapeutische Wirkung nicht notwendigerweise einsetzt. Ein weiterer

Nachteil ist daß es schwierig ist, sie in stabiler Form mit einem hohen Antikörpertiter in großen Mengen zur Verfügung zu stellen, da sie durch das Sammeln von Blut von gesunden Personen oder von Bakterien-infizierten Patienten gewonnen w«den, und das konstante und kontinuierliche Gewinnen von Seren mit einem hohen Antikörpertiter sehr schwer ist. Ein weiterer Nachteil ist daß sie mitHepatitisvirus (e. g. HB-Virus), Adult-T-Zellen-50 Leukämie-Virus (ATLV, HTLV), etc. kontaminiert sein könn«i, da das Blut das das Ausgangsmaterial darstellt, von einer Vielzahl unbekannter Personen erhalten wird. Um diese Nachteile zu überwinden, ist es in hohem Masse wünschenswert, einen humanen monoklonalen Antikörper mit einem stark inhibierenden Effekt auf Infektionen durch P. aeruginosa zur Verfügung zu stellen.

Wenn ein Antikörp« an die Oberflächenschicht eines Bakterienkörpers gebunden wird, so beschleunigt sich die 55 Phagocytose des Bäkterienkörpers durch einen Makrophagen (i. e. es findet eine Beschleunigung d« Phagocytose aufgrund von Opsonierung statt), oder es erfolgt eine Lyse des Bakterienkörpers durch ein Komplement. Als Target-Antigen auf d« Oberflächenschicht des Bakterienkörpers P. aeruginosa kennt man Lipopolysaccharid (LPS), -2-

AT 395 591B Hüllprotein, Flagellum, Pilus, etc. Unter diesen besitzt das O-Polysaccharid, das einen Bestandteil von LPS darstellt, und sich an der äußersten Seite der Oberflächenschicht befindet und als „O-Antigen“ bezeichnet wird, eine starke Antigenität, und der Antikörper, der dem O-Antigen entspricht, zeigt im allgemeinen eine stark präventive oder therapeutische Wirkung.

Das O-Antigen ist in seiner chemischen Struktur unterschiedlich, so daß die zu P. aeruginosa gehörenden Stämme aufgrund ihres Unterschiedes in der immunologischen Reaktionsfähigkeit mit einem Anti-Serum oder einem Mausmonoklonalen Antikörper, die auf das O-Antigen des Standardstammes von P. aeruginosa hergestellt wurden, klassifiziertweiden. Diese Klassifizierung bezeichnet man als Serotyp. TypischeBeispieleder Serotyp-Klassifizierung sind folgende: Typen 1 bis 17 gemäß der Klassifizierung durch Homma et al (Japan. J. Exp. Med., 44,1, [1974]), Typen 1 bis 7 gemäß der Klassifizierung durch Fisher et al (J. Bacteriol., 98,835 [1969]), Typen A bis M gemäß der Klassifizierung durch Nippon Ryokunoh-kin Kenkyukai Kesseigata-betsu Kento Iinkai (Committee of Study on Serotype Classification, Japanese Study Group on Pseudomonas aeruginosa [im folgenden als Japanisches Kommittee“ bezeichnet] (Japan. J. Exp. Med., 45,329 [1976]), Typen 1 bis 17 gemäß der Klassifizierung durch das International Antigenic Typing System (IATS), etc. Diese Klassifizierungen und ihre Querverbindungen sind in Tabelle 1 dargestellt (Japan. J. Exp. Med., 46,329 [1976]).

Taten? 1

Serotvo-Klassifizierung von P. aeruginosa

Japanisches Kommittee 1976 Homma et al 1974 IATS 1983 Fisheretal 1969 A 1 3 B 2,7,13,16 2,5,16 3,7 C 3 8 6 D 4 9 - E 5 11 2 F 6 4 - G 8 6 1 H 9 10 5 I 10 1 4 J 11 15 - K 12 13 - L 14 - - M 15,17 - - - - 7,12,14,17 - P. aeruginosa O-Antigen hat eine Polymerstruktur, welche wiederkehrende Einheiten von zwei bis fünf Sacchariden umfaßt; die Sequenz dieser wiederkehrenden Einheiten unterscheidet sich bei jedem Serotyp. Man weiß, daß ein Antikörper, der auf ein bestimmtes O-Antigen spezifisch ist, eine starke präventive oder therapeutische Wirkung gegen Infektionen von P. aeruginosa des Serotyps zeigt, zu dem das genannte O-Antigen gehört, jedoch keinen Effekt gegen P. aeruginosa eines beliebigen anderen Serotyps bewirkt. Es ist auch bekannt, daß man einen humanen monoklonalen Antikörper kontinuierlich durch Verwendung einer etablierten Zellinie, die in der Lage ist, einen spezifischen Antikörper zu bilden, hersteilen kann.

Eine etablierte Zellinie, die in der Lage ist, einen auf das O-Antigen des Lipopolysaccharids von P. aeruginosa spezifischen humanen monoklonalen Antikörper zu produzieren, kann durch Anwendung eines EB (Epstein-Barr)-Virus-Transformationsverfahrens, einer Zellfusions-Methode und dergleichen erhalten werden. So offenbart z. B. JP-Al-61-69796, daß die Transformation von Milz-Lymphozyten, die von Patienten erhalten wurden, die in der Vergangenheit mit P. aeruginosa infiziert worden waren, mit EB-Virus zu EB-Virus-transformierten Zellen führt, die einen auf das O-Antigen vonP. aeruginosa spezifischen humanen monoklonalen Antikörper produzierenkönnen. JP-Al-61-152281 offenbart, daß die Stimulierung von Zellen den Mandeln, die von Patienten mit Tonsillitis erhalten wurden, mit Poke-Weed-Mitogen (PWM) und Fusionierung der stimulierten Zellen von Mandeln mit Maus- -3-

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MyelomzeUen (P3-X63-Ag8-UI-Stamm) zu Human-Maus-Hybridomen führt, die einen auf das O-Antigen von P. aeruginosa spezifischen humanen monoklonalen Antikörper produzieren können. Die vorstehend offenbarten humanen monoklonalen Antikörper sind jedoch auf Serotyp-spezifische humane monoklonale Antikörper begrenzt, i. e. sie besitzen eine Bindungsfähigkeit an P. aeruginosa eines bestimmten Serotyps und zeigen kein Bindungs-5 vermögen an P. aeruginosa anderer Serotypen.

Andererseits offenbart JP-A1-62-187417eine monoklonale-Antikörper-Kreuzbindung und ein Kreuz-Präventiv auf P. aeruginosa von zwei oder mehr Serotypen, was auf eine Zelle zurückgeht, die einen monoklonalen Antikörper produziert, der mit den Stämmen vom Typ 2,5 und 16 nach der IATS-Klassifizierung sowie den Stämmen der Typen 3 und 7 nach der Fisher-Klassifizierung kreuzreagiert Wie aus der vorstehenden Tabelle 1 hervorgeht, fallen alle 10 diese Stämme unter Typ B nach der Klassifizierung des Japanischen Kommittees. Somit ist der genannte monoklonale Antikörper immernoch spezifisch auf dieStämmeeines einzelnen Serotyps.Dergenanntemonoklonale Antikörper zeigt somit nur eine Bindungsfähigkeit an weniger als 20 % der klinisch isolierten Stämme; aus diesem Grunde istfürpraktischeZweckeeine große Anzahl von Serotyp-spezifischen monoklonalen Antikörpern erforderlich.

Die von den Gram-negativen Bakterien verursachten infektiösen Erkrankungen fuhren zu Septikämie, wobei das IS Leben des Patienten häufig in Gefahr gerät Typische Symptome der Septikämie sind Pyrexie, Steifheit. Organinsuffizienz, Schock, etc. Der septische Schock wird als „Endotoxin-Schock“ bezeichnet und ist von LPS (Lipopolysaccharid) verursacht das als Endotoxin bekannt ist; Endotoxin wird als Ergebnis von Wachstum und Absterben einer großen Zahl Gram-negativer Bakterien und/oderdem Aufbrechen der genannten Bakterien aufgrund der Wirkung von verabreichten Antibiotika vom Bakterienkörper in den menschlichen Körp«: abgegeben. Dieakuvc 20 Stelle, die den Endotoxin-Schock verursacht ist bekannt und stellt Lipid A in LPS dar. Derzeit ist keine wirksame oder therapeutische Methode gegen Endotoxin-Schock verfügbar, die Mortalität aufgrund von Endotoxin-Schock beträgt etwa 50 %. Aus diesem Grunde besteht ein starker Bedarf für die Entwicklung einer wirksamen präventiven oder therapeutischen Methode.

Ziegler et al haben wärme-sterilisierteE. coli J5 (Rc-Typ rauhe Mutante) als Vaccine an gesunde Personen zum 25 Erhalteines Antiserums verabreicht, das sich bei der Prävention von tödlichem Schockaufgrund von Bacterämic als wirksam erwies (New England; J. Med., 207,125-1230 [1982]).

Daraufhin wurden verschiedene Tierversuche und klinische Versuche unternommen, und es zeigte sich, daß verschiedene Antiseren undmonoklonale Antikörper, die spezifischaufE.coliJ5oderdasKemglykolipidderGram-negativen Bakterien sind, sich bei der Verhinderung von Endotoxin-Schock als wirksam erweisen (WO 8404458. 30 WO 8501659; EP-A-0174204; JA-A-61-130300; Mutharia et al.: Inf. Immun., 45,631-636 (1984); Teng et al: Proc.

Natl. Acad. Sei., USA, 82,1790-1794 (1985); Gigliotti & Shenep: J. Inf. Dis., 151,1005-1011 (1985); Braude etal: J. Inf. Dis. 136 (Erg.), 167-173 (1977); Nelles and Niswanden Inf. Immun.,46,677-681 (1984); Pollack etal: J. Clin. Invest., 72,1874-1881 (1983); Young et al: Clin. Res., 30,522A (1982); Young et al: Clin. Res., 32,518A (1984)).

