DE3539775C2 - Neues Lymphokin, gegen dieses Lymphokin spezifische Antikörper, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents
Neues Lymphokin, gegen dieses Lymphokin spezifische Antikörper, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre VerwendungInfo
- Publication number
- DE3539775C2 DE3539775C2 DE3539775A DE3539775A DE3539775C2 DE 3539775 C2 DE3539775 C2 DE 3539775C2 DE 3539775 A DE3539775 A DE 3539775A DE 3539775 A DE3539775 A DE 3539775A DE 3539775 C2 DE3539775 C2 DE 3539775C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cells
- human
- human cells
- producing
- tumor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 45
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 40
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 73
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 69
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 59
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 35
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 29
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 24
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 16
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 claims description 15
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 13
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 12
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 10
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 claims description 9
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 6
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 5
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 5
- -1 eyewash Substances 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- MYKOKMFESWKQRX-UHFFFAOYSA-N 10h-anthracen-9-one;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 MYKOKMFESWKQRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 4
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 claims description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 4
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- 102000016605 B-Cell Activating Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108010028006 B-Cell Activating Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 3
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 claims description 3
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 claims description 3
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 2
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 2
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 239000003976 antineoplastic alkaloid Substances 0.000 claims 1
- 239000003972 antineoplastic antibiotic Substances 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 12
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 11
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 8
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 8
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 7
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 7
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 7
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 6
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 6
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 5
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 5
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 5
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 5
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- AQTQHPDCURKLKT-JKDPCDLQSA-N vincristine sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C=O)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 AQTQHPDCURKLKT-JKDPCDLQSA-N 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 4
- 229960002110 vincristine sulfate Drugs 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 3
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanol Chemical compound OCCC1=CC=CC=C1 WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 2
- 240000007643 Phytolacca americana Species 0.000 description 2
- 235000009074 Phytolacca americana Nutrition 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000012829 chemotherapy agent Substances 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 2
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001420 nimustine Drugs 0.000 description 2
- VFEDRRNHLBGPNN-UHFFFAOYSA-N nimustine Chemical compound CC1=NC=C(CNC(=O)N(CCCl)N=O)C(N)=N1 VFEDRRNHLBGPNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GCKMFJBGXUYNAG-UHFFFAOYSA-N 17alpha-methyltestosterone Natural products C1CC2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C)(O)C1(C)CC2 GCKMFJBGXUYNAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- NKGPJODWTZCHGF-KQYNXXCUSA-N 6-thioinosinic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(S)=C2N=C1 NKGPJODWTZCHGF-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KABRXLINDSPGDF-UHFFFAOYSA-N 7-bromoisoquinoline Chemical compound C1=CN=CC2=CC(Br)=CC=C21 KABRXLINDSPGDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHHKQEUPHAENFK-UHFFFAOYSA-N Carboquone Chemical compound O=C1C(C)=C(N2CC2)C(=O)C(C(COC(N)=O)OC)=C1N1CC1 SHHKQEUPHAENFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010667 Carcinoma of liver and intrahepatic biliary tract Diseases 0.000 description 1
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 238000006421 Davidson Oxazole synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- SAMRUMKYXPVKPA-VFKOLLTISA-N Enocitabine Chemical compound O=C1N=C(NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SAMRUMKYXPVKPA-VFKOLLTISA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 229920001491 Lentinan Polymers 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 235000010654 Melissa officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000062730 Melissa officinalis Species 0.000 description 1
- GCKMFJBGXUYNAG-HLXURNFRSA-N Methyltestosterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@](C)(O)[C@@]1(C)CC2 GCKMFJBGXUYNAG-HLXURNFRSA-N 0.000 description 1
- 101710204212 Neocarzinostatin Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010057150 Peplomycin Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 241000011102 Thera Species 0.000 description 1
- FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N Thiotepa Chemical compound C1CN1P(N1CC1)(=S)N1CC1 FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- USZYSDMBJDPRIF-SVEJIMAYSA-N aclacinomycin A Chemical compound O([C@H]1[C@@H](O)C[C@@H](O[C@H]1C)O[C@H]1[C@H](C[C@@H](O[C@H]1C)O[C@H]1C[C@]([C@@H](C2=CC=3C(=O)C4=CC=CC(O)=C4C(=O)C=3C(O)=C21)C(=O)OC)(O)CC)N(C)C)[C@H]1CCC(=O)[C@H](C)O1 USZYSDMBJDPRIF-SVEJIMAYSA-N 0.000 description 1
- 229960004176 aclarubicin Drugs 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 231100000215 acute (single dose) toxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000011047 acute toxicity test Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- GUSANBRNBREBPL-TZTIVRRBSA-N alpha-D-Ara-(1->5)-alpha-D-Ara-(1->3)-[alpha-D-Ara-(1->5)]-alpha-D-Ara-(1->5)-alpha-D-Ara-(1->5)-alpha-D-Ara-(1->2)-[alpha-D-Man-(1->6)]-alpha-D-Man-(1->6)-[alpha-D-Man-(1->2)]-alpha-D-Man-(1->6)-alpha-D-Man-(1->6)-alpha-D-Man Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OC[C@H]2O[C@H](O[C@H]3[C@H](O)[C@@H](OC[C@H]4O[C@H](OC[C@H]5O[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@H]7O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]7O)O[C@@H]6OC[C@H]6O[C@H](OC[C@H]7O[C@H](OC[C@H]8O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]8O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]7O)[C@@H](O[C@H]7O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]7O)[C@@H](O)[C@@H]6O)[C@@H](O)[C@@H]5O)[C@@H](O)[C@@H]4O)O[C@@H]3CO[C@H]3O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]3O)[C@@H](O)[C@@H]2O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUSANBRNBREBPL-TZTIVRRBSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- KZOWNALBTMILAP-JBMRGDGGSA-N ancitabine hydrochloride Chemical compound Cl.N=C1C=CN2[C@@H]3O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]3OC2=N1 KZOWNALBTMILAP-JBMRGDGGSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 201000009613 breast lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229960002115 carboquone Drugs 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 229960005243 carmustine Drugs 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- ZYVSOIYQKUDENJ-WKSBCEQHSA-N chromomycin A3 Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@@H]1OC(C)=O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@@H]1C[C@@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](C)O1 ZYVSOIYQKUDENJ-WKSBCEQHSA-N 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940035811 conjugated estrogen Drugs 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229960003901 dacarbazine Drugs 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N deoliosyl-3C-alpha-L-digitoxosyl-MTM Natural products CC=1C(O)=C2C(O)=C3C(=O)C(OC4OC(C)C(O)C(OC5OC(C)C(O)C(OC6OC(C)C(O)C(C)(O)C6)C5)C4)C(C(OC)C(=O)C(O)C(C)O)CC3=CC2=CC=1OC(OC(C)C1O)CC1OC1CC(O)C(O)C(C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229950011487 enocitabine Drugs 0.000 description 1
- YJGVMLPVUAXIQN-UHFFFAOYSA-N epipodophyllotoxin Natural products COC1=C(OC)C(OC)=CC(C2C3=CC=4OCOC=4C=C3C(O)C3C2C(OC3)=O)=C1 YJGVMLPVUAXIQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTTMOCOWZLSYSV-QWAPEVOJSA-M equilin sodium sulfate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4C3=CCC2=C1 QTTMOCOWZLSYSV-QWAPEVOJSA-M 0.000 description 1
- FRPJXPJMRWBBIH-RBRWEJTLSA-N estramustine Chemical compound ClCCN(CCCl)C(=O)OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 FRPJXPJMRWBBIH-RBRWEJTLSA-N 0.000 description 1
- 229960001842 estramustine Drugs 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000007986 glycine-NaOH buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 229940115286 lentinan Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000000865 liniment Substances 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 201000002250 liver carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229960001566 methyltestosterone Drugs 0.000 description 1
- CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N mithramycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](C)[C@@H](O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N neocarzinostatin chromophore Chemical compound O1[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC)[C@H]1O[C@@H]1C/2=C/C#C[C@H]3O[C@@]3([C@@H]3OC(=O)OC3)C#CC\2=C[C@H]1OC(=O)C1=C(O)C=CC2=C(C)C=C(OC)C=C12 QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPMKNHGAPDCYLP-UHFFFAOYSA-N nimustine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CNC(=O)N(CCCl)N=O)C(N)=N1 KPMKNHGAPDCYLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229950003180 peplomycin Drugs 0.000 description 1
- QIMGFXOHTOXMQP-GFAGFCTOSA-N peplomycin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCN[C@@H](C)C=1C=CC=CC=1)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1NC=NC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QIMGFXOHTOXMQP-GFAGFCTOSA-N 0.000 description 1
- NJBFOOCLYDNZJN-UHFFFAOYSA-N pipobroman Chemical compound BrCCC(=O)N1CCN(C(=O)CCBr)CC1 NJBFOOCLYDNZJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000952 pipobroman Drugs 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229960003171 plicamycin Drugs 0.000 description 1
- YJGVMLPVUAXIQN-XVVDYKMHSA-N podophyllotoxin Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@H](O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 YJGVMLPVUAXIQN-XVVDYKMHSA-N 0.000 description 1
- 229960001237 podophyllotoxin Drugs 0.000 description 1
- YVCVYCSAAZQOJI-UHFFFAOYSA-N podophyllotoxin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2C3=CC=4OCOC=4C=C3C(O)C3C2C(OC3)=O)=C1 YVCVYCSAAZQOJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229940113116 polyethylene glycol 1000 Drugs 0.000 description 1
- 108010001062 polysaccharide-K Proteins 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003339 sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- WFWLQNSHRPWKFK-ZCFIWIBFSA-N tegafur Chemical compound O=C1NC(=O)C(F)=CN1[C@@H]1OCCC1 WFWLQNSHRPWKFK-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- 229960001674 tegafur Drugs 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960001196 thiotepa Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000001875 tumorinhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- KDQAABAKXDWYSZ-PNYVAJAMSA-N vinblastine sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.C([C@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 KDQAABAKXDWYSZ-PNYVAJAMSA-N 0.000 description 1
- 229960004982 vinblastine sulfate Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005212 vindesine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003871 white petrolatum Substances 0.000 description 1
- 229950009268 zinostatin Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Description
Die Erfindung betrifft ein neues Lymphokin (Anspruch 1), ein Verfahren
zu seiner Herstellung (Ansprüche 2 bis 15, 23, 30) und eine pharmazeutische Zusammensetzung (Ansprüche 16-21) sowie einen
gegenüber diesem Lymphokin spezifischen monoklonalen Antikörper
(Anspruch 22) und seine Herstellung (Ansprüche 23 bis 28).
Lymphotoxin (LT) und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) sind be
kannte Lymphokine, die Tumorzellen schädigen. So wurde
Lymphotoxin beispielsweise beschrieben von Aoki, Ryuichi
et al. in "Lymphokine", Shin-Menekigaku Sosho, Bd. 6, Seiten
87 bis 105, Igaku-Shoin, Tokio, 1979; B.R. Bloom & P.R.
Glade in "In Vitro Method in Cell-Mediated Immunity", Aca
demic Press, Inc. 1971; und in "Cellular Immunology", Bd.
38, Seiten 388 bis 402 (1978); der Tumor-Nekrose-Faktor
(TNF) wurde beispielsweise beschrieben in E.A. Carswell
et al. "Proceedincis of the National Academy of Sciences
of the U.S.A." Bd. 72, Nr. 9, Seiten 3666 bis 3670 (1975)
und in E. Pick "Lymphokines", Bd. 2, Seiten 235 bis 272
"Tumor Necrosis Factor", Academic Press, Inc. (1981).
Kürzlich wurde in der JP-A-146 293/83 ein Anti-Tumor-Lympho
kin-Glycoprotein beschrieben.
In "Scientific American", Bd. 243, Nr. 4, Seiten 56 bis
64 (1980) beschreibt C. Milstein monoklonale Antikörper.
