DE69824670T2

DE69824670T2 - Verwendung von Tumor-Cytotoxic-Faktor-II (TCF-II) zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung und/oder Behandlung von strahlungsinduzierten Krankheiten

Info

Publication number: DE69824670T2
Application number: DE69824670T
Authority: DE
Inventors: Yoshio Pittsburgh Arai
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Atlas Pharmaceuticals Inc Sunnyvale Calif Us
Priority date: 1997-07-14
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2018-07-10
Also published as: DK0891778T3; US5998370A; KR100564353B1; AU7417498A; ATE269714T1; KR19990013676A; EP0891778A3; ES2219810T3; DE69824670D1; EP0891778B1; EP0891778A2; ZA986090B; CA2242559A1; AU732053B2; JPH1129493A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel, die Tumor-Cytotoxic-Faktor-II (TCF-II) als wirksame Komponente für die Verhinderung und/oder Behandlung von strahlungsinduzierter Verminderung der Anzahl an weißen Blutkörperchen enthalten. Die vorliegende Erfindung stellt ausgezeichnete Mittel zur Verhinderung und/oder Behandlung von strahlungsinduzierter Verminderung der Anzahl an weißen Blutkörperchen zur Verfügung, die durch Strahlungstherapie verursacht wurden, um Krankheiten wie Krebs und akquiriertes Immundefekt-Syndrom (AIDS) zu behandeln. Diese Mittel sind als medizinische Präparate brauchbar.
Knochenmarksuppression offenbart sich durch die verminderte Anzahl der Plättchen (Thrombozytopenie), die verminderte Anzahl der Leukozyten (Leukopenie) und Anämie. Weil Knochenmarksuppression als direktes Ergebnis von Chemotherapie und Bestrahlungstherapie, die bei Erkrankungen wie Krebs und akquiriertes Immundefekt-Syndrom (AIDS) angewendet werden, vorkommt, wurde dies ein ernstes Problem bei der Behandlung dieser Krankheiten. Gegenwärtig werden nur symptomatische Behandlungen, wie Infusionen von Erythrozyten und Plättchen, angewendet, um Knochenmarksuppression zu behandeln, die durch diese Therapien bei diesen Krankheiten verursacht wurden. Obwohl die Verwendung des Colony-Stimulating-Factor (CSF) zunehmend bei der Erkennung als ein medizinisches Mittel Aufmerksamkeit erlangt, mit dem das Wachstum von Leukozyten stimuliert wird, um deren Anzahl zu erhöhen, ist bis heute noch kein Mittel bekannt, das wirksam Knochenmarksuppression verhindert.
Bisherige Versuche zeigten, daß eine bestimmte Art von biologisch aktiven Substanzen, die aus dem Körper abgeleitet wurden, Knochenmarksuppression verhindert. Beispiele solcher Substanzen schließen Interleukin-1 (IL-1) und Macrophage-Inflammatory-Protein-1a (MIP-1a) ein (G. Damia, Cancer Res., 4082–4089, 52, 1992, B. Lord, Blood, 2605–2609, 79, 1992). Jedoch zeigt IL-1 eine starke entzündliche Wirkung und es wird befürchtet, daß Nebenwirkungen wie Entzündung und Schock einschließlich Kopfschmerz und Fieber verursacht werden (Saito et al. Geka Chiryo (Surgical Therapy), 65, 156–164, 1991). Es gibt außerdem keinen weiteren Bericht über MIP-1a als die bisherigen Untersuchungen.
Als Ergebnis intensiver Untersuchungen und Forschungen nach therapeutischen Mitteln, mit denen strahlungsinduzierte Störungen kontrolliert werden, haben die genannten Erfinder gefunden, daß TCF-II, das als Tumor-Cytotoxic-Faktor bekannt ist, eine ausgezeichnete Wirkung aufweist, um die strahlungsinduzierte Verminderung der Anzahl an weißen Blutkörperchen zu verhindern und zu behandeln. Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mittel bereitzustellen, daß TCF-II als wirksame Komponente enthält, um die strahlungsinduzierte Verminderung der Anzahl an weißen Blutkörperchen zu verhindern und/oder zu behandeln, die durch Strahlungstherapie verursacht wird, die für Behandlungen von Krankheiten, wie Krebs und AIDS, angewendet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel, die TCF-II als wirksame Komponente zur Verhinderung und/oder Behandlung von strahlungsinduzierter Verminderung der Anzahl an weißen Blutkörperchen enthalten, die durch Strahlungstherapie, die zur Behandlung von Krankheiten wie Krebs oder AIDS angewendet wird, verursacht werden. Diese Mittel sind als medizinische Präparate brauchbar.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 veranschaulicht den Effekt von TCF-II bei der Unterdrückung der Abnahme der Anzahl an weißen Blutkörperchen nach Bestrahlung, wie in Beispiel 1, durchgeführt. In 1 wurde ein Lösungsmittel einer Gruppe I (Kontrollgruppe) von Tieren und TCF-II wurde einer Gruppe II von Tieren verabreicht. Ein Symbol * zeigt, daß hier ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen bei p < 0,05 ist.
2 veranschaulicht den Effekt von TCF-II bei der Unterdrückung der Abnahme einer Anzahl an Stammzellen nach Bestrahlung, wie in Beispiel 1, durchgeführt. In 2 wurde ein Lösungsmittel einer Gruppe I (Kontrollgruppe) von Tieren und TCF-II wurde einer Gruppe II von Tieren verabreicht. Ein Symbol * zeigt, daß hier ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen bei p < 0,05 ist.
3 veranschaulicht die Wirkung von TCF-II bei der Unterdrückung Milzatrophie nach Bestrahlung, wie in Beispiel 1 durchgeführt. In 3 wurde ein Lösungsmittel einer Gruppe I (Kontrollgruppe) von Tieren und TCF-II wurde einer Gruppe II von Tieren verabreicht.
TCF-II, die wirksame Komponente der vorliegenden Erfindung, ist ein bekanntes Protein, das aus humanen Fibroblasten gewonnen wird und die folgenden Eigenschaften aufweist:

