DE3887052T2

DE3887052T2 - Menschliche, Insulin ähnliche Wachstumfaktoren mit reduzierter Bindung zu Serumträgerproteinen und ihre Herstellung in Hefe.

Info

Publication number: DE3887052T2
Application number: DE3887052T
Authority: DE
Inventors: Joy D Applebaum; Marvin L Bayne; Margaret A Cascieri
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1987-09-21
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1994-07-21
Anticipated expiration: 2008-09-17
Also published as: JPH01156998A; FI884276A; DK521888A; YU46987B; AU2245588A; ZA886966B; PT88546A; US4876242A; AU608364B2; HUT49375A; NO884183D0; ATE100139T1; EP0309050B1; DE3887052D1; EP0309050A1; DK521888D0; KR890005150A; YU177388A; HU205170B; FI884276A0

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Der Einbau von Fragmenten des Insulinmoleküls in IGF-I wurde bisher in Form von zweikettigen disulfidverknüpften insulinartigen Strukturen versucht. Diese Moleküle besitzen relativ zu IGF-I eine wesentlich verringerte biologische Aktivität, und die Bindung an Serum-Carrierprotein ist immer noch deutlich, was die in vitro-Aktivität solcher Verbindungen in vivo wenig nützlich macht. Siehe Joshi et al. Biochemistry 24 : 4208-42 (1985); DeVroede et al. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82 : 3010-14 (1985); und Joshi et al. Biochem and Biophys. Res. Comm. 133 : 423-429 (1985). Die erfindungsgemäß beschriebenen IGF-I-Analoga werden als einkettige IGF-I-artige Moleküle mit dem gleichen Wirkpotential am IGF-Rezeptor vom Typ I wie IGF-I und sehr geringer Bindung an Serumprotein hergestellt, was solchen Analoga bei einer in vivo-Anwendung eine deutliche Wirksamkeit verleiht.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Der insulinartige menschliche Wachstumsfaktor I (hIGF-I, auch Somatomedin C genannt,) ist ein aus menschlichem Serum gereinigtes Protein mit 70 Aminosäuren. Es wird angenommen, daß es viele der Wirkungen der Wachstumshormone auslöst, insbesondere wurde gezeigt, daß es das Wachstum in hypophysektomierten Ratten stimuliert. Ferner wurde gezeigt, daß IGF-I das Zellwachstum und die Differenzierung verschiedener Zelltypen fördert.
Der menschliche IGF-I zeigt in der Aminosäuresequenz eine bemerkenswerte Homologie mit Insulin. Diese Homologie ist die Grundlage eines computererzeugten dreidimensionalen Strukturmodells für hIGF-I (Blundell et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75 : 180-184 (1978) und Blundell et al. Fed. Proc. am Soc. Exp. Biol. 42: 2592-2597 (1983)). Dieses Modell sagt voraus, daß ein Teil der Insulinrezeptor- Bindungsregion innerhalb des IGF-I-Moleküls erhalten bleibt, was die Fähigkeit von hIGF-I erklärt, an Insulinrezeptoren zu binden. Das Modell schlägt auch Regionen des hIGF-I-Moleküls vor, die für die Bindung an Serum-Carrierproteine verantwortlich sein können.
Einer der Hauptunterschiede zwischen hIGF-I und Insulin ist, daß im normalen menschlichen Blut mehr als 99% des IGF-I an Serum-Carrierproteine gebunden sind, die die Kapillarbarriere nicht leicht überqueren. Somit ist der größte Teil von IGF im Serum inaktiv. Die physiologische Bedeutung des IGF-Carrierproteinkomplexes ist nicht klar. Das Vorliegen von Serum-Bindungsproteinen ist für die Bioaktivität und Bioverfügbarkeit von exogen verabreichtem IGF-I ein Hindernis.
Forschungen über die Rolle von Serum-Bindungsproteinen hinsichtlich der Bioaktivität von IGF-I könnten potentiell zu wichtigen bioaktiven Verbindungen führen. Unser Weg war so, daß ein IGF-I-Analogon hergestellt wurde, das eine wirksame Bindung mit dem Rezeptor vom Typ I beibehält, jedoch eine verringerte Bindung mit Serum- Carrierproteinen aufweisen würde. Der Entwurf für dieses Analogon basiert auf der Beobachtung, daß Insulin nicht an Serum-Carrierproteine bindet. Der Beweis für synthetische insulinartige zweikettige Analoga legt nahe, daß sich die Aminosäuren von IGF-I, die für das Binden an Carrierprotein verantwortlich sind, in der B-Region von IGF-I befinden. Darum wurde ein synthetisches Gen für den menschlichen IGF-I modifiziert, um für ein IGF-I-Analogon zu codieren, in dem die ersten 16 Aminosäuren von hIGF-I durch die ersten 17 Aminosäuren der B-Kette von menschlichem Insulin ersetzt sind. Das synthetische Gen wird dann in ein rekombinantes Hefe-DNA-Expressionssystem eingebaut, und das Peptidanalogon, das durch die modifizierten Hefezellen produziert wird, wird daraus extrahiert und gereinigt. Weitere Modifikationen des IGF-I-Moleküls wurden durchgeführt und führten zu zusätzlichen Analoga, von denen alle eine wesentliche Bindung an den IGF- I-Rezeptor vom Typ I und eine verringerte Bindung an Serum-Carrierproteine zeigen.
