DE60016560T2

DE60016560T2 - Mutierte variante des insulin-ähnlichen wachstumsfaktor-i (igf-i)

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Publication number: DE60016560T2
Application number: DE60016560T
Authority: DE
Inventors: Yves Dubaquie; J. Paul FIELDER; B. Henry LOWMAN; L. Deborah MORTENSEN
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-01-06
Filing date: 2000-01-05
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2020-01-06
Also published as: IL143866A; WO2000040613A1; PT1141014E; US6403764B1; DK1141014T3; AU762351B2; ES2234560T3; JP2002535968A; CA2356109A1; EP1141014B1; IL143866A0; JP2006328074A; WO2000040613A9; US20110003746A1; DE60016560D1; AU2224500A; CA2356109C; EP1141014A1; ATE284415T1; US20020160955A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Verwendung bestimmter Agonisten der insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGFs) zur Behandlung verschiedener Funktionsstörungen.
Beschreibung des Hintergrunds und des verwandten Standes der Technik
Die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren I und II (IGF-I bzw. IGF-II) vermitteln in vivo mehrere Wirkungen, die Zellproliferation, Zelldifferenzierung, Inhibierung des Zelltods und Insulin-artige Aktivität einschließen (Übersichtsartikel in Clark und Robinson, Cytokine Growth Factor Rev., 7: 65–80 (1996); Jones und Clemmons, Endocr. Rev., 16: 3-34 (1995)). Die meisten dieser mitogenen und metabolischen Antworten werden durch die Aktivierung des IGF-I-Rezeptors ausgelöst, einem α₂β₂-Heterotetramer, das mit dem Insulinrezeptor nahe verwandt ist (McInnes und Sykes, Biopoly., 43: 339–366 (1998); Ullrich et al., EMBO J., 5: 2503–2512 (1986)). Beide Proteine sind Mitglieder der Tyrosinkinaserezeptor-Superfamilie und verfügen über gemeinsame intrazelluläre Signalkaskaden (Jones und Clemmons, supra). IGF-Insulin-Hybridrezeptoren wurden isoliert, aber ihre Funktion ist unbekannt. Die IGF-I- und Insulin-Rezeptoren binden ihre spezifischen Liganden mit nanomolarer Affinität. IGF-I und Insulin können mit ihren jeweiligen nicht-verwandten Rezeptoren kreuzreagieren, wenn auch mit einer 100–1000-fach geringeren Affinität (Jones und Clemmons, supra). Vor kurzem wurde über die Kristallstruktur berichtet, die einen Teil des extrazellulären Teils des IGF-I-Rezeptors beschreibt (Garret et al., Nature, 394: 395–399 (1998)).
Im Unterschied zu Insulin werden die Aktivität und die Halbwertszeit von IGF-I von sechs IGF-I-Bindungsproteinen (IGFBPs 1–6) und vielleicht zusätzlich von einer entfernter verwandten Klasse von Proteinen moduliert (Jones und Clemmons, supra; Baxter et al., Endocrinology, 139: 4036 (1998)). Die IGFBPs können die IGF-Aktivität entweder inhibieren oder verstärken, abhängig davon, ob sie löslich oder Zellmembran-assoziiert sind (Bach und Rechter, Diabetes Reviews, 3: 38–61 (1995)). Die IGFBPs binden IGF-I und IGF-II mit verschiedenen Affinitäten und Spezifitäten (Jones und Clemmons, supra; Bach und Rechler, supra). Zum Beispiel bindet IGFBP-3 IGF-I und IGF-II mit einer ähnlichen Affinität, wogegen IGFBP-2 und IGFBP-6 IGF-II mit einer viel höheren Affinität binden als IGF-I (Bach und Rechler, supra; Oh et al., Endocrinology, 132, 1337-1344 (1993)).
Die klassischen IGFBPs besitzen eine molekulare Masse in dem Bereich von 22–31 kDa und enthalten eine Gesamtzahl von 16–20 Cysteinen in ihren konservierten Amino- und Carboxy-terminalen Domänen (Bach und Rechler, supra; Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8: 45–62 (1997); Martin und Baxter, Curr. Op. Endocrinol. Diab., 16–21 (1994)). Die zentrale Domäne, die beide Cystein-reiche Regionen verbindet, ist nur schwach konserviert und enthält die Schnittstellen für IGFBP-spezifische Proteasen (Chernausek et al., J. Biol. Chem., 270: 11377–11382 (1995); Clemmons, supra; Conover, Prog. Growth Factor Res., 6: 301–309 (1995)). Eine weitere Regulierung der IGFBPs kann durch Phosphorylierung und Glycosylierung erreicht werden (Bach und Rechler, supra; Clemmons, supra). Es gibt keine verfügbare hochauflösende Struktur für irgendein intaktes Mitglied der IGFBP-Familie. Jedoch wurde kürzlich über die NMR-Strukturen von zwei N-terminalen Fragmenten von IGFBP-5 berichtet, die eine IGF-Bindeaktivität bewahren (Kalus et al., EMBO J., 17:6558–6572 (1998)).
IGF-I ist ein einzelkettiges 70-Aminosäuren-Protein mit hoher Homologie zu Proinsulin. Im Unterschied zu anderen Mitgliedern der Insulin-Superfamilie wird die C-Region der IGFs nach der Translation nicht proteolytisch entfernt. Es wurde über die NMR-Strukturen in Lösung von IGF-I (Cooke et al., Biochemistry, 30: 5484–5491 (1991); Hua et al., J. Mol. Biol., 259: 297–313 (1996)), mini-IGF-I (eine hergestellte Variante, der die C-Kette fehlt; DeWolf et al., Protein Science, 5: 2193–2202 (1996)), und IGF-II (Terasawa et al., EMBO J., 13: 5590–5597 (1994); Torres et al., J. Mol. Biol., 248: 385–401 (1995)) berichtet. Es besteht im Allgemeinen Übereinstimmung darüber, dass distinkte Epitope auf IGF-I für die Bindung von Rezeptor- und Bindungsproteinen verwendet werden. Es wurde in Tiermodellen gezeigt, dass Rezeptor-inaktive IGF-Mutanten in der Lage sind, endogenes IGF-I von Bindungsproteinen zu verdrängen und dadurch in vivo insgesamt einen IGF-I-Effekt zu erzeugen (Loddick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1894–1898 (1998); Lowman et al., Biochemistry, 37: 8870–8878 (1998)). Während die Reste Y24, Y29, Y31 und Y60 mit der Rezeptorbindung in Verbindung gebracht werden, binden deren IGF-Mutanten noch IGFBPs (Bayne et al., J. Biol. Chem., 265: 15648–15652 (1990); Bayne et al., J. Biol. Chem., 264: 11004–11008 (1989); Cascieri et al., Biochemistry, 27 3229–3233 (1988); Lowman et al., supra).
Außerdem wurde eine (1–27,gly⁴,38–70)-hIGF-I genannte Variante, in der die Reste 28–37 der C-Region von menschlichem IGF-I durch eine Glycin-Brücke mit vier Resten ersetzt sind, entdeckt, die an IGFBPs, aber nicht an IGF-Rezeptoren bindet (Bar et al., Endocrinology, 127: 3243–3245 (1990)).
Eine Vielzahl von Mutagenesestudien haben sich mit der Charakterisierung des IGFBP-Bindungsepitops auf IGF-I befasst (Bagley et al., Biochem. J., 259: 665–671 (1989); Baxter et al., J. Biol. Chem., 267: 60–65 (1992); Bayne et al., J. Biol. Chem., 263: 6233-6239 (1988); Clemmons et al., J. Biol. Chem., 265 : 12210–12216 (1990); Clemmons et al., Endocrinology, 131: 890–895 (1992); Oh et al., supra). Zusammengefasst wurde gefunden, dass die N-terminalen Reste 3 und 4 und die helikale Region, die die Reste 8–17 umfasst, wichtig für die Bindung an die IGFBPs sind. Außerdem wurde ein Epitop identifiziert, das die Reste 49–51 bei der Bindung an IGFBP-1, -2 und -5 einbezieht (Clemmons et al., Endocrinology, supra (1992)). Außerdem wurde gezeigt, dass eine natürlicherweise vorkommende, verkürzte Form von IGF-I, der die ersten drei N-terminalen Aminosäuren fehlen (des(1–3)-IGF-I genannt) an IGFBP-3 mit einer 25-fach geringeren Affinität bindet (Heding et al., J. Biol. Chem., 271: 13948–13952 (1996); U.S. Pat. Nr. 5,077,276; 5,164,370; 5,470,828).
Bei einem Versuch, die Beiträge exponierter Aminosäurereste in der N-terminalen Helix zu der Bindung zu charakterisieren, wurden mehrere Alanin-Mutanten von IGF-I hergestellt (Jansson et al., Biochemistry, 36: 4108–4117 (1997)). Jedoch zeigten die Circulardichroismus-Spektren dieser mutierten Proteine Strukturänderungen im Vergleich zu Wildtyp-IGF-I, die es schwierig machten, IGFBP-Bindungsbeiträge zu den mutierten Seitenketten klar zuzuordnen. Ein anderer Ansatz wurde in einer jüngsten Studie gewählt, wobei das IGFBP-1-Bindungsepitop auf IGF-I durch heteronukleäre NMR-Spektroskopie untersucht wurde (Jansson et al., J. Biol. Chem., 273: 24701–24707 (1998)). Die Autoren identifizierten zusätzlich die Reste R36, R37 und R50 als funktionell beteiligt an der Bindung an IGFBP-1.
Andere IGF-I-Varianten wurden offenbart. Zum Beispiel beschreibt in der Patentliteratur WO 96/33216 eine verkürzte Variante, die die Reste 1–69 des authentischen IGF-I umfasst. BP 742,228 offenbart zwei-kettige IGF-I-Superagonisten, die Derivate des natürlicherweise vorkommenden einzelkettigen IGF-I mit einer verkürzten C-Domäne sind. Die IGF-I-Analoga besitzen die Formel: BCⁿ,A, worin B die B-Domäne von IGF-I oder ein funktionelles Analog davon ist, C die C-Domäne von IGF-I oder ein funktionelles Analog davon ist, n die Zahl der Aminosäuren in der C-Domäne ist und von in etwa 6 bis in etwa 12 beträgt, und A die A-Domäne von IGF-I oder ein funktionelles Analog davon ist.
Zusätzlich offenbaren Cascieri et al., Biochemistry, 27: 3229–3233 (1988) vier Mutanten von IGF-I, von denen drei eine verringerte Affinität für den Typ-1-IGF-Rezeptor aufweisen. Diese Mutanten sind: (Phe²³,Phe²⁴,Tyr²⁵)IGF-I (welches bezüglich seiner Affinität zu den Typ-1- und -2-IGF- und Insulin-Rezeptoren gleich stark wie menschliches IGF-I ist), (Leu²⁴)IGF-I und (Ser²⁴)IGF-I (die eine geringere Affinität als IGF-I zu menschlichem placentalen Typ-1-IGF-Rezeptor, dem placentalen Insulin-Rezeptor und dem Typ-1-IGF-Rezeptor von Ratten- und Mäusezellen haben) und Desoctapeptid-(Leu²⁴)IGF-I (in dem der Verlust der Aromatizität an Position 24 mit der Deletion der Carboxy-terminalen D-Region von hIGF-I kombiniert ist, das eine geringere Affinität als (Leu²⁴)IGF-I für den Typ-I-Rezeptor und eine höhere Affinität für den Insulin-Rezeptor hat). Diese vier Mutanten haben normale Affinitäten für menschliche Serumbindungsproteine.
Bayne et al., J. Biol. Chem., 264: 11004–11008 (1988) offenbaren drei strukturelle Analoga von IGF-I: (I-62)IGF-I, dem die Carboxy-terminale 8-Aminosäuren-D-Region von IGF-I fehlt; (1-27, Gly⁴,38–70)IGF-I, worin die Reste 28–37 der C-Region von IGF-I durch eine Glycin-Brücke mit vier Resten ersetzt ist, und (1–27,Gly⁴,38–62)IGF-I, mit einem Glycin-Austausch der C-Region und einer Deletion der D-Region. Peterkofsky et al., Endocrinology, 128: 1769–1779 (1991) offenbaren Daten unter Verwendung der Gly⁴-Mutante von Bayne et al., supra, Bd. 264. U.S. Pat. Nr. 5,714,460 bezieht sich auf die Verwendung von IGF-I oder einer Verbindung, die die aktive Konzentration von IGF-I erhöht, um neurale Schäden zu behandeln.
Cascieri et al., J. Biol. Chem., 264: 2199–2202 (1989) offenbaren drei IGF-I-Analoga, in denen spezifische Reste in der A-Region von IGF-I durch die korrespondierenden Reste der A-Kette von Insulin ersetzt sind. Die Analoga sind:
(Ile⁴¹,Glu⁴⁵,Gln⁴⁶,Thr⁴⁹,Ser⁵⁰,Ile⁵¹,Ser⁵³,Tyr⁵⁵,Gln⁵⁶)IGF-I, eine A-Ketten-Mutante, in der der Rest 41 von Threonin zu Isoleucin verändert ist und die Reste 42–56 der A-Region ersetzt sind; (Thr⁴⁹,Ser⁵⁰,Ile⁵¹)IGF-I; und (Tyr⁵⁵,Gln⁵⁶)IGF-I.
WO 94/04569 offenbart ein von dem natürlichen IGFBP verschiedenes, spezifisches Bindemolekül, das fähig ist, an IGF-I zu binden und das die biologische Aktivität von IGF-I erhöhen kann. WO 98/45427, veröffentlicht am 15. Oktober 1998, und Lowman et al., supra, offenbaren IGF-I-Agonisten, die durch Phagenpräsentation identifiziert wurden.
Auch WO 97/39032 offenbart Ligandeninhibitoren von IGFBPs und Verfahren für ihre Verwendung. Außerdem offenbart U.S. Pat. Nr. 5,891,722 Antikörper mit Bindungsaffinität für freies IGFBP-1 und Vorrichtungen und Verfahren für den Nachweis von freiem IGFBP-1 und von einem Riss in der fötalen Membran auf der Basis der Anwesenheit von Fruchtwasser in einem Vaginalsekret, was durch die Anwesenheit von freiem IGFBP-1 in dem Vaginalsekret gezeigt wird.
Trotz all dieser Anstrengungen ist das Bild des IGFBP-Bindungsepitops auf IGF-I unscharf und mit einer geringen Auflösung geblieben. Die früheren Studien umfassten zumeist Insertionen homologer Insulinregionen in IGF-I oder Proteinverkürzungen (z.B: des(1–3)-IGF-I) und unterschieden nicht zwischen Effekten aufgrund von Missfaltungen und wirklichen Bindungsdeterminanten. Eine Kombination der Ergebnisse all dieser Studien wird außerdem durch den Umstand verkompliziert, dass verschiedene Techniken verwendet wurden, um die Komplexbildung der mutierten IGF-Formen mit den IGFBPs zu analysieren, die von radiomarkierten Ligandenbindungsversuchen bis zu Biosensoranalysen reichten.
Es ist gut abgesichert, dass das GH/IGF/IGFBP-System an der Regulation der anabolischen und metabolischen Homöostase beteiligt ist und dass Fehler in diesem System das Wachstum, die Physiologie und die glykämische Kontrolle nachteilig beeinflussen können (Jones et al., Endocr. Rev., 16: 3–34 (1995); Davidson, Endocr. Rev., 8: 115–131 (1987); Moses, Curr. Opin. Endo. Diab., 4: 16–25 (1997)). Neuere Daten weisen auf eine erweiterte Rolle für IGFBPs bei der Regulation sowohl der Plasmaspiegel als auch der Bioaktivität von GH und IGF-I hin (Jones et al., supra; Lewitt et al., Endocrinology, 129: 2254–2256 (1991); Rosenfield et al., „IGF-I treatment of syndromes of growth hormone insensitivity", in: The insulin-like growth factors and their regulatory proteins. Hrsg. Baxter RC, Gluckman PD, Rosenfield RG. Excerpta Medica, Amsterdam, 1994), S. 357–464; Lee et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 216: 319–357 (1997); Cox et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 135: 1913–1920 (1995); Lewitt et al., Endocrinology, 133: 1797–1802 (1993)). Veränderungen von IGFBP-Spiegeln können zu klinischen Manifestationen von entweder IGF-Überschuss oder -Mangel führen und auch zu GH-Resistenz beitragen (Barreca et al., JCEM, 83: 3534–3541 (1998); Shmueli et al., Hepatology, 24: 127–133 (1996); Murphy et al., Prog. Growth Factor Res., 6: 425–432 (1996); Rajkumar et al., Endocrinology, 136: 4039–4034 (1995); Hall et al., Acta Endocrinol. (Copenh.), 118: 321–326 (1988); Ross et al., Clin. Endocrinol., 35: 47–54 (1991); Scharf et al., J. Hepatology, 25: 689–699 (1996)).
Die beiden IGFBPs, die hauptsächlich verantwortlich für die Regulation der biologischen Aktivität sowohl von IGFs als auch von GH zu sein scheinen, sind IGFBP-1 und IGFBP-3. IGFBP-3 scheint das hauptsächlich für die Regulation der Gesamtspiegel von IGF-I und IGF-II im Plasma verantwortliche IGFBP zu sein. IGFBP-3 ist ein GH-abhängiges Protein und ist bei Fällen von GH-Mangel oder -Resistenz verringert (Jones et al., supra; Rosenfield et al., supra; Scharf et al., supra). Es wird allgemein angenommen, dass IGFBP-1 ein Inhibitor der IGF-Aktivität ist, und IGFBP-1 ist bei den meisten Fällen von GH-resistenten Zuständen, wie Diabetes, Nierenversagen, Stauungsinsuffizienz (congestive heart failure), Leberversagen, Unterernährung, Wasting-Syndromen und bei nahezu allen katabolischen Zuständen erhöht (Lewitt et al., 1993, supra; Barreca et al., supra; Scharf et al., supra; Bereket et al., Endocrinology, 137: 2238–2245 (1996); Crown und Holly, Clin. Nutrit., 14: 321–328 (1995); Underwood und Backeljauw, J. Int. Med., 234: 571–577 (1993); Thrailkill et al., J. Clin. Endo. Metab., 82(4): 1181–1187 (1997)). Die meisten dieser Erkrankungszustände sind durch das folgende biochemische Profil gekennzeichnet: gestörte Glucose-Kontrolle, Entzündung, überschüssige IGFBP-1-Spiegel, niedrige IGFBP-3-Spiegel, niedrige IGF-Bioaktivität und überschüssige GH-Spiegel (Jones et al., supra; Barreca et al., supra; Shmueli et al., supra; Murphy et al., supra; Rajkumar et al., supra; Hall et al., supra; Ross et al., supra; Bereket et al., supra; Crown und Holly, supra; Bereket et al., Clinical Endocrinology, 45(3): 321–326 (1996); Batch et al., J. Clin. Endo. Metab., 73: 964–968 (1991); Powell et al., The Southwest Pediatric Nephrology Study Group, Kidney Int., 51: 1970–1979 (1997)).
Glucocorticoide wurden mit einer Verringerung der Proteinsynthese und einer Zunahme des Protein-Katabolismus in Verbindung gebracht (Simmons et al, J. Clin. Invest., 73: 412-420 (1984)) sowie mit einer Zunahme der Ausscheidung von Stickstoff im Urin (Sapir et al., Clin. Sci. Mol. Med., 53: 215–220 (1977)). Diese Wirkungen mögen teilweise durch eine Verringerung der Wachstumshormon-Sekretion vermittelt werden (Trainer et al., J. Endocrinol., 134: 513–517 (1991)) oder durch eine direkte Wirkung von Glucocorticoiden auf der Gewebeebene (Baron et al., Am. J. Physiol., 263: E489–E492 (1992)), die zu einer Beeinflussung der lokalen Produktion von IGF-I und IGFBPs führt (McCarthy et al., Endocrinology, 126: 1569–1575 (1990); Lee et al., supra) und einer Antagonisierung der Insulinwirkung (Horber et al., Diabetes, 40: 141–149 (1991)). Frühere Studien an Ratten haben gezeigt, dass rekombinantes menschliches IGF-I und seine Analoga der katabolischen Wirkung von Glucocorticoidanaloga, wie Dexamethason, entgegenwirken können (Tomas et al., Biochem. J., 282: 91–97 (1992)). Außerdem wurde gezeigt, dass Insulin den Proteinkatabolismus verbessern kann (Woolfson et al., N. Eng. J. Med., 300: 14–17 (1979)).
Kombinationstherapien wurden ebenfalls offenbart. Zum Beispiel beschreiben Fuller et al., Biochem Soc Trans, 19: 277S (1991) die Verwendung von Insulin und IGF zur Stimulation der Proteinsynthese des Herzens. Umpleby et al., Europ. J. Clin. Invest., 24: 337–344 (1994) offenbaren die Behandlung von Hunden, die über Nacht gehungert hatten, mit Insulin und IGF, um die Auswirkungen auf den Proteinmetabolismus zu bestimmen. Außerdem offenbart U.S. Pat. Nr. 5,994,303 die Verwendung einer Kombination von Insulin und IGF-I, um einer Abnahme des Stickstoffgleichgewichts und der Proteinsynthese entgegenzuwirken.
In Bezug auf Nierenversagen wurde berichtet, dass IGF-I eine Vielzahl von Wirkungen auf die Niere ausübt (Hammerman und Miller, Am. J. Physiol., 265: F1–F14 (1993)). Es ist seit Jahrzehnten bekannt, dass die bei Patienten mit Acromegalie beobachtete Zunahme der Nierengröße von einer signifikanten Erhöhung der glomerulären Filtrationsrate begleitet ist (O'Shea und Layish, J. Am. Soc. Nephrol., 3: 157–161 (1992)). U.S. Pat. Nr. 5,273,961 offenbart ein Verfahren zur prophylaktischen Behandlung von Säugern mit einem Risiko für akutes Nierenversagen. Die Infusion des Peptids bei Menschen mit normaler Nierenfunktion erhöht die glomeruläre Filtrationsrate und den Plasmafluss der Nieren (Guler et al., Acta Endocrinol., 121: 101–106 (1989); Guler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2868–2872 (1989); Hirschberg et al., Kidney Int., 43: 387–397 (1993); U.S. Pat. Nr. 5,106,832). Außerdem reagieren Menschen mit gemäßigt verringerter Nierenfunktion auf kurzzeitige (vier Tage) IGF-I-Verabreichung mit einer Erhöhung der glomerulären Filtrations- und Plasmaflussrate der Nieren. Folglich ist IGF-I ein möglicher therapeutischer Wirkstoff bei chronischem Nierenversagen (O'Shea et al., Am. J. Physiol., 264: F917–F922 (1993)).
