DE3789559T2

DE3789559T2 - Menschlicher präproinsulinähnlicher Wachstumsfaktor I.

Info

Publication number: DE3789559T2
Application number: DE3789559T
Authority: DE
Inventors: Gwen Grabowski Krivi; Peter Scott Rotwein
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 1986-01-07
Filing date: 1987-01-06
Publication date: 1994-10-13
Anticipated expiration: 2007-01-07
Also published as: AR246765A1; DK4387D0; NZ218811A; US4963665A; DK4387A; JPH0819158B2; KR920005918B1; IL81175A; EP0229750A2; EP0229750A3; CA1340455C; AU6715187A; JPS62228285A; IL81175A0; DE3789559D1; ES2062993T3; KR880006362A; AU588072B2; EP0229750B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neues, Insulinartiges Wachstumsfaktor-Vorläuferprotein und neue Human- Präproinsulin-artige Wachstumsfaktor-I-Gene und -DNA-Sequenzen.

Hintergrund der Erfindung

Insulin-artige Wachstumsfaktoren (IGFs) wurden aus verschiedenen Tier-Spezies isoliert, und man nimmt an, daß sie aktive wachstumsfördernde Moleküle sind, die die anabolen Wirkungen solcher Hormone, wie die des Wachstumshormons und des placentaren Lactogens, vermitteln. Als solche sollten sich die IGFs zur Behandlung und/oder Potenzierung verschiedener Wachstumszustände und/oder der Wundheilung eignen.
Die Bezeichnung "Insulin-artige Wachstumsfaktoren" wurde ausgewählt, um die Insulin-artigen Wirkungen und die Insulinartige Struktur dieser Peptide auszudrücken. Die IGFs weisen eine fast 50% Aminosäurehomologie mit Insulin auf und ähneln in der dreidimensionalen Struktur dem Proinsulin. Weiters sind in der dreidimensionalen Darstellung die Strukturen der IGFs dem Proinsulin ähnlich, indem sie Einzelkettenpeptide sind, die durch drei Disulfidbrücken vernetzt sind und aus einem B-kettenartigen Aminoendteil (B-Domäne), einem Verbindungspeptid (C-Domäne) und einem A-kettenartigen Teil (A-Domäne) bestehen. Zusätzlich ist eine Carboxy-terminale Verlängerung vorhanden (D-Domäne), die man beim Proinsulin nicht findet. In jüngsten Untersuchungen wird auch vom Vorhandensein noch einer weiteren Carboxy-terminalen Verlängerung berichtet, die man bei Proinsulin nicht findet, und die als E-Domäne bezeichnet wurde. Das E-Domänen-Peptid wurde bisher in Verbindung mit Ratten- und Human-IGF-II identifiziert. Hylka et al. (1985) und Zumstein et al. (1985).
Bisher wurden mehrere Klassen von IGFs identifiziert. Diese umfassen IGF-I (Somatomedin C), IGF-II, Somatomedin A, und eine Mischung von Peptiden, genannt vermehrungsstimulierende Aktivität (multiplication-stimulating activity, MSA). Diese heterologe Gruppe von Peptiden zeigt in vitro - Daughaday (1977); Clemmons und Van Wyk (1981a) - und in vivo - van Buul-Offers und Van den Brande (1980), Schoenle et al. (1982) - wichtige wachstumsfördernde Wirkungen.
Es wurden zwei IGFs beim Menschen charakterisiert. Diese sind IGF-I, umfassend ein basisches Protein mit 70 Aminosäuren, Rinderknecht und Humbel (1978a), Rubin et al. (1982), und IGF-II, umfassend ein neutrales Peptid mit 67 Aminosäuren, Rinderknecht und Humbel (1978b); Marquardt und Todaro (1981). Während die vollständigen Aminosäuresequenzen nur für Ratten- und Human-IGF-I und IGF-II bestimmt worden sind, Humbel, R. E. (1984), wurde mittels Radioimmunoassay und/oder Readiorezeptorassay gezeigt, daß ein hoher Grad an Homologie und/oder Kreuz-Reaktivität unter den IGF-I und unter den IGF-II von verschiedenen Spezies besteht. Wilson und Hintz (1982).
Die zirkulierenden Mengen dieser Peptide scheinen in einem größeren oder geringeren Ausmaß der Steuerung des Wachstumshormons zu unterliegen, wobei IGF-I in höherem Ausmaß gesteuert wird als IGF-II. IGF-I spielt beispielsweise eine grundlegende Rolle beim postnatalen Wachstum der Säuger als Hauptvermittler der Wachstumshormonwirkung. Vgl. Copeland et al. (1980) und Schoenle et al. (1982).
Vassilopoulou-Sellin und Phillips (1982) kamen unter Verwendung von Molekularsieb-Chromatographie zu der Annahme, daß die IGF-I-Aktivität, die sowohl in vitro als auch in vivo untersucht wurde, aus der Leber der Ratte extrahiert ein höheres Molekulargewicht (etwa 30 Kilodalton) als die aus Plasma extrahierte Aktivität hat (etwa 8 Kilodalton). Die Autoren vermuteten, daß das Material mit dem höheren Molekulargewicht einen IGF-I-Vorläufer darstellen kann. Die Autoren zeigten auch, daß die Stoffwechselregulierung des IGF-I der Rattenleber mit dem höheren Molekulargewicht ähnlich dem IFG-I, das aus Rattenserum stammte, war. In jüngster Zeit isolierten Zumstein et al. (1985) eine unterschiedliche Pro-Form des IGF-II aus Humanserum, von welchem sie zeigten, daß es in vitro IGF-II-artige Aktivität enthielt.
Wegen der potentiellen Bioaktivität und Nützlichkeit von Vorläufer-IGF-I-Proteinen mit hohem Molekulargewicht bei der Behandlung und/oder der Potenzierung verschiedener Wachstumszustände wurde die Aminosäuresequenz und DNA-Kodiersequenz eines solchen Vorläufer-Proteins seit langem gesucht.
Jansen et al. (1983) stellte eine von einem Human-IGF-I-cDNA- Klon stammende Aminosäuresequenz bereit, was die Vermutung eines größeren IGF-I-Vorläufers unterstützt. Vgl. auch Niederländische Patentanmeldung Nr. 8302324, veröffentlicht am 16. Jänner 1985.
Die von Jansen geoffenbarte cDNA bot jedoch keine ausreichende DNA-Sequenz-Information, um den genauen Translationsbeginn des vermuteten Vorläufer-Proteins zu lehren. Außerdem erbringen Jansen et al. (1983) und die Niederländische Patentanmeldung Nr. 8302324 keinen Beweis oder keine Lehre dafür, daß die cDNA-Sequenz exprimiert wird oder werden kann (beispielsweise, daß das vermutete Vorläufer-protein produziert wird).
Tatsächlich ist sehr wenig über die Biosynthese von IGF-I bekannt. Vorläufige Studien deuten an, daß pro haploidem Genom nur ein Human-IGF-I-Gen existiert. Ullrich et al. (1984); Brissenden et al. (1984); und Tricoli et al. (1984). Untersuchungen der Biosynthese von IGF-I wurden durch einen sehr geringen IGF-I- Gehalt im Gewebe erschwert, Vassilopoulou-Sellin und Phillips (1982), und weil im Gegensatz zu IGF-II keine gezüchteten Zellinien identifiziert wurden, die signifikante Mengen dieses Peptids herstellen. Clemmons und Van Wyk (1981b); Clemmons und Shaw (1983). Weiters wurde weder das vollständige Human-IGF-I-Gen isoliert, noch die vollständige DNA-Sequenz bestimmt. Voruntersuchungen von Bell et al. (1985) deuten darauf hin, daß das Human- IGF-I-Gen mindestens 35 Kilobasen (kb) lang ist, wovon nur 210 Basenpaare (bp) für reifes Human-IGF-I kodieren. Die Untersuchungen von Bell et al. (1985) deuten auch darauf hin, daß das Human- IGF-I-Gen nur vier Exons enthält, die gemeinsam für ein einziges Vorläufer-IGF-I-Protein kodieren. Die große Größe (z. B. mehr als 35 kb) und Komplexität dieses Gens in bezug auf die für reifes IGF-I kodierenden Sequenzen haben sowohl die Isolierung als auch die Identifizierung der vollständigen genomischen DNA-Sequenzen besonders erschwert. Die Isolierung eines genomischen IGF-I-Klons (z. B. IGF-I-Gens) würde die Untersuchungen der IGF-I-Biosynthese sehr erleichtern und ein Mittel zur Identifizierung und Erzeugung von Vorläufer-, reifen und/oder intermediären IGF-I-Spezies und allelen Varianten derselben schaffen. Ein genomischer Klon macht es somit leichter, festzustellen, welche Proteine man für aktive wachstumsfördernde Peptide hält.
Dementsprechend ist es ein Ziel dieser Erfindung, ein hochreines Gen und/oder synthetische DNA-Sequenzen zu schaffen, die für ein IGF-I-Vorläuferprotein (Präproinsulin-artiger Wachstumsfaktor I) und/oder Peptidfragmente davon kodieren und zur Herstellung eines solchen Proteins und/oder solcher Fragmente geeignet sind.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, Verfahren zur Verfügung zu stellen, bei welchen eine solche DNA zur Herstellung solcher Proteine und Peptide genutzt wird.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung der Aminosäuresequenz eines neuen Präproinsulin-artigen Wachstumsfaktor-I und von Verfahren, bei welchen ein solches Protein oder Fragmente davon zur Förderung eines erwünschten Wachstums oder einer Funktionalität von Zellen bei Tieren verwendet wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung eines neuen Präproinsulin-artigen Wachstumsfaktor-I-(ppIGF-I)-Proteins, ein im wesentlichen reines Human-IGF-I-Gen und synthetische DNA-Sequenzen, die für das neue ppIGF-I-Protein kodieren.
Gemäß einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein im wesentlichen reines IGF-I-Gen vor, das für mindestens zwei ppIGF-I-Proteine kodiert und die Nucleotidsequenz (oder ihre funktionellen Äquivalente zur Proteinexpression) wie in Fig. 4 angeführt enthält.
Gemäß einer anderen Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung synthetische DNA-Sequenzen vor, die für ein neues ppIGF- I-Protein kodieren. Eine solche synthetische DNA-Sequenz enthält die Nucleotidsequenz (oder ihre funktionellen Äquivalente zur Proteinexpression) wie in Fig. 2 angeführt.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung eine im wesentlichen reine DNA-Sequenz vor, die für eine Carboxy-terminale Verlängerung des neuen ppIGF-I-Proteins kodiert. Eine solche im wesentlichen reine DNA-Sequenz enthält die folgende Nucleotidsequenz (oder ihre funktionellen Äquivalente zur Peptidexpression):
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform sieht die Erfindung ein neues ppIGF-I-Protein mit der Aminosäuresequenz, wie in Fig. 6 angeführt, vor.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein neues Verlängerungspeptid vor, das die folgende Aminosäuresequenz hat:
NH&sub2;-Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys Giy Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys Lys Gly Lys-COOH.
Dieses Verlängerungspeptid stellt einen Carboxy-terminalen Verlängerungsteil des neuen ppIGF-I-Proteins dar.
Gemäß anderen Ausführungsformen sieht die Erfindung verschiedene Verfahren zur Förderung von Wachstum und/oder anderer wünschenswerter Funktionen von Zellen bei Tieren durch Verabreichung der neuen Proteine und/oder Peptide dieser Erfindung an Tiere in Mengen, die zum Hervorrufen solcher Wirkungen ausreichen, vor.
