DE3539775C2

DE3539775C2 - Neues Lymphokin, gegen dieses Lymphokin spezifische Antikörper, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE3539775C2
Application number: DE3539775A
Authority: DE
Inventors: Masakazu Mitsuhashi; Masashi Kurimoto
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1984-11-09
Filing date: 1985-11-09
Publication date: 1994-05-26
Anticipated expiration: 2005-11-10
Also published as: SE468853B; AU603053B2; FR2572936B1; FR2572936A1; IT1184668B; GB2168355B; KR930004596B1; AU4970885A; SE8505286L; ES548727A0; GB8527466D0; ATA327685A; DE3539775A1; IT8548762A0; US5002878A; US5030564A; KR860006268A; ES556785A0; AT395017B; ES8703161A1

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Lymphokin (Anspruch 1), ein Verfahren zu seiner Herstellung (Ansprüche 2 bis 15, 23, 30) und eine pharmazeutische Zusammensetzung (Ansprüche 16-21) sowie einen gegenüber diesem Lymphokin spezifischen monoklonalen Antikörper (Anspruch 22) und seine Herstellung (Ansprüche 23 bis 28).

Lymphotoxin (LT) und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) sind be kannte Lymphokine, die Tumorzellen schädigen. So wurde Lymphotoxin beispielsweise beschrieben von Aoki, Ryuichi et al. in "Lymphokine", Shin-Menekigaku Sosho, Bd. 6, Seiten 87 bis 105, Igaku-Shoin, Tokio, 1979; B.R. Bloom & P.R. Glade in "In Vitro Method in Cell-Mediated Immunity", Aca demic Press, Inc. 1971; und in "Cellular Immunology", Bd. 38, Seiten 388 bis 402 (1978); der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) wurde beispielsweise beschrieben in E.A. Carswell et al. "Proceedincis of the National Academy of Sciences of the U.S.A." Bd. 72, Nr. 9, Seiten 3666 bis 3670 (1975) und in E. Pick "Lymphokines", Bd. 2, Seiten 235 bis 272 "Tumor Necrosis Factor", Academic Press, Inc. (1981).

Kürzlich wurde in der JP-A-146 293/83 ein Anti-Tumor-Lympho kin-Glycoprotein beschrieben.

In "Scientific American", Bd. 243, Nr. 4, Seiten 56 bis 64 (1980) beschreibt C. Milstein monoklonale Antikörper.

Als Chemotherapeutika werden im allgemeinen mindestens ein Alkylierungsmittel, metabolische Antagonisten, Anti tumorantibiotika und Pflanzenalkaloide verwendet. Chemothera peutika haben jedoch die Nachteile, daß bei ihrer Verwendung bei den Patienten Nebenwirkungen auftreten können, daß ihr Tumorspektrum relativ eng und ungenügend ist und daß sie zu medikament-resistenten Tumoren führen können.

Als Ergebnis jahrelanger Untersuchungen über Lymphokine wurde nun ein neues Lymphokin entdeckt, dessen physikochemi sche Eigenschaften und zytotoxische Aktivität auf bösartige Tumorzellen völlig von denen bekannter Lymphokine verschie den sind. Dieses neue Lymphokin kann nun hergestellt und verwendet werden, außerdem wurde ein gegenüber diesem Lymphokin spezifischer monoklonaler Antikörper gefunden und auch hergestellt.

Die Erfindung betrifft somit ein neues Lymphokin mit den folgenden physikochemischen Eigenschaften:

1) Molekulargewicht:
20 000 ± 2000 Dalton
2) Isoelektrischer Punkt:
pI = 6,2 ± 0,3
3) Elektrophoretische Beweglichkeit:
auf Scheiben-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE): Rf = 0,29 ± 0,02
4) UV-Absorptionsspektrum:
Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm
5) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
unlöslich in Wasser, Salzlösung und Phosphatpuffer, kaum löslich oder unlöslich in Ethylether, Ethylacetat oder Chloroform
6) Farbreaktion:
proteinpositiv gemäß Lowry- oder nach der Mikrobiuret- Methode,
saccharidpositiv mit Phenol-Schwefelsäure oder Anthron- Schwefelsäure
7) Biologische Eigenschaften:
gegen L 929-Zellen zytotoxisch,
gegen KB-Zellen zytostatisch,
praktisch frei von Interferonaktivität
8) Stabilität in wässerigen Lösungen:
bis zu 60°C stabil bei 30 min. Inkubation bei pH 7,2
stabil im pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 bei 16 stünd. Inkubation bei 4°C
9) Stabilität bei Kryokonservierung bzw. Kältelagerung:
bei -10°C über einen Monat und länger stabil und
10) spezifische Aktivität:
10⁶ Einheiten/mg Protein oder darüber.

Die Erfindung betrifft auch die Herstellung und die Verwen dung des erfindungsgemäßen Lymphokins sowie den gegenüber diesem Lymphokin spezifischen monoklonalen Antikörper und seine Herstellung.

Im folgenden wird das neue erfindungsgemäße Lymphokin ein fach mit "LK 2" abgekürzt.

LK 2 wird hergestellt durch Inberührungbringen von LK 2 produzierenden Humanzellen, beispielsweise Humanleukozyten, Humanlymphozyten und daraus etablierten Zellinien, mit einem LK 2-Induktor. Humanleukozyten und -lymphozyten können aus frischem Humanblut isoliert werden; die etablierten Humanzellinien können in herkömmlicher Weise in vitro ver mehrt werden.

Für eine wirkungsvollere Ausnutzung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es zweckmäßig, eine in vivo Zellvermehrung anzuwenden, in der die Humanzellinie direkt in einen nicht humanen Warmblütler transplantiert wird oder in herkömmli che Diffusionskammern inokuliert wird, in denen die Nährflüs sigkeit des nichthumanen Warmblütlers der Zellinie zuge führt wird.

Im Gegensatz zur in vitro Zellvermehrung benötigt das in vivo Verfahren kein oder viel weniger teures Serum enthalten des Nährmedium und weniger Pflege während der Zellvermeh rung; die vermehrten Humanzellen liefern eine viel höhere LK 2-Aktivität.

Außerdem kann bei dem in vivo Verfahren die Humanzellinie leicht vermehrt werden durch Verwendung der von dem nicht humanen Warmblütler zur Verfügung gestellten Nährkörper flüssigkeit, wenn man die Humanzellinie einem nichthumanen Warmblütler transplantiert oder die Zellinie in eine her kömmliche Diffusionskammer einbringt, die die Körperflüssig keit aufnimmt und diese Kammer in das Tier einbettet oder auf das Tier aufbringt. In beiden Fällen werden die Tiere in herkömmlicher Weise gefüttert.

Das in vivo Verfahren ist außerdem dadurch gekennzeichnet, daß eine stabilere und schnellere Zellvermehrung, eine höhere Zellproduktion und eine viel höhere LK 2-Produktion je Zelle als mit dem in vitro Verfahren erreicht werden kann.

Für die Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren sind Humanzellinien geeignet, die LK 2 produzieren, in einen nichthumanen Warmblütler transplantiert und in diesem Tier leicht vermehrt werden können, wie beispielsweise die in "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", Bd. 20, Nr. 6, Seiten 616 bis 643 (1975) beschriebenen Humanzellinien. Besonders geeignet sind Human-Lymphoblastoidlinien, wie Namalwa (ATCC CRL 1432), beschrieben in "Journal of Clinical Microbio logy", Bd. 1, Seiten 116 bis 117 (1975); BALL-1, TALL-1 und NALL-1, beschrieben in I. Miyoshi, "Nature", Bd. 267, Seiten 843 bis 844 (1977); M-7002 und B-7101, beschrieben in "The Journal of Immunology", Bd. 113, Seiten 1334 bis 1345 (1974); JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, MOLT-3 (ATCC CRL 1552) und EBV-HO, beschrieben in "The Tissue Culture", Bd. 6, Nr. 13, Seiten 527 bis 546 (1980); CCRF-SB (ATCC CCL 120); CCRF-CEM (ATCC CCL 119); BALM 2; DND-41; und andere etablier te Zellinien, die durch Transformieren normaler Humanmono zyten oder -granulozyten mit karzinogenen Viren, Mitteln oder Bestrahlung erhalten worden sind.

Die Vermehrungsgeschwindigkeit und/oder LK 2-Produktivität je Zelle dieser Zellinien kann verbessert werden durch Zellfusion mit Polyethylenglykol oder Sendai-Virus oder durch Genrekombination mit beispielsweise Nuklease, Ligase oder DNA-Polymerase. Die hier angegebenen verwendbaren Humanzellinien sollen jedoch den Umfang der Erfindung nicht beeinträchtigen. Eine oder mehrere dieser Zellinien können kombiniert in den Stufen bis zur LK 2-Induktion verwendet werden. Gegebenenfalls können Humanleukozyten oder Lympho zyten, die aus frischem Humanblut hergestellt werden können, in Kombination mit jeder dieser Humanzelllinien verwendet werden.