Die Verwendung von IGF-I oder seiner Analoga zur Behandlung von Säugern, die an Nierenfunktionsstörungen, wie z.B. polyzystischer Nierenerkrankung und verwandten Indikationen, Nierendysplasien und/oder Nierenhypoplasien leiden, ist in U.S. Pat. Nr. 5,985,830 beschrieben. Dieses Patent berichtet auch, dass IGF-I ein wirksamer Wirkstoff für die Förderung der glumerulären Entwicklung und Nierenentwicklung in Säugern ist, die an chronischem Organschaden leiden.
Außerdem kann die Nierenfunktion über einen Zeitraum von Tagen verbessert werden, indem IGF-I bei chronischem Nierenversagen im Endzustand verabreicht wird. Das ist wichtig, weil das chronische Nierenversagen im Endzustand ein Zustand ist, der nur mit Dialyse oder Transplantation behandelt werden kann und dessen Häufigkeit schnell zunimmt. Diabetiker und ältere Personen neigen zu diesem Zustand. Annähernd sechzig Prozent der Patienten mit chronischem Nierenversagen im Endzustand sind von der Hämodialyse betroffen, ungefähr zehn Prozent von der Peritonealdialyse, und die verbleibenden in etwa dreißig Prozent erhalten ein Transplantat. Eine Dialysetherapie wird jedes Jahr bei über 50.000 Patienten in den Vereinigten Staaten begonnen. Weiteren 25 der Patienten mit Nierenversagen im Endzustand wird jedes Jahr der Zugang zur Dialyse verwehrt. Die Kosten für die Behandlung dieser von Dialyse betroffenen Patienten betragen im Durchschnitt über 200 Millionen $ pro Monat. Außerdem haben die Patienten während der Dialyse einen beeinträchtigten Lebensstil. Obwohl IGF-I die Nierenfunktion derjenigen verbessern kann, die ein Nierenversagen im Endzustand erleiden, dauern die Verbesserungen der glomerulären Filtrationsrate und des Nierenplasmaflusses, die von IGF-I kurzfristig hervorgerufen werden, während einer langfristigen Verabreichung nicht an, und die Häufigkeit von Nebenwirkungen ist hoch (Miller et al., Kidney International, 46: 201–207 (1994)).
Die Dynamik der Wechselwirkungen von IGF-I mit empfänglichen Geweben sind komplex und unvollständig verstanden. Die biologische Aktivität von zirkulierendem IGF-I wird von den Spiegeln von Plasma-IGFBPs reguliert, die IGF-I-Wirkungen sowohl verstärken als auch hemmen (Cohick und Clemmons; Annu. Rev. Physiol., 55: 131–153 (1993); Kupfer et al., J. Clin. Invest., 91: 391–396 (1993)). Außerdem regulieren in Geweben vorhandene IGFBPs die Wechselwirkung von zirkulierendem IGF-I mit seinem Rezeptor. Die IGF-I-Rezeptordichte im Gewebe wird von Veränderungen der Spiegel von zirkulierendem IGF-I verändert. In der Niere stehen die Anzahlen von IGF-I-Rezeptoren in umgekehrtem Verhältnis zu den Spiegeln von zirkulierendem IGF-I (Hise et al., Clin. Sci., 83: 223–239 (1991)).
Es ist bekannt, dass unter manchen Umständen erhöhte Spiegel von zirkulierendem IGF-I mit langfristigen Veränderungen der Nierenfunktion verbunden sind oder diese direkt verursachen. Zum Beispiel halten die Erhöhungen der Clearance von Insulin und PAH, die die Erhöhungen von zirkulierendem GH und IGF-I in Patienten mit Acromegalie begleiten, über Jahre an (Ikkos et al., Acta Endocrinol., 21: 226–236 (1956)). Eine Erhöhung der Kreatinin-Clearance erfolgte innerhalb der ersten 12 Tage einer IGF-I-Verabreichung an einen GH-insensitiven Laron-Zwerg. Die Erhöhung nahm während der nächsten 59 Tage zu (Walker et al., J. Pediatr., 121: 641–646 (1992)).
GH stimuliert die Synthese von IGFBP-3 in der Leber (Hammerman und Miller, supra; Cohick und Clemmons, supra; Kupfer et al., supra). Es ist die Verringerung der Spiegel von zirkulierendem GH, die sich aus der Hemmung der GH-Freisetzung der Hypophyse durch IGF-I ergibt, von der man annimmt, dass sie zu dem Abfall von zirkulierendem IGFBP-3 bei Menschen führt, denen IGF-I verabreicht wurde. Wegen ihrer GH-Unempfindlichkeit sind bei Laron-Zwergen die IGFBP-3-Spiegel niedrig und werden durch IGF-I erhöht (Kenety et al., Acta Endocrinol., 128: 144–149 (1993)). Dieser Unterschied oder ein anderer des IGF-I-Effektorsystems könnte das Fehlen der Unempfindlichkeit gegenüber IGF-I bei diesen Personen erklären.
Walker et al., supra, haben gefunden, dass IGF-I die Kalziumausscheidung im Urin oder das Urinvolumen erhöhte. Miller et al., supra, sahen keine solche Wirkung. IGF-I erhöht auch den Transport von Phosphat über die proximale tubuläre Bürstensaummembran (Quigley und Baum, J. Clin. Invest., 88: 368–374 (1991)). Patienten mit langjähriger Acromegalie zeigten eine deutliche Nierenhypertrophie und hatten höher als normale glomeruläre Filtrationsraten, was darauf hindeutete, dass die Hyperfiltration, die die langjährigen Erhöhungen des zirkulierenden GH und IGF-I bei Menschen begleitet, für die Nieren nicht schädlich ist (Ikkos et al., supra; Hoggenberg et al., Acta Endocrinol., 129: 151–157 (1993)).
Die periodische Verabreichung von IGF-I zur Behandlung chronischer Fehlfunktionen, wie chronischen Nierenversagens, ist in den U.S.-Patenten Nr. 5,565,428 und 5,741,776 offenbart.
Unter klinischen Bedingungen sind die Spiegel von zirkulierendem IGF-I bei präterminalem chronischem Nierenversagen (CRF) normal und bei der Nierenerkrankung im Endstadium geringfügig verringert (Powell et al., Am. J. Kindey, 10: 287–292 (1987); Blum et al., Pediatr. Nephrol., 5: 539–544 (1991); Tönshoff et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 80: 2684–2691 (1995); Tönshoff et al., Pediatr. Nephrol., 10: 269–274 (1996)). Im Unterschied dazu sind IGFBP-1, IGFBP-2 und IGFBP-3-Fragmente mit niedrigem Molekulargewicht bei chronischem Nierenversagen im Verhältnis zu dem Ausmaß der Nierenfehlfunktion im Serum erhöht (Lee et al., Pediatr. Res., 26: 308–315 (1989); Liu et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 70: 620–628 (1990); Powell et al., Pediatr. Res., 33: 136-143 (1993)). Die biologische Wirkung von IGF-I wird durch den Typ-I-IGF-Rezeptor vermittelt. Weil IGFBPs mit ähnlichen oder höheren Affinitäten wie denjenigen des Typ-I-IGF-Rezeptors an IGFs binden, ist der Überschuss an ungesättigten, hochaffinen IGFBPs in CRF-Serum in der Lage, die IGF-Wirkung auf Zielgewebe zu hemmen, indem sie mit dem Typ-I-IGF-Rezeptor um die Bindung an IGF konkurrieren (Tönshoff et al., Prog. Growth Factor Res., 6: 481–491 (1996)). Tatsächlich wurden erhöhte IGFBP-Spiegel in CRF als Inhibitoren der IGF-Bioaktivität sowohl in vitro (Blum et al., supra) als auch in vivo (Tönshoff et al., supra, 1995) identifiziert.
Wenig ist über die Produktionsraten von IGF-I und IGFBPs bei CRF bekannt. Es wurde vorgeschlagen, dass die Konstellation von erhöhtem IGFBP bei normalen IGFs auf eine verringerte IGF-I-Sekretionsrate bei CRF hinweist, weil unter normalen Bedingungen erwartet würde, dass eine erhöhte IGF-Bindungskapazität sofort durch in der Leber produzierte IGFs gesättigt würde (Blum, Acta Paediatr. Scand. [Suppl], 379: 24–31 (1991)). Die frühere Analyse von Plasma-IGFBP-Spiegeln bei klinischem CRF hatte auch darauf hingedeutet, dass eine erhöhte IGFBP-2-Produktionsrate zu erhöhten IGFBP-Spiegeln in CRF-Plasma beitragen könnte (Tönshoff et al., supra, 1995). Diese beiden Hypothesen wurden überprüft, indem die hepatische IGF-I-Genexpression und die Plasmaspiegel von IGFBP-1, -2, -3 und -4 in einem Rattenmodell experimenteller Urämie analysiert wurden und indem die Genexpression von IGFBP-1, -2 und -4 in der Leber und Niere analysiert wurde (Tönshoff et al., Endocrinology, 138: 938–946 (1997)). Die Autoren fanden, dass eine erniedrigte hepatische IGF-I- und eine erhöhte IGFBP-1- und IGFBP-2-Genexpression bei experimenteller Urämie auftreten.
Für vollständige Übersichtsartikel über die Wirkung von IGF-I auf die Niere siehe z.B. Hammerman und Miller, Am. J. Physiol., 265: F1–F14 (1993) und Hammerman und Miller, J. Am. Soc. Nephrol., 5: 1–11 (1994).
Die Behandlung von Patienten mit einer Fehlregulation der GH/IGF-Achse, die Nierenfunktionsstörungen einschließt, mit IGF-I mag aufgrund der abnormen Verteilung der IGFBPs, hauptsächlich aufgrund hoher IGFBP-1-Spiegel, ohne Erfolg sein. Deshalb könnte eine IGF-I-Mutante mit einer verringerten Affinität für IGFBP-1 ohne Verlust der Fähigkeit, IGFBP-3 zu binden, eine einzigartige und wirksame Therapie für die klinischen Zustände sein, die durch solch eine Fehlregulation gekennzeichnet sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Demgemäß stellt die Erfindung in einem Ausführungsbeispiel eine IGF-I-Variante bereit, worin der Aminosäurerest an Position 49 der nativen Sequenz des menschlichen IGF-I durch einen Alanin- oder einen Glycin-Rest ersetzt ist.
Außerdem wird hierin eine Zusammensetzung bereitgestellt, die die Variante in einem Träger umfasst, vorzugsweise einem pharmazeutisch geeigneten Träger. Vorzugsweise ist die Zusammensetzung steril.
Zusätzlich wird hierin ein Verfahren zur Behandlung einer Funktionsstörung bereitgestellt, die durch Fehlregulation der GH/IGF-Achse in einem Säuger gekennzeichnet ist, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge der wie oben beschriebenen Variante an den Säuger. Der Säuger ist vorzugsweise ein Mensch, und die Funktionsstörung ist vorzugsweise eine Nierenfunktionsstörung, mehr bevorzugt Nierenversagen.
Das erfindungsgemäße Peptid kann alleine oder gemeinsam mit einem aktiven Wirkstoff für die jeweils zu behandelnde Funktionsstörung verabreicht werden, zum Beispiel einem Nieren-aktiven Wirkstoff, wie z.B. BQ-123 für Nierenfunktionsstörungen.
Die Erfindung betrifft auch ein Kit, das einen Behälter umfasst, der eine pharmazeutische Zusammensetzung enthält, die das erfindungsgemäße Peptid enthält und Anweisungen, die den Anwender anleiten, die Zusammensetzung für die Behandlung einer Funktionsstörung zu verwenden, die durch Fehlregulation der GH/IGF-Achse in einem Säuger gekennzeichnet ist. Falls die Funktionsstörung eine Nierenfunktionsstörung ist, kann das Kit wahlweise außerdem einen Behälter umfassen, der ein Nieren-aktives Molekül enthält.
Zur Identifizierung der erfindungsgemäßen Peptide wurde menschliches IGF-I monovalent auf filamentösen Phagemid-Partikeln präsentiert (U.S. Pat. Nr. 5,750,373 und 5,821,047), und eine vollständige Alanin-Scanning-Mutagenese von diesen (Cunningham und Wells, Science, 244: 1081–1085 (1989); U.S. Pat. Nr. 5,834,250) wurde mittels Phagenpräsentation („turbo-ala scan") (Cunningham et al. EMBO J., 13: 2508–2515 (1994); Lowman, Methods Mol. Biol., 87: 249–264 (1998)) durchgeführt. Die mutierten IGF-Phagemide wurden verwendet, um die Bindungsdeterminanten auf IGF-I für IGFBP-1 und IGFBP-3 zu kartieren. Das Alanin-Scanning enthüllt Spezifizitätsdeterminanten für diese Bindungsproteine, um Bindungsprotein-spezifische IGF-Varianten herzustellen, die spezifisch an IGFBP-1 oder IGFBP-3 binden, um ihre Clearance-Halbwertzeit zu modulieren, ihre proteolytische Stabilität zu verbessern oder ihre Gewebeverteilung in vivo zu verändern. Diese Mutanten sollten nützlich für die Kartierung der funktionellen Bindungsstelle für den IGF-Rezeptor sein, über dessen Kristallstruktur kürzlich berichtet wurde (Garret et al., supra). Außerdem kann es von Interesse sein, die Epitope verschiedener IGF-bindender Antikörper oder anderer Peptide oder Proteine, die an IGF-I binden, zu kartieren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A und 1B zeigen einen Phagen-ELISA der Variante GlS-A70V-IGF-I, die an IGFBP-1 (1A) und IGFBP-3 (1B) bindet. Mit 1 μg/ml IGFBP-1 (1A) oder IGFBP-3 (1B) beschichtete Mikrotiterplatten wurden in Anwesenheit der angegebenen Mengen des löslichen Kompetitor-Proteins IGFBP-1 (1A) oder IGFBP-3 (1B) mit Phagenpartikeln inkubiert, die GlS-A70V präsentierten. Die halb-maximale Hemmkonzentration (IC₅₀) des Kompetitors, d.h. die inhibitorische Konzentration des Kompetitors, die zu einer halb-maximalen Bindung des Phagemids in dem jeweiligen Experiment führten, ist für das jeweilige IGFBP angegeben.
Die 2 zeigt die Abnahme oder die Zunahme der IGFBP-Affinität für die durch Phagen-ELISA getesteten IGF-I-Mutanten. Die relativen IC₅₀-Werte (IC_50mut/IC_50GlS-A70V) jeder IGF-I-Alaninmutante (Affinitätsänderungen jeder Mutante für die Bindungsproteine im Vergleich zu IGF-IGlS-A70V) sind für IGFBP-1 (gefüllte Balken) und IGFBP-3 (leere Balken) gezeigt. Die Daten stammen aus der Tabelle 1 unten. Relative IC₅₀-Werte <1 zeigen eine Zunahme der Affinität an; Werte > 1 zeigen einen Affinitätsverlust an. Das Sternchen zeigt an, dass die jeweiligen Varianten nicht auf einem Phagen präsentiert wurden, wie anhand der Antikörperbindung geschlossen wurde.
Die 3A und 3B zeigen die Bindungsspezifität der IGF-I-Variante F49A, die IGFBP-1 bzw. -3 in einem Kompetitions-Phagen-ELISA auf dem Phagen präsentiert wurde. Phagemid-Partikel, die F49A präsentierten (Quadrate) wurden in der Gegenwart der angegebenen Mengen von löslichem IGFBP-1 (3A) oder IGFBP-3 (3B) an Platten gebunden, die mit IGFBP-3 beschichtet waren. Das gleiche Experiment wurde parallel mit einem Phagen durchgeführt, der die Wildtyp-ähnliche IGF-I-Variante GlS-A70V (Kreise) präsentierte. Siehe die Tabellen I und II unten für die absoluten IC₅₀-Werte: Die Datenpunkte sind Durchschnitt ± Standardabweichung, n = 2. Immunsorbierende Platten wurden mit 1 μg/ml IGFBP-3 beschichtet, und ELISAs wurden wie in den Beispielen unten beschrieben durchgeführt, wobei parallel Wildtyp-IGF-I-Phage (WT, Kreise) und IGF-F49A-Phage (F49A, Quadrate) verwendet wurden. Die Experimente wurden doppelt durchgeführt, und die Datenpunkte sind als Durchschnitt ± Standardabweichung gezeigt.
Die 4 offenbart einen Sequenzvergleich von menschlichem IGF-I der nativen Sequenz (bezeichnet wtIGF) (SEQ ID NR:1), menschlichem Proinsulin der nativen Sequenz (bezeichnet Proinsulin) (SEQ ID NR:2) und menschlichem Insulin der nativen Sequenz (bezeichnet Insulin (B-Kette), gefolgt von Insulin (A-Kette)) (SEQ ID NR:3). Die Sternchen und Punkte zeigen Sequenzidentität bzw. Sequenzähnlichkeit an den angegebenen Aminosäurepositionen zwischen den drei Sequenzen an.
Die 5A–5D zeigen eine Biosensor-Analyse der IGFBP-Bindung an immobilisierte IGF-I-Varianten. Sensorgramme sind für IGFBP-1 (5A, 5C) oder IGFBP-3 (5B, 5D) gezeigt, die an immobilisiertes Wildtyp-IGF-I (5A, 5B) oder die F49A-IGF-Variante (5C, 5D) binden. Die Ligandenkonzentrationen in jedem Experiment waren 1 μM, 500 nM und 250 nM. Siehe Tabelle II wegen der kinetischen Parameter.
Die 6A–6B zeigen ein Modell der funktionellen Bindungsepitope für IGFBP-1 bzw. IGFBP-3 auf der Oberfläche von IGF-I. Die Aminosäure-Seitenketten wurden entsprechend ihrem relativen Beitrag zur Bindungsenergie klassifiziert (Tabelle I) und wie folgt farbig dargestellt: keine Wirkung (grau); 2–5-facher Verlust der apparenten Affinität (gelb); 5–10-fach (orange); 10–100-fach (hellrot); > 100-fach (dunkelrot). Falls verfügbar, wurden die Nummern der Phagen-ELISA-Versuche in der Tabelle I unten verwendet. BIACORE^TM-Daten wurden stattdessen für die V11A-, R36A- und P39A-Varianten (Tabelle II) verwendet. Die NMR-Struktur von IGF-I (Cooke et al., supra) wurde unter Verwendung des Programms Insight II^TM (MSI, San Diego, CA) dargestellt. Das Bindungsepitop für IGFBP-1 (6A) liegt auf der „oberen" und „unteren" Seite der N-terminalen Helix (Reste 8–17), verbunden durch den energetisch wichtigen Rest F49. Bei IGFBP-3 (6B) tragen einzelne IGF-I-Seitenketten sehr wenig Bindungsenergie bei. Das Bindungsepitop hat sich von dem N-Terminus weg verlagert und schließt neuerdings G22, F23, Y24 ein.
Die 7 zeigt die in einem kompetitiven BIACORE^TM-Bindungsexperiment bestimmte Menge von gebundenem IGFBP-1, die gegen die IGF-Variantenkonzentration von E3A/F49A (Quadrate) und F49A (Kreise) aufgetragen wurde.
Die 8A und 8B zeigen jeweils die IGF-I-Aktivität in nM-Einheiten, die für mehrere IGF-I-Varianten bei den Variantenkonzentrationen 13 nM (hoch) und 1,3 nM (niedrig) unter Verwendung einer IGF-I-KIRA-optische-Dichte-Analyse berechnet wurde. Das für jede IGF-Variante erhaltene Signal wurde mit dem einer Standard- Verdünnungsreihe von Wildtyp-IGF-I verglichen und als apparente IGF-I-Konzentration wiedergegeben, die der beobachteten Aktivität entsprach.
Die 9A und 9B zeigen IGF-Rezeptor-Aktivierungskurven für F49A-IGF-I (9A) und E3A/F49A- (9B) sowie für Wildtyp-IGF-I, die unter Verwendung von Verdünnungsreihen in KIRA-Tests gemessen wurden. Die Varianten sind durch Quadrate wiedergegeben, und das Wildtyp-IGF-I ist durch Kreise wiedergegeben.
Die 10A und 10B zeigen eine Bewertung vorläufiger pharmakologischer Eigenschaften von F49A- und E3A/F49A-IGF-I, die radiomarkiert und Ratten intravenös verabreicht wurden. Die 10A zeigt einen Zeitverlauf der Rate, mit der beide Moleküle aus dem Blut der Tiere beseitigt wurden, wobei die Quadrate Wildtyp-IGF-I repräsentieren, die Kreise E3A/F49A-IGF-I repräsentieren und die Rauten F49A-IGF-I repräsentieren. Die 10B zeigt das Gewebe-zu-Blut-Verhältnis für diese beiden IGF-Varianten in verschiedenen Organen, nämlich Niere, Leber, Milz, Herz und Bauchspeicheldrüse, nach 5, 15 und 30 Minuten, wobei die gefüllten Balken Wildtyp-IGF-I repräsentieren, die gepunkteten Balken E3A/F49A-IGF-I repräsentieren und die gestreiften Balken F49A-IGF-I repräsentieren.
Die 11 zeigt Circulardichroismusspektren von Wildtyp-IGF-I (Kreise), F49A-IGF-I (Quadrate) und E3A/F49A-IGF-I (Rauten).