Gemäß anderen Ausführungsformen sieht die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der im wesentlichen reinen Proteine dieser Erfindung durch Bewirkung der Expression des hierin vorgesehenen Gens und/oder der hierin vorgesehen synthetischen DNA-Sequenzen vor.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In den folgenden schematischen Darstellungen sind Aminosäuresequenzen angegeben, die sich vom Amino-Terminus (NH&sub2;) zum Carboxy-Terminus (COOH) der Sequenz lesen. Die DNA-Sequenzen sind in einer 5' zu 3'-Orientierung vorgesehen. Relevante Restriktions- Endonucleasestellen sind ebenfalls gezeigt. Die wie nachfolgend beschrieben markierten DNA-Bereiche dienen nur der schematischen Darstellung und sind, soferne nicht anders angeführt, nicht maßstabgetreu. Die Nummerierung der DNA-Sequenzen von 5' zu 3' und der Aminosäuresequenzen vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus dient nur zum Zwecke der schematischen Darstellung.
Fig. 1 zeigt eine Karte eines Human-IGF-1B-cDNA-KlonS. Die horizontalen Richtungspfeile zeigen, wie man an die DNA- Sequenzierung der cDNA herangeht: das offene Kästchen bedeutet den 585-Basen-offenen Leserahmen, wobei das schraffierte Kästchen die DNA-Sequenz bedeutet, die für das reife Human-IGF-I-Peptid kodiert; die dünnen Linien bedeuten die 5'- und 3'-nicht-translatierten Bereiche der 1136- Nucleotid-cDNA. Unter der Karte der Human-IGF-1B-cDNA sind repräsentative cDNA-Klone mit der Bezeichnung λIGF-2 und λIGF-5. Das "A&sub4;&sub2;" am λIGF-5-Klon bedeutet eine Poly-A- Kodiersequenz bestehend aus 42 Adenosin- (A)-Basen.
Fig. 2 zeigt die DNA-Sequenz des IGF-1B-cDNA-Klons (1136 Nucleotide) und eine Translation des 585-Basen-offenen Leserahmens beginnend am Nucleotid 183 (z. B. ppIGF-1B Aminosäuresequenz). Terminator-Codons sind mit ### und *** bezeichnet. Der strichliert unterstrichene Bereich bezeichnet die Nucleotide, die für das reife Human-IGF-I-Peptid (Nucleotid 327 bis Nucleotid 536) und die zugehörige Aminosäuresequenz von reifem Human-IGF-I kodieren. Der durchgehend unterstrichene Bereich bezeichnet die Nucleotide, die für das IGF-1B-Carboxy-terminale Verlängerungs-Peptid und die zugehörige Aminosäuresequenz dieses Verlängerungs-Peptids kodieren.
Fig. 3(a) zeigt die Struktur- und Restriktionskarte des Human- IGF-I-Gens. Der 5' zu 3'-Richtungspfeil bedeutet die 5' zu 3'-Orientierung des IGF-I-Gens. Die dünnen Linien bedeuten Introns und angrenzende Bereiche; das bedeutet einen Bereich eines Introns, das nicht durch molekulares Klonieren isoliert ist; die ausgefüllten Kästchen (1, 2, 3, 4, 5) bedeuten Kodierbereiche, und die schraffierten Kästchen bedeuten nicht-kodierende Bereiche; die vertikalen Pfeile unter den Exons 4 und 5 bedeuten die Polyadenylierungsstellen. Die mit "Alu" markierten Bereiche bedeuten eine Hybridisierung zu mittel-repetitiver DNA vom Alu-Typ. Restriktionsstellen sind mit "B" = BamHI, "E" = EcoRI, "H" = HindIII bezeichnet. Unter der Restriktionskarte sind repräsentative genomische Klone gezeigt.
(b) zeigt detaillierte Restriktionskarten der IGF-I-Exons 1 bis 5. Die horizontalen Richtungspfeile bedeuten die DNA- Sequenzierungsstrategie; die Kästchen bedeuten Exons, wobei die ausgefüllten Bereiche Kodierbereiche bedeuten und die schraffierten Bereiche nicht-kodierende Bereiche bedeuten. Die vertikalen Pfeile unter den Exons 4 und 5 bedeuten die Polyadenylierungsstellen.
Fig. 4 zeigt die DNA-Sequenz des Human-IGF-I-Gens. Exons sind oben und Introns und angrenzende DNA sind unten gezeigt. Die Translation der ppIGF-I-Proteine (z. B. Aminosäuresequenz von ppIGF-1A und ppIGF-1B) sind angedeutet, und die Carboxyterminalen Verlängerungen des pIGF-1A und pIGF-1B sind durch voll ausgezogene Oberlinien mit der Bezeichnung 1A bzw. 1B angegeben. Die 70 Aminosäuren des reifen IGF-I sind strichliert unterstrichen. Die "in-frame" Translations-Terminationscodons TGA und TAA, die dem Translationsinitiierungs- Startsignalcodon ATG vorhergehen, sind mit *** bezeichnet. Eine mutmaßliche Transkriptionsstartstelle ist mit bezeichnet. Die Polyadenylierungssignale AATAAA und AATATA sind durch eine voll ausgezogene Oberlinie bezeichnet, und es folgen ihnen Poly-A-Additionsstellen, die mit "poly A " bezeichnet sind, in den Exans 4 bzw. 5. Die punktierte Linie bezeichnet nicht-sequenzierte Bereiche, deren Längen in kb (Kilobasen) darauf angegeben sind.
Fig. 5 zeigt einen Vergleich von IGF-1A- und IGF-1B-cDNA- Sequenzen. Die obere Linie bedeutet IGF-1B. Die untere Linie bedeutet IGF-1A. Die terminalen (5' und 3') Nucleotide sind mit einem "X" bezeichnet.
Fig. 6 zeigt die Aminosäuresequenz des ppIGF-1B-Proteins.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Wie hierin verwendet, sind die Symbole, die Aminosäuren (z. B. Ala für Alanin) und Nucleotide (G, C, A, T) repräsentieren, die herkömmlich verwendeten Symbole. Vgl. Lehninger (1976).
Wie hierin verwendet, bedeutet "Gen" einen Bereich chromosomaler DNA, welcher Bereich DNA-Sequenzen enthält, die für ein gegebenes Protein kodieren. Typischerweise enthalten eukaryontische Gene sowohl Introns als auch Exons. Der Ausdruck "Exon" bezieht sich auf jene Gen- (z. B. DNA-)-Sequenzen, die in RNA transkribiert werden. Ein bestimmtes Exon kann daher sowohl für Protein kodierende als auch nicht-kodierende DNA-Sequenzen aufweisen, wobei sowohl die kodierenden als auch die nicht-kodierenden DNA-Sequenzen in RNA transkribiert werden, doch werden nur die Kodiersequenzen in Protein translatiert. Der Ausdruck "Intron" bedeutet eine DNA-Sequenz, die in einem bestimmten Gen vorhanden ist, die weder transkribiert noch translatiert wird und im allgemeinen zwischen Exons vorhanden ist (daher der Name "intron").
Der Ausdruck "im wesentlichen rein" bedeutet, wenn er hierin zur Beschreibung eines Proteins, Peptids, einer Nucleinsäure- (DNA- oder RNA-)-Sequenz, eines Gens und/oder Moleküls verwendet wird, im wesentlichen frei von Proteinen, Peptiden, Nucleinsäuresequenzen, Genen und/oder Molekülen, mit welchen das beschriebene Protein, Peptid, die Nucleinsäuresequenz, das Gen und/oder das Molekül in seinem natürlichen Zustand (z. B. in vivo) verbunden ist.
Der Ausdruck "synthetisch" bedeutet, wenn er hier zur Beschreibung eines Proteins oder eines Peptids verwendet wird, ein Protein oder Peptid, das mittels einer anderen Technik (z. B. chemischen oder enzymatischen Synthese oder rekombinanten DNA- Expression) als seiner natürlichen Erzeugung in einem Tier hergestellt worden ist. Somit sind "synthetische Proteine oder Peptide", wie sie hergestellt sind, typischerweise im wesentlichen rein (z. B. frei von Proteinen oder Peptiden natürlichen Ursprungs). In ähnlicher Weise bedeutet der Ausdruck "synthetisch" unter Bezugnahme auf DNA-Sequenzen oder Moleküle, daß solche DNA-Sequenzen oder Moleküle mittels irgendeiner anderen Technik als ihrer natürlichen Replikation in vivo hergestellt worden sind. So kann unter Verwendung der hierin beschriebenen Nucleotidsequenzen jegliche DNA-Sequenz dieser Erfindung mittels verschiedener, den Fachleuten bekannter "synthetischer" Techniken, wie automatisierter DNA-Synthetisierausrüstung, anderer chemischer Synthesemethoden, enzymatischer Isolierung, cDNA-Synthese oder Klonierungstechniken hergestellt werden, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Der Ausdruck "Carboxy-terminales Verlängerungspeptid" oder alternativ "Verlängerungspeptid", wie hierin verwendet, bedeutet ein Peptid, das in den DNA-Sequenzen nach (3') der reifen, für IGF-I kodierenden DNA-Sequenz kodiert ist. Ein Verlängerungspeptid der vorliegenden Erfindung hat beispielsweise die folgende Aminosäuresequenz:
NH&sub2;-Arg-Ser-Val-Arg-Ala-Gln-Arg-His-Thr-Asp-Met Pro-Lys-Thr-Gln-Lys-Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-ASn Lys-Asn-Thr-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Lys-Gly-Trp-Pro Lys-Thr-His-Pro-Gly-Gly-Glu-Gln-Lys-Glu-Gly-Thr Glu-Ala-Ser-Leu-Gln-Ile-Arg-Gly-Lys-Lys-Lys-Glu Gln-Arg-Arg-Glu-Ile-Gly-Ser-Arg-Asn-Ala-Glu-Cys Arg-Gly-Lys-Lys-Gly-Lys-COOH.
Ein zweites Verlängerungspeptid besteht aus den in der obigen Sequenz unterstrichenen Aminosäuren. Dieses zweite Verlängerungspeptid ist im neuen IGF-I Exon 4 der vorliegenden Erfindung kodiert. Man nimmt an, daß diese Verlängerungspeptide eine verbesserte biologische Aktivität besitzen und/oder den im IGF-I- Gen kodierten Proteinen verleihen.
Für die Fachwelt ist es auch verständlich, daß Hinweise auf Proteine dieser Erfindung durch ihre jeweiligen Aminosäuresequenzen verschiedene Aminosäure-Substitutionen, -Zusätze und/oder -Deletionen umfassen, solange die Aktivität des Proteins im wesentlichen aufrecht erhalten bleibt. Auf ähnliche Weise sind die im wesentlichen reinen und synthetischen DNA-Sequenzen und Gene, die von der vorliegenden Erfindung genannt werden, so zu verstehen, daß sie verschiedene Nucleotidsequenzvariationen, wie Nucleotid-Deletionen, -Substitutionen, -Inversionen, -Additionen, alle Variationen und/oder funktionelle Äquivalente zur Expression von darin kodiertem(n) Protein(en) umfassen, so lange die Aktivität des (der) darin kodierten Proteins (Proteine) im wesentlichen aufrecht erhalten bleibt. Solche Aminosäure- und Nucleotidsequenz- Variationen sind den Fachleuten wohl bekannt und können mittels solcher herkömmlicher Techniken wie chemischer de novo Synthese, enzymatischen Manipulationen und rekombinanten DNA-Techniken geschaffen werden. Man erwartet beispielsweise, daß Änderungen der spezifischen DNA-Sequenzen und/oder Gene der vorliegenden Erfindung mittels bekannter Degenerationen des genetischen Codes durchgeführt werden können, um der Codon- und/oder Expressions- Vorliebe spezifischer Wirtszellen oder Organismen, die zur Synthetisierung von Protein(en) der vorliegenden Erfindung verwendet werden, zu entsprechen.

