DE69829992T2

DE69829992T2 - Methode zur mobilisierung hematopoietischer stammzellen

Info

Publication number: DE69829992T2
Application number: DE69829992T
Authority: DE
Inventors: G. Andrew KING; Yanqiu Qian
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1997-11-26
Filing date: 1998-11-20
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2018-11-21
Also published as: PL340754A1; EP1033997A4; AR016695A1; EP1033997B1; KR20010032511A; EP1033997A1; CN1280503A; ZA9810775B; DE69829992D1; JP2001523727A; ATE293987T1; AU1596299A; CA2311235A1; SA98190913A; ES2239814T3; WO1999026645A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen und ein neues desamidiertes Chemokin.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Alle Mitglieder der Interkrin- oder Chemokinfamilie sind basische heparinbindende Polypeptide, die vier Cysteinreste aufweisen, die zwei Disulfidbrücken bilden. All diese Proteine, die funktionell charakterisiert wurden, scheinen an proinflammatorischen und/oder restorativen Funktionen beteiligt zu sein.
In klinischen Situationen zur Verwendung hochdosierter Chemotherapie ist des Biomolekül der Wahl G-CSF. Allgemein werden in einer solchen Behandlung Patienten mit einer geringen Dosis eines Chemotherapeutikums wie Cyclophosphamid vorbehandelt. Während der Remission wird der Patient mit einem CSF, wie G-CSF behandelt, das schließlich die Mobilisierung von Zellen aus dem Knochenmark in den peripheren Kreislauf zum Ernten von leukophoresiertem Blut verursacht. Dem Patienten wird danach eine hohe Dosis von Chemotherapie verabreicht, um die klinische Remission des Krebses zu induzieren. Das resultierende Knochenmarkversagen wird durch Infusion der gelagerten Blutzellen behandelt, die zuvor gesammelt wurden. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, zum Beispiel durch die Auslassung der anfänglichen Dosis von Chemotherapie und/oder wechselnde Blutentnahmeprotokolle.
Obwohl die Verwendung dieser hämatopoetischen Stammzell-Transplantationstechniken vielversprechend aussieht, sind multiple Aphereseverfahren erforderlich, um ausreichend Stammzellen zur erfolgreichen Aufpfropfung zu ernten, um eine schwere Myelosuppression zu behandeln, wenn G-CSF allein verwendet wird [siehe z.B. Bensinger et al., Blood, 81:3158 (1993) und R. Haas et al., Sem. in Oncology, 21:19 (1994)]. Deshalb bleibt trotz dieser signifikanten Fortschritte und der Verfügbarkeit bestimmter regulatorischer Biomoleküle die verzögerte Erholung der Hämatopoese eine bedeutende Quelle für Morbidität und Mortalität bei myelosupprimierten Patienten.
WO 97/15595 offenbart ein Verfahren zur Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen durch Verabreichung unter anderem bestimmter modifizierter Formen von groβ.
Es besteht ein fortgesetzter Bedarf auf diesem Gebiet nach Zusammensetzungen und Verfahren zur Steigerung der hämatopoetischen Erholung, insbesondere in Fällen von mit Chemotherapie verbundener Myelosuppression.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINGUNG
In einem Aspekt sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung einer neuen desamidierten Form eines modifizierten groβ (Aminosäuren 5-73 aus SEQ ID NO:3), das am Rest 69 desamidiert ist und nützlich zur Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen ist, in der Herstellung eines Medikaments zur Stimulation von hämatopoetischen Stammzellen und Multimere davon vor.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen in einem Tier bereit, umfassend das Verabreichen einer effektiven Menge eines modifizierten oder multimeren groβ-Chemokins wie hier beschrieben an ein Tier.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine neue desamidierte Form eines modifizierten groβ bereit (Aminosäuren 5-73 aus SEQ ID NO:3), das am Rest 69 desamidiert ist und nützlich zur Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen ist.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden weiter in der folgenden ausführlichen Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
2 ist ein Diagramm, das die Wirkung von modifiziertem groβ (Aminosäuren 5-73 aus SEQ ID NO:3) im Mobilisierungstest mit einzelnem Mittel aus Beispiel 1 (Vergleichsbeispiel) zeigt.
3 ist ein Balkendiagramm, das den Vergleich von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), IL-8, groβ (Aminosäuren 1-73; SEQ ID NO:3) und modifiziertem groβ (Aminosäuren 5-73 aus SEQ ID NO:3) im Mobilisierungstest mit einzelnem Mittel zeigt (Beispiel 1 – Vergleichsbeispiel).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Behandlung von Myelosuppression durch Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark in das periphere Blut unter Verwendung von hier beschriebenen modifizierten oder multimeren groβ-Chemokinen bereit.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine neue desamidierte Form eines trunkierten groβ (Aminosäuren 5-73 aus SEQ ID NO:3), desamidiert am Rest 69, eine pharmazeutische Zusammensetzung davon und ihre Verwendung in der Behandlung von Myelosuppression bereit.
Die Desamidierung erfolgt in Position 69 (unter Verwendung der 1-73-Nomenklatur zur Definition des groβ voller Länge). Die Desamidierung bildet die α- oder β-isomeren Aspartatprodukte: Asparaginsäure und Isoasparaginsäure.