Wie vorstehend angegeben ist, ist der auf O-Antigen von P. aeruginosa-Lipopolysaccharid bekannte spezifische 35 Antikörper nur wirksam zur Verhinderung und Behandlung von Infektionen, die von P. aeruginosa des Serotyps verursacht sind, zu dem das genannte O-Antigen gehört; dieser Antikörper ergibt keinen präventiven oder therapeutischenEffektbei Infektionen, die vonP. aeruginosa eines anderen Serotyps verursacht sind. Dementsprechend ist es zur Prävention und Behandlung von Infektionen durch P. aeruginosa von beliebigem Serotyp erforderlich, mindestens 13 bis 17 Arten monoklonaler Antikörper, die gegen sämtliche Serotypen von P. aeruginosa spezifisch 40 sind, zur Verfügung zu stellen. Zu diesem Zweck müssen Zellinien zur Verfügung gestellt werden, die humane monoklonale Antikörper produzieren, welche mindestens auf 13 bis 17 Arten von Serotypen spezifisch sind. Außerdem ist die Kultivierung einer jeden Zellinie in großem Maßstab sowie die Reinigung des produzierten Antikörpers erforderlich; dies führt vom industriellen Standpunkt her zu großen Problemen. Es ist deshalb wünschenswert, einen humanen monoklonalen Antikörper zu entwickeln, der nichtnur an einen Serotyp-Stamm von 45 P. aeruginosa gebunden werden kann, sondern an eine Vielzahl oder an alle Serotyp-Stämme, um so einen präventiven oder therapeutischen Effekt gegen Infektionen, die von P. aeruginosa verschiedener Serotypen verursacht werden, zu ergeben.

Als Ergebnis einer umfangreichen Untersuchung zum Erhalt eines humanen monoklonalen Antikörpers, der bei der Prävention undBehandlunginfektiöser Erkrankungen, die vonP. aeruginosa verursacht werden, wirksam ist, und 50 eines human-Immunglobulins mit hohem Titer, welches denselben enthält, im industriellen Maßstab, konnte man nun mit Erfolg aus humanen B-Lymphocyten eine Zellinie schaffen, die einen humanen monoklonalen Antikörper produziert, der spezifisch an die gemeinsame chemische Struktur von LPS in P. aeruginosa verschiedener Serotypen bindet Durch Kultivierung einer derartigen Zellinie ist einhumaner monoklonaler Antikörper erhältlich,der auf zwei oder mehr Arten von LPS verschiedener Serotypen reagiert und einen präventiven oder therapeutischen Effekt gegen 55 Infektionen durch P. aeruginosa von zwei oder mehr Serotypen zeigt Genauer ausgedrückt ist der monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung dadurch charakterisiert, daß er ein spezifisches Bindungsvermögen auf fast alle Stämme von P. aeruginosa, die zu den Typen A, F, G und M nach der Klassifizierung des Japanischen Kommittees -4-

AT 395 591B gehören, zeigt, und dadurch deutlich von üblichen monoklonalen Antikörpern, die nur auf einen Serotyp-Stamm spezifisch sind, wie auch von dem bekannten monoklonalen Antikörper, der zu Stämmen von Serotypen innerhalb einer Untergruppe nach der genannten Klassifizierung kreuzreagiert, wie dies in JP-Al-62-187417 offenbart ist, unterschieden werden kann.

Dementsprechend ist es die grundlegende Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen humanen Antikörper zur Verfügung zu stellen, der eine Antigen-spezifische Stelle, wie sie LPS von P. aeruginosa eigen ist, erkennt, insbesondere ein humaner monoklonaler Antikörper mit einer einzigen Antigen-Spezifität (monospezifischer Antikörper). Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine humane Zellinie zu schaffen, die in der Lage ist, den genannten humanen Antikörper kontinuierlich zu produzieren. Nach einer weiteren Aufgabe der Erfindung soll eine humane Immunglobulin-Präparation zur Verhinderung oder Behandlung von Infektionen durch P. aeruginosa zur Verfügung gestellt werden, welche den humanen Antikörper umfaßt Eine weitere Aufgabe der Erfindung liegt in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung des genannten humanen Antikörpers durch in vitro oder in vivo Kultivierung der genannten humanen Zellinie. Darüber hinaus ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Erhalt der genannten humanen Zellinie zur Verfügung zu stellen. Nach einer weiteren Aufgabe der Erfindung soll ein neuer Antikörper zur Verfügung gestellt werden, der die chemische Struktur, wie sie dem LPS in P. aeruginosa eigen ist erkennt und mit dem Lipid A, das von Gram-negativen Bakterien stammt, wie P. aeruginosa, E. coli und S. typhimurium, kreuzreagiert. Diese und weitere Aufgaben gemäß der Erfindung ergeben sich für den Fachmann aufgrund da vorstehenden sowie nachfolgenden Beschreibung.

Der humane monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung, der spezifisch ist auf die Antigen-determinierende Stelle, wie sie dem LPS in P. aeruginosa eigen ist soll einen einzelnen humanen monoklonalen Antikörper darstellen, der die Antigen-determinierende Stelle, die dem LPS von P. aeruginosa von zwei oder mehr Serotypen, z. B. den Typen A, G, F und M, eigen ist, erkennt und mit Lipid A in dem LPS, das von Gram-negativen Bakterien stammt, kreuzreagiert. Er kann von einem einzigen Antikörper-produzierenden Clon hergestellt werden.

Der genannte humane monoklonale Antikörper hat ein Bindungsvermögen (Bindungsaktivität) zu Stämmen von P. aeruginosa von zwei oder mehr Serotypen oder zu dem darauf vorkommenden LPS, i. e. eine Fähigkeit zur Beschleunigung einer bakterioziden Eigenschaft in Gegenwart eines Komplements, sowie einer Phagozytose durch ein Neutrophiles oder einen Makrophagen (Opsonierung), und kann infektiöse Erkrankungen durch P. aeruginosa verhindern oder behandeln. Die Epitope des genannten humanen monoklonalen Antikörpers liegen in dem LPS der Stämme vom Typ A, G, F und M vor, insbesondere an der Lipid A-Stelle und dem Polysaccharidteil in LPS.

Der hier verwendete Serotyp ist in Übereinstimmung mit der Klassifizierung nach dem Japanischen Kommittee und wird bestimmt aufgrund des Unterschiedes in der immunochemischen Reaktion, und zwar unter Verwendung eines Antiserums oder eines Maus-monoklonalen Antikörpers, die spezifisch auf den Standardstamm von P. aeruginosa eines jeden Serotyps reagieren. LPS bedeutet ein Lipopolysaccharid, das einen Bestandteil da Oberflächenschicht eines Gram-negativen Bakterienkörpers darstellt, und ein Lipid (Lipid A) und einen daran gebundenen Kemteil umfaßt, wobei der Kemteil 2-Keto-3-desoxyoctonsäure, Heptose, Phosphorsäure, etc. als Bestandteile umfaßt, und eine Polysaccharid-Seitenkette an seinem Ende trägt, die als „O-Antigen“ bezeichnet wird. Das O-Antigen hat eine polymere Struktur, die eine gerade Kette, bestehend aus 2 bis 5 Monosacchariden als wiederkehrende Einheit, umfaßt. Die Zusammensetzung, Anordnung und Konfiguration der Saccharidkette ist unter den Serotypen verschieden; dieser Unterschied stellt die Basis für die Klassifizierung mit Serotypen dar.

Wie vorstehend angegeben, betrifft, die vorliegende Erfindung einen humanen monoklonalen Antikörper, der die übliche Antigen-spezifische Stelle in LPS von P. aeruginosa eikennt und mit Lipid A, das von Gram-negativen Bakterien stammt, kreuzreagiert.

Der humane monoklonale Antikörper, der mit dem von Gram-negativen Bakterien stammenden Lipid A kreuzreagiert, stellt einen einzelnen Antikörper vom human-Typ dar, der spezifisch Lipid A, das aus Gram-negativen Bakterien, wieE. coli,S. typhimurium undP.aeruginosa,isoliert und gereinigt wurde,erkennenkann. Da der humane monoklonale Antikörper ein Bindungsvermögen (Bindungsaktivität) spezifisch für Lipid A von Gram-negativen Bakterien, einschließlich P. aeruginosa und eine neutralisierende Fähigkeit (neutralisierende Aktivität) im Hinblick auf die biologischen Aktivitäten, wie Mitogenaktivität, tödliche Toxizität und Schwarzman-Reaktion, wie sie von Lipid A verursacht werden, neben der genannten Reaktivität auf die gemeinsame Antigen-spezifische Stelle in LPS von P. aeruginosa besitzt, eignet er sich als präventives oder therapeutisches Agens gegen Endotoxin-Schock, der von Gram-negativen Bakterien verursacht wird.

Der humane monoklonale Antikörper kann auch eine Bindungsfähigkeit an LPS, das von E. coli oder S. typhimurium freigesetzt wird, oder an den LPS-Teil im Falle der exponierten Lipid A-Stelle, wie in einem an O-Antigen und Kern-Polysaccharid defizienten Stamm (e. g. Stamm vom tief rauhen Typ), aufweisen.

Lipid AbestehtauseinemGlykolipidteil in LPS und kann aus LPS hergestelltweiden durch SpaltungderKetosid-Bindung in Ketodesoxyoctonsäure (KDO) mit Hilfe einer Säure. Es umfaßt ein Skelett aus -5-

AT 395 591B ß-(l-6)-Di-saccharid-l,4'-diphosphorester und daran befindlichen Fettsäuren, wobei die Menge der Fettsäuren 4 Mol pro 1 Mol Lipid A beträgt Die Art, Anzahl und Bindungsstelle der Fettsäuren variiert mit jedem Stamm.

Die humane Zellinie, die kontinuerlich den humanen monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung, der spezifisch mit der gemeinsamen Antigen-bestimmenden Stelle in LPS von P. aeruginosa reagiert und insbesondere mit Lipid A von Gram-negativen Bakterien kreuzreagiert, produzieren kann, kann nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden, wobei einige typische Beispiele nachstehend angegeben sind.

Bei dem ersten Verfahren werden humane B-Lymphocyten, die mit P. aeruginosa (lebende Bakterien oder mit Formalin oder durch Erhitzen abgetötete Bakterien), LPS, das von P. aeruginosa stammt, oder Gram-negativen Bakterien, die auf ihrer Oberflächeeine Lipid A-Strukturaufweisen (lebende Bakterien oder mitFormalin oder durch Erhitzen abgetötete Bakterien), vorzugsweise E. coli J5 oder S. typhimurium Rc-, Rd- oder Re-Mutanten, oder LPS oder Lipid A, die von diesen Stämmen stammen, sensibilisiert (immunisiert) wurden, in vivo oder in vitro mit EB (Epstein-Barr)-Virus durch Vermischen infiziert, wobei die genannten B-Lymphocyten zu solchen transformiert werden, die kontinuierlich proliferieren. Aus diesen transformierten Zellen (vor oder nach dem Clonieren) werden diejenigen selektiert, die einen Antikörper mit einer reaktionsfähigen Spezifität produzieren, und kontinuierlich in vitro gezüchtet, um Zellinien zu schaffen, die den genannten Antikörper kontinuierlich produzieren können. Die Selektion kann mit Hilfe von ELISA (Enzym-Immunosorbent-Bestimmung) unter Verwendung einer Auswahl von Bakterien zum Screenen «folgen, wobei diese P. aeruginosa-Stämme 17 verschiedener Serotyp-Arten und E. coli 0-111 :B4 und J5 umfassen. Die Selektion kann auch mit Hilfe von ELISA unter Verwendung von LPS und Lipid A, die von P. aeruginosa, E. coli 0-111-B4 und J5 und von S. typhimurium-Wildstamm und Ra- bis Re-Mutanten stammen, als Antigen erfolgen.