DNA der Erfindung

Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde eine neue, IGF-I-spezifische cDNA, hierin als IGF-1B-cDNA bezeichnet, identifiziert und isoliert. Die Nucleotidsequenz dieser IGF- 1B-cDNA wurde als solche bestimmt, wie in Fig. 2 gezeigt. Eine weitere DNA-Sequenzanalyse der IGF-1B-cDNA zeigte einen 585- Nucleotid-offenen Leserahmen (Nucleotide 183 bis 767, Fig. 2), welcher für ein neues, 195 Aminosäuren-Präproinsulin-artiges Wachstumsfaktor-I-Protein kodiert, das hierin als ppIGF-1B bezeichnet ist. Die Aminosäuresequenz des neuen ppIGF-1B ist so, wie in Fig. 6 gezeigt. Wie nachfolgend genauer beschrieben und in Fig. 5 dargestellt, zeigte ein Vergleich zwischen der IGF-1B-cDNA und der ppIGF-I-cDNA, von Jansen et al. (1983) veröffentlicht, daß die IGF-1B-cDNA eine neue und eigene synthetische DNA-Sequenz ist, die für ein neues und eigenes ppIGF-I-Protein (z. B. ppIGF-1B) kodiert. Während man feststellte, daß die ersten 402 Nucleotide der IGF-1B-cDNA-Sequenz im wesentlichen homolog zur Sequenz von Jansen et al. (1983) war, divergiert die Nucleotidsequenz danach in typischer Weise. Die Jansen et al. (1983)- und IGF-1B-cDNAs führen somit zu (beispielsweise kodieren für) zwei verschiedene und eigene ppIGF-I-Proteine, die sich sowohl hinsichtlich der Größe (195 Aminosäuren für IGF-1B gegenüber 153 Aminosäuren) als auch hinsichtlich der Carboxy-terminalen Verlängerungspeptidzusammensetzung, deren Bedeutung nachstehend genauer besprochen wird, unterscheiden.
Die neue IGF-1B-cDNA erwies sich als zur Herstellung von ppIGF-1B in vitro geeignet, und man erwartet von ihr, daß sie eine synthetische DNA-Sequenz ermöglicht, die zur Herstellung von ppIGF-1B oder irgendeines Teils davon in geeigneten Wirtszellen (z. B. Bakterien-, Hefe-, Säuger- oder Pflanzenwirtszellen) mittels herkömmlicher rekombinanter DNA-Techniken und Gentechnik geeignet ist. Man nimmt auch an, daß bei ausgewählten Zellen von Säugern die synthetische IGF-1B-DNA-Sequenz zur Herstellung von reifem IGF-I geeignet sein kann, und zwar als Ergebnis einer zellulären oder Postproduktions-Verarbeitung des ppIGF-1B zu reifem IGF-I.
Nachdem nun die DNA-Sequenz der IGF-1B-cDNA vorgesehen worden ist (vgl. Fig. 2), können synthetische DNA-Moleküle, die diese Sequenz umfassen, mit herkömmlichen Mitteln, wie automatisierter DNA-Synthese, geschaffen werden.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde die IGF-1B-cDNA aus einer cDNA-Bibliothek isoliert, welche aus RNA (mRNA) konstruiert worden war. Die cDNA- Bibliothek wurde konstruiert und auf IGF-I-cDNA-enthaltende Klone gescreent gemäß den von Kwok et al. (1985) und Gubler und Hoffman (1983) beschriebenen Verfahren. Obwohl man annimmt, daß die Leber der Hauptsitz der IGF-Produktion ist, glaubt man, daß viele andere Gewebe, beispielsweise fötales Gewebe und Fibroblasten, ebenfalls IGF synthetisieren. Somit können solche anderen Gewebe alternativ zur Konstruktion einer Human-cDNA-Bibliothek verwendet werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde eine einer reifen IGF-I-Kodiersequenz entsprechende Oligonucleotidsonde verwendet, um die Human-cDNA-Bibliothek auf die Gegenwart von spezifische cDNA-Sequenzen enthaltenden Klonen zu screenen. Insbesondere umfaßte die Sonde ein 42-Nucleotid molekül (42 Mer), entsprechend der DNA-Sequenz, die für die Aminosäuren 10 bis 23 (vgl. Aminosäuren 58-70 in Fig. 6) von reifem Human IGF-I kodiert. Eine solche Sonde kann zur Isolierung genomischer cDNA und/oder RNA-Sequenzen, die für das ganze oder für einen Teil des reifen IGF-I kodieren, verwendet werden. Jeder andere Bereich der reifen IGF-I-DNA-Kodiersequenz kann alternativ verwendet werden. Zusätzlich kann die Länge (z. B. die Anzahl von Nucleotiden) einer solchen Oligonucleotidsonde, je nachdem, wie zwingend die verwendeten Hybridisierungsbedingungen sind, variieren. Typischerweise sollte eine solche Oligonucleotidsonde aus mindestens 13 oder 14 Nucleotiden bestehen, die zu der (den) DNA- oder RNA-Sequenz(en), die identifiziert werden soll(en), homolog sind.
Das Screenen einer cDNA-Bibliothek mit einer Sonde, die auf reifen IGF-I gerichtet ist, ermöglicht die Identifizierung von potentiell allen IGF-I-Messenger-RNAS (mRNA), die aktiv im Gewebe, aus welchem die cDNA-Bibliothek konstruiert wurde, exprimiert sind.
Die Translation solcher mRNAs kann reifen IGF-I, IGF-I-Vorläufer, die zumindest einen Teil des reifen IGF-I-Proteins enthalten, und jegliche andere Proteine, die mindestens einen Teil des reifen IGF-I-Proteins auf mRNA-Niveau der Biosynthese dieser Proteine enthalten, umfassen, ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Obwohl bei der bevorzugten Ausführungsform eine cDNA-Analyse von IGF-I- Gen-Produkten verwendet wurde, kann man alternativ zelluläre mRNA mittels Northern Blot-Analyse gemäß der den Fachleuten wohlbekannten Methoden zur Identifizierung von IGF-I-spezifischen mRNA screenen. Vgl. Thomas, P.S. (1980).
Wie nachstehend genauer beschrieben, wurden dann IGF-I- spezifische DNA-Sequenzen enthaltende Klone isoliert und mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen geschnitten, um sowohl die Größe als auch die Bereiche der darin enthaltenen IGF-I-spezifischen cDNA-Inserts zu bestimmen. Alle Restriktionsenzyme können verwendet werden. Vgl. Maniatis et al. (1982). Mit diesen Mitteln wurden IGF-I-cDNA-Inserts im Größenbereich von etwa 800 bis etwa 1150 Nucleotidpaare identifiziert und isoliert. Die nachfolgende Restriktionskartierung dieser DNA-Inserts zeigte überraschenderweise, daß die isolierten Inserts von zweierlei Typ waren, hierin als IGF-1A-cDNA (IGF-1A) bzw. IGF-1B-cDNA (IGF-1B) bezeichnet. Diese Entdeckung einer neuen ppIGF-I-Protein-Kodiersequenz ist von Bedeutung, da sie nun ein Mittel zur Identifizierung und Isolierung neuer IGF-I-Gensequenzen, zur Produktion eines synthetischen, im wesentlichen reinen, neuen ppIGF-I-Proteins und ein Mittel, mit welchem die Biosynthese von reifem IGF-I untersucht und gegebenenfalls zum Erhalt erwünschter biologischer Aktivitäten und/oder Wirkungen manipuliert werden kann, bietet.
Es wurde dann eine DNA-Sequenzanalyse dieser beiden cDNAs durchgeführt, und die entsprechenden Sequenzen wurden verglichen, wie in Fig. 5 gezeigt. Wie zuvor besprochen ist die IGF-1B-CDNA eine neue und eigene synthetische IGF-I-DNA-Sequenz, die für ein ppIGF-I-Protein, das als ppIGF-1B bezeichnet ist, kodiert. Man stellte fest, daß die IGF-1A-cDNA zur von Jansen et al. (1983) isolierten cDNA-Sequenz äquivalent war. Bedeutenderweise enthielten beide IGF-I-cDNAs (-1A und -1B), die mittels der Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert worden waren, zusätzliche Sequenzen am 5'-Ende, die nun eine genaue Bestimmung aller möglichen Translationsstarts des (der) darin kodierten Vorläuferproteins (-proteine) ermöglichen.
Insbesondere wurden, wie in Fig. 2 gezeigt, vier mögliche Translations-Start-Signalcodons (ATG) im selben Leserahmen mit der DNA-Sequenz, die für reifen IGF-I kodiert, identifiziert. Das erste ATG-Codon beginnt am Nucleotid 84, das zweite bei 183, das dritte bei 252 und das vierte bei 261. Wie in Fig. 2 dargestellt, zeigen die neuen 5'-IGF-1B-cDNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung auch das Vorhandensein von zwei im selben Leserahmen befindlichen Translationsterminationscodons (### und *** bezeichnet) vor (5' zu) und mit dem zweiten ATG-Codon, das am Nucleotid 183 beginnt, was darauf hindeutet, daß die Nucleotide 183 bis 185 das erste operable Translationsstart-Signalcodon (ATG) für das (die) ppIGF-I-Protein(e) darstellen. Tatsächlich bilden, wie in den nachfolgenden Beispielen genauer gezeigt, die Nucleotide 183 bis 185 wirklich ein operables Translationsstart- Signalcodon (ATG) für die ppIGF-I-Proteine, die sowohl in der synthetischen IGF-1A- als auch -1B-DNA-Sequenz kodiert sind.
Diese Feststellung ist von Bedeutung, da sowohl die definitiven Translationsstart-Signalcodons als auch die Translationsterminationscodons innerhalb eines bestimmten Gens oder einer synthetischen DNA-Sequenz identifiziert sein sollten, bevor die Aminosäuresequenz eines bestimmten, darin kodierten Proteins bzw. darin kodierter Proteine abgeleitet und/oder danach daraus hergestellt werden kann. Das von der vorliegenden Erfindung vorgesehene IGF-I-Gen und die synthetischen DNA-Sequenzen stellen die erste Beschreibung des operablen Translationsstart-Signalcodons sowohl für das neu entdeckte, IGF-1-B-kodierte ppIGF-I- protein (ppIGF-1B) als auch für das von Jansen et al. (1983) vorgeschlagene IGF-I-Vorläuferprotein dar. Außerdem ermöglicht die Identifizierung des Translationsstarts für das (die) ppIGF-I- Protein(e) eine quantitative und qualitative Produktion von synthetischem(n) ppIGF-I-Protein(en) mit solchen herkömmlichen Mitteln, wie chemischen, enzymatischen und/oder rekombinanten DNA- Methoden.
Tatsächlich können, wie in den Beispielen unten beschrieben, die ppIGF-I-Proteine der vorliegenden Erfindung wirksam hergestellt werden, indem eine Expression der hier identifizierten und isolierten ppIGF-I-cDNAS in einem in vitro-Zellysatexpressions- System bewirkt wird. Alternativ können ppIGF-1A- und -1B-Proteine und/oder Fragmente davon durch rekombinante DNA (rDNA)-Techniken erzeugt werden. Zu den rekombinanten DNA-Produktionsmethodenlehren würde das Klonieren mindestens der Protein-Kodiersequenzen (z. B. zumindestens der Nucleotide 183 bis etwa 767, Fig. 2, für IGF-1B) mittels herkömmlicher Techniken in zelluläre (Bakterien-, Hefe-, Säuger- und/oder Pflanzen-) Expressionsvektoren, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, und nachfolgende Produktion (z. B. Expression der ppIGF-I-DNA-Kodiersequenzen) des ppIGF-I-Proteins in der ausgewählten Wirtszelle gehören. Die so hergestellten Proteine können dann mittels herkömmlicher Techniken isoliert werden. Mit diesen und anderen herkömmlichen Mitteln, wie beispielsweise - jedoch nicht beschränkt auf - chemische Synthese, können die DNA- Sequenzinformationen und die synthetischen DNA-Sequenzen, die alle oder einen Teil der IGF-1A- und IGF-1B-cDNAS enthalten, zur Herstellung von im wesentlichen reinem, reifem IGF-I, ppIGF-I (z. B. ppIGF-1B) und/oder einem Verlängerungspeptid verwendet werden.
Außerdem ermöglichen es die DNA-Sequenzen und Gene der vorliegenden Erfindung dem Fachmann, die Biosynthese des reifen IGF-I und dessen biologische Regulierung wirksamer zu untersuchen und/oder zu manipulieren. Weiters können das ganze oder Teile des IGF-I-Gens oder der DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung äquivalenter DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, Gen(e) und/oder allelen Variationen davon beim Menschen und anderen Spezies (z. B. Rind, Schwein und/oder Vogel) verwendet werden, wobei bei solchen DNA und/oder RNA-Sequenzen eine ausreichende Homologie vorliegt. Tatsächlich umfaßt ein Beispiel für solche, von der vorliegenden Erfindung beinhaltete RNA-Moleküle die 1,7, 3,7 und 6,3 kb (Kilobase)-polyadenylierten IGF-I RNA, die durch Hybridisierung mit der IGF-1B-cDNA und/oder einer synthetischen DNA, die für das neue Verlängerungspeptid kodiert, identifiziert wurden. Der Grad der Homologie, der zur Identifizierung solcher DNA- und/oder RNA-Sequenzen oder Moleküle notwendig ist, ist dem Fachmann wohl bekannt und kann beispielsweise je nachdem, wie stringent die verwendeten Hybridisierungsbedingungen sind und/oder die die relativen Größen der Gene oder der verwendeten Nuclein- Säuresequenzen und Sonde sind, variieren.