Als Chemotherapeutika werden im allgemeinen mindestens
ein Alkylierungsmittel, metabolische Antagonisten, Anti
tumorantibiotika und Pflanzenalkaloide verwendet. Chemothera
peutika haben jedoch die Nachteile, daß bei ihrer Verwendung
bei den Patienten Nebenwirkungen auftreten können, daß
ihr Tumorspektrum relativ eng und ungenügend ist und daß
sie zu medikament-resistenten Tumoren führen können.
Als Ergebnis jahrelanger Untersuchungen über Lymphokine
wurde nun ein neues Lymphokin entdeckt, dessen physikochemi
sche Eigenschaften und zytotoxische Aktivität auf bösartige
Tumorzellen völlig von denen bekannter Lymphokine verschie
den sind. Dieses neue Lymphokin kann nun hergestellt und
verwendet werden, außerdem wurde ein gegenüber diesem
Lymphokin spezifischer monoklonaler Antikörper gefunden und
auch hergestellt.
Die Erfindung betrifft somit ein neues Lymphokin mit den
folgenden physikochemischen Eigenschaften:
- 1) Molekulargewicht:
20 000 ± 2000 Dalton - 2) Isoelektrischer Punkt:
pI = 6,2 ± 0,3 - 3) Elektrophoretische Beweglichkeit:
auf Scheiben-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE): Rf = 0,29 ± 0,02 - 4) UV-Absorptionsspektrum:
Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm - 5) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
unlöslich in Wasser, Salzlösung und Phosphatpuffer, kaum löslich oder unlöslich in Ethylether, Ethylacetat oder Chloroform - 6) Farbreaktion:
proteinpositiv gemäß Lowry- oder nach der Mikrobiuret- Methode,
saccharidpositiv mit Phenol-Schwefelsäure oder Anthron- Schwefelsäure - 7) Biologische Eigenschaften:
gegen L 929-Zellen zytotoxisch,
gegen KB-Zellen zytostatisch,
praktisch frei von Interferonaktivität - 8) Stabilität in wässerigen Lösungen:
bis zu 60°C stabil bei 30 min. Inkubation bei pH 7,2
stabil im pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 bei 16 stünd. Inkubation bei 4°C - 9) Stabilität bei Kryokonservierung bzw. Kältelagerung:
bei -10°C über einen Monat und länger stabil und - 10) spezifische Aktivität:
106 Einheiten/mg Protein oder darüber.
Die Erfindung betrifft auch die Herstellung und die Verwen
dung des erfindungsgemäßen Lymphokins sowie den gegenüber
diesem Lymphokin spezifischen monoklonalen Antikörper und
seine Herstellung.
Im folgenden wird das neue erfindungsgemäße Lymphokin ein
fach mit "LK 2" abgekürzt.
LK 2 wird hergestellt durch Inberührungbringen von LK 2
produzierenden Humanzellen, beispielsweise Humanleukozyten,
Humanlymphozyten und daraus etablierten Zellinien, mit
einem LK 2-Induktor. Humanleukozyten und -lymphozyten können
aus frischem Humanblut isoliert werden; die etablierten
Humanzellinien können in herkömmlicher Weise in vitro ver
mehrt werden.
Für eine wirkungsvollere Ausnutzung des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist es zweckmäßig, eine in vivo Zellvermehrung
anzuwenden, in der die Humanzellinie direkt in einen nicht
humanen Warmblütler transplantiert wird oder in herkömmli
che Diffusionskammern inokuliert wird, in denen die Nährflüs
sigkeit des nichthumanen Warmblütlers der Zellinie zuge
führt wird.
Im Gegensatz zur in vitro Zellvermehrung benötigt das in
vivo Verfahren kein oder viel weniger teures Serum enthalten
des Nährmedium und weniger Pflege während der Zellvermeh
rung; die vermehrten Humanzellen liefern eine viel höhere
LK 2-Aktivität.
Außerdem kann bei dem in vivo Verfahren die Humanzellinie
leicht vermehrt werden durch Verwendung der von dem nicht
humanen Warmblütler zur Verfügung gestellten Nährkörper
flüssigkeit, wenn man die Humanzellinie einem nichthumanen
Warmblütler transplantiert oder die Zellinie in eine her
kömmliche Diffusionskammer einbringt, die die Körperflüssig
keit aufnimmt und diese Kammer in das Tier einbettet oder
auf das Tier aufbringt. In beiden Fällen werden die Tiere
in herkömmlicher Weise gefüttert.
Das in vivo Verfahren ist außerdem dadurch gekennzeichnet,
daß eine stabilere und schnellere Zellvermehrung, eine
höhere Zellproduktion und eine viel höhere LK 2-Produktion
je Zelle als mit dem in vitro Verfahren erreicht werden
kann.
Für die Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren sind
Humanzellinien geeignet, die LK 2 produzieren, in einen
nichthumanen Warmblütler transplantiert und in diesem Tier
leicht vermehrt werden können, wie beispielsweise die in
"Protein, Nucleic Acid and Enzyme", Bd. 20, Nr. 6, Seiten
616 bis 643 (1975) beschriebenen Humanzellinien. Besonders
geeignet sind Human-Lymphoblastoidlinien, wie Namalwa (ATCC
CRL 1432), beschrieben in "Journal of Clinical Microbio
logy", Bd. 1, Seiten 116 bis 117 (1975); BALL-1, TALL-1
und NALL-1, beschrieben in I. Miyoshi, "Nature", Bd. 267,
Seiten 843 bis 844 (1977); M-7002 und B-7101, beschrieben
in "The Journal of Immunology", Bd. 113, Seiten 1334 bis
1345 (1974); JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, MOLT-3 (ATCC CRL 1552)
und EBV-HO, beschrieben in "The Tissue Culture", Bd. 6,
Nr. 13, Seiten 527 bis 546 (1980); CCRF-SB (ATCC CCL 120);
CCRF-CEM (ATCC CCL 119); BALM 2; DND-41; und andere etablier
te Zellinien, die durch Transformieren normaler Humanmono
zyten oder -granulozyten mit karzinogenen Viren, Mitteln
oder Bestrahlung erhalten worden sind.
Die Vermehrungsgeschwindigkeit und/oder LK 2-Produktivität
je Zelle dieser Zellinien kann verbessert werden durch
Zellfusion mit Polyethylenglykol oder Sendai-Virus oder
durch Genrekombination mit beispielsweise Nuklease, Ligase
oder DNA-Polymerase. Die hier angegebenen verwendbaren
Humanzellinien sollen jedoch den Umfang der Erfindung nicht
beeinträchtigen. Eine oder mehrere dieser Zellinien können
kombiniert in den Stufen bis zur LK 2-Induktion verwendet
werden. Gegebenenfalls können Humanleukozyten oder Lympho
zyten, die aus frischem Humanblut hergestellt werden können,
in Kombination mit jeder dieser Humanzelllinien verwendet
werden.
Als nichthumaner Warmblütler können im erfindungsgemäßen
Verfahren alle Tiere verwendet werden, in denen sich Human
zellen vermehren können, beispielsweise Geflügel, wie Hühner
oder Tauben, oder Säugetiere, wie Hunde, Katzen, Affen,
Kaninchen, Ziegen, Schweine, Pferde, Rinder, Meerschwein
chen, Ratten, Nacktratten, Hamster, Mäuse oder Nacktmäuse.
Da die Transplantation von Humanzellen in Tiere unerwünschte
Immunoreaktionen hervorruft, werden nichthumane Warmblütler
im möglichst jüngsten Stadium verwendet, z. B. als Ei, Embryo
oder Fötus oder als Neugeborene oder jüngste Tiere, um
diese Immunreaktion so gering wie möglich zu halten.
Vor der Transplantation können die Tiere mit Röntgen- oder
Gamma-Strahlen in einer Dosis von etwa 200 bis 600 rem
bestrahlt werden, oder es wird ihnen ein Antiserum oder
ein die Immunreaktion unterdrückendes Mittel injiziert,
um die Immunreaktion auf dem geringstmöglichen Wert zu
halten.
Bei Verwendung eines Tieres ohne Immunreaktion, wie einer
Nacktmaus oder Nacktratte als Wirt, können die oben beschrie
benen Humanzellen ohne diese Vorbehandlung in die Tiere
transplantiert und leichter vermehrt werden, ohne Angst vor
auftretenden unerwünschten Immunreaktionen, da diese Tiere
sogar als Erwachsene weniger Immunreaktionen zeigen.
Die Zellvermehrung und/oder die Erhöhung der LK 2-Produktion
kann stabilisiert werden durch nacheinander folgende Trans
plantation in den gleichen oder in verschiedene nichtmensch
liche Warmblütler. Das kann beispielsweise dadurch erreicht
werden, daß eine Zellinie zuerst einem Hamster transplan
tiert wird und die Humanzellinie in dem Hamster vermehrt
wird, dann die vermehrten Humanzellen in eine Nacktmaus
transplantiert werden. In diesem Fall können die aufeinander
folgenden Transplantationen mit einem nichthumanen Warm
blütler der gleichen Klasse oder Ordnung wie auch der glei
chen Art oder Gattung durchgeführt werden.
Die Humanzellen können in jede Stelle des Tieres transplan
tiert werden, vorausgesetzt, die Humanzellen vermehren
sich dort: Beispielsweise in die Allantoishöhle oder intra
venös, intraperitoneal oder subkutan.
Die Humanzellen können aber auch vermehrt werden durch
Einbringen in eine herkömmliche Diffusionskammer verschiede
ner Form oder Größe, die mit geeigneten Vorrichtungen ausge
rüstet ist, um eine Verunreinigung der Kammer mit Tierzellen
zu vermeiden, jedoch die Humanzellen mit der Nährkörper
flüssigkeit des Tieres versorgt, z. B. mit einem Membran
filter, einem Ultrafilter oder Hohlfaser mit einer Poren
größe von etwa 10-7 bis 10-5 m, und Einbetten, beispiels
weise intraperitoneal, der Kammer in das Tier, wobei sich
die Humanzellen in der Kammer durch Versorgung mit der
Nährkörperflüssigkeit des Tieres vermehren.
Die Diffusionskammer kann außerdem so ausgelegt und bei
spielsweise auf das Tier angebracht werden, daß die Nährflüs
sigkeit in der Kammer frei zirkulieren kann. Die Kultur
in der Kammer kann während der Zellvermehrung beobachtet
werden, und zwar entweder durch mindestens ein an der Kammer
wand angebrachtes durchsichtiges Seitenfenster und/oder
durch Ersatz der Kammer selbst gegen eine neue Kammer zu
verschiedenen Zeitpunkten, um die Zellvermehrung ohne
Schlachten des Tieres über seine Lebenszeit zu erhalten
und die Zellproduktion je Tier stark zu erhöhen. Da die
Humanzellen mit den Tierzellen in einer solchen Diffusions
kammer nicht in direkte Berührung kommen, werden unerwünsch
te Immunreaktionen verhindert; es kann jeder nichthumane
Warmblütler ohne Vorbehandlung zur Unterdrückung dieser
Immunreaktion verwendet werden, und die vermehrten lebensfä
higen Humanzellen können leicht aus der Diffusionskammer
gewonnen werden.
Die Tiere können in herkömmlicher Weise gefüttert werden,
nach der Transplantation ist keine besondere Vorsicht not
wendig. Für eine maximale Zellvermehrung ist im allgemeinen
eine Zeit von 1 bis 10 Wochen notwendig; es werden Zellzah
len von etwa 107 bis 1012 Humanzellen je Tier oder auch
mehr erhalten. Insbesondere vermehren sich die transplantier
ten Humanzellen im erfindungsgemäßen Verfahren um etwa
102 bis 107 mal oder mehr, was etwa 10 bis 106 mal mehr
ist, als herkömmlicherweise erhältlich durch Inokulieren
und Vermehren der Humanzellen auf einem in vitro Nährkultur
medium. Das wirkt sich auch günstig auf die LK 2-Produktion
aus.