1. Molekulargewicht (SDS-Gelelektrophorese) unter nicht reduzierten Bedingungen: 78.000 ± 2.000 oder 74.000 ± 2.000 unter reduzierten Bedingungen: 52.000 ± 2.000 (Hauptbande A) 30.000 ± 2.000 (Bande B) 26.000 ± 2.000 (Bande C)
2. Isoelektrischer Punkt: 7,4–8,6

Das oben genannte TCF-II kann durch ein Verfahren erhalten werden, bei dem eine Flüssigkeitskultur humaner Fibroblasten konzentriert und auf einem Ionenaustauscher absorbiert wird und das erhaltene Eluat mittels Affinitätschromatographie (WO 90/10651) oder durch genetische Verfahrenstechniken (WO 92/01053) gereinigt wird.
TCF-II, die wirksame Komponente der vorliegenden Erfindung, kann eine Verbindung sein, die aus humanen Fibroblasten IMR-90 gewonnen wird oder kann eine Verbindung sein, die durch Genrekombination unter Verwendung von Mikroorganismen oder anderen Zellen, die auf der Gensequenz basieren, die in der WO 90/10651 beschrieben ist, hergestellt wird. In alternativer Weise kann eine Verbindung verwendet werden, die durch genetische Verfahrenstechniken, die in der WO 92/01053 offenbart sind, erhalten wird. In allen Fällen kann entweder TCF-II ohne gebundene Zuckerkette oder TCF-II mit verschiedenen gebundenen Zuckerketten, die aus verschiedenen Wirtszellen oder Mikroorganismen hergestellt werden, verwendet werden, aber das TCF-II mit gebundenen Zuckerketten wird bevorzugt. Das so erhaltene TCF-II kann weiter konzentriert und gereinigt sein, wobei bekannte Isolierungs- und Aufreinigungsverfahren verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Präzipitationsverfahren unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels, Aussalzen, Gelfiltration, Affinitätschromatographie mit monoclonalen Antikörpern oder Elektrophorese verwendet werden. Das Verfahren zur Aufreinigung durch Affinitätschromatographie mit einem monoclonalen Antikörper ist in der japanischen Offenlegungsschrift 93/97 offenbart und TCF-II kann mit den darin offenbarten Antikörpern aufgereinigt werden. Gereinigtes TCF-II kann zur Lagerung lyophilisiert oder eingefroren werden. Außerdem kann jede Substanz, die eine ähnliche Aktivität wie TCF-II besitzt, als ein Mittel verwendet werden, das ähnlich dem der vorliegenden Erfindung ist. Zum Beispiel kann Hepatocyt-Wachstumsfaktor (HGF), der sich vom TCF-II Protein in fünf Aminosäuren unterscheidet (Japanische Offenlegungsschrift 88/22526) oder gereinigter Scatter-Faktor (SF, Gherardi und Stocker, Nature, 346, 228, 1990) verwendet werden. Außerdem können die Mittel der vorliegenden Erfindung als ein Zusatz in der Chemotherapie verwendet werden, die ähnlich der Strahlungstherapie Knochenmarksuppression induzieren.
Die Verhinderung und/oder Behandlung von strahlungsinduzierter Abnahme der Anzahl der weißen Blutkörperchen kann durch Gabe des Mittels zur Verhinderung und/oder Behandlung von strahlungsinduzierter Abnahme der Anzahl der weißen Blutkörperchen gemäß der vorliegenden Erfindung durch intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektion durchgeführt werden.