Was die allelen Variationen des hier vorgesehenen Gens und der DNA-Sequenzen betrifft, so wurde festgestellt, daß die (IGF- 1A)-cDNA von Jansen et al. (1983) eine Identität über 413 Nucleotide (z. B. präzise Homologie) mit dem neuen IGF-1B aufwies, mit Ausnahme eines unterschiedlichen Nucleotids in der Jansen et al. (1983)-cDNA-Sequenz, wobei dieser Unterschied eine konservative dritte Positionsänderung in einem Glycincodon (Nucleotid 452 der IGF-1B-Sequenz) ist. Solche Positionsänderungen in einem gegebenen Codon können sich aus einer allelen Variation ergeben und/oder ein Beispiel für diese sein. Solche allelen Variationen, wie sie in den IGF-1B-DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung auftreten können, werden als Äquivalente des hierin vorgesehenen IGF-I-Gens und der DNA-Sequenzen angesehen.
Wie in Fig. 5 gezeigt, divergieren die IGF-1A- und IGF-1B- DNAs nach einer 459 Nucleotid-langen Identität. Insbesondere folgt, wenn man in bezug auf die Proteinsequenz analysiert, wie in Fig. 2 gezeigt, der Punkt der Abweichung auf einen Lysinrest 16 Aminosäuren nach dem reifen IGF-I-Bereich. Wie nachstehend im Detail beschrieben, entspricht der Punkt der Abweichung einer Exon-Intron-Verbindung, die in der in Fig. 3 gezeigten IGF-I-Gen- Struktur vorliegt. Die IGF-1A-cDNA-Sequenz kodiert für weitere 19 Aminosäuren nach dem Punkt der IGF-1A- und -1B-Divergenz und kodiert dadurch für ein ppIGF-I-Protein, dessen Länge 153 Aminosäuren betragen kann, das nachstehend als ppIGF-1A bezeichnet ist. Die IGF-1B-cDNA-Sequenz enthält zusätzliche 61 Aminosäuren nach dem Punkt der IGF-1A- und -1B-Abweichung und kodiert dadurch für ein ppIGF-I-Protein, dessen Länge etwa 195 Aminosäuren betragen kann, das nachstehend als ppIGF-1B bezeichnet ist. Die zwei Carboxy-terminalen Verlängerungen, die im wesentlichen aus den 19 Aminosäuren von IGF-1A bzw. 61 Aminosäuren von IGF-1B bestehen, zeigen keine Aminosäurehomologie miteinander. Außerdem zeigte keines der Carboxy-terminalen Verlängerungspeptide eine Homologie mit irgendeinem anderen Protein in der National Biomedical Research Foundation Protein Sequence Data Bank. Dayhoff et al. (1983) und Wilbur und Lipman (1983). Diese Unterschiede in Verbindung mit der Entdeckung, daß zwei eigene ppIGF-I-cDNAs vorhanden sind, verifiziert durch die nachfolgende in vivo- Identifizierung entsprechender mRNA-Moleküle (siehe nachfolgende Beispiele), ist eine Bestätigung dafür, daß die von der vorliegenden Erfindung vorgesehene synthetische ppIGF-1B-DNA-Sequenz eine neue ppIGF-I-cDNA darstellt, die für ein neues und eigenes ppIGF-I-Protein (ppIGF-1B) und Verlängerungspeptid( e) kodiert.
Bei einer anderen wichtigen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde ein neues Human-IGF-I-Gen identifiziert und isoliert. Zum Unterschied vom von Bell et al. (1985) identifizierten Gen enthält das IGF-I-Gen dieser Erfindung 5 Exons und kodiert für mindestens zwei ppIGF-I-Proteine. Die Genstruktur und DNA-Sequenz des neuen IGF-I-Gens ist in den Fig. 3 bzw. 4 gezeigt, während die Exons 1, 2, 3 und 5, wie in Fig. 3 gezeigt, strukturell von BeIl et al. (1985) identifiziert wurden, wurden die kompletten DNA-Sequenzen dieser Exons nicht vorgesehen. Diese Sequenzen sind für die Bestimmung der Anzahl und Aminosäurezusammensetzung(en) des (der) möglichen, im IGF-I-Gen kodierten ppIGF- I-Proteins (-Proteine) wesentlich. Weiters ist die Sequenzinformaticn von wesentlicher Bedeutung für die nachfolgende Verwendung des Gens oder von Teilen davon (z. B. bestimmten Exons oder Intron- Exon-Kombinationen) in in vitro- oder in-vivo-Proteinproduktions- Systemen.
Zur Synthetisierung von ppIGF-I-Proteinen, IGF-I-Genverwandten Proteinen und reifen IGF-I-Proteinen in beispielsweise Säugersystemen kann es erwünscht sein, ein im wesentlichen reines IGF-I-Gen oder Teile davon (z. B. Exons) zu verwenden. Insbesondere kann es erwünscht sein, IGF-I-spezifische DNA-Sequenzen, die Intron- und Exon-Bereiche umfassen, zu verwenden. Alternativ kann die Verwendung von im wesentlichen Intron-freien DNA-Sequenzen, die vom hier vorgesehenen IGF-I-Gen stammen, zur Herstellung von ppIGF-I-Proteinen oder Verlängerungspeptiden wünschenswert sein. Aus diesen Gründen und zum Zweck der Positionierung der neuen DNA- Sequenzen der vorliegenden Erfindung innerhalb der IGF-I-Gen- Sequenz wurden IGF-I-Gen-Sequenzen isoliert und kloniert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden zwei genomische Bibliotheken auf IGF-I-Gen- Inserts unter Verwendung von IGF-1A- und -1B-cDNAs oder Fragmenten davon gescreent. Wie nachstehend genauer beschrieben und in den Fig. 3 und 4 gezeigt, wurden fünf Exons identifiziert, während zuvor nur von 4 Exons berichtet worden ist. Vgl. Bell et al.
(1985). Es wurde festgestellt, daß das neu entdeckte Exon 4 (vgl. Fig. 3 und 4) für eine carboxy-terminale Verlängerung von ppIGF-1B kodiert, während das Exon 5 für eine Carboxy-terminale Verlängerung von ppIGF-1A kodiert.
Exon 1 kodiert für mindestens 21 Aminosäuren, die ein Leader- Peptid umfassen können, welches die Sekretion von IGF-I ermöglicht. Es ist bekannt, daß IGF-I von den Zellen, die es erzeugen, ausgeschieden wird, daher auch der Ausdruck "Präproinsulin-artiger Wachstumsfaktor-I" (ppIGF-I) zur Bezeichnung eines IGF-I-Vorläufer- Proteins. Exon 2 ist etwa 157 Nucleotide lang und kodiert für 52 Aminosäuren und ist in der DNA-Sequenz mit einem IGF-I-Exon, über das von Ullrich et al. (1984) berichtet wurde, identisch. Die in Exon 2 kodierten 27 Anfangs-Aminosäurereste gehen dem Beginn der reifen IGF-1B-Domäne voraus und enthalten zwei Methioninreste, die als zusätzliche Translationsstartsignale dienen können. Exon 2 kodiert auch für die ersten 25 Aminosäuren der B-Domäne von reifem IGF-I. Es zeigte sich, daß Codon 26 von einem großen Intron von mindestens 21 kb unterbrochen war. Der Rest der für das reife IGF- I-Protein kodierenden genetischen Information liegt in Exon 3. Insbesondere enthält Exon 3 11 Nucleotide, die für den Rest der B- Domäne kodieren, 12 für die C-Domäne kodierende Codons, 21 für die A-Domäne kodierende Codons und 8 für die D-Domäne kodierende Codons. Zusätzlich kodiert Exon 3 für 16 zusätzliche Aminosäuren, die eine neu beschriebene E-Domäne und/oder einen Teil der Carboxy-terminalen Verlängerung von pIGF-1A und pIGF-1B darstellen können. Somit können die "carboxy-terminalen Verlängerungsproteine" oder "Verlängerungs-Peptide" der vorliegenden Erfindung eine Kombination der letzten, in Exon 3 kodierten Aminosäuren (z. B. NH&sub2;-Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys-COOH) und des in Exon 4 kodierten Peptids, des in Exon 4 kodierten Peptids und/oder irgendeiner Reihe von Aminosäuren, die in den innerhalb von Exon 4 und den letzten 48 Nucleotiden von Exon 3 gefundenen DNA-Sequenzen kodiert sind, umfassen.
Es zeigte sich, daß die Exons 4 und 5 jeweils für eigene Verlängerungs-Peptide, Translations-Terminationscodons, 3'-nichttranslatierte Bereiche, Poly-A-Additions- (z. B. Adenylierungs-)- Signale und -Stellen kodieren. Exon 4, das 1,5 kb 3' zu Exon 3 liegt, besteht aus 515 Nucleotiden und umfaßt das 3'-Ende (z. B. den Carboxy-Terminus) der IGF-1B-Kodiersequenz. Das in Exon 4 kodierte Verlängerungs-Peptid umfaßt ein stark basisches 61- Aminosäurepeptid mit mehreren dibasischen und tribasichen Resten. Aufgrund von Analogien mit anderen biosynthetischen Stoffwechselrouten, bei welchen Vorläuferproteinzwischenstufen (z. B. Umwandlung von Proinsulin zu Insulin) verwendet werden, können diese dibasichen und tribasischen Reste für die enzymatische Verarbeitung von im Gen oder in den Genen der vorliegenden Erfindung kodierten ppIGF-I-Protein(en) zu beispielsweise einem reifen IGF- I-Protein sorgen. Zusätzlich oder alternativ können diese Reste die Bindung an solche negativ geladenen Makromoleküle, wie DNA, erleichtern. Nach dem TGA-Terminations-Codon in Exon 4 gibt es 329 Basen von 3'-nicht-tranlatierter DNA. Exon 5, das sich 17 kb hinter dem 3'-Ende des Exon 3-befindet, ist 344 Basen lang, kodiert für das 3'-Ende der IGF-1A-Kodiersequenz und enthält ein TAG-Translations-Terminations-Codon und 284 Basen 3'-nichttranslatierter DNA. Zusätzlich enthalten alle Intron-Exon-Ränder Consensus-RNA-Spleiß-Sequenzen, was andeutet, daß jede Kombination von Exons innerhalb eines mRNA-Moleküls bestehen und daher in ein IGF-I-Gen-verwandtes Protein translatiert werden kann.
Die hierin vorgesehenen Gene und DNA-Sequenzen ermöglichen nun die in vitro-Produktion mittels solcher Techniken, wie rekombinater DNA und chemischer Synthese, und die in vivo- Detektion von Proteinen, die ein von einem einzigen Exon kodiertes Protein und/oder jede Kombination von Exon-kodierten Proteinen umfassen. Man nimmt an, daß solche Proteine biologisch aktiv sind und insbesondere daß sie IGF-I-artige Aktivität besitzen. Die zugehörigen biologischen Aktivitäten können als solche vom Fachmann unter Verwendung von in vitro- und/oder in vivo- Untersuchungen festgestellt werden. Vgl. Daughaday (1977); Clemmons und Van Wyk (1981a); van Buul-Offers und Van de Brande (1980); Schoenle et al. (1982); und Hylka et al. (1985).
Weiters ist die Isolierung, Restriktionskarte und Bestimmung der IGF-I-Gen-Struktur und -Sequenz von Bedeutung, da sie nun eine Möglichkeit zur Lokalisierung von DNA-Polymorphien bietet, die beispielsweise durch chromosomale Restriktionsendonuclease-Analyse festgestellt wurden. Tatsächlich haben wir die Stellenpolymorphie für die Restriktionsendonucleasen Hind III und Pvu II lokalisiert, von welchen von Bell et al. (1985) berichtet wurde, daß sie miteinander verbunden sind und zu Exon 5 des genomischen IGF-I- Gens kartiert worden sind. Solche Polymorphien sind zur Bestimmung familiärer genetischer Verbindungen nützlich und wurden diagnostisch für verschiedene Erkrankungen verwendet. Außerdem können solche IGF-I-Gen-Polymorphien diagnostisch für wachstumsbeeinflußte Erkrankungen verwendet werden. Weiters werden solche Polymorphien als Äquivalente für hierin vorgesehene Gen-Sequenzen angesehen.
Die vorliegende Erfindung erwägt weiters, daß das im wesentlichen reine IGF-I-Gen der vorliegenden Erfindung oder Teile (z. B. Exons) davon nun verwendet werden können, um IGF-I-Gen-verwandte Proteine, inklusive doch nicht eingeschränkt auf ppIGF-I-Proteine, reife IGF-I-Proteine, Varianten davon und/oder biosynthetische Zwischenprodukte davon de novo zu erzeugen und/oder in vivo zu vermehren.

