DE69128754T2 - Merschliches CNP-Gen und Vorläufer protein - Google Patents
Merschliches CNP-Gen und Vorläufer proteinInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft das Gen eines menschlichen CNP (menschliches natriuretisches Peptid des C-Typs, das hier als hCNP abgekürzt ist) sowie das durch dieses Gen codierte hCNP-Vorläuferprotein (prepro hCNP).
- In den letzten Jahren sind verschiedene Peptide, die insgesamt als "natriuretische Peptide" (NP) bezeichnet werden, aus Atria und Gehirnen verschiedener Tiere isoliert worden. Heute können diese NPs in drei Typen klassifiziert werden, dem natriuretischen Peptid des A-Typs (ANP), dem natriuretischen Peptid des B-Typs (BNP) und dem natriuretischen Peptid des C-Typs (CNP), wobei dies von der Ähnlichkeit der primären Aminosäuresequenz und der Struktur dieser Vorläufer abhängt. Unter diesen drei Typen wurden zuerst ANP und BNP aus dem Atrium und Gehirn isoliert und identifiziert und werden daher manchmal als "atriales natriuretisches Peptid" beziehungsweise "Gehirn-natriuretisches Peptid" bezeichnet (Matsuo, H. und Nakazato, H., Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 16, 43, 1987; Sudoh, T. et al., Nature 332, 78, 1988). Es ist heute jedoch bekannt, daß ANP nicht nur im Atrium, sondern auch im Gehirn und BNP nicht nur im Gehirn, sondern auch im Atrium vorkommt. Außerdem entfalten ANP und BNP wesentliche natriuretische und hypotensive Wirkungen, so daß deutlich wurde, daß jedes dieser Peptide nicht nur als Hormon aus dem Atrium in das Blut abgesondert wird, sondern auch als Nerventransmitter im Blut wirkt, wobei sie in beiden Fällen dazu beitragen, das homeostatische Gleichgewicht des Körperflüssigkeitsvolumens und den Blutdruck in Säugern zu regulieren.
- CNP wurde erst kürzlich von Sudoh et al. als dritter NP-Typ, der weder ANP noch BNP zugeordnet werden kann, aus dem Hirn von Schweinen isoliert und identifiziert (Sudoh, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 168, 863, 1990). Das zuerst entdeckte CNP bestand aus 22 Aminosäureresten (dieses Peptid ist hier als "pCNP-22" bezeichnet). Wie ANP und BNP enthält CNP zwei Cysteinreste, die eine intramolekulare Disulfidbindung bilden, wobei ein Ring, bestehend aus 17 Aminosäureresten, hergestellt wird. Außerdem wurde festgestellt, das die primäre Aminosäuresequenz, die in pCNP-22 die Ringstruktur bildet, mit denen in ANP und BNP hoch homolog ist.
- pCNP-22 unterscheidet sich jedoch von ANP und BNP, dadurch, daß die letzteren verschiedene Aminosäurereste zusätzlich an den C-Terminus der Ringstruktur gebunden haben, während eine solche "Endstruktur" in pCNP-22 nicht vorhanden ist. Mit anderen Worten endet der C-Terminus von pCNP-22 mit einem Gysteinrest. Auf der Basis dieser Tatsachen wurde festgestellt, daß die Struktur von pCNP-22 ähnlich, aber eindeutig unterschiedlich zu denen von ANP und BNP ist. Außerdem entfaltete pCNP-22 natriuretische und hypotensive Wirkungen und es wurde daher festgestellt, daß es eine höhere Aktivität als ANP und BNP in relaxierenden Aktivitätsuntersuchungen in Stuhlproben von Hühnern aufzeigte. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde festgestellt, daß pCNP-22 einem neuen NP-Typ angehört, dessen Peptide als "CNPs" bezeichnet wurden.
- Im Anschluß an pCNP-22 wurde von den Erfindern ein zweites als CNP bezeichnetes Peptid aus dem Hirn von Schweinen isoliert und identifiziert. Es wurde festgestellt, daß das Peptid aus 53 Aminosäureresten besteht, wobei pCNP-22 an dem C-Terminus vorhanden ist (dieses Peptid ist hier als pCNP-53 abgekürzt). Mit anderen Worten wurde festgestellt, daß pCNP-53 ein Peptid ist, das 31 weitere Aminosäurereste am C-Terminus von pCNP-22 gebunden hat. Interessant ist, daß pCNP-53 in größeren Mengen als pCNP-22 in dem Hirn von Schweinen auftritt (gewöhnlich aufgeführt: japanische Patentanmeldung Nr. 186582/1990).