Somit ist es Aufgabe der Erfindung, die Herstellung von synthetischen Genen, die für IGF-I-Analoga codieren, und den Einbau solcher Gene in einen Mikroorganismus zu beschreiben. Eine weitere Aufgabe ist es, die Herstellung von IGF-I-Analoga durch Züchten des genetisch modifizierten Mikroorganismus zu beschreiben. Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die Eigenschaften und Verwendungen der so hergestellten IGF-I-Analoga zu beschreiben. Noch weitere Aufgaben werden beim Durchlesen der folgenden Beschreibung klar.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wir haben ein synthetisches Gen, das für ein 71-Aminosäure-Analogon von menschlichem IGF-I codiert, exprimiert. Dieses Analogon IGF132 enthält die ersten 17 Aminosäuren der B-Kette des menschlichen Insulins anstelle der ersten 16 Aminosäuren von hIGF-I. Das Analogon besitzt im Vergleich zu normalem menschlichen IGF-I nahezu die gleiche Affinität für den IGF-Rezeptor vom Typ I (Fig. 6). Das Analogon IGF132 besitzt jedoch eine stark verringerte Bindung sowohl an menschliche Serum- Carrierproteine als auch an Ratten-Serumcarrierproteine (Fig. 7 und 8). Somit behält dieses neue Protein fast die gesamte Aktivität am IGF-Rezeptor vom Typ I bei, bindet jedoch nicht an die Serumkomponenten. Es wird erwartet, daß dieses Analogon in vivo wirksamer ist als der normale IGF-I. Dieses Analogon ist bei der Stimulation der DNA-Synthese in 3T3-Zellen 10 mal wirksamer als der normale IGF-I (Fig. 9).
Die erfindungsgemäßen synthetischen Gene codieren für ein Peptid, das ein Analogon des menschlichen insulinartigen Wachstumsfaktors (hIGF-I) ist und die folgende Struktur aufweist, worin die Buchstabenbezeichnung für die Aminosäurebestandteile die unten angegebenen Definitionen besitzt:
A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-LCG-A&sub5;-A&sub6;-LV-A&sub7;-AL-A&sub8;-A&sub9;-R
worin:
A&sub1; G, V oder FV bedeutet;
A&sub2; P oder N bedeutet;
A&sub3; E oder Q bedeutet;
A&sub4; T, H oder A bedeutet;
A&sub5; A oder S bedeutet;
A&sub6; E oder H bedeutet;
A&sub7; D oder E bedeutet;
A&sub8; Q oder Y bedeutet;
A&sub9; F oder L bedeutet; und
R für den Rest des hIGF-I-Peptids steht, das aus 54 Aminosäuren, wie folgt, besteht:
VCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIV
DECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA
mit der Ausnahme, daß das folgende Gen GPETLCGAELVDALQF-R, das den Wildtyp von hIGF-I darstellt, aus der vorgenannten Definition ausgenommen ist.
Während Fachleuten die Aminosäure-Buchstabenbezeichnungen im allgemeinen gut bekannt sind, lauten zum Zweck der Klarheit die hier verwendeten Definitionen wie folgt:
A-Alanin
C-Cystein
D-Aspartamsäure
E-Glutaminsäure
F-Phenylalanin
G-Glycin
H-Histidin
I-Isoleucin
K-Lysin
L-Leucin
M-Methionin
N-Asparagin
P-Prolin
Q-Glutamin
R-Arginin
S-Serin
T-Threonin
V-Valin
Y-Tyrosin
Bevorzugte Variationen der vorgenannten Peptidanaloga sind folgende:
A&sub1; bedeutet G, V oder FV;
A&sub2; bedeutet P oder N;
A&sub3; bedeutet Q;
A&sub4; bedeutet A;
A&sub5; bedeutet A oder S;
A&sub6; bedeutet E oder H;
A&sub7; bedeutet D oder E;
A&sub8; bedeutet Y; und
A&sub9; bedeutet L.
Ferner sind spezifische Beispiele für solche Verbindungen wie folgt:
FVNQHLCGSHLVEALYL-R (Verbindung A oder IGF132)
GPETLCGAELVDALYL-R (Verbindung B oder IGF122)
GPQALCGAELVDALQF-R (Verbindung C oder IGF130)
GPQALCGAELVDALYL-R (Verbindung D oder IGF252)
VNQHLCGSHLVGALYL-R
Die Peptidanaloga können durch Verfahren, die den Verfahren entsprechen, die zur Herstellung des natürlichen hIGF-I-Peptids verfügbar sind, und durch Modifikationen davon, die Fachleuten gut bekannt sind, hergestellt werden. Insbesondere können diese Analoga chemisch synthetisiert werden, indem die für den menschlichen IGF-I entwickelten Verfahren angewendet werden. Siehe beispielsweise Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80 : 2216-2220 (1983). Erfindungsgemäß können die IGF-I-Analoga auch hergestellt werden, indem eine Transformation empfindlicher Bakterien-, Hefe- oder Zellkülturgewebe-Wirte mit rekombinanten Plasmiden angewendet wird, die DNA-Sequenzen einschließen, die in der Lage sind, die Expression der IGF-I-Analoga zu steuern. Die DNA-Sequenz kann synthetisch, chromosomal oder durch DNA- Rekombinationstechniken oder eine Kombination davon hergestellt werden. Die DNA- Sequenzen, die in der Lage sind, die Expression der IGF-I-Analoga zu steuern, könnten auch in die Keimbahn von Tieren oder extrachromosomal unter Erzeugung transgener Tiere, die die IGF-Analoga endogen produzieren, eingebaut werden.