Nach dem zweiten Verfahren werden humane B-Lymphocyten, die sensibilisiert sind mit P. aeruginosa (lebende Bakterien oder mit Formalin oder durch Erhitzen äbgetötete Bakterien), LPS, das von P. aeruginosa stammt, oder Gramnegativen Bakterien, die auf ihrer Oberfläche eine Lipid A-Struktur aufweisen (lebende Bakterien oder mit Formalin oder durch Erhitzen abgetötete Bakterien), vorzugsweise E. coli J5 oder S. typhimurium Rc-, Rd- oder Re-Mutanten, oder LPS oder Lipid A, das von diesen Stämmen stammt, einer Zellfusion mit Myelomzellen oder B-Lymphoblastoidzellen zur Etablierung von Zellinien unterworfen, die in vitro kontinuierlich proliferieren können und kontinuierlich einen LPS-spezifischen Antikörper produzieren.

Nach dem dritten Verfahren werden die EB-Virus-transformierten Zellen, wie sie in dem ersten Verfahren erhalten wurden, einer Zellfusion mit Myelomzellen oder B-Lymphoblastoidzellen unterworfen, um eine Zellinie zu schaffen, die in vitro kontinuerlich gezüchtet werden kann, und dabei kontinuierlich einen LPS-spezifischen Antikörper produziert.

Die auf diese Weise hergestellten Zellinien können in vivo (e. g. nackte Maus) oder in vitro kultiviert werden, worauf das Sammeln und die Reinigung des in das Kulturmedium oder die Aszites-Flüssigkeit fieigesetzten Antikörpers erfolgt, wobei man den Antikörper in einer großen Menge erhält

Die Herstellung des humanen monoklonalen Antikörpers gemäß der Erfindung umfaßt die folgenden Schritte: (1) Herstellung von humanen B-Lymphocyten, die mit einem Antigen sensibilisiert sind; (2) Herstellung von Zellinien, die einen monoklonalen spezifischen Antikörper produzieren, und zwar durch Immortalisieren der in (1) hergestellten Zellen; (3) Kultivieren der in (2) hergestellten Zellinien; (4) Reinigung des spezifischen monoklonalen Antikörpers aus der Kultur, wie sie in (3) erhalten wird; und (5) Herstellung einer Immunglobulin-Präparation mit hohem Titer, welche den in (4) gereinigten spezifischen monoklonalen Antikörper umfaßt. Jeder dieser Schritte wird im folgenden im Detail erläutert.

Schritt (11:

Als humane B-Lymphocyten können humane Lymphocytenzellen verwendet werden, die einen Antikörper auf LPS von P. aeruginosa und Lipid A von Gram-negativen Bakterien produzieren, wobei die Lymphocyten durch Zentrifugation unter Verwendung einer Lymphocyten-Trennflüssigkeit, wie Lymphoprep** oder Mono-Poly-Resolving Medium** (Flow Lab.) aus peripherem Blut abgetrennt werden. Es können auch B-Lymphocyten verwendet werden, die aus Geweben oder Organen (z. B. Lymphknoten, Milz), die für Diagnosezwecke oder zur Therapie der Erkrankungen extrahiert wurden, oder aus dem Blut der Nabelschnur oder dergleichen stammen. Es ist wünschenswert, daß diese Zellen von Personen stammen, die in der Vergangenheit mit P. aeruginosa infiziert wurden, so daß deren Zellen sensibilisiert sind. Geeignete Personen, von denen man diese Zellen erhält, kann man durch vorheriges Messen des Antikörpertiters ihrer Seren auswählen. Alternativ können humane B-Lymphocyten von beliebigen Personen, ungeachtet ihrer Krankengeschichte in der Vergangenheit, erhalten und mit inaktivierten P.aeruginosa,LPS,dasvonP.aeruginosastammtoder Gram-negativen Bakterien,dieeineLipidA-Struktur auf ihrer Oberfläche aufweisen, vorzugsweise inaktivierte E. coli J5 oder S. typhimurium Rc-, Rd- oder Re-Mutanten, oder LPS oder Lipid A, das von solchen Gram-negativen Bakterien stammt, in vitro zur Sensibilisierung vermischt werden. Das heißt, sämtliche dieser Antigene, die inaktiviert sind, können zu B-Lymphocyten zugegeben werden. -6-

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Außerdem können Lösungen, die Lymphokine enthalten, wie B-2kllen-Proliferationsfaktoren und B-Zellen-Differenzierungsfaktoren (e. g. Pflanzenlektine, wiePoke-Weed-Mitogen (PWM), Komponenten des Bakterienkörpers, wie Cowan I, human-Lymphocyten-Mischkultur, eine Blutzellenkultur aus der Nabelschnur, Milz oder Thymus) zu den humanen B-Lymphocy ten zur in vitro-Sensibilisierung zugegeben werden; dann erfolgt die Proliferierung und Differenzierung unter Erhalt von Antikörper-produzierenden Zellen. Die auf diese Weise erhaltenen humanen B-Lymphocyten weisen ein Antikörper-Molekül auf der Zelloberfläche auf und können für begrenzte Zeit eine geringe Menge an Antikörper freisetzen; sie sind jedoch nicht unsterblich.

Schritt (2):

Zur Umwandlung der vorstehenden sensibilisierten humanen B-Lymphocyten zu kontinuierlichproliferierenden unsterblichen Zellinien gibt es grundsätzlich zwei Verfahren, wobei das raste darin besteht, daß man B-Lymphocyten mit EB-Virus infiziert, und zwar durch Mischkultivierung der sensibilisierten humanen B-Lymphocyten mitEB-Virus, hergestellt aus Marmoset-Zellen B95-8, vorzugsweise unter Verwendung von 2 bis 10 TD50 Virus pro Zelle. Mikroplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 0,5 bis 3 x 10* Zellen pro Vertiefung inokuliert; die Kultivierung zur Transformation erfolgt unter Verwendung eines üblichen Mediums (e. g. RPMU640,Eagle’s MEM), welches Fötal-Rinderserum, Rinderserum, Pferdeserum oder Humanserum in einer Menge von 2 bis 20 % (V/V) in Gegenwart von 5 bis 10 % CO2 bei 32 bis 37 °C enthält; die Kultivierung erfolgt über einen Zeitraum von 2 bis 5 Wochen; während dieser Zeit wird das Medium in Intervallen von 2 bis 4 Tagen zu jeweils der halben Menge ausgetauschL Sofern dies erforderlich ist, können 1 bis 2 pg/ml Cyclosporin A und ein antibiotisches oder antimikrobielles Agens zur Verhinderung einer Mykoplasma-Kontaminierung zugegeben werden. Die auf diese Weise transformierten Zellen können in Form von Kolonien mit 20 bis 200 Zellen unter einem optischen Mikroskop 10 oder mehr Tage nach der Infektion beobachtet und ohne weiteres von den nichttransformierten Zellen unterschieden werden. Die Kultur, die transformierte Zellen enthält und in den Vertiefungen ausreichend proliferiert ist, wird einem Screenen auf Antikörpertiter mit Hilfe von ELISA unterworfen. Vertiefungen, in denen die Antikörperherstellung beobachtet wird, werden selektiert und die Spezifität auf LPS wird mit Hilfe der Westem-Blotting-Methode bestätigt.

Daraufhin wird die Kultur, die den transformierten Zellhaufen enthält, wiederholt abgesaugt und miteiner Pipette aufgesaugt, um die Zellhaufen aufzubrechen, dann mit der Kulturlösung verdünnt, um eine geeigneteZellkonzentration einzustellen, und damit wird eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen mit 0,5 bis 100 Zellen pro Vertiefung zum Clonieren inokuliert (limitierende Verdünnungsmethode). Alternativ kann das Clonieren unter Verwendung von Agarose (e. g. Meeres-Plague-Agarose) erfolgen. Die transformierten Zellen (ca. 7 x 10* bis 7 x 10^) werden z. B. in eine Kulturschale (30 ml Durchmesser) mit 0,36 bis 0,4 % (G/V) Agarose inokuliert und unter 5 % CO2 bei 37 °C kultiviert, um aus einer einzelnen Zelle eine Kolonie zu proliferieren. Beim Clonieren ist es wünschenswert, Bauchfellzellen der Maus, humane Blutlymphocyten der Nabelschnur oder Röntgenstrahl-behandelte Milzzellen der Maus als Beschickungsschicht zu verwenden. Von den clonierten Zellinien weiden diejenigen durch Bestimmung des Antikörpertiters im Überstand der Kulturen der geclonten Zellinien selektiert, die eine hohe Produktivität des spezifischen Antikörpers zeigen, wobei die Bestimmung des Titers nach derEUSA-Methode unter Verwendung der Bakterienkörper von P. aeruginosa 17 verschiedener Serotypen und E. coli 0-lll:B4 und J5 als das Festphasen-Antigen, und unter weiterer Verwendung von LPS und Lipid A, die von P. aeruginosa von 17 verschiedenen Serotypen, E. Coli 0-lll:B4 undJ5,S.typhimurium Wildstamm, undRa- bis Re-Mutanten stammen, als Festphasen-Antigen. Das vorstehend beschriebene Clonen und Selektieren wird nacheinander zwei- oder dreimal durchgeführt, um eine transformierte Zellinie zu erhalten, die eine hohe Prolifeiationsrate besitzt und den spezifischen Antikörper in stabiler Weise und in großen Mengen produziert.

Beim zweiten Verfahren unterwirft man die sensibilisierten humanen B-Lymphocyten und Myelomzellen einer Zellfusion in Gegenwart von Polyethylenglykol. Die verwendeten Myelomzellen sind Hypoxanthin-guanin-phosphoribosyl-Transferase (HGPRT)-Mangelmutanten (e. g. P3X63-Ag 8 (P3), P3X63-Ag 8.653), die von Mausmyelomzellen abstammen, HGPRT-Mangelmutanten, die von der humanen Myelomzelle U-266 abstammen, HGPRT-defizientehiiinan-Maus-HeteiomyeloinzellenSHM-D33,etc. HGPRT-Mangelmutanten,die von humanen B-Lymphoblastoidzellen abstammen, können ebenfalls verwendet werden.

Als Polyethylenglykol (PEG) verwendet man z. B. PEG 1.000bis 6.000 in einer Konzentration von 30 bis 50 % (G/V). Die Fusionseffizienz kann durch Zugabe von Lectin, Poly-L-lysin, Dimethylsulfoxid, etc. gesteigert werden.