Pharmazeutische Präparate zur Verhinderung und/oder Behandlung von strahlungsinduzierter Abnahme der Anzahl der weißen Blutkörperchen können durch Mischen von pharmazeutischen akzeptablen Trägern oder Verdünnungsmitteln, die gemäß den gewünschten Formen ausgewählt werden, mit dem TCF-II Protein als eine wirksame Komponente hergestellt werden. Diese pharmazeutischen Präparate werden in Übereinstimmung mit bekannten pharmazeutischen Verfahren hergestellt. Wenn nötig, können pH-Wert kontrollierende Mittel, Pufferlösungen, Stabilisatoren oder dergleichen zugegeben werden. Die Dosierung der pharmazeutischen Präparate der vorliegenden Erfindung für Patienten ist nicht speziell begrenzt und kann abhängig sein von der Heftigkeit der Symptome, dem allgemeinen Gesundheitszustand, Alter und Körpergewicht des zu behandelnden Patienten und anderen Bedingungen. Zum Beispiel kann ein pharmazeutisches Präparat, das 0,6 mg bis 600 mg, vorzugsweise 6 mg bis 60 mg reines TCF-II enthält, einem Erwachsenen einmal oder mehrmals pro Tag gegeben werden. Die Konzentration an TCF-II in pharmazeutischen Präparaten kann abhängig von der Menge der Verabreichung bestimmt werden.
Die folgenden Herstellungsbeispiele und Ausführungsformen erklären die vorliegende Erfindung detaillierter. Es ist jedoch selbstverständlich, daß sie nur dem Zweck der Veranschaulichung dienen und nicht den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken.
Herstellungsbeispiel 1
Aufreinigung von TCF-II
Zellen wurden in Übereinstimmung mit dem in der WO 90/10651 offenbarten Verfahren und dem Verfahren von Higashio et al. (Higashio, K. et al., B. B. R. C., Vol. 170, 397–404, 1990) kultiviert, um reines TCF-II zu erhalten. Es wurden dazu 3 × 10⁶ Zellen humane Fibroblasten IMR-90 (ATCC CCL-186) in eine Roller Flasche, die 100 ml DMEM Kulturmedium ergänzt mit 5% Kälberserum enthielt, überführt und für 7 Tage mit einer Roller Geschwindigkeit von 0,5 bis 2 rpm in Kultur genommen. Wenn die gesamte Zelmenge 1 × 10⁷ erreicht hatte, wurde Trypsin zugegeben, um die Zellen abzulösen und die Zellen wurden am Boden der Flasche gesammelt. 100 g sterilisierte 5–9 mesh Keramikpartikel (Toshiba Ceramic) wurden in die Flasche gegeben und die Zellen wurden statisch für 25 Stunden in Kultur genommen. Dann wurden 500 ml des oben genannten Mediums zugegeben und die Inkubation weitergeführt. Das gesamte Medium wurde zurückgewonnen und das Medium wurde frisch in Intervallen von 7 bis 10 Tagen ergänzt. Auf diese Weise wurde die Produktion über 2 Monate weiter geführt, um 4 l Flüssigkeitskultur pro Roller Flasche zu gewinnen. Die spezifische Aktivität der so erhaltenen Flüssigkeitskultur betrug 32 μg/ml. 750 l der Flüssigkeitskultur wurden mittels Ultrafiltration mit einem Membranfilter (MW 6000 cut, Amicon) konzentriert und die Aufreinigung wurde mit einer vierstufigen Chromatographie, d. h. CM Sephadex C-50 (Pharmacia), Con A Sepharose (Pharmacia), Mono S Säule (Pharmacia) und Heparinsepharose (Pharmacia), durchgeführt, um reines TCF-II zu erhalten.
Herstellungsbeispiel 2
Herstellung von rekombinantem TCF-II
Zellen mit einem rekombinanten TCF-II Gen wurden kultiviert, um reines TCF-II in Übereinstimmung mit dem in der WO 92/01053 offenbarten Verfahren zu erhalten. Transformierte Namalwa-Zellen wurden kultiviert, um 20 l Flüssigkeitskultur zur erhalten. Diese Flüssigkeitskultur wurde einer Chromatographie auf CM Sephadex C-50 (Pharmacia), Con-A Sepharose CL-6B (Pharmacia) und HPLC, ausgestattet mit einer Mono S Säule (Pharmacia), unterworfen, um etwa 11 mg reines TCF-II zu erhalten.
Herstellungsbeispiel 3
Herstellung von TCF-II pharmazeutischen Präparaten
Beispiele zur Herstellung von Injektionen, die TCF-II enthielten, die nach den Herstellungsbeispielen 1 und 2 erhalten wurden, sind die folgenden:

(1) TCF-II 20 μg

humanes Serumalbumin 100 mg
Die obigen Bestandteile wurden in Zitronensäure-Pufferlösung pH 6,03 gelöst und das Gesamtvolumen auf 20 ml eingestellt. Die Lösung wurde sterilisiert, in Kolben verteilt (jeweils 2 ml) und dann lyophilisiert, wonach die Kolben versiegelt wurden.

(2) TCF-II 40 μg

Tween 80 1 mg

humanes Serumalbumin 100 mg
Die obigen Bestandteile wurden in einer Salzlösung zur Injektion gelöst und das gesamte Volumen wurde auf 20 ml eingestellt. Die Lösung wurde sterilisiert, in Kolben verteilt (jeweils 2 ml) und dann lyophilisiert, wonach die Kolben versiegelt wurden.

(3) TCF-II 20 μg

Tween 80 2 mg

Sorbitol 4 g
Die obigen Bestandteile wurden Zitronensäure-Pufferlösung pH 6,03 gelöst und das Gesamtvolumen auf 20 ml eingestellt. Die Lösung wurde sterilisiert, in Kolben verteilt (jeweils 2 ml) und dann lyophilisiert, wonach die Kolben versiegelt wurden.

(4) TCF-II 40 μg

Tween 80 1 mg

Glycin 2 g
Die obigen Bestandteile wurden in einer Salzlösung zur Injektion gelöst und das gesamte Volumen wurde auf 20 ml eingestellt. Die Lösung wurde sterilisiert, in Kolben verteilt (jeweils 2 ml) und dann lyophilisiert, wonach die Kolben versiegelt wurden.

(5) TCF-II 40 μg

Tween 80 1 mg

Sorbitol 2 g

Glycin 1 g
Die obigen Bestandteile wurden in einer Salzlösung zur Injektion gelöst und das gesamte Volumen wurde auf 20 ml eingestellt. Die Lösung wurde sterilisiert, in Kolben verteilt (jeweils 2 ml) und dann lyophilisiert, wonach die Kolben versiegelt wurden.

(6) TCF-II 20 μg

Sorbitol 4 g

humanes Serumalbumin 50 mg
Die obigen Bestandteile wurden in Zitronensäure-Pufferlösung pH 6,03 gelöst und das Gesamtvolumen auf 20 ml eingestellt. Die Lösung wurde sterilisiert, in Kolben verteilt (jeweils 2 ml) und dann lyophilisiert, wonach die Kolben versiegelt wurden.

(7) TCF-II 40 μg

Glycin 2 g

humanes Serumalbumin 50 mg
Die obigen Bestandteile wurden in einer Salzlösung zur Injektion gelöst und das gesamte Volumen wurde auf 20 ml eingestellt. Die Lösung wurde sterilisiert, in Kolben verteilt (jeweils 2 ml) und dann lyophilisiert, wonach die Kolben versiegelt wurden.