Als nichthumaner Warmblütler können im erfindungsgemäßen Verfahren alle Tiere verwendet werden, in denen sich Human zellen vermehren können, beispielsweise Geflügel, wie Hühner oder Tauben, oder Säugetiere, wie Hunde, Katzen, Affen, Kaninchen, Ziegen, Schweine, Pferde, Rinder, Meerschwein chen, Ratten, Nacktratten, Hamster, Mäuse oder Nacktmäuse.

Da die Transplantation von Humanzellen in Tiere unerwünschte Immunoreaktionen hervorruft, werden nichthumane Warmblütler im möglichst jüngsten Stadium verwendet, z. B. als Ei, Embryo oder Fötus oder als Neugeborene oder jüngste Tiere, um diese Immunreaktion so gering wie möglich zu halten.

Vor der Transplantation können die Tiere mit Röntgen- oder Gamma-Strahlen in einer Dosis von etwa 200 bis 600 rem bestrahlt werden, oder es wird ihnen ein Antiserum oder ein die Immunreaktion unterdrückendes Mittel injiziert, um die Immunreaktion auf dem geringstmöglichen Wert zu halten.

Bei Verwendung eines Tieres ohne Immunreaktion, wie einer Nacktmaus oder Nacktratte als Wirt, können die oben beschrie benen Humanzellen ohne diese Vorbehandlung in die Tiere transplantiert und leichter vermehrt werden, ohne Angst vor auftretenden unerwünschten Immunreaktionen, da diese Tiere sogar als Erwachsene weniger Immunreaktionen zeigen.

Die Zellvermehrung und/oder die Erhöhung der LK 2-Produktion kann stabilisiert werden durch nacheinander folgende Trans plantation in den gleichen oder in verschiedene nichtmensch liche Warmblütler. Das kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß eine Zellinie zuerst einem Hamster transplan tiert wird und die Humanzellinie in dem Hamster vermehrt wird, dann die vermehrten Humanzellen in eine Nacktmaus transplantiert werden. In diesem Fall können die aufeinander folgenden Transplantationen mit einem nichthumanen Warm blütler der gleichen Klasse oder Ordnung wie auch der glei chen Art oder Gattung durchgeführt werden.

Die Humanzellen können in jede Stelle des Tieres transplan tiert werden, vorausgesetzt, die Humanzellen vermehren sich dort: Beispielsweise in die Allantoishöhle oder intra venös, intraperitoneal oder subkutan.

Die Humanzellen können aber auch vermehrt werden durch Einbringen in eine herkömmliche Diffusionskammer verschiede ner Form oder Größe, die mit geeigneten Vorrichtungen ausge rüstet ist, um eine Verunreinigung der Kammer mit Tierzellen zu vermeiden, jedoch die Humanzellen mit der Nährkörper flüssigkeit des Tieres versorgt, z. B. mit einem Membran filter, einem Ultrafilter oder Hohlfaser mit einer Poren größe von etwa 10^-7 bis 10^-5 m, und Einbetten, beispiels weise intraperitoneal, der Kammer in das Tier, wobei sich die Humanzellen in der Kammer durch Versorgung mit der Nährkörperflüssigkeit des Tieres vermehren.

Die Diffusionskammer kann außerdem so ausgelegt und bei spielsweise auf das Tier angebracht werden, daß die Nährflüs sigkeit in der Kammer frei zirkulieren kann. Die Kultur in der Kammer kann während der Zellvermehrung beobachtet werden, und zwar entweder durch mindestens ein an der Kammer wand angebrachtes durchsichtiges Seitenfenster und/oder durch Ersatz der Kammer selbst gegen eine neue Kammer zu verschiedenen Zeitpunkten, um die Zellvermehrung ohne Schlachten des Tieres über seine Lebenszeit zu erhalten und die Zellproduktion je Tier stark zu erhöhen. Da die Humanzellen mit den Tierzellen in einer solchen Diffusions kammer nicht in direkte Berührung kommen, werden unerwünsch te Immunreaktionen verhindert; es kann jeder nichthumane Warmblütler ohne Vorbehandlung zur Unterdrückung dieser Immunreaktion verwendet werden, und die vermehrten lebensfä higen Humanzellen können leicht aus der Diffusionskammer gewonnen werden.

Die Tiere können in herkömmlicher Weise gefüttert werden, nach der Transplantation ist keine besondere Vorsicht not wendig. Für eine maximale Zellvermehrung ist im allgemeinen eine Zeit von 1 bis 10 Wochen notwendig; es werden Zellzah len von etwa 10⁷ bis 10¹² Humanzellen je Tier oder auch mehr erhalten. Insbesondere vermehren sich die transplantier ten Humanzellen im erfindungsgemäßen Verfahren um etwa 10² bis 10⁷ mal oder mehr, was etwa 10 bis 10⁶ mal mehr ist, als herkömmlicherweise erhältlich durch Inokulieren und Vermehren der Humanzellen auf einem in vitro Nährkultur medium. Das wirkt sich auch günstig auf die LK 2-Produktion aus.

Erfindungsgemäß ist jedes Verfahren anwendbar, vorausgesetzt die LK 2-Produktion kann in den vermehrten Humanzellen induziert werden. Die vermehrten Humanzellen werden in dem als Wirt für die Zellvermehrung verwendeten Tier mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht. So werden bei spielsweise Humanzellen, die in einer Ascitessuspension vermehrt wurden, oder Tumorzellen, die beispielsweise sub kutan gebildet wurden, direkt in vivo mit einem LK 2-Induk tor in Berührung gebracht, um die LK 2-Produktion zu indu zieren; das angesammelte LK 2 wird aus dem Ascites, dem Serum und/oder Tumor gewonnen und gereinigt. Die vermehrten Humanzellen können aber auch aus dem Tier gewonnen und dann in vitro mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht werden. So können vermehrte Humanzellen, die entweder aus der Ascitessuspension oder durch Aufbrechen und Extrahieren der beispielsweise subkutan gebildeten Tumormasse(n) gewon nen wurden, in einem Nährkulturmedium suspendiert, auf eine Temperatur von etwa 20 bis 40°C zu Erreichung einer Zelldichte von etwa 10⁵ bis 10⁸ Zellen/ml vorgewärmt und in vitro mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht werden; das angesammelte LK 2 kann dann aus der Kultur gewonnen werden.

Bei Verwendung einer herkömmlichen Diffusionskammer werden die vermehrten Humanzellen mit dem LK 2-Induktor in der Kammer oder nach der Gewinnung in Berührung gebracht.

Die so erhaltenen Humanzellen können weitere 1 bis 4 d in vitro vor der LK 2-Induktion kultiviert werden, um die Fortpflanzungszeit zu regulieren.

Die LK 2-Produktion je Tier kann durch Anwendung mindestens einer der folgenden Verfahren noch gesteigert werden:

1) Die vermehrten Humanzellen werden in dem Tier, das als Wirt für die Zellvermehrung verwendet wurde, mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht und dann aus der (den) Stelle(n) des Tieres oder dessen Gesamtkörper gewonnen und dann in vitro mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht.
2) Die Humanzellen werden wiederholt mit einem LK 2-Induktor in Berührung gebracht.
3) Die in das Tier eingebettete oder mit dem Tier verbundene Diffusionskammer wird zu verschiedenen Zeitpunkten durch eine frische Kammer ersetzt.

Als LK 2-Induktoren im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind herkömmliche alpha-Interferon-Induktoren (alpha-IFN- Induktoren), wie Viren, Nucleinsäuren und Nucleotide, sowie herkömmliche gamma-Interferon-Induktoren (gamma-IFN-Induk toren), wie Phytohämagglutinin, Concanavalin A, Mytogen aus Phytolacca americana (pokeweed), Lipopolysaccharid, Endotoxin, Polysaccharid und Bakterien. Antigene wirken auf die sensibilisierten Zellen als LK 2-Induktoren.

Die LK 2-Produktion kann durch eine kombinierte Verwendung von IFN-alpha- und IFN-gamma-Induktoren als LK 2-Induktoren erhöht werden. Es wurde bestätigt, daß diese Kombination die gleichzeitige Produktion von humanspezifischem Inter feron (HuIFN) induziert. Das ist sehr günstig, da gleichzei tig und wirtschaftlich günstig zwei oder mehr biologisch aktive Substanzen hergestellt werden können, z. B. LK 2 und HuIFN und die Humanzellen viel wirkungsvoller ausge nützt werden können.

Das so erhaltene LK 2 kann durch ein oder mehrere Reini gungs- und/oder Trennverfahren gewonnen werden, beispiels weise durch Aussalzen, Dialyse, Filtrieren, Zentrifugieren, Einengen und/oder Lyophilisieren. Ist ein sehr viel reineres LK 2-Präparat erwünscht, so kann ein Präparat mit höchster Reinheit durch Anwendung der oben beschriebenen Verfahren in Kombination mit anderen herkömmlichen Verfahren erhalten werden, beispielsweise durch Adsorption und Desorption an einem Ionenaustauscher, Gelfiltration, Fraktionierung am isoelektrischen Punkt, Elektrophorese, Ionenaustausch chromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie, Säulen chromatographie und/oder Affinitätschromatographie.