Die Fusion kann z. B. in der gleichen Weise ausgeführt werden, wie dies in der Publikation von Köhler et al (Nature, 256,495 [1975]) beschrieben ist, wobei Mauszellen miteinander fusioniert werden, um ein Hybridom zu eizeugen, das einen monoklonalen Antikörper der Maus produziert. Die sensibilisierten humanen B-Lymphocyten und HGPRT-defizienten Myelomzellen werden z. B. miteinander in Anteilen von 10 -1:1,30 bis 50 % (G/V) vermischt PEG 4,000 wird innerhalb 0,5 bis 1 Minute portionsweise zugegeben, und das erhaltene Gemisch ein bis 10 Minuten stehen gelassen. Zu diesem Gemisch gibt man innerhalb von 5 bis 10 Minuten 9 bis 50 ml eines Kulturmediums, das kein Serum enthält; im weiteren wird Kulturmedium zugegeben, um eineZellkonzraitration von -7-

AT 395 591B 1θ5 bis lofyml einzustellen. Eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen wird mit der auf diese Weise erhaltenen Zellsuspension inokuliert, und zwar mit 2 x 10^ bis 2 x 10^ Zellen pro Vertiefung. Am folgenden Tag wird die halbe Menge durch ein Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-haltiges Medium (HAT-Medium) oder ein Hypoxanthin-Azaserin-haltiges Medium (HAz-Medium) ersetzt, die Kultivierung erfolgt ca. 2 bis 3 Wochen lang unter 5 % CO2 bei 32 bis 37 °C; während dieser Zeit wird jeweils die halbe Menge des Kulturmediums in Intervallen von 3 Tagen ersetzt, wobei ein HAT-Medium ca. 10 bis 20 Tage und dann ein Hypoxanthin-Thymidin-haltiges Medium (HT-Medium) ca. 3 bis 5 Tage eingesetzt wird, um eine proliferierende Kolonie zu erhalten, i. e. ein Hybridom. Es ist auch möglich, ein Hybridom durch kombinierten Einsatz von Stoffwechselinhibitoren ohne Verwendung einer HGPRT-Mangelmutante zu selektieren. Der Antikörpertiter des Kulturmediums des Hybridoms wird, wie vorstehend erwähnt, mitHilfe der ELIS A-Methode bestimmt; dieZellinie, die den spezifischen Antikörper mit der vorstehenden Reaktionsspezifität produziert, wird selektiert, und die Spezifität auf Polysaccharid wird mit Hilfe der Westem-Blotting-Methode bestätigt. Man wiederholt das Clonieren mit Hilfe der limitierenden Verdünnungsmethode oder der Agarosemethode zwei- bis dreimal, um eine stabile Zellinie mit einer hohen Proliferationsrate und einer hohen Produktion des spezifischen Antikörpers zu erhalten.

In dem vorstehend genannten ersten Verfahren können EB-Virus-transformierteZellen anstelle von sensibilisierten humanen B-Lymphocyten verwendet werden.

Die nach der EB-Virus-Transformationsmethode oder der Zellfusion (Hybridom)-Methode aus sensibilisierten humanen B-Lymphocyten erhaltenen Zellinien können kontinuierlich pioliferiert werden und produzieren den spezifischen Antikörper in stabiler Weise und in großen Mengen.

Schritt (31:

Die auf diese Weise erhaltenen transformierten Zellen oder Hybridzellen (Hybridome) (0,5 bis 5 x l(r Zel-len/ml) werden im stationären Zustand oder unter Rotation in einem üblichen Kulturmedium für tierische Zellen in einem Behälter, wie einem Inkubationskolben oder einer entsprechenden Platte, unter Verwendung eines CO2-Inkubators bei 32 bis 37 °C unter 2 bis 10 % CO2 inkubiert. Insbesondere dann, wenn die Inkubation in großem Maßstäb erfolgt, können ein Kolbeninkubator, ein Hohlfasersystem oder dergleichen, wie sie für tierische Zellen geeignet sind, verwendet werden. Das übliche Kulturmedium kann z. B. ein Medium darstellen, das 2 bis 20 % Serum von Rinderfötus, Kalb, Rind, Pferd, dem Menschen, etc. (e. g. RPMI1640, Eagle’s MEM) enthält, oder es kann ein Serum-freies Medium darstellen, welches die für die Proliferation der Zellen erforderlichen Spurenkomponenten enthält (e. g. Insulin, Transferrin, Ethanolamin, Selenit, Rinderalbumin, Lipid) oder dergleichen.

Schritt (4):

DieReinigung des Antikörpers kann nach konventionellenbiochemischen Verfahren erfolgen (e. g.Fraktionierung durch Ammoniumsulfat-Fällung, Fraktionierung durch Ethanol-Fällung, PEG-Fraktionierung, Ionenaustausch-Chromatographie,Gelfiltration, Affinitäts-Chromatographie,Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie, Elektrophorese). Beim Reinigungsverfahren ist darauf zu achten, daß eine Agglutinierung oder eine Senkung der Antikörperaktivität vermieden wird. Zu diesem Zweck kann human Serumalbumin (HSA) in einer Menge von 0,05 bis 2 % zugegeben werden. Manchmal ist es bevorzugt, Aminosäuren, die Glycin oder alpha-Alanin, insbesondere basische Aminosäuren, wie Lysin, Arginin oder Histidin, Saccharide, wie Glucose oder Mannit, Salze, wie Natriumchlorid, etc., zuzugeben. Es kann zu einer Agglutination kommen, insbesondere im Falle eines IgM-Antikörpers. Zur Verhinderung einer solchen Agglutination eignet sich eine Behandlung mit ß-Propiolacton, Essigsäureanhydrid oder dergleichen. In einem solchen Fall ist die intravenöse Verabreichung möglich.

Schritt (5):

Der gereinigte monoklonale Antikörper kann nach einem an sich bekannten konventionellen Verfahren zu einer biologischen Präparation formuliert werden; diese Verfahren umfassen z. B. das Filtrieren durch ein Membranfilter zum Entfernen von Bakterien, das Abfüllen in sterilisierte Ampullen mit einem Stabilisator und Gefriertrocknen.

Die Präparation des humanen monoklonalen Antikörpers gemäß der Erfindung kann aus nur einer Art von humanem monoklonalem Antikörper aufLPSvonP. aeruginosa zur Verwendung aispräventives oder therapeutisches Agens gegen Infektionen durchP. aeruginosa bestehen. Bevorzugt umfaßtdiePräparation außerdem mindestens eine Art von humanem monoklonalen Antikörper, der eine Antigen-bestimmende Stelle erkennt, die sich in ihrer Molekularstruktur von LPS von P. aeruginosa unterscheidet, und/oder mindestens eine Art eines konventionellen humanen Antikörpers, der Exotoxine, Exoenzyme (e. g. Elastase, Protease), Hüllproteine und Endotoxine erkennt. Die Präparation kann auch jeden beliebigen humanen Antikörper auf ein von P. aeruginosa verschiedenes Bakterium, eines Virus, Fungi, Protozoen, Krebszellen, etc. enthalten. Außerdem kann der humane monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung in eine konventionelle humane Immunglobulin-Präparation inkorporiert werden, um eine Immunglobulin-Präparation auf LPS mit hohem Titer zu bilden. -8-

AT 395 591B

Der humane monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung gehört zur Klasse IgG oder IgM, ist jedoch nicht auf dieselben beschränkt. Der humane monoklonale Antikörper besitzt ein Bindungsvermögen (Bindungsaktivität) zu P. aeruginosa von zwei oder mehr Arten von Serotypen, weist in Gegenwart eines Komplements eine bakteriozide Aktivität auf (Komplement-bakteriozide Aktivität) und besitzt die Eigenschaft zur Beschleunigung der Phagocy tose von Neutrophilen und Makrophagen auf P. aeruginosa (Opsonierung). Experimentelle Infektionen an Mäusen mit P. aeruginosa von zwei oder mehr Arten von Serotypen können durch Verabreichung eines einzelnen humanen monoklonalen Antikörpers gemäß der Erfindung behandelt werden.

Der humane monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung besitzt eine spezifische Bindungsfähigkeit an die Bakterienkörper von P. aeruginosa HD 1001 (ATCC 27577), HD 1006 (ATCC27582), IID1020und IID1015 unter den Standardstämmen zur Serotyp-Klassifizierung von P. aeruginosa. Außerdem weist er ein Bindungsvermögen an Lipid A von Gram-negativen Bakterien auf; die biologische Aktivität, wie die letale Aktivität oder Schwartzman-Reaktion, können dadurch neutralisiert werden.

Der humane monoklonale Antikörper kann an Lipopolysaccharide von E. coli Rc-Mutante J5 (ATCC 39355), S. minnesota rauher Typ Rc-,Rd- und Re-Mutanten und P. aeruginosa IID 1001 (ATCC 27577) binden, jedoch nicht an Lipopolysaccharide von E. coli glatt«' Typ Stamm 0-111:B4; S. minnesota glatter Typ Wildstamm, rauher Typ Ra- und Rb-Mutanten und P. aeruginosa IID 1002 (ATCC 27578) und PA 103.

Wie aus dem Vorstehenden hervorgeht, unterscheidet sich der humane monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung von bekannten Serotyp-spezifischen monoklonalen Antikörpern und bekannten Serotyp-Untergruppen-kreuzreagierenden monoklonalen Antikörpern. Da er an P. aeruginosa von zwei oder mehr verschiedenen Serotypen bindet, kann P. aeruginosa aller oder fast aller Serotypen mit einer geringeren Anzahl monoklonaler Antikörper, einschließlich demselben, erfaßt werden. Der humane monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung ist daher vom Gesichtspunkt der Prävention und Therapie von P. aeruginosa-Infektionen äußerst wertvoll. Außerdem eignet er sich zur Prävention und Behandlung von Endotoxin-Schock, gegen den es zur Zeit kein wirksames Mittel gibt.

Die Epitope, die von dem humanen monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung erkannt werden, sind die Lipid A-Stelle und die Polysaccharid-Stelle in LPS. Die zu erkennende Polysaccharid-Stelle ist in bestimmten Serotyp-Stämmen, i. e. Typen A, F, G und M, auf eine limitiert. Es wird deshalb angenommen, daß eine Struktur, die die Lipid A-Stelle und die Polysaccharid-Stelle gemeinsam haben, vorliegt.