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele
A. Definitionen
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Säuger" für Behandlungszwecke auf ein beliebiges Tier, das als Säuger klassifiziert ist, einschließlich Menschen, domestizierte Tiere und Nutztiere und Zoo-, Sport- oder Haustiere, wie z.B. Hunde, Pferde, Katzen, Schafe, Schweine, Rinder etc. Der hierin bevorzugte Säuger ist ein Mensch. Der Ausdruck „nicht-erwachsen" bezieht sich auf Säuger mit einem Alter vom perinatalen Alter (wie z.B. Säuglinge mit niedrigem Geburtsgewicht) bis zum Pubertätsalter, wobei die letzteren solche sind, die noch nicht ihr volles Wachstumspotenzial erreicht haben.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „IGF" auf nativen insulinähnlichen Wachstumsfaktor I und nativen insulinähnlichen Wachstumsfaktor II, sowie natürliche Varianten davon, wie z.B. Gehirn-IGF, das auch als des(1–3)-IGF-I bekannt ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich IGF-I auf insulinähnlichen Wachstumsfaktor I aus einer beliebigen Spezies, einschließlich Rind, Schaf, Schwein, Pferd und Mensch, vorzugsweise Mensch, und, falls bezogen auf eine exogene Verabreichung, aus einer beliebigen Quelle, ob natürlich, synthetisch oder rekombinant. Menschliches IGF-I „nativer Sequenz", dessen Sequenz in 4 (SEQ ID NR:1) gezeigt ist, wird z.B. durch das in EP 230,869 , veröffentlicht am 5. August 1987, EP 128,733 , veröffentlicht am 19. Dezember 1984 oder EP 288,451 , veröffentlicht am 26. Oktober 1988, beschriebene Verfahren hergestellt. Mehr bevorzugt wird dieses IGF-I nativer Sequenz rekombinant hergestellt und ist von Genentech, Inc., South San Francisco, CA, für klinische Untersuchungen erhältlich.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „IGF-II" auf insulinähnlichen Wachstumsfaktor II aus einer beliebigen Spezies, einschließlich Rind, Schaf, Schwein, Pferd und Mensch, vorzugsweise Mensch, und, falls bezogen auf eine exogene Verabreichung, aus einer beliebigen Quelle, ob natürlich, synthetisch oder rekombinant. Es kann nach dem z.B. in EP 128,733 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Ein „IGFBP" oder ein „IGF-Bindungsprotein" bezieht sich auf ein Protein oder ein Polypeptid, das normalerweise mit IGF-I oder IGF-II assoziiert oder daran gebunden oder komplexiert ist, sei es, dass es zirkulatorisch ist (d.h. in Serum oder Gewebe) oder nicht. Solche Bindungsproteine schließen keine Rezeptoren ein. Diese Definition schließt IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6, Mac 25 (IGFBP-7) und Prostacyclin-stimulierenden Faktor (PSF) oder Endothelzell-spezifisches Molekül (ESM-1), sowie andere Proteine mit hoher Homologie zu IGFBPs ein. Mac 25 ist zum Beispiel in Swisshelm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 4472–4476 (1995) und Oh et al., J. Biol. Chem., 271: 30322–30325 (1996) beschrieben. PSF ist in Yamauchi et al., Biochemical Journal, 303: 591–598 (1994) beschrieben. ESM-1 ist in Lassalle et al., J. Biol. Chem., 271: 20458–20464 (1996) beschrieben. Wegen weiterer identifizierter IGFBPs siehe z.B. EP 375,438 , veröffentlicht am 27. Juni 1990; EP 369,943 , veröffentlicht am 23. Mai 1990; WO 89/09268, veröffentlicht am 5. Oktober 1989; Wood et al., Molecular Endocrinology, 2: 1176–1185 (1988); Brinkman et al., The EMBO J., 7: 2417–2423 (1988); Lee et al., Mol. Endocrinol., 2: 404–411 (1988); Brewer et al., BBRC, 152: 1289–1297 (1988); EP 294,021 , veröffentlicht am 7. Dezember 1988; Baxter et al., BBRC, 147: 408–415 (1987); Leung et al., Nature, 330: 537–543 (1987); Martin et al., J. Biol. Chem., 261: 8754–8760 (1986); Baxter et al., Comp. Biochem. Physiol., 91B: 229–235 (1988); WO 89/08667, veröffentlicht am 21. September 1989, WO 89/09792, veröffentlicht am 19. Oktober 1989; und Binkert et al., EMBO J., 8: 2497–2502 (1989).
Der Ausdruck „Körperflüssigkeit" bezieht sich auf eine biologische Probe einer Flüssigkeit aus einem Säuger, vorzugsweise aus einem Menschen. Solche Flüssigkeiten schließen wässrige Flüssigkeiten, wie z.B. Serum, Plasma, Lymphflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Follikelflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Amnionflüssigkeit, Milch, Gesamtblut, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Sputum, Tränen, Schweiß, Schleim, Gewebekultur-Medium, Gewebeextrakte und zelluläre Extrakte, ein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „menschlicher IGF-Rezeptor" auf einen beliebigen Rezeptor für ein in Menschen gefundenes IGF und schließt die Typ-1- und Typ-2-IGF-Rezeptoren in Menschen ein, an die sowohl menschliches IGF-I als auch IGF-II bindet, wie z.B. den placentalen Typ-1-IGF-I-Rezeptor etc.
„Peptide" schließen eine/n IGF-I-Agonisten/IGF-I-Variante ein, der/die wenigstens zwei Aminosäuren hat, und schließen Polypeptide ein, die wenigstens in etwa 50 Aminosäuren haben. Die Definition schließt Peptidderivate, ihre Salze oder optischen Isomere ein.
Eine „Funktionsstörung, gekennzeichnet durch Fehlregulation der GH/IGF-Achse" bezieht sich auf einen Zustand in einem Säuger, umfassend oder führend zu Defekten in dem GH/IGF/IGFBP-System, das an der Regulation der anabolischen und metabolischen Homöostase beteiligt ist. Solche Funktionsstörungen sind gekennzeichnet durch Wachstumsdefekte, physiologische Defekte und/oder Defekte der glykämischen Kontrolle und Defekte mit klinischen Manifestationen von entweder IGF-Überschuss oder -Mangel und/oder GH-Resistenz und/oder -Mangel, wobei sich letzterer durch verringerte Spiegel von IGFBP-3 und/oder erhöhte Spiegel von IGFBP-1 äußert. Beispiele schließen solche Funktionsstörungen wie hyperglykämische Funktionsstörungen, Nierenfunktionsstörungen, Stauungsinsuffizienz (congestive heart failure), Leberversagen, Unterernährung, Turner-Syndrom, Down-Syndrom, ein Wasting-Syndrom, das eine Abnahme der Proteinsynthese einschließt, wie z.B. AIDS-Wasting, und katabolische Zustände, gekennzeichnet durch erhöhte IGFBP-Spiegel (wie z.B. IGFBP-1-Spiegel) im Vergleich zu solchen Spiegeln in Säugern ohne eine solche Funktionsstörung, wie z.B. eine kritische Erkrankung, eine Funktionsstörung, die eine Abnahme des Stickstoffgleichgewichts einschließt, und durch Glucocorticoid-Überschuss verursachten Proteinkatabolismus, ein. Ein Beispiel derjenigen mit einem Überschuss an Glucocorticoid ist ein Patient, für den eine Aufrechterhaltung eines im Wesentlichen normalen Wachstums gewünscht wird, wie z.B. neugeborene und vorpubertäre Säuger, die einer Hochdosis-Steroidhormon-Therapie ausgesetzt werden, wie z.B. Kinder mit nephrotischem Syndrom oder totaler Zottenatrophie. Weitere Synergien sind eingeschlossen, zum Beispiel wobei der Katabolismus und eine Nierenfunktionsstörung behandelt werden, weil die Behandlung den Gewichtsverlust minimiert, der häufig das Auftreten von Niereninsuffizienzen begleiten kann, oder ein verbessertes Wachstum einer Person fördern, die wegen einer anderen Funktionsstörung behandelt wird, wobei die Fälle besondere Bedeutung haben, bei denen die Person kein Erwachsener ist.
Die meisten dieser Krankheitszustände sind durch das folgende biochemische Profil gekennzeichnet: gestörte Glucosekontrolle, Entzündung, überschüssige IGFBP-1-Spiegel, niedrige IGFBP-3-Spiegel, niedrige IGF-Bioaktivität und überschüssige GH-Spiegel. Die Bestimmung solcher Bedingungen kann durch klinische Standardmittel erfolgen, zum Beispiel ELISA für Spiegel von Molekülen, klinische Chemie, RIA oder Bioassay (siehe zum Beispiel Jones et al., supra; Davidson, supra; Moses, supra; Lewitt et al., 1991, supra; Rosenfield et al., supra; Lee et al., 1997, supra; Cox et al., supra; Lewitt et al., 1993, supra; Barreca et al., supra; Shmueli et al., supra; Murphy et al., supra; Rajkumar et al., supra; Hall et al., supra; Ross et al., supra; Scharf et al., supra; Bereket et al., Endocrinology, supra; Crown und Holly, supra; Underwood und Backeljauw, supra; Thrailkill et al., supra; Bereket et al., Clinical Endocrinology, supra; Batch et al., supra; und Powell et al., 1997, supra).
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „hyperglykämische Funktionsstörungen" auf alle Formen von Diabetes, wie z.B. Typ-I- und Typ-II-Diabetes, sowie Hyperinsulinämie und Hyperlipidämie, z.B. fettleibige Personen, und Insulin-resistenter Diabetes, wie Mendenhall'sches Syndrom, Werner-Syndrom, Leprechaunismus, lipoatrophen Diabetes und andere Lipoatrophien. Die bevorzugte hyperglykämische Funktionsstörung ist Diabetes, besonders Typ-I- und Typ-II-Diabetes. „Diabetes" selbst bezieht sich auf eine fortschreitende Erkrankung des Kohlenhydratstoffwechsels, die eine unzureichende Produktion oder Verwendung von Insulin einschließt und durch Hyperglykämie und Glycosurie gekennzeichnet ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „hypoglykämischer Wirkstoff" auf Sekretagoge, vorzugsweise orale Wirkstoffe, die die Sekretion von Insulin durch die Bauchspeicheldrüse verursachen, und Insulin. Mehr bevorzugt sind hierin für die Verwendung beim Menschen Insulin und die Sulfonylharnstoff-Klasse oraler hypoglykämischer Wirkstoffe. Beispiele schließen Glyburide, Glipizide und Gliclazid ein.
Außerdem sind Wirkstoffe, die die Insulinempfindlichkeit erhöhen, wie z.B. Biguanide, in dieser Definition enthalten und sind ebenfalls bevorzugt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Insulin" auf einen beliebigen Insulintyp aus einer beliebigen Spezies, einschließlich Rind, Schaf, Schwein, Pferd und vorzugsweise Mensch, und beliebigen Ursprungs, ob natürlich, synthetisch oder rekombinant. Alle Insulin-Arzneimittel, über die berichtet wurde, zum Beispiel in Diabetes Mellitus – Theory and Practice, vierte Auflage, Harold Rifkin, MD, Hsg. (Elsevier, New York, 1990), Kapitel 29, und U.S. Pharmacist, 18 (Nov. Suppl.) S. 38–40 (1993), sind erfindungsgemäß geeignet. Alle verschiedenen Formen von menschlichem Insulin, die auf dem Markt sind, sind eingeschlossen, wie z.B. die in Jens Brange, Galenics of Insulin, The Physico-chemical and Pharmaceutical Aspects of Insulin and Insulin Preparations (Springer-Verlag, New York, 1987, Seite 17–40), erwähnten. Diese schließen Altinsulin (regular insulin), NPH-Insulin (Neutral Protamine Hagedorn), auch Isophan-Insulin genannt, 70/30-Insulin, zusammengesetzt aus 70% NPH-Insulin und 30% Altinsulin, Semilente-Insulin, Ultralente-Insulin, Lente-Insulin und Humalog-Insulin ein. Für die Verwendung beim Tier ist erfindungsgemäß die Insulinform der jeweils zu behandelnden Spezies bevorzugt, wie z.B. menschliches Insulin zur Behandlung von Menschen.
Eine „Nierenfunktionsstörung" ist hierin definiert als Niereninsuffizienz, die mit einer vorausgehenden Geschichte akuten oder chronischen Nierenversagens assoziiert ist, das wahlweise eine Dialyse erforderlich machen kann, einschließlich, aber nicht beschränkt auf beispielsweise chronische Nierenfunktionsstörungen, wie z.B. chronische Niereninsuffizienz, chronisches Nierenversagen im Endstadium, primäre und sekundäre Glomerulonephritis, nephrotisches Syndrom, interstitielle Nephritis, Pyelonephritis, Glomerulosklerose, z.B. Kimmelstiel-Wilson bei Diabetes-Patienten, und Nierenversagen nach Nierentransplantation, sowie akutes Nierenversagen und akute tubuläre Nekrose aufgrund von Ischämie, Nierendysfunktion, assoziiert mit Diabetes oder Autoimmun-Nephropathien, unerwünschte Reaktionen auf nephrotoxische Arzneimittel oder renotoxische Immunsuppressiva, die zur Organtransplantation verabreicht wurden; akute Abstoßungsschübe bei Nieren-Posttransplantationspatienten; polyzystische Nierendegeneration und verwandte Indikationen; Nierendysplasien; Nierenhypoplasien; kongenitale Nierenanomalien; andere Funktionsstörungen, bei denen eine verstärkte glomeruläre Entwicklung angezeigt ist, wie z.B. Spina bifida, Solitärnieren, intrauterinäre Wachstumshemmung, pediatrische Syndrome mit Wachstumsanomalien (z.B. Turner-Syndrom und Down-Syndrom) und dergleichen; Funktionsstörungen, bei denen eine verstärkte Nierenentwicklung angezeigt ist, wie z.B. bei denjenigen, die an chronischer Organverletzung leiden, denjenigen, die sich einer Transplantation einer kleinen Niere unterzogen haben (worin ein weiteres Wachstum des Organs unterbunden ist), Personen, die an Nierentubulus-Vergiftung leiden, Personen, die sich einer Chemotherapie unterzogen haben (z.B. Krebspatienten) und dergleichen; und physikalische Befunde, wie z.B. Urämie, Proteinurie und Anurie. Solch eine Funktionsstörung würde notwendigerweise von einer Behandlung mit IGF-I profitieren und ist vorzugsweise ein prä-terminales Nierenversagen oder ein Nierenversagen im Endstadium oder chronische Niereninsuffizienz.
Wie hierin verwendet, ist ein „Nieren-aktives Molekül" eines, das die Rückresorption und Retention von Elektrolyten fördert oder auf andere Weise wirkt, um eine Nierenfunktionsstörung zu behandeln. Beispiele werden unten gegeben.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Behandeln" sowohl auf eine therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Diejenigen, die eine Behandlung benötigen, schließen diejenigen ein, die die Funktionsstörung bereits haben, sowie diejenigen, die dazu neigen, die Funktionsstörung zu haben oder bei denen die Funktionsstörung diagnostiziert wurde oder diejenigen, bei denen die Funktionsstörung verhindert werden soll. Fortlaufende Behandlung oder Verabreichung bezieht sich auf eine Behandlung auf wenigstens einer täglichen Basis ohne Unterbrechung der Behandlung für einen oder mehrere Tage. Periodische Behandlung oder Verabreichung, oder Behandlung oder Verabreichung auf periodische Weise, bezieht sich auf eine Behandlung, die nicht fortlaufend, sondern ihrer Natur nach eher zyklisch ist. Der Behandlungsplan kann hierin entweder fortlaufend oder periodisch sein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „aktives" oder „biologisch aktives" IGF in Zusammenhang mit veränderlichen Serum- und Gewebespiegeln von endogenem IGF auf IGF, das an seinen Rezeptor bindet oder in anderer Weise das Auftreten einer biologischen Aktivität verursacht, wie z.B. diejenigen biologischen Aktivitäten von endogenem oder exogenem IGF, auf die hierin Bezug genommen wird.
B. Ausführungsformen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich gemäß einem Aspekt auf eine IGF-I-Variante, worin die Aminosäure des humanen Wildtyp-IGF-I an der Position 49 der nativen Sequenz des humanen IGF-I durch einen Alanin- oder einen Glycin-Rest ersetzt ist. Vorzugsweise ist die fragliche Aminosäure durch einen Alanin-Rest ersetzt.
Die erfindungsgemäßen Peptide können durch chemische Synthese oder unter Verwendung der rekombinanten Technologie hergestellt werden. Diese Verfahren sind im Stand der Technik bekannt. Chemische Synthese, speziell Festphasensynthese, ist für kurze (z.B. weniger als 50 Reste) Peptide oder diejenigen bevorzugt, die nicht-natürliche oder ungewöhnliche Aminosäuren, wie z.B. D-Tyr, Ornithin, Aminoadipinsäure und dergleichen enthalten. Rekombinante Verfahren sind für längere Polypeptide bevorzugt. Wenn rekombinante Verfahren ausgewählt werden, kann ein synthetisches Gen de novo hergestellt werden oder ein natürliches Gen kann mutiert werden, zum Beispiel durch Kassetten-Mutagenese. Exemplarische allgemeine rekombinante Verfahren werden unten dargestellt.
Aus einem gereinigten IGF und seiner Aminosäuresequenz kann, zum Beispiel, eine IGF-Variante, die eine Peptidyl-Mutante eines IGF-Vorläufer-Moleküls ist, unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden. Diese Techniken sehen es in vereinfachter Form vor, entweder das natürliche oder das synthetische Gen, das für ein Peptid kodiert, zu nehmen; es in einen geeigneten Vektor einzufügen; den Vektor in eine geeignete Wirtszelle einzuführen; die Wirtszelle zu kultivieren, um die Expression des Gens zu veranlassen; und das dabei produzierte Peptid zu gewinnen oder zu isolieren. Vorzugsweise wird das gewonnene Peptid dann bis zu einem geeigneten Grad gereinigt.
Etwas ausführlicher wird die DNA-Sequenz, die eine Peptidyl-IGF-Variante kodiert, kloniert und manipuliert, sodass sie in einem geeigneten Wirt exprimiert werden kann. DNA, die Vorläufer-Polypeptide kodiert, kann aus einer genomischen Bibliothek, von cDNA, die von mRNA von Zellen, die das Peptid exprimieren, abgeleitet ist, oder durch synthetisches Herstellen der DNA-Sequenz (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl.), Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989) erhalten werden.
Die Vorläufer-DNA wird dann in ein geeignetes Plasmid oder einen geeigneten Vektor eingefügt, der verwendet wird, um eine Wirtszelle zu transformieren. Im Allgemeinen werden Plasmidvektoren, die ein Replikon und Kontrollsequenzen enthalten, die von Spezies abgeleitet sind, die kompatibel mit der Wirtszelle sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt gewöhnlich eine Replikationsstelle sowie Sequenzen, die Proteine oder Peptide kodieren, die in der Lage sind, eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen zu ermöglichen.
Zum Beispiel kann E. coli mit pBR322 transformiert werden, einem Plasmid, das von einer E. coli-Spezies abgeleitet ist (Mandel et al., J. Mol. Biol. 53: 154 (1970)). Das Plasmid pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt somit einfache Mittel zur Selektion bereit. Andere Vektoren schließen verschiedene Merkmale ein, wie z.B. verschiedene Promotoren, die oft wichtig bei der Expression sind. Zum Beispiel stellen die Plasmide pKK223-3, pDR720 und pPL-Lambda Expressionsvektoren mit den tac-, trp- oder P_L-Promotoren dar, die gegenwärtig erhältlich sind (Pharmacia Biotechnology).
Ein bevorzugter Vektor ist pB0475. Dieser Vektor enthält Replikationsursprünge für Phagen und E. coli, die es ihm erlauben, zwischen solchen Wirten hin- und herbewegt zu werden, und dadurch sowohl die Mutagenese als auch die Expression erleichtern (Cunningham et al., Science, 243: 1330–1336 (1989); U.S. Pat. Nr. 5,580,723). Andere bevorzugte Vektoren sind pR1T5 und pR1T2T (Pharmacia Biotechnology). Diese Vektoren enthalten geeignete Promotoren, gefolgt von der Z-Domäne von Protein A, die es in diese Vektoren eingeführten Genen erlauben, als Fusionsproteine exprimiert zu werden.
Andere bevorzugte Vektoren können unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt werden, wobei die relevanten Merkmale der oben beschriebenen Vektoren kombiniert werden. Relevante Merkmale schließen den Promotor, die Ribosomenbindungsstelle, das Decorsin- oder Ornatin-Gen oder Genfusion (die Z-Domäne von Protein A und Decorsin oder Ornatin und sein Linker), die Antibiotika-Resistanzmarker und geeignete Replikationsursprünge ein.
Die Wirtszelle kann prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Prokaryonten sind für das Klonieren und Exprimieren von DNA-Sequenzen bevorzugt, um Vorläufer-IGF-I-Polypeptid, Segment-substituierte Peptide, Rest-substituierte Peptide und Peptid-Varianten herzustellen. Zum Beispiel kann E. coli K12 Stamm 294 (ATCC Nr. 31446) verwendet werden, sowie E. coli B, E. coli X1776 (ATCC Nr. 31537) und E. coli c600 und c600hfl, E. coli W3110 (F^–, gamma^–, prototroph/ATCC Nr. 27325), Bazillen, wie z.B. Bacillus subtilis, und andere Enterobacteriacaen, wie z.B. Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens, und verschiedene Pseudomonas-Spezies. Der bevorzugte Prokaryont ist E. coli W3110 (ATCC 27325). Wenn sie von Prokaryonten exprimiert werden, enthalten die Peptide typischerweise ein N-terminales Methionin oder ein Formylmethionin und sind nicht glycosyliert. Im Fall von Fusionsproteinen sitzt das N-terminale Methionin oder Formylmethionin an dem Aminoterminus des Fusionsproteins oder der Signalsequenz des Fusionsproteins. Diese Beispiele sollen selbstverständlich illustrativ und nicht limitierend sein.
Zusätzlich zu Prokaryonten können eukaryontische Organismen, wie z.B. Hefekulturen oder von multizellulären Organismen abgeleitete Zellen, verwendet werden. Im Prinzip ist jede derartige Zellkultur verwendbar. Jedoch ist das Interesse an Vertebratenzellen am größten, und die Vermehrung von Vertebratenzellen in Kultur (Gewebekultur) ist zu einem reproduzierbaren Verfahren geworden. Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Herausgeber (1973). Beispiele für solche nützlichen Wirtszelllinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Chinesische-Hamster-Ovarien(CHO)-Zelllinien, W138-, 293-, BHK-, COS-7- und MDCK-Zelllinien.
Eine Abwandlung der oben genannten Verfahren sieht die Verwendung von Genfusionen vor, wobei das Gen, das das gewünschte Peptid kodiert, in dem Vektor mit einem Gen, das ein anderes Protein oder ein Fragment eines anderen Proteins kodiert, assoziiert ist. Dies führt dazu, dass das gewünschte Peptid von der Wirtszelle als eine Fusion mit einem anderen Protein oder Peptid produziert wird. Das „andere" Protein oder Peptid ist häufig ein Protein oder Peptid, das von der Zelle ausgeschieden werden kann, was es ermöglicht, das gewünschte Peptid aus dem Kulturmedium zu isolieren und es zu reinigen, und das Erfordernis, die Wirtszellen zu zerstören, vermieden wird, das auftritt, wenn das gewünschte Peptid innerhalb der Zelle bleibt. Alternativ kann das Fusionsprotein intrazellulär exprimiert werden. Es ist nützlich, Fusionsproteine zu verwenden, die in hohem Maße exprimiert werden.
Die Verwendung von Genfusionen kann, obwohl sie nicht essenziell ist, die Expression heterologer Peptide in E. coli sowie die nachfolgende Reinigung dieser Genprodukte erleichtern (Harris, in Genetic Engineering, Williamson, R., Hrsg. (Academic Press, London, Bd. 4, 1983), S. 127; Ljungquist et al., Eur. J. Biochem., 186: 557–561 (1989) und Ljungquist et al., Eur. J. Biochem., 186: 563–569 (1989)). Protein-A-Fusionen werden häufig verwendet, weil die Bindung von Protein A, oder genauer der Z-Domäne von Protein A, an IgG einen „Affinitätshenkel" für die Reinigung der Fusionsproteine bietet. Es wurde auch gezeigt, dass viele heterologe Proteine abgebaut werden, wenn sie direkt in E. coli exprimiert werden, aber stabil sind, wenn sie als Fusionsproteine exprimiert werden. Marston, Biochem. J., 240: 1 (1986).