Erfindungsgemäß ist jedes Verfahren anwendbar, vorausgesetzt
die LK 2-Produktion kann in den vermehrten Humanzellen
induziert werden. Die vermehrten Humanzellen werden in
dem als Wirt für die Zellvermehrung verwendeten Tier mit
einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht. So werden bei
spielsweise Humanzellen, die in einer Ascitessuspension
vermehrt wurden, oder Tumorzellen, die beispielsweise sub
kutan gebildet wurden, direkt in vivo mit einem LK 2-Induk
tor in Berührung gebracht, um die LK 2-Produktion zu indu
zieren; das angesammelte LK 2 wird aus dem Ascites, dem
Serum und/oder Tumor gewonnen und gereinigt. Die vermehrten
Humanzellen können aber auch aus dem Tier gewonnen und
dann in vitro mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht
werden. So können vermehrte Humanzellen, die entweder aus
der Ascitessuspension oder durch Aufbrechen und Extrahieren
der beispielsweise subkutan gebildeten Tumormasse(n) gewon
nen wurden, in einem Nährkulturmedium suspendiert, auf
eine Temperatur von etwa 20 bis 40°C zu Erreichung einer
Zelldichte von etwa 105 bis 108 Zellen/ml vorgewärmt und
in vitro mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht
werden; das angesammelte LK 2 kann dann aus der Kultur
gewonnen werden.
Bei Verwendung einer herkömmlichen Diffusionskammer werden
die vermehrten Humanzellen mit dem LK 2-Induktor in der
Kammer oder nach der Gewinnung in Berührung gebracht.
Die so erhaltenen Humanzellen können weitere 1 bis 4 d
in vitro vor der LK 2-Induktion kultiviert werden, um die
Fortpflanzungszeit zu regulieren.
Die LK 2-Produktion je Tier kann durch Anwendung mindestens
einer der folgenden Verfahren noch gesteigert werden:
- 1) Die vermehrten Humanzellen werden in dem Tier, das als Wirt für die Zellvermehrung verwendet wurde, mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht und dann aus der (den) Stelle(n) des Tieres oder dessen Gesamtkörper gewonnen und dann in vitro mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht.
- 2) Die Humanzellen werden wiederholt mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht.
- 3) Die in das Tier eingebettete oder mit dem Tier verbundene Diffusionskammer wird zu verschiedenen Zeitpunkten durch eine frische Kammer ersetzt.
Als LK 2-Induktoren im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet
sind herkömmliche alpha-Interferon-Induktoren (alpha-IFN-
Induktoren), wie Viren, Nucleinsäuren und Nucleotide, sowie
herkömmliche gamma-Interferon-Induktoren (gamma-IFN-Induk
toren), wie Phytohämagglutinin, Concanavalin A, Mytogen
aus Phytolacca americana (pokeweed), Lipopolysaccharid,
Endotoxin, Polysaccharid und Bakterien. Antigene wirken
auf die sensibilisierten Zellen als LK 2-Induktoren.
Die LK 2-Produktion kann durch eine kombinierte Verwendung
von IFN-alpha- und IFN-gamma-Induktoren als LK 2-Induktoren
erhöht werden. Es wurde bestätigt, daß diese Kombination
die gleichzeitige Produktion von humanspezifischem Inter
feron (HuIFN) induziert. Das ist sehr günstig, da gleichzei
tig und wirtschaftlich günstig zwei oder mehr biologisch
aktive Substanzen hergestellt werden können, z. B. LK 2
und HuIFN und die Humanzellen viel wirkungsvoller ausge
nützt werden können.
Das so erhaltene LK 2 kann durch ein oder mehrere Reini
gungs- und/oder Trennverfahren gewonnen werden, beispiels
weise durch Aussalzen, Dialyse, Filtrieren, Zentrifugieren,
Einengen und/oder Lyophilisieren. Ist ein sehr viel reineres
LK 2-Präparat erwünscht, so kann ein Präparat mit höchster
Reinheit durch Anwendung der oben beschriebenen Verfahren
in Kombination mit anderen herkömmlichen Verfahren erhalten
werden, beispielsweise durch Adsorption und Desorption
an einem Ionenaustauscher, Gelfiltration, Fraktionierung
am isoelektrischen Punkt, Elektrophorese, Ionenaustausch
chromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie, Säulen
chromatographie und/oder Affinitätschromatographie.
Immobilisierte monoklonale Antikörper, die durch Binden
eines monokonalen Anti-LK 2-Antikörpers (der im folgenden
beschrieben wird) auf einen geeigneten wasserunlöslichen
Träger erhalten werden kann, beispielsweise auf BrCN-akti
vierte Sepharose
kann zweckmäßigerweise zur Beschleunigung und
leichteren LK 2-Reinigung verwendet werden.
Es wurde bestätigt, daß das so erhaltene LK 2 die folgenden
physikochemischen Eigenschaften hat:
- 1) Molekulargewicht:
20 000 ± 2000 Dalton - 2) Isoelektrischer Punkt:
pI = 6,2 ± 0,3 - 3) Elektrophoretische Beweglichkeit:
in der Scheiben-Polyacrylamidgelelektrophorese Rf = 0,29 ± 0,02 - 4) UV-Absorptionsspektrum:
Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm - 5) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
unlöslich in Wasser, Salzlösung und Phosphatpuffer, kaum löslich oder unlöslich in Ethylether, Ethylacetat oder Chloroform - 6) Farbreaktion:
proteinpositiv gemäß Lowry oder der Mikrobiuretmethode saccharidpositiv mit Phenol-Schwefelsäure oder Anthron- Schwefelsäure - 7) Biologische Aktivität:
bei L 929-Zellen zytotoxisch,
bei KB-Zellen zytostatisch,
praktisch frei von Interferonaktivität - 8) Stabilität in wässeriger Lösung:
stabil bis zu 60°C bei 30min. Inkubation bei pH 7,2,
stabil im pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 bei 16stünd.
Inkubation bei 4°C - 9) Stabilität bei Kryokonservierung:
einen Monat oder länger stabil bei -10°C und - 10) spezifische Aktivität:
106 Einheiten/mg Protein und darüber.
Es wurde auch bestätigt, daß LK 2 normale Humanzellen nicht
wesentlich zytolysiert, jedoch eine bemerkenswerte Zytolyse
bei einer Vielzahl von Humantumorzellen sowie bei Mäuse-Fi
broblastoidzellen, L 929, bewirkt und diese Zellen abtötet.
So ist LK 2 beispielsweise in Form einer Zusammensetzung
für die Prophylaxe und/oder Therapie von LK 2-empfindlichen
Erkrankungen geeignet, beispielsweise bei bösartigen Tumoren
und insbesondere verschiedenen bösartigen Humantumoren,
deren Behandlung sehr schwierig ist.
Somit kann erfindungsgemäß die tumorhemmende Wirkung von
Chemotherapeutika mit einem Steigerungsmittel, das LK 2
als Wirkstoff enthält, erhöht werden.
Die Dosis an Chemotherapeutika kann auf etwa 1/2 bis 1/1000
verringert werden, da die tumorhemmende Wirkung der Chemo
therapeutika außerordentlich mit dem Steigerungsmittel
erhöht werden kann. Außerdem verbreitert die Verwendung
des Steigerungsmittels das Tumorspektrum der Chemotherapeu
tika und ermöglicht die Behandlung von medikament-resisten
ten Tumoren.
Als Chemotherapeutika können erfindungsgemäß beispielsweise
eines oder mehrere der folgenden Mittel verwendet werden:
Alkylierungsmittel, wie Melphalan, Cyclophosphamide, Ifosf amide, Estramustine, Natriumphosphat, Busulfan, Imorpo sulfantosilat, N-Methyl-3,3′-dimesyloxydipropylamin-bi phenyl-4,4′-disulfonat, Carboquon, Thio-TEPA, Carmustin, Nimustinhydrochlorid, Streptozocin, Dacarbazin und Pipo broman; metabolische Antagonisten, wie Methotrexat, Fluoro uracil, Tegaful, Carmoful, Cytarabin, Ancitabinhydrochlorid, Enocitabin, 6-Mercaptopurin und Thioinosin; tumorhemmende Antibiotika, wie Doxorubicin, Daunorubicin, Aclarubicin, Bleomycin, Peplomycin, Mitomycin C, Actinomycine D und C, Chromomycin A3, Mithramycin und Neocarzinostatin; und Pflanzenalkaloide, wie Vincristinsulfat, Vinblastinsulfat, Vindesinsulfat und Podophyllotoxin. Bei der Behandlung von Prostata- oder Brustkrebs kann gegebenenfalls mindestens ein tumorhemmendes Hormon, wie Prednisolon, Methyltestosteron oder konjugiertes Östrogen, in Kombination mitverwendet werden.
Alkylierungsmittel, wie Melphalan, Cyclophosphamide, Ifosf amide, Estramustine, Natriumphosphat, Busulfan, Imorpo sulfantosilat, N-Methyl-3,3′-dimesyloxydipropylamin-bi phenyl-4,4′-disulfonat, Carboquon, Thio-TEPA, Carmustin, Nimustinhydrochlorid, Streptozocin, Dacarbazin und Pipo broman; metabolische Antagonisten, wie Methotrexat, Fluoro uracil, Tegaful, Carmoful, Cytarabin, Ancitabinhydrochlorid, Enocitabin, 6-Mercaptopurin und Thioinosin; tumorhemmende Antibiotika, wie Doxorubicin, Daunorubicin, Aclarubicin, Bleomycin, Peplomycin, Mitomycin C, Actinomycine D und C, Chromomycin A3, Mithramycin und Neocarzinostatin; und Pflanzenalkaloide, wie Vincristinsulfat, Vinblastinsulfat, Vindesinsulfat und Podophyllotoxin. Bei der Behandlung von Prostata- oder Brustkrebs kann gegebenenfalls mindestens ein tumorhemmendes Hormon, wie Prednisolon, Methyltestosteron oder konjugiertes Östrogen, in Kombination mitverwendet werden.
Die Kombination dieser Chemotherapeutika mit LK 2 soll
ten je nach Bedingungen gewählt und nicht beschränkt werden.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann hergestellt
werden durch Immunisierung eines nichthumanen Warmblütlers
mit LK 2 als Antigen, Isolierung der Antikörper produzieren
den Zellen aus dem Tierkörper, Fusion der Antikörper produ
zierenden Zellen mit Myelomazellen, Selektion der entstande
nen Hybridzellen als Klon, der LK 2-spezifische Antikörper
produzieren kann, Vermehrung dieses Klons und Gewinnung
des LK 2-spezifischen monoklonalen Antikörpers aus den
vermehrten Zellen.
Die Immunisierung kann erreicht werden durch Injektion
beispielsweise intravenös, intraperitoneal oder subkutan, einer
wässerigen LK 2-Lösung, -Emulsion oder -Suspension als
Antigen in einen geeigneten nichthumanen Warmblütler, wie
Huhn, Taube, Hund, Katze, Affe, Ziege, Schwein, Rind, Pferd,
Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Hamster oder Maus, und
Füttern des Tieres während 3 oder mehr Tage zur Induktion
der Antikörperproduktion. Als Antigen kann auch ein
Konjugat von LK 2 mit einem Saccharid gemäß JP-A-23 847/83
verwendet werden.
Das Antigen kann als Einzeldosis oder wenn notwendig in
zwei oder mehr Dosen zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf
von etwa 3 bis 30 d injiziert werden.
Die Milzzellen des immunisierten Tieres, in dem die Antikör
per-Produktion induziert worden ist, werden mit Myelomazel
len der gleichen oder einer anderen Art in geeigneter Weise
fusioniert, z. B. gemäß G. Kohler et al. in "Nature", Bd.