Zur Prävention und Therapie infektiös« Erkrankungen durch P. aeruginosa, gemischten Infektionen durch Bakterien, die P. aeruginosa enthalten, und von Endotoxin-Schock, der durch Gram-negative Bakterien verursacht wird, kann eine Präparation von human-Immunglobulin, die einen humanen monoklonalen Antikörper umfaßt, an erwachsene Patienten in einer Menge von ca. 1 bis 10 g jeweils im Falle eines ernsthaften Symptoms oder in einer Menge von ca. 0,2 bis 5 g jeweils im Falle eines nicht-ernsthaften Symptoms oder zu Präventivzwecken verabreicht werden. Der Gehalt an humanem monoklonalem Antikörper gemäß der Erfindung in der Präparation von human-Immunglobulin beträgt gewöhnlich 0,5 bis 500 mg, vorzugsweise ca. 5 bis 50 mg.

Wie vorstehend angegeben, besitzt der humane monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung einen hohen Antikörpertiter auf dessen Antigen und zeigt einen ausgezeichneten therapeutischen Effekt bei experimentellen Infektionen von Mäusen. Da er ein Protin menschlichen Ursprungs darstellt, kommt es nicht zu irgendwelchen Nebeneffekten (e. g Anaphylaxe), wie dies bei der Verabreichung eines heterogenen Proteins beobachtet wird. Da er von einer bestimmten spezifischen Zellinie produziert wird, ist die Möglichkeit einer Kontaminierung durch unbekannte Biorisiken im Vergleich zu konventionellen Immunglobulinen, die aus menschlichem Blut einer Anzahl unbekannter Personen hergestellt werden, weit geringer.

Der humane monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung wird in stabiler Weise und in einer großen Menge mit einem hohen Antikörpertiter produziert; sein Herstellungsverfahren ist dem konventioneller Herstellungsverfahren unter Verwendung von menschlichem Blut im Hinblick auf eine leichte Qualitätskontrolle überlegen.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert, die jedoch die Erfindung nicht beschränken sollen.

Beispiel 1

Herstellung von humanen monoklonalen Antikörper-oroduzierenden Zellinien durch die EB-Virus-

Transformations-Methode: (1) Herstellung der EB-Virus-Lösung und Bestimmung des Virustiters derselben EB-Virus-produzierende und freisetzende Marmoset-Zellen B95-8 wurden in einem RPMI1640-Medium suspendiert, welches 10 % Fötal-Kälberserum (FCS) bei einer Konzentration von 6,5 x 10^ Zellen/ml enthielt, und unter stationären Bedingungen in einem Kulturkolben T-75 (Coming #25110) bei 37 °C in 5 % C02-Atmosphäre 4 Tage lang inkubiert. Der Kulturüberstand wurde gesammelt und mit Hilfe einer Low-Speed-Zentrifuge (RS-20BH; Tommy Precision Ind. Co., Ltd.) bei 2.000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde durch ein -9-

AT 395 591B 0. 45 μ Membranfilter (Millex SLHA 0250S) filtriert Das Filtrat wurde in Serumgläser (MS-4505; Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) gegeben und bei -80 °C gelagert. Bei Verwendung des Inhalts, der für Experimente zur Transformation humaner Lymphocyten mit EB-Virus diente, wurde entsprechend verdünnt

Der Virustiter der EB-Virus-Lösung wurde nach der Methode von Moss et al (J. General Virology, 17,233 [1972]) unter Verwendung von peripheren Blutlymphocyten (PBL) als Indikatorzellen bestimmt. D. h., eine Suspension von humanen peripheren Blutlymphocyten (10° Zellen/ml) in RPMI1640-Medium, welches 15 % FCS enthielt, wurde in die Vertiefungen einer Mikroplatte (96 Vertiefungen) (Sumitomo Bakelite) gegeben, und zwar 100 μΙ/Vertiefung. In jede Vertiefung wurde die EB-Virus-Lösung (20 μΐ) in zehnfachen Serienverdünnungen (im Bereich von 10® bis 10^) mit dem vorstehenden Medium gegeben; die Inkubation erfolgte bei 37 °C in 5 % CO2-Atmopshäre. Alle drei Tage wurde ein Drittel des Mediumvolumens erneuert; nach drei Wochen wurde die Anwesenheit transformierter Zellen mit Hilfe des qitischen Mikroskops geprüft Die Bestimmung erfolgte an 6 Vertiefungen pro Verdünnung; dabei wurde die Transformationsrate bestimmt. Die höchste Verdünnung, die für eine Transformation von 50 % der Zellen erforderlich war, wurde stochastisch aus der Transformationsrate einer jeden Verdünnung nach der Methode von Reed und Muench bestimmt; die darin enthaltene Virusmenge wurde berechnet und galt als ITD50, woraus die Virusmenge in der ursprünglichen Probe zurückgerechnet und mit Hilfe der TDgQ-Zahl bezeichnet wurde. Die EB-Virus-Lösung mit einer Virusmenge von 10^ bis 10^ TD5Q/ml wurde auf diese Weise erhalten. (2) Bestimmung des Anti-P. aeruginosa-Antikörpertiters nach der ELISA-Methode

Der Antikörpertiter gegen P. aeruginosa-Oberflächenantigen wurde wie folgt gemessen. P. aeruginosa wurde in einer Phosphatpufferlösung (PBS) (pH 7,2; welche NaCl (8 g/1), KCl (0,2 g/1), NaHP04.12H20 (2,99 g/1) und KH2PO4 (0,2 g/1) enthielt) suspendiert bis zu einer Extinktion von 0,2 bei einer Wellenlänge von 600 nm. Die Suspension wurde in die Vertiefungen von Mikroplatten (Falcon #3912) (96 Vertiefungen) gegeben, und zwar in einer Menge von μΙ/Vertiefung; daraufhin wurde 15 Minuten bei 2.000 UpM zentrifugiert. Es wurde 2%iger Clutaraldehyd zu jeder Vertiefung in einer Menge von 50 μΙ/Vertiefung gegeben, um den Bakterienköiper an die Mikroplatten zu fixieren. Nach Entfernung der Bakterienlösung aus den Mikroplatten wurde eine 3%ige PBS-Lösung, die Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, auf die Mikroplatte gegeben, und zwar in einer Menge von 120 μΙ/Vertiefung, und es wurde 30 Minuten bei 37 °C inkubiert, um den nicht-gebundenen Teil der Assay-Plattezu blockieren. Die erhaltene Mikroplatte wurde als Antigen-beschichtete Platte beim folgenden Verfahrensschritt verwendet. Sofern dies gewünscht wurde, erfolgte die Lagerung dieser Mikroplatte bei -20 °C.

Vor dem Assay wurde die Mikroplatte mit 0,05 % Tween 20, welches PBS-Lösung (PBST) enthielt, dreimal gewaschen. 1 %iges BSA, welches PBST enthielt, wurde in einer Menge von 50 μΙ/Vertiefung zugegeben; daraufhin erfolgte Zugabe einer Probe (Serum, Ascites, oder Kulturüberstand), gegebenenfalls verdünnt mit l%igem BSA, welches PBST enthielt, und zwar in einer Menge von 50 μΙ/Vertiefung; dann wurde 2 h bei 37 °C inkubiert. DieProbe wurde von der Platte entfernt, die mit PBST dreimal gewaschen wurde. Daraufhin wurde zur zweistündigen Inkubierung bei 37 °C Phosphatase-markierter, durch Affinitätschromatographie gereinigter Anti-human-Immunglobulin-Antikörper (Kirkegaard & Perry Lab. Inc.) (zweiter Antikörper), verdünnt mit l%igem BSA, welches PBS-Lösung enthielt, in 500- bis 1.000-fachem Überschuß zu der Mikroplatte zugegeben, und zwar ΙΟΟμΙ/Vertiefung.ZurMessungdesIgG-Antikörpertiters unddes IgM-Antikörpertiters wurden jeweilsPhosphatase-markierterAnti-human-IgG-Antikörper und Phosphatase-markierter Anti-human-IgM-Antikörperverwendet.Nach Entfernung des zweiten Antikörpers wurde die Mikroplatte dreimal mit PBST gewaschen, und Substratlösung, 1. e. eine wäßrige Lösung von p-Nitrophenyl-phosphorsäure-dinatriumsalz (3 mg) in 10 % Diethanolamin-Puffer (pH 9,1; 1 ml), welcher NaNg (0,2 mg/1 ml) und MgCl2.6H20 (0,1 mg/ml) enthielt, auf die Mikroplatte gegeben, und zwar 100 μΙ/Vertiefung; daraufhin erfolgte die Umsetzung bei 37 °C. Nach 45 Minuten wurden 3 N NaOH zugegeben,undzwar 20 μΙ/Vertiefung,um die Reaktion zu stoppen. DieBindungsaktivität des Antikörpers (OD4Q5) wurde an Multiskan^ (Titertek) gemessen.

Herstellung von Lvnrohocvten aus humanem peripherem Blut

Humanes peripheres Blut (100 ml) mit einem hohen Antikörpertiter auf P. aeruginosa mehrerer Serotypen wurde gesammelt. Mono-Poly-Resolving-Medium^ (15 ml; Flow Lab.) wurde in ein Zentrifugenglas gegeben (50 ml Volumen; Sumitomo Bakelite), das vorstehende humane periphere Blut (20 ml) wurde langsam zugegossen und dann mit einer Zentrifuge niedriger Geschwindigkeit (BS-20BH, Tommy Piecision Ind.) bei 2.500 UpM (Rotor-TS-7) 15 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, wodurch die roten Blutzellen undLymphocyten getrennt wurden. Der Anteil, der die Lymphocyten enthielt, wurde gesammelt und mit 10 % FCS, welches RPMI1640-Medium enthielt (im folgenden als Medium bezeichnet), zweimal gewaschen, und dann einer Berechnung unterzogen, wobei 1,2 x KP Lymphocyten erhalten wurden. -10-

AT 395 591B (4~> Herstellung von Anti-P. aeruginosa-LPS-Antikörper-produzierenden Zellinien nach der EB-Vinis-

Transformationsmethode

Humane periphere Bluüymphocyten (2 x 10') wurden in dem Medium (2 ml) suspendiert, undEB-Virus-Lösung (10 ml; Virusmenge: 10? TDjQ/ml) zugegeben und dann 2 h bei 37 °C in 5%iger CC^-Atmosphäre inkubiert.