Diese desamidierte Form hat überraschend die Beibehaltung der Mobilisierungsaktivität des trunkierten Stamm-groβ (5-73) gezeigt. Dies war unerwartet, da andere Peptide Aktivität verloren, wenn das Asn zu einem Asp oder Iso-Asp verändert wurde (Bongers et al., Int. J. Pept. Protein Res. 1992, Apr.; 39(4): 364-74; Friedmen et al., Int. J. Pept. Protein Res. 1991 Jan.; 37(1) 14-20). Das desamidierte (Position 69) trunkierte groβ (Aminosäuren 5-73 aus SEQ ID NO:3) allein und in einer Mischung mit dem nicht-desamidierten trunkierten groβ-Stammprotein kann ebenfalls zur Behandlung von Myelosuppression durch Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark in das periphere Blut verwendet werden.
I. Definitionen
Wie hier verwendet, bezeichnet "hämatopoetischer synergistischer Faktor" oder "HSF" eine Klasse von Proteinen, einschließlich der natürlich vorkommenden Chemokine und modifizierten Chemokine, die durch synergistische Aktivität in der Stimulation der Hämatopoese bei Verabreichung in vivo und in vitro mit einem anderen hämatopoetischen Faktor, wie ein koloniestimulierender Faktor, oder kombiniert mit natürlich zirkulierenden CSFs gekennzeichnet sind.
Der Begriff "reife Chemokine", ebenfalls bekannt als "Interkrine", wie hier verwendet, definiert die herkömmlich auf diesem Gebiet als KC, groα, groβ und groγ bezeichneten Proteine. Der Zweckmäßigkeit halber wird die Aminosäuresequenz des murinen Proteins KC, das 72 Reste enthält, in SEQ ID NO:1 bereitgestellt. Diese Sequenzen sind erhältlich aus Genbank, Eingangsnummer J04596. Die Sequenzen des humanen Proteins groα (Aminosäuren 1-73) sind in SEQ ID NO:2 bereitgestellt. Die Sequenzen des humanen Proteins groβ (Aminosäuren 1-73) sind in SEQ ID NO:3 bereitgestellt. Die Sequenzen des humanen Proteins groγ sind in SEQ ID NO:4 bereitgestellt. Die cDNA und Aminosäuresequenzen von groγ werden ebenfalls in der interna tionalen Patentanmeldung WO 92/00326 (9. Jan. 1992) bereitgestellt. Diese groγ-Sequenzen wurden ferner in WO 94/29341 veröffentlicht (22. Dezember 1994).
Die modifizierten Chemokine der vorliegenden Erfindung stammen aus groβ. Die modifizierten Chemokine schließen Desaminoproteine ein, die durch Eliminierung der ersten vier Aminosäuren am Amino-(N-)-Terminus gekennzeichnet sind. Gegebenenfalls können die in dieser Erfindung nützlichen Chemokine, insbesondere wenn sie rekombinant exprimiert werden, ein inseriertes N-terminales Met enthalten. Das N-terminale Methionin, das in das Protein für Expressionszwecke inseriert wird, kann entweder während der Reifung des Proteins durch eine Wirtszelle oder synthetisch unter Verwendung bekannter Techniken gespalten werden. Alternativ, falls gewünscht, kann diese Aminosäure durch Enzymverdau oder andere bekannte Mittel gespalten werden.
Mit dem Begriff "multimeres Protein" oder "Multimer" sind hier multimere Formen der modifizierten Proteine gemeint, die in dieser Erfindung nützlich sind, zum Beispiel Dimere, Trimere, Tetramere und andere aggregierte Formen. Solche multimeren Formen können durch Synthese oder rekombinante Expression hergestellt werden und können Chemokine enthalten, die durch eine Kombination von synthetischen und rekombinanten Techniken wie nachfolgend beschrieben erzeugt werden. Multimere können sich bei Expression natürlich bilden oder können zu solchen multiplen Formen konstruiert werden. Multimere Chemokine können Multimere des gleichen modifizierten Chemokins einschließen. Ein anderes Multimer kann durch die Aggregation unterschiedlicher modifizierter Proteine gebildet werden. Noch ein anderes Multimer wird durch die Aggregation eines modifizierten Chemokins dieser Erfindung und eines bekannten reifen Chemokins gebildet. Bevorzugt würde ein in der Erfindung nützliches Dimer oder Multimer wenigstens ein desamidiertes Desaminochemokinprotein der Erfindung und wenigstens ein anderes Chemokin oder ein anderes Protein enthalten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es den gleichen Typ biologischer Aktivität besitzt. Dieses andere Protein kann ein zusätzliches Desaminochemokin oder ein anderes bekanntes Protein sein.
II. In der Erfindung nützliche Proteine
Allgemein schließen die in dem Verfahren der Erfindung nützlichen Chemokine das modifizierte groβ (Aminosäuren 5-73 aus SEQ ID NO:3), das am Rest 69 desamidiert ist, und daraus stammende multimere Proteine ein.
Chemokine und modifizierte Chemokine, die in solchen Multimeren eingeschlossen sein können, werden im Detail in WO 94/29341 beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform verwendet das Verfahren der Erfindung ein desamidiertes Desaminochemokinprotein der Erfindung. Bevorzugt ist das Verfahren der Erfindung das desamidierte Desamino-groβ, das die Proteinsequenz aufweist, die die Aminosäuren 5 bis 73 aus SEQ ID NO:3 umspannt, worin die Aminosäure in Position 69 zu Iso-Asparaginsäure oder Asparaginsäure desamidiert wurde, oder eine Mischung aus desamidierten und nicht-desamidierten Desamino-groβ-umspannenden Aminosäuren 5 bis 73 aus SEQ ID NO:3.