(8) TCF-II 40 μg

humanes Serumalbumin 50 mg
Die obigen Bestandteile wurden in Zitronensäure-Pufferlösung pH 6,03 gelöst und das Gesamtvolumen auf 20 ml eingestellt. Die Lösung wurde sterilisiert, in Kolben verteilt (jeweils 2 ml) und dann lyophilisiert, wonach die Kolben versiegelt wurden.
Ausführungsbeispiel 1
Wirkung der TCF-II Verabreichung bei Knochenmarksuppression bei bestrahlten Mäusen Ein Cäsium (Cs) 137 Bestrahlungsgerät (J L Shepherd and Associates, San Fernando, CA) wurde für die Bestrahlung verwendet. Die Bestrahlungsdosis betrug 5,5 Gy, was als eine subletale Dosis für die gesamte Körperstrahlung bekannt ist. Eine Woche vor der Bestrahlung wurden 12 Wochen alte weibliche C3H/HeJ Mäuse in zwei Gruppen geteilt. Gruppe I war eine Kontrollgruppe, bei der den Tieren nur Lösungsmittel verabreicht wurde und Gruppe II war eine Versuchsgruppe, bei der 500 μg/kg/Dosis TCF-II pro Tier verabreicht wurden. TCF-II wurde zweimal täglich über eine Woche verabreicht.
Neun Tage nach der Bestrahlung wurde eine Blutprobe genommen und die Anzahl der weißen Blutkörperchen bestimmt. Die Milz-Kolonie Anzahl und das Milzgewicht wurden 10 Tage nach der Bestrahlung bestimmt. 1 zeigt das Ergebnis der Anzahl der weißen Blutkörperchen. Die Anzahl der weißen Blutkörperchen in den Tieren, denen TCF-II gegeben wurde (Gruppe II), war signifikant höher als die bei den Tieren, denen Lösungsmittel (Gruppe I) gegeben wurde, dies weist darauf hin, daß die TCF-II Gabe die Reduzierung der Anzahl der Leukozyten, die durch die Bestrahlung bewirkt wird, unterdrückt. 2 zeigt als nächstes das Ergebnis der Anzahl der Milzkolonie. Die Zahl der intrinsischen Milzkolonien in Tieren, denen TCF-II verabreicht wurde (Gruppe II) war signifikant höher als die der Tiere, denen Lösungsmittel gegeben wurde (Gruppe I), dies weist darauf hin, daß die TCF-II Gabe die Reduzierung der Anzahl der Stammzellen, die durch die Bestrahlung bewirkt wird, unterdrückt. 3 zeigt das Ergebnis der Bestimmung des Gewichts der Milz. Die Gewichte der Milz bei den Tieren, den TCF-II verabreicht wurde (Gruppe II), waren höher als die der Tiere, denen Lösungsmittel gegeben wurde (Gruppe I), dies weist darauf hin, daß die Verabreichung von TCF-II dazu neigt, die Atrophie der Milz, die durch die Bestrahlung bewirkt wird, zu unterdrücken. Die Verabreichung von TCF-II hat die ausgezeichnete Wirkung bei der Unterdrückung von strahlungsinduzierten Störungen, wie der Abnahme der Anzahl der Leukozyten und der Stammzellen und der Atrophie der Milz, die durch die Bestrahlung verursacht werden.
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die vorliegende Erfindung ausgezeichnete Mittel für die Verhinderung und/oder Behandlung von strahlungsinduzierter Abnahme der Anzahl an weißen Blutkörperchen liefert, die durch Bestrahlungstherapie verursacht wird, die angewendet wird, um Erkrankungen wie Krebs und AIDS zu behandeln. Die Mittel sind als medizinische Präparate brauchbar.

Claims

Verwendung von Tumor-Cytotoxic-Faktor-II (TCF-II) zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung und/oder Behandlung von strahlungsinduzierten Krankheiten, bei denen die strahlungsinduzierte Krankheit eine verminderte Anzahl an weißen Blutkörperchen ist.
Verwendung von TCF-II zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung und/oder Behandlung der verminderten Anzahl von weißen Blutkörperchen, die durch Strahlung bewirkt wurde gemäß Anspruch 1, die 0,6 mg bis 600 mg gereinigtes TCF-II in einem pharmazeutischen Präparat enthält.
Verwendung von TCF-II zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung und/oder Behandlung der verminderten Anzahl von weißen Blutkörperchen, die durch Strahlung bewirkt wurde gemäß Anspruch 1, die 6 mg bis 60 mg gereinigtes TCF-II in einem pharmazeutischen Präparat enthält.