Die erfindungsgemäßen synthetischen Gene werden hergestellt, indem biotechnologische DNA-Rekombinationstechniken, die den Fachleuten gut bekannt sind, angewendet werden. Fig. 1 zeigt die Stufen der Kombination der Plasmide pα2 und phIGF unter Einschluß des synthetischen erfindungsgemäßen Gens.
Das synthetische Gen produziert hIGF-I-Analoga, die eine wesentliche Aktivität aufweisen, da sie aber anscheinend nicht an Serumproteine binden, Aktivitätsspiegel besitzen, die, auf molarer Basis oder auf der Basis des Gewichts, wesentlich aktiver sind als Wildtyp-hIGF-I. Die Verbindungen sind somit als Mittel zur Steigerung der Ausbeute und Wirksamkeit der Milchproduktion bei Tieren, insbesondere bei Wiederkäuern wie Kühen, hochaktiv. Die Verbindungen sind ebenfalls als wachstumsfördernde Mittel für lebensmittelproduzierende Tiere geeignet, indem die Geschwindigkeit der Gewichtszunahme, die Futterausnutzung und Skelettqualität verbessert werden. Die Verbindungen sind ferner als Mittel geeignet, um die Wundheilung zu beschleunigen und die Erythropoese (Produktion von Erythrocyten) zu stimulieren.
Bei einer Anwendung zur Steigerung der Milchproduktion oder als tierischer Wachstumsbeschleuniger werden die Verbindungen parenteral, wie beispielsweise als subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion, oder durch ein subkutanes Implantat mit verzögerter Freisetzung verabreicht. Bei einer subkutanen, intramuskulären und intravenösen Injektion wird der aktive Bestandteil in einem flüssigen Trägervehikel aufgelöst oder dispergiert. Zur parenteralen Verabreichung wird das aktive Material zweckmäßigerweise mit einem verträglichen Vehikel, vorzugsweise aus der Reihe pflanzlicher Öle, wie Erdnußöl, Baumwollsamenöl und dergleichen, vermischt. Weitere parenterale Vehikel, wie eine organische Präparation unter Verwendung von Solketal-, Glycerin-, Formalin-Formulierungen und wäßrigen parenteralen Formulierungen, werden ebenfalls verwendet. Die aktive Verbindung oder die aktiven Verbindungen werden in der parenteralen Formulierung zur Verabreichung aufgelöst oder suspendiert, wobei solche Formulierungen im allgemeinen 0,005 bis 5 Gew.-% der aktiven Verbindung enthalten.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen wirken durch die deutliche Steigerung des Niveaus der Milchproduktion oder der Geschwindigkeit der Gewichtszunahme oder der Futterausnutzung bei einer Verabreichung in Konzentrationen von 0,1 bis 100 mg pro kg des tierischen Körpergewichts, vorzugsweise bei 1 bis 10 mg/kg. Wenn die Verbindungen in Form eines subkutanen Implantats verabreicht werden, wird die Verbindung in einem langsam dispersen Material, das den Fachleuten bekannt ist, suspendiert oder aufgelöst oder in einer Vorrichtung verabreicht, die das aktive Material langsam freisetzt, indem eine konstante Triebkraft, wie eine osmotische Pumpe, angewendet wird. In solchen Fällen ist eine konstante Verabreichung über Zeiträume von 20 bis 120 Tagen möglich, wobei der aktive Bestandteil mit 0,1 bis 10 mg/kg/Tag freigesetzt wird.
Da die hIGF-I-Analoga synergistisch mit dem aus Thrombocyten stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) oder mit weiteren Kompetenzfaktoren, wie dem Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), synergistisch reagieren, um die DNA-Synthese und Zellreplikation in menschlichen Fibroblasten zu stimulieren, sind solche Analoga geeignet, um die Wundheilung, insbesondere in den Fällen zu beschleunigen, in denen die endogenen hIGF-Spiegel gering sind. Somit können die erfindungsgemäßen IGF-I- Analoga in Kombination mit PDGF oder FGF verabreicht werden. Die Verbindungen können parenteral, entweder subkutan, intramuskulär oder intravenös, unter Verwendung pharmazeutisch verträglicher