Fusionsproteine können unter Verwendung von Chemikalien, wie z.B. Cyanogenbromid, das bei einem Methionin spaltet, oder Hydroxylamin, das zwischen einem Asn- und Gly- Rest spaltet, gespalten werden. Unter Verwendung rekombinanter DNA-Standardmethoden werden die Nukleotidbasenpaare, die diese Aminosäuren kodieren, unmittelbar vor dem 5'-Ende des Gens insertiert, das das gewünschte Peptid kodiert.
Alternativ kann die proteolytische Spaltung des Fusionsproteins angewendet werden (Carter, in Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes, Ladisch et al., Hrsg. (American Chemical Society Symposium Series Nr. 427, 1990), Kap. 13, Seiten 181–193).
Proteasen wie z.B. Faktor Xa, Thrombin und Subtilisin oder seine Mutanten und eine Anzahl anderer wurden erfolgreich für die Spaltung von Fusionsproteinen verwendet. Typischerweise wird ein Peptidlinker, der durch die verwendete Protease spaltbar ist, zwischen dem „anderen" Protein (z.B. der Z-Domäne von Protein A) und dem gewünschten Peptid insertiert. Unter Verwendung rekombinanter DNA-Methodik werden die Nukleotidbasenpaare, die den Linker kodieren, zwischen die Gene oder Genfragmente insertiert, die für die anderen Proteine kodieren. Eine proteolytische Spaltung des teilweise gereinigten Fusionsproteins, das den richtigen Linker enthält, kann dann entweder bei dem nativen Fusionsprotein oder dem reduzierten oder denaturierten Fusionsprotein durchgeführt werden.
Das Peptid kann oder kann nicht richtig gefaltet sein, wenn es als ein Fusionsprotein exprimiert wurde. Außerdem kann der spezifische Peptidlinker, der die Schnittstelle enthält, zugänglich oder nicht zugänglich für die Protease sein. Diese Faktoren bestimmen, ob das Fusionsprotein denaturiert oder rückgefaltet werden muss, und, wenn das der Fall ist, ob diese Verfahren vor oder nach der Spaltung angewendet werden.
Wenn eine Denaturierung und Rückfaltung erforderlich ist, wird das Peptid typischerweise mit einem Chaotrop, wie z.B. Guanidin-HCl, und anschließend mit einem Redox-Puffer behandelt, der zum Beispiel reduziertes und oxidiertes Dithiothreitol oder Glutathion in den geeigneten Verhältnissen, pH und Temperatur enthält, so dass das Peptid in seine native Struktur zurückgefaltet wird.
Wenn Peptide nicht unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden, werden sie vorzugsweise unter Verwendung von Festphasen-Synthese hergestellt, wie z.B. die allgemein von Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1963), beschriebene, obgleich andere gleichwertige chemische Synthesen, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendbar sind. Die Festphasen-Synthese wird am C-Terminus des Peptids durch Koppelung einer geschützten α-Aminosäure an ein geeignetes Harz begonnen. Solch ein Ausgangsmaterial kann hergestellt werden, indem eine α-Amino-geschützte Aminosäure durch eine Esterbindung an ein chlormethyliertes Harz oder ein Hydroxymethylharz oder durch eine Amidbindung an ein BHA-Harz oder MBHA-Harz angehängt wird. Die Herstellung des Hydroxymethylharzes wurde von Bodansky et al., Chem. Ind. (London), 38: 1597–1598 (1966), beschrieben. Chlormethylierte Harze sind kommerziell von BioRad Laboratories, Richmond, CA, und von Lab. Systems, Inc erhältlich. Die Herstellung solch eines Harzes wurde von Stewart et al., „Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), Kapitel 1, Seiten 1–6, beschrieben. BHA- und MBHA-Harzträger sind kommerziell erhältlich und werden im Allgemeinen nur verwendet, wenn das gewünschte herzustellende Polypeptid ein unsubstituiertes Amid an dem C-Terminus hat.
Die Aminosäuren werden an die Peptidkette unter Verwendung von Techniken gekoppelt, die im Stand der Technik für die Ausbildung von Peptidbindungen gut bekannt sind. Ein Verfahren schließt die Umwandlung der Aminosäure in ein Derivat ein, das die Carboxylgruppe empfänglicher für die Reaktion mit der freien N-terminalen Aminogruppe des Peptidfragments macht. Zum Beispiel kann die Aminosäure mittels Reaktion einer geschützten Aminosäure mit Chlorameisensäureethylester, Chlorameisensäurephenylester, Chlorameisensäure-sec-butylester, Chlorameisensäureisobutylester, Pivalinsäurechlorid oder ähnlichen Säurechloriden in ein gemischtes Anhydrid umgewandelt werden. Alternativ kann die Aminosäure in einen aktiven Ester umgewandelt werden, wie z.B. einen 2,4,5-Trichlorphenylester, einen Pentachlorphenylester, einen Pentafluorphenylester, einen p-Nitrophenylester, einen N-Hydroxysuccinimidester oder einen mit 1-Hydroxybenzotriazol gebildeten Ester.
Ein anderes Kopplungsverfahren schließt die Verwendung eines geeigneten Kopplungsmittels, wie z.B. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid oder N,N'-Diisopropylcarbodiimid, ein. Andere geeignete, dem Fachmann geläufige Kopplungsmittel sind in E. Gross & J. Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Bd. I: Major Methods of Peptide Bond Formation (Academic Press, New York, 1979), offenbart.
Es sollte berücksichtigt werden, dass die α-Aminogruppe jeder bei der Peptidsynthese eingesetzten Aminosäure während der Kopplungsreaktion geschützt werden muss, um Nebenreaktionen mit ihren aktiven α-Aminofunktionen zu vermeiden. Es sollte auch berücksichtigt werden, dass bestimmte Aminosäuren in der Seitenkette reaktive funktionelle Gruppen (z.B. Sulfhydryl, Amino, Carboxyl und Hydroxyl) enthalten und dass solche funktionellen Gruppen ebenfalls mit geeigneten Schutzgruppen geschützt werden müssen, um das Auftreten einer chemischen Reaktion an dieser Stelle sowohl während des anfänglichen als auch der folgenden Kopplungsschritte zu vermeiden. Geeignete Schutzgruppen, die im Stand der Technik bekannt sind, sind in Gross und Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Bd. 3: „Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis" (Academic Press, New York, 1981) beschrieben.
Bei der Auswahl einer bestimmten Seitenketten-Schutzgruppe, die bei der Synthetisierung der Peptide verwendet werden soll, werden im Allgemeinen die folgenden allgemeinen Regeln befolgt. Eine α-Amino-Schutzgruppe (a) muss bewirken, dass die α-Aminofunktion unter den bei der Kopplungsreaktion verwendeten Bedingungen inert ist, (b) muss nach der Kopplungsreaktion unter Bedingungen, die keine Seitenketten-Schutzgruppen entfernen und die Struktur des Peptidfragments nicht verändern, leicht entfernbar sein und (c) muss die Möglichkeit einer Racemisierung während der Aktivierung, unmittelbar vor der Kopplung, ausschalten. Eine Seitenketten-Schutzgruppe (a) muss bewirken, dass die funktionelle Gruppe der Seitenkette unter den bei der Kopplungsreaktion verwendeten Bedingungen inert ist, (b) muss unter den bei der Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe verwendeten Bedingungen stabil sein und (c) muss nach der Fertigstellung des gewünschten Aminosäure-Peptids unter Reaktionsbedingungen, die die Struktur der Peptidkette nicht verändern, leicht entfernbar sein.
Es wird für den Fachmann ersichtlich sein, dass die für die Peptidsynthese als nützlich bekannten Schutzgruppen sich bezüglich ihrer Reaktivität mit den zu ihrer Entfernung eingesetzten Wirkstoffen unterscheiden werden. Zum Beispiel sind bestimmte Schutzgruppen, wie z.B. Triphenylmethyl und 2-(p-Biphenylyl)isopropyloxycarbonyl, sehr unbeständig und können unter leicht sauren Bedingungen gespalten werden. Andere Schutzgruppen, wie z.B. t-Butyloxycarbonyl (BOC), t-Amyloxycarbonyl, Adamantyl-oxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl, sind weniger unbeständig und erfordern zu ihrer Entfernung mäßig starke Säuren, wie z.B. Trifluoressigsäure, Salzsäure oder Bortrifluorid in Essigsäure. Noch andere Schutzgruppen, wie z.B. Benzyloxycarbonyl (CBZ oder Z), Halobenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, Cycloalkyloxycarbonyl und Isopropyloxycarbonyl, sind noch weniger unbeständig und erfordern stärkere Säuren, wie z.B. Fluorwasserstoff, Bromwasserstoff oder Bortrifluoracetat in Trifluoressigsäure, für ihre Entfernung. In den Klassen nützlicher Aminosäure-Schutzgruppen sind eingeschlossen:

(1) für eine α-Amino-Gruppe (a) aromatische Schutzgruppen vom Urethantyp, wie z.B. Fluorenylmethyloxycarbonyl(FMOC)CBZ und substituiertes CBZ, wie z.B. p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-6-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl und p- Methoxybenzyloxycarbonyl, o-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl und dergleichen; (b) aliphatische Schutzgruppen vom Urethantyp, wie z.B. BOC, t-Amyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, 2-(p-Biphenylyl)isopropyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl und dergleichen; (c) Schutzgruppen vom Cycloalkyl-Urethantyp, wie z.B. Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl; und (d) Allyloxycarbonyl. Die bevorzugten α-Amino-Schutzgruppen sind BOC oder FMOC.
(2) für die in Lys anwesende Seitenketten-Aminogruppe kann der Schutz durch eine beliebige der oben in (1) genannten Gruppen, wie z.B. BOC, p-Chlorbenzyloxycarbonyl etc., erfolgen.
(3) für die Guanidingruppe von Arg kann der Schutz durch Nitro, Tosyl, CBZ, Adamantyloxycarbonyl, 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl oder 2,3,6-Trimethyl-4-methoxyphenylsulfonyl oder BOC erfolgen.
(4) für die Hydroxylgruppe von Ser, Thr oder Tyr kann der Schutz zum Beispiel durch C1-C4 Alkyl, wie z.B. t-Butyl; Benzyl (BZL); substitutiertes BZL, wie z.B. p-Methoxybenzyl, p-Nitrobenzyl, p-Chlorbenzyl, o-Chlorbenzyl und 2,6-Dichlorbenzyl, erfolgen.
(5) für die Carboxylgruppe von Asp oder Glu kann der Schutz zum Beispiel durch Veresterung unter Verwendung von Gruppen wie z.B. BZL, t-Butyl, Cyclohexyl, Cyclopentyl und dergleichen erfolgen.
(6) für den Imidazol-Stickstoff von His wird geeigneter Weise der Tosyl-Rest verwendet.
(7) für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr wird geeigneter Weise eine Schutzgruppe wie z.B. Tetrahydropyranyl, tert-Butyl, Trityl, BZL, Chlorbenzyl, 4-Brombenzyl oder 2,6-Dichlorbenzyl verwendet. Die bevorzugte Schutzgruppe ist 2,6-Dichlorbenzyl.
(8) für die Seitenketten-Aminogruppe von Asn oder Gln wird vorzugsweise Xanthyl (Xan) verwendet.
(9) bei Met wird die Aminosäure vorzugsweise ungeschützt gelassen.
(10) für die Thiogruppe von Cys wird typischerweise p-Methoxybenzyl verwendet.

Die C-terminale Aminosäure, z.B. Lys, wird an der N-Aminoposition durch eine geeignet ausgewählte Schutzgruppe, BOC in dem Fall von Lys, geschützt. Das BOC-Lys-OH kann zunächst an das Benzhydrylamin- oder chlormethylierte Harz nach dem in Horiki et al., Chemistry Letters, 165–168 (1978) beschriebenen Verfahren oder unter Verwendung von Isopropylcarbodiimid bei etwa 25°C für 2 Stunden unter Rühren gekoppelt werden. Nach der Kopplung der BOC-geschützten Aminosäure an den Harzträger wird die α-Amino-Schutzgruppe, etwa unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan oder TFA alleine, entfernt. Die Entschützung wird bei einer Temperatur zwischen etwa 0°C und Raumtemperatur durchgeführt. Andere Standard-Spaltungsreagenzien, wie z.B. HCl in Dioxan, und Bedingungen für das Entfernen spezifischer α-Amino-Schutzgruppen, sind in der Literatur beschrieben.
Nach dem Entfernen der α-Amino-Schutzgruppe werden die verbleibenden α-Amino- und Seitenketten-geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge gekoppelt. Als Alternative zu der getrennten Zugabe jeder Aminosäure während der Synthese können einige vor der Zugabe zu dem Festphasen-Synthesizer aneinander gekoppelt werden. Die Auswahl eines geeigneten Kopplungsreagens gehört zu dem Fachwissen auf diesem Gebiet. Besonders geeignet als Kopplungsreagens ist N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid oder Diisopropylcarbodiimid.
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in den Festphasenreaktor im Überschuss eingeführt, und die Kopplung wird in geeigneter Weise in einem Medium von Dimethylformamid (DMF) oder CH₂Cl₂ oder Mischungen davon durchgeführt. Falls eine unvollständige Kopplung eintritt, wird das Kopplungsverfahren wiederholt, bevor die N-Amino-Schutzgruppe vor der Kopplung der nächsten Aminosäure entfernt wird. Der Erfolg der Kopplungsreaktion auf jeder Stufe der Synthese kann überwacht werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Überwachung der Synthese ist mittels der Ninhydrin-Reaktion, wie von Kaiser et al., Anal. Biochem. 34: 595 (1970) beschrieben. Die Kopplungsreaktionen können automatisch unter Verwendung wohlbekannter Verfahren, zum Beispiel eines BIOSEARCH 9500^TM Peptid-Synthesizers, durchgeführt werden.
Nach Vollendung der gewünschten Peptidsequenz muss das geschützte Peptid von dem Harzträger abgespalten werden und alle Schutzgruppen müssen entfernt werden. Die Spaltungsreaktion und das Entfernen der Schutzgruppen wird geeigneter Weise gleichzeitig oder schrittweise durchgeführt. Wenn der Harzträger ein chlormethyliertes Polystyrolharz ist, ist die das Peptid an dem Harz verankernde Bindung eine zwischen der freien Carboxylgruppe des C-terminalen Restes und einer der vielen auf der Harzmatrix vorhandenen Chlormethylgruppen gebildete Esterbindung. Es wird verstanden werden, dass die verankernde Bindung durch Reagenzien gespalten werden kann, die bekanntlich in der Lage sind, eine Esterbindung zu spalten und die Harzmatrix zu durchdringen.
Ein besonders günstiges Verfahren ist mittels Behandlung mit flüssigem, wasserfreiem Fluorwasserstoff. Dieses Reagens wird nicht nur das Peptid von dem Harz abspalten, sondern wird auch alle Schutzgruppen entfernen. Deshalb wird die Verwendung dieses Reagens direkt das vollständig entschützte Peptid liefern. Wenn das chlormethylierte Harz verwendet wird, führt die Behandlung mit Fluorwasserstoff zu der Bildung freier Peptidsäuren. Wenn das Benzhydrylamin-Harz verwendet wird, führt die Behandlung mit Fluorwasserstoff direkt zu den freien Peptidaminen. Die Reaktion mit Fluorwasserstoff in Gegenwart von Anisol und Dimethylsulfid bei 0°C für eine Stunde wird gleichzeitig die Seitenketten-Schutzgruppen entfernen und das Peptid von dem Harz freisetzen.
Wenn das Peptid abgespalten werden soll, ohne die Schutzgruppen zu entfernen, kann das geschützte Peptid-Harz einer Methanolyse unterzogen werden, um das geschützte Peptid, bei dem die C-terminale Carboxylgruppe methyliert ist, zu erhalten. Der Methylester wird dann unter milden alkalischen Bedingungen hydrolysiert, um die freie C-terminale Carboxylgruppe zu erhalten. Die Schutzgruppen an der Peptidkette werden dann durch Behandlung mit starker Säure entfernt, wie z.B. flüssigem Fluorwasserstoff. Ein besonders nützliches Verfahren zur Methanolyse ist das von Moore et al., Peptides, Proc. Fifth Amer. Pept. Symp., M. Goodman und J. Meienhofer, Hrsg. (John Wiley, N.Y., 1977), S. 518-521), wobei das geschützte Peptid-Harz mit Methanol und Kaliumcyanid in Anwesenheit von Kronenether behandelt wird.
Ein anderes Verfahren zur Abspaltung des geschützten Peptids von dem Harz, wobei das chlormethylierte Harz verwendet wird, ist durch Ammonolyse oder durch Behandlung mit Hydrazin. Falls gewünscht, kann das erhaltene C-terminale Amid oder Hydrazid zu dem freien C-terminalen Carboxyl-Rest hydrolysiert werden, und die Schutzgruppen können auf konventionelle Weise entfernt werden.
Es wird auch erkannt werden, dass die an der N-terminalen α-Aminogruppe vorhandene Schutzgruppe vorzugsweise entweder bevor oder nachdem das geschützte Peptid von dem Träger abgespalten wird, entfernt werden kann.
Die Reinigung der erfindungsgemäßen Peptide wird typischer Weise durch konventionelle Verfahren, wie z.B. präparative HPLC (einschließlich Umkehrphasen-HPLC) oder andere bekannte chromatographische Verfahren, wie z.B. Gelpermeation, Ionenaustausch, Verteilungschromatographie, Affinitätschromatographie (einschließlich monoklonaler-Antikörper-Säulen) oder Gegenstromverteilung, erreicht.
Die erfindungsgemäßen Peptide können durch Polymerisierung stabilisiert sein. Das kann durch Kreuzvernetzung von Monomerketten mit polyfunktionellen kreuzvernetzenden Mitteln entweder direkt oder indirekt mittels multifunktioneller Polymere erreicht werden. Gewöhnlich werden zwei im Wesentlichen identische Polypeptide an ihren C- oder N-Termini vernetzt, wobei ein bifunktionelles kreuzvernetzendes Mittel verwendet wird. Das Mittel wird verwendet, um die terminalen Amino- und/oder Carboxylgruppen kreuzzuvernetzen. Im Allgemeinen werden beide terminalen Carboxylgruppen oder beide terminalen Aminogruppen miteinander kreuzvernetzt, obwohl bei der Auswahl des geeigneten kreuzvernetzenden Mittels die alpha-Aminogruppe eines Polypeptids mit der terminalen Carboxylgruppe des anderen Polypeptids kreuzvernetzt wird. Vorzugsweise sind die Polypeptide an ihren C-Termini mit Cystein substituiert. Unter im Stand der Technik wohlbekannten Bedingungen kann eine Disulfidbindung zwischen den terminalen Cysteinen hergestellt werden, wodurch die Polypeptidketten kreuzvernetzt werden. Zum Beispiel werden Disulfidbrücken in günstiger Weise durch Metall-katalysierte Oxidation der freien Cysteine oder durch nukleophile Substitution eines geeignet modifizierten Cystein-Rests gebildet. Die Auswahl des kreuzvernetzenden Mittels wird von den Identitäten der reaktiven Seitenketten der in den Polypeptiden anwesenden Aminosäuren abhängen. Zum Beispiel wäre eine Disulfid-Kreuzvernetzung nicht bevorzugt, falls Cystein an zusätzlichen Stellen zu dem C-Terminus in dem Polypeptid vorhanden wären. Ebenso erfindungsgemäß umfasst sind mit Methylenbrücken kreuzvernetzte Peptide.
Geeignete Kreuzvernetzungsstellen auf den Peptiden, abgesehen von den N-terminalen Amino- und C-terminalen Carboxylgruppen, schließen epsilon-Aminogruppen ein, die auf Lysin-Resten gefunden werden, sowie Amino-, Imino-, Carboxyl-, Sulfhydryl- und Hydroxylgruppen, die sich an den Seitenketten interner Reste der Peptide befinden oder von Resten, die in flankierende Sequenzen eingefügt sind. Eine Kreuzvernetzung durch extern zugegebene kreuzvernetzende Wirkstoffe wird geeigneter Weise z.B. durch die Verwendung beliebiger Reagenzien aus einer Anzahl dem Fachmann bekannter Reagenzien erreicht, zum Beispiel durch Carbodiimid-Behandlung des Polypeptids. Andere Beispiele geeigneter multifunktioneller (gewöhnlich bifunktioneller) kreuzvernetzender Mittel finden sich in der Literatur.
Die erfindungsgemäßen Peptide können auch durch Zyklisierung konformationell stabilisiert sein. Die Peptide werden gewöhnlich durch kovalentes Verbinden der N- und C-terminalen Domänen eines Peptids an die entsprechende Domäne des anderen erfindungsgemäßen Peptids zyklisiert, um Cyclooligomere zu bilden, die zwei oder mehr wiederholte Peptidsequenzen enthalten, wobei jedes innere Peptid im Wesentlichen dieselbe Sequenz besitzt. Außerdem werden zyklisierte Peptide (ob Cyclooligomere oder Cyclomonomere) kreuzvernetzt, um 1 bis 3 zyklische Strukturen zu bilden, die von 2 bis 6 Peptide umfassen. Die Peptide sind vorzugsweise nicht kovalent durch α-Amino- und Hauptketten-Carboxylgruppen (Kopf an Schwanz) verbunden, sondern sind vielmehr durch die Seitenketten von Resten, die in den N- und C-terminalen Domänen lokalisiert sind, verbunden. Die Verbindungsstellen werden so im Allgemeinen zwischen den Seitenketten der Reste sein.
Viele geeignete Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen mono- oder poly-zyklisierten Peptiden sind per se bekannt. Eine Lys/Asp-Zyklisierung wurde erreicht, indem Na-BOC-Aminosäuren auf einem Festphasenträger mit einem Fmoc/9-Fluorenylmethyl(OFm)-Seitenkettenschutz für Lys/Asp verwendet wurden; das Verfahren wird durch eine Behandlung mit Piperidin, gefolgt von einer Zyklisierung, abgeschlossen.
Glu- und Lys-Seitenketten wurden ebenfalls bei der Herstellung zyklischer oder bizyklischer Peptide kreuzvernetzt: Das Peptid wird durch Festphasen-Chemie auf einem p-Methylbenzhydrylamin-Harz synthetisiert. Das Peptid wird von dem Harz abgespalten und entschützt. Das zyklische Peptid wird unter Verwendung von Diphenylphosphorylazid in verdünntem Methylformamid hergestellt. Für ein alternatives Verfahren siehe Schiller et al., Peptide Protein Res., 25: 171–177 (1985). Siehe auch U.S. Pat. Nr. 4,547,489.