- Eine andere kürzlich durchgeführte Studie identifizierte durch Genanalyse erfolgreich die Struktur des Vorläufers von pCNP-22 und pCNP-53 und dies trug dazu bei, den Mechanismus, der hinter der Biosynthese dieser Peptide steht, aufzuklären (Europäische Patentanmeldung Nr. 91 111 630.0). Die Erfinder isolierten und identifizierten ein Schweine-chromosomales Gen und die cDNA, die für pCNP-22 und pCNP-53 codiert; durch ihre Analysen wurde die Struktur des Schweine-CNP Vorläuferproteins (prepro pCNP) aufgeklärt; zur gleichen Zeit wurde festgestellt, daß sowohl pCNP-22 als auch pCNP-53 zuerst von mRNA als ein prepro pCNP, bestehend aus 126 Aminosäureresten translatiert wird und daß das in dem N-terminalen Bereich des Vorläuferproteins vorhandene Signalpeptid anschließend in dem Sekretionsverfahren abgespalten wird, was zur Umwandlung zu pCNP führt, das wiederum spezifisch durch prozessierende Enzyme gespalten und wie geeignet in pCNP- 53 oder pCNP-22 umgewandelt wird. Auf der Basis dieser Beobachtungen wurde festgestellt, daß in dem Fall von ANP und BNP, sowohl pCNP-22 als auch pCNP-53 Sekretpeptide sind, die von einem gemeinen Vorläuferprotein biosynthetisiert werden (prepro pCNP).
- In starkem Kontrast zu den zu ANP und BNP gehörenden Peptiden, über die in vorherigen Studien festgestellt wurde, daß sie nicht nur als Hormone aus dem Atrium in das Blut abgesondert werden, sondern auch als Nerventransmitter im Gehirn wirken, wodurch sie das homeostatische Gleichgewicht des Körperflüssigkeitsvolumens und den Blutdruck regulieren, bleibt CNP in vielen Punkten hinsichtlich der Details über seine Verbreitung in vivo und seine physiologischen Wirkungen unaufgeklärt.
- Was ANP und BNP betrifft, sind ihre Strukturen im Menschen nachgewiesen worden und Anstrengungen, sie als Pharmazeutika zu verwenden, sind im Gange. Bis jetzt ist die Struktur von CNP noch nicht im Menschen identifiziert worden.
- Ein natriuretisches Peptid des C-Typs (CNP-22) sowie eine N-terminale erweiterte Form davon (CNP-53), wie in dem Hirn von Schweinen identifiziert, ist in Biochem. Biophys. Res. Comm., Bd. 168, S. 863-870 beschrieben worden.
- Figur 1zeigt die Restriktionsenzymkarte für hgEco-2 und hgEco-1, sowie die Strategie für die Bestimmung der Basensequenz;
- Figur 2zeigt die DNA-Basensequenz von hgEco-3, die für das hCNP- Vorläuferprotein codiert, sowie die Aminosäuresequenz des hCNP-Vorläuferproteins, das durch die Exone im Strukturgenbereich codiert wird; und
- Figur 3zeigt die ganze Basensequenz der hCNP-cDNA, sowie die Aminosäuresequenz des hCNP-Vorläuferproteins, das durch sie codiert ist.
- In Anbetracht dessen, daß sowohl die Aminosäuresequenz von ANP als auch die Basensequenz, die diese codiert, mit hoher Homologie über die Tierarten beibehalten wird, nahmen die Erfinder an, daß mit großer Wahrscheinlichkeit diese Situation auch bei CNP der Fall ist. Außerdem, in Anbetracht dessen, daß CNP in dem Hirn von Schweinen in viel kleineren Mengen als ANP und BNP vorkommt und daß das Hirngewebe für die Herstellung dieser Peptide noch zu identifizieren ist, dachten die Anmelder, daß es schwierig sein wird, das CNP-Peptid direkt aus menschlichem Hirn zu identifizieren, und daß es auch schwierig sein wird zur Identifikation von menschlichen CNPs die cDNA zu isolieren und analysieren. Auf Basis dieser Annahmen entwarfen die Erfinder ein Verfahren, durch das das menschliche CNP-Gen unter Verwendung einer Sonde, die vorher vom Schweine-CNP-Gen oder cCNP erhalten wurde, isoliert wurde; und das isolierte menschliche CNP-Gen wurde zur Identifizierung der Struktur des menschlichen CNP-Vorläuferproteins sowie auch der Strukturen der menschlichen CNPs, die pCNP-53 und pCNP-22 entsprechen, untersucht.