parenteraler Formulierungsbestandteile, wie derjenigen, die oben aufgeführt sind, verabreicht werden. Die Verbindungen werden in einer Dosis von 0, 1 bis 100 mg/kg, vorzugsweise von 1 bis 10 mg/kg, verabreicht. Vorzugsweise jedoch werden die Verbindungen bei der Verwendung als Mittel zur Beschleunigung der Wundheilung topisch verabreicht. Die typischen Formulierungen zur topischen Verabreichung sind Flüssigkeits-, Pasten-, Salben- und Sprayformulierungen. Die Formulierungen können auch in eine Flüssigkeit eingearbeitet werden, die auf die Wunde aufgetragen wird. Die Flüssigkeit setzt die Verbindung direkt an der Stelle, die der Behandlung bedarf, frei.
Die Verbindungen werden in die topische Formulierung in Konzentrationen von 0,003 bis 10 Gew.- % eingearbeitet, wobei die meisten Formulierungen 0,3 bis 3% erfordern. Die Konzentration kann eingestellt werden, um Tagesdosen von 0,06 bis 2 mg der aktiven Verbindung bereitzustellen, wobei Mehrfachanwendungen während irgendeines bestimmten Tages zugelassen sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können, wahrscheinlich aufgrund ihrer Fähigkeit, die späte Differenzierung der erythroiden Vorstufe zu stimulieren, auch als erythropoetische Mittel nützlich sein. In solchen Fällen werden die Verbindungen, wie oben beschrieben, parenteral verabreicht. Die Verbindungen können entweder allein oder in Kombination mit Erythropoitin verabreicht werden, um die Produktion von Erythrocyten zu beschleunigen. Für solche Anwendungen werden die Verbindungen in Dosen von 0,1 bis 100 mg/kg, vorzugsweise von 1 bis 10 mg/kg, verabreicht. Solche Dosen beziehen sich auf einen Tag, und erforderlichenfalls kann die Dosis in mehrere Tagesdosen aufgeteilt werden.
Beigefügt hierzu sind Figuren, die die Erfindung weiter beschreiben und erklären.
Fig. 1 beschreibt die Herstellung des rekombinanten Plasmids pα2IGF132 aus dem Plasmid pα2 und dem Plasmid phIGF durch selektive Spaltung und Rekombination. Das Plasmid codiert für das 71 Aminosäure-Analogon des menschlichen IGF-I.
Fig. 2A beschreibt ein Ersatzgenfragment für die Position NdeI/BstEII des Plasmids pJY1. Das Ersatzfragment wurde seinerseits durch Ligasierung der vier Oligonucleotide IGF132, IGF133, IGF134 und IGF135 gebildet.
Fig. 3A beschreibt die DNA-Gensequenz und das Analogon, für das sie codiert, das durch Ligasierung in das Plasmid pα2IGF132 inseriert wird.
Die Fig. 3B, 3C und 3D beschreiben gleichermaßen die DNA-Gensequenz und Analoga für IGF122, IGF130 bzw. IGF252.
Fig. 4 beschreibt das Elutionsprofil von Analogon IGF132 mit einer Biogel p10 Gelfiltrationssäule.
Fig. 5 beschreibt die Reinigung der aktiven Peaks über Biogel P10 durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie der Präparation von A (IGF132), B (IGF 122), C (IGF130) und D (IGF252).
Fig. 6 beschreibt die Bindung der Analoga A (IGF132), B (IGF 122), C (IGF 130) und D (IGF252) an IGF-Rezeptoren vom Typ I im Vergleich zu rekombinantem WildtyphIGF-I. In der Figur ist Analogon A durch " ", B durch " ", C durch " " und D durch " " und der Wildtyp-IGF-I durch " "> dargestellt.
Fig. 7 beschreibt die Bindung von Analogon A (IGF132), B (IGF 122), C (IGF130) und D (IGF252) an menschliche Serum-Carrierproteine im Vergleich zur Bindung von Wildtyp-hIGF-I. hIGF-I ist fest an Serum-Carrierproteine gebunden, während die Analoga IGF132 und IGF252 sehr schwach gebunden sind. Dieselben Darstellungen, die in Fig. 6 gezeigt sind, werden bei dieser Figur eingesetzt.
Fig. 8 beschreibt die Bindung von Analogon A (IGF 132) und hIGF-I an natives Bindungsprotein in Rattenserum. hIGF-I bindet sättigend, wohingegen die Bindung des Analogons A (IGF132) nicht beobachtet wird.
Fig. 9 beschreibt einen Vergleich der biologischen Aktivitäten von IGF-I mit den Analoga A (IGF132) und B (IGF252) hinsichtlich der Fähigkeit, die DNA-Synthese in 3T3-Zellen zu stimulieren. Es wird beobachtet, daß die Analoga A und D 10 mal wirksamer sind als Wildtyp-IGF-I.
Fig. 10 beschreibt einen Vergleich der Fähigkeit von IGF-I und IGF252, die Glycogensynthese in einer Rattenmembran (Teil A) oder die Lipidsynthese in Ratten- Fettgewebe (Teil B) in vivo zu stimulieren. IGF252 ist bei der Stimulation der Glycogensynthese in vivo wenigstens zweimal wirksamer als IGF-I. Weder IGF-I noch IGF252 stimulieren bei diesen Dosen die Lipidsynthese.