Wie in WO 94/29341 beschrieben, können ähnliche Modifikationen an KC-, groα- und groγ-Proteinen vorgenommen werden, die nützlich in den Verfahren der Erfindung sind. Diese Proteine werden alle in der Literatur beschrieben und sind den Fachleuten bekannt.
Bevorzugte multimere Proteine, die in dieser Erfindung nützlich sind, schließen Dimere oder Multimere ein, die wenigstens ein desamidiertes Desaminochemokin-groβ-Protein der Erfindung und wenigstens ein anderes Chemokin oder ein anderes Protein enthalten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es den gleichen Typ biologischer Aktivität aufweist. Dieses andere Protein kann ein zusätzliche Desaminochemokin oder ein anderes bekanntes Protein sein. Zum Beispiel umfaßt ein wünschenswertes Dimer, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, zwei Desaminoproteine wie oben beschrieben, die bevorzugt durch Disulfidbindungen verbunden sind. Ein wünschenswertes Multimer kann ein Aggregat aus zwei oder mehr Desamino-groβ-Proteinen sein, insbesondere aus zwei Proteinen, die aus den Aminosäuren 5-73 aus SEQ ID NO:3 bestehen. Alternativ kann ein anderes Dimer der Erfindung ein desamidiertes Desamino-groβ-Protein der Erfindung in Kombination mit einem reifen groβ-Protein sein. In ähnlicher Weise können verschiedene Kombinationen aus Dimeren oder anderen multimeren Formen eine Kombination aus dem modifizierten desamidierten groβ und anderen Chemokinen, wie die KC-, groα- und groγ-Proteine, enthalten. Zum Beispiel kann ein desamidiertes Desamino-groβ-Protein der Erfindung ein Dimer mit einem unmodifizierten reifen groα-Protein bilden. Ein Fachmann kann andere wünschenswerte Multimere unter Verwendung der modifizierten desamidierten Chemokine der Erfindung erhalten. Jedoch ist die Verwendung multimerer Formen aus zwei oder mehr unterschiedlichen modifizierten Proteinen wie hier definiert nützlich im Verfahren dieser Erfindung. Das in diesem Verfahren eingesetzte Chemokin kann ebenfalls eine multimere Form eines desamidierten modifizierten Chemokins wie oben erörtert und eines anderen bekannten reifen Proteins sein.
Diese Proteine und Monomere wurden im Detail in der Literatur beschrieben und können unter Verwendung herkömmlicher Techniken und/oder der in WO 94/29341 beschriebenen Techniken synthetisiert oder rekombinant hergestellt werden.
III. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Wünschenswert werden die modifizierten oder multimeren desamidierten groβ-Chemokine, die im Verfahren der Erfindung nützlich sind, in der Herstellung von Medikamenten verwendet und/oder sind nützlich in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung. So können die Chemokine zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert und in der gleichen Weise verabreicht werden, wie es zum Beispiel in WO 90/02762 (22. März 1990) und WO 94/29341 (22. Dezember 1994) beschrieben wird.
Diese Medikamente oder pharmazeutischen Zusammensetzungen, die in der Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen nützlich sind, enthalten eine therapeutische effektive Menge eines desamidierten modifizierten oder multimeren Chemokins wie hier definiert und einen annehmbaren pharmazeutischen Träger. Wie hier verwendet, schließt der Begriff "pharmazeutisch" tierärztliche Anwendungen der Erfindung ein.
Der Begriff "therapeutisch effektive Menge" bezeichnet die Menge eines Chemokins, ob in monomerer oder multimerer Form, die nützlich zur Mobilisierung von Stammzellen in ausreichenden Mengen ist, um die gewünschte physiologische Wirkung zu erreichen.
Allgemein wird ein desamidiertes modifiziertes Desaminochemokin, das in der Erfindung nützlich ist, in einer Menge von ca. 0,01 ng/kg Körpergewicht bis ca. 100 mg/kg Körpergewicht und bevorzugt von ca. 0,01 ng/kg Körpergewicht bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Dosis verabreicht. Wünschenswert enthält das Medikament oder die Zusammensetzung, wenn ein multimeres Chemokin im Verfahren der Erfindung verwendet wird, Mengen des multimeren Proteins am unteren Ende dieses Bereich. Bevorzugt werden diese pharmazeutischen Zusammensetzungen an menschliche oder andere Säugetierpatienten durch Injektion verabreicht. Jedoch kann die Verabreichung auf jedem angemessenen internen Weg erfolgen und kann nach Bedarf wiederholt werden, zum Beispiel ein- bis dreimal täglich für 1 Tag bis ca. eine Woche.
Geeignete pharmazeutische Träger sind den Fachleuten allgemein bekannt und können leicht ausgewählt werden. Derzeit ist der bevorzugte Träger Kochsalzlösung. Gegebenenfalls können die pharmazeutischen Assays der Erfindung andere aktive Bestandteile enthalten oder können in Verbindung mit anderen Therapeutika verabreicht werden. Geeignete optionale Bestandteile oder andere Therapeutika schließen diejenigen ein, die herkömmlich zur Behandlung von Zuständen dieser Natur sind, zum Beispiel u.a. andere entzündungshemmende Mittel, Diuretika und Immunsuppressiva. Wünschenswert sind diese modifizierten Chemokine besonders gut geeignet zur Verabreichung in Verbindung mit koloniestimulierendem Faktor.