Immobilisierte monoklonale Antikörper, die durch Binden eines monokonalen Anti-LK 2-Antikörpers (der im folgenden beschrieben wird) auf einen geeigneten wasserunlöslichen Träger erhalten werden kann, beispielsweise auf BrCN-akti vierte Sepharose kann zweckmäßigerweise zur Beschleunigung und leichteren LK 2-Reinigung verwendet werden.

Es wurde bestätigt, daß das so erhaltene LK 2 die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:

1) Molekulargewicht:
20 000 ± 2000 Dalton
2) Isoelektrischer Punkt:
pI = 6,2 ± 0,3
3) Elektrophoretische Beweglichkeit:
in der Scheiben-Polyacrylamidgelelektrophorese Rf = 0,29 ± 0,02
4) UV-Absorptionsspektrum:
Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm
5) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
unlöslich in Wasser, Salzlösung und Phosphatpuffer, kaum löslich oder unlöslich in Ethylether, Ethylacetat oder Chloroform
6) Farbreaktion:
proteinpositiv gemäß Lowry oder der Mikrobiuretmethode saccharidpositiv mit Phenol-Schwefelsäure oder Anthron- Schwefelsäure
7) Biologische Aktivität:
bei L 929-Zellen zytotoxisch,
bei KB-Zellen zytostatisch,
praktisch frei von Interferonaktivität
8) Stabilität in wässeriger Lösung:
stabil bis zu 60°C bei 30min. Inkubation bei pH 7,2,
stabil im pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 bei 16stünd.
Inkubation bei 4°C
9) Stabilität bei Kryokonservierung:
einen Monat oder länger stabil bei -10°C und
10) spezifische Aktivität:
10⁶ Einheiten/mg Protein und darüber.

Es wurde auch bestätigt, daß LK 2 normale Humanzellen nicht wesentlich zytolysiert, jedoch eine bemerkenswerte Zytolyse bei einer Vielzahl von Humantumorzellen sowie bei Mäuse-Fi broblastoidzellen, L 929, bewirkt und diese Zellen abtötet. So ist LK 2 beispielsweise in Form einer Zusammensetzung für die Prophylaxe und/oder Therapie von LK 2-empfindlichen Erkrankungen geeignet, beispielsweise bei bösartigen Tumoren und insbesondere verschiedenen bösartigen Humantumoren, deren Behandlung sehr schwierig ist.

Somit kann erfindungsgemäß die tumorhemmende Wirkung von Chemotherapeutika mit einem Steigerungsmittel, das LK 2 als Wirkstoff enthält, erhöht werden.

Die Dosis an Chemotherapeutika kann auf etwa 1/2 bis 1/1000 verringert werden, da die tumorhemmende Wirkung der Chemo therapeutika außerordentlich mit dem Steigerungsmittel erhöht werden kann. Außerdem verbreitert die Verwendung des Steigerungsmittels das Tumorspektrum der Chemotherapeu tika und ermöglicht die Behandlung von medikament-resisten ten Tumoren.

Als Chemotherapeutika können erfindungsgemäß beispielsweise eines oder mehrere der folgenden Mittel verwendet werden:
Alkylierungsmittel, wie Melphalan, Cyclophosphamide, Ifosf amide, Estramustine, Natriumphosphat, Busulfan, Imorpo sulfantosilat, N-Methyl-3,3′-dimesyloxydipropylamin-bi phenyl-4,4′-disulfonat, Carboquon, Thio-TEPA, Carmustin, Nimustinhydrochlorid, Streptozocin, Dacarbazin und Pipo broman; metabolische Antagonisten, wie Methotrexat, Fluoro uracil, Tegaful, Carmoful, Cytarabin, Ancitabinhydrochlorid, Enocitabin, 6-Mercaptopurin und Thioinosin; tumorhemmende Antibiotika, wie Doxorubicin, Daunorubicin, Aclarubicin, Bleomycin, Peplomycin, Mitomycin C, Actinomycine D und C, Chromomycin A₃, Mithramycin und Neocarzinostatin; und Pflanzenalkaloide, wie Vincristinsulfat, Vinblastinsulfat, Vindesinsulfat und Podophyllotoxin. Bei der Behandlung von Prostata- oder Brustkrebs kann gegebenenfalls mindestens ein tumorhemmendes Hormon, wie Prednisolon, Methyltestosteron oder konjugiertes Östrogen, in Kombination mitverwendet werden.

Die Kombination dieser Chemotherapeutika mit LK 2 soll ten je nach Bedingungen gewählt und nicht beschränkt werden.

Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann hergestellt werden durch Immunisierung eines nichthumanen Warmblütlers mit LK 2 als Antigen, Isolierung der Antikörper produzieren den Zellen aus dem Tierkörper, Fusion der Antikörper produ zierenden Zellen mit Myelomazellen, Selektion der entstande nen Hybridzellen als Klon, der LK 2-spezifische Antikörper produzieren kann, Vermehrung dieses Klons und Gewinnung des LK 2-spezifischen monoklonalen Antikörpers aus den vermehrten Zellen.

Die Immunisierung kann erreicht werden durch Injektion beispielsweise intravenös, intraperitoneal oder subkutan, einer wässerigen LK 2-Lösung, -Emulsion oder -Suspension als Antigen in einen geeigneten nichthumanen Warmblütler, wie Huhn, Taube, Hund, Katze, Affe, Ziege, Schwein, Rind, Pferd, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Hamster oder Maus, und Füttern des Tieres während 3 oder mehr Tage zur Induktion der Antikörperproduktion. Als Antigen kann auch ein Konjugat von LK 2 mit einem Saccharid gemäß JP-A-23 847/83 verwendet werden.

Das Antigen kann als Einzeldosis oder wenn notwendig in zwei oder mehr Dosen zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf von etwa 3 bis 30 d injiziert werden.

Die Milzzellen des immunisierten Tieres, in dem die Antikör per-Produktion induziert worden ist, werden mit Myelomazel len der gleichen oder einer anderen Art in geeigneter Weise fusioniert, z. B. gemäß G. Kohler et al. in "Nature", Bd. 256, Seiten 495 bis 497 (1975) oder "European Journal of Immunology", Bd. 6, Seiten 511 bis 519 (1976). Die so erhal tenen Hybridzellen werden selektioniert und geklont, der (die) Klon(e) wird (werden) in vitro oder in vivo kultiviert und der angesammelte hochspezifische monoklonale Antikörper wird dann aus der entstandenen Kultur gewonnen. Dabei wird das in vivo Verfahren dem in vitro Verfahren vorgezogen, da bei in vivo Kultivierung eine viel höhere Vermehrung des Klons und eine viel höhere Produktion des monoklonalen Antikörpers ohne Verwendung eines teuren Serums erreicht werden kann.

Beim in vivo Verfahren wird der Klon dadurch vermehrt, daß die Nährkörperflüssigkeit eines nichthumanen Warmblüt lers ausgenützt wird, wobei dieser der gleichen oder einer anderen Art als bei der Immunisierung angehören kann; dabei wird der Klon in einen solchen nichthumanen Warmblütler transplantiert oder der Klon wird in eine herkömmliche Diffusionskammer inokuliert, die die Nährkörperflüssigkeit eines solchen Tieres aufnehmen kann; der angesammelte mono klonale Antikörper wird aus den Körperflüssigkeiten, wie Ascites und Serum, gewonnen. Nach der Vermehrung in vivo kann der Klon aber auch in einem serumfreien Kulturmedium weitere 1 bis 5 d kultiviert werden; der angesammelte mono klonale Antikörper kann aus der entstandenen Kultur gewonnen werden.

Der so erhaltene monoklonale Antikörper kann leicht durch ein oder mehrere Trenn- und/oder Reinigungsverfahren gewon nen werden, beispielsweise durch Aussalzen, Dialyse, Filtrie ren, Zentrifugieren, Einengen und/oder Lyophilisieren. Ist eine sehr viel höhere Reinigung erwünscht, so kann ein Präparat mit höchster Reinheit durch Kombinieren der oben beschriebenen Verfahren mit anderen herkömmlichen Verfahren erreicht werden, beispielsweise durch Adsorption und Desorption an einem Ionenaustauscher, Gelfiltration, Fraktionierung am isoelektrischen Punkt, Elektrophorese, Ionenaustauschchromatographie, Hochleistungsflüssigchromato graphie, Säulenchromatographie und/oder Affinitätschromato graphie. Die Ausbeute an monoklonalem Antikörper kann zweck mäßigerweise noch verbessert werden durch Verwendung eines immobilisierten LK 2-Gels, das durch Binden von hochreinem LK 2 auf einem wasserunlöslichen Träger, wie BrCN-aktivierte Sepharose, erhalten werden kann.

Der erfindungsgemäß erhältliche monoklonale Antikörper ist als Ligand für die Affinitätschromatographie bei der LK 2- Produktion sowie für die Diagnose verschiedener Human erkrankungen wegen seiner Spezifität für LK 2, das bösartige Tumoren schädigt, geeignet.