BEISPIEL

Konstruktion des Gens für das IGF132-Analogon

Ein synthetisches Gen, das für die 70 Aminosäuren von hIGF-I codiert, wurde zusammengesetzt und in pBR322 kloniert, um das Plasmid phIGF zu ergeben. Das Plasmid phIGF wurde unter Bildung des Plasmids pJYI, wie in Fig. 1 beschrieben, modifiziert. Vier Oligonucleotide: IGF 132-5' TATG CCGC ATC CTT TCC TTG GAT AAA AGA TTT GTA AAC CAA CAT 3'; IGF133-5' ACA CAA ATG TTG GTT TAC AAA TCT TTT ATC CAA GGA AAG GAT CCG GCA 3'; IGF134-5' TTG TGT GGC TCC CAT CTG GTT GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGC G 3' und IGF135-5' GTC ACC GCA AAC CAA GTA CAA AGC TTC AAC GAG ATG GGA GCC 3' wurden unter Bildung eines NdeI/BstEII-Ersatzfragments (Fig. 2) ligasiert. Dieses Fragment wurde in pJY1 inseriert, das mit der Endonuclease NdeI und BstEII verdaut wurde. Die Transformation von E. coli mit dem Ligasierungsgemisch ergibt Bakterien, die das Plasmid pJY132 aufweisen. Die DNA-Sequenz und das IGF- Analogon, für das sie codiert, sind in Fig. 3A gezeigt.