IV. Verfahren zur Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen
Die Erfindung stellt verbesserte Verfahren zur Behandlung von Zuständen bereit, die durch Immunsuppression oder geringe Zahlen von hämatopoetischen Stammzellen und daraus differenzierten Zellen gekennzeichnet sind, einschließlich (ohne Beschränkung) Entzündung, Fieber, virale, pilzliche und bakterielle Infektionen, Krebs, myelopoetische Dysfunktion, Hämatopoese-Störungen, aplastische Anämie und Autoimmunkrankheiten, und von Zuständen, die durch eine geringe Erzeugung und/oder Differenzierung von hämatopoetischen und/oder Knochenmarkzellen gekennzeichnet sind. Dieses Verfahren beinhaltet das Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung an ein ausgewähltes Säugetier. Bevorzugt wird diese Zusammensetzung zusammen mit einem koloniestimulierenden Faktor verabreicht oder enthält diesen. Geeignete Quellen für koloniestimulierenden Faktor sind allgemein bekannt und schließen zum Beispiel natürliches, synthetisches und rekombinantes GM-CSF, M-CSF, G-CSF und IL-3 ein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann ein in der Erfindung nützliches Desaminochemokin in vivo verabreicht werden und darf synergistisch mit den natürlichen koloniestimulierenden Faktoren wirken, die in einem ausgewählten Patienten gefunden werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform verwendet das Verfahren der Erfindung die hier beschriebenen desamidierten Desaminochemokine in Verbindung mit GM-CSF (oder G-CSF). Die Verwendung eines modifizierten Chemokins, wie zum Beispiel eines desamidierten Desamino-groβ, oder einer Mischung von desamidiertem Desamino-groβ und Desamino-groβ, gemäß dem Verfahren der Erfindung in Kombination mit G-CSF (es wurde beobachtet, daß diese Kombination Synergie aufweist), erlaubt die Verabreichung geringerer Dosen von G-CSF an einen Patienten, was die äußerst unangenehmen Nebenwirkungen reduziert, die durch GM-CSF (G-CSF) verursacht werden.
Die im Verfahren der Erfindung nützlichen desamidierten modifizierten oder multimeren Chemokine sind durch die Fähigkeit zur Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen bei alleiniger Verabreichung gekennzeichnet, oder dadurch, daß sie eine synergistische Aktivität in der Stimulation der Hämatopoese besitzen, wenn sie in vivo und in vitro mit einem anderem hämatopoetischen Faktor verabreicht werden, zum Beispiel mit einem koloniestimulierenden Faktor oder einem Wachstumsfaktor, oder bei Kombination mit natürlich zirkulierenden CSFs oder bei Verabreichung in einem Protokoll mit Chemotherapie.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen in einem Tier durch Verabreichung einer effektiven Menge eines modifizierten Proteins, das aus humanem groβ-Chemokin (SEQ ID NO:3) stammt, das am Rest 69 desamidiert ist, an ein Tier bereit.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen in einem Tier bereit, umfassend das Verabreichen einer effektiven Menge eines multimeren Proteins, das eine Assoziation wenigstens eines desamidierten modifizierten groβ-Chemokins wie oben beschrieben und eines zweiten Chemokins umfaßt, an ein Tier.
In der Durchführung des Verfahren zur Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen kann der Begriff "effektive Menge" dieser Proteine als die Menge definiert werden, die bei Verabreichung an einen Patienten durch geeignete Mittel hämatopoetische Stammzellen mobilisiert und die Anzahl von hämatopoetischen Stammzellen im peripheren Blut erhöht. Es wird erwartet, daß diese Menge höher als die Menge ist, die zur Stimulierung des Wachstums oder der Entwicklung von hämatopoetischen Vorläuferzellen erforderlich ist. Die effektive Menge erhöht im Kreislauf die Zellen, die aus den hämatopoetischen Stammzellen in anwendbaren klinischen oder tierärztlichen Situationen differenziert werden. Eine wünschenswerte effektive Menge kann ca. 0,01 ng/kg bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Dosis sein.
Geeignete Mittel der Verabreichung zur Mobilisierung von Stammzellen schließen ohne Beschränkung die Bolusinjektion oder inkrementelle Verabreichung der effektiven Menge durch Injektion, intravenösen Tropf oder jeden anderen angemessenen internen Weg, einschließlich subkutaner Injektion, ein. Dosierungen können nach Bedarf wiederholt werden, zum Beispiel 1- bis 3-mal täglich für 1 Tag bis ca. eine Woche.
Zusätzlich kann das Verfahren dieser Erfindung, das die oben identifizierten desamidierten modifizierten oder multimeren Chemokine einsetzt, in Transplantationsschemata für hämatopoetische Stammzellen in peripherem Blut verwendet werden. Zum Beispiel werden im Anschluß an eine optionale Anfangsdosis eines Chemotherapeutikums die oben identifizierten desamidierten modifizierten oder multimeren Chemokine anstelle der jetzt verwendeten CSFs verabreicht, um hämatopoetische Stammzellen aus dem Knochenmark zum peripheren Kreislauf zur Ernte sowie zur erneuten Verabreichung im Anschluß an hohe Dosen von Chemotherapie zu mobilisieren. Geeignete Chemotherapeutika schließen ohne Beschränkung die allgemein bekannten Mittel ein, wie Cyclophosphamid, Cisplatin, ARA-C, 5-Fluorouracil, Etopsid, Epirubicin, Carboplatin, Busulfan, Mitoxantron und Carmustin. Bei Verabreichung mit den erfindungsgemäßen Chemokinen sind die Mengen der Chemotherapeutika die herkömmlich eingesetzten Mengen, d.h. ca. 1,2 g/m² Etopsid, 800 mg/m² ARA-C, 200 mg/kg Cyclophosphamid, etc. Siehe für solche Dosierungen Hass et al., Seminars in Oncol. 21:19-24 (1994), hier durch Verweis eingeführt.