Disulfid-kreuzvernetzte oder -zyklisierte Peptide werden nach herkömmlichen Verfahren hergestellt. Das Verfahren von Pelton et al. (J. Med. Chem., 29: 2370–2375 (1986)) ist geeignet, mit der Ausnahme, dass ein größerer Anteil von Cyclooligomeren produziert wird, indem die Reaktion in konzentrierteren Lösungen als der von Pelton et al. für die Herstellung von Cyclomonomeren beschriebenen, verdünnten Reaktionsmischung durchgeführt wird. Die gleiche Chemie ist für die Synthese von Dimeren oder Cyclooligomeren oder Cyclomonomeren nützlich. Ebenso nützlich sind Thiomethylen-Brücken. Lebl und Hruby, Tetrahedron Letters, 25: 2067–2068 (1984). Siehe auch Cody et al., J. Med. Chem., 28: 583 (1985).
Die gewünschten zyklischen oder polymeren Peptide werden durch Gelfiltration, gefolgt von Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie oder andere herkömmliche Verfahren gereinigt. Die Peptide werden steril filtriert und in herkömmliche pharmakologisch geeignete Vehikel formuliert.
Die für die hierin beschriebenen Verfahren erforderlichen Ausgangsmaterialien sind in der Literatur bekannt oder können unter Verwendung bekannter Verfahren und bekannter Ausgangsmaterialien hergestellt werden.
Falls in den hergestellten Peptiden Kohlenstoffatome, die an vier nichtidentische Substituenten gebunden sind, asymmetrisch sind, können die Peptide als Diastereoisomere, Enantiomere oder Mischungen davon vorliegen. Die oben beschriebenen Synthesen können Racemate, Enantiomere oder Diastereomere als Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukte verwenden. Diastereomere Produkte, die aus solchen Synthesen resultieren, können durch chromatographische oder Kristallisationsverfahren getrennt werden. In gleicher Weise können enantiomere Produktmischungen unter Verwendung derselben Techniken oder durch andere im Stand der Technik bekannte Verfahren getrennt werden. Jedes der asymmetrischen Kohlenstoffatome kann, wenn vorhanden, in einer oder beiden Konfigurationen R) oder S) vorliegen, und beide sind von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die erfindungsgemäßen Peptide können einem Säuger durch eine beliebige geeignete Technik, einschließlich orale, parenterale (z.B. intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse oder subkutane Injektion oder Infusion, oder Implantat), nasale, pulmonäre, vaginale, rektale, sublinguale oder topische Verabreichungswege verabreicht werden und können in Dosierungsformen formuliert werden, die für jeden Verabreichungsweg geeignet sind. Der spezifische Verabreichungsweg wird z.B. von der medizinischen Geschichte des Patienten, einschließlich beliebiger beobachteter oder erwarteter Nebenwirkungen bei der Verwendung des Peptids, dem Typ des zu verabreichenden Peptids und dem jeweiligen Typ der zu behandelnden Funktionsstörung abhängen. In am meisten bevorzugter Weise erfolgt die Verabreichung durch kontinuierliche Infusion (unter Verwendung z.B. von Vorrichtungen mit langsamer Freisetzung oder Minipumpen, wie z.B. osmotischen Pumpen oder Hautpflastern) oder durch Injektion (unter Verwendung z.B. intravenöser oder subkutaner Mittel).
Das bei der Therapie zu verwendende Peptid wird in einer Weise formuliert und dosiert sein, die mit der guten medizinischen Praxis übereinstimmt, wobei der klinische Zustand des einzelnen Patienten (speziell die Nebenwirkungen der Behandlung mit dem Peptid), die Art der Funktionsstörung, der Verabreichungsort, das Verabreichungsverfahren, das Verabreichungsschema und andere dem Praktiker bekannte Faktoren berücksichtigt werden. Somit werden die „wirksamen Mengen" des Peptids für die erfindungsgemäßen Zwecke aufgrund von Überlegungen bestimmt und müssen Mengen sein, die zu einer biologischen Verfügbarkeit der Arzneimittel für den Säuger und der gewünschten Wirkung führen.
Eine bevorzugte Verabreichung ist eine chronische Verabreichung von in etwa zwei Mal pro Tag während 4–8 Wochen, um die Wirkungen von IGF-I zu reproduzieren. Obwohl eine Injektion bevorzugt ist, kann auch eine chronische Infusion angewendet werden, wobei eine Infusionsvorrichtung für kontinuierliche subkutane (SC) Infusionen verwendet wird. Eine intravenöse Beutellösung kann ebenfalls verwendet werden. Der Schlüsselfaktor bei der Auswahl einer geeigneten Dosis für die fragliche Erkrankung ist das erhaltene Ergebnis, das im Fall von Diabetes zum Beispiel als Abnahme der Blutglucose und Annäherung an den normalen Bereich gemessen wird, oder andere Kriterien für eine Messung einer Behandlung einer Funktionsstörung, die dem medizinischen Praktiker geeignet erscheinen.
Als allgemeiner Vorschlag wird die gesamte pharmazeutisch wirksame Menge des parenteral verabreichten Peptids pro Dosis in einem Bereich sein, der durch eine Dosis-Antwort-Kurve gemessen werden kann. Zum Beispiel können IGFs in an IGFBPs gebundener Form oder im Blut in Körperflüssigkeiten des zu behandelnden Säugers gemessen werden, um die Dosierung zu bestimmen. Alternativ kann man dem Patienten zunehmende Mengen des Peptids verabreichen und die Serumspiegel des Patienten von IGF-I und IGF-II überprüfen. Die Menge des einzusetzenden Peptids kann auf einer molaren Basis berechnet werden, die auf diesen Serumspiegeln von IGF-I und IGF-II basiert. Siehe Beispiel 3 unten zu der Verdrängung von IGF-I-Tracer von in menschlichem Serum vorhandenen IGFBPs.
Speziell erfordert ein Verfahren zur Bestimmung einer geeigneten Dosierung des Peptids das Messen von IGF-Spiegeln in einer biologischen Flüssigkeit, wie z.B. einer Körper- oder Blutflüssigkeit. Das Messen solcher Spiegel kann durch ein beliebiges Mittel durchgeführt werden, einschließlich RIA und ELISA. Nach dem Messen der IGF-Spiegel wird die Flüssigkeit mit dem Peptid in Kontakt gebracht, wobei einzelne oder vielfache Dosen verwendet werden. Nach diesem Schritt des Inkontaktbringens werden die IGF-Spiegel in der Flüssigkeit nochmals gemessen. Falls die IGF-Spiegel der Flüssigkeit in einem ausreichenden Maße gesunken sind, um die erwünschte Wirksamkeit, wegen der das Molekül verabreicht werden soll, zu erzielen, kann die Dosis des Moleküls dann angeglichen werden, um die maximale Wirksamkeit zu erzielen. Dieses Verfahren kann in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Vorzugsweise wird dieses Verfahren in vivo durchgeführt, d.h., nachdem die Flüssigkeit aus dem Säuger entnommen und die IGF-Spiegel gemessen wurden, wird das erfindungsgemäße Peptid dem Säuger verabreicht, wobei eine einzelne oder vielfache Dosen verwendet werden (das heißt, der Schritt des Inkontaktbringens wird durch Verabreichung an einen Säuger bewirkt), und dann werden die IGF-Spiegel nochmals in einer Flüssigkeit gemessen, die dem Säuger entnommen wurde.
Ein anderes Verfahren zur Bestimmung der Dosierung ist es, Antikörper gegen das Peptid oder ein anderes Nachweisverfahren für das Peptid in dem LIFA-Format zu verwenden. Dies würde den Nachweis endogener oder exogener, an IGFBP gebundener IGFs, sowie der Menge von an das IGFBP gebundenem Peptid erlauben.
Ein anderes Verfahren zur Bestimmung der Dosierung wäre es, den Spiegel von „freiem" oder aktivem IGF im Blut zu messen. Für einige Verwendungen wäre der Spiegel von „freiem" IGF ein geeigneter Marker der Wirksamkeit und wirksamer Dosen oder Dosierungen.
Zum Beispiel ist ein Verfahren für den Nachweis endogenen oder exogenen, an IGF-Bindungsprotein gebundenen IGFs oder der Menge des erfindungsgemäßen Peptids oder für den Nachweis der Menge von ungebundenem IGF in einer biologischen Flüssigkeit beschrieben. Dieses Verfahren umfasst:

(a) Inkontaktbringen der Flüssigkeit mit 1) einem Mittel für den Nachweis des Peptids, das spezifisch für das Peptid ist (wie z.B. ein erster Antikörper, der spezifisch für Epitope auf dem Peptid ist), das an einem Festphasenträger befestigt ist, so dass in der Anwesenheit des Peptids die IGF-Bindungsstellen auf dem Peptid verfügbar für die Bindung an das IGF-Bindungsprotein bleiben, wodurch ein Komplex zwischen dem Mittel und dem IGF-Bindungsprotein gebildet wird; und 2) dem Peptid für einen ausreichenden Zeitabschnitt, um alle verfügbaren IGF-Bindungsstellen auf dem IGF-Bindungsprotein zu sättigen, wobei ein gesättigter Komplex gebildet wird;
(b) Inkontaktbringen des gesättigten Komplexes mit einem detektierbar markierten zweiten Mittel, das spezifisch für das IGF-Bindungsprotein ist (wie z.B. einem zweitem Antikörper, der spezifisch für Epitope auf dem IGFBP ist), die verfügbar für die Bindung sind, wenn das Peptid an das IGF-Bindungsprotein gebunden ist; und
(c) quantitatives Analysieren der Menge des gebundenen markierten Mittels als Maß für das IGFBP in der biologischen Flüssigkeit und somit als Maß für die Menge von gebundenem Peptid und IGF-Bindungsprotein, gebundenem IGF und IGF-Bindungsprotein oder in der Flüssigkeit vorhandenem aktivem IGF.

Aufgrund der oben genannten Verfahren für die Bestimmung von Dosierungen kann die Menge an Peptid, die verwendet werden kann, im Allgemeinen geschätzt werden, d.h. von in etwa 10 μg/kg/Tag bis 200 μg/kg/Tag könnten verwendet werden, basierend auf kg Körpergewicht des Patienten, obgleich, wie oben bemerkt, dies einem großen Maß therapeutischer Erwägungen unterliegt. Zum Beispiel beträgt bei der Behandlung chronischen Nierenversagens die tägliche Dosis vorzugsweise in etwa 10 bis 160 μg/kg, mehr bevorzugt 20 bis 100 μg/kg und am meisten bevorzugt in etwa 25 bis 75 μg/kg.
Ein weiteres Verfahren wird bereitgestellt, um die Verteilung von IGFs auf spezifischen IGFBPs abzuschätzen, z.B. auf IGFBP-1 oder IGFBP-3 unter Verwendung des LIFA-Formats.
Das Peptid wird in geeigneter Weise durch ein System zur verzögerten Freisetzung verabreicht. Geeignete Beispiele von Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung schließen semipermeable Polymermatrices in Form geformter Artikel, z.B. Filme oder Mikrokapseln, ein. Matrices zur verzögerten Freisetzung schließen Polylactide (U.S. Pat. Nr. 3,773,919, EP 58,481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und gamma-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22, 547–556 (1983), poly(2-Hydroxyethyl-Methacrylat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167–277 (1981) und Langer, Chem. Tech., 12: 98–105 (1982), Ethylenvinylacetat (Langer et al., supra) oder Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133,988 ) ein. Zusammensetzungen zur verzögerten Freisetzung schließen auch ein lipsomal eingeschlossenes Peptid ein. Liposomen, die das Peptid enthalten, werden nach per se bekannten Verfahren hergestellt: DE 3,218,121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688–3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030–4034 (1980); EP 52,322 ; EP 36,676 ; EP 88,046 ; EP 143,949 ; EP 142,641 ; Japanische Patentanmeldung 83-118008; U.S. Pat. Nrn. 4,485,045 und 4,544,545; und EP 102,324 . Gewöhnlich sind die Liposomen von dem kleinen (von in etwa 200 bis 800 Angström), unilamellären Typ, wobei der Lipidgehalt größer als in etwa 30 Molprozent Cholesterin ist, wobei der ausgewählte Anteil für die am meisten wirksame Therapie angepasst ist.
PEGylierte Peptide, die eine längere Lebensdauer haben, können auch verwendet werden, basierend auf z.B. der in WO 95/32003, veröffentlicht 30. November 1995, beschriebenen Konjugattechnologie.
Für die parenterale Verabreichung wird das Peptid gemäß einem Ausführungsbeispiel im Allgemeinen durch Mischen mit einem pharmazeutisch oder parenteral geeigneten Träger, d.h. einem der für Rezipienten bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und mit anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich ist, jeweils mit einem gewünschten Reinheitsgrad als injizierbare Einzeldosisform (Lösung, Suspension oder Emulsion) formuliert. Zum Beispiel enthält die Formulierung vorzugsweise keine oxidierenden Mittel und anderen Peptide, die bekannterweise schädlich für Polypeptide sind.
Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch gleichmäßiges und enges Inkontaktbringen des Peptids mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder beidem hergestellt. Dann wird das Produkt, falls erforderlich, in die Form der gewünschten Formulierung gebracht. Vorzugsweise ist der Träger ein parenteraler Träger, weiter bevorzugt eine mit dem Blut des Empfängers isotone Lösung. Beispiele solcher Trägervehikel schließen Wasser, Kochsalzlösung, Ringerlösung, eine gepufferte Lösung und Dextroselösung ein. Nicht-wässrige Vehikel, z.B. nicht-flüssige Öle und Ethyloleat, sind erfindungsgemäß ebenfalls nützlich.
Der Träger enthält geeigneterweise geringe Mengen von Additiven, wie z.B. Substanzen, die die Isotonizität und chemische Stabilität erhöhen. Solche Materialien sind für Empfänger bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und schließen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat, Succinat, Essigsäure und andere organische Säuren und ihre Salze; Antioxidantien, wie z.B. Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als 10 Reste), z.B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Glycin; Aminosäuren, wie z.B. Glutaminsäure, Asparaginsäure, Histidin oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Zellulose oder ihrer Derivate, Glucose, Mannose, Trehalose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit oder Sorbit; Gegenionen, wie z.B. Natrium; nicht-ionische oberflächenaktive Stoffe, wie z.B. Polysorbate, Poloxamere oder Polyethylenglycol (PEG); und/oder neutrale Salze, z.B. NaCl, KCl, MgCl₂, CaCl₂, etc. ein.
Das Peptid ist typischerweise in solchen Vehikeln bei einem pH von oder von in etwa 4,5 bis 8 formuliert. Es wird verstanden werden, dass die Verwendung bestimmter der vorgenannten Arzneimittelträger, Träger oder Stabilisatoren zu der Bildung von Salzen des Peptids führen wird. Die endgültige Zubereitung kann eine stabile Flüssigkeit oder ein lyophilisierter Feststoff sein.
Typische Formulierungen der Peptide als pharmazeutische Zusammensetzungen werden unten besprochen. In etwa 0,5 bis 500 mg des Peptids oder der Mischung von Peptiden, in der Form der freien Säure oder Base oder als ein pharmazeutisch geeignetes Salz, werden mit einem physiologisch geeigneten Vehikel, Träger, Arzneimittelträger, Bindemittel, Konservierungsmittel, Stabilisator, Aroma, etc., wie es die übliche pharmazeutische Praxis verlangt, gemischt. Die Menge an wirksamem Bestandteil in diesen Zusammensetzungen ist so, dass eine geeignete Dosis in dem angegebenen Bereich erhalten wird.
Das Peptid, das für eine therapeutische Verabreichung verwendet werden soll, muss steril sein. Sterilität wird leicht mittels Filtrierung durch Sterilfiltrationsmembranen (z.B. 0,2-μm-Membranen) erreicht. Therapeutische Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter platziert, der einen sterilen Zugangsanschluss hat, z.B. einen intravenösen Lösungsbeutel oder ein Fläschchen, das einen mit einer Injektionsnadel durchstechbaren Stöpsel hat.
Das Peptid wird gewöhnlicherweise als eine wässrige Lösung oder als eine lyophilisierte Formulierung zur Rekonstituierung in Einzel- oder Mehrfachdosis-Behältern gelagert werden, z.B. versiegelten Ampullen oder Röhrchen. Als ein Beispiel einer lyophilisierten Formulierung werden 10-ml-Fläschchen mit 5 ml steril-filtrierter 1 % (Gew/Vol) wässriger Lösung des Peptids gefüllt, und die resultierende Mischung wird lyophilisiert. Die Infusionslösung wird durch Rekonstituieren des lyophilisierten Peptids unter Verwendung von bakteriostatischem Wasser-zur-Injektion hergestellt.
Eine Kombinationstherapie mit dem erfindungsgemäßen Peptid und einem oder mehreren anderen geeigneten Reagenzien, die die Gesamtmenge von IGF im Blut erhöhen oder die Wirkung des Peptids steigern, ist ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung. Diese Reagenzien erlauben es im Allgemeinen dem erfindungsgemäßen Peptid, das gebildete IGF freizusetzen. Zum Beispiel ist es wünschenswert, andere aktive Moleküle gemeinsam mit dem Peptid zu verabreichen. Zum Beispiel kann das Peptid bei Wasting- oder katabolischen Zuständen gemeinsam mit einem Appetitförderer, wie z.B. MEGASE^TM, verabreicht werden.
Außerdem wird das Peptid in geeigneter Weise verabreicht, indem es für die Verabreichung an einen Rezeptor oder Antikörper oder ein Antikörperfragment gekoppelt ist.
Eine zusätzliche Kombinationstherapie würde ein Wachstumshormon, wie z.B. menschliches Wachstumshormon, IGFBP-3 oder IGFBP-5, einschließen.
Bei der Behandlung hyperglycämischer Erkrankungen wird das Peptid geeigneterweise zusammen mit einer wirksamen Menge eines hypoglykämischen Wirkstoffs, wie z.B. Sulfonylharnstoff oder einem beliebigen Insulintyp verabreicht. Der hypoglykämische Wirkstoff wird dem Säuger mittels einer beliebigen geeigneten Technik verabreicht, einschließlich parenteral, intranasal, oral oder auf jedem anderen wirksamen Weg. Am meisten bevorzugt erfolgt die Verabreichung auf dem oralen Weg. Zum Beispiel sind MICRONASE^TM-Tabletten (Glyburid), die von Upjohn in Tablettenkonzentrationen von 1,25, 2,5 und 5 mg vermarktet werden, zur oralen Verabreichung geeignet. Die gewöhnliche Aufrechterhaltungsdosis für Typ-2-Diabetiker, die mit der erfindungsgemäßen Therapie behandelt werden, beträgt im Allgemeinen in dem Bereich von oder von in etwa 1,25 bis 20 mg pro Tag, die als Einzeldosis oder über den Tag verteilt gegeben werden kann, wie es als geeignet erscheint [Physician's Desk Reference, 2563–2565 (1995)]. Andere Beispiele von Tabletten auf Glyburid-Basis, die zur Verschreibung erhältlich sind, schließen das GLYNASE^TM-Markenarzneimittel (Upjohn) und das DIABETA^TM-Markenarzneimittel (Hoechst-Roussel) ein. GLUCOTROL^TM (Pratt) ist die Marke für eine Glipizid(1-Cyclohexyl-3-[p-[2-(5-methylpyrazincarboxamid)ethyl]phenyl]sulfonyl]harnstoff)-Tablette, die sowohl in 5- als auch in 10-mg-Stärke erhältlich ist, und wird auch Typ-2-Diabetikern verschrieben, die nach einer Diätkontrolle eine hypoglykämische Therapie benötigen, oder bei Patienten, die nicht mehr auf andere Sulfonylharnstoffe reagieren [Physician's Desk Reference, 1902–1903 (1995)]. Andere hypoglykämische Wirkstoffe als Sulfonylharnstoffe, wie z.B. die Biguanide (z.B. Metformin und Phenformin) oder Troglitazone oder andere Arzneimittel, die die Insulinwirkung beeinflussen, können auch verwendet werden.
Bei der Behandlung von Stauungsinsuffizienz (congestive heart failure) können ACE-Inhibitoren gemeinsam mit dem erfindungsgemäßen Peptid nützlich sein, indem sie den systemischen Gefäßwiderstand verringern und die zirkulatorische Kongestion lindern. Die ACE-Inhibitoren schließen die mit den Marken Accupril^® (Quinapril), Altace^® (Ramipril), Capoten^® (Captopril), Lotensin^® (Benazepril), Monopril^® (Fosinopril), Prinivil^® (Lisinopril), Vasotec^® (Enalapril) und Zestril^® (Lisinopril) bezeichneten ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Ein Beispiel eines ACE-Inhibitors ist der unter der Marke Capoten^® verkaufte. Generisch als Captopril bezeichnet, wird dieser ACE-Inhibitor chemisch als 1-[(2S)-3-Mercapto-2-methylpropionyl]-L-prolin bezeichnet.
Für Nierenfunktionsstörungen kann das Peptid geeigneterweise mit einem Nieren-aktiven Molekül verabreicht werden, das die Rückresorption und Rückhaltung von Elektrolyten fördert, wie z.B. das atriale natriuretische Peptid (ANP), ANP-Analoga oder eine beliebige Variante davon mit oder ohne Rezeptor-Aktivität, Urodilatin, menschliches B-Typ-natriuretisches-Peptid (BNP), Angiotensinrezeptor-Antagonist, Vasopressin und seine Analoga und Endothelin-Antagonisten, wie z.B. Antikörper oder Peptidantagonisten. Ein Beispiel ist BQ-123 (Ihara et al., Life Science, 50: 247–250 (1992); JP 51-94254A, veröffentlicht am 3. August 1993; Webb et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 185: 887-892 (1992)), ein zyklisches Pentapeptid, das ein potenter und spezifischer Blocker für Endothelin-A-Rezeptoren ist und nur die von Endothelin-1, nicht jedoch die von CT-1, Maus-LIF oder Phenylephrin induzierte, hypertrophe Aktivität blockiert. Ein anderes Beispiel ist die von Ihara et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 178: 132–137 (1991) beschriebene Stammverbindung von BQ-123. Weitere Beispiele schließen die in EP 647,236 , EP 647,449 , EP 633,259 (Phenylsulfonylaminopyrimidin-Derivate), EP 601,386 (Sulfonamid-Verbindungen), U.S. Pat. Nr. 5,292,740 (Phenylsulfonamidopyrimidine) und U.S. Pat. Nr. 5,270,313 (Phenylsulfonylaminopyrimidin-Derivate) beschriebenen ein. Außerdem können Inhibitoren des Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE) in Verbindung mit der IGF-I-Behandlung von Nierenfunktionsstörungen vorteilhaft sein.