Expression des IGF132-Analogons

Die Bam HI IGFI32-Genkassette aus dem Plasmid pJY132 wurde, wie in Fig. 1 angegeben, in mit pα2 verdautes Bam HI ligasiert. Das Plasmid mit der IGF132- Kassette in pα2 in der richtigen Orientierung wurde als pα2IGF132 bezeichnet. Dieses Plasmid wurde in den Hefestamm BJ1995 eingebaut. Der Hefestamm, der das Plasmid pα2IGF132 aufweist, gibt das Protein IGF132 in die Wachstumsmedien ab.

Expression und Reinigung von mutanten hIGF I-Peptiden

Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm BJ1995 (MATα, leu2, trp1, ura3, prb1-1122, pep4-3, cir) wurde mit dem geeigneten Expressionsplasmid transformiert, und die Transformanten wurden auf Leucin-Minus-Platten selektiert. Die Zellen wurden in 1 Liter 5x leu(-)-Medium, pH 4,8, enthaltend 0,85% Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, angereichert mit 4% Glucose, 1% Ammoniumsulfat, 0,6% Natriumhydroxid, 0,03% L-Isoleucin, 0,03% L-Phenylalanin, 0,025% L-Tyrosin, 0,02% L-Lysin, 0,02% L-Tryptophan, 0,02% Uracil, 0,02% Adenin, 0,01% L-Arginin, 0,005% Methionin, 0,005% L-Histidin, 29 uM Eisen(III)-chlorid, 25 uM Zinksulfat und 1% Bernsteinsäure, bis zur Sättigung gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 3000 · g entfernt. Der geklärte Überstand wurde mit 10 g BioRex 70, equilibriert in 1% Bernsteinsäure, pH 4,8, vermischt. Nach 3-stündigem Rühren bei 4ºC wurde das Harz in eine 2,5 cm-Säule gegossen und mit 111% Bernsteinsäure, pH 4,8, gewaschen. Das Peptid wurde mit 1 M Ammoniumacetat, pH 8, eluiert. Rezeptoraktives Material wurde vereinigt, auf 4 ml konzentriert, dann auf eine Biogel P10 (200-400 mesh)-Säule von 2,5 · 90 cm, equilibriert in 1 N Essigsäure, aufgegeben. Die Gelfiltration wurde bei 30 ml pro Stunde durchgeführt. 12 ml Fraktionen wurden gesammelt und durch einen Radiorezeptortest auf die IGF-artige Aktivität getestet. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Die Aktivität wurde in 0,2 ml 0,05% Trifluoressigsäure, 15% Acetonitril wiederhergestellt und auf eine C18-uBondapak (0,46 · 25 cm, 10 um, Waters) reverse phase-HPLC-Säule aufgegeben. Die Peptide wurden unter Verwendung eines Acetonitril-Gradienten von 15-50% in 0,05% Trifluoressigsäure eluiert. Die Flußgeschwindigkeit betrug 1 ml/min. Es wurden 1 Minuten-Fraktionen gesammelt und durch den Rezeptortest getestet. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Das gereinigte Peptid wurde durch Aminosäurenanalyse quantitativ bestimmt und bei -20ºC in 0,1 N Essigsäure bei einer Konzentration von 0,1 mM aufbewahrt.