Die LK 2-Titer werden entweder durch Verwendung von KB-Zel en oder L 929-Zellen als Zielzellen bestimmt: Bei Verwendung von KB-Zellen wird die zytostatische Aktivität gemäß "Cancer Chemotherapy Report", Teil 3, Bd. 3, Nr. 2, September (1972) bestimmt. Bei Verwendung von L 929-Zellen wird die zytotoxi sche Aktivität in Gegenwart von Aktinomycin D gemäß E. Pick, "Lymphokines", Bd. 2, Seiten 245 bis 249, "Tumor-Nekrose- Faktor", Academic Press, Inc. (1981) bestimmt. Im folgenden wird die Bestimmung mit L 929-Zellen verwendet, wenn nichts anderes angegeben ist.

Die HuIFN-Titer werden mit der herkömmlichen Plaque-Reduk tionsmethode unter Verwendung von FL-Zellen aus Humanamnion flüssigkeit gemäß "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", Bd. 20, Nr. 6, Seiten 616 bis 643 (1975) bestimmt.

Die Hämagglutinationstiter werden gemäß S.E. Salk "The Journal of Immunology", Bd. 49, Seiten 87 bis 98 (1944) bestimmt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel A-1 Herstellung von teilgereinigtem LK 2

Neugeborenen Hamstern wird herkömmliches Antiserum aus Kaninchen injiziert, um ihre Immunreaktion zu schwächen, und subkutan eine Human-Lymphoblastoidlinie, BALL-1, trans plantiert. Die Tiere werden drei Wochen in herkömmlicher Weise gefüttert. Die subkutan gebildeten Tumormassen werden extrahiert, zerkleinert und in Salzlösung aufgebrochen. Die so erhaltene Zellsuspension wird mit RPMI 1640-Medium, pH 7,2, das mit Serum aufgefüllt wird, gewaschen und in einem frischen Präparat des gleichen Kulturmediums zu einer Zelldichte von etwa 2×10⁶ Zellen/ml wieder suspendiert. Diese Zellsuspension wird mit Sendai-Virus (etwa 400 Hämag glutinationstiter/ml) versetzt und 24 h zur Induktion der der LK 2-Produktion bei 37°C inkubiert.

Die Kultur wird bei etwa 1000 g und etwa 4°C zentrifugiert, der entstandene Niederschlag wird entfernt. Der so erhalte ne Überstand wird gegen eine Salzlösung, die 0,01 m Phos phatpuffer, pH 7,2, 20 h dialysiert und durch ein Membran filter filtriert. Das Filtrat wird durch eine Säule mit immobilisierten Anti-HuIFN-Antikörper geleitet, die nicht adsorbierte Fraktion wird gesammelt. Aus dieser Fraktion wird eine aktive Fraktion durch Chromatofokussierung gewon nen, eingeengt und zu einem pulverförmigen Produkt mit LK 2-Aktivität lyophilisiert.

Die spezifische Aktivität dieses Produkts beträgt etwa 10⁶ Einheiten/mg Protein. Die LK 2-Ausbeute beträgt etwa 2,0×10⁷ Einheiten/Hamster.

Beispiel A-2 Herstellung von Anti-LK 2-Antikörpern

Ein gemäß Beispiel A-1 hergestelltes LK 2-Präparat wird in einer Salzlösung zu einer Proteinkonzentration von etwa 0,05% (Gew./Vol.) gelöst; die Lösung wird mit dem gleichen Volumen an Freunds Volladjuvans versetzt. Mäuse werden immunisiert durch subkutane Injektion von 0,2 ml-Proben des so erhaltenen Gemisches und 7 d nach der ersten Injek tion gefüttert. Nach der Induzierung der Anti-LK 2-Anti körper-Produktion in den Antikörper produzierenden Zellen der Tiere wird die Milz jedes Tiers extrahiert, zerkleinert, aufgebrochen und suspendiert und zwar zusammen mit einer Maus-Myeloma-Zellinie (P₃-X63-Ag8) in serumfreiem Eagle′s Minimalnährmedium, pH 7,2, das 50% (Gew./Vol.) Polyethy lenglykol 1000 enthält und auf 37°C vorgewärmt war. Das Gemisch mit einer Zelldichte von 10⁴ Zellen/ml wird 5 min stehengelassen, dann auf das 20fache mit einem frischen Präparat des gleichen Kulturmediums verdünnt; die Hybrido mazellen, die in dem Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthaltenden Medium wachsen können, werden gemäß R.L. David son und P.S. Gerald in "Somatic Cell Genetics", Bd. 2, Nr. 2, Seiten 175 bis 176 (1976), gesammelt; der Klon ent hält Hybridomazellen, die Anti-LK 2-Antikörper produzieren können. Diese geklonten Hybridomazellen werden in einer Dosis von etwa 10⁶ Zellen/Maus intraperitoneal in Mäuse transplantiert, die 2 Wochen gefüttert und dann geschlachtet werden. Die Körperflüssigkeiten der Tiere, wie Ascites flüssigkeit und Blut, werden gesammelt, zentrifugiert und mit Ammoniumsulfat ausgesalzen; die Fraktionen, die bei 30 bis 50% Sättigung ausfallen, werden gesammelt. Diese Fraktionen werden dialysiert und mit einem immobilisierten Anti-LK 2-Antikörpergel der Affinitätschromatographie zuge führt. Das immobilisierte Anti-LK 2-Antikörpergel wurde erhalten durch Umsetzung einer gemäß Beispiel A-1 erhaltenen LK 2-Probe mit BrCN-aktivierter Sepharose bei Raumtempera tur, wobei eine Anti-LK 2-Antikörperfraktion entstand, die dialysiert, konzentriert und lyophilisiert wurde.

Das entstandene pulverförmige Produkt neutralisiert immuno logisch spezifisch die zytotoxische Aktivität von LK 2.

Die Stabilität des monoklonalen Antikörpers in wässeriger Lösung wird durch Bestimmung der Restneutralisationsaktivi tät nach Inkubieren unter bestimmten Bedingungen untersucht: Nach der 30min. Inkubation bei pH 7,2 und verschiedenen Temperaturen bleiben 80% und mehr der Aktivität übrig, bei 70°C gehen jedoch 90% und mehr verloren. Nach der 16stünd. Inkubation bei 4°C und verschiedenen pH-Werten ist die Aktivität in einem pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 stabil, sie geht jedoch bei einem pH-Wert von 2,0 zu 90% und mehr verloren.

Bei der Untersuchung der Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers wurde festgestellt, daß der monoklonale Antikör per gegenüber 2-Mercaptoethanol empfindlich ist und eine spezifische Antigen-Antikörper-Reaktion mit Anti-Maus-Immuno globulin-M-Antikörper zeigt. Deshalb wird der monoklonale Antikörper in die Klasse der Immunoglobulin-M-Antikörper eingereiht.

Beispiel A-3 Herstellung und physikochemische Eigenschaften des hoch reinen LK 2

Ein gemäß Versuch A-1 erhaltenes teilgereinigtes LK 2-Präpa rat wird mit einem gemäß Beispiel A-2 hergestellten immobi lisierten monoklonalen Antikörpergel der Affinitätschroma tographie unterworfen; die LK 2-Fraktionen werden gesammelt, dialysiert, eingeengt und lyophilisiert.

Es wird ein hochreines LK 2-Präparat mit einer spezifischen Aktivität von etwa 10⁹ Einheiten/mg Protein erhalten.

Die physikochemischen Eigenschaften des LK 2 werden an diesem Präparat untersucht:

1) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht von LK 2 wird durch Elektrophorese mit SDS-Polyacrylamidgel gemäß K. Weber und M. Osborn in "Journal of Biological Chemistry", Bd. 244, Seite 4406 (1969), bestimmt. Die Säule mit 10% Acrylamidgel wird mit etwa 10 µg-Proben des Präparats in Gegenwart von 0,1% SDS beladen, die Elektrophorese wird mit 8 mA je Säule während 4 h durchgeführt. Nach der Extraktion und der folgenden LK 2-Bestimmung der aktiven Fraktion beträgt das Molekulargewicht von LK 2 20 000 ± 2000 Dalton.

2) Isoelektrischer Punkt

Bei einer 2stünd. 25 W-Elektrofokussierung des Präparats mit einem Gelprodukt für die Elektrofokussierung bei pH 3,5 bis 9,5 ("Ampholine Pagplate") erhält man einen isoelektrischen Punkt pI = 6,2 ± 0,3.

3) Elektrophoretische Beweglichkeit

Gemäß B.J. Davis in "Annals of New York Academy of Scien ces", Bd. 121, Seite 404 (1964), werden etwa 10 µg-Proben des Präparats auf Säulen mit 7,5% Acrylamidgel aufge bracht, 2 h der Elektrophorese bei pH 8,3 und 3 mA je Säule unterworfen, extrahiert und auf LK 2-Aktivität untersucht. Man erhält eine elektrophoretische Beweglich keit Rf von 0,29 ± 0,02.

4) UV-Absorptionsspektrum

Durch Analyse des UV-Spektrums des Präparats mit einem UV-250-Spektrometer wird ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm gefunden.

5) Löslichkeit in Lösungsmitteln

Das Präparat ist in Wasser, Salzlösung und Phosphatpuffer unlöslich, in Ethylether, Ethylacetat und Chloroform kaum löslich oder unlöslich.