Die Proteine

Gemäß einer Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf ein neues ppIGF-I-Protein (ppIGF-1B) mit einer Aminosäuresequenz, wie in Fig. 6 gezeigt, gerichtet. Gemäß einer weiteren wichtigen Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf neue Verlängerungs-Peptide gerichtet, für welche ein Peptid mit der Aminosäure- Sequenz, wie in Fig. 7 gezeigt, ein Beispiel ist. Aufgrund der hier vorgesehenen Sequenzen können diese Proteine und Äquivalente davon nun mit solchen herkömmlichen Mitteln, wie chemischer Synthese, enzymatischer in vitro-Synthese, rDNA-Techniken und/oder Isolierung aus menschlichem Gewebe, hergestellt werden.
Man erwartet, daß die Produktion der Proteine oder Peptide dieser Erfindung mittels rDNA und/oder chemischer Synthese zu geringfügigen Veränderungen in der Aminosäurezusammensetzung führen kann. Beispielsweise kann die Produktion in Bakterien zur Addition eines Methionins am Amino(NH&sub2;)-Terminus führen, und die chemische Synthese kann zu Variationen des Carboxy (-COOH)- Terminus führen, so daß jeder der Reste -COOR, -CRO, -CONHNR&sub1;, -CONR&sub1;R&sub2; oder -CH&sub2;OR (wobei R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander Niedrigalkyl oder Wasserstoff sind) gefunden werden kann. Solche im wesentlichen reine und/oder synthetische Proteine werden als im Bereich der vorliegenden Erfindung liegend angesehen.
Weiters ermöglichen es die durch die vorliegende Erfindung vorgesehenen neuen DNA-Sequenzen und Gene dem Fachmann, ppIGF-I- Proteine und/oder biologisch aktive Fragmente davon, inklusive, doch nicht ausschließlich, reifes IGF-I und Verlängerungs-Peptide zu identifizieren, zu isolieren und/oder zu produzieren. Die biologische Aktivität dieser Proteine kann wachstumsfördernde Aktivität(en) von reifem IGF-I einschließen, ist jedoch nicht auf diese eingeschränkt, und kann daher gemäß der dem Fachmann bekannten in vitro- und in vivo-Untersuchungen bestätigt werden.
Es zeigte sich, daß IGF-I insbesondere die Zellvermehrung, das Skelettwachstum, die Gewichtszunahme und das Biustdrüsenwachstum stimuliert, wobei letzteres eine Voraussetzung für eine verbesserte Milchproduktion ist. Man erwartet, daß auch das hier beschriebene neue ppIGF-1B-Protein alle oder einige dieser wachstumsfördernden Aktivitäten besitzt und in einem ausgewählten Gewebe eine verbesserte Aktivität aufweisen kann.
Man nimmt auch an, daß biologisch aktive Fragmente der Proteine dieser Erfindung mit herkömmlichen Mitteln herstellbar sind. Diese Fragmente werden nachfolgend manchmal als "IGF-I-Gen-verwandte Proteine" bezeichnet und so verstanden, daß sie Proteine umfassen, wobei zumindest ein Teil dieses (dieser) Proteins (Proteine) im Gen und/oder den synthetischen DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung und/oder allelen Variationen davon kodiert ist.
Gemäß einer Vorgangsweise werden die Aminosäuresequenzen der ppIGF-I (z. B. ppIGF-1A- und ppIGF-1B)-Proteine und Verlängerungs- Peptide davon von den DNA-Sequenzen und ihren jeweiligen cDNAs und vom neuen, von der vorliegenden Erfindung vorgesehenen IGF-I-Gen abgeleitet. Beispielsweise wurde festgestellt, daß das ppIGF-1B- Protein die in Fig. 6 angeführte Aminosäuresequenz aufweist.
Gemäß einer anderen Vorgangsweise wurden die ppIGF-I-Proteine durch Verwendung von in vitro-Systemen, die für eine Expression der IGF-1A- und -1B-cDNAS sorgten, identifiziert. Der Ausdruck "Expression" bedeutet, wie hierin verwendet, wenn auf ein Gen oder eine synthetische DNA-Sequenz bezug genommen wird, die Transkription eines bestimmten Gens oder einer DNA-Sequenz in mRNA, gefolgt von einer Translation der mRNA in Protein. Die so erzeugten Proteine können danach mittels herkömmlicher Techniken, wie Polyacrylamidgelelektrophorese, Affinitätschromatographie, Ionenaustausch, Revers-Phasen-HPLC, Immun-Präzipitation oder irgendeiner herkömmlichen Fraktionierungstechnik isoliert und danach sequenziert werden. Mittels dieser Methoden wurde bewiesen, daß ein ppIGF-1B-Protein mit 195 Aminosäuren und ein ppIGF-1A- Protein mit 153 Aminosäuren in vitro erzeugt werden kann, daß diese Proteine ihren jeweiligen Aminosäuresequenzen entsprechen, die von ihren jeweiligen, hierin identifizierten cDNA-Sequenzen abgeleitet waren, und daß das erste im betreffenden Leserahmen vorkommende Methionincodon [z. B. die Basenpaare 183-185 für IGF-1B (vgl. Fig. 2)) das Haupttranslationsstartsignalcodon für beide ppIGF-I-Proteine ist.
Um zu bestätigen, daß die in den synthetischen IGF-1A- und 1B-DNA-Sequenzen und/oder den carboxy-terminalen Verlängerungen davon kodierten Proteine (z. B. ppIGF-1A und ppIGF-1B) als eigene und separate Peptide und/oder als Teil separater und eigener Proteine in vivo erzeugt werden, machten wir folgendes: Radioaktiv markierte vollständige IGF-1A-cDNA oder vollständige IGF-1B-cDNA und radioaktiv markierte DNAs, die den entweder in Exon 4 oder Exon 5 enthaltenen Kodiersequenzen entsprachen, wurden einzeln mit in der Leber des Menschen erzeugten RNA-Transcripten (mRNA) hybridisiert.
Mit diesen Mitteln wurden polyadenylierte RNA-Moleküle im Bereich einer Länge von etwa 900 bis etwa 1350 Nucleotiden identifiziert, die mit all den zuvor erwähnten Sonden hybridisierten. Diese Ergebnisse bestätigen die aktive Transkription von sowohl für die IGF-1A- als auch -1B-DNA-Sequenzen kodierender DNA in vivo. Weiters wurden drei zusätzliche polyadenylierte RNAs (mRNAs) mit einer Länge von etwa 1,7, 3,7 bzw. 6,3 Kilobasen (kb) identifiziert. Obgleich die Anmelder nicht an die folgende Theorie des Mechanismus gebunden sein möchten, nehmen wir an, daß diese größeren mRNAs Formen von ppIGF-I-Vorläufer-mRNAS oder mRNAs darstellen, die für IGF-I-Gen-verwandte Proteine kodieren (z. B. Proteine, die im wesentlichen aus der Sequenz von im wesentlichen reinem ppIGF-I und/oder einem im wesentlichen reinen Verlängerungs-Peptid bestehen). Weiters stellt unsere Entdeckung, wonach das Human-IGF-I-Gen der vorliegenden Erfindung die Produktion mannigfaltiger Proteine bewirkt, ein Mittel dar, mit welchem die IGF-I-Biosynthese und/oder Reifung reguliert werden kann und/oder ein Mittel, mit welchem IGF-I-Gen-verwandte Proteine reguliert und/oder synthetisiert werden können. Insbesondere ist IGF-I vor allem zur Unterstützung des linearen Wachstums nötig, das Niveau der Gen-Expression kann während des Wachstums und der Entwicklung variieren und/oder kann bei verschiedenen Geweben variieren, und zwar je nach den Wachstumserfordernissen dieses Gewebes (dieser Gewebe). Die ppIGF-I-Proteine können einen Regulierungspunkt für die Produktion von reifem IGF-I und/oder für die Produktion von IGF-I-Gen-verwandtem Protein während dieser Wachstumsstadien und/oder in gewebsspezifischer Weise bieten.
Die Identifizierung und Isolierung der ppIGF-I-cDNAS und entsprechender mRNA, die in vivo synthetisiert worden ist, deuten darauf hin, daß die ppIGF-I-Proteine der vorliegenden Erfindung in vivo erzeugt werden. Obwohl man annimmt, daß die Ausbeuten in bezug auf für den Handel erwünschte Ausbeuten niedrig sein werden, nimmt man an, daß auf Basis der hierin vorgesehenen DNA und Aminosäuresequenzen im wesentlichen reine ppIGF-I-Proteine aus Gewebe (d. h. Fibroblasten, Blut, Leber usw.) und/oder aus Zellen davon isoliert werden können. Solche im wesentlichen reine Proteine werden als Teil der vorliegenden Erfindung angesehen.