Außerdem werden auch andere Mittel zur Beeinflussung des IGF-Status, wie z.B. Diät- oder Übungskuren, ebenfalls als erfindungsgemäße Kombinationsbehandlungen angesehen. Zum Beispiel kann man dem Säuger das Peptid gemeinsam mit einer Hoch-Kalorien-Diät oder Nahrung, wie z.B. ENSURE^TM ohne oder gemeinsam mit Nahrungsergänzungen, wie z.B. Ketosäure-Ergänzungen, verabreichen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Gentherapie zur Behandlung eines Säugers unter Verwendung einer Nukleinsäure, die das Peptid kodiert. Im Allgemeinen wird Gentherapie verwendet, um die IGF-Spiegel in einem Säuger zu erhöhen (oder überzuexprimieren). Für diesen Zweck können Nukleinsäuren verwendet werden, die das Peptid kodieren. Sobald die Aminosäuresequenz bekannt ist, kann man unter Verwendung der Degeneriertheit des genetischen Codes verschiedene Nukleinsäuremoleküle herstellen und auswählen, welches zur Gentherapie verwendet werden soll.
Es gibt zwei Hauptansätze, um die Nukleinsäure (die wahlweise in einem Vektor enthalten ist) für Zwecke der Gentherapie in die Zellen des Patienten einzubringen: in vivo und ex vivo. Für die In-Vivo-Einbringung wird die Nukleinsäure direkt in den Patienten gespritzt, für gewöhnlich an der Stelle, wo das Peptid gebraucht wird. Für die Ex-Vivo-Behandlung werden die Zellen des Patienten entnommen, die Nukleinsäure wird in diese isolierten Zellen eingeführt, und die modifizierten Zellen werden dem Patienten entweder direkt oder z.B. eingekapselt in durchlässigen Membranen, die in den Patienten implantiert werden, verabreicht. Siehe z.B. U.S. Patent Nrn. 4,892,538 und 5,283,187.
Es gibt eine Vielfalt von verfügbaren Techniken für das Einführen von Nukleinsäuren in lebende Zellen. Die Techniken unterscheiden sich, abhängig davon, ob die Nukleinsäure in vitro in die kultivierten Zellen oder in vivo in die Zellen des betreffenden Wirts eingeführt werden soll. Geeignete Techniken für den in vitro-Transfer von Nukleinsäuren in Säugerzellen schließen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, die Kalziumphosphat-Präzipitationsmethode, etc. ein. Ein üblicherweise verwendeter Vektor für die Ex-Vivo-Einbringung des Gens ist ein Retrovirus.
Die gegenwärtig bevorzugten In-Vivo-Nukleinsäure-Transfertechniken schließen die Transfektion mit viralen Vektoren (wie z.B. Adenovirus, Herpes-Simplex-I-Virus oder Adeno-Associated-Virus) und Lipid-basierte Systeme ein (nützliche Lipide für den Lipid-basierten Transfer des Gens sind zum Beispiel DOTMA, DOPE und DC-Chol). In einigen Situationen ist es wünschenswert, die Nukleinsäurequelle mit einem Mittel zu versehen, das auf die Zielzellen gerichtet ist, wie z.B. einem Antikörper, der spezifisch für ein Zelloberflächen-Membranprotein oder die Zielzelle ist, einen Liganden für einen Rezeptor auf der Zielzelle, etc. Wo Liposomen verwendet werden, können für das Targetting und/oder für eine Erleichterung der Aufnahme Proteine verwendet werden, die an ein mit der Endocytose assoziiertes Zelloberflächen-Membranprotein binden, z.B. Capsid-Proteine oder Fragmente davon mit einem Tropismus für einen bestimmten Zelltyp, Antikörper gegen Proteine, die während des Zyklus internalisiert werden und Proteine, die eine intrazelluläre Lokalisierung vermitteln und die intrazelluläre Halbwertzeit verlängern. Die Technik der Rezeptor-vermittelten Endocytose ist z.B. in Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429–4432 (1987); und Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410–3414 (1990) beschrieben. Für einen Übersichtsartikel der gegenwärtig bekannten Genmarkierungs- und Gentherapie-Protokolle siehe Anderson et al., Science, 256: 808–813 (1992). Siehe auch WO 93/25673 und darin zitierte Querverweise.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Kits. Ein typisches Kit umfasst einen Behälter, vorzugsweise ein Fläschchen für die Peptidformulierung, die das Peptid in einem pharmazeutisch geeigneten Puffer umfasst sowie Anweisungen, wie z.B. eine Produktbeilage oder -beschriftung, die den Verwender anweist, die pharmazeutische Formulierung für die Behandlung einer durch Fehlregulation der GH/IGF-Achse in einem Säuger gekennzeichnete Funktionsstörung zu verwenden. Das Kit schließt wahlweise einen Behälter, vorzugsweise ein Gläschen, für ein Kombinationsmolekül, wie z.B. ein Nierenaktives Molekül für Nierenversagen, ein.
Die Erfindung wird bei Bezugnahme auf die folgenden Beispiele vollständiger verstanden werden. Diese sollten jedoch nicht in einer Weise ausgelegt werden, wodurch der Umfang der Erfindung begrenzt würde. Alle hierin erwähnten Literatur- und Patentzitate sind ausdrücklich durch Querverweis einbezogen.
BEISPIEL 1
Alanin-Scanning-Mutagenese von IGF-I und strukturellen Varianten
Einleitung
Ein Alanin-Scanning-Mutagenese-Ansatz (Cunningham und Wells, supra) wurde verwendet, um den Teil jeder Seitenkette von IGF-I jenseits des beta-Kohlenstoffs zu entfernen. Der Beitrag dieser Atome zu der freien Energie der Bindung des Peptids an IGFBP-1 oder an IGFBP-3 wurde dann durch kompetitiven Phagen-ELISA bestimmt. Bei diesem Versuch wird IGFBP-1 oder IGFBP-3 verwendet, um IGF-Phagen-Mutanten daran zu hindern, an eine mit IGFBP-1 oder IGFBP-3 beschichtete immunsorbierende Platte zu binden. Die Bindung (IC₅₀) kann anhand einer Titrationsreihe des Bindungsproteins berechnet werden. Einige Mutanten wurden auch auf ihre direkte Bindung in BIACORE^TM-Versuchen untersucht.
In diesen Beispielen können gewöhnliche alpha-Aminosäuren durch den Standard-Ein- oder -Drei-Buchstaben-Aminosäurecode beschrieben werden, wenn auf Zwischenprodukte und Endprodukte Bezug genommen wird. Mit gewöhnlichen Aminosäuren sind solche Aminosäuren gemeint, die unter Leitung von mRNA in Proteine eingebaut werden. Standardabkürzungen sind in The Merck Index, 10. Ausgabe, S. Misc-2-Misc-3 aufgelistet.
Soweit nicht anders angegeben, haben die gewöhnlichen alpha-Aminosäuren die natürliche oder „L"-Konfiguration an dem alpha-Kohlenstoffatom. Falls dem Code ein „D" voransteht, bedeutet dies das entgegengesetzte Enantiomer der gewöhnlichen alpha-Aminosäure. Modifizierte oder ungewöhnliche alpha-Aminosäuren, wie z.B. Norleucin (Nle) und Ornithin (Orn), werden angegeben, wie in der U.S. Patent and Trademark Office Official Gazette 1114 TMOG, 15. Mai 1990, beschrieben.
Aufgrund der Ergebnisse von Experimenten, bei denen die unten beschriebene IGF-Mutante verwendet wurde, wird vorhergesagt, dass Moleküle des hierin beanspruchten Typs die Spiegel von aktivem IGF in einem behandelten Versuchssubjekt erhöhen sollten.
Materialien und Methoden:
Herstellung des Phagemid-Vektors und Mutagenese
Das Gen, das das reife menschliche IGF-I kodiert, wurde ausgehend von pBKIGF2B (U.S. Pat. Nr. 5,342,763) unter Verwendung der PCR-Primer 5'-AGC TGC TTT GAT ATG CAT CTC CCG AAA CTC TGT GCG GT-3' (SEQ ID NR:4) und 5'-GAG CGA TCT GGG TCT AGA CAG ATT TAG CGG GTT TCA G-3' (SEQ ID NR:5) amplifiziert. Das erhaltene Fragment wurde mit NsiI und XbaI geschnitten und in pH0753 ligiert, der zuvor mit NsiI und XbaI gespalten wurde. pH0753 ist ein Derivat von phGHam-g3 (Lowman et al., Biochemistry, 30: 10832–10838 (1991)), in dem die zusätzliche XbaI-Stelle in der Alkalische-Phosphatase-Promotor-(PhoA)-Region unter Verwendung des Oligonukleotids 5'-AAA AGG GTA TGT AGA GGT TGA GGT-3' (SEQ ID NR:6) deletiert wurde. Der ligierte Vektor pH0753, der den offenen Leserahmen von IGF-I enthält, wurde pIGF-g3 genannt. Er kodiert für IGF-I, das die Doppelmutation GlS-A70V enthält und an ein Fragment des Gen-III-Proteins (Reste 249–406) des E. coli-Bakteriophagen M13 fusioniert ist. Es wurde gefunden, dass die Bindung dieser IGF-I-Variante an IGFBP-1 und IGFBP-3 von Wildtyp-IGF-I nicht unterschieden werden kann. Eine Alanin-Mutagenese wurde unter Verwendung von einzelsträngigem Plasmid pIGF-g3 als Vorlage durchgeführt (Kunkel et al., Methods Enzymol., 204: 125–139 (1991)). Alle Reste von IGF-I mit der Ausnahme von Cysteinen und Alaninen wurden einzeln durch Alanin ersetzt. Die resultierenden Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung überprüft.
Bindung von auf Phagen präsentierten IGF-Mutanten an IGFBP-1 und -3 (Phagen-ELISA)
Immunosorbierende Platten (Nunc, MAXISORP^TM, 96 Vertiefungen) wurden mit 100 μl/Vertiefung von 1 μg/ml IGFBP-1 oder IGFBP-3 in PBS-Puffer pH 7,2 bei 4 °C über Nacht beschichtet. Die Platten wurden dann mit 0,5 % TWEEN 20^TM/PBS (auch als Bindungspuffer verwendet) für 2 Stunden bei Raumtemperatur blockiert (proteinöse Blockierungsmittel wie Rinderserumalbumin wurden vermieden, um eine mögliche IGF- oder IGFBP-Kontaminierung zu vermeiden). E. coli-Zellen (XL1-Blue, Stratagene), die frisch mit Phagemidvektor transformiert waren, wurden über Nacht in 5 ml 2YT-Medium (Sambrook et al., supra) in Gegenwart von M13-VCS-Helferphagen (Stratagene) kultiviert. Die Phagenpartikel wurden geerntet und in PBS-Puffer resuspendiert, wie in Lowman, H. B., „Phage Display of Peptide Libraries on Protein Scaffolds", in Cabilly, S. (Hrsg.) Combinatorial Peptide Library Protocols (Humana Press Inc.: Totowa, NJ, 1998), S. 249–264 beschrieben. Dann wurden die Phagen-Konzentrationen eingestellt, um ein maximales ELISA-Signal von 0,2–0,4 für jede Mutante zu erhalten (Lowman, in Cabilly, S. (Hrsg.), supra). Dreifache Verdünnungsreihen von löslichem Kompetitor wurden in nicht-absorbierenden Mikrotiterplatten (Nunc, F., 96 Vertiefungen) mit Bindungspuffer (0,5 % TWEEN^TM 20/PBS) hergestellt, die Phagen in zuvor bestimmten Konzentrationen enthielten. Der Verdünnungsbereich des Kompetitorproteins erstreckte sich über sechs Größenordnungen, beginnend bei 5 μM für IGFBP-1 und 500 nM für IGFBP-3. Nach dem Blockieren wurden die Platten, die immobilisierte Zielmoleküle (target) enthielten, mit 0,05 % TWEEN^TM/PBS-Puffer gewaschen und anschließend mit 80 μl/Vertiefung der zuvor gemischten Phagen-Kompetitor-Lösungen für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde gebundener Phage mit 80 μl/Vertiefung einer Lösung nachgewiesen, die einen primären Kaninchen-anti-Phage-polyklonaler-Antikörper und ein sekundärer-Ziege-anti-Kaninchen-monoklonaler-Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugat in 0,5 % TWEEN 20^TM/PBS enthielt. o-Phenylendiamin (Sigma) und Tetramethylbenzidin (Kirkegaard und Perry) wurden als chromogene Substrate verwendet, was zum Produktnachweise bei 492 bzw. 450 nm führte. IC₅₀-Werte wurden durch Anpassung der Bindungsdaten an eine generische Sättigungskurve bestimmt (Lowman, in Cabilly, S. (Hrsg.), supra). Wenigstens zwei Einzelklone jeder IGF-Mutante wurden analysiert. Die Werte in Tabelle I entsprechen den Durchschnitten ± Standardabweichung einzeln bestimmter IC₅₀-Werte.
Expression und Reinigung von IGFBP-1 und IGFBP-3
Menschliches IGFBP-1 wurde in CHO-Zellen exprimiert und aus dem konditionierten Medium, wie von Mortensen et al.; Endocrinology, 138: 2073–2080 (1997) beschrieben, gereinigt. Rekombinantes menschliches IGFBP-3 wurde ebenfalls kloniert und in Säugerzellen exprimiert (Wood et al., Mol. Endocrinology, 2: 1176–1185 (1988)). Die Reinigung aus konditioniertem Medium folgte im Wesentlichen dem für IGFBP-1 beschriebenen Verfahren unter Verwendung einer IGF-Affinitätssäule (Martin und Baxter, J. Biol. Chem., 261: 8754–8760 (1986)).
Expression und Reinigung löslicher IGF-I-Mutanten
Das Plasmid pBKIGF2B (U.S. Pat. Nr. 5,342,763) exprimiert das an das Leader-Peptid von lamB fusionierte menschliche Wildtyp-IGF-I unter der Kontrolle des P_phoA-Promotors. Um die ortsspezifische Mutagenese zu erleichtern, wurde der Replikationsursprung des Phagen fl (F1-Ori) in das Plasmid pBKIGF2B eingeführt. Zu diesem Zweck wurde ein 466-bp-BamHI-Fragment, das den F1-Ori enthielt, aus pH0753 (Lowman et al., supra, 1991) ausgeschnitten, während das Plasmid pBKIGF2B mit EcoRI linearisiert wurde. Der Vektor und das Fragment wurden beide mit Klenow-Enzym behandelt, um die Restriktionsstellen-Überhänge vor der Stumpfenden-Ligation aufzufüllen. Korrekte Konstrukte wurden anhand der Fähigkeit, einzelsträngige Phagemid-DNA in der Gegenwart von M13VCS-Helferphagen zu produzieren, ausgewählt. Der erhaltene Phagemid-Vektor wurde pBKIGF2B-fl-ori genannt und als Template für die Herstellung der gewünschten IGF-I-Ala-Mutanten (siehe Tabelle II) unter Verwendung des Verfahrens von Kunkel et al., Methods Enz., 204: 125–139 (1991) hergestellt. Jeder Mutageneseschritt wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Die Expression von IGF-I-Mutanten wurde, wie für den IGF-I-Wildtyp beschrieben (Joly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2773–2777 (1998)) durchgeführt, jedoch ohne transiente Überexpression von Oxidoreduktasen. Das Reinigungsverfahren basierte auf einem früheren Protokoll (Chang und Swartz, „Single-Step Solubilization and Folding of IGF-I Aggregates from Escherichia coli", in Cleland, J. L. (Hrsg.), Protein Folding In Vivo and In Vitro (American Chemical Society, Washington, DC, 1993), S. 178–188), mit geringen Abweichungen. Typischerweise wurden 6 g nasser Zellpaste (entsprechend 2 l Niedrigphosphatmedium, kultiviert für 24 Stdn.) in 150 ml 25 mM Tris-HCl pH 7,5 resuspendiert, die 5 mM EDTA enthielten. Die Zellen wurden in einem Mikrofluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) lysiert, und refraktile Partikel, die angehäufte IGF-Aggregate enthielten, wurden durch Zentrifugation bei 12.000 × g gesammelt. Die refraktilen Partikel wurden zweimal mit Lysepuffer, zweimal mit Lysepuffer, der 1 % N-Laurylsarcosin (Sigma) enthielt, um Membranproteine zu extrahieren, und noch zweimal mit Lysepuffer gewaschen. Die gewaschenen refraktilen Körper wurden zu in etwa 2 mg/ml in 50 mM CAPS (3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure; Sigma)-Puffer pH 10,4 resuspendiert, der 2 M Harnstoff, 100 mM NaCl, 20 % MeOH und 2 mM DTT enthielt. Dieses Verfahren kombiniert die Solubilisierung refraktiler Körper und die nachfolgende oxidative Rückfaltung von IGF-I-Mutanten (Chang und Swartz, supra).
Nach 3 Stdn. bei Raumtemperatur wurden die Rückfaltungslösungen durch Mikrokonzentrator-Membranen (Centricon, Amicon) mit einem Molekulargewichts-Ausschluss von 50 kDa filtriert. Der größte Teil des monomeren IGF-I wurde in dem Eluat gewonnen, wogegen Kontaminanten mit höherem Molekulargewicht in dem Retentat konzentriert wurden. An diesem Punkt waren die IGF-I-Fraktionen zu > 95 % rein, wie anhand einer SDS-PAGE-Analyse beurteilt wurde. Um IGF-I mit korrekter Disulfidbindung von Austausch-IGF (IGF-Swap) (das zwei nicht-native Disulfide enthielt; Hober et al., Biochemistry, 31: 1749–1756 (1992); Miller et al., Biochemistry, 32: 5203-5213 (1993)) zu trennen, wurden die Rückfaltungslösungen mit 5 % Essigsäure angesäuert und auf eine Dynamax^TM-C18-halbpräparative HPLC-Säule (Varian; 10,0 mm ID) mit 4 ml/min aufgetragen. Die Puffer waren H₂O/0,1 % TFA (A) und Acetonitril/0,1 % TFA (B). Die Trennung der Disulfidisomere wurde durch Anlegen des folgenden Gradienten erreicht: 0–30 % B für 20 min, 30–45 % B für 60 min. Das Verhältnis von nativem IGF-I zu Austausch-IGF-I (IGF-Swap) war im Allgemeinen in etwa 2:1 für jede Mutante, wobei Austausch-IGF (IGF-Swap) früher in dem Gradienten eluierte als natives IGF-I. Das Molekulargewicht jeder Mutante wurde durch Massenspektrometrometrie überprüft. Nach der HPLC-Reinigung wurden die Proben lyophilisiert und in etwa zu 1 mg/ml in 100 mM HEPES-Puffer, pH 7,4, rekonstituiert.
Kinetische Biosensor-Messungen
Die Bindungsaffinitäten der IGF-Varianten für IGFBP-1 und IGFBP-3 wurden unter Verwendung eines BIACORE^TM-2000-Systems für kinetische Interaktionsanalysen in Echtzeit bestimmt (Biacore, Inc., Piscataway, NJ), um Assoziations- (k_a) und Dissoziationsgeschwindigkeiten (k_d) zu messen. Carboxymethyliertes-Dextran-Biosensorchips (CM5, BIAcore-Inc.) wurden mit EDC (N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid) und NHS (N-Hydroxysuccinimid) nach den Anweisungen des Herstellers aktiviert. Für die Immobilisierung wurden IGF-Mutanten in 20 mM Natriumacetat pH 4,8 mit einer Konzentration von 50 μg/ml auf den Biosensorchip injiziert, um in etwa 450 bis 600 RUs (Resonanz-Antworteinheiten) von kovalent-gekoppeltem Protein zu erhalten. Gruppen, die nicht reagiert hatten, wurden durch eine Injektion von 1 M Ethanolamin blockiert. Kinetische Messungen wurden durch Injizieren von 2-fachen Verdünnungsreihen (beginnend mit 1 μM) von entweder IGFBP-1 oder IGFBP-3 in Laufpuffer (PBS, 0,05 % Tween 20, 0,1 % Ovalbumin, 0,1 % Natriumazid) bei 25 °C unter Verwendung einer Flussrate von 20 μl/min durchgeführt. Assoziationsgeschwindigkeiten (k_a) und Dissoziationsgeschwindigkeiten (k_d) wurden getrennt berechnet, wobei ein 1:1-Langmuir^TM-Assoziationsmodell in der BIACORE^TM-Evaluation-Software V. 3.0 verwendet wurde. Die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante (K_D) wurde als k_d/k_a berechnet.
Ergebnisse
Monovalente Phagen-Präsentation von IGF-I
Für ein schnelles und umfassendes Alanin-Scan der 70 Aminosäurereste von IGF-I wurde zunächst bestimmt, ob das Protein monovalent auf der Oberfläche des Phagen M13 präsentiert werden konnte (Bass et al., Proteins, 8: 309–314 (1990)). Die Phagenpräsentations-Technologie kombiniert den Vorteil der schnellen Einzelstrang-DNA-Mutagenese mit einer leichten Reinigung des resultierenden Mutantenproteins, einfach durch Isolieren der entsprechenden Phagenpartikel (z.B. Cunningham et al., 1994, supra). Ein Vektor wurde konstruiert, in dem das reife menschliche IGF-I an die Carboxyterminale Domäne des M13-Gen-III-Produkts fusioniert war. Dieses Konstrukt schließt die stII-Signalsequenz ein, die das Fusionsprotein in den periplasmatischen Raum von E. coli dirigiert und eine monovalente Präsentation des Proteins erlaubt (Bass et al., supra; Lowman et al., supra, 1991). Für Klonierungszwecke wurden die erste und die letzte Aminosäure von IGF-I geändert; die resultierende Mutante GlS-A70V wurde als Vorlagen(Template)-Konstrukt für die nachfolgende Alanin-Scanning-Mutagenese verwendet.
Wenn Phagenpartikel, die IGF-I-GlS-A70V präsentierten, isoliert und in einem Bindungskompetitions-Phagen-ELISA bezüglich ihrer Affinität für IGFBPs untersucht wurden, waren die in diesem Experiment bestimmten IC₅₀ 8,5 nM für IGFBP-1 und 0,5 nM für IGFBP-3 (1). Diese Werte sind in guter Übereinstimmung mit den in BIACORE^TM-Experimenten unter Verwendung von Wildtyp-IGF-I (Heding et al., supra) bestimmten Dissoziationskonstanten. Die Wildtyp-IGF-I-Affinitäten, die mit radioaktiven Immunassays (RIA) bestimmt wurden, sind ~ 2,8 nM für IGFBP-1 und ~ 0,8 nM für IGFBP-3, was die aus dem Phagen-ELISA abgeleiteten IC₅₀-Werte unterstützt. Außerdem wurden Phagenpartikel, die IGF-I-GlS-A70V präsentierten, in effizienter Weise von 11 unabhängigen, an Mikrotiterplatten immobilisierten Maus-anti-IGF-I-Antikörpern gefangen. Diese Ergebnisse deuteten gemeinsam darauf hin, dass die präsentierte IGF-Variante korrekt gefaltet und auf der Oberfläche des Phagenpartikels zugänglich ist.