6) Farbreaktion

Das Präparat ist proteinpositiv gemäß der Lowry- und der Mikrobiuret-Methode, saccarid-positiv mit Phenol- Schwefelsäure und Anthron-Schwefelsäure.

7) Biologische Aktivität

Es wurde eine zytotoxische Aktivität bei L 929-Zellen und eine zytostatische Aktivität bei KB-Zellen, jedoch keine wesentliche HuIFN-Aktivität festgestellt.

8) Stabilität in wässeriger Lösung i) Hitzestabilität

Präparatproben mit etwa 1×10⁵ Einheiten/ml werden bei pH 7,2 und verschiedenen Temperaturen 30 min inkubiert; die zytotoxische Restaktivität wird be stimmt; dabei wird festgestellt, daß LK 2 bis zu 60°C stabil ist.

ii) pH-Stabilität

0,1 ml Präparatproben (1×10⁶ Einheiten/ml) werden mit 1 ml Pufferlösung mit verschiedenen pH-Werten versetzt, beispielsweise mit Mcllvaine-Puffer bei pH 2 bis 7, Phosphatpuffer, pH 7,8, Glycin-NaOH- Puffer, pH 8 bis 11, und 16 h bei 4°C inkubiert. 0,1 ml des inkubierten Gemisches werden dann mit 0,05 m Phosphatpuffer, pH 7,2, auf pH 7,2 einge stellt, die Restaktivität wird bestimmt. Es wird festgestellt, daß LK 2 im pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 stabil ist.

iii) Stabilität gegenüber Bacillusprotease (Dispase)

Etwa 1×10⁵ Einheiten/ml Präparat werden mit einer Bacillusprotease ("Dispase") zu einer Enzymaktivität von 100 Einheiten/ml versetzt, das Gemisch wird bei pH 7,2 und 37°C 2 h inkubiert. Während der Inkuba tion werden dem Gemisch kleine Proben entnommen, die mit Kälberserumalbumin zu einer Konzentration von 1% (Gew./Vol.) zur Unterbrechung der enzymati schen Reaktion versetzt werden. Bei dieser Bestim mung der LK 2-Aktivität wurde festgestellt, daß LK 2 gegenüber der Bacillusprotease empfindlich ist und seine Aktivität bei fortschreitender enzyma tischer Reaktion verliert.

9) Stabilität bei Kryokonservierung bzw. Kältelagerung

Das LK 2-Präparat wurde in wässeriger Lösung bei -10°C und pH 7,2 einen Monat gelagert, aufgetaut und bestimmt. Es konnte keine Aktivitätsabnahme festgestellt werden.

Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß LK 2 physiko chemische Eigenschaften hat, die sich von denen bekannter Lymphokine, wie LT, TNF oder IFN, unterscheiden. Auch der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper ist neu, da er die zytotoxische Aktivität des neuen Lymphokins LK 2 immuno logisch spezifisch neutralisiert.

Beispiel B-1 Zytostatische Wirkung auf bösartige Tumorzellen

Die zytostatische Wirkung von LK 2 auf verschiedene Human zellen wird mit den gemäß Beispiel A-1 und A-3 erhaltenen LK 2-Präparaten untersucht.

Die in Tabelle 1 angegebenen Humanzellen (10⁶ Zellen) werden in 1 ml herkömmlichen Nährmedium, das Kälberfötusserum enthält, suspendiert, 1 d kultiviert, mit 0,1 ml einer Salzlösung, die entweder 50 Einheiten oder 500 Einheiten eines gemäß Beispiel A-1 oder A-3 hergestellten LK 2-Präpa rats enthält, versetzt und 2 d bei 37°C inkubiert. Am Ende der Kultur werden die lebenden Zellen mit Neutralrot (Farbreagens) gemäß der in "Applied Microbiology", Bd. 22, Nr. 4, Seiten 671 bis 677 (1971), beschriebenen Methode gefärbt; das Farbreagens wird mit einer angesäuerten Ethanol lösung eluiert. Die Anzahl der lebenden Zellen wird durch Bestimmung der Eluatabsorption bei einer Wellenlänge von 540 nm gemessen.

Als Kontrolle wird 0,1 ml einer LK 2-freien Salzlösung verwendet.

Die Wachstumshemmung (Prozent) wird gemäß folgender Glei chung berechnet:

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.

Die Ergebnisse bestätigen, daß LK 2 normale Zellen nicht wesentlich beeinträchtigt, jedoch sehr stark das Wachstum verschiedener bösartiger Tumorzellen hemmt. Aus Tabelle 1 ist auch ersichtlich, daß ein teilgereinigtes LK 2-Präpa rat mit einem hochreinen Präparat gut vergleichbar ist.

Beispiel B-2

Einer Gruppe von BALB/c-Mäusen werden Meth-A-Zellen aus Mäusesarkom transplantiert. Vom 10. Tag nach der Transplanta tion an wird den Mäusen intravenös eine Salzlösung, die ein gemäß Beispiel A-3 hergestelltes LK 2-Präparat enthält, in einer Dosis von 100 oder 1000 Einheiten/kg einmal täglich während 15 d injiziert. Die Mäuse werden dann geschlachtet, die in den Tieren gebildeten Tumormassen werden bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle II

Beispiel B-3

Einer Gruppe vom BALB/c-Nacktmäusen werden subkutan in den Rücken kleine Fragmente von Humanbrustkrebs-Gewebe transplantiert.

Nachdem die Tumormassen auf etwa 200 mm³ in den Tierkörpern gewachsen sind, wird den Tieren eine Salzlösung, die ein gemäß Beispiel A-1 oder A-3 hergestelltes LK 2-Präparat enthält, intravenös in einer Dosis von entweder 100 Einhei ten/kg oder 1000 Einheiten/kg einmal täglich während 20 d injiziert. Dann werden die Tiere geschlachtet, die entstan denen Tumormassen werden bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle III

Beispiel B-4

Einer Gruppe von BALB/c-Nacktmäusen werden subkutan in den Rücken kleine Humanbrustkrebs-Gewebefragmente gemäß Beispiel B-3 transplantiert.

Nachdem die Tumormassen auf etwa 200 mm³ in den Tierkörpern gewachsen sind, wird den Tieren eine Salzlösung, die ein gemäß Beispiel A-3 hergestelltes LK 2-Präparat und/oder ein alpha-HuIFN-Präparat enthält, intravenös einmal täglich während 20 d injiziert. Dann werden die Tiere geschlachtet, die entstandenen Tumormassen werden bestimmt.

Als Kontrolle wird eine LK 2- und alpha-HuIFN-freie Salzlösung verwendet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben.

Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß die kombinierte Verwen dung von LK 2- und alpha-HuIFN die tumorhemmende Wirkung von alpha-HuIFN extrem steigert.

Tabelle IV

Beispiel B-5

Ein akuter Toxizitätstest, in dem einer Gruppe von 20 d alten Mäusen ein gemäß Beispiel A-3 hergestelltes LK 2-Prä parat verabreicht wurde, bestätigt, daß die Toxizität des Präparats nach intraperitonealer Injektion extrem niedrig ist, d. h. LD₅₀ = 19⁹ Einheiten oder mehr.

Aus den oben angegebenen Versuchen ist ersichtlich, daß LK 2 eine starke zytostatische Wirkung auf bösartige Tumoren sowohl in vitro als auch in vivo hat. Außerdem ist die Verabreichung von LK 2 sicher, da eine hohe Dosierung nor male Zellen praktisch nicht beeinträchtigt und eine niedrige Dosierung Tumorzellen deutlich hemmt.

Die wirksame LK 2-Dosis liegt im allgemeinen im Bereich von 5 bis 500 000 000 Einheiten/d bei Erwachsenen: Insbe sondere beträgt sie bei lokaler Verabreichung, beispiels weise in Form einer Lokalinjektion oder eines Augenwassers, 5 bis 10 000 000 Einheiten/d, bei Verabreichung durch die Haut oder die Schleimhäute, beispielsweise in Form einer Salbe oder eines Zäpfchens, 10 bis 50 000 000 Einheiten/d, bei systemischer Verabreichung, beispielsweise als intra venöse oder intramuskuläre Injektion, 50 bis 100 000 000 Einheiten/d und bei oraler Verabreichung 500 bis 500 000 000 Einheiten/d; die Dosierung ist jedoch je nach Anweisungen und dem Befinden des Patienten frei wählbar.

Obwohl LK 2 in herkömmlicher Weise durch Vermischen mit herkömmlichen Trägern, Grundstoffen und/oder Hilfsmitteln in ein Medikament verarbeitet werden kann, sollte der LK 2- Gehalt wegen der Toxizität, der wirksamen Dosis und der Sicherheit mindestens 5 Einheiten/g betragen.

Die Art und die Form der prophylaktischen und/oder thera peutischen Mittel für LK 2-empfindliche Erkrankungen kann frei gewählt werden: So sind beispielsweise für eine orale Verabreichung Präparate für den Darm geeignet, wie Kapseln, Tabletten oder Pulver, für die rektale Verabreichung Zäpf chen; für die Injektion kann es beispielsweise eine lyophi lisierte Injektion sein, die vor der Verwendung mit destil liertem Wasser zu einer Injektionslösung gelöst wird; auch in Form eines Collunariums, Augenwassers oder einer Salbe ist das Präparat geeignet.