Charakterisierung der IGF-Analoga

Zur Bestimmung der Konzentration der gereinigten Analoga wurde die quantitative Aminosäurenanalyse eingesetzt. Die Aminosäurezusammensetzung steht mit derjenigen, die für die Analoga erwartet wird, im Einklang.
Die Bindung der Analoga an den IGF-Rezeptor vom Typ I ist in Fig. 6 gezeigt. Die Analoga A (IGF 132), B (IGF 122), C (IGF130) und D (IGF252) hemmen die Bindung von ¹²&sup5;I-hIGF-I an menschliche Placentamembranen mit einer IC&sub5;&sub0; von 12 nM, 4,5 nM, 5,3 nM bzw. 5,0 nM im Vergleich zu 5,6 nM für rekombinanten WildtyphIGF-I. Die Bindung des Analogons 132 an menschliche Serum-Carrierproteine ist in Fig. 7 gezeigt. Der rekombinante Wildtyp-hIGF-I hemmt die Bindung von ¹²&sup5;I-hIGF-I an säurestabile menschliche Carrierproteine mit einer IC&sub5;&sub0; von 0,42 nM; das Analogon IGF 132 zeigte wenig Fähigkeit, diese Bindung mit einer IC&sub5;&sub0; > 1000 nM zu hemmen. IGF 130, IGF 122 und IGF252 hemmen die Bindung mit IC&sub5;&sub0;-Werten von 1,8 nM, 2,1 nM bzw. 300 nM.
Das ¹²&sup5;-I-markierte Analogon IGF132 wurde hinsichtlich der Fähigkeit aufgezeichnet, Komponenten in normalem Rattenserum zu binden. Wenn ¹²&sup5;I-IGF oder ¹²&sup5;I-IGF132 ohne vorherige Inkubation mit Serum chromatographiert wurde, wird die Radioaktivität als breiter Peak eluiert, der an die Stelle wandert, die für ein 7,5 kD-Peptid erwartet wird (Fig. 8A). Nach der Inkubation von ¹²&sup5;I-IGF mit Rattenserum erscheint ein radioaktiver Peak, der an der Stelle eluiert, die für ein 150 kD-Protein erwartet wird. Die Menge der Radioaktivität in dem freien ¹²&sup5;I-αIGF-Peak nimmt ab (Fig. 8B ( )). Der ¹²&sup5;I-IGF, der an die 150 kD-Spezies gebunden ist, stellt 36% ± 5% des gesamten ¹²&sup5;I-IGF-I in der Inkubation dar. Wenn die Inkubation in Gegenwart von 1 ug unmarkiertem IGF durchgeführt wird, wird nur ein radioaktiver Peak beobachtet. Dieser entspricht ungebundenem ¹²&sup5;I-IGF (Fig. 8 (0)). Somit ist unter den Bedingungen dieses Tests die Bindung von ¹²&sup5;I-IGF an die 150 kD-Spezies aus Rattenserum sättigend.
Nach der Inkubation von 1²&sup5;I-IGF132 mit Rattenserum wird nur das freie radioaktive Peptid eluiert (Fig. 8C ( )). Die Gegenwart von 1 ug unmarkiertem IGF 132 während der Inkubation verändert das radioaktive Profil nicht wesentlich (Fig. 8C (0)).
IGF-I stimuliert die DNA-Synthese in 3T3-Zellen der Maus. Wie in Fig. 9 gezeigt, stimulieren IGF252 und IGF 132 die DNA-Synthese in diesen Zellen mit einer etwa 10 mal höheren Wirksamkeit als der Wildtyp-IGF-I.
IGF-I stimuliert den Einbau von ¹&sup4;C-Glucose in Glycogen in der Rattenmembran in vivo. Dieser Prozeß wird durch den IGF-Rezeptor vom Typ 1 ausgelöst. Wie in Fig. 10, Teil A gezeigt, ist IGF252 wenigstens zweimal wirksamer als Wildtyp-IGF-I. Wie erwartet, stimulieren weder IGF-I noch 1GF252 den Einbau von ¹&sup4;C-Glucose in Lipid im Fettgewebe. Fettgewebe weist keine IGF-Rezeptoren vom Typ I auf.

Claims

1. Synthetisches Polypeptid-Analogen von hIGF-I, das folgende Struktur aufweist:

A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-LCG-A&sub5;-A&sub6;-LV-A&sub7;-AL-A&sub8;-A&sub9;-r

worin

A&sub1; G, V oder FV bedeutet;

A&sub2; P oder N bedeutet;

A&sub3; E oder Q bedeutet;

A&sub4; T, H oder A bedeutet;

A&sub5; A oder S bedeutet;

A&sub6; E oder H bedeutet;

A&sub7; D oder E bedeutet;

A&sub8; Q oder Y bedeutet;

A&sub9; F oder L bedeutet; und

R für den Rest des hIGF-I-Peptids steht, mit der Maßgabe, daß die Gruppe A&sub1; bis A&sub9; und die weiteren Aminosäuren nicht GPETLCGAELVDALQF-R bildet.

2. Peptid nach Anspruch 1, worin

A&sub1; G, V oder FV bedeutet;

A&sub2; P oder N bedeutet;

A&sub3; Q bedeutet;

A&sub4; A bedeutet;

A&sub5; A oder S bedeutet;

A&sub6; E oder H bedeutet;

A&sub7; D oder E bedeutet;

A&sub8; Y bedeutet;

A&sub9; L bedeutet.