- Gemäß diesen Verfahrens schnitten die Erfinder durch Behandeln mit einem Restriktionsenzym DdeI zuerst ein DNA-Fragment von ca. 70 Basen (pC cDNA) aus der pCNP cDNA (siehe Europäische Patentanmeldung Nr. 91 111 630.9) aus und verwendeten dieses Fragment als Sonde. Die Sonde kann auch chemisch synthetisiert werden. Unter Verwendung dieser Sonde haben die Erfinder eine menschliche chromosomale Genbibliothek (λ-Phagenvektor, in dem ein menschliches chromosomales Genfragment eingefügt ist) gescreent. Die menschliche chromosomale Genbibliothek kann leicht durch den Fachmann hergestellt werden oder alternativ ist sie im Handel von Clonetech Co. erhältlich. Als Ergebnis wurde eine klonhybridisierende pC cDNA erhalten. Die Analyse dieses Klons (λhCNP2) zeigte, daß er ca. 15 kbp des menschlichen chromosomalen Gens aufwies und daß ein EcoRI DNA-Fragment (hgEco-2), umfassend ca. 2 kbp der 15 kbp, mit der pC cDNA-Sonde hybridisierte. Durch Untersuchung dieses hgEco-2, umfassend ca. 2 kbp, wurde deutlich, daß dieses DNA-Fragment ein Teil des hCNP-Gens enthält (für die Restriktionsenzymkarte für hgEco-2 und die Strategie für die Basensequenzbestimmung siehe Figur 1).
- Im nächsten Schritt haben die Erfinder im Hinblick auf die Identifizierung der gesamten Struktur des hCNP-Vorläuferproteins die menschliche chromosomale Genbibliothek wieder unter Verwendung von hgEco-2 als Sonde gescreent. Als Ergebnis wurde ein Klon, der mit der hgEco-2-Sonde hybridisierte, erhalten. Analyse dieses Klons (λhCNP1) bestätigte, daß er ein menschliches chromosomales Gen von 15 kbp und mehr enthält und daß ein EcoRI-Fragment (hgEco-1) dieses Klons, das ca. 4 kbp umfaßt, mit der hgEco- 2-Sonde hybridisierte.
- Die Erfinder haben anschließend eine Restriktionsenzymkarte für das hgEco-1-Fragment konstruiert und diese mit der schon konstruierten Karte für hgEco-2 (siehe Figur 1) verglichen. Folglich wurde offensichtlich, daß hgEco-1 eine DNA war, die zusätzlich an der 5'-Stelle von hgEco-2 ein menschliches chromosomales Gen von ca. 2kbp gebunden hatte. Basierend auf dieser Feststellung bestimmten die Erfinder die Basensequenz des DNA-Fragments von Interesse (zur Strategie für die Basensequenzbestimmung von hgEco-1 siehe Figur 1). Folglich wurde festgestellt, daß, wie in Figur 2 gezeigt, hgEco-1 nicht nur ein Strukturgen, das für die gesamte Aminosäuresequenz des menschlichen CNP-Vorläuferproteins codiert, sondern auch den Promotorbereich des menschlichen CNP-Gens enthält.
- Zunächst ist zu dem Promotorbereich zu sagen, daß eine TATA-Box, die von den Promotorbereichen eukaryontischer Gene geteilt wird, in den Positionen 1546-1551 der DNA-Basensequenz, die in Figur 2 gezeigt ist, vorhanden ist und es wurde auch festgestellt, daß zwei GC-Boxen und eine Y-Box stromaufwärts der TATA-Box liegen, wobei beide voraussichtlich an der Kontrolle der Genexpression teilnehmen. Basierend auf diesen Tatsachen schlußfolgerten die Erfinder, daß der Bereich von Interesse der Promotorbereich des CNP-Vorläufergens ist.
- Zum Strukturgenbereich ist zu sagen, daß ATG stromabwärts (auf der 3'- Seite) der TATA-Box in den Positionen 172-174 der Basensequenz vorhanden war. Da dieses ATG das erste Methionin-Codon ist, das stromaufwärts (auf der 3'-Seite) der TATA-Box auftritt, und da die Basensequenz um das Codon herum in Übereinstimmung mit der Consensus-Sequenz eines Translationsstartcodons, A/G NNATG (N bedeutet entweder A, T, G oder C) ist, von der bekannt ist, daß sie in Eukaryonten vorhanden ist, nahmen die Erfinder an, daß das ATG von Interesse ein Translationsstartcodon für den menschlichen CNP-Vorläufer ist. Ein Vergleich mit der bereits identifizierten Struktur des Schweine-CNP chromosomalen Gens zeigt, daß, wenn angenommen wird, daß dieses ATG ein Translationsstartcodon ist, der