Die oben identifizierten neuen Chemokine können verwendet werden, um die herkömmlich verwendeten CSFs in Behandlungsschemata zu ergänzen. Alternativ können die oben identifizierten Chemokine in Kombinationstherapien mit anderen hämatopoetischen regulatorischen Biomolekülen, wie mit den oben bezeichneten, an der Hämatopoese beteiligten Molekülen, oder mit Wachstumsfaktoren, herkömmlichen Pharmazeutika und/oder Wirkstoffen für die gleichen Zwecke verwendet werden. Geeignete Quellen für solche Wachstumsfaktoren sind allgemein bekannt und schließen ohne Beschränkung natürliches, synthetisches und rekombinantes GM-CSF, G-CSF, Stammzellfaktor und Flt-3-Ligand ein. Andere geeignete Biomoleküle schließen (S)-5-Oxo-L-proly-a-glutamyl-L-a-aspartyl-N⁸-(5-amino-1-carboxypentyl)-8-oxo-N⁷-[N-{N-(5-oxo-L-prolyl)-L-a-glutamuyl}-L-a-aspartyl]-L-threo-2,7,8-triaminooctanoyl-lysin ((pGlu-Glu-Asp)₂-Sub-(Lys)₂)[Pelus et al., Exp. Hematol. 22: 239-247 (1994)] ein.
Noch weitere Pharmazeutika und Wirkstoffe zur Koverabreichung können leicht durch einen Fachmann ausgewählt werden.
Die Vorteile der Verwendung dieser Erfindung als Austausch oder in Verbindung mit herkömmlichen Verfahren zur hämatopoetischen Stammzelltransplantation in peripherem Blut bestehen darin, daß eine schnellere Erholung von PMNs und/oder Blutplättchen auftritt als bei der Knochenmarktransplantation, das Infektionsrisiko reduziert ist und das Verfahren die Verabreichung potentiell höherer Heilungsdosen von Chemotherapie oder einer Reihe von dosisintensivierter Chemotherapie erlaubt.
Die folgenden Beispiele sind nur illustrativ und beschränken nicht den Umfang der Erfindung. Beispiele 1 bis 3 sind Vergleichsbeispiele; Beispiele 4-5 sind Beispiele für Ausführungsformen der Erfindung.
BEISPIEL 1 – Mobilisierungsassay (Vergleichsbeispiel)
Aus KC [SEQ ID NO:1], groβ [SEQ ID NO:3] und groγ [SEQ ID NO:4] stammende Chemokine, einschließlich modifizierter und multimerer Chemokine, werden unter Verwendung bekannter Techniken hergestellt. Siehe z.B. WO 94/29341 für eine zusätzliche Diskussion in bezug auf die Herstellung solcher Chemokine. Diese Chemokine werden auf die Fähigkeit zur Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen in Mäusen untersucht. Jedes Chemokin wird in Konzentrationen von 50, 10 und 2 μg/Maus getestet und über den subkutanen, intramuskulären, intraperitonealen, intravenösen oder oralen Weg verabreicht. Die Kinetik der Chemokinmobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen wird in 15-minütigen Intervallen über einen Zeitraum von 60 Minuten überwacht, indem Blutproben durch Herzpunktion aus den Mäusen entnommen werden. Die mobilisierten hämatopoetischen Stammzellen werden durch Trennung über einem Lympholyte-M^®-Dichtegradienten fraktioniert und gesammelt. Zellen werden zur zukünftigen Verwendung gewaschen.
Reife Blutzellelemente werden unter Verwendung eines Technicon^®-HI-Hämatologieanalysators, der mit tierärztlicher Software ausgerüstet ist, gezählt. Die Mobilisierung von reifen inflammatorischen Zellen, wie polymorphonukleäre (PMN) Zellen, Eosinophile und Basophile, werden bei der Auswertung des gesamten potentiellen inflammatorischen Profils berücksichtigt.
Zur Überwachung früher und später hämatopoetischer Vorläuferzellen wird ein CFU-GM-Assay durchgeführt, d.h. Blutproben die während der Mobilisierungsphase gesammelt wurden, werden auf koloniebildende Einheiten (CFU-GM) an den Tagen 7 und 14 getestet. Die Zellen werden auf 10⁶ Zellen/ml in McCoy-Medium ohne Serum eingestellt. Ein Einzelschicht-Agarsystem, das aus McCoy-Medium besteht, angereichert mit Nährmitteln (NaHCO₃, Pyruvat, Aminosäuren, Vitamine und HEPES-Puffer), 0,3 % Bacto-Agar und 15 % fötales Rinderserum, wird verwendet. Zellen aus den Blutproben (Endkonzentration 10⁵ Zellen/ml) werden zum Agarsystem hinzugegeben. Die Agarplatten werden bei 37°C, 7,5 % CO₂ für 7-14 Tage inkubiert. Kolonien aus sich vermehrenden Zellen (CFU-GM) werden unter Verwendung eines Mikroskops gezählt.