Die jüngste Identifizierung von eine E-Domäne enthaltendem Ratten-IGF-II-Protein und die Isolierung eines die E-Domäne im Rattenserum darstellenden aktiven freien Peptids, Zumstein et al. (1983) und Hylka et al. (1985,) deuten darauf hin, daß eine Familie von IGF-Gen-verwandten biologisch aktiven Peptiden oder Proteinen in vivo hergestellt werden kann. Solche Proteine würden das hierin geoffenbarte neue IGF-1B-Carboxy-terminale Verlängerungspeptid einschließen, jedoch nicht auf dieses eingeschränkt sein. Es wird auch erwartet, daß Proteine, die aus verschiedenen Kombinationen von IGF-I-Gen-Exons bestehen, in einer solchen Familie aus IGF-Gen-verwandten Proteinen inkludiert sein können. Beispielsweise können die Carboxy-terminalen Verlängerungspeptide von pIGF-1A und/oder -1B spezifischen, auf das Gewebe beschränkten biologischen Funktionen dienen. Die Funktionen der alternativ exprimierten Carboxy-terminalen Peptide können vom Fachmann unter Verwendung von beispielsweise synthetischen Peptiden und Antikörpern zu diesen untersucht werden. Alternativ kann RNA-Spleißen einen Regulierungspunkt für IGF-I-Gen-Expression schaffen, wie es für andere Gene vorgeschlagen worden ist, Rosenfeld et al. (1983), bei welchen verschiedene Kombinationen von Exons in verschiedenen Geweben funktionieren. Solche möglichen Exon-Kombinationen werden als von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen angesehen.
Die vorliegende Erfindung erwägt auch, daß die hierin vorgesehen Gene und DNA-Sequenzen verwendet werden können, um diese IGF-I-Gen-verwandten Proteine zu erzeugen und/oder deren Isolierung zu unterstützen. Obgleich die vorliegende Erfindung eine spezifische ppIGF-1B-Aminosäuresequenz beschreibt, die in solchen Genen und DNA-Sequenzen kodiert ist, erwartet man, daß alternative offene Leserahmen und somit ein alternatives Protein (z. B. Aminosäuresequenzen) im hierin vorgesehenen Gen und den DNA- Sequenzen kodiert sein kann. Solche Proteine werden als zu den IGF-I-Gen-verwandten Proteinen gehörend angesehen, die von den hierin vorgesehenen neuen Genen und DNA-Sequenzen geschaffen werden.
Wie zuvor besprochen, nimmt man an, daß das neue ppIGF-I und Verlängerungs-Peptide der vorliegenden Erfindung zur Verabreichung an Tiere zur Förderung des Wachstums, zur Erhöhung der Milchproduktion und/oder des Mager/Fett/Verhältnisses oder des Muskelgehalts der Tiere geeignet sind. Für solche Verwendungszwecke können ein oder mehrere Proteine oder Peptide dieser Erfindung (oder nicht-toxische Salze davon) mit einem nicht-toxischen, physiologisch akzeptablen (festen oder flüssigen) Träger vereinigt werden, um eine Zusammensetzung zu bilden, die mittels einer geeigneten Technik, z. B. intravenös, subkutan, intramuskulär, intranasal oder oral, in einer Form an Tiere verabreicht werden kann, die die Proteine oder Peptide vor einem Abbau im Verdauungstrakt schützt. Solche Zusammensetzungen können dem Tier durch Injektion, Infusion oder Implantation, vorzugsweise in einem Medium (z. B. Dispersion in Öl oder einen Polymer) verabreicht werden, die die Abgabe des Peptids an die Zielzellen des Tieres in einer gewünschten Rate erleichtert. Eine solche Methode der Verabreichung an ein Tier (z. B. trächtige Kühe und Färsen) ist eine Infusion des Proteins oder Peptids in einem Träger, der zur Erreichung einer angemessenen Dispersion im Brustdrüsengewebe geeignet ist, in die Brustdrüse, wie genauer in der gleichzeitig schwebenden U.S. Patentanmeldung Ser. No. 837,477, eingereicht am 7. März 1986, gelehrt. Die Offenbarung der besagten Anmeldung ist hierin durch Bezugnahme darauf eingeschlossen. Die Anteile an Träger und biologisch aktivem Peptid in solchen Zusammensetzungen können alle jene sein, die die gewünschten Wirkungen bei Tieren erleichtern. Bevorzugte Anteile können vom Fachmann leicht bestimmt werden.
Die benötigte Dosierung variiert je nach besonderem gewünschten Resultat und der Dauer der gewünschten Behandlung. Eine wirksame Dosis des ppIGF-1B-Proteins und/oder -Verlängerungspeptids (bzw. -peptide) beträgt von etwa 60 Mikrogramm (ug) bis etwa 6 Milligramm (mg) pro Kilogramm (kg) Körpergewicht des Tieres bei täglicher Verabreichung während einer Behandlungsdauer von etwa ein bis etwa drei Wochen. Eine bevorzugtere Dosis ist von etwa 400 ug bis etwa 800 ug pro kg pro Tag. Wie hierin verwendet, ist die wirksame Konzentration als eine Konzentration des besonderen Proteins oder Peptids, die eine zufriedenstellende Stimulierung des gewünschten Zellwachstums und/oder der Funktionalität schafft, definiert. Die am meisten bevorzugte Menge oder die wirksamste Dosierung zur Erreichung eines gewünschten Resultats (z. B. erhöhter Milchproduktion) kann durch Routineversuche bestimmt werden. Die bevorzugte Dosierung kann von Variablen, wie der Größe, der allgemeinen Gesundheit und dem Ernährungszustand des jeweiligen Tieres, abhängen.
Bioaktive Peptide dieser Erfindung können in einer im wesentlichen reinen Form, d. h. frei von anderen Proteinen oder Peptiden (welchen Ursprungs auch immer) mit einer bedeutenden Wirkung auf die Bioaktivität der Proteine oder des Peptids (bzw. der Peptide) dieser Erfindung verwendet werden. Dies ist jedoch nicht wesentlich, da in vielen Anwendungsbereichen die Proteine oder Peptide dieser Erfindung in zufriedenstellender Weise (in vielen Fällen sogar vorteilhafterweise) in Mischungen oder anderen Kombinationen mit verschiedenen Proteinen oder Peptiden, z. B. anderen Tierwachstumsfaktoren, wie Rinder- (oder anderem Tier-)- IGF-I, EGF oder TGF-α (alpha-transformierendem Wachstumsfaktor) verwendet werden können.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und sollen den Umfang der Erfindung auf keine Weise einschränken. Obgleich diese Erfindung anhand ihrer bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, sind für den Fachmann aus dem Lesen dieser Anmeldung verschiedene Modifikationen und Varianten derselben offensichtlich.
Alle Enzyme, inklusive Restriktionsendonucleasen, T&sub4;-DNA- Ligase, T&sub4;-Polynucleotidkinase, DNA-Polymerase, Ribonuclease A, DNA-modifizierende Enzyme, Weizenkeimlysate, Kaninchenreticulocyten-Lysat, unmarkierte Aminosäuren und Proteinase K, wurden von New England Biolabs (Beverly, Massachusetts) und Bethesda Research Laboratories (BRL) (Gaithersburg, Maryland) gekauft und gemäß den Spezifikationen des Erzeugers verwendet. Nitrocellulosefilter wurden von Schleicher und Schuell (Keene, New Hampshire) und Millipore (Bedford, Massachusetts) erhalten. Radionuclide und radioaktiv markierte Aminosäuren wurden von New England Nuclear (Boston, Massachusetts) und Amersham (Arlington Heights, Illinois) gekauft. Desoxyribonucleosid-triphosphat, Ribonucleosid-triphosphate und Didesoxyribonucleosid-triphosphate wurden von Pharmacia PL Biochemicals (Piscataway, New Jersey) gekauft.
Ein 42-Basen-Oligonucleotid, das der für die Aminosäuren 10 bis 23 von reifem Human-IGF-I-kodierenden DNA-Sequenz entspricht (Jansen et al. 1983 und Ullrich et al. 1984) wurde im Department of Biological Sciences, Monsanto Company (St. Louis, Missouri) unter Verwendung eines Applied Biosystems DNA Synthesizers gemäß der vom Hersteller angegebenen Vorgangsweise synthetisiert. Applied Biosystems, Inc. (Foster City, California). Die Sequenz des 42-Mers war wie folgt:
Das 42-Mer wurde am 5'-Ende unter Verwendung von Gamma-³²P- Adenosintriphosphat und T&sub4;-Polynucleotidkinase gemäß der von Maniatis et al. (1982) beschriebenen Verfahren markiert, um eine spezifische Aktivität von etwa 10&sup7; dpm pro Picomol zu erreichen. Das radioaktiv markierte 42-Mer wurde dann zum Screenen einer gemäß den von Kwok, S.C.M. et al. (1985) und Gubler und Hoffman (1983) angeführten Methoden hergestellten Menschenleber-cDNA- Bibliothek auf IGF-I-enthaltende DNA-Sequenzen verwendet. Die Menschenleber-cDNA-Bibliothek in Lambda gtll wurde von den Doktoren S.L.C. Woo und T. Chandra (Baylor University School of Medicine, Houston, Texas) erhalten. Lambda gtll ist auch bei der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, Maryland) unter der ATCC-Akzessionsnummer 37194 und einer darin gemäß der von Kwok, S.C.M. et al. (1985) beschriebenen Methode hergestellten Menschenleber-cDNA-Bibliothek erhältlich. E. coli K 12, Stamm Y1088, ist bei ATCC unter der ATCC-Akzessionsnummer 37 195 erhältlich. Die Plasmide pGEM1 und pGEM2 wurden von Promega Biotech (Madison, Wisconsin) erhalten.