256, Seiten 495 bis 497 (1975) oder "European Journal of
Immunology", Bd. 6, Seiten 511 bis 519 (1976). Die so erhal
tenen Hybridzellen werden selektioniert und geklont, der
(die) Klon(e) wird (werden) in vitro oder in vivo kultiviert
und der angesammelte hochspezifische monoklonale Antikörper
wird dann aus der entstandenen Kultur gewonnen. Dabei wird
das in vivo Verfahren dem in vitro Verfahren vorgezogen,
da bei in vivo Kultivierung eine viel höhere Vermehrung
des Klons und eine viel höhere Produktion des monoklonalen
Antikörpers ohne Verwendung eines teuren Serums erreicht
werden kann.
Beim in vivo Verfahren wird der Klon dadurch vermehrt,
daß die Nährkörperflüssigkeit eines nichthumanen Warmblüt
lers ausgenützt wird, wobei dieser der gleichen oder einer
anderen Art als bei der Immunisierung angehören kann; dabei
wird der Klon in einen solchen nichthumanen Warmblütler
transplantiert oder der Klon wird in eine herkömmliche
Diffusionskammer inokuliert, die die Nährkörperflüssigkeit
eines solchen Tieres aufnehmen kann; der angesammelte mono
klonale Antikörper wird aus den Körperflüssigkeiten, wie
Ascites und Serum, gewonnen. Nach der Vermehrung in vivo
kann der Klon aber auch in einem serumfreien Kulturmedium
weitere 1 bis 5 d kultiviert werden; der angesammelte mono
klonale Antikörper kann aus der entstandenen Kultur gewonnen
werden.
Der so erhaltene monoklonale Antikörper kann leicht durch
ein oder mehrere Trenn- und/oder Reinigungsverfahren gewon
nen werden, beispielsweise durch Aussalzen, Dialyse, Filtrie
ren, Zentrifugieren, Einengen und/oder Lyophilisieren.
Ist eine sehr viel höhere Reinigung erwünscht, so kann
ein Präparat mit höchster Reinheit durch Kombinieren der
oben beschriebenen Verfahren mit anderen herkömmlichen
Verfahren erreicht werden, beispielsweise durch Adsorption
und Desorption an einem Ionenaustauscher, Gelfiltration,
Fraktionierung am isoelektrischen Punkt, Elektrophorese,
Ionenaustauschchromatographie, Hochleistungsflüssigchromato
graphie, Säulenchromatographie und/oder Affinitätschromato
graphie. Die Ausbeute an monoklonalem Antikörper kann zweck
mäßigerweise noch verbessert werden durch Verwendung eines
immobilisierten LK 2-Gels, das durch Binden von hochreinem
LK 2 auf einem wasserunlöslichen Träger, wie BrCN-aktivierte
Sepharose, erhalten werden kann.
Der erfindungsgemäß erhältliche monoklonale Antikörper
ist als Ligand für die Affinitätschromatographie bei der
LK 2- Produktion sowie für die Diagnose verschiedener Human
erkrankungen wegen seiner Spezifität für LK 2, das bösartige
Tumoren schädigt, geeignet.
Die LK 2-Titer werden entweder durch Verwendung von KB-Zel
en oder L 929-Zellen als Zielzellen bestimmt: Bei Verwendung
von KB-Zellen wird die zytostatische Aktivität gemäß "Cancer
Chemotherapy Report", Teil 3, Bd. 3, Nr. 2, September (1972)
bestimmt. Bei Verwendung von L 929-Zellen wird die zytotoxi
sche Aktivität in Gegenwart von Aktinomycin D gemäß E. Pick,
"Lymphokines", Bd. 2, Seiten 245 bis 249, "Tumor-Nekrose-
Faktor", Academic Press, Inc. (1981) bestimmt. Im folgenden
wird die Bestimmung mit L 929-Zellen verwendet, wenn nichts
anderes angegeben ist.
Die HuIFN-Titer werden mit der herkömmlichen Plaque-Reduk
tionsmethode unter Verwendung von FL-Zellen aus Humanamnion
flüssigkeit gemäß "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", Bd.
20, Nr. 6, Seiten 616 bis 643 (1975) bestimmt.
Die Hämagglutinationstiter werden gemäß S.E. Salk "The
Journal of Immunology", Bd. 49, Seiten 87 bis 98 (1944)
bestimmt.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Neugeborenen Hamstern wird herkömmliches Antiserum aus
Kaninchen injiziert, um ihre Immunreaktion zu schwächen,
und subkutan eine Human-Lymphoblastoidlinie, BALL-1, trans
plantiert. Die Tiere werden drei Wochen in herkömmlicher
Weise gefüttert. Die subkutan gebildeten Tumormassen werden
extrahiert, zerkleinert und in Salzlösung aufgebrochen.
Die so erhaltene Zellsuspension wird mit RPMI 1640-Medium,
pH 7,2, das mit Serum aufgefüllt wird, gewaschen und in
einem frischen Präparat des gleichen Kulturmediums zu einer
Zelldichte von etwa 2×106 Zellen/ml wieder suspendiert.
Diese Zellsuspension wird mit Sendai-Virus (etwa 400 Hämag
glutinationstiter/ml) versetzt und 24 h zur Induktion der
der LK 2-Produktion bei 37°C inkubiert.
Die Kultur wird bei etwa 1000 g und etwa 4°C zentrifugiert,
der entstandene Niederschlag wird entfernt. Der so erhalte
ne Überstand wird gegen eine Salzlösung, die 0,01 m Phos
phatpuffer, pH 7,2, 20 h dialysiert und durch ein Membran
filter filtriert. Das Filtrat wird durch eine Säule mit
immobilisierten Anti-HuIFN-Antikörper geleitet, die nicht
adsorbierte Fraktion wird gesammelt. Aus dieser Fraktion
wird eine aktive Fraktion durch Chromatofokussierung gewon
nen, eingeengt und zu einem pulverförmigen Produkt mit
LK 2-Aktivität lyophilisiert.
Die spezifische Aktivität dieses Produkts beträgt etwa
106 Einheiten/mg Protein. Die LK 2-Ausbeute beträgt etwa
2,0×107 Einheiten/Hamster.
Ein gemäß Beispiel A-1 hergestelltes LK 2-Präparat wird
in einer Salzlösung zu einer Proteinkonzentration von etwa
0,05% (Gew./Vol.) gelöst; die Lösung wird mit dem gleichen
Volumen an Freunds Volladjuvans versetzt. Mäuse werden
immunisiert durch subkutane Injektion von 0,2 ml-Proben
des so erhaltenen Gemisches und 7 d nach der ersten Injek
tion gefüttert. Nach der Induzierung der Anti-LK 2-Anti
körper-Produktion in den Antikörper produzierenden Zellen
der Tiere wird die Milz jedes Tiers extrahiert, zerkleinert,
aufgebrochen und suspendiert und zwar zusammen mit einer
Maus-Myeloma-Zellinie (P3-X63-Ag8)
in serumfreiem Eagle′s
Minimalnährmedium, pH 7,2, das 50% (Gew./Vol.) Polyethy
lenglykol 1000 enthält und auf 37°C vorgewärmt war. Das
Gemisch mit einer Zelldichte von 104 Zellen/ml wird 5 min
stehengelassen, dann auf das 20fache mit einem frischen
Präparat des gleichen Kulturmediums verdünnt; die Hybrido
mazellen, die in dem Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin
enthaltenden Medium wachsen können, werden gemäß R.L. David
son und P.S. Gerald in "Somatic Cell Genetics", Bd. 2,
Nr. 2, Seiten 175 bis 176 (1976), gesammelt; der Klon ent
hält Hybridomazellen, die Anti-LK 2-Antikörper produzieren
können. Diese geklonten Hybridomazellen werden in einer
Dosis von etwa 106 Zellen/Maus intraperitoneal in Mäuse
transplantiert, die 2 Wochen gefüttert und dann geschlachtet
werden. Die Körperflüssigkeiten der Tiere, wie Ascites
flüssigkeit und Blut, werden gesammelt, zentrifugiert und
mit Ammoniumsulfat ausgesalzen; die Fraktionen, die bei
30 bis 50% Sättigung ausfallen, werden gesammelt. Diese
Fraktionen werden dialysiert und mit einem immobilisierten
Anti-LK 2-Antikörpergel der Affinitätschromatographie zuge
führt. Das immobilisierte Anti-LK 2-Antikörpergel wurde
erhalten durch Umsetzung einer gemäß Beispiel A-1 erhaltenen
LK 2-Probe mit BrCN-aktivierter Sepharose bei Raumtempera
tur, wobei eine Anti-LK 2-Antikörperfraktion entstand,
die dialysiert, konzentriert und lyophilisiert wurde.
Das entstandene pulverförmige Produkt neutralisiert immuno
logisch spezifisch die zytotoxische Aktivität von LK 2.
Die Stabilität des monoklonalen Antikörpers in wässeriger
Lösung wird durch Bestimmung der Restneutralisationsaktivi
tät nach Inkubieren unter bestimmten Bedingungen untersucht:
Nach der 30min. Inkubation bei pH 7,2 und verschiedenen
Temperaturen bleiben 80% und mehr der Aktivität übrig,
bei 70°C gehen jedoch 90% und mehr verloren. Nach der
16stünd. Inkubation bei 4°C und verschiedenen pH-Werten
ist die Aktivität in einem pH-Bereich von 4,0 bis 11,0
stabil, sie geht jedoch bei einem pH-Wert von 2,0 zu 90%
und mehr verloren.
Bei der Untersuchung der Eigenschaften des monoklonalen
Antikörpers wurde festgestellt, daß der monoklonale Antikör
per gegenüber 2-Mercaptoethanol empfindlich ist und eine
spezifische Antigen-Antikörper-Reaktion mit Anti-Maus-Immuno
globulin-M-Antikörper zeigt. Deshalb wird der monoklonale
Antikörper in die Klasse der Immunoglobulin-M-Antikörper
eingereiht.
Ein gemäß Versuch A-1 erhaltenes teilgereinigtes LK 2-Präpa
rat wird mit einem gemäß Beispiel A-2 hergestellten immobi
lisierten monoklonalen Antikörpergel der Affinitätschroma
tographie unterworfen; die LK 2-Fraktionen werden gesammelt,
dialysiert, eingeengt und lyophilisiert.
Es wird ein hochreines LK 2-Präparat mit einer spezifischen
Aktivität von etwa 10⁹ Einheiten/mg Protein erhalten.
Die physikochemischen Eigenschaften des LK 2 werden an
diesem Präparat untersucht:
Das Molekulargewicht von LK 2 wird durch Elektrophorese
mit SDS-Polyacrylamidgel gemäß K. Weber und M. Osborn
in "Journal of Biological Chemistry", Bd. 244, Seite
4406 (1969), bestimmt. Die Säule mit 10% Acrylamidgel
wird mit etwa 10 µg-Proben des Präparats in Gegenwart
von 0,1% SDS beladen, die Elektrophorese wird mit 8 mA
je Säule während 4 h durchgeführt. Nach der Extraktion
und der folgenden LK 2-Bestimmung der aktiven Fraktion
beträgt das Molekulargewicht von LK 2 20 000 ± 2000
Dalton.
Bei einer 2stünd. 25 W-Elektrofokussierung des Präparats
mit einem Gelprodukt für die Elektrofokussierung bei
pH 3,5 bis 9,5 ("Ampholine Pagplate")
erhält man einen isoelektrischen
Punkt pI = 6,2 ± 0,3.
Gemäß B.J. Davis in "Annals of New York Academy of Scien
ces", Bd. 121, Seite 404 (1964), werden etwa 10 µg-Proben
des Präparats auf Säulen mit 7,5% Acrylamidgel aufge
bracht, 2 h der Elektrophorese bei pH 8,3 und 3 mA je
Säule unterworfen, extrahiert und auf LK 2-Aktivität
untersucht. Man erhält eine elektrophoretische Beweglich
keit Rf von 0,29 ± 0,02.