Zusätzlich werden frühe hämatopoetische hochproliferative potentielle (HPP) Vorläufer in den CFU-Kulturen am Tag 14 gezählt.
Das Chemokin IL-8, das hämatopoetische Stammzellen als ein einzelner Faktor mobilisiert, wird in diesen Studien als Positivkontrolle eingeschlossen.
Vorläufige Experimente haben gezeigt, daß die Verabreichung von groβ [SEQ ID NO:3] zu einer dosisabhängigen Mobilisierung von CFU-GM führt, ähnlich den Ergebnissen mit der Kontrolle. Modifiziertes groβ, das Protein aus groβ mit N-terminaler Trunkierung von 4 Aminosäuren (Aminosäuren 5-73), mobilisierte signifikant höhere Zahlen von hämatopoetischen Vorläuferzellen als groβ (Aminosäuren 1-73) oder IL-8. Keine signifikanten Veränderungen (>3-fach) in reifen Zellelementen wurden in mit groβ behandelten Mäusen beobachtet, was eine spezifische Mobilisierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen nahelegt. Dieses Ergebnis zeigt, daß die modifizierten Desaminochemokine gesteigerte Mobilisierungseigenschaften im Vergleich zu den reifen Proteinen aufweisen können.
BEISPIEL 2 – Mobilisierungsassay in Kombination mit blutbildenden Stimulantien (Vergleichsbeispiel)
Blutbildende Stimulantien werden in Kombination mit den oben als Mobilisierungsfaktor identifizierten Chemokinen getestet. Die blutbildenden Stimulantien schließen G-CSF, GM-CSF, (5)-5-Oxo-L-prolyl-a-glutamyl-L-a-aspartyl-N⁸-(5-amino-1-carboxypentyl)-8-oxo-N⁷-[N-{N-(5-oxo-L-prolyl)-L-a-glutamuyl}-L-a-aspartyl]-L-threo-2,7,8-triaminooctanoyl-lysin [(p-Glu-Glu-Asp)₂-Sub-(Lys)₂] [Pelus, oben zitiert] und FLT-3-Ligand ein. Jedes G-CSF-Mimetikum, d.h. ein blutbildendes Stimulanz, das nicht ein CSF-artiges G-CSF oder GM-CSF ist, aber hämatopoetische Aktivität besitzt, kann verwendet werden.
In Kombinationsassays wird das blutbildende Stimulans, z.B. G-CSF, mit 50 μg/kg an Mäuse 4 Tage vor den Chemokinen oder modifizierten oder multimeren Chemokinen verabreicht, die aus KC [SEQ ID NO:1], groβ [SEQ ID NO:3] und groγ [SEQ ID NO:4] stammen. Sie in Beispiel 1 wird die Dosis des Chemokins und der Zeitpunkt der Blutentnahme variiert.
Ein CFU-GM-Assay wird wie oben in Beispiel 1 beschrieben mit CSF, IL-1 und GM-CSF als Quelle für koloniestimulierende Aktivität durchgeführt. Reife Blutzellelemente, frühe und spätere Vorläufer werden wie für Beispiel 1 gemessen.
Kombinationsuntersuchungen mit Vorbehandlung durch blutbildendes Stimulans verwendet MIP-1α als Positivkontrolle.
BEISPIEL 3 – Stammzelltransplantationsmodell aus murinem peripheren Blut (Vergleichsbeispiel)
A. Mobilisierung von "Primitive Long Term Repopulating" Stammzellen
Das folgende Experiment wurde in einem Stammzell-Transplantationsmodell in vivo durchgeführt um zu bestimmen, ob N-terminal trunkiertes groβ [Aminosäuren 5-73 aus SEQ ID NO:3, bezeichnet als groβ-T] "primitive long term repopulating"-Stammzellen mobilisiert. In diesem Modell sind gamma-bestrahlte Mäuse Empfänger von Knochenmarkzellen. Die Mäuse werden für 100 Tage auf Überleben verfolgt.
Die Fähigkeit von Blutstammzellen, gesammelt aus Mäusen, die mit entweder PBS, groβ-T (50 μg mit 15-30 min), G-CSF (1 μg/Maus 2-mal täglich × 4) oder G-CSF und dann groβ-T behandelt wurden, zur Rettung ansonsten letal bestrahlter Mäuse. Mononukleäre Blutzellen (bis zu 10⁶), gesammelt aus PBS-behandeltem Mäuseprotein 0-10 % der Mäuse 100 Tage nach der Transplantation. Mäuse, die Markzellen als Positivkontrolle des Assays erhielten, waren zu 100 % überlebend am Tag 100. Mobilisierte Blutzellen (10⁶ Zellen/Maus), gesammelt aus mit groβ-T allein behandelten Mäusen, schützte 70 % der Empfänger. Mobilisierte Blutzellen (10⁶ Zellen/Maus), gesammelt aus G-CSF-behandelten Donoren, schützte 80 % der Empfänger. Mobilisierte Blutzellen, gesammelt aus mit G-CSF und groβ-T behandelten Donoren, mobilisieren größere Zahlen von wiederbesiedelnden Zellen als G-CSF alleine.