Beispiel 1

Das folgende Beispiel zeigt die Isolierung von IGF-1A- und IGF- 1B-cDNAS aus einer Menschenleber-cDNA-Bibliothek Kurz gesagt wurde die Menschenleber-cDNA-Bibliothek in Lambda gtll folgendermaßen gescreent. Lambda gtll wurde auf E. coli K12, Stamm Y1088, gemäß der von Young und Davis (1983) beschriebenen Methode plattiert. Duplikat-Nitrocellulosefilter wurden gemäß dem von Woo, S. L. C. (1979) beschriebenen Verfahren hergestellt und etwa 20 Stunden lang bei 42ºC unter Verwendung von 2 · 10&sup6; dpm Sonde pro Filter in Puffer, enthaltend 5 · SSC (1 · SSC = 150 mM NaCI, 15 mM Na-Citrat, pH 7,0), 50 mM Na-Phosphat, pH 6,8, 40% (Vol./Vol.) entionisiertes Formamid, 50 Mikrogramm/Milliliter denaturierte Lachssamen-DNA, 5 · Denhardt-Lösung [0,1% (Gew./ Vol.) Ficoll, 0,1% (Gew./Vol.) Rinderalbumin, 0,1% (Gew./Vol.) Polyvinylpyrolidon, Maniatis et al. (1982)], hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter 15 min lang bei 22ºC und 15 min lang bei 40ºC in einer Lösung, die 0,2 · SSC, 0,1% (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt, gewaschen und danach unter Verwendung von Verstärkerschirmen einem Kodak XAR5-Film (Eastman Kodak Co., Rochester, New York) ausgesetzt. Positive Plaques wurden bei geringerer Dichte wieder gescreent. Insbesondere wurden beim Primär-Screenen 2,5 · 10&sup4; Plaques pro 137 mm Filter und beim Sekundär-Screenen etwa 1-2 · 10² Plaques pro 87 mm Filter verwendet. Phagen-DNA aus den positiven Plaques wurde dann wie von Helms et al. (1985) beschrieben hergestellt und durch Restriktionsenzymverdau und Gel-Elektrophorese, Maniatis et al. (1982) kartiert und danach sequenziert.
Etwa 5 · 10&sup5; Plaques der Menschenleber-cDNA-Bibliothek wurden, wie gerade beschrieben, mit der IGF-I-spezifischen 42-Mer Sonde gescreent, was zur Isolierung von 7 positiven Plaques mit DNA-Inserts im Bereich von etwa 800 bis etwa 1150 Nucleotid-Paaren führte. Durch Restriktionskartieren mit EcoRI, BamHI und PstI wurde festgestellt, daß die cDNAs zweierlei Typs waren. Zwei der 7 positiven Plaques, die Inserts von etwa 800 bis 850 Nucleotid- Paaren enthielten, enthielten innere BamHI-Restriktions-Endonucleasestellen, und es zeigte sich, daß sie der von Jansen et al. (1983) berichteten IGF-I-cDNA entsprachen. Diese Inserts wurden als IGF-1A-cDNA bezeichnet. Die übrigen 5 positiven Klone hatten eine Restriktions-Endonuclease-Karte gemeinsam, die sich von der Karte der IGF-1A-cDNA unterschied. Diese 5 Klone wurden als IGF- 1B-cDNA bezeichnet. Die zwei größten Inserts, in Fig. 1 als λIGF-2 und λIGF-5 gezeigt, wurden dann für eine DNA-Sequenzanalyse ausgewählt.
Die DNA-Sequenzierung erfolgte mittels des von Sanger et al. (1977) und Biggin et al. (1983) beschriebenen Didesoxy-Ketten- Terminationsverfahrens, nachdem Restriktionsfragmente in M13mp18 und M13mp19-Bakteriophagen, wie von Norrander et al. (1983) beschrieben, subkloniert worden waren. Die Sequenzierungsstrategie ist in Fig. 1 gezeigt. Die DNA-Sequenzen der beiden IGF-1B-cDNA- Isolate wurden in ihrer Gesamtheit an beiden Strängen und über alle Restriktionsenzymstellen, die als Initiierungspunkte verwendet wurden, bestimmt, außer das äußerste 3'-Ende eines Klons λIGF-5 (vgl. Fig. 3), welches dreimal nur in einer Ausrichtung sequenziert wurde.
Beide Isolate ergaben über gemeinsame Bereiche identische Ergebnisse. Die DNA-Sequenz und die Aminosäuretranslation scheinen in Fig. 2 auf. Das IGF-1B-cDNA-Aggregat besteht aus 1136 Nucleotiden, einschließlich 42 Desoxyadenosinreste des Poly-A-Traktes. Die Größe der IGF-1B-cDNA stimmt mit der Größe der Haupt-mRNA (900 bis 1350 Nucleotide) überein, was durch Filterhybridisierung bestimmt wurde und nachstehend genauer beschrieben ist. Die Sequenz kann in drei Abschnitte unterteilt werden: einen 5'-nicht-translatierten Bereich mit den ersten 182 Nucleotiden; ein Initiierungscodon und einen offenen Leserahmen von etwa 585 Nucleotiden (195 Codons), gefolgt von einem opal-(TGA)-Terminationscodon; und einem 3'-nicht-translatierten Bereich von etwa 368 Nucleotiden, der in einem Poly-A-Trakt endet.
Wie in Fig. 2 gezeigt, beginnt der offene 585 Nucleotid- Leserahmen mit dem zweiten in der Phase befindlichen ATG-Codon. Dem ersten ATG an den Nucleotiden 84 bis 86 folgt sofort ein Opal- Terminator im Leserahmen. Der in Fig. 2 gezeigte offene Leserahmen kodiert für ein ppIGF-I von etwa 195 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von etwa 21.841 Dalton, wenn man annimmt, daß das ATG-Codon an den Basen 183 bis 185 die Proteinsynthese initiiert. Die reife IFG-I-Protein-Sequenz ist durch die Nucleotide 327 bis 536 kodiert, was durch die schraffierte Fläche in Fig. 1 angezeigt und in Fig. 2 unterstrichen ist. Den 70 reifen IGF-I-Codons folgt eine unike und neue Carboxy-terminale Verlängerung von 77 Aminosäuren. Obwohl die ersten 16 Aminosäuren dieser Carboxy-terminalen Verlängerung mit den ersten 16 Aminosäuren der IGF-1A-Carboxyterminalen Verlängerung identisch sind, sind die übrigen 61 Aminosäuren unik, was durch eine fehlende Homologie mit der IGF- 1A-Carboxy-terminalen Verlängerung oder mit irgendeinem anderen Protein in der National Biomedical Research Foundation Protein Sequence Data Bank bestimmt wurde. Dayhoff et al. (1983) und Wilbur und Lipman (1983).
Eine Bestätigung der in vivo-Expression von zwei eigenen ppIFG-I-Proteinen, die in der IGF-1A- bzw. -1B-cDNA kodiert sind, wurde durch Identifizierung von Messenger-RNA-Molekülen, die für diese Proteine kodieren, erreicht. Insbesondere wurde polyadenylierte Leber-RNA aus bei -70ºC frisch gefrorenem Gewebe durch Extraktion mit Guanidiniumthiocyanat isoliert gemäß dem von Chirgwin et al. (1979) beschriebenen Verfahren und einer Chromatographie auf Oligo-dT-Cellulose wird von Aviv und Leder (1972) beschrieben. Die polyadenylierte RNA wurde mit Glyoxal denaturiert, wie von McMaster und Carmichael (1977) beschrieben, einer Elektrophorese durch ein 1,25% (Gew.-/Vol.) Agarosegel unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter durch Blotten gemäß dem von Thomas (1980) beschriebenen Verfahren transferiert. Komplette IGF- 1A- und -1B-cDNAs oder DNAs, die entweder für die IGF-1A- oder -1B-Carboxyl-terminalen Verlängerungen kodierten, wurden alle einzeln mit ³²P markiert, und zwar mittels Nick-Translation, wie von Rigby et al. (1977) beschrieben, auf 8-12 · 10&sup8; dpm pro Mikrogramm, und auf die Filter hybridisiert bei 42ºC in einer Lösung enthaltend 50% (Vol./Vol.) Formamid, 5 · SSC, 50 mM Na- Phosphat, pH 6,5, 100 Mikrogramm pro Milliliter denaturierte Lachssamen-DNA, 1 · Denhardt-Lösung und 10% (Gew./Vol.) Dextransulfat. Die Filter wurden 15 min lang bei 22ºC in einem Puffer, der 0,2 · SSC und 0,1% (Gew./Vol.) SDS enthielt, 30 min unter zweimaligem Wechseln im selben Puffer bei 48ºC gewaschen und danach unter Verwendung von Verstärkenschirmen 62 Stunden lang bei -70ºC autoradiographiert.
Sowohl die IGF-1A- als auch die -1B-cDNAs hybridisierten mit RNA-Transkripten in Menschenleber. Die Hybridisierung entweder der uniken Carboxy-terminalen Verlängerung von IGF-1A- oder -1B-cDNA zeigt eine Hauptbande von etwa 900 bis etwa 1350 Nucleotiden. Andere größere Banden wurden bei 1,7, 3,7 und 6,3 Kilobasen potentieller bzw. verarbeiteter Vorläufer-mRNAs oder alternativ anderer IGF-I-Gen-verwandten mRNAs gesehen. Parallelversuche unter Verwendung ganzer IGF-1A- und -1B-cDNAs lieferten ähnliche Ergebnisse.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die Isolierung und Kartierung des genomischen Human-IGF-I-GenS.
Eine Human-genomische Bibliothek wurde unter Verwendung eines Hybrid-Vektors, λMG14, Helms et al. (1985), und größen-fraktionierter Human-Leukocyten-DNA, die teilweise mit MboI, wie von Maniatis et al. beschrieben, verdaut worden war, hergestellt. Gen- Bibliotheken können wie von Maniatis et al. (1982) beschrieben hergestellt werden. Etwa 4 · 10&sup5; Plaques aus dieser Bibliothek und einer anderen, die aus Humanfoetalleber, von Lawn et al. (1978) beschrieben, stammte, wurden gemäß den von Maniatis et al. (1982) beschriebenen Verfahren unter Verwendung von ³²P-markierten IGF-I- cDNAs, die mittels Nick-Translation, wie von Rigby et al. (1977) beschrieben, hergestellt worden waren, als Hybridisierungssonden gescreent. DNA aus Plaque-gereinigten positiven Isolaten, Helms et al. (1985) wurde kartiert, wobei BamHI, EcoRI und HindIII Einzel- und Doppelverdau durch Hybridisierung mit ³²P IGF-I-cDNAS und Human-Alu-Sonden, hergestellt wie von Schmid und Jelinek (1982) beschrieben, verwendet wurden. Aus 15 genomischen Klonen, die IFG- I-Exons enthielten, wurden 8 zur weiteren Analyse ausgewählt, die aus Restriktionsendonucleasekartierung und Southern Blotting bestand. Die acht ausgewählten Klone und die darin enthaltenen genomischen DNA-Bereiche sind in Fig. 3(a) gezeigt und mit λIGF- und nachfolgender Zahl bezeichnet.
Die Ergebnisse dieser Analysen sind in Fig. 3(a), die eine Restriktionskarte der isolierten genomischen IFG-I-Gene darstellt, zusammengefaßt. Fünf Bereiche der isolierten DNA hybridisierten an die cDNA-Sonden und wurden als Exons 1-5 bezeichnet, die als die nummerierten Kästchen in Fig. 3(a) gezeigt sind. Die Exons 1, 2, 3 und 5 umfassen IGF-1A-mRNA (z. B. DNA, die für pIGF-1A kodiert), und die Exons 1, 2, 3 und 4 umfassen IGF-1B-mRNA (z. B. DNA, die für pIGF-1B kodiert). Vom Anfang des Exons 1 bis zum Ende des Exons 5 erstreckt sich das Gen über mehr als 45 Kilobasen (kb). Es wurde festgestellt, daß der unvollständig charakterisierte DNA- Bereich zwischen den Exons 2 und 3 ein Intron darstellt, da diese Sequenz ein Asparagincodon in der B-Domäne von reifem IGF-I unterbricht und daher kein zusätzliches Exon enthalten kann. Wie in Fig. 3(a) gezeigt, sind im genomischen IGF-I-Gen fünf Bereiche, die stark mit mittel-repetitiver DNA vom Alu-Typ hybridisieren, Schmid und Jelinek (1982). Diese Alu-Typ-Sequenzen kartieren zu dazwischenliegenden und seitlichen DNA-Sequenzen, Schmid und Jelinek (1982).
Subklone, die jedes Exon enthielten, wurden in pUCl8- und pUC19-Plasmiden gemäß den von Norrander et al. (1983) beschriebenen Verfahren zur weiteren Restriktionskartierung, und in M13mp18 und M13mp19 gemäß den von Norrander et al. (1983) beschriebenen Verfahren zur DNA-Sequenzierung hergestellt. M13mp18, M13mp19, pUC18 und puC19 sind von New England Biolabs (Beverly, Massachusetts) erhältlich. Die DNA-Sequenzanalyse erfolgte gemäß den von Sanger et al. (1977) und Biggin et al. (1983) beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Didesoxyketten-terminierenden Inhibitoren, ³&sup5;S-dATP und sowohl Standardals auch denaturierender Gel-Elektrophorese. Die verwendete DNA- Sequenzierungsstrategie ist in Fig. 3(b) schematisch dargestellt. Die Ausgangs-DNA-Sequenzierung der Exons 3 und 4 wurde erhalten, nachdem eine Serie von überlappenden Deletionen unter Verwendung von Bal 31-Exonuclease, von Poncz et al. (1982) beschrieben, hergestllt worden war, wie durch die voll ausgezogenen Kreise im in Fig. 3(b) gezeigten sequenzierungsschema angezeigt ist. Jegliche andere Sequenzanalyse wurde an spezifischen Restriktionsendonucleasestellen begonnen, wie durch die kurzen, vertikalen Linien in Fig. 3(b) veranschaulicht. Die Pfeile geben das Ausmaß der bestimmten Sequenz an. Außer 100 Nucleotiden des Introns, das dem Exon 2 vorangeht, und einem Teil von Exon 4, wurden alle in Fig. 4 dargestellten Sequenzen auf beiden DNA-Strängen bestätigt, einschließlich aller Restriktionsendonucleasestellen, die als initiierungspunkte verwendet wurden. Alle Exon-Intron-Spleißverbindungen und Polyadenylierungsstellen wurden durch Vergleich mit IGF-1A- und IGF-1B-cDNA-Sequenzen bestimmt.
Eine Southern-Blot-Analyse wurde kurz folgendermaßen durchgeführt. Zehn Mikrogramm DNA aus Human-Leukozyten, Maniatis et al. (1982), wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen HindIII, PvuII, EcoRI, BamHI und BgIII, verdaut und dann einer Elektrophorese durch 0,8% (Gew./Vol.) Agarosegels bei 20-25 Volt in einem Puffer enthaltend 0,089 M Tris-borat, 0,089 M Borsäure und 0,001 M Na&sub2;-EDTA unterzogen. DNA-Fragmente wurden durch Blotten gemäß der von Southern (1975) beschriebenen Methode auf Nitrocellulosefilter transferiert. Vorhybridisierung der Filter, Hybridisierung mit radioaktiv markierten IGF-I-cDNA-Sonden, die, wie zuvor beschrieben, hergestellt worden waren, und Nachhybridisierungswascbungen erfolgten nach dem Verfahren von Wahl et al. (1979). Hybridisierungsbanden wurden mittels Autoradiographie nachgewiesen.
Eine Southern-Blot-Analyse wurde an 18 nicht verwandten Erwachsenen mit normalem Wuchs unter Verwendung von IGF-1A- und IGF-1B-cDNA-Sonden und den oben angeführten Restriktionsenzymen durchgeführt. Es wurde festgestellt, daß die von BeIl et al. (1985) berichtete Stellenpolymorphie für HindIII und PvuII miteinander verbunden sind und ausschließlich in der Nähe von Exon 5 des genomischen IGF-I-Gens kartiert sind.
Die vollständige genomische IGF-I-Gen-Sequenz ist in Fig. 4 dargestellt. Der in einer Ausrichtung sequenzierte Bereich von Exon 4 stimmt mit der entsprechenden cDNA Sequenz, die für das Carboxy-terminale Verlängerungspeptid von pIGF-1B kodiert, vollständig überein. Die DNA-Sequenz von Exon 5 stimmt mit der entsprechenden cDNA-Sequenz, die für das C-terminale Verlängerungspeptid von pIGF-1A kodiert, vollständig überein.
Durch Primer-Extension-Analyse unter Verwendung von Menschenleber-RNA und einem ³²P-markierten Oligonucleotid, 5'TGAGAGCAATGTCACATTTC3', wurde festgestellt, daß sich das 5'-Ende der ppIGF-I-mRNA 583 Nucleotide vor der Primärstelle an der Position 1108 erstreckt, Fig. 4. Wenn der 5'-nicht-translatierte Bereich des Gens kein Intron enthält, muß die Transkription an der Position 525 oder 526 beginnen, Fig. 4. Wenn ein Intron innerhalb des 5'-nicht-translatierten Bereichs enthalten ist, würde die Transkription höchstwahrscheinlich weiter vor den Positionen 525 oder 526 beginnen. Die in Fig. 2 gezeigte IGF-1B-cDNA erstreckt sich 182 Nucleotide 5' zum Translationsinitiierungscodon und enthält mehrere, davor befindliche Translationsterminationscodons in Phase, wie in Fig. 4 bezeichnet. Ein Bereich von 42 Nucleotiden weiter 5' an den Positionen 199 bis 241, Fig. 4, in der Sequenz enthält abwechselnd Purin- und Pyrimidin-Reste mit der Fähigkeit, Z-DNA zu bilden, was ein Anzeichen für aktiv transkribierte DNA ist, Nordheim und Rich (1983).