DieEB-Virus-infizierten humanen Lymphocyten wurden in einem Dulbecco-Modified-Eagle-Minimum-Essential-Medium (im folgenden als Medium zur Herstellung der Zellinie bezeichnet) suspendiert, welches 15 % PCS, 10 % NCTC 109 Gewebekulturmedium, Penicillin (100 IE/ml), Streptomycin (100 pg/ml), Arginin (0,2 mg/ml), Oxalessigsäure (0,15 mg/mB, Natriumpyruvat (0,05 mg/ml) und Rinder-Insulin (0,2 E/ml) umfaßte, wobei die Zellkonzentration ca. 2 x 10^ Zellen/ml betrug; die Suspension wurde in eine Kultuiplatte mit 24 Vertiefungen, die zuvor mit suspendierten peritonealen Mauszellen belegt worden war (ca. 1x10^ Zellen/Vertiefung) gegeben, und zwar in einer Menge von 0,5 ml/Vertiefung. DieLymphocyten wurden bei 37 °C in 100 %Feuchtigkeitund 5 % CC>2-Atmosphäre kultiviert; die Hälfte des Mediums wunde alle drei-Tage durch frisches Medium zur Herstellung von Zellinien ersetzt, und zwar beginnend eine Woche nach dem Start der Inkubation. Nach ca. einem Monat wurden die Zellen gesammelt und für die Zellfusion verwendet (51 Zellfusion mit EB-Virus-transformierten Zellen

Maus BALB/C-Myelomzellen, die von der MOPC-21-Linie abstammen und HGPRT-defizient sind (P3X63-Ag8.653; ATCC CRL 1580) wurden in dem Medium zur Herstellung von Zellinien subkultivicn. 1 x 107 Zellen davon wurden dreimal mit einem Eagle-Minimum-Essential-Medium gewaschen. Die EB-Viru* transformierten Zellen (2 x 10^ Zellen), die in (4) erhalten wurden, wurden mit einem Eagle-Minimum Essential-Medium dreimal gewaschen, mit Myelomzellen (1x10^ Zellen) in einem Zentrifugenröhrchen (Coming #25330) vermischt und 7 Minuten bei400x g zentrifugiert. Zu dem erhaltenen Pellet wurde innerhalb einer Minute während des Rotierens des Zentrifugengläschens und Rührens mit einer Pipette, PEG4000(1 ml; 45 % PBS-Lösun*' Merck) zugegeben; daraufhin wurde das Ganze 1 Minute bei Raumtemperatur stehen gelassen. Ein Eagle-Minimum Essential-Medium (9 ml) wurde in 5 Minuten zur Verdünnung zugegeben und die erhaltene Verdünnung 1 h hei 37 °C gehalten. Das durch Zentrifugation erhaltene Pellet wurde in dem Medium zur Herstellung der Zclhmr (100 ml) suspendiert und in Mikroplatten mit 96 Vertiefungen (Falcon#3040) gegeben, und zwar 1 x 101 2 3 4 Myelom zellen/Vertiefung. Gleichzeitig wurden Maus-BALB/C-Milzzellen als Beschickungszellen zugegeben, und /war 3 x1ο4 Zellen/Vertiefung; dann wurde bei 37 °C in 5%iger CC^-Atmosphäre inkubiert. Jeweils nach 2 oder 3 Tagen wurde das halbe Volumen des Mediums durch ein Selektionsmedium ersetzt. Nach 2-wöchiger Zellfusion wurden die Überstände in den Vertiefungen, in denen eine Proliferierung beobachtet wurde, im Hinblick auf die Produktion von Antikörpern auf P. aeruginosa verschiedener Serotypen mit Hilfe der ELISA-Methode untersucht. Die fusionierten Zellen (Hybridome) in der Vertiefung, die einen verhältnismäßig hohen Antikörpertiter zeigten, wurden gesammelt und einer weiteren Kultivierung durch Clonierung mit Hilfe der limitierenden Verdünnungsmethode unterworfen. Nach ca. zwei Wochen wurde die Anwesenheit von Antikörpern auf die gemeinsame Antigenbestimmende Stelle und die Bindung an P. aeruginosa mehrerer Serotypen mit Hilfe der ELISA-Methode am Kulturüberstand des Clons bestätigt. Der Clon wurde unter Verwendung einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen (MS-30240: Sumitomo Bakelite), einem T-25-Kulturkolben (#25100; Coming) und einem T-75-Kulturkolben (#25110; Coming) in jeweils größerem Maßstab kultiviert. Dieser Clon wurde als „Hybridom FK-1F3“ bezeichnet und unter der Hinterlegungs-Nr. FERM P-9784 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, in Tsukuba, Ibaraki-ken/Japan, hinterlegt. Der humane monoklonale Antikörper FRF-1F3 stellt ein IgM (μ, k) dar.

Beispiel 2

Analyse des Antigens, das vom Antikörper FRF-1F3 erkannt wird: -11- 1

Herstellung von LPS von P. aeruginosa 2

Die Herstellung von LPS von P. aeruginosa erfolgte auf die gleiche Weise, wie nach der Methode von Westphal et al („Methods in Carbohydrate Chemistry“, Academic Press, N.Y., Band 5, S. 83-91 [1965]). D. h.: der feuchte Bakterienkörper (4g) wurde mit 45 %igem Phenol, das auf 65 bis 68 °C erwärmt worden war, behandelt, unter 10 °C abgekühlt und 15 Minuten bei 3.000 UpM zentrifugiert, wodurch LPS als wäßrige Schicht extrahiert wurde. Die 3 wäßrige Schicht wurde zur Eliminierung von Phenol gegen Wasser dialysiert und unter reduziertem Druck unter Bildung von LPS-Micellen konzentriert, die zur Gewinnung von LPS ultra-zentrifugiert wurden. Als Ergebnis 4 wurden jeweils 2 mg LPS vom Typ A Standardstamm IID1001, Typ E Stamm PA103 und Typ G Standardstamm HD 1020 erhalten. Der verwendete Bakterienkörper von P. aeruginosa wurde von der Hinterlegungsstelle des Medical Science Research Institute, Tokyo Univerität, Japan, erhalten. Er ist auch von der American Type Culture Collection (ATCC) in den Vereinigten Staaten erhältlich.

AT395 591B (2) Analyse des Antigens mit Hilfe der Westem-Blotting-Methode LPS der Typen A und E von P. aeruginosa wurden einer Elektrophorese an Desoxycholsäure (DOC)/Poly-acrylamidgel nach der Methode von Komuro et al (Zusammenfassung der Berichte für das 33. Symposium über Toxine in Osaka, S. 94-99 [1986]) unterworfen; das Gel wurde in Transferpuffer (25mM tris-192mM-Glycine, pH 8,3; 20 % (V/V) Methanol) bei 4 °C über Nacht eingetaucht und auf Durapore^-Membran (Millipore) bei Raumtemperatur transferiert. Dann folgte Inkubation mit einer 2 % Kasein-haltigen PBS-Lösung bei Raumtemperatur für 1 h, um eine Blockierung zu bewirken. Im weiteren wurde eine Inkubation mit einer 0,l%igen BSA-Lösung und einer 10 % FCS-haltigen TBS-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Auf der erhaltenen blockierenden Durapore^-Membran wurden wäßrigeLösungen des FKF- 1F3-Kulturüberstandes und des humanen monoklonalen Antiköipers HI-006 (IgM), der spezifisch das Typ E O-Antigen erkennt, als Kontrolle 1 h bei 37 °C und dann über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Durapore^ Membran wurde mit 0,05 % Tween 20-haltiger TBS-Lösung (pH 8,0) fünfmal gewaschen und mit dem zweiten Antikörper (Peroxidase-markierter Anti-human-Immunglobulin-Antikörper, verdünnt mit 1 % BSA und 0,05 % Tween 20-haltiger PBS im 3.000-fachen Überschuß) 1 h bei 37 °C inkubiert. In gleicher Weise wurde fünfmal mit 0,05 % Tween 20-haltigem PBS (pH 8,0) gewaschen; mit einem Farbagens (PBS, welches 0,5 mg/ml Chlomaphthol, 20 % Methanol und 0,08 % %02 enthielt, pH 7,5) wurde angefärbt. Als Ergebnis wurde in der Elektrophoresebahn von P. aeruginosa Typ A LPS eine Gruppe hintereinanderliegender Banden aufgrund der Reaktion mit dem Antikörper FKF-1F3 beobachtet, während in der Elektrophoresebahn von P. aeruginosa Typ E LPS keine Reaktion stattfand. Im Falle von HI-006 als Kontrolle wurden die hintereinanderliegenden Banden in der Elektrophoresebahn vom Typ E LPS beobachtet, während in keiner anderen Bahn eine Färbung festgestellt wurde.

Beispiel 3

Untersuchung des Bindungsspektrums des Antikörpers FKF-1F3 durch die ELISA-Methode: (U Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-1F3 an die Standard-Serotvp-Stämme von P, aeruginosa

Auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 (2) wurde mit Hilfe der ELISA-Methode das Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-IF3 an die Standard-Serotyp-Stämme von P. aeruginosa untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Die verwendeten Stämme wurden von derHinterlegungsstelledes Medical Science Research Institute, Tokyo University, Japan, erhalten und in Herz-Infusions-Agar-Medium oder einem Herz-Infusions-Nährflüssigkeits-Medium kultiviert.

Tabelle 2

Bindungsaktivität des Antikörpers FKF-1F3 an die Standard-Serotvpe-StMmme von P. aeruginosa nach der Klassifizierung des Japanischen Kommittees

Serotyp Stamm Bindungsaktivität (OU4Q5)* A IID1001 0,6 B IID1002 0 B IID1007 0 B IID1013 0 B IID5004 0 C IID1021 0 D HD 1004 0 E HD 1130 0 F IID1006 0,4 G HD 1020 0,4 H IID 1009 0 I HD 1010 0 J IID 1011 0 K IID 1012 0 L IID 5141 0 M HD 5018 0,1 N IID 1015 0,3

Anmerkung; * Extinktion nach Anfärbung gemäß dm- ELISA-Methode (45 Minuten). -12- AT 395 591B Es zeigte sich somit, daß der Anitkörper FKF-1F3 ein auf die Typen A, F, G und M spezifisches Bindungsvermögen besitzt. (2) Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-1F3 an klinisch isolierte Stämme Das Bindungsveimögen des Antikörpers FKF-1F3 an die Typen A und G, die klinisch mit hoher Häufigkeit isoliert wurden, wurde untersucht Zur Untersuchung dienten 19 klinische Isolate vom Typ A und 19 klinische Isolate vom Typ G. Es zeigte sich, daß der Antikörper von 14 klinischen Isolaten vom Typ A (74 %) und 10 klinischen Isolaten vom Typ G (53 %) gebunden wurde; dies ist in Tabellen 3 und 4 wiedergegeben.

Tabelle 3

Bindungsaktivität des Antikörpers FKF-1F3 an 19 klinische Isolate vom Serotvp A

Stamm

Bindungsaktivität (OD4Q5)* SP6745 SP6746 SP6783 SP6818 SP6830 SP6840 SP6708a SP9710 SP9711 SP9731 SP9762 SP9763 SP9768 SP9780 SP10029 SP10040 SP10060 SP10618 SP10676 0,81,6 U 2.50,6 2.4 U 2,0 1.6 0,1 0,1 0,1 1,6 2,1 1.4 0,2 0,6 1,7 0,2

Anmerkung: * Extinktion nach Anfärben gemäß der ELIS A-Methode (nach 45 Minuten).