B. Mobilisierung von Stammzellen aus peripherem Blut
Die Rate, mit der durch groβ-T mobilisierte Stammzellen aus peripherem Blut reife Blutzell-Abstammungslinien in einem bestrahlten Wirt erholten, wurde ausgewertet. 10⁶ periphere Blutzellen geringer Dichte (LDPBC) wurden in bestrahlte Empfänger injiziert und das Blut durch Herzpunktion an den Tagen 7 bis 19 nach der Bestrahlung entnommen. LDPBC aus den unterschiedlichen Gruppen wurden unter optimalen Bedingungen für die CFU-GM-Mobilisierung aufgefangen. Die in diesem Experiment verglichenen Gruppen waren PBS, groβ-T allein (50 μg, 15 min), G-CSF (2-mal täglich × 5 Tage, 1 μg/Maus allein) und groβ-T + G-CSF. Normalen Mäusen wurde Blut täglich zum Vergleich mit den transplantierten Tieren entnommen.
Mäuse, die ein Transplantat aus PBS-behandelten Donoren erhielten, versagten in der Erholung von reifen Blutzellelementen und starben. Die Rate der Neutrophilerholung in den Mäusen, die durch trunkiertes groβ mobilisierte Zellen erhielten, war schneller als bei denjenigen, die G-CSF- mobilisierte Zellen erhielten. Mäuse, denen durch die Kombination aus groβ-T + G-CSF mobilisiertes LDPBC transplantiert wurde, führten zu einer schnelleren Neutrophilerholungsrate als bei groβ-T-mobilisierten Zellen.
Die Erholung der Blutplättchenzahlen in den gleichen Mäusen folgte dem gleichen Muster: groβ-T + G-CSF > groβ-T > G-CSF >> PBS. Jedoch sind am Tag 19 die Blutplättchenzahlen noch weit davon entfernt, zu normalen Werten zurückzukehren. Diese Daten weisen darauf hin, daß groβ-T-mobilisierte Blutstammzellen in Empfängermäuse eintransplantieren mit resultierenden Neutrophil- und Blutplättchenerholungsraten, die gleich oder besser als bei G-CSF-mobilisierten Stammzellen sind.
BEISPIEL 4 – Herstellung von groβ-T und desamidiertem groβ-T
(Beispiel der Erfindung)
Expression von groβ-T
groβ-T wurde intrazellulär in E. coli unter Verwendung von LW14-Wirtsstamm und eines Expressionsvektors (pEAHy) exprimiert. Die Expression wurde durch den Phagen-lamda-PL-Promotor auf dem Vektor und einen temperaturempfindlichen cI857-Repressor kontrolliert. Die Expression wird durch eine Temperaturverschiebung der wachsenden Zellen induziert. Das induzierte Protein befand sich im unlöslichen Zelllysat-Pellet. Aus 10 1 Fermentation geerntete Zellen wurden auf -70°C eingefroren.
Zelllyse, Neufaltung und Reinigung von groβ-T
Eingefrorene Zellen wurden in 20 mM Natriumcitratpuffer, pH 6,0, der 40 mM NaCl und 2 mM EDTA enthielt, dispergiert (10 ml/g Zellen) und durch zwei Passagen durch einen Microfluidics M110Y oder Gaulin mit 11 000 psi lysiert. Das Lysat wurde mit 10 000 g für eine Stunde bei 4°C zentrifugiert. Das gesamte groβ-T befand sich im Pellet, und der Lysatüberstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 2M Guanidin-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,0 für 2 Stunden bei 25°C solubilisiert (2 ml/g Zellen). Die Lösung wurde in einem gleichen Volumen Wasser verdünnt, und unlösliches Material wurde durch Zentrifugieren mit 15 000 g für eine Stunde entfernt. Zur Umwandlung des gesamten groβ-T zur reduzierten Form wurde der Überstand auf 20 mM DTT eingestellt und für 2 Stunden bei 25°C inkubiert. Die Lösung wurde auf 10 ml/g Zellen mit 5 mM HCl verdünnt, was zu einer Feststoffausfällung führte. Die Ausfällung (enthielt kein groβ-T) wurde durch Zentrifugieren mit 25 000 g für eine Stunde entfernt. Der klare Überstand wurde gegen 5 mM HCl dialysiert (3 K) oder diafiltriert (Filtron 3 K-Kante). Das reduzierte groβ-T in 5 mM HCl wurde mit 2 M Trizma-Base auf pH 7,5 neutralisiert und auf 1 mM Cysteamin, 0,2 mM Cystamin und 1 mM EDTA eingestellt. Rückoxidation wurde für 2 Stunden bei 25°C erlaubt. Die Lösung wurde mit 1 M HCl auf pH 6,5 eingestellt und auf eine Toyopearl SP 650 M-Säule aufgetragen (2 ml Harz/g Zellen), die mit 50 mM Mes pH 6,5 äquilibriert worden waren (Puffer A). Die Säule wurde mit 5 Säulenvolumina von Puffer A und dann mit 5 Säulenvolumina von 22 % von Puffer B (1 M NaCl in Puffer A) gewaschen. groβ-T wurde mit 35 % von Puffer B mit >95 % Reinheit eluiert. Die Sammlung wurde durch Q-Sepharose in 0,4 M NaCl geleitet, um etwaige assoziierte DNA oder Endoxin zu entfernen, in 1 mM Kaliumphosphat pH 6,5 (Puffer P), das 50 mM NaCl enthielt, dialysiert und auf eine Hydroxyapatitsäule (BioRad Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Typ I) aufgetragen. Die HA-Säule wurde mit 0,15 M NaCl in Puffer P gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und groβ-T wurde mit 0,5 M NaCl in Puffer P eluiert. Die HA-Sammlung wurde gegen Kochsalzlösung dialysiert und bei -70°C gelagert, wo sie unbegrenzt stabil war. Zum Erhalt von homogenem nicht-desamidiertem groβ-T wurde die Sammlung aus der SP-Säule unter Verwendung einer C18RP-HPLC-Säule anstelle von Q-Sepharose- und HA-Säulen fraktioniert. Die SP-Sammlung wurde auf 0,1 % TFA eingestellt und auf eine Vydac C18-Säule (2,2 × 25 cm, 10 μm, Nest Group) aufgetragen, die mit 12,5 % Puffer R (80 % Acetonitril in 0,1 % TFA) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit einem Säulenvolumen von 30 % Puffer R gewaschen. groβ-T wurde mit 5 Säulenvolumina eines linearen Gradienten von 30 zu 40 % von Puffer R eluiert. Die Sammlung aus der C18-Säule wurde zur Trockene lyophilisiert, in Kochsalzlösung mit 10 mg/ml resuspendiert, umfassend gegen Kochsalzlösung dialysiert und bei -80°C vor ihrer Verwendung in Tierversuchen gelagert.