Ala-Scanning-Mutagenese der IGF-I-Bindung an IGFBP-1 und IGFBP-3
Alle Reste von GlS-A70V-IGF-I mit der Ausnahme der vier nativen Alanine und sechs Cysteine wurden einzeln unter Verwendung des beschriebenen GlS-A70V-IGF-I-gIII-Vektors als Vorlage durch Alanin ausgetauscht. Zusätzlich wurden die Einzelmutanten S1G und V70A und die Doppelmutation, die Wildtyp-IGF-I wiederherstellte, konstruiert. Jedes dieser Konstrukte wurde in E. coli exprimiert und auf Phagen präsentiert. IC₅₀-Werte für die Bindung an IGFBP-1 und IGFBP-3 wurden durch kompetitiven Phagen-ELISA, wie in 1 gezeigt, bestimmt. Wenigstens zwei verschiedene Klone jeder Mutante wurden getestet. Die resultierenden IC₅₀-Werte sind in der Tabelle I aufgelistet, und die Abnahme oder die Zunahme von IC₅₀ bei jeder Mutante im Vergleich zu GlS-A70V ist in 2 grafisch dargestellt.
TABELLE I Apparente Affinitäten (IC₅₀) von IGF-I-Varianten für IGFBP-1 und IGFBP-3, bestimmt durch Phagen-Präsentation^a
Die Mehrzahl der Alanin-Mutanten ergab nur geringe Änderungen der IC₅₀-Werte in dem Phagen-ELISA. Bedeutsamerweise zeigte Wildtyp-IGF-I die gleichen Affinitäten für IGFBP-1 und IGFBP-3 wie GlS-A70V, vor dessen Hintergrund die Alanin-Austausche durchgeführt wurden (Tabelle I, 2). Nur wenige Reste führten zu beträchtlichen (> 10-fach) Affinitätsverlusten, wenn sie durch Alanin ausgetauscht wurden: E3, G7, L10, V11, F25, R36, P39, F49 und P63 für die IGFBP-1-Bindung; V11, R36, P39 und P63 für die IGFBP-3-Bindung. Es wurde angemerkt, dass Ala-Austausche von Glycinen und Prolinen zu strukturellen Störungen des Protein-Rückgrats führen können (Di Cera, Chem. Rev., 98: 1563–1591 (1998)).
Nur einge mäßige Verbesserungen der Bindungsaffinität wurden durch Alanin-Austausche gefunden. S1A, D12A und D45A zeigten eine in etwa 2-fache Zunahme der IGFBP-1-Bindung, während S35A und T41A eine ähnliche Wirkung für IGFBP-3 zeigten. Jedoch sind 2-fache Veränderungen von IC₅₀-Werten bei diesen Experimenten an der Grenze der Genauigkeit.
IGFBP-Spezifitätsdeterminanten
E3A, G7A, L10A, F25A und F49 zeigten einen unterschiedlichen Effekt bei der Bindung von IGFBP-1 im Vergleich zu IGFBP-3. Bei diesen fünf IGF-I-einzel-Alanin-Mutanten unterschied sich der relative IC₅₀ für IGFBP-1 um mehr als das Vierfache von demjenigen für IGFBP-3 (2; Tabelle 1, relative Spezifität). E3A und F49A zeigten die höchsten relativen Spezifitätsfaktoren in dieser Gruppe. Die Alanin-Substitution von E3 hatte praktisch keine Auswirkung auf die IGFBP-3-Affinität (1,4-fach), während die Bindung an IGFBP-1 34-fach geschwächt war. In sogar noch dramatischerer Weise war die Affinität von F49A mehr als 100-fach für IGFBP-1, aber nur 3,6-fach für BP-3 verringert. Dieses Ergebnis wurde in einem direkten Vergleich durch Phagen-ELISA veranschaulicht. IGF-I-F49A-präsentierende Phagenpartikel wurden in der Anwesenheit von löslichem IGFBP-1 (3A) oder IGFBP-3 (3B) in mit IGFBP-3 beschichtete Vertiefungen zugegeben. Im Vergleich zu einem Kontrollphagen, der IGF-I-GlS-A70V präsentierte, verschob sich die Bindungskurve von F49A bei der IGFBP-1-Kompetition um mehr als zwei Größenordnungen (3A). Im Gegensatz waren die Bindungskurven bei der IGFBP-3-Kompetition ähnlich, und die IC₅₀-Werte unterschieden sich um weniger als einen Faktor von 4 (3B). Somit sind E3 und F49 zwei Hauptspezifitätsdeterminanten in dem IGF-I-Molekül für die IGFBP-1-Bindung.
Die Reste G7, L10 und F25 schienen wichtig für die Bindung beider IGFBPs zu sein, obwohl sie einen ausgeprägteren Affinitätsverlust für IGFBP-1 als für IGFBP-3 zeigten, wenn sie durch Alanine substituiert wurden. Für IGFBP-3 wurde keine signifikante Spezifitätsdeterminante identifiziert, wie z.B. eine Mutante, die viel fester an IGFBP-1 als an IGFBP-3 bindet. Jedoch hatten die Mutationen E9A, D12A, F23A, Y24A, T29A, S34A und D45A geringfügig stärkere (in etwa 2-fach) Auswirkungen auf die IGFBP-3-Bindung als auf die IGFBP-1-Bindung.
BIACORE^TM-Messungen gereinigter löslicher IGF-Mutanten
Zur Bestätigung der durch Phagen-ELISA erhaltenen Ergebnisse wurden spezifische Alanin-Mutanten exprimiert, und für kinetische Analysen unter Verwendung eines BIACORE^TM-Instruments gereinigt. Die Dissoziationskonstante (K_D) von Wildtyp-IGF-I wurde als 13 nM für IGFBP-1 und 1,5 nM für IGFBP-3 (5A und 5B; Tabelle II) bestimmt. Der Unterschied in der Affinität für die IGFBPs beruht auf einer 10-fach schnelleren Assoziationsgeschwindigkeit (k_a) von IGF-I an IGFBP-3 (3,2 × 10⁵ im Vergleich zu 3,2 × 10⁴ M^–1s^–1). Diese Ergebnisse stimmen gut mit den absoluten IC₅₀-Werten überein, die durch Phagen-ELISA bestimmt wurden (1A und 1B; Tabelle I). Wie erwartet, zeigte die Doppelmutante GlS-A70V kinetische Parameter, die im Grunde nicht unterscheidbar vom Wildtyp waren (Tabelle II).
V11A, R36A und P39A wurden getestet, weil diese Varianten aufgrund der Antikörper-Erkennungsexperimente (siehe oben) nicht in korrekter Weise auf dem Phagen präsentiert wurden. R36A und P39A zeigten Wildtyp-Kinetiken für beide Bindungsproteine, wogegen V11A eine 5-fache Abnahme der Affinität sowohl für IGFBP-1 als auch für IGFBP-3 zeigte.
Außerdem wurde beschlossen, die lösliche IGF-Variante T4A zu untersuchen. Dieser Rest war in früheren Publikationen (Bayne et al., supra, J. Biol. Chem., 263: Clemmons et al., supra, 1990), mit der IGFBP-Bindung in Verbindung gebracht worden, aber hatte vorliegend in den Phagen-Versuchen geringe Effekte gezeigt. Die Zunahme der K_D-Werte von T4A im Vergleich zu Wildtyp-IGF-I war in etwa 2- bis 3-fach höher als die durch Phagen-ELISA bestimmten IC₅₀-Verhältnisse (Tabelle II). Eine größere Diskrepanz zwischen den durch Phagen und die Biosensoranalyse erhaltenen Ergebnissen wurde für F16A beobachtet. In diesem Fall unterschieden sich die beiden Methoden um einen Faktor von 4.
Es wurde gezeigt, dass Mutationen in der ersten α-helikalen Region eine destabilisierende Wirkung auf die IGF-Proteinstruktur haben (Jansson et al., supra, 1997). Ohne Beschränkung auf irgendeine Theorie wird angenommen, dass das g3-Fusionsprotein auf der Oberfläche des Phagens stabiler sein könnte als das zurückgefaltete, gereinigte lösliche Protein. Dies wird durch die BIACORE^TM-Resultate unterstützt, die für F25A und F49A erhalten wurden, zwei außerhalb der strukturell empfindlichen N-terminalen Helix gelegenen Resten. Die jeweiligen Änderungen der K_D- und IC₅₀-Werte sind für diese beiden Mutanten in hervorragender Übereinstimmung (Tabelle II). Der unterschiedliche Effekt von F49A auf die Bindung an die IGFBPs wurde durch die BIACORE^TM-Analyse bestätigt. Eine 70-fache Abnahme der Affinität wurde für die IGFBP-1-Bindung gemessen (5C; Tabelle II), wogegen die IGFBP-3-Bindung nur 4-fach verringert war (5D; Tabelle II).
TABELLE II Kinetische Parameter für die Wechselwirkung gereinigter IGF-I-Varianten mit IGFBP-1 und -3, bestimmt durch BIACORE^TM-Analyse^a Bindung an IGFBP-1
Bindung an IGFBP-3
Rolle der N-terminalen IGF-I-Reste
Überraschenderweise wurden die IGFBP-3-Wechselwirkung von den Alanin-Substitutionen im Allgemeinen viel weniger beeinflusst als die Wechselwirkung mit IGFBP-1, obwohl IGFBP-3 IGF-I mit in etwa 10-fach höherer Affinität bindet. Abgesehen von P63A zeigte keine Alanin-Mutante eine > 6-fache Abnahme der IGFBP-3-Affinität (2 und Tabelle I).
Es war zuvor in Biosensor-Experimenten gezeigt worden, dass des(1–3)-IGF-I IGFBP-3 mit einer 25-fach verringerten Affinität bindet (Heding et al., supra). Dieser natürlicherweise vorkommenden Form von IGF-I fehlen die ersten drei N-terminalen Reste, und sie zeigt eine erhöhte mitogene Potenz, die vermutlich auf ihrer verringerten IGFBP-Bindung beruht (Bagley et al., supra). Da keine der ersten drei Aminosäure-Seitenketten irgendeinen energetischen Beitrag zu der Bindung von IGFBP-3 zu leisten scheint (Tabelle I), aber dennoch des(1–3)-IGF-I bezüglich der IGFBP-3-Bindung beeinträchtigt ist, wird ohne Begrenzung auf irgendeine Theorie die Hypothese aufgestellt, dass Rückgrat-Wechselwirkungen beteiligt sein könnten.
Diese Hypothese wurde getestet, indem eine dreifache Alaninmutante (Ala(1–3)-IGF-I) auf Phagen präsentiert wurde, wobei die ersten drei N-terminalen Aminosäuren ausgetauscht wurden. Falls das Rückgrat in dieser Region zu der Wechselwirkung mit IGFBP-3 beiträgt, sollte diese Mutante in der Lage sein, zu binden. Die Bindung an IGFBP-1 sollte jedoch aufgrund des Fehlens der E3-Seitenkette verringert sein (Tabelle I). Als eine Kontrolle wurde die des(1–2)-IGF-I-Mutante hergestellt, um beliebige mögliche Rückgrat-Wechselwirkungen mit IGFBP-1 an den Positionen 1 und 2 zu überprüfen. Wie erwartet, zeigte Ala(1–3)-IGF-I, ähnlich wie E3A, eine verringerte IGFBP-1-Affinität aber keine Veränderung der IGFBP-3-Affinität (Tabelle I; 2). Bei des(1–2)-IGF-I wurde für beide Bindungsproteine kein Unterschied der Affinität beobachtet. Zusammengefasst mit den Beobachtungen an des(1–3)-IGF-I (Heding et al., supra) deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ohne Beschränkung auf irgendeine Theorie das Peptidrückgrat zwischen den Resten 3 und 4 von IGF-I wichtige Wechselwirkungen mit IGFBP-3 vermittelt.
Diskussion
Die funktionellen IGFBP-1- und IGFBP-3-Bindungsepitope auf der Oberfläche von IGF-1 wurden durch Alanin-Scanning-Mutagenese untersucht. Beide Bindungsepitope sind in der 6 dargestellt. Einzelne IGF-I-Seitenketten-Wechselwirkungen spielen eine viel wichtigere Rolle für die Bindung an IGFBP-1 als an IGFBP-3. Zwei Hauptbindungsbereiche werden für IGFBP-1 gefunden (6A). Eine befindet sich auf der oberen Oberfläche der N-terminalen Helix (zusammengesetzt aus G7, L10, V11, L14, F25, I43 und V44) und eine auf der unteren Oberfläche (zusammengesetzt aus E3, T4, L5, F16, V17 und L54). Diese beiden Bindungsbereiche sind durch F49 und R50 verbunden. Bei IGFBP-3 ist das Bindungsepitop unschärfer und hat sich verlagert, um G22, F23 und Y24 einzuschließen (6B). Die Bindung von IGFBP-3 ist im Allgemeinen viel weniger empfindlich gegenüber Alanin-Substitutionen. Tatsächlich ist die stärkste Affinitätsverringerung (abgesehen von P63A, siehe unten) eine 6-fache Verringerung, die bei G7A beobachtet wurde. Dieses Ergebnis ist faszinierend, weil IGFBP-3 mit einer 10-fach höheren Affinität an IGF-I bindet, als IGFBP-1 dies tut. Höchstwahrscheinlich tragen, ohne Beschränkung auf irgendeine Theorie, Wechselwirkungen, die ihren Ursprung an dem IGF-I-Hauptkettenrückgrat haben, zu der Bindung von IGFBP-3 bei. Diese Hypothese wird weiter durch die Experimente mit der Ala(1–3)-IGF-Mutante unterstützt. Während die einzelnen und dreifachen Alanin-Substitutionen kein Auswirkung auf die IGFBP-3-Bindung haben, führt die Deletion der ersten drei Aminosäuren zu einer 25-fachen Verringerung der Affinität (Bagley et al., supra; Clemmons et al., supra, 1992; Heding et al., supra). Zusammengefasst verwendet IGF-I verschiedene Bindungsweisen, um mit IGFBP-1 und IGFBP-3 zu assoziieren: Einige wenige Aminosäureseitenketten-Wechselwirkungen sind für die Bindung an IGFBP-1 wichtig, während Rückgrat-Wechselwirkungen eine energetische Hauptrolle für die Bindung an IGFBP-3 zu spielen scheinen.
Eine jüngste Publikation hat das Bindungsepitop auf IGF-I für IGFBP-1 durch heteronukleäre NMR-Spektroskopie untersucht (Jansson et al., supra, 1998). Die Autoren fanden, dass die IGF-I-Reste 29, 30, 36, 37, 40, 41, 63, 65 und 66 unter anderen nach einer Komplexierung mit IGFBP-1 bei 30 °C Störungen der chemischen Verschiebung erlitten. Außerdem identifizierten Jansson und Mitarbeiter R36, R37 und R50 als Teile des funktionellen Bindungsepitops und testeten diese Alanin-Mutanten in BIACORE^TM-Experimenten. Die größte, von diesen Autoren beobachtete Affinitätsänderung war eine dreifache Abnahme für R50A. Jedoch waren Jansson et al. aufgrund der bereits in der ersten NMR-Studie des Hormons beobachteten strukturellen Flexibilität von IGF-I (Cooke et al., supra) nicht in der Lage, viele Reste, einschließlich F49, in dem NMR-Spektrum vollständig zuzuordnen.
In ähnlichen Studien von Protein-Protein-Grenzflächen wurde gefunden, dass nur einige wenige Seitenketten-Reste zu dem größten Teil der freien Bindungsenergie beitragen (Clackson und Wells, Science, 267: 383–386 (1995); Kelley et al., Biochemistry, 34: 10383–10392 (1995)). Dasselbe trifft für die IGF-IGFBP-1-Wechselwirkung zu. Dabei ist jedoch, wie für den an den Faktor VIIa bindenden Gewebefaktor bemerkt wurde, die Größe der Werte der freien Bindungsenergie (ΔΔG), die von den wichtigen Seitenketten stammen, kleiner als in dem Fall des Wachstumshormons (Kelley et al., supra). Die Reste mit vorherrschenden ΔΔG-Beiträgen waren nicht wie bei der Wachstumshormon-Rezeptor-Grenzfläche auf der IGF-I-Oberfläche gruppiert (Clackson und Wells, supra), jedoch bildeten sie dennoch ein kontinuierliches IGFBP-1-Bindungsepitop (6A). Im Gegensatz war das IGFBP-3-Bindungsepitop auf IGF-I diskontinuierlich, und Seitenketten trugen sehr geringe individuelle Bindungsenergien bei.
Die Substitution von P63 durch Alanin in IGF-I führt zu einer verringerten Affinität für beide Bindungsproteine, die in dem bei den kompetitiven Phagen-ELISAs verwendeten Konzentrationsbereich nicht gemessen werden kann. Jedoch befindet sich der Rest P63 auf der gegenüberliegenden Seite des IGF-I-Moleküls im Verhältnis zu dem Haupt-Bindungsepitop. Außerdem wurde angemerkt, dass Alanin-Substitutionen von Glycinen und Prolinen zu Strukturveränderungen führen können (Di Cera, supra). Außerdem schlossen Jansson et al., 1998, supra, dass der C-terminale Teil von IGF-I nicht an direkten IGFBP-1-Kontakten beteiligt ist, sondern vielmehr indirekte Konformationsänderungen in Folge der Komplexbildung erfährt. Eine ausführliche Charakterisierung von Antikörper-Bindungsstellen auf IGF-I wurde von Mañes et al., Endocrinology, 138: 905–915 (1997) durchgeführt. Sie zeigten eine gleichzeitige Bindung von IGFBP-1 oder -3 an IGF-I in einem Komplex mit Antikörpern, die die C-terminale D-Domäne erkennen. Diese Ergebnisse unterstützen außerdem frühere Beobachtungen, wonach die D-Domäne, die mit dem Rest P63 beginnt, nicht an der Bindung von IGFBP-1 oder -3 beteiligt ist (Bayne et al., supra, 1988).
Die größte Diskrepanz zwischen einem IC₅₀-Verhältnis, das durch Phagen-ELISA erhalten wurde, und einem BIACORE^TM-Ergebnis wurde bei dem Rest F16 beobachtet. Wie bereits erwähnt, führte die Substitution dieses Restes durch Alanin zu Strukturveränderungen in dem IGF-I-Molekül (Jansson et al., supra, 1997). Derselbe Effekt wurde bei der K_D in den BIACORE^TM-Ergebnissen beobachtet, aber die Affinitätsabnahme war in den Phagen-ELISA-Experimenten weniger ausgeprägt (siehe Tabelle II). Bei beiden BIACORE^TM-Messungen wurde IGF-F16A verwendet, das während des Reinigungsverfahrens rückgefaltet worden war (Jansson et al., supra, 1997). Bei der Phagenpräsentation wird das interessierende Protein jedoch natürlicherweise von der Sekretionsmaschinerie von E. coli transloziert. Die geringe Proteinmenge bei der monovalenten Phagen-Präsentation (< 1 Molekül pro Phagenpartikel) mag zur Vermeidung von Aggregation und Missfaltung beitragen. Zusätzlich könnte die Fusion von IGF-I an das verkürzte g3-Phagenprotein einen stabilisierenden Effekt auf die native Struktur des Peptids ausüben.
Die Hauptmenge von IGF-I im Kreislauf wird als Komplex mit IGFBP-3 und einem dritten Protein gefunden, das als Säure-empfindliche Untereinheit (ALS) bezeichnet wird (Bach und Rechler, supra; Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8: 45–62 (1997); Jones und Clemmons, supra). Dieser ternäre Komplex mit einem Molekulargewicht von 150 kD kann die Gefäßwände nicht überqueren und wirkt als zirkulierender Vorrat für IGFs. Durch diesen Mechanismus wird die Halbwertszeit von IGF-I dramatisch erhöht (Simpson et al., Growth Horm IGF Res., 8: 83–95 (1998)). Die Spiegel von IGFBP-3 werden von IGF-I positiv reguliert. Im Unterschied ist die Rolle von IGFBP-1 weniger klar. Diese Klasse von Bindungsproteinen ist im Allgemeinen weniger häufig als IGFBP-3, und ihre Spiegel werden von Insulin negativ reguliert (Bach und Rechler, supra; Clemmons, supra, 1997; Jones und Clemmons, supra).
Basierend auf den erfindungsgemäßen Ergebnissen werden IGFBP-spezifische Varianten von IGF-I erhalten. Die Kombination mehrerer Alanin-Mutationen führt zu einer Variante, die IGFBP-1 sehr schwach bindet, während sie weiterhin die hochaffine Bindung von IGFBP-3 behält. Der Entwurf von IGFBP-1-spezifischen Varianten, die nicht länger an IGFBP-3 binden, kann die Phagen-Präsentation von IGF-I und die zufällige Anordnung von Aminosäuren an bestimmten Positionen beinhalten (Cunningham et al., 1994, supra; Lowman und Wells, J. Mol. Biol., 243: 564–578 (1993)).
Schlussfolgerung:
Es wurden Reste in IGF-I identifiziert, die wichtig für die Bindung an IGFBP-1 und IGFBP-3 sind. Verschiedene Reste wurden gefunden, die die Bindungsspezifität für ein bestimmtes IGFBP bestimmen. Jüngste Veröffentlichungen (Loddick et al., supra; Lowman et al., Biochemistry, supra, 1998)) berichteten über Tierstudien, in denen erhöhte Spiegel von bioverfügbarem „freiem" IGF-I durch die Verdrängung von endogenem IGF-I von Bindungsproteinen erzeugt wurden. IGFBP-spezifische IGF-I-Varianten können wie erfindungsgemäß beschrieben diagnostisch und therapeutisch verwendet werden.
BEISPIEL 2
Charakterisierung bestimmter Mutanten mit Bezug auf die Behandlung von Nierenerkrankungen
Herstellung von IGF-I-Mutanten
In Beispiel 1 (und in Dubaquié und Lowman, Biochemistry, 38: 6386 (1999)) werden IGF-
I-Mutanten identifiziert, bei denen die Bindung an IGFBP-1, IGFBP-3 oder beide Bindungsproteine reduziert war. Insbesondere identifizierte die vollständige Alanin-Scanning-Mutagenese von IGF-I die Glutaminsäure 3 (E3) und Phenylalanin 49 (F49), sowie in gewissem Umfang Phenylalanin 16 (F16) und Phenylalanin 25 (F25), als Spezifitätsdeterminanten für die Bindung an IGFBP-1. Phagenpräsentations-Alanin-Scanning-Ergebnisse deuteten darauf hin, dass beide Seitenketten an den Positionen 3 und 49 selektiv eine beachtliche Bindungsenergie für die Komplexbildung mit IGFBP-1 beitragen (~ 30-fache Affinitätsabnahme bei E3A, ~ 100-fache bei F49A), während ihr Beitrag zur Bindungsenergie für IGFBP-3 nicht nachweisbar (E3A) oder unbedeutend ist (~ 4-fach für F49A) (siehe Beispiel 1 und Dubaquié und Lowman, supra).