Bei der Behandlung von Patienten mit einem bösartigen Tumor kann beispielsweise ein dem Patienten entnommenes Tumor gewebefragment in vitro mit LK 2 behandelt werden, um die Immunogenität des Gewebefragments zu erhöhen, und dem Patien ten wieder verabreicht werden, um so eine wirkungsvollere Behandlung des bösartigen Tumors zu erreichen.

Die kombinierte Verwendung von LK 2 mit tumorhemmenden Mitteln, beispielsweise Lymphokine, wie HuIFN, TNF, LT und T-Zellwachstumsfaktor (TCGF), tumorhemmenden Polysaccha riden, wie 1,3-β-Glukan, Arabinomannan, Lipopolysaccharid, OK-432 (Picibanil), PSK (Krestin) und Lentinan, metaboli schen Antagonisten, wie Methotrexat und Fluoruracil, und tumorhemmenden Antibiotika, wie Doxorubicin und Mitomycin C, ist sehr günstig, da diese kombinierte Verwendung die tumorhemmende Wirkung von LK 2 extrem erhöht.

Insbesondere wurde festgestellt, daß LK 2 die tumorhemmende Wirkung von Chemotherapeutika erhöht.

Die steigernde Wirkung von LK 2 auf die Tumorhemmung wird im folgenden erklärt.

Beispiel C-1 Steigerung der tumorhemmenden Wirkung von Chemotherapeutika mit LK 2

Die Steigerung der tumorhemmenden Wirkung von Chemothera peutika mit LK 2 wird mit bösartigen Tumorzeilen untersucht.

Bösartige Humantumorzellen (10⁶ Zellen) werden in 1 ml herkömmliches Kulturnährmedium, das mit Kälberfötusserum versetzt ist, eingeimpft und einen Tag kultiviert. Die Kultur wird dann mit 0,1 ml einer Salzlösung, die 100 Ein heiten eines gemäß Beispiel A-3 hergestellten LK 2-Präparats und/oder ein Chemotherapeutikum enthält, versetzt und weite re zwei Tage bei 37°C kultiviert.

Als Kontrolle wird eine LK 2- und chemotherapeutikumfreie Salzlösung verwendet.

Nach beendeter Kultur wird die Anzahl der lebenden Zellen gemäß Beispiel B-1 gezählt, die Wachstumshemmung (%) wird bestimmt.

Die Konzentration der untersuchten Chemotherapeutika war wie folgt Nimustin-Hydrochlorid (ACNU), 1,0×10^-6 g/ml Kultur, Fluoruracil (5-FU): 1,5×10^-8 g/ml Kultur, Doxoru bicin (ADM): 1,0×10^-10 g/ml Kultur, Mitomycin C (MMC): 2,5×10^-9 g/ml Kultur und Vinkristin-Sulfat (VCR): 1,5×10^-10 g/ml Kultur.

Die Ergebnisse sind Tabelle 5 angegegeben.

Aus Tabelle 5 ist ersichtlich, daß LK 2 die tumorhemmende Wirkung von Chemotherapeutika extrem erhöht.

Beispiel C-2

Einer Gruppe von BALB/c Nacktmäusen werden subkutan in den Rücken kleine Humanbrustkrebs-Gewebefragmente trans plantiert.

Nach dem die Tumormassen auf etwa 200 mm³ in den Tierkörpern gewachsen sind, wird eine Salzlösung, die ein gemäß Beispiel A-3 hergestelltes LK 2-Präparat enthält, intravenös einmal täglich während 20 Tagen injiziert. Die Tiere werden dann geschlachtet, die entstandenen Tumormassen werden bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben.

Tabelle VI

Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß LK 2 sogar in vivo sehr stark die tumorhemmende Wirkung von Chemotherapeutika erhöht.

Die Ergebnisse bestätigen auch, daß eine Kombination eines Chemotherapeutikums mit LK 2 eine hohe tumorhemmende Wirkung hat, sogar dann, wenn das Chemotherapeutikum allein eine niedrige Konzentration und somit eine ungenügende tumor hemmende Wirkung aufweist.

Die Verwendung von LK 2 als Steigerungsmittel für Chemo therapeutika verringert sehr die eingesetzte Chemotherapeuti kum-Konzentration, verhindert Nebeneffekte und verbreitert sehr das Tumorspektrum der Chemotherapeutika.

Das erfindungsgemäße, LK 2 enthaltende Steigerungsmittel weist eine steigernde Wirkung auf die Tumorhemmung auf, wenn es mit Chemotherapeutika verwendet wird.

Das Steigerungsmittel wird mit einem Chemotherapeutikum vorgemischt, das entstandene Gemisch wird gleichzeitig auf einmal verabreicht. Man kann aber auch zuerst entweder das Steigerungsmittel oder das Chemotherapeutikum verab reichen und das andere Mittel auf gleiche oder andere Weise nachreichen.

Die folgenden Beispiele D, E und F erläutern die LK 2-Her stellung, LK 2 enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen sowie den LK 2-spezifischen monoclonalen Antikörper.

Beispiel D-1

Eine Humanlymphoblastoid Linie, BALL-1, wird in Eagle′s Minimalnährmedium, pH 7,4, das 20% Kälberfötusserum ent hält, eingeimpft und in vitro in Suspension bei 37°C auf herkömmliche Weise kultiviert. Die vermehrten Humanzellen werden mit serumfreien Eagle′s Minimalnährmedium, pH 7,4, gewaschen und in einem frischen Präparat des gleichen Kultur mediums wieder suspendiert, und zwar zu einer Zelldichte von etwa 1×10⁷ Zellen/ml. Die Zellsuspension wird mit Sendai-Virus in einer Dosierung von etwa 1000 Hämagglu tinationstiter/ml versetzt und einen Tag bei 38°C zur Induktion der LK 2-Produktion inkubiert. Nach dem Zentri fugieren der entstandenen Kultur bei etwa 1000 g und 4°C wird der Überstand gegen eine Salzlösung, die 0,01 m Phos phatpuffer, pH 7,2, 15 Stunden dialysiert und durch einen Membranfilter filtriert. Das Filtrat wird auf eine Säule mit Anti-LK 2-Antikörper gemäß Beispiel A-1 aufgegeben; die nicht adsorbierte Fraktion wird gemäß Beispiel A-3 durch Affinitätschromatographie gereinigt, und zwar auf einer Säule mit einem Anti-LK 2-Antikörper gebundenen Gel, und zu einem Konzentrat mit einer spezifischen LK 2-Akti vität von etwa 10⁹ Einheiten/mg Protein eingeengt.

Die Ausbeute beträgt etwa 1,5×10⁶ Einheiten/l der induzier ten Zellsuspension.

Beispiel D-2

Neugeborenen Hamstern wird ein herkömmliches Antiserum aus Kaninchen zur Schwächung ihrer Immunreaktion injiziert und subkutan eine Humanlymphoblastoid-Linie, BALL-1, trans plantiert; die Tiere werden drei Wochen in herkömmlicher Weise gefüttert. Die in den Tieren subkutan gebildeten Tumormassen von je etwa 15 g werden extrahiert, zerkleinert und in Salzlösung aufgebrochen. Nach dem Waschen mit serum freiem RPMI 1640-Medium, pH 7,2, werden die vermehrten Zellen in einem frischen Präparat des gleichen Kulturme diums zu einer Zelldichte von etwa 5×10⁶ Zellen/ml wieder suspendiert. Die Zellsuspension wird mit Sendai-Virus und Endotoxin aus E. coli in einer Dosierung von etwa 1000 Hämagglutinationstiter/ml und etwa 10 µg/ml versetzt und bei 37°C einen Tag zur Induktion der LK 2-Produktion in kubiert. Nach dem Zentrifugieren der Kultur bei etwa 1000 g und 4°C zur Entfernung des Sediments wird der Überstand gegen eine Salzlösung, die 0,01 m Phosphatpuffer, pH 7,2 enthält, 21 Stunden dialysiert und durch einen Membranfilter filtriert. Das Filtrat wird mit einer Antikörpersäule gemäß Beispiel D-1 gereinigt; die Eluatlösung wird eingeengt und zu einem pulverförmigen Produkt mit einer spezifischen LK 2-Aktivität von etwa 10⁹ Einheiten/mg Protein lyophilisiert.

Die Ausbeute beträgt etwa 3,2×10⁷ Einheiten.

Beispiel D-3

Erwachsenen Nacktmäusen wird intraperitoneal eine Human lymphoblastoid-Linie, TALL-1, transplantiert; die Tiere werden fünf Wochen in herkömmlicher Weise gefüttert, dann wird intraperitoneal Newcastle-Virus (etwa 3000 Hämag glutinationstiter je Nacktmaus), das vorher durch UV-Be strahlung praktisch inaktiviert worden ist, injiziert; die Tiere werden 24 h nach der Injektion geschlachtet, die Ascitesflüssigkeit wird gesammelt, gereinigt, einge engt und gemäß Beispiel D-2 zu einem pulverförmigen Produkt mit LK 2-Aktivität lyophilisiert.

Die Ausbeute beträgt etwa 3,5×10⁶ Einheiten je Nacktmaus.

Beispiel D-4

Erwachsene Mäuse werden mit Röntgenstrahlen in einer Dosis von etwa 400 rem bestrahlt, um ihre Immunreaktion zu schwä chen, dann wird ihnen eine Humanlymphoblastoidzell-Linie, Mono-1, subkutan transplantiert; die Tiere werden in her kömmlicher Weise drei Wochen gefüttert. Die in den Tieren subkutan gebildeten Tumormassen von je etwa 10 g werden extrahiert und gemäß Beispiel D-2 aufgebrochen. Die so erhaltenen Humanzellen werden gemäß Beispiel D-2 suspen diert, die entstandene Zellsuspension wird mit Sendai-Virus und Conkanavalin A in einer Dosis von etwa 500 Hämaggluti nationstiter/ml und 0,8 µg/ml versetzt und bei 37°C einen Tag zur Induktion der LK 2-Produktion inkubiert. Die Kultur wird dann gereinigt, eingeengt und gemäß Beispiel D-2 zu einem pulverförmigen Produkt mit LK 2-Aktivität lyophili siert.

Die Ausbeute beträgt etwa 2,0×10⁷ Einheiten je Maus.

Beispiel D-5

Neugeborenen Hamstern wird eine Humanlymphoblastoid-Linie, Namalwa (ATCC CRL 1432) gemäß Beispiel D-2 transplantiert; die Tiere werden in herkömmlicher Weise vier Wochen ge füttert. Die in den Tieren subkutan gebildeten Tumormassen von je etwa 20 g werden extrahiert und zu einer Zellsus pension mit einer Zelldichte von etwa 3×10⁶ Zellen/ml aufge brochen. Die Zellsuspension wird mit Sendai-Virus in einer Dosis von etwa 1000 Hämagglutinationstiter je ml versetzt und bei 36°C zwei Tage zur Induktion der LK 2-Produktion inkubiert. Die Kultur wird gereinigt und gemäß Beispiel D-1 zu einem Konzentrat mit LK 2-Aktivität eingeengt.

Die Ausbeute beträgt etwa 2,2×10⁷ Einheiten je Hamster.

Beispiel D-6

Eine Humanlymphoblastoid-Linie, NALL-1, wird in Salzlösung suspendiert und in eine etwa 10 ml fassende zylindrische Kunststoff-Diffusionskammer eingebracht, die mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von etwa 0,5 µm ausge rüstet ist. Die Kammer wird intraperitoneal in eine erwachse ne Ratte eingebettet, das Tier wird vier Wochen in herkömm licher Weise gefüttert. Nach dem Entfernen der Kammer be trägt die Zelldichte in der Kammer etwa 5×10⁸ Zellen/ml, was etwa 10² mal oder mehr ist als bei der in vitro-Vermehrung in einem CO₂-Inkubator unter Verwendung eines Nährkultur mediums erreichbar ist. Die Humanzellen werden in dem Kultur medium gemäß Beispiel D-2 suspendiert, mit Newcastle-Virus (etwa 500 Hämagglutinationstiter/ml), das vorher durch UV-Bestrahlung inaktiviert worden ist, und Phytohämagglu tinin (etwa 50 µg/ml) versetzt und bei 37°C einen Tag zur Induktion der LK 2-Produktion inkubiert. Die Kultur wird gereinigt, eingeengt und gemäß Beispiel D-2 zu einem pulverförmigen Produkt mit LK 2-Aktivität lyophilisiert.

Die Ausbeute beträgt etwa 8×10⁶ Einheiten je Ratte.

Beispiel D-7

Eine Humanlymphoblastoid-Linie, CCRF-CEM (ATCC CCL 119) wird in die Allantoishöhlen von befruchteten Eiern, die bei 37°C 5 d inkubiert worden sind, eingeimpft; die Eier werden bei dieser Temperatur eine weitere Woche inkubiert. Die vermehrten Humanzellen werden aus den Eiern gewonnen und gemäß Beispiel D-1 zu einer Zelldichte von 5×10⁶ Zellen/ ml suspendiert. Die Zellsuspension wird mit Sendai-Virus (etwa 500 Hämagglutinationstiter/ml) versetzt und bei 37°C 1 d zur Induktion der LK 2-Produktion inkubiert. Die erhal tene Kultur wird gereinigt und gemäß Beispiel D-2 zu einem pulverförmigen Produkt mit LK 2-Aktivität eingeengt.

Die Ausbeute beträgt etwa 7,0×10⁵ Einheiten/10 befruchtete Eier.

Beispiel E-1 Injektion

Ein gemäß Beispiel D-2 hergestelltes LK 2-Präparat mit einer Aktivität von 500 000 Einheiten wird in 200 ml Salz lösung gelöst und unter sterilen Bedingungen durch ein Membranfilter filtriert. 2 ml-Proben des Filtrats werden in sterilisierte Glasampullen verteilt, lyophilisiert und als pulverförmige Injektion verschlossen.

Die Injektion wird günstigerweise allein oder als Steige rungsmittel in Kombination mit einem Chemotherapeutikum, wie Melphalan, Methotrexat oder Doxorubicin, zur Behandlung von Brustkrebs, Lungenkarzinom, Leberkarzinom oder Leukämie verwendet.

Beispiel E-2 Injektion

Gemäß Beispiel E-1 wird eine pulverförmige Injektion herge stellt mit dem Unterschied, daß 3×10⁸ Einheiten alpha-HuIFN aus Humanlymphoblastoidzellen in 200 ml Salzlösung zusam men mit 5×10⁵ Einheiten LK 2 gelöst werden.

Die Injektion wird günstigerweise allein oder als Steige rungsmittel in Kombination mit einem Chemotherapeutikum, wie Tegafur, Mitomycin C oder Vincristin-Sulfat zur Behand lung von Brustkrebs, Lungenkarzinom, Leberkarzinom oder Leukämie verwendet; ihre therapeutische Wirksamkeit ist größer als die der Injektion des Beispiels E-1.

Beispiel E-3 Salbe

Ein gemäß Beispiel D-3 hergestelltes LK 2-Präparat wird mit einer Mindestmenge an flüssigem Paraffin bis zur Homoge nität verknetet. Das Gemisch wird in herkömmlicher Weise mit weißer Vaseline zu einer Salbe mit einer LK 2-Aktivität von 20 000 Einheiten/g versetzt.

Die Salbe wird günstigerweise allein oder als Steigerungsmit tel in Kombination mit einem Chemotherapeutikum, wie Cyclo phosphamid, Fluoruracil oder Vincristinsulfat, zur Behand lung von Hautkarzinom, Brustkrebs oder Lymphom verwendet.

Beispiel E-4 Augenwasser

Ein Gemisch von 800 ml destilliertem Wasser, 5 ml beta- Phenylethylalkohol und 20 000 000 Einheiten eines gemäß Beispiel D-4 hergestellten LK 2-Präparats werden mit Natrium chlorid und einer zusätzlichen Menge an destilliertem Wasser zu 1000 ml isotoner Lösung vermischt.

Die Lösung wird günstigerweise allein oder als Steigerungs mittel in Kombination mit einem Chemotherapeutikum, wie Cytarabin oder Vincristinsulfat, zur Behandlung von Retina blastom verwendet.

Beispiel E-5 Überzogene enterale Tabletten

Überzogene enterale Tabletten werden in herkömmlicher Weise hergestellt durch Tablettieren eines Gemisches aus Stärke, Maltose und eines gemäß Beispiel D-7 hergestellten LK 2- Präparats zu einem LK 2-Gehalt von 200 000 Einheiten/Tablet te (100 mg) und anschließendes Überziehen der Tabletten mit Methylcellulose-phthalatester.

Die Tabletten werden günstigerweise allein oder als Steige rungsmittel in Kombination mit einem Chemotherapeutikum, wie Doxorubicin, Fluoruracil oder Mitomycin C, zur Behand lung von Kolonkarzinom oder Leberkarzinom verwendet.

Beispiel F-1

Mäuse werden gemäß Beispiel A-2 immunisiert mit dem Unter schied, daß ein hochreines LK 2-Präparat, das gemäß Beispiel A-3 erhalten wurde, als Antigen verwendet wird. Die Milz zellen der Tiere werden zusammen mit einer Mausmyelomalinie (P3-NS-1/1-Ag4-1 von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japan) in einer Salzlösung supendiert, die 140 mM/l NaCl, 54 mM/l KCl, 1 mM/l NaH₂PO₄ und 2 mM/l CaCl₂ enthält. Die Suspension hat eine Zelldichte von 10⁴ Zellen/ml und wird mit einer frischen Salzlösung der gleichen Zusammen setzung, die jedoch vorher durch UV-Bestrahlung inaktivier tes Sendai-Virus enthält, unter Eiskühlung versetzt; das Gemisch wird 5 min stehengelassen, dann mit etwa der 20fachen Menge 37°C warmem RPMI 1640-Medium verdünnt. Die Hybridomazellen, die Anti-LK 2-Antikörper produzieren kön nen, werden gemäß Beispiel A-2 geklont. Die geklonte Hybri domazellen werden intraperitoneal in 7 d alte Hamster (etwa 10⁷ Zellen/Hamster), deren Immunreaktion in herkömmlicher Weise geschwächt worden ist, transplantiert; der monoklonale Antikörper wird aus den Tierkörpern gemäß Beispiel A-2 gewonnen.