Herstellung von desamidiertem groβ-T
Wenn das obige gereinigte groβ-T in 0,1 M Na-Phosphat-Puffer pH 8,0 für 5 Tage bei 25°C inkubiert wurde, wurde groβ-T auf Basis der Analyse durch Kapillarelektrophorese vollständig desamidiert. Eine einzelne Stelle der Desamidierung wurde durch NMR-Spektren als N69D identifiziert.
BEISPIEL 5
Detektion von Desamidierungsprodukten von groβ-T unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC (Beispiel der Erfindung)
Auftrennung der iso-Asp 69-, Asp 69- und nativen Asn 69-Formen von groβ-T in ihrem Dislufid-verbrückten Zustand (nicht-reduziert) wurde unter Verwendung einer Zorbax 300SB-C8 Umkehrphasen-HPLC-Säule (2,1 mm × 150 mm, Teilenummer 883750.906, Rockland Technologies, Inc.) erreicht, die an ein HP1090 Chromatographiesystem (Hewlett Packard) angeschlossen war. Eine typische Analyse beinhaltete die Injektion von 16 μg einer groβ-T-Mischung, die in 40 μl 0,1 % TFA in Wasser gelöst war. Die Trennung wurde unter Verwendung einer Elution mit linearem Gradienten erreicht (Tabelle 1), indem Puffer A (enthaltend 1 ml von TFA von HPLC-Qualität "Baker Analyzed", hinzugegeben zu 1 1 von Nanopure II-Wasser) und Puffer B (enthaltend 80 % Acetonitril, 0,1 % TFA (800 ml von Acetonitril von HPLC-Qualität, hinzugegeben zu 200 ml Wasser, gefolgt von 1 ml TFA von HPLC-Qualität) vermischt wurden. Die Säulentemperatur wurde auf 60°C gehalten, und Peaks wurden bei sowohl 210 als auch 215 nm detektiert.
Tabelle 1
Iso-Asp 69-, Asp 69- und native Asn 69-groβ-T-Peptide ergaben Retentionszeiten von 44,2 min, 51,9 min bzw. 47,7 min.
Unter Verwendung eines geringfügig modifizierten Gradienten und der gleichen Chromatographiebedingungen wie oben beschrieben wurde eine Analyse sowohl der nativen als auch groβ-T-desamidierten Produkte mit reduzierten Disulfidbrücken (reduziert) erreicht.
Tabelle 2
Reduzierte Iso-Asp 69-, Asp 69- und native Asn 69-groβ-T-Peptide ergaben Retentionszeiten von 43,7 min, 50,6 min bzw. 46,9 min.
Zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind in der oben identifizierten Beschreibung eingeschlossen, und es wird erwartet, daß sie für einen Fachmann naheliegend sind. Es wird angenommen, daß solche Modifikationen und Veränderungen an den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung vom Umfang der hier anhängenden Ansprüche umfaßt sind.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung einer effektiven Menge eines modifizierten gro-β-Proteins mit einer Proteinsequenz, die die Aminosäuren 5 bis 73 aus SEQ ID NO: 3 umspannt, worin Aminosäure 69 zu Asparaginsäure oder Isoasparaginsäure desamidiert wurde, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen eines Patienten.
Verwendung gemäss Anspruch 1 einer Kombination aus einem desamidierten modifizierten gro-β-Protein gemäss Anspruch 1 und einem modifizierten gro-β-Protein, das Aminosäuren 5 bis 73 aus SEQ ID NO: 3 umfasst, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen eines Patienten.
Verwendung gemäss Anspruch 1, worin das desamidierte modifizierte gro-β-Protein ca. 0,01 ng bis ca. 1 g des desamidierten modifizierten gro-β-Proteins umfasst.
Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das desamidierte modifizierte gro-β-Protein in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einer Kombinationstherapie mit einem hämatopoetischen regulatorischen Biomolekül oder einem Wachstumsfaktor verwendet wird.
Verwendung gemäss Anspruch 4, worin der Wachstumsfaktor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus GM-CSF, G-CSF, Stammzellfaktor und Flt-3-Ligand besteht.
Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen eines Patienten, der eine hämatopoetische Stammzelltransplantation aus peripherem Blut erhält.
Chemokin, das aus den Aminosäuren 5 bis 73 aus SEQ ID NO: 3 besteht, worin die Aminosäure Nr. 69 zu Asparaginsäure oder Isoasparaginsäure desamidiert wurde.