Eine weiter verbesserte Spezifität für IGFBP-3 wurde vermutlich durch kummulatives Mutieren von IGF-I erreicht, weil die Wirkungen von Punktmutationen häufig additiv bezüglich ihres Beitrags zu der freien Bindungsenergie sind (Wells, Biochemistry, 29: 8509 (1990)). Deshalb wurde eine Doppelmutante von IGF-I, E3A/F49A, durch die Kombination der Punktmutationen E3A und F49A in einem einzigen Molekül konstruiert. Obwohl F16A eine geringere IGFBP-Spezifitätswirkung zeigte (Beispiel 1 und Dubaquié und Lowman, supra), wurde auch die Doppelmutante F16A/F49A hergestellt.
Außerdem wurde eine neue Punktmutante von IGF-I, Y31C, hergestellt, die ein einzelnes, vermutlich ungepaartes Cysteinylthiol enthält, um eine ortsspezifische Immobilisierung von IGF-I für Bindungsversuche zu erleichtern. Y31C wurde ausgewählt, weil es außerhalb der Bindungsepitope für IGFBP-1 und IGFBP-3 ist (Dubaquié und Lowman, supra). Diese Immobilisierungstechnik stellt eine einheitliche Ligandenpopulation (Cunningham und Wells, J. Mol. Biol., 234: 554 (1993)) für die Bindung durch injizierten Analyten (d.h. IGF-Bindungsprotein) sicher. Der Vorteil dieses Verfahrens gegenüber der früher verwendeten Aminkopplung ist, dass der IGF-I-N-Terminus unblockiert und frei für beliebige mögliche Aminkopplungen an die Chipmatrix ist. Dies mag besonders wichtig für Bindungsanalysen von IGFBP-1 sein, von dem angenommen wird, dass es mit Seitenketten des IGF-I-N-Terminus interagiert (Dubaquié und Lowman, supra). Y31C, das auf einem Phagen präsentiert wurde, zeigte Wildtyp-ähnliche Affinitäten sowohl für IGFBP-1 als auch für IGFBP-3, was die Vorstellung unterstützt, dass die Region um Rest 31 bei der Rezeptorbindung wichtig ist, aber keinen Kontakt mit den Bindungsproteinen bildet (Bayne et al., J. Biol. Chem., 264: 11004 (1988), supra; Bayne et al., J. Biol. Chem, 265: 15648 (1989), supra).
Einzel-Alanin-Varianten von IGF-I, einschließlich F49A, sowie die E3A/F49A-Doppelmutante wurden exprimiert, gereinigt und rückgefaltet, um das entsprechende Disulfidisomer zu ergeben, wie durch HPLC-Analyse beurteilt wurde (erfindungsgemäßes Beispiel 1 und Dubaquié und Lowman, supra). Diese Varianten wurden in Versuchen zur spezifischen Bindungsprotein-Protein-Bindung und Rezeptoraktivierung getestet.
IGFBP-1- und IGFBP-3-Bindungsaffinität
Die Bindungsaffinitäten dieser Varianten für IGFBP-1 und IGFBP-3 wurden mit derjenigen von Wildtyp-IGF-I unter Verwendung einer BIACORE^TM-Analyse verglichen. Kinetische Experimente mit IGFBP-3-Bindung an immobilisiertes IGF-I oder Varianten (Tabelle III) wurden, wie in Experiment 1 und in Dubaquié und Lowman, supra, beschrieben, durchgeführt und mit F49A-IGF-I und Wildtyp-IGF-I verglichen. Bei diesem Versuch war die Doppelmutante E3A/F49A in etwa 20-fach schwächer bezüglich der Bindungsaktivität für IGFBP-3 als der Wildtyp, und die Doppelmutante F16A/F49A war in etwa 66-fach schwächer (Tabelle III).
TABELLE III Kinetiken der IGFBP-3-Bindung an IGF-I (*Daten aus der Tabelle II von Beispiel 1)
Für Messungen der IGFBP-1-Bindung an IGF-I wurden Kinetikexperimente unter Verwendung einer Einzel-Cystein-IGF-I-Variante, Y31C, durchgeführt, die auf der Sensorchipoberfläche durch eine Disulfidbindung immobilisiert war (BIACORE^TM System Manual Supplement, 5a-I, Pharmacia (1991)). Die Ergebnisse (Tabelle IV) sind in Übereinstimmung mit den Bindungsaffinitäten, die unter Verwendung von durch nicht spezifische Aminkopplung an den Biosensorchip immobilisiertem Wildtyp-IGF-I erhalten wurden (Beispiel 1 und Dubaquié und Lowman, supra).
TABELLE IV Kinetiken der IGFBP-1-Bindung an IGF-I (*Daten aus der Tabelle II von Beispiel 1)
Die Bindung von F49A und E3A/F49A an IGFBP-1 war zu schwach für genaue Kinetikmessungen. Deshalb wurde ein kompetitiver Bindungsversuch (WO 98/45427, veröffentlicht am 15. Oktober 1998) durchgeführt, um die entsprechenden Affinitäten abzuschätzen. Die Einzel-Cystein-IGF-I-Variante Y31C wurde verwendet, die wie oben beschrieben auf einer BIACORE^TM-Biosensorchip-Oberfläche immobilisiert war. Kompetitive Bindungsexperimente, die halbmaximale inhibitorische Konzentrationswerte (IC₅₀) lieferten, wurden wie folgt durchgeführt: 50 nM IGFBP-1 wurde mit einer Verdünnungsreihe der gewünschten IGF-Variante inkubiert. Diese Proteingemisch-Lösungen wurden mit 5 μl/min über einem B1-Chip injiziert, der Cystein-gekoppeltes IGF-I-Y31C enthielt (200 Antworteinheiten). Die Menge an gebundenem IGFBP-1 wurde durch Abzug der nicht-spezifischen Bindung nach einer 20-minütigen Injektion ermittelt und gegen die Konzentration der IGF-Variante graphisch aufgetragen (7). Die Ergebnisse sind in der Tabelle V gezeigt.
TABELLE V Hemmung der IGFBP-1-Bindung an immobilisiertes Y31C IGF-I
Verglichen mit Wildtyp-IGF-I hatten F49A und E3A/F49A stark verringerte Bindungsaffinitäten für IGFBP-1. F49A band an IGFBP-1 mit einem IC₅₀ von 1,6 ± 0,2 μM (Tabelle V), während es eine hochaffine Dissoziationskonstante (K_D) von 6,3 ± 1,7 nM für IGFBP-3 (Tabelle III) bewahrte. Bezüglich der Bindung von E3A/F49A an IGFBP-1 wurde gefunden, dass sie sogar noch schwächer war, mit einem geschätzten IC₅₀ von 64 ± 9 μM (Tabelle V), während es eine nur geringfügig erniedrigte Affinität (K_D = 22,2 ± 10,3 nM) für IGFBP-3 hatte (Tabelle III). Diese In-Vitro-Messungen deuten darauf hin, dass keine der IGF-Varianten unter physiologischen Bedingungen eine stabile Verbindung mit IGFBP-1 eingehen sollte.
KIRA-Untersuchungen der IGF-Typ-I-Rezeptor-Aktivierung
Der Kinaserezeptor-Aktivierungsversuch (KIRA) untersucht spezifisch und quantitativ das Ausmaß der cytoplasmatischen IGF-Rezeptor-Phosphorylierung nach extxrazellulärer Stimulation durch einen Liganden (Sadick et al., J. Pharm. Biomed. Analysis, 19 (6): 883-891 (1998)). Verschiedene IGF-Varianten, GlS/A70V, T4A, V11A, F16A, F25A, F16A/F49A, R36A, P39A und F49A wurden in Einzelkonzentrations-Untersuchungen der Rezeptoraktivierung untersucht. Die IGFBP-1- und IGFBP-3-Bindungsaktivitäten dieser Varianten sind, mit Ausnahme von F16A/F49A, in der Tabelle II und in Dubaquié und Lowman, supra, angegeben. Die Tabelle VI fasst die relativen Affinitäten und Spezifitäten von BIACORE^TM-Messungen zusammen.
Für die KIRA-Versuche wurden die Variantenkonzentrationen anhand optischer Dichtemessungen grob auf 13 nM („Hochkonzentration") oder 1,3 nM („Niedrigkonzentration") geschätzt. Das für jede IGF-Variante erhaltene Signal wurde mit demjenigen einer Standard-Verdünnungsreihe von Wildtyp-IGF-I verglichen und als eine apparente IGF-I-Konzentration angegeben, die der in dem KIRA-Versuch (8A–8B) beobachteten Aktivität entspricht. Obwohl keine genauen relativen Stärken gemessen wurden, zeigen diese Ergebnisse, dass alle untersuchten Mutanten die Fähigkeit bewahren, den IGF-Typ-1-Rezeptor zu aktivieren.
TABELLE VI Relative IGFBP-1- und IGFBP-3-Affinitäten von IGF-I-Varianten. NDB, keine nachweisbare Bindung; ND, nicht bestimmt; (*Daten aus der Tabelle II von Beispiel 1)
Die Tabelle VI zeigt, dass F16A und F25A, zusätzlich zu F49A, beide eine erheblich verringerte Affinität für IGFBP-1, aber in geringerem Maße für IGFBP-3 aufweisen. Gemäß den KIRA-Versuchen (8) bewahren beide noch ihre biologische Aktivität.
Für die Bestimmung der relativen Wirksamkeit von F49A und E3A/F49A wurde deren Fähigkeit, den Typ-1-IGF-Rezeptor zu aktivieren, unter Verwendung von Verdünnungsreihen in KIRA-Versuchen untersucht. Wie in den 9A–9B gezeigt, weisen sowohl F49A als auch E3A/F49A IGF-Rezeptoraktivierungs-Kurven auf, die von Wildtyp-IGF-I nicht unterscheidbar sind. Die halbmaximalen effektiven Konzentrationen (EC₅₀) betrugen 20,0 ± 1,3 ng/ml für F49A, 19,8 ± 0,5 ng/ml für E3A/F49A und 18,9 ± 0,2 ng/ml und 19,8 ± 0,6 ng/ml für Wildtyp-IGF-I. Diese Ergebnisse weisen deutlich darauf hin, dass beide IGF-Mutanten voll biologisch aktiv sind.
Blut-Clearance und Nierenanreicherung von IGF-I-Varianten in Ratten
Die Anreicherung aktiver IGF-Moleküle in der Niere könnte möglicherweise günstig bei chronischem oder akutem Nierenversagen sein. Diese pathologischen Zustände sind durch abnorm hohe Spiegel von IGFBP-1 und IGFBP-2, verbunden mit einer Verringerung der IGF-I-Synthese, gekennzeichnet, die schließlich zum Zellkatabolismus führen (Tönshoff et al., supra, 1997).
Um vorläufige pharmakologische Eigenschaften von F49A- und E3A/F49A-IGF-I zu bestimmen, wurden beide Proteine radiomarkiert und Ratten intravenös verabreicht. Die 10A zeigt einen Zeitverlauf der Geschwindigkeit, mit der beide Moleküle aus dem Blut der Tiere entfernt werden. Wie aufgrund ihrer verringerten IGFBP-Affinitäten erwartet, wurden beide Varianten mit einer höheren Geschwindigkeit entfernt als menschliches Wildtyp-IGF-I. Interessanterweise wurde die Doppelmutante (E3A/F49A) schneller als die Einzelmutante (F49A) entfernt, was gut mit den jeweiligen Affinitäten für das Hauptbindungsprotein im Serum, IGFBP-3 (Tabelle III), korreliert. Die 10B zeigt das Gewebe-zu-Blut-Verhältnis für die IGF-Varianten in verschiedenen Organen. Die Mehrzahl der radioaktiv markierten IGF-Moleküle wurde in der Niere entdeckt, wogegen die Radioaktivitätsspiegel in der Leber, Milz, Herz und Bauchspeicheldrüse viel niedriger waren. Es ist offensichtlich, dass die Varianten F49A und E3A/F49A sich zu statistisch signifikant höheren Spiegeln in der Niere anreichern als Wildtyp-IGF-I.
Circulardichroismus-Analyse von IGF-I-Varianten
Die Circulardichroismus-Spektren von F49A- und E3A/F49A-IGF-I wurden analysiert, um zu untersuchen, ob die eingeführten Mutationen bedeutende Veränderungen der Proteinstruktur hervorrufen. Eine strukturelle Destabilisierung könnte zu einer erhöhten proteolytischen Empfindlichkeit führen, die eine alternative Erklärung für die schnelleren Blut-Clearance-Raten der IGF-Varianten liefern würde. Wie in 11 gezeigt, haben beide Mutanten jedoch praktisch identische Spektra wie dasjenige, das für Wildtyp-IGF-I aufgezeichnet wurde. Die CD-Spektra zeigen sowohl α-Helix- als auch Zufallsknäuel-Elemente, wie aufgrund der NMR-Spektroskopie von IGF-I erwartet wurde (Cooke et al., Biochemistry, 30: 5484, (1991)). Die thermische Stabilität von IGF-I konnte durch Circulardichroismus nicht exakt bestimmt werden, vermutlich aufgrund des relativ hohen Anteils (~ 30 %) von Zufallsknäuel (Jansson et al., Biochemistry, 36: 4108 (1997)), der bereits bei Raumtemperatur vorhanden war. Die Tatsache, dass die CD-Spektra beider Varianten keine signifikante Abweichung von Wildtyp-IGF-I zeigten, ist ein Hinweis, dass die eingeführten Mutationen die Gesamtstruktur von IGF-I nicht verändern.
Schlussfolgerung
Aufgrund der oben gezeigten Daten würde erwartet werden, dass die Einzel- und Doppelmutanten F16A-, F16G-, F16S-, F25A-, F25G-, F25S-, F49A-, F49G-, F49S-, E3A/F49A-, E3A/F49G-, E3G/F49A-, E3G/F49G-, E3A/F49S-, E3S/F49A-, E3S/F49S-, E3G/F49S- und E3S/F49G-IGF-I wirksam bei der Behandlung einer Funktionsstörung sein sollten, die durch Fehlregulation der GH/IGF-Achse gekennzeichnet ist, da die Alanin-substituierten Mutanten eine verringerte Affinität für IGFBP-1 ohne erheblichen Verlust der Fähigkeit an IGFBP-3 zu binden, aufweisen und aufgrund vieler Tests biologisch aktiv sind. Außerdem wird erwartet, dass solche Mutanten wirksam bei der Behandlung von Nierenerkrankungen sind, da F49A und E3A/F49A sich zu statistisch signifikant höheren Spiegeln in der Niere anreichern als Wildtyp-IGF-I und im Vergleich zu anderen Organen und da die Alanin-substituierten Mutanten nur schwach an IGFBP-1 binden und bei experimenteller Urämie eine erhöhte IGFBP-1- und IGFBP-2-Genexpression vorliegt (Tönshoff et al., supra, 1997).
BEISPIEL 3
Behandlung von Menschen
Dieses Beispiel zeigt das Prinzip, wie ein exogen verabreichtes Peptid, das an ein oder mehrere der IGFBPs bindet, endogene IGFs verdrängt und wie ein erfindungsgemäßes Peptid zur Verwendung in Menschen dosiert werden kann.
In dieser Studie wurde menschlichen Typ-II-Diabetikern rekombinantes menschliches IGF-I oder ein Placebo durch zweimal tägliche Injektion bei vier Dosierungen (10, 20, 40 oder 80 μg/kg) für 12 Wochen verabreicht. Blutproben wurden vor, alle zwei Wochen während und nach (EP) den 12 Wochen der Behandlung entnommen. Die Konzentrationen von IGF-I, IGF-II und IGFBP-3 wurden in allen Proben gemessen, mit der Ausnahme von IGF-II, das in den Proben nicht gemessen wurde, die von Patienten stammen, die mit 10 μg/Tag von IGF-I behandelt wurden.
Die 43 von WO 98/45427 zeigt die Konzentrationen von IGF-I im Blut der Patienten. Die unerwartete Beobachtung war der „Plateau"-Effekt der Verabreichung von 40 und 80 μg von IGF-I; mit diesen beiden Dosen wurde dieselbe Gesamtkonzentration von IGF-I im Blut erreicht.
Die 44 von WO 98/45427 zeigt die Konzentrationen von IGF-II im Blut der Patienten. Im Unterschied zu den ansteigenden Spiegeln von IGF-I fielen die Spiegel von IGF-II in einem nahezu spiegelbildlichen Muster zu dem Anstieg der IGF-I-Konzentrationen. Wie bei dem Plateau der ansteigenden IGF-I-Konzentrationen erreichten auch die fallenden IGF-II-Konzentrationen ein Plateau.
Die 45 von WO 98/45427 zeigt die Konzentrationen von IGFBP-3 im Blut der Patienten. Im Gegensatz zu den eindeutigen Veränderungen der Muster von IGF-I und IGF-II im Blut zeigten die Konzentrationen von IGFBP-3 kein statistisch signifikantes oder klares Veränderungsmuster.
Eine Prüfung der 43 und 44 von WO 98/45427 zeigt, dass die Gesamt-IGF-Konzentrationen (IGF-I und IGF-II) geringe Veränderungen während der Behandlung zeigten. Der Grund war, dass der Anstieg der IGF-I-Konzentrationen dem Abfall der IGF-II-Konzentrationen nahe angenähert war. Die Prüfung aller drei Figuren zeigt, dass die Dosis-abhängigen Veränderungen der Konzentrationen von IGF-I und IGF-II im Blut der Patienten nicht von einer verringerten IGFBP-3-Bindungsprotein-Kapazität begleitet waren (IGFBP-3 ist das Hauptbindungsprotein im Blut).
Die offensichtliche Erklärung für den Abfall der Konzentration von IGF-II und die Plateaus der IGF-I- und IGF-II-Konzentrationen ist, dass die IGF-Bindungsprotein-Kapazität eine begrenzte Größe hat und die in diesem Experiment verwendeten IGF-I-Dosen eine dosisabhängige Verdrängung von IGF-II von den Bindungsproteinen verursachte.
Es ist eine logische Erweiterung der Beobachtungen dieses Beispiels, zu erwarten, dass ein beliebiges Molekül mit der Fähigkeit, Spiegel von aktivem IGF zu erhöhen, ähnliche Aktivitäten zeigen sollte wie die in diesem Beispiel für IGF-I gezeigten. Außerdem kann, ausgehend von den verwendeten IGF-I-Dosen und den gezeigten IGFBP- und IGF-I- und IGF-II-Konzentrationen, in einfacher Weise berechnet werden, wie viel eines Peptids gegeben werden sollte, um die Spiegel von aktivem endogenem IGF zu erhöhen. Die molare Größe im Vergleich zu IGF-I, die Affinität des Peptids für das IGFBP und seine Bioverfügbarkeit sollten andere Variable sein, die beachtet werden, um Dosen zu finden, die das aktive IGF bei einem Menschen erhöhen.
Die vorliegende Erfindung wurde hierin notwendigerweise unter Bezug auf bestimmte spezifische Verfahren und Materialien beschrieben. Es soll verstanden werden, dass die Erörterung dieser spezifischen Verfahren und Materialien in keiner Weise irgendeine Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung darstellt, die sich auf eine beliebige und sämtliche alternativen Materialien und Verfahren erstreckt, die zur Erreichung der Ziele der vorliegenden Erfindung geeignet sind.

Claims

IGF-I-Variante, worin der Aminosäurerest an Position 49 der nativen Sequenz des humanen IGF-I durch einen Alanin- oder einen Glycinrest ersetzt ist.
Variante nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest an Position 49 der nativen Sequenz des humanen IGF-I durch einen Alaninrest ersetzt ist.
Zusammensetzung, umfassend die Variante nach einem beliebigen der Ansprüche 1 oder 2 in einem Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, weiter umfassend ein Nieren-aktives Molekül.
Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder 4, worin der Träger steril ist.
Verwendung der Variante nach einem beliebigen der Ansprüche 1 oder 2 oder der Zusammensetzung nach einem beliebigen der Ansprüche 3 bis 5 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Funktionsstörung, die durch Fehlregulation der GH/IGF-Achse in einem Säuger gekennzeichnet ist, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge der Variante an den Säuger.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Funktionsstörung eine hyperglykämische Funktionsstörung, eine Nierenfunktionsstörung, Stauungsinsuffizienz (congestive heart failure), Leberversagen, Unterernährung, ein Wasting-Syndrom oder ein katabolischer Zustand ist, bei dem die IGFBP-1-Spiegel im Vergleich zu solchen Spiegeln in einem Säuger ohne diese Funktionsstörung erhöht sind.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Funktionsstörung eine Nierenfunktionsstörung ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Nierenfunktionsstörung chronisches oder akutes Nierenversagen ist.
Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüche 7 bis 9, wobei dem Säuger außerdem eine wirksame Menge eines Nieren-aktiven Moleküls verabreicht werden soll.
Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüche 6 bis 10, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Kit, umfassend einen Behälter, enthaltend eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die Variante der Ansprüche 1 oder 2 und Anweisungen, die den Anwender anleiten, die Zusammensetzung für die Behandlung einer Funktionsstörung zu verwenden, die durch Fehlregulation der GH/IGF-Achse in einem Säuger gekennzeichnet ist.
Kit nach Anspruch 12, wobei die Funktionsstörung eine hyperglykämische Funktionsstörung, eine Nierenfunktionsstörung, Stauungsinsuffizienz (congestive heart failure), Leberversagen, Unterernährung, ein Wasting-Syndrom oder ein katabolischer Zustand ist, wobei die IGFBP-1-Spiegel im Vergleich zu solchen Spiegeln in einem Säuger ohne diese Funktionsstörung erhöht sind.
Kit nach Anspruch 13, wobei die Funktionsstörung eine Nierenfunktionsstörung ist.
Kit nach Anspruch 14, wobei die Funktionsstörung chronisches oder akutes Nierenversagen ist.
Kit nach einem beliebigen der Ansprüche 12 bis 15, weiter umfassend einen Behälter, der ein Nieren-aktives Molekül enthält.
Kit nach einem beliebigen der Ansprüche 12 bis 16, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Funktionsstörung, die durch Fehlregulation der GH/IGF-Achse in einem Säuger gekennzeichnet ist, wobei das Verfahren durch die Verwendung einer, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 oder 2 definierten, IGF-I-Variante als essenzieller Bestandteil des Medikaments gekennzeichnet ist.