3. Peptid nach Anspruch 1, das FVNQHLCGSHLVEALYL-R ist

4. Peptid nach Anspruch 1, das GPETLCGAELVDALYL-R ist.

5. Peptid nach Anspruch 1, das GPQALCGAELVDALQF-R ist.

6. Peptid nach Anspruch 1, das GPQALCGAELVDALYL-R ist.

7. Peptid nach Anspruch 1, das VNQHLCGAELVDALYL-R ist.

8. Synthetisches Gen, das für das Polypeptid nach Anspruch 1 codiert.

9. Synthetisches Gen, das für das Polypeptid nach Anspruch 3 codiert.

10. Synthetisches Gen nach Anspruch 9, das folgendes ist:

11. Synthetisches Gen, das für das Polypeptid nach Anspruch 4 codiert.

12. Synthetisches Gen nach Anspruch 11, das folgendes ist:

13. Synthetisches Gen, das für das Polypeptid nach Anspruch 5 codiert.

14. Synthetisches Gen nach Anspruch 13, das folgendes ist:

15. Synthetisches Gen, das für das Polypeptid nach Anspruch 6 codiert.

16. Synthetisches Gen nach Anspruch 14, das folgendes ist:

17. Verfahren zur Herstellung des synthetischen Gens nach einem der Ansprüche 8 bis 16, welches umfaßt:

a) Synthese der geeigneten Baustein-Oligonucleotide;

b) Verknüpfen und Ligasieren der genannten Oligonucleotide mit Genfragmenten;

und

c) Klonieren des synthetischen Gens in ein rekombinantes DNA-Plasmid.

18. Verfahren zur Herstellung des Polypeptid-Analogons nach Anspruch l, durch die rekombinanten DNA-Expressionssysteme von Bakterien, Hefe oder Wirten aus Zellkulturgewebe, welches umfaßt:

a) Insertion des geeigneten synthetischen Gens in einen Expressionsvektor unter Bildung einer Expressionscassette;

b) Einbau der Expressionscassette in Bakterien, Hefe oder einen Wirt aus Zellkulturgewebe;

c) Züchten des transformierten Expressionswirtes; und

d) Reinigung des gewünschten Polypeptid-Analogons aus dem genannten Wirt.

19. Verfahren zur Förderung der Laktation bei Tieren, welches umfaßt, Verabreichen eines synthetischen Polypeptid-Analogons von hIGF-I nach Anspruch 1 an ein laktierendes Tier.

20. Präparat, das zur Förderung der Laktation bei Tieren geeignet ist, welches einen inerten Träger und ein synthetisches Polypeptid-Analogon von hIGF-I nach Anspruch 1 enthält.

21. Verfahren zur Förderung des Wachstums und des Futter-Nutzeffekts bei Tieren, welches umfaßt Verabreichen eines synthetischen Polypeptid-Analogons von hIGF-I nach Anspruch 1 an ein solches Tier.

22. Verfahren zur Förderung des Wachstums und des Futter-Nutzeffekts bei Tieren, welches einen inerten Trägerstoff und ein synthetisches Polypeptid-Analogon von hIGF-I nach Anspruch 1 enthält.

23. Verfahren zur Vergrößerung des Magerfleisch-Gehalts und Verringerung des Fettgehalts von fleischproduzierenden Tieren, weiches umfaßt Verabreichen eines synthetischen Polypeptid-Analogons von hIGF-I nach Anspruch 1 an ein solches Tier.

24. Präparat, das zur Vergrößerung des Magerfleisch-Gehalts und zur Verringerung des Fettgehalts von fleischproduzierenden Tieren geeignet ist, welches einen inerten Trägerstoff und ein synthetisches Polypeptid-Analogon von hIGF-I nach Anspruch 1 enthält.

25. Verwendung eines synthetischen Polypeptid-Analogons von hIGF-I nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments, das zur Förderung der Wundheilung bei Tieren geeignet ist.

26. Präparat, das zur Förderung der Wundheilung bei Tieren geeignet ist, welches einen inerten Trägerstoff und ein synthetisches Polypeptid-Analogon von hIGF-I nach Anspruch 1 enthält.

27. Verwendung eines synthetischen Polypeptid-Analogons von hIGF-I nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulation der Erythropoese bei Tieren.

28. Präparat, das zur Stimulation der Erythropoese bei Tieren geeignet ist, weiches einen inerten Trägerstoff und ein synthetisches Polypeptid-Analogon von hIGF-I nach Anspruch 1 enthält.