Durch Analyse des UV-Spektrums des Präparats mit einem
UV-250-Spektrometer
wird ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge
von etwa 280 nm gefunden.
Das Präparat ist in Wasser, Salzlösung und Phosphatpuffer
unlöslich, in Ethylether, Ethylacetat und Chloroform
kaum löslich oder unlöslich.
Das Präparat ist proteinpositiv gemäß der Lowry- und
der Mikrobiuret-Methode, saccarid-positiv mit Phenol-
Schwefelsäure und Anthron-Schwefelsäure.
Es wurde eine zytotoxische Aktivität bei L 929-Zellen
und eine zytostatische Aktivität bei KB-Zellen, jedoch
keine wesentliche HuIFN-Aktivität festgestellt.
Präparatproben mit etwa 1×105 Einheiten/ml werden
bei pH 7,2 und verschiedenen Temperaturen 30 min
inkubiert; die zytotoxische Restaktivität wird be
stimmt; dabei wird festgestellt, daß LK 2 bis zu
60°C stabil ist.
0,1 ml Präparatproben (1×106 Einheiten/ml) werden
mit 1 ml Pufferlösung mit verschiedenen pH-Werten
versetzt, beispielsweise mit Mcllvaine-Puffer bei
pH 2 bis 7, Phosphatpuffer, pH 7,8, Glycin-NaOH-
Puffer, pH 8 bis 11, und 16 h bei 4°C inkubiert.
0,1 ml des inkubierten Gemisches werden dann mit
0,05 m Phosphatpuffer, pH 7,2, auf pH 7,2 einge
stellt, die Restaktivität wird bestimmt. Es wird
festgestellt, daß LK 2 im pH-Bereich von 4,0 bis
11,0 stabil ist.
Etwa 1×105 Einheiten/ml Präparat werden mit einer
Bacillusprotease ("Dispase")
zu einer Enzymaktivität von
100 Einheiten/ml versetzt, das Gemisch wird bei
pH 7,2 und 37°C 2 h inkubiert. Während der Inkuba
tion werden dem Gemisch kleine Proben entnommen,
die mit Kälberserumalbumin zu einer Konzentration
von 1% (Gew./Vol.) zur Unterbrechung der enzymati
schen Reaktion versetzt werden. Bei dieser Bestim
mung der LK 2-Aktivität wurde festgestellt, daß
LK 2 gegenüber der Bacillusprotease empfindlich
ist und seine Aktivität bei fortschreitender enzyma
tischer Reaktion verliert.
Das LK 2-Präparat wurde in wässeriger Lösung bei -10°C
und pH 7,2 einen Monat gelagert, aufgetaut und bestimmt.
Es konnte keine Aktivitätsabnahme festgestellt werden.
Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß LK 2 physiko
chemische Eigenschaften hat, die sich von denen bekannter
Lymphokine, wie LT, TNF oder IFN, unterscheiden. Auch der
erfindungsgemäße monoklonale Antikörper ist neu, da er
die zytotoxische Aktivität des neuen Lymphokins LK 2 immuno
logisch spezifisch neutralisiert.
Die zytostatische Wirkung von LK 2 auf verschiedene Human
zellen wird mit den gemäß Beispiel A-1 und A-3 erhaltenen
LK 2-Präparaten untersucht.
Die in Tabelle 1 angegebenen Humanzellen (10⁶ Zellen) werden
in 1 ml herkömmlichen Nährmedium, das Kälberfötusserum
enthält, suspendiert, 1 d kultiviert, mit 0,1 ml einer
Salzlösung, die entweder 50 Einheiten oder 500 Einheiten
eines gemäß Beispiel A-1 oder A-3 hergestellten LK 2-Präpa
rats enthält, versetzt und 2 d bei 37°C inkubiert. Am
Ende der Kultur werden die lebenden Zellen mit Neutralrot
(Farbreagens) gemäß der in "Applied Microbiology", Bd.
22, Nr. 4, Seiten 671 bis 677 (1971), beschriebenen Methode
gefärbt; das Farbreagens wird mit einer angesäuerten Ethanol
lösung eluiert. Die Anzahl der lebenden Zellen wird durch
Bestimmung der Eluatabsorption bei einer Wellenlänge von
540 nm gemessen.
Als Kontrolle wird 0,1 ml einer LK 2-freien Salzlösung
verwendet.
Die Wachstumshemmung (Prozent) wird gemäß folgender Glei
chung berechnet:
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
Die Ergebnisse bestätigen, daß LK 2 normale Zellen nicht
wesentlich beeinträchtigt, jedoch sehr stark das Wachstum
verschiedener bösartiger Tumorzellen hemmt. Aus Tabelle
1 ist auch ersichtlich, daß ein teilgereinigtes LK 2-Präpa
rat mit einem hochreinen Präparat gut vergleichbar ist.
Einer Gruppe von BALB/c-Mäusen werden Meth-A-Zellen aus
Mäusesarkom transplantiert. Vom 10. Tag nach der Transplanta
tion an wird den Mäusen intravenös eine Salzlösung, die
ein gemäß Beispiel A-3 hergestelltes LK 2-Präparat enthält,
in einer Dosis von 100 oder 1000 Einheiten/kg einmal täglich
während 15 d injiziert. Die Mäuse werden dann geschlachtet,
die in den Tieren gebildeten Tumormassen werden bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
Einer Gruppe vom BALB/c-Nacktmäusen werden subkutan in
den Rücken kleine Fragmente von Humanbrustkrebs-Gewebe
transplantiert.
Nachdem die Tumormassen auf etwa 200 mm3 in den Tierkörpern
gewachsen sind, wird den Tieren eine Salzlösung, die ein
gemäß Beispiel A-1 oder A-3 hergestelltes LK 2-Präparat
enthält, intravenös in einer Dosis von entweder 100 Einhei
ten/kg oder 1000 Einheiten/kg einmal täglich während 20 d
injiziert. Dann werden die Tiere geschlachtet, die entstan
denen Tumormassen werden bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.
Einer Gruppe von BALB/c-Nacktmäusen werden subkutan in
den Rücken kleine Humanbrustkrebs-Gewebefragmente gemäß
Beispiel B-3 transplantiert.
Nachdem die Tumormassen auf etwa 200 mm3 in den Tierkörpern
gewachsen sind, wird den Tieren eine Salzlösung, die ein
gemäß Beispiel A-3 hergestelltes LK 2-Präparat und/oder
ein alpha-HuIFN-Präparat enthält, intravenös einmal täglich
während 20 d injiziert. Dann werden die Tiere geschlachtet,
die entstandenen Tumormassen werden bestimmt.
Als Kontrolle wird eine LK 2- und alpha-HuIFN-freie
Salzlösung verwendet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben.
Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß die kombinierte Verwen
dung von LK 2- und alpha-HuIFN die tumorhemmende Wirkung
von alpha-HuIFN extrem steigert.
Ein akuter Toxizitätstest, in dem einer Gruppe von 20 d
alten Mäusen ein gemäß Beispiel A-3 hergestelltes LK 2-Prä
parat verabreicht wurde, bestätigt, daß die Toxizität des
Präparats nach intraperitonealer Injektion extrem niedrig
ist, d. h. LD50 = 199 Einheiten oder mehr.
Aus den oben angegebenen Versuchen ist ersichtlich, daß
LK 2 eine starke zytostatische Wirkung auf bösartige Tumoren
sowohl in vitro als auch in vivo hat. Außerdem ist die
Verabreichung von LK 2 sicher, da eine hohe Dosierung nor
male Zellen praktisch nicht beeinträchtigt und eine niedrige
Dosierung Tumorzellen deutlich hemmt.
Die wirksame LK 2-Dosis liegt im allgemeinen im Bereich
von 5 bis 500 000 000 Einheiten/d bei Erwachsenen: Insbe
sondere beträgt sie bei lokaler Verabreichung, beispiels
weise in Form einer Lokalinjektion oder eines Augenwassers,
5 bis 10 000 000 Einheiten/d, bei Verabreichung durch die
Haut oder die Schleimhäute, beispielsweise in Form einer
Salbe oder eines Zäpfchens, 10 bis 50 000 000 Einheiten/d,
bei systemischer Verabreichung, beispielsweise als intra
venöse oder intramuskuläre Injektion, 50 bis 100 000 000
Einheiten/d und bei oraler Verabreichung 500 bis 500 000 000
Einheiten/d; die Dosierung ist jedoch je nach Anweisungen
und dem Befinden des Patienten frei wählbar.
Obwohl LK 2 in herkömmlicher Weise durch Vermischen mit
herkömmlichen Trägern, Grundstoffen und/oder Hilfsmitteln
in ein Medikament verarbeitet werden kann, sollte der LK 2-
Gehalt wegen der Toxizität, der wirksamen Dosis und der
Sicherheit mindestens 5 Einheiten/g betragen.
Die Art und die Form der prophylaktischen und/oder thera
peutischen Mittel für LK 2-empfindliche Erkrankungen kann
frei gewählt werden: So sind beispielsweise für eine orale
Verabreichung Präparate für den Darm geeignet, wie Kapseln,
Tabletten oder Pulver, für die rektale Verabreichung Zäpf
chen; für die Injektion kann es beispielsweise eine lyophi
lisierte Injektion sein, die vor der Verwendung mit destil
liertem Wasser zu einer Injektionslösung gelöst wird; auch
in Form eines Collunariums, Augenwassers oder einer Salbe
ist das Präparat geeignet.
Bei der Behandlung von Patienten mit einem bösartigen Tumor
kann beispielsweise ein dem Patienten entnommenes Tumor
gewebefragment in vitro mit LK 2 behandelt werden, um die
Immunogenität des Gewebefragments zu erhöhen, und dem Patien
ten wieder verabreicht werden, um so eine wirkungsvollere
Behandlung des bösartigen Tumors zu erreichen.
Die kombinierte Verwendung von LK 2 mit tumorhemmenden
Mitteln, beispielsweise Lymphokine, wie HuIFN, TNF, LT
und T-Zellwachstumsfaktor (TCGF), tumorhemmenden Polysaccha
riden, wie 1,3-β-Glukan, Arabinomannan, Lipopolysaccharid,
OK-432 (Picibanil), PSK (Krestin) und Lentinan, metaboli
schen Antagonisten, wie Methotrexat und Fluoruracil, und
tumorhemmenden Antibiotika, wie Doxorubicin und Mitomycin
C, ist sehr günstig, da diese kombinierte Verwendung die
tumorhemmende Wirkung von LK 2 extrem erhöht.
Insbesondere wurde festgestellt, daß LK 2 die tumorhemmende
Wirkung von Chemotherapeutika erhöht.
Die steigernde Wirkung von LK 2 auf die Tumorhemmung wird
im folgenden erklärt.
Die Steigerung der tumorhemmenden Wirkung von Chemothera
peutika mit LK 2 wird mit bösartigen Tumorzeilen untersucht.
Bösartige Humantumorzellen (10⁶ Zellen) werden in 1 ml
herkömmliches Kulturnährmedium, das mit Kälberfötusserum
versetzt ist, eingeimpft und einen Tag kultiviert. Die
Kultur wird dann mit 0,1 ml einer Salzlösung, die 100 Ein
heiten eines gemäß Beispiel A-3 hergestellten LK 2-Präparats
und/oder ein Chemotherapeutikum enthält, versetzt und weite
re zwei Tage bei 37°C kultiviert.
Als Kontrolle wird eine LK 2- und chemotherapeutikumfreie
Salzlösung verwendet.
Nach beendeter Kultur wird die Anzahl der lebenden Zellen
gemäß Beispiel B-1 gezählt, die Wachstumshemmung (%) wird
bestimmt.