Tabelle 4

Bindungsaktivität des Antikörpers FKF-1F3 an 19 klinische Isolate vom Serotvp G

Stamm

Bindungsaktivität (OD4Q5)* SP9704 SP9709 SP9712 SP9714 SP9717 SP9718 SP9738 SP9785 SP9743 SP9792 1.7 1,6 0,1 1,4 0 0,8 0,7 1,1 1.8 0,1 -13- AT 395 591B Tabelle 4 (Fortsetzung

Bindungsaktivität des Antikörpers FKF-1F3 an 19 klinische Isolate vom Serotvp G Stamm Bindungsaktivität (OD4Q5)* SP9755 0,1 SP9761 0 SP9767 13 SP9772 0 GN11187 0 TL2378 1,7 TL2378 1,7 TL2424 0 SP6788 13 SP9728a 0,3

Anmerkung: * Extinktion nach Anfärben gemäß der ELISA-Methode (nach 45 Minuten).

Es wurde auch die Bindungsaktivität des Antikörpers FKF-1F3 an klinische Isolate von P. aeruginosa Serotyp M, der häufig chronische broncho-oesophageale Infektionen verursacht, untersucht Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt, wobei zu ersehen ist, daß die Bindungsaktivität weitgehend vom Ursprung der Stämme abhängig ist und der genannte Antikörper an die untersuchten Stämme zu 10 bis 99 % gebunden wird.

Tabelle 5

Bindungsaktivität des Antikörpers FKF-1F3 an klinische Isolate vom Serotvp M Stamm Ort der Isolierung und/oder Jahr Bindungsaktivität (OD405) SP9716 SP9730 SP9744 SP9748 SP9749 SP9752 SP9775 SP10067 SP10675 Tokyo 1984 H Tf Η H iH OOOOOOO -H O SP6763 1,0 SP6764 0,9 SP6765 0,9 SP6782 U SP6794 Kyoto 1,0 GN5833 0,6 TL6852 1984 1,1 TL6890 0,1 SP6892 1,1 SP6895 0,8 SP6908 0,8

Anmerkung: ** Extinktion nach Anfarben gemäß der ELISA-Methode (nach 15 Minuten). -14-

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Beispiel 4

Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-1F3 an E. coli J5: Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (2) wurde die Bindungsaktivität des Antikörpers FKF-1F3 an E. coli Rc-Typ Mutante J5 (ATCC 39355) nach der ELISA· Methode untersucht Der J5-Stamm wurde in einem Herz-Infusions-Agar-Medium inkubiert. Die Ergebnisse gehen aus Tabelle 6 hervor und zeigen, daß der Antikörper FKF- 1F3 stark an P. aeruginosa HD 1001 (Serotyp A) als positive Kontrolle und schwach an E. coli J5 bindet

Tabelle 6

Stamm

Bindungsaktivität (OD405) 03 0,6 0 E.COÜJ5 P. aeruginosa HD 1001 (-)

Beispiel 5

Untersuchung der Bindungsspezifität durch ein kompetitives System: Da bestätigt werden konnte, daß der Antikörper FKF-1F3 an die Bakterienkörper von P. aeruginosa HD 1001 (Serotyp A) und P. aeruginosa IID1002 (Serotyp B) bindet, wurde die Bindungsspezifität durch ein kompetitives System untersucht, i. e. in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 (2) nach der ELISA-Methode unter Verwendung einer Bäkterienplatte. Als kompetitive Substanz dienten LPS (jeweils 50 pg/ml) von P. aeruginosa ÜD1001 (Serotyp A), P. aeruginosa HD 1002 (Serotyp B),P. aeruginosa 103 (Serotyp E),P. aeruginosa IID 1020 (Serotyp G),E. Coli 0-lll:B4undJ5.Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 wiedergegeben.

Tabelle 7

Antigenplatte Ursprung der kompetitiven Bindungsaktivität

Substanz (LPS) (OD405) PA IID 1001-Stamm PA IID 1001 PA IID 1002 PA PA 103 PA IID 1020 EC 0-lll:B4 ECJ5 (-) 0,6 2.4 2.4 1,9 2.5 2,1 2,3 PA ÜD 1020-Stamm PA ÜD 1001 0,2 PA IE) 1002 1,0 PA PA 103 0,9 PA ÜD 1020 0,7 EC0-111:B4 1,0 ECJ5 0,8 (-) 0,9

In den Bakterienkörper-Platten vonP. aeruginosa ÜD 1001 und IID 1020 inhibierte das von HD 1001 stammende LPS die Bindung des Antikörpers FKF-1F3 stark; das von HD 1020 stammende LPS zeigte eine schwache Inhibierungsaktivität. Andere LPS ergaben keine oder nur eine sehr schwache Aktivität. -15-

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Beispiele

Bindunesvermögen des Antikörpers FKF-1F3 an LPS, das von P. aeruginosa stammt:

Von P. aeruginosa stammendes LPS (1 pg/ml), Phosphatidylcholin (5 pg/ml), Cholesterin (2,5 pg/ml) wurden in Ethanol aufgelöst; die erhaltene Lösung wurde auf eine Platte mit 96 Vertiefungen gegeben, und zwar 10 μΙ/Vertiefung; darauf wurde das Ganze 2 h bei 37 °C zum Trocknen stehen gelassen. 3%ige BSA-PBS-Lösung (100 μΐ) wurde zugegeben; die Reaktion zum Blockieren wurde 2 h lang bei Raumtemperatur ausgeführt, wobei eine Antigenplatte unter Verwendung von LPS als Antigen (Rannagi et al: „Application of Immunological Methods in Biomedical Science“, Blackwell Scientific, Oxford, Seiten 117.1-117.20 [1986]) erhalten wurde.

Die ELIS A-Methode wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (2) unter Verwendung von 0,5 % BS A-PBS anstelle von PBST durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt.

Taten? 3

Ursprung von LPS Serotyp Bindungsaktivität (OD405) P. aeruginosa A IID 1001 A 0,7 P. aeruginosa A IID 1002 B 0,1 P. aeruginosa PAO1822 B 0,1 P. aeruginosa PA 103 E 0,2 P. aeruginosa IID 1020 G 0,3

Der Antikörper FKF-1F3 wurdestaik an das vonP. aeruginosa IID1001 (Serotyp A) stammende LPS gebunden; an das von P. aeruginosa HD 1020 (Serotyp G) stammende LPS erfolgte nur eine schwache Bindung.

Beispiel 7

Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-1F3 an LPS und Lipid A. welche von Salmonella stammen:

Das Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-1F3 an eine Reihe von LPS, die von Salmonella minnesota stammen, wurde durch kompetitive Reaktion mit Hilfe der ELISA-Methode untersucht. Der Antikörper FKF-1F3 wurde mit LPS, das von S. minnesota stammt, und Lipid A (hoch gereinigte LPS-Kits, List Biological Laboratories, Inc.) als kompetitive Substanzen in Konzentrationen von 2,5 μΜ und 25 μΜ vermischt und dann 1 h bei 37 °C inkubiert-ELISA wurde unter VerwendungeinerPlattemit96 Vertiefungen durchgeführt, wobeiderBakterienkörper von P. aeruginosa IID 1001 auf die Platte zur Bestimmung der Inhibierungsrate fixiert wurde. Die Ergebnisse gehen aus Tabelle 9 hervor und zeigen, daß der Antikörper FKF-1F3 ein starkes Bindungsvermögen an Lipid A und LPS (rauher Typ Rc, Rd und Re) besitzt.

Tabelle 9 LPS-Chemotyp

Bindungsaktivität (OD405) 0,25 μΜ 25 μΜ LPS Wildtyp 0,24 0,29 Ra 0,27 0,25 Rb 0,24 0,22 Rc 0,22 0,07 Rd 0,17 0,04 Re 0,03 0 Lipid A 0,12 oa (-) 0,26 0,26

Anmerkung: Die Bindungsaktivität ist diejenige nach Abzug des Kontrollwertes (0,14). -16-

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Beispiel 8

Bindungsvermögen von FKF-1F3 an Lipid A von Gram-negativen Bakterien:

Die Untersuchung wurde unter Verwendung von Lipid A, das von E. coli stammt, Lipid A, das von S. typhimurium Re-Mutante stammt (Ribi Immunochem. Research Ine., Hamilton, MT), und Lipid A, das von 5 S. minnesota RS9S stammt (List Biological Laboratories Inc.) auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 nach der ELISA-Methode durchgeführt LPS und Lipid A, die von P. aeruginosa IID 1001 stammen, wurden wie folgt hergestellt: Methode nach Westphal et al, wobei die wasserlösliche Fraktion, die durch Extraktion mit 45 % heißem Phenol erhalten wurde, mit Cetylmethylammoniumbromid („Cetavlon“; Nakarai Chemical) zur Eliminierung von Nucleinsäure behandelt wurde; das Ethanolpräzipitat diente als LPS-Specimen (Methods Carbohydr. Chem., 5, 10 83-91 [1965]);LPS wurdemitl%igerEssigsäure90Minutenbei 100 °C hydrolysiert; der Chloroformextrakt diente als ein Lipid A-Specimen (Eur. J. Biochem., 52,331-343 [1975]). Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 wurde ein ELISA durchgeführt unter Verwendung einer mit Lipid A von S. minnesota R595 beschichteten Platte und unter Verwendung von Lipid A als kompetitive Substanz (50 pg/ml). Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt, woraus hervorgeht, daß der Antikörper FKF-1F3 ein Bindungsvermögen auf Lipid A, welches von verschiedenen Gram-IS negativen Bakterien stammt, besitzt

Tabelle 10 20 Lipid A Bindungsaktivität (OD405) P. Aeruginosa IID 1001 0,25 E. coli J5 0,18 25 S. thyphimurium Re-Mutante 0,16 S. minnesota R595 0,18 (-) 1,07 30

Beispiel 9

Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-1F3 an LPS. das von P. aeruginosa stammt:

Das Bindungsvermögen an LPS, welches von P. aeruginosa HD 1001 stammt wurde mit dem von LPS von E. coli und S. minnesota verglichen. ELISA wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 ausgefühlt, wobei eine 35 mit Lipid A von S. minnesota R595 beschichtete Platte verwendet wurde und intaktes LPS und Lipid A, welche von P. aeruginosa IID 1001 stammen (sieheBeispiel 8) undLPS vom glatten TypundLipid A vonE. coli und S. minnesota als kompetitive Substanzen (50 pg/ml) dienten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 wiedergegeben und zeigen, daß der Antikörper an Lipid A, das von einem beliebigen Mikroorganismus stammt, und LPS vom glatten Typ, welches allein von P. aeruginosa stammt bindeL Der Grund, warum das Bindungsvermögen an LPS vom glatten Typ nicht 40 festgestellt wurde, liegt wahrscheinlich an einer Mycellen-Bildung durch LPS in wäßriger Lösung, wodurch die Lipid A-Komponente auf dem Polysaccharid-Teil durch sterische Hinderung nicht exponiert ist Im Falle von P. aeruginosa kann zusätzlich zu Lipid A jede Antikörper-Bindungsstelle vorliegen. 45 Kompetitive Substanz Tabellen Bindungsaktivität (OD4Q5) 50 P. aeruginose IID 1001 LPS 0,16 P. aeruginosa II1001 Lipid A 0,24 E. coli 0-lll:B4 LPS 1,02 E.coliJ5 LPS 0,18 S. minnesota Wildtyp LPS 1,07 55 S. minnesota R595 Lipid A 0,20 (-) 1.12 -17

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Beispiel 10

Bindunesvermögen des Antikörpers FKF-1F3 an Chitin:

Teng et al gelang die Herstellung von humanem monoklonalen Antikörper (IgM) auf LPS von E. coli J5 (Proc. NaÜ. Acad. Sei., USA 82,1970*1974 [1985]). In diesem Artikel ist angegeben, daß der Antikörper ein Bindungsvermögen auf Chitin (N-Acetylglucosamin-Homopolymer) besitzt.