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Expression von IGF-1A- und IGF-1B- Vorläufer-Peptiden in vitro und die Fähigkeit des ersten Methionin-(ATG)-Codons im Leserahmen, den Start der ppIGF-I- Translation zu signalisieren.
Im vorliegenden Beispiel wurden Human-IFG-1A- und IGF-1B- cDNAs separat zu den Plasmiden pGEM1 und pGEM2 ligasiert, um rekombinante Plasmide zu schaffen, die eine IGF-I-cDNA mit ihrem 5'-Ende angrenzend an den in den pGEM-Plasmiden enthaltenen Bakteriophagen-T&sub7;-Promotor enthalten. Insbesondere wurde die IGF- 1A-cDNA zu einem zuvor mit EcoRI verdauten pGEM1-Plasmid ligiert. Die richtige Ausrichtung der IGF-1A-cDNA im rekombinanten Plasmid wurde durch Restriktionsendonucleaseanalyse unter Verwendung von BamHI bestätigt. IGF-1B-cDNA-enthaltende rekombinante pGEM2- Plasmide wurden durch Ligation einer RsaI-verdauten IGF-1B-cDNA, die einen EcoRI-Linker an ihrem 3'-Ende enthielt, zu einem zuvor mit EcoRI und HincII doppelt verdauten pGEM2-Plasmid konstruiert. Die richtige Ausrichtung der IGF-1B-cDNA in bezug auf den T&sup7;- Promotor im rekombinanten Plasmid wurde durch Verdau mit PstI bestätigt. Nach Isolierung der rekombinanten Plasmide, die als pGEM1/IGF-1A bzw. pGEM2/IGF-1B bezeichnet wurden, wurde jedes Plasmid am 3'-Ende der entsprechenden IGF-1 DNA-Sequenzen unter Verwendung der Enzyme HindIII bzw. EcoRI linearisiert. Komplementäre RNAs, die als IGF-1A-cRNA und IGF-1B-cRNA bezeichnet wurden, wurden durch Transkription in vitro unter Verwendung von T&sub7;-RNA- Polymerase (Davanloo et al., 1984), gemäß der Methode von Melton et al. (1984) hergestellt. Um die Wirksamkeit einer nachfolgenden Translation zu erhöhen, wurde jede RNA ko-transkriptionell gecapt, wobei man dem Verfahren von Hart et al. (1985) folgte. Gecapte IGF-1A- und IGF-1B-cRNAs der gesamten Länge wurden in vitro unter Verwendung von sowohl Weizenkeim- als auch Kaninchen-Reticulozyten-Lysaten (Pelham und Jackson, 1976), in Anwesenheit von Methionin oder ³H-Leucin und den 19 übrigen nicht-markierten Aminosäuren mit äquivalenten Ergebnissen translatiert. Die primären Translationsprodukte wurden mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese (Laemmli, 1970) in 12% (Gew./Vol.) oder 15% (Gew./Vol.) Acrylamid, gefolgt von Autoradiographie, beurteilt. Das experimentell bestimmte primäre IGF-1A-Translationsprodukt zeigte eine Mobilität von etwa 17.000 Dalton in ausgezeichneter Übereinstimmung mit dem vorausgesagten Molekulargewicht des Vorläufers mit 153 Aminosäuren, 17.026 Dalton. Zusätzlich wurde die in vitrosynthetisierte Amino-terminale Aminosäuresequenz dieses IGF-1A- Peptids bestimmt, und sie stimmte mit der Sequenz des aus der IGF- 1A-cDNA vorhergesagten primären Translationsprodukts vollständig überein. Die Translation beginnt somit mit dem ersten Methionin- Codon im Leserahmen (z. B. Basenpaare 59-61 für IGF-1A, Fig. 5) und nicht an den Methioninresten 24 oder 27 (z. B. Basenpaare 128-130 bzw. 137-139, vgl. Fig. 5). IGF-1A wurde so als ein Vorläufer mit 153 Aminosäuren synthetisiert. Auf ähnliche Weise wanderte das experimentell festgestellte primäre IGF-1B-Translationsprodukt auf einem Polyacrylamidgel mit einer Mobilität von etwa 22.000 Dalton, also in ausgezeichneter Übereinstimmung mit dem vorhergesagten Molekulargewicht des IGF-1B mit 195 Aminosäuren, 21.841 Dalton, wie durch die IGF-1B-cDNA-Sequenz definiert. So wurde IGF-1B als ein 195-Aminosäurenmolekül hergestellt, welches dem Protein entsprach, das in der synthetischen DNA und im im wesentlichen reinen IGF-I-Gen der vorliegenden Erfindung kodiert war.
Verschiedene andere Beispiele sind für den Fachmann nach Lesen der vorliegenden Offenbarung offensichtlich, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzugehen, und alle diese anderen Beispiele sollen im Umfang der beigefügten Ansprüche mit eingeschlossen sein.
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Claims

1. Synthetische DNA-Sequenz, die für ein Präproinsulin-artiges Wachstumsfaktor-I Protein kodiert, das die in Fig. 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

2. Synthethische DNA-Sequenz, die die in Fig. 2 gezeigte Nucleotidsequenz von etwa Nucleotid 1 bis etwa Nucleotid 1136 aufweist.

3. Synthetische DNA-Sequenz, die die in Fig. 2 gezeigte Nucleotidsequenz von etwa Nucleotid 183 bis etwa Nucleotid 767 aufweist.

4. Synthetische DNA-Sequenz, die für ein reifes Human-IGF-I- Peptid kodiert, das an seinem Carboxy-Ende direkt mit dem Aminoterminus eines Peptids verbunden ist, das die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

NH&sub2;-Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gin Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys Glu Gli Arg Arg Glu Ile Giy Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys Lys Gly Lys-COOH.

5. DNA-Sequenz nach Anspruch 4, die die in Fig. 2 gezeigte Nucleotidsequenz von etwa Nucleotid 327 bis etwa Nucleotid 767 aufweist.

6. Synthetische DNA-Sequenz, die für ein Peptid kodiert, welches folgende Aminosäuresequenz aufweist:

NH&sub2; Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys Lys Gly Lys-COOH.

7. DNA-Sequenz nach Anspruch 6, die die in Fig. 2 gezeigte Nucleotidsequenz von etwa Nucleotid 537 bis etwa Nucleotid 767 aufweist.

8. Synthetische DNA-Sequenz, die für ein Peptid kodiert, welches folgende Aminosäuresequenz aufweist:

NH&sub2;-Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys Lys Gly Lys-COOH.

9. DNA-Sequenz nach Anspruch 8, die die folgende Nucleotidsequenz aufweist:

10. DNA-Sequenz, die für einen Präproinsulin-artigen Wachstumsfaktor-I kodiert, welcher die in Fig. 6 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

11. Im wesentlichen reines Präproinsulin-artiges Wachstumsfaktor-I-Protein, das die in Fig. 6 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

12. Im wesentlichen reines reifes Humaninsulin-artiges wachstumsfaktor-I-Peptid, das an seinem Carboxyende direkt mit dem Amino-Terminus eines Peptids verbunden ist, welches die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

NH&sub2;-Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys Glu Gen Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys Lys Gly Lys-COOH.

13. Im wesentlichen reines Verlängerungs-Peptid für IGF-I, das die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

NH&sub2;-Arg Ser Val Arg Aia Gin Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gin Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gin Ile Arg Gly Lys Lys Lys Giu Gin Arg Arg Giu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys Lys Gly Lys-COOH.

14. Im wesentlichen reines Verlängerungs-Peptid für IGF-I, das die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

NR&sub2;-Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys Lys Gly Lys-COOH.

15. Intron-freie DNA-Sequenz, die für das Peptid nach Anspruch 12 kodiert.

16. Intron-freie DNA-Sequenz, die für das Verlängerungs-Peptid nach Anspruch 13 kodiert.

17. Intron-freie DNA-Sequenz, die für das Verlängerungs-Peptid nach Anspruch 14 kodiert.

18. Rekombinanter DNA-Vektor, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für das Protein nach Anspruch 11 kodiert.

19. Rekombinanter DNA-Vektor, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Protein nach Anspruch 12, dem Protein nach Anspruch 13 und dem Protein nach Anspruch 14.

20. Verfahren zur Wachstumsförderung bei einem Tier, bei welchem ein wie in Anspruch 11 definiertes Protein an ein Tier verabreicht wird.

21. Verfahren zur Verbesserung der Milchbildung bei einer Kuh, bei welchem ein wie in Anspruch 11 definiertes Protein an die Kuh verabreicht wird.

22. Therapeutische Zusammensetzung zur Wachstumsförderung, die eine therapeutisch wirksame Menge des Proteins nach Anspruch 11 und ein pharmazeutisch akzeptables Träger- oder Verdünnungsmittel umfaßt.

23. Therapeutische Zusammensetzung zur Verbesserung der Milchbildung bei einer Kuh, die eine therapeutisch wirksame Menge des Proteins nach Anspruch 11 und ein pharmazeutisch akzeptables Träger- oder Verdünnungsmittel umfaßt.

24. Im wesentlichen reines DNA-Molekül, das die Nucleotidsequenz des IGF-I-Gen-Exon 4, wie in Fig. 4 dargestellt, umfaßt.