Die Konzentration der untersuchten Chemotherapeutika war
wie folgt Nimustin-Hydrochlorid (ACNU), 1,0×10-6 g/ml
Kultur, Fluoruracil (5-FU): 1,5×10-8 g/ml Kultur, Doxoru
bicin (ADM): 1,0×10-10 g/ml Kultur, Mitomycin C (MMC):
2,5×10-9 g/ml Kultur und Vinkristin-Sulfat (VCR): 1,5×10-10
g/ml Kultur.
Die Ergebnisse sind Tabelle 5 angegegeben.
Aus Tabelle 5 ist ersichtlich, daß LK 2 die tumorhemmende
Wirkung von Chemotherapeutika extrem erhöht.
Einer Gruppe von BALB/c Nacktmäusen werden subkutan in
den Rücken kleine Humanbrustkrebs-Gewebefragmente trans
plantiert.
Nach dem die Tumormassen auf etwa 200 mm3 in den Tierkörpern
gewachsen sind, wird eine Salzlösung, die ein gemäß Beispiel
A-3 hergestelltes LK 2-Präparat enthält, intravenös einmal
täglich während 20 Tagen injiziert. Die Tiere werden dann
geschlachtet, die entstandenen Tumormassen werden bestimmt.
Als Kontrolle wird eine LK 2- und chemotherapeutikumfreie
Salzlösung verwendet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben.
Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß LK 2 sogar in vivo
sehr stark die tumorhemmende Wirkung von Chemotherapeutika
erhöht.
Die Ergebnisse bestätigen auch, daß eine Kombination eines
Chemotherapeutikums mit LK 2 eine hohe tumorhemmende Wirkung
hat, sogar dann, wenn das Chemotherapeutikum allein eine
niedrige Konzentration und somit eine ungenügende tumor
hemmende Wirkung aufweist.
Die Verwendung von LK 2 als Steigerungsmittel für Chemo
therapeutika verringert sehr die eingesetzte Chemotherapeuti
kum-Konzentration, verhindert Nebeneffekte und verbreitert
sehr das Tumorspektrum der Chemotherapeutika.
Das erfindungsgemäße, LK 2 enthaltende Steigerungsmittel
weist eine steigernde Wirkung auf die Tumorhemmung auf,
wenn es mit Chemotherapeutika verwendet wird.
Das Steigerungsmittel wird mit einem Chemotherapeutikum
vorgemischt, das entstandene Gemisch wird gleichzeitig
auf einmal verabreicht. Man kann aber auch zuerst entweder
das Steigerungsmittel oder das Chemotherapeutikum verab
reichen und das andere Mittel auf gleiche oder andere Weise
nachreichen.
Die folgenden Beispiele D, E und F erläutern die LK 2-Her
stellung, LK 2 enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen
sowie den LK 2-spezifischen monoclonalen Antikörper.
Eine Humanlymphoblastoid Linie, BALL-1, wird in Eagle′s
Minimalnährmedium, pH 7,4, das 20% Kälberfötusserum ent
hält, eingeimpft und in vitro in Suspension bei 37°C auf
herkömmliche Weise kultiviert. Die vermehrten Humanzellen
werden mit serumfreien Eagle′s Minimalnährmedium, pH 7,4,
gewaschen und in einem frischen Präparat des gleichen Kultur
mediums wieder suspendiert, und zwar zu einer Zelldichte
von etwa 1×107 Zellen/ml. Die Zellsuspension wird mit
Sendai-Virus in einer Dosierung von etwa 1000 Hämagglu
tinationstiter/ml versetzt und einen Tag bei 38°C zur
Induktion der LK 2-Produktion inkubiert. Nach dem Zentri
fugieren der entstandenen Kultur bei etwa 1000 g und 4°C
wird der Überstand gegen eine Salzlösung, die 0,01 m Phos
phatpuffer, pH 7,2, 15 Stunden dialysiert und durch einen
Membranfilter filtriert. Das Filtrat wird auf eine Säule
mit Anti-LK 2-Antikörper gemäß Beispiel A-1 aufgegeben;
die nicht adsorbierte Fraktion wird gemäß Beispiel A-3
durch Affinitätschromatographie gereinigt, und zwar auf
einer Säule mit einem Anti-LK 2-Antikörper gebundenen Gel,
und zu einem Konzentrat mit einer spezifischen LK 2-Akti
vität von etwa 10⁹ Einheiten/mg Protein eingeengt.
Die Ausbeute beträgt etwa 1,5×106 Einheiten/l der induzier
ten Zellsuspension.
Neugeborenen Hamstern wird ein herkömmliches Antiserum
aus Kaninchen zur Schwächung ihrer Immunreaktion injiziert
und subkutan eine Humanlymphoblastoid-Linie, BALL-1, trans
plantiert; die Tiere werden drei Wochen in herkömmlicher
Weise gefüttert. Die in den Tieren subkutan gebildeten
Tumormassen von je etwa 15 g werden extrahiert, zerkleinert
und in Salzlösung aufgebrochen. Nach dem Waschen mit serum
freiem RPMI 1640-Medium, pH 7,2, werden die vermehrten
Zellen in einem frischen Präparat des gleichen Kulturme
diums zu einer Zelldichte von etwa 5×106 Zellen/ml wieder
suspendiert. Die Zellsuspension wird mit Sendai-Virus und
Endotoxin aus E. coli in einer Dosierung von etwa 1000
Hämagglutinationstiter/ml und etwa 10 µg/ml versetzt und
bei 37°C einen Tag zur Induktion der LK 2-Produktion in
kubiert. Nach dem Zentrifugieren der Kultur bei etwa 1000 g
und 4°C zur Entfernung des Sediments wird der Überstand
gegen eine Salzlösung, die 0,01 m Phosphatpuffer, pH 7,2
enthält, 21 Stunden dialysiert und durch einen Membranfilter
filtriert. Das Filtrat wird mit einer Antikörpersäule gemäß
Beispiel D-1 gereinigt; die Eluatlösung wird eingeengt und
zu einem pulverförmigen Produkt mit einer spezifischen LK
2-Aktivität von etwa 10⁹ Einheiten/mg Protein lyophilisiert.
Die Ausbeute beträgt etwa 3,2×107 Einheiten.
Erwachsenen Nacktmäusen wird intraperitoneal eine Human
lymphoblastoid-Linie, TALL-1, transplantiert; die Tiere
werden fünf Wochen in herkömmlicher Weise gefüttert, dann
wird intraperitoneal Newcastle-Virus (etwa 3000 Hämag
glutinationstiter je Nacktmaus), das vorher durch UV-Be
strahlung praktisch inaktiviert worden ist, injiziert;
die Tiere werden 24 h nach der Injektion geschlachtet,
die Ascitesflüssigkeit wird gesammelt, gereinigt, einge
engt und gemäß Beispiel D-2 zu einem pulverförmigen Produkt
mit LK 2-Aktivität lyophilisiert.
Die Ausbeute beträgt etwa 3,5×106 Einheiten je Nacktmaus.
Erwachsene Mäuse werden mit Röntgenstrahlen in einer Dosis
von etwa 400 rem bestrahlt, um ihre Immunreaktion zu schwä
chen, dann wird ihnen eine Humanlymphoblastoidzell-Linie,
Mono-1, subkutan transplantiert; die Tiere werden in her
kömmlicher Weise drei Wochen gefüttert. Die in den Tieren
subkutan gebildeten Tumormassen von je etwa 10 g werden
extrahiert und gemäß Beispiel D-2 aufgebrochen. Die so
erhaltenen Humanzellen werden gemäß Beispiel D-2 suspen
diert, die entstandene Zellsuspension wird mit Sendai-Virus
und Conkanavalin A in einer Dosis von etwa 500 Hämaggluti
nationstiter/ml und 0,8 µg/ml versetzt und bei 37°C einen
Tag zur Induktion der LK 2-Produktion inkubiert. Die Kultur
wird dann gereinigt, eingeengt und gemäß Beispiel D-2 zu
einem pulverförmigen Produkt mit LK 2-Aktivität lyophili
siert.
Die Ausbeute beträgt etwa 2,0×107 Einheiten je Maus.
Neugeborenen Hamstern wird eine Humanlymphoblastoid-Linie,
Namalwa (ATCC CRL 1432) gemäß Beispiel D-2 transplantiert;
die Tiere werden in herkömmlicher Weise vier Wochen ge
füttert. Die in den Tieren subkutan gebildeten Tumormassen
von je etwa 20 g werden extrahiert und zu einer Zellsus
pension mit einer Zelldichte von etwa 3×106 Zellen/ml aufge
brochen. Die Zellsuspension wird mit Sendai-Virus in einer
Dosis von etwa 1000 Hämagglutinationstiter je ml versetzt
und bei 36°C zwei Tage zur Induktion der LK 2-Produktion
inkubiert. Die Kultur wird gereinigt und gemäß Beispiel D-1
zu einem Konzentrat mit LK 2-Aktivität eingeengt.
Die Ausbeute beträgt etwa 2,2×107 Einheiten je Hamster.
Eine Humanlymphoblastoid-Linie, NALL-1, wird in Salzlösung
suspendiert und in eine etwa 10 ml fassende zylindrische
Kunststoff-Diffusionskammer eingebracht, die mit einem
Membranfilter mit einer Porengröße von etwa 0,5 µm ausge
rüstet ist. Die Kammer wird intraperitoneal in eine erwachse
ne Ratte eingebettet, das Tier wird vier Wochen in herkömm
licher Weise gefüttert. Nach dem Entfernen der Kammer be
trägt die Zelldichte in der Kammer etwa 5×108 Zellen/ml, was
etwa 102 mal oder mehr ist als bei der in vitro-Vermehrung
in einem CO2-Inkubator unter Verwendung eines Nährkultur
mediums erreichbar ist. Die Humanzellen werden in dem Kultur
medium gemäß Beispiel D-2 suspendiert, mit Newcastle-Virus
(etwa 500 Hämagglutinationstiter/ml), das vorher durch
UV-Bestrahlung inaktiviert worden ist, und Phytohämagglu
tinin (etwa 50 µg/ml) versetzt und bei 37°C einen Tag
zur Induktion der LK 2-Produktion inkubiert. Die Kultur
wird gereinigt, eingeengt und gemäß Beispiel D-2 zu einem
pulverförmigen Produkt mit LK 2-Aktivität lyophilisiert.
Die Ausbeute beträgt etwa 8×106 Einheiten je Ratte.
Eine Humanlymphoblastoid-Linie, CCRF-CEM (ATCC CCL 119)
wird in die Allantoishöhlen von befruchteten Eiern, die
bei 37°C 5 d inkubiert worden sind, eingeimpft; die Eier
werden bei dieser Temperatur eine weitere Woche inkubiert.
Die vermehrten Humanzellen werden aus den Eiern gewonnen
und gemäß Beispiel D-1 zu einer Zelldichte von 5×106 Zellen/
ml suspendiert. Die Zellsuspension wird mit Sendai-Virus
(etwa 500 Hämagglutinationstiter/ml) versetzt und bei 37°C
1 d zur Induktion der LK 2-Produktion inkubiert. Die erhal
tene Kultur wird gereinigt und gemäß Beispiel D-2 zu einem
pulverförmigen Produkt mit LK 2-Aktivität eingeengt.
Die Ausbeute beträgt etwa 7,0×105 Einheiten/10 befruchtete
Eier.
Ein gemäß Beispiel D-2 hergestelltes LK 2-Präparat mit
einer Aktivität von 500 000 Einheiten wird in 200 ml Salz
lösung gelöst und unter sterilen Bedingungen durch ein
Membranfilter filtriert. 2 ml-Proben des Filtrats werden
in sterilisierte Glasampullen verteilt, lyophilisiert und
als pulverförmige Injektion verschlossen.