In diesem Beispiel wurde das Bindungsvermögen des Antikörpers FKF-1F3 an Chitin mit Hilfe der ELISA-Methode unter Verwendung einer mit Lipid A von S. minnesota R595 beschichteten Platte sowie mit Chitin-Pulver aus Krebsschalen (Nakarai Chemical) als kompetitive Substanz auf die gleiche Weise untersucht wie in Beispiel 8. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengefaßt und zeigen, daß keine Kreuzreaktion zwischen Antikörper FKF-1F3 und Chitinbeobachtetwerden kann. Somit unterscheidet sich der AntikörperFKF-lF3 in seinemEpitop von dem Antikörper auf LPS, das von E. coli J5 stammt

Tabellen

Kompetitive Substanz Dosis (pg) Bindungsaktivität (OD405) Chitin 5 1,05 10 1,01 Lipid A, welches von 5 0,33 S. minnesota R595 stammt 10 0,18 (-) - 1,07

Beispiel 11

Trennung des Polvsaccharidteils von LPS und Analyse des Antigens: ffl Trennung des Polvsaccharidteils von LPS. welches von P. aeruginosa ΠΡ1001 stammt

Nach der Methode von Wilkinson etal (Eur. J. Biochem., 52,331 [1975]) wurde der Polysaccharidteil von LPS, welches von P. aeruginosa HD 1001 stammt, abgetrennt. Es wurde so verfahren: LPS (10 mg) wurde in l%iger Essigsäure aufgelöst und 90 Minuten bei 100 °C hydrolysiert Das fireigesetzte Lipid A wurde durch Fraktionierung mitChloroform eliminiert DieerhaltenewasserlöslicheFraktionwuideeinerSäulenchromatographie(Säulengröße: 1 x 70 cm) unter Verwendung von Dextran („Sephadex G50“; Pharmacia, Uppsala), equilibriert mit 50 mMPyridin-Acetat-Puffer (pH 5,5) zur Fraktionierung unterworfen. Mit Hilfe der Spektralfotometrie wurden die Positionen bestimmt bei denen das Polysaccharid, das Kemoligosaccharid vom semi-rauhen Typ und das Kemoligosaccharid vom rauhen Typ eluiert wurden. Das neutrale Saccharid wurde mit Hilfe der Phenol-Schwefelsäure-Methode nachgewiesen (Dubois et al, AnaL Chem., 28,350 [1956]); das Aminosaccharid wurde mit 2 N Schwefelsäure 2 h bei 100 °C hydrolysiert und dann mit der MBTH (3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon-hydrochlorid)-Methode (Tsuji et al, Chem. Pharm. Bull., 17, 217 [1969]) nachgewiesen. Die Fraktionen des Polysaccharids, des Kemoligosaccharids vom semi-rauhen Typ und das Kranoligosaccharid vom rauhen Typ wurden nach dem Gefriergetrocknen erhalten. (21 Bindunesvermögen des Antikörpers FKF-1F3 an die Polvsaccharidfiaktion

Mit Hilfe der ELIS A-Methode wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 die Kompetition des Antikörpers FKF-1F3 mit dem Polysaccharid, dem Kemoligosaccharid vom semi-rauhen Typ und dem Kemoligosaccharid vom rauhen Typ, die vonP.aeraginosallD 1001 stammen; undin Beispiel 11 (1) erhalten wurden, untersucht. Die Menge der verwendeten kompetitiven Substanz war diejenige, die 20 nMol des neutralen Saccharids gemäß der Phenol-Schwefelsäure-Methode, wie sie in Beispiel 11 (1) genannt wird, entsprach. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 aufgeführt -18-

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Tabelle 13

Kompetivie Substanz

Bindungsaktivität (OD405)

Polysaccaiid 0,04 Kemoligosaccharid vom semi-rauhen Typ 0,42 Kemoligosaccharid von rauhen Typ 0,39 (-) 039

Aus den vorstehenden Ergebnissen und dem Westem-Blotting in Beispiel 2 (1) kann gefolgert werden, daß das von dem Antikörper FKF-1F3 erkannte Epitop im Falle bestimmter Stämme von P. aeruginosa zusätzlich zu Lipid A im Polysaccharidteil vorliegt.

Beispiel 12

Therapeutische Wirkunedes Antikörpers FKF-1F3 auf experimentelle Infektionen mitP. aeruginosa in Mäusen: (11 Therapeutische Wirkung auf Infektionen durch P. aeruginosa (Serotvp ff) ICR-slc-Mäuse (4 Wochen alt; männlich; 10 Tiere pro Gruppe) wurden intraperitoneal mit 1,2 x 10* oder 6,2 x 10* Zellen von klinischem P. aeraginosa-Isolat SP6788 (Serotyp G) inokuliert Nach 1 h wurde der Antikörper FKF-1F3 (0,1 pg) intraperitoneal verabreicht. Die Beurteilung des therapeutischen Effektes »folgte auf Basis der Überlebensrate nach einer Woche. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 aufgeführt, und zeigen, daß in der behandelten Gruppe alle Tiere überlebten, und daß der Antikörper FKF-1F3 wirksam ist zur Behandlung von Infektionen durch P. aeruginosa (Serotyp G).

Tabelle 14

Antikörper Dosis Überlebensrate (%) (inokulierte Menge, CFU pro Maus) 1,2x10* 6,2x10* FKF-1F3 0,1 pg/Maus 100 100

Keine - 20 30 (2) Therapeutischer Effekt auf Infektionen durch P. aeruginosa (Serotvp A) ICR-slc-Mäuse (5 % Mutin) (4 Wochen alt; männlich; 10 Tiere pro Gruppe) wurden intraperitoneal mit 3,7 x 10*, 1,5 x 105 oder 73 x 10^ Zellen von klinischem P. aeruginosa-Isolat SP6788 (Serotyp A) inokuliert Nach 1 h wurde der Antikörper FKF- 1F3 (0,1 pg) intraperitoneal verabreicht Die Beurteilung der therapeutischen Wirkung erfolgte auf Basis der Überlebensiate nach einer Woche. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 aufgefuhrt und zeigen, daß in der behandelten Gruppe die Übeilebensrate signifikant ist, selbst wenn die inokulierte Menge bis zu 1,5 x 10^ Zellen beträgt. Der Antikörper FKF-1F3 ist wirksam zur Behandlung von Infektionen durch P. aeruginosa (Serotyp A). -19-

Claims (15)

1. AT 395 591B Tabelle 15 Antikörper Dosis Überlebensrate (%) (inokulierte Menge, CFU pro Maus) 3,7x101 2 3 4 5 1,5 x 106 7 8 9 10 11 7,3 x1ο6 FKF-1F3 0,1 pg/Maus 100 80 0 BSA 2pg/Maus 80 20 10 physiollog. Kochsalzlösung _ 50 10 0 -20- 1
2. PATENTANSPRÜCHE 2 Humaner monoklonaler Antikörper, der spezifisch an O-Polysaccaride von Stämmen vonPseudomonas aeruginosa, welche nach der Klassifizierung des Studienkommittees für Serotypenklassifikation, japanische Studiengruppe von Pseudomonas aeruginosa, in zwei oder mehrere verschiedene Serotypen unterteilt sind, und auch an Lipid A, welches von Gram-negativen Bakterien stammt, bindet
3. 3 Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Serotypen ausgewählt sind aus den Typen A, F, GundM.
4. 4 Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gram-negativen Bakterien ausgewählt sind aus Escherichia, Salmonella und Pseudomonas.
5. 5 Antikörper nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß dieser auf Lipid A, das von einer Escherichia coli Rc Mutante stammt, reagiert
6. 6 Antikörper nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß dieser auf Lipid A, das von Escherichia coli Rc Mutante J5 (ATCC 39355) stammt reagiert
7. 7 Antikörper nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß dieser IgM darstellt
8. 8 Humaner monoklonaler Antikörper FKF-1F3.
9. 9 Präventives oder therapeutisches Mittel gegen bakterielle Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß dieses eine wirksame Menge des Antikörpers nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 als Wirkstoff enthält
10. 10 Präventives oder therapeutisches Mittel gegen durch Bakterien, umfassend Gram-negative Bakterien, verursachte Infektionen nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wirksame Menge des Antikörpers nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 als Wirkstoff enthält 11 Präventives oder therapeutisches Mittel gegen durch Bakterien, umfassend Pseudomonas aeruginosa, verursach-te Infektionen nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wirksame Menge des Antikörpers nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 als Wirkstoff enthält AT 395 591 B
11. 11. Präventives oder therapeutisches Mittel gegen von Gram-negativen Bakterien verursachten Endotoxin-Schock, dadurch gekennzeichnet, daß dieses eine wirksame Menge des Antikörpers nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 als Wirkstoff enthält.
12. 12. Mit Epstein-Barr-Virus transformierte Zellinie, dadurch gekennzeichnet, daß diese in der Lage ist, den Antikörper nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 zu produzieren, sowie jede weitere davon abstammende Zellinie.
13. 13. Hybridom, dadurch gekennzeichnet, daß dieses durch Zellfusion eines Human-B-Lymphozyten, der eine Epstein-Barr-Virus transformierte Zelle umfaßt, mit einer Myelomzelle erhalten wird, wobei das Hybridom in der Lage ist, den Antikörper nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 zu produzieren, sowie jede weitere davon abstammende Zellinie.
14. 14. Hybridom FKF-1F3 und jede weitere davon abstammende Zellinie.
15. 15. Verfahren zur Herstellung eines humanen monoklonalen Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellinie nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 14 als Zellkultur züchtet und aus dem Kulturiiberstand den gebildeten Antikörper gewinnt. -21-