Wie der monoklonale Antikörper des Beispiels A-2 neutrali siert dieses Produkt auch immunologisch spezifisch die zytotoxische Aktivität von LK 2.

Die Stabilität des monoklonalen Antikörpers in wässeriger Lösung wird durch Bestimmung der Restneutralisationsaktivi tät nach Inkubieren unter bestimmten Bedingungen gemessen: Nach 30min. Inkubation bei pH 7,2 und verschiedenen Tempera turen sind 80% und mehr der Aktivität bei 60°C noch erhal ten, wogegen 90% oder mehr bei 70°C verlorengehen. Nach 16stünd. Inkubation bei 4°C und verschiedenen pH-Werten ist die Aktivität in einem pH-Bereich von 2,0 bis 11,0 stabil.

Bei der Untersuchung verschiedener Eigenschaften des mono klonalen Antikörpers wurde festgestellt, daß der monoklonale Antikörper gegenüber 2-Mercaptoethanol beständig ist und eine spezifische Antigen-Antikörperreaktion mit Antimaus- Immunoglobulin-G-Antikörper aufweist. D. h., der monoklonale Antikörper gehört in die Klasse der Immunoglobulin-G-Antikör per.

Beispiel F-2

Ein monoklonaler Anti-LK 2-Antikörper wird gemäß Beispiel F-1 hergestellt mit dem Unterschied, daß als Mausmyeloma linie SP2/0-Ag14 anstelle von P3-NS-1/1-Ag4-1 verwendet wird.

Die immunologisch spezifische Neutralisation der zytotoxi schen Aktivität von LK 2 durch den monoklonalen Antikörper entspricht der des Beispiels F-1. D. h., der monoklonale Antikörper gehört ebenfalls in die Klasse der Immunoglobu lin-G-Antikörper.

Claims

1. Lymphokin (LK 2) mit den folgenden physikochemischen Eigenschaften:

1) Molekulargewicht:
20 000 ± 2000 Dalton
2) Isoelektrischer Punkt:
pI = 6,2 ± 0,3
3) Elektrophoretische Beweglichkeit:
auf Scheiben-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE): Rf = 0,29 ± 0,02
4) UV-Absorptionsspektrum:
Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm
5) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
unlöslich in Wasser, Salzlösung und Phosphatpuffer, kaum löslich oder unlöslich in Ethylether, Ethylacetat oder Chloroform
6) Farbreaktion:
proteinpositiv gemäß Lowry- oder nach der Mikrobiuret- Methode,
saccharidpositiv mit Phenol-Schwefelsäure oder Anthron- Schwefelsäure
7) Biologische Aktivität:
zytotoxisch bei L 929-Zellen,
zytostatisch bei KB-Zellen,
praktisch frei von Interferonaktivität
8) Stabilität in wässeriger Lösung:
bis zu 60°C stabil bei 30min. Inkubation bei pH 7,2, stabil im pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 bei 16stünd. Inkubation bei 4°C
9) Stabilität bei Kryokonservierung:
stabil bei -10°C über einen Monat und länger und
10) spezifische Aktivität:
10⁶ Einheiten/mg Protein oder darüber.

2. Verfahren zur Herstellung von Lymphokin LK 2 gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch

- Vermehrung von LK 2-produzierenden Humanzellen,
- Inberührungbringen der vermehrten Humanzellen mit einem LK 2-Induktor unter solchen Bedingungen, daß sich eine wesentliche Menge an LK 2 ansammelt und
- Gewinnung des angesammelten LK 2.

3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeich net durch die Vermehrung der LK 2-produzierenden Human zellen in vitro.

4. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeich net durch die Vermehrung der LK 2-produzierenden Human zellen in vivo.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die LK 2-produzierenden Humanzellen erhalten werden durch

- Transplantatieren der Humanzellen in einen nichthumanen Warmblütler,
- Füttern der Tiere, wobei die Humanzellen die Nährflüssig keit des Tierkörpers zu ihrer Vermehrung nutzen und
- Extrahieren und Aufbrechen des im Tierkörper gebildeten Tumors.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4 , dadurch gekennzeichnet, daß die LK 2-produzierenden Humanzellen erhalten werden durch

- Suspendieren der Humanzellen in einer Diffusionskammer, in der die Nährflüssigkeit des nichthumanen Warmblütlers den Humanzellen zugeführt wird,
- Einbetten oder Aufbringen der Kammer in oder auf einen nichthumanen Warmblütler, so daß die Nährflüssigkeit des Tieres den Humanzellen in der Kammer zugeführt wird,
- Füttern der Tiere, wobei die Humanzellen die Nährflüssig keit des Tierkörpers zu ihrer Vermehrung nutzen, und
- Gewinnen der vermehrten Humanzellen aus der Kammer.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der nichthumane Warmblüt ler Geflügel oder ein Säugetier ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in dem nichthumanen Warm blütler die Immunreaktion geschwächt oder unterdrückt worden ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Diffusionskammer mit mindestens einem Membranfilter, Hohlfaser- oder Ultrafilter mit einer nominellen Porengröße von 10^-7 bis 10^-5 m ausge rüstet ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die LK 2-produzierenden Humanzellen Humanleukozyten oder Humanlymphozyten sind.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die LK 2-produzierenden Humanzellen Lymphoblastoidzellen sind.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die LK 2-produzierenden Humanzellen aus der aus Namalwa (ATCC CRL 1432), BALL-1, TALL-1, NALL-1, M-7002, B-7101, JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, EBV-HO, MOLT-3 (ATCC CRL 1552), CCRF-SB (ATCC CCL 120), CCRF-CEM (ATCC CCL 119), BALM-2 und DND-41 bestehenden Gruppe ausgewählt werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Humanzellen in vitro mit dem LK 2-Induktor in Berührung gebracht werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Humanzellen in vivo mit dem LK 2-Induktor in Berührung gebracht werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der LK 2-Induktor ein alpha-Interferon- und/oder gamma-Interferon-Induktor ist.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an einer wirkungsvollen Menge an Lymphokin LK 2 gemäß Anspruch 1, in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln.

17. Tumorhemmende Zusammensetzung nach Anspruch 16.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 17 mit einem LK 2-Gehalt von mindestens 5 Einheiten/g.

19. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18 in Form einer Injektion, eines Augenwassers, einer Salbe, eines Zäpfchens oder Collunarium.

20. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 bis 19 mit einem zusätzlichen Gehalt an einem Chemotherapeutikum.

21. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Chemotherapeu tikum aus der aus Alkylierungsmittel, metabolischem Antago nisten, tumorhemmendem Antibiotikum, Alkaloid und deren Gemischen bestehenden Gruppe ausgewählt wird.

22. Für LK 2 gemäß Anspruch 1 spezifischer monoklonaler Antikörper.

23. Verfahren zur Herstellung des für LK 2 gemäß Anspruch 1 spezifischen monoklonalen Antikörpers, gekennzeichnet durch

- Immunisierung eines nichthumanen Warmblütlers mit LK 2 als Antigen,
- Gewinnung der Antikörper produzierenden Zellen aus dem Tierkörper,
- Fusionierung der Antikörper produzierenden Zellen mit Myelomazellen,
- Selektionierung eines Anti-LK 2-Antikörper produzierenden Klons aus den entstandenen Hybridomazellen,
- Vermehrung des Klons und
- Kultivierung der vermehrten Zellen zur Herstellung des für LK 2 spezifischen monoklonalen Antikörpers.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekenn zeichnet, daß die Antikörper produzierenden Zellen Milzzellen sind.

25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch ge kennzeichnet, daß der nichthumane Warmblütler eine Maus ist.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß gemäß einem der Ansprüche 2 bis 15 hergestelltes LK 2 verwendet wird.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Fusionierung durchge führt wird durch

- Suspendieren der Antikörper produzierenden Zellen mit den Myelomazellen in einer Salzlösung, die eine wirkungs volle Menge eines Zellfusionierungsmittels enthält, und
- Stehenlassen der entstandenen Zellsuspension.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß als Zellfusionsmittel Sendai-Virus oder Polyethylenglykol verwendet wird.

29. Verfahren zur Reinigung von LK 2 gemäß Anspruch 1, gekenn zeichnet durch

- Affinitätschromatographie einer LK 2 und Verunreinigungen enthaltenden Lösung an einer Säule mit immobilisierten Anti-LK 2-Antikörpern und
- Gewinnung der entstandenen LK 2-aktiven Fraktion(en).

30. Verfahren nach Anspruch 29, gekennzeich net durch die Verwendung des gemäß einem der Ansprüche 23 bis 28 hergestellten Anti-LK 2-Antikörpers.