Die Injektion wird günstigerweise allein oder als Steige
rungsmittel in Kombination mit einem Chemotherapeutikum,
wie Melphalan, Methotrexat oder Doxorubicin, zur Behandlung
von Brustkrebs, Lungenkarzinom, Leberkarzinom oder Leukämie
verwendet.
Gemäß Beispiel E-1 wird eine pulverförmige Injektion herge
stellt mit dem Unterschied, daß 3×108 Einheiten alpha-HuIFN
aus Humanlymphoblastoidzellen in 200 ml Salzlösung zusam
men mit 5×105 Einheiten LK 2 gelöst werden.
Die Injektion wird günstigerweise allein oder als Steige
rungsmittel in Kombination mit einem Chemotherapeutikum,
wie Tegafur, Mitomycin C oder Vincristin-Sulfat zur Behand
lung von Brustkrebs, Lungenkarzinom, Leberkarzinom oder
Leukämie verwendet; ihre therapeutische Wirksamkeit ist
größer als die der Injektion des Beispiels E-1.
Ein gemäß Beispiel D-3 hergestelltes LK 2-Präparat wird
mit einer Mindestmenge an flüssigem Paraffin bis zur Homoge
nität verknetet. Das Gemisch wird in herkömmlicher Weise
mit weißer Vaseline zu einer Salbe mit einer LK 2-Aktivität
von 20 000 Einheiten/g versetzt.
Die Salbe wird günstigerweise allein oder als Steigerungsmit
tel in Kombination mit einem Chemotherapeutikum, wie Cyclo
phosphamid, Fluoruracil oder Vincristinsulfat, zur Behand
lung von Hautkarzinom, Brustkrebs oder Lymphom verwendet.
Ein Gemisch von 800 ml destilliertem Wasser, 5 ml beta-
Phenylethylalkohol und 20 000 000 Einheiten eines gemäß
Beispiel D-4 hergestellten LK 2-Präparats werden mit Natrium
chlorid und einer zusätzlichen Menge an destilliertem Wasser
zu 1000 ml isotoner Lösung vermischt.
Die Lösung wird günstigerweise allein oder als Steigerungs
mittel in Kombination mit einem Chemotherapeutikum, wie
Cytarabin oder Vincristinsulfat, zur Behandlung von Retina
blastom verwendet.
Überzogene enterale Tabletten werden in herkömmlicher Weise
hergestellt durch Tablettieren eines Gemisches aus Stärke,
Maltose und eines gemäß Beispiel D-7 hergestellten LK 2-
Präparats zu einem LK 2-Gehalt von 200 000 Einheiten/Tablet
te (100 mg) und anschließendes Überziehen der Tabletten
mit Methylcellulose-phthalatester.
Die Tabletten werden günstigerweise allein oder als Steige
rungsmittel in Kombination mit einem Chemotherapeutikum,
wie Doxorubicin, Fluoruracil oder Mitomycin C, zur Behand
lung von Kolonkarzinom oder Leberkarzinom verwendet.
Mäuse werden gemäß Beispiel A-2 immunisiert mit dem Unter
schied, daß ein hochreines LK 2-Präparat, das gemäß Beispiel
A-3 erhalten wurde, als Antigen verwendet wird. Die Milz
zellen der Tiere werden zusammen mit einer Mausmyelomalinie
(P3-NS-1/1-Ag4-1 von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.,
Osaka, Japan) in einer Salzlösung supendiert, die 140 mM/l
NaCl, 54 mM/l KCl, 1 mM/l NaH2PO4 und 2 mM/l CaCl2 enthält.
Die Suspension hat eine Zelldichte von 104 Zellen/ml und
wird mit einer frischen Salzlösung der gleichen Zusammen
setzung, die jedoch vorher durch UV-Bestrahlung inaktivier
tes Sendai-Virus enthält, unter Eiskühlung versetzt; das
Gemisch wird 5 min stehengelassen, dann mit etwa der 20fachen
Menge 37°C warmem RPMI 1640-Medium verdünnt. Die
Hybridomazellen, die Anti-LK 2-Antikörper produzieren kön
nen, werden gemäß Beispiel A-2 geklont. Die geklonte Hybri
domazellen werden intraperitoneal in 7 d alte Hamster (etwa
10⁷ Zellen/Hamster), deren Immunreaktion in herkömmlicher
Weise geschwächt worden ist, transplantiert; der monoklonale
Antikörper wird aus den Tierkörpern gemäß Beispiel A-2
gewonnen.
Wie der monoklonale Antikörper des Beispiels A-2 neutrali
siert dieses Produkt auch immunologisch spezifisch die
zytotoxische Aktivität von LK 2.
Die Stabilität des monoklonalen Antikörpers in wässeriger
Lösung wird durch Bestimmung der Restneutralisationsaktivi
tät nach Inkubieren unter bestimmten Bedingungen gemessen:
Nach 30min. Inkubation bei pH 7,2 und verschiedenen Tempera
turen sind 80% und mehr der Aktivität bei 60°C noch erhal
ten, wogegen 90% oder mehr bei 70°C verlorengehen. Nach
16stünd. Inkubation bei 4°C und verschiedenen pH-Werten
ist die Aktivität in einem pH-Bereich von 2,0 bis 11,0
stabil.
Bei der Untersuchung verschiedener Eigenschaften des mono
klonalen Antikörpers wurde festgestellt, daß der monoklonale
Antikörper gegenüber 2-Mercaptoethanol beständig ist und
eine spezifische Antigen-Antikörperreaktion mit Antimaus-
Immunoglobulin-G-Antikörper aufweist. D. h., der monoklonale
Antikörper gehört in die Klasse der Immunoglobulin-G-Antikör
per.
Ein monoklonaler Anti-LK 2-Antikörper wird gemäß Beispiel
F-1 hergestellt mit dem Unterschied, daß als Mausmyeloma
linie SP2/0-Ag14
anstelle von P3-NS-1/1-Ag4-1 verwendet wird.
Die immunologisch spezifische Neutralisation der zytotoxi
schen Aktivität von LK 2 durch den monoklonalen Antikörper
entspricht der des Beispiels F-1. D. h., der monoklonale
Antikörper gehört ebenfalls in die Klasse der Immunoglobu
lin-G-Antikörper.
Claims (30)
1. Lymphokin (LK 2) mit den folgenden physikochemischen
Eigenschaften:
- 1) Molekulargewicht:
20 000 ± 2000 Dalton - 2) Isoelektrischer Punkt:
pI = 6,2 ± 0,3 - 3) Elektrophoretische Beweglichkeit:
auf Scheiben-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE): Rf = 0,29 ± 0,02 - 4) UV-Absorptionsspektrum:
Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm - 5) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
unlöslich in Wasser, Salzlösung und Phosphatpuffer, kaum löslich oder unlöslich in Ethylether, Ethylacetat oder Chloroform - 6) Farbreaktion:
proteinpositiv gemäß Lowry- oder nach der Mikrobiuret- Methode,
saccharidpositiv mit Phenol-Schwefelsäure oder Anthron- Schwefelsäure - 7) Biologische Aktivität:
zytotoxisch bei L 929-Zellen,
zytostatisch bei KB-Zellen,
praktisch frei von Interferonaktivität - 8) Stabilität in wässeriger Lösung:
bis zu 60°C stabil bei 30min. Inkubation bei pH 7,2, stabil im pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 bei 16stünd. Inkubation bei 4°C - 9) Stabilität bei Kryokonservierung:
stabil bei -10°C über einen Monat und länger und - 10) spezifische Aktivität:
106 Einheiten/mg Protein oder darüber.
2. Verfahren zur Herstellung von Lymphokin LK 2 gemäß Anspruch 1,
gekennzeichnet durch
- - Vermehrung von LK 2-produzierenden Humanzellen,
- - Inberührungbringen der vermehrten Humanzellen mit einem LK 2-Induktor unter solchen Bedingungen, daß sich eine wesentliche Menge an LK 2 ansammelt und
- - Gewinnung des angesammelten LK 2.
3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeich
net durch die Vermehrung der LK 2-produzierenden Human
zellen in vitro.
4. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeich
net durch die Vermehrung der LK 2-produzierenden Human
zellen in vivo.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die LK 2-produzierenden
Humanzellen erhalten werden durch
- - Transplantatieren der Humanzellen in einen nichthumanen Warmblütler,
- - Füttern der Tiere, wobei die Humanzellen die Nährflüssig keit des Tierkörpers zu ihrer Vermehrung nutzen und
- - Extrahieren und Aufbrechen des im Tierkörper gebildeten Tumors.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4 , dadurch
gekennzeichnet, daß die LK 2-produzierenden
Humanzellen erhalten werden durch
- - Suspendieren der Humanzellen in einer Diffusionskammer, in der die Nährflüssigkeit des nichthumanen Warmblütlers den Humanzellen zugeführt wird,
- - Einbetten oder Aufbringen der Kammer in oder auf einen nichthumanen Warmblütler, so daß die Nährflüssigkeit des Tieres den Humanzellen in der Kammer zugeführt wird,
- - Füttern der Tiere, wobei die Humanzellen die Nährflüssig keit des Tierkörpers zu ihrer Vermehrung nutzen, und
- - Gewinnen der vermehrten Humanzellen aus der Kammer.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß der nichthumane Warmblüt
ler Geflügel oder ein Säugetier ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß in dem nichthumanen Warm
blütler die Immunreaktion geschwächt oder unterdrückt worden
ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß die Diffusionskammer mit
mindestens einem Membranfilter, Hohlfaser- oder Ultrafilter
mit einer nominellen Porengröße von 10-7 bis 10-5 m ausge
rüstet ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, daß die LK 2-produzierenden
Humanzellen Humanleukozyten oder Humanlymphozyten sind.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, daß die LK 2-produzierenden
Humanzellen Lymphoblastoidzellen sind.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, daß die LK 2-produzierenden
Humanzellen aus der aus Namalwa (ATCC CRL 1432), BALL-1,
TALL-1, NALL-1, M-7002, B-7101, JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, EBV-HO,
MOLT-3 (ATCC CRL 1552), CCRF-SB (ATCC CCL 120), CCRF-CEM
(ATCC CCL 119), BALM-2 und DND-41 bestehenden Gruppe
ausgewählt werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch
gekennzeichnet, daß die Humanzellen in vitro
mit dem LK 2-Induktor in Berührung gebracht werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch
gekennzeichnet, daß die Humanzellen in vivo
mit dem LK 2-Induktor in Berührung gebracht werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch
gekennzeichnet, daß der LK 2-Induktor ein
alpha-Interferon- und/oder gamma-Interferon-Induktor ist.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an
einer wirkungsvollen Menge an Lymphokin LK 2 gemäß Anspruch 1, in Kombination
mit pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen und/oder
Verdünnungsmitteln.
17. Tumorhemmende Zusammensetzung nach Anspruch 16.
18. Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 17 mit einem
LK 2-Gehalt von mindestens 5 Einheiten/g.
19. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18
in Form einer Injektion, eines Augenwassers, einer Salbe,
eines Zäpfchens oder Collunarium.
20. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 bis 19
mit einem zusätzlichen Gehalt an einem Chemotherapeutikum.
21. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, daß das Chemotherapeu
tikum aus der aus Alkylierungsmittel, metabolischem Antago
nisten, tumorhemmendem Antibiotikum, Alkaloid und deren
Gemischen bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
22. Für LK 2 gemäß Anspruch 1 spezifischer monoklonaler Antikörper.
23. Verfahren zur Herstellung des für LK 2 gemäß Anspruch 1 spezifischen
monoklonalen Antikörpers, gekennzeichnet
durch
- - Immunisierung eines nichthumanen Warmblütlers mit LK 2 als Antigen,
- - Gewinnung der Antikörper produzierenden Zellen aus dem Tierkörper,
- - Fusionierung der Antikörper produzierenden Zellen mit Myelomazellen,
- - Selektionierung eines Anti-LK 2-Antikörper produzierenden Klons aus den entstandenen Hybridomazellen,
- - Vermehrung des Klons und
- - Kultivierung der vermehrten Zellen zur Herstellung des für LK 2 spezifischen monoklonalen Antikörpers.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Antikörper produzierenden Zellen
Milzzellen sind.
25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch ge
kennzeichnet, daß der nichthumane Warmblütler
eine Maus ist.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch
gekennzeichnet, daß gemäß einem der Ansprüche
2 bis 15 hergestelltes LK 2 verwendet wird.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch
gekennzeichnet, daß die Fusionierung durchge
führt wird durch
- - Suspendieren der Antikörper produzierenden Zellen mit den Myelomazellen in einer Salzlösung, die eine wirkungs volle Menge eines Zellfusionierungsmittels enthält, und
- - Stehenlassen der entstandenen Zellsuspension.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27, dadurch
gekennzeichnet, daß als Zellfusionsmittel
Sendai-Virus oder Polyethylenglykol verwendet wird.
29. Verfahren zur Reinigung von LK 2 gemäß Anspruch 1, gekenn
zeichnet durch
- - Affinitätschromatographie einer LK 2 und Verunreinigungen enthaltenden Lösung an einer Säule mit immobilisierten Anti-LK 2-Antikörpern und
- - Gewinnung der entstandenen LK 2-aktiven Fraktion(en).
30. Verfahren nach Anspruch 29, gekennzeich
net durch die Verwendung des gemäß einem der Ansprüche
23 bis 28 hergestellten Anti-LK 2-Antikörpers.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59236356A JPH0811759B2 (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | 新リンホカイン▲ii▼とその製法および用途 |
JP59236357A JPS61115099A (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | モノクロ−ナル抗体とその製法 |
JP60028396A JPS61115026A (ja) | 1985-02-18 | 1985-02-18 | 新リンホカイン2の製造方法 |
JP60166754A JPS61115028A (ja) | 1985-07-30 | 1985-07-30 | 抗腫瘍効果増強剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3539775A1 DE3539775A1 (de) | 1986-11-06 |
DE3539775C2 true DE3539775C2 (de) | 1994-05-26 |
Family
ID=27458873
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE3539775A Expired - Fee Related DE3539775C2 (de) | 1984-11-09 | 1985-11-09 | Neues Lymphokin, gegen dieses Lymphokin spezifische Antikörper, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US5019385A (de) |
KR (1) | KR930004596B1 (de) |
AT (1) | AT395017B (de) |
AU (1) | AU603053B2 (de) |
CH (1) | CH664574A5 (de) |
DE (1) | DE3539775C2 (de) |
ES (2) | ES8703161A1 (de) |
FR (1) | FR2572936B1 (de) |
GB (1) | GB2168355B (de) |
IT (1) | IT1184668B (de) |
SE (1) | SE468853B (de) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4758549A (en) * | 1983-12-13 | 1988-07-19 | Kabushiki Kaisha Mayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Lymphokine, monoclonal antibody specific to the lymphokine and their production and uses |
RO113611B1 (ro) * | 1990-08-03 | 1998-09-30 | Asta Pharma Ag | Preparate solide de ifosfamida, administrate oral si procedeu de obtinere |
TWI373343B (en) * | 2000-02-10 | 2012-10-01 | Abbott Gmbh & Co Kg | Antibodies that bind human interleukin-18 and methods of making and using |
US20030044398A1 (en) * | 2001-03-20 | 2003-03-06 | Robl James M. | Methods for producing antibodies in mammals |
GB0208041D0 (en) * | 2002-04-08 | 2002-05-22 | Lonza Biologics Plc | Method of culturing animal cells |
US7968684B2 (en) * | 2003-11-12 | 2011-06-28 | Abbott Laboratories | IL-18 binding proteins |
US9107879B1 (en) * | 2010-04-01 | 2015-08-18 | Vanderbilt University | Methods of increasing the cytotoxicity of chemotherapeutic agents with multisubstrate inhibitors of histone, protein-lys, polyamine acetylation, and polyamine metabolism |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1164964A (en) * | 1967-04-20 | 1969-09-24 | Ceskoslovenska Akademie Ved | A Method of Cultivation of Animal Cells, and Apparatus for Carrying Out the Said Method. |
GB2016015B (en) * | 1978-01-22 | 1982-05-06 | Hayashibara Co | Method of preparing interferon and preparations containing interferon |
JPS5598118A (en) * | 1979-01-18 | 1980-07-25 | Hayashibara Takeshi | Preparation of type-2 interferon and drug containing the same |
US4621053A (en) * | 1980-07-30 | 1986-11-04 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Process for the production of human peptide hormones |
JPS5823847B2 (ja) * | 1981-02-06 | 1983-05-18 | 株式会社 林原生物化学研究所 | 抗ヒト蛋白質抗体の製造方法 |
US4473493A (en) * | 1981-04-29 | 1984-09-25 | Immunex Corporation | Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity |
US4481137A (en) * | 1982-02-26 | 1984-11-06 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Glycoproteins and processes for their production |
DE3378128D1 (en) * | 1982-04-20 | 1988-11-03 | Sloan Kettering Inst Cancer | Purification of interleukin 2 |
ZA834976B (en) * | 1982-07-30 | 1984-08-29 | Genentech Inc | Human lymphotoxin |
JPS5939832A (ja) * | 1982-08-28 | 1984-03-05 | Ajinomoto Co Inc | モノクロ−ナル抗体ならびにその製法、使用法 |
JPS59116231A (ja) * | 1982-12-13 | 1984-07-05 | スロ−ン−ケツタリング・インステイテユ−ト・フオ−・キヤンサ−・リサ−チ | 抗−インタ−ロイキン−2単クロ−ン抗体 |
DE3329449A1 (de) * | 1983-08-16 | 1985-03-07 | Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt | Monoklonaler antikoerper, der eine struktur erkennt, die dem human-interleukin-2 (tcgf) und der leichten kette (lambda) von humanimmunglobulin gemeinsam ist, und hybridoma-zell-linien, die diese monoklonalen antikoerper produzieren |
FR2550802B1 (fr) * | 1983-08-17 | 1986-04-11 | Inst Nat Sante Rech Med | Procede de production d'interleukine 1 humaine et medicaments correspondants |
US4758549A (en) * | 1983-12-13 | 1988-07-19 | Kabushiki Kaisha Mayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Lymphokine, monoclonal antibody specific to the lymphokine and their production and uses |
IL73883A (en) * | 1984-12-20 | 1990-12-23 | Yeda Res & Dev | Monoclonal antibodies against tnf-alpha,hybridomas producing them and method for the purification of tnf-alpha |
DE3686794T2 (de) * | 1985-02-05 | 1993-03-04 | Cetus Oncology Corp | Reinigung des natuerlichen kolonie-stimulierenden faktors-1. |
-
1985
- 1985-10-28 US US06/792,158 patent/US5019385A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-05 KR KR1019850008229A patent/KR930004596B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1985-11-07 GB GB8527466A patent/GB2168355B/en not_active Expired
- 1985-11-08 AU AU49708/85A patent/AU603053B2/en not_active Ceased
- 1985-11-08 CH CH4800/85A patent/CH664574A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-11-08 IT IT48762/85A patent/IT1184668B/it active
- 1985-11-08 ES ES548727A patent/ES8703161A1/es not_active Expired
- 1985-11-08 SE SE8505286A patent/SE468853B/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-11-08 FR FR858516536A patent/FR2572936B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-09 DE DE3539775A patent/DE3539775C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-11-11 AT AT0327685A patent/AT395017B/de not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-06-25 ES ES556785A patent/ES8801582A1/es not_active Expired
-
1988
- 1988-07-21 US US07/223,719 patent/US5030564A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-21 US US07/223,718 patent/US5002878A/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-07-21 US US07/223,717 patent/US5003048A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CH664574A5 (fr) | 1988-03-15 |
SE8505286L (sv) | 1986-05-10 |
DE3539775A1 (de) | 1986-11-06 |
ES8801582A1 (es) | 1988-02-16 |
ES8703161A1 (es) | 1987-02-01 |
KR860006268A (ko) | 1986-09-09 |
US5019385A (en) | 1991-05-28 |
SE468853B (sv) | 1993-03-29 |
ES548727A0 (es) | 1987-02-01 |
AU4970885A (en) | 1986-05-15 |
US5030564A (en) | 1991-07-09 |
IT8548762A0 (it) | 1985-11-08 |
ATA327685A (de) | 1992-01-15 |
SE8505286D0 (sv) | 1985-11-08 |
FR2572936A1 (fr) | 1986-05-16 |
IT1184668B (it) | 1987-10-28 |
ES556785A0 (es) | 1988-02-16 |
GB2168355A (en) | 1986-06-18 |
FR2572936B1 (fr) | 1990-07-20 |
US5003048A (en) | 1991-03-26 |
AU603053B2 (en) | 1990-11-08 |
AT395017B (de) | 1992-08-25 |
KR930004596B1 (ko) | 1993-06-01 |
GB8527466D0 (en) | 1985-12-11 |
US5002878A (en) | 1991-03-26 |
GB2168355B (en) | 1989-04-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3227262C2 (de) | ||
DE3001585A1 (de) | Verfahren zur herstellung von interferon typ ii und es enthaltende zubereitungen | |
DE2606118C2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Gamaglobulins und intravenös verabreichbares Arzneimittel | |
DE2902136A1 (de) | Interferon und es enthaltende zubereitungen | |
DE60127237T2 (de) | Therapeutischer monoklonaler rekombinanter anti-ige antikörper gegen hunde-allergie | |
DE3306297A1 (de) | Neue glykoproteine, verfahren zu deren herstellung und therapeutische mittel, die solche glykoproteine enthalten, gegen tumore | |
DE4006269A1 (de) | Antikoerper gegen den tumor-nekrosefaktor-rezeptor | |
DE3539775C2 (de) | Neues Lymphokin, gegen dieses Lymphokin spezifische Antikörper, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung | |
KR930000188B1 (ko) | 신규 림포카인(lymphokine), 이 림포카인에 특이적인 모노클로날 항체 및 이들의 제조방법 | |
DE19748287A1 (de) | Verfahren zur indirekten Bestimmung der Typ I Interferon-Produktion in vivo mittels Antikörper gegen humane Mx-Proteine sowie Antikörper hierzu | |
AT395591B (de) | Humaner monoklonaler antikoerper, verfahren zu dessen herstellung, arzneimittel und hybridzelle | |
EP0216605B1 (de) | Lymphokin, dessen Herstellung und Verwendungen | |
DE69434256T2 (de) | Immunglobulin-Infusion bei der Xenotransplantation | |
DE3249946C2 (de) | hTNF-haltiges therapeutisches Mittel gegen maligne Tumoren und dessen Verwendung | |
DE69824670T2 (de) | Verwendung von Tumor-Cytotoxic-Faktor-II (TCF-II) zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung und/oder Behandlung von strahlungsinduzierten Krankheiten | |
DE4312916C2 (de) | Arzneimittel zur Behandlung von Immunreaktionen | |
DE3236298C2 (de) | ||
DE19728323A1 (de) | Verwendung von BK-RiV-Präparaten und/oder ihren Bestandteilen in der Medizin und Veterinärmedizin zur Diagnose, Therapie und Prophylaxe, zur Prüfung und Normalisierung des "Allgemein zellulärsekretorischen Abwehrsystems" (AZSA) und der mit diesem kausal verknüpften Körperzustände | |
DE4345200A1 (de) | Arzneimittel zur Behandlung von Immunreaktionen | |
JPS61115028A (ja) | 抗腫瘍効果増強剤 | |
JPH0811759B2 (ja) | 新リンホカイン▲ii▼とその製法および用途 | |
JPH0523755B2 (de) | ||
JPS60126228A (ja) | 新リンホカイン1とその製造方法および用途 | |
JPH0532033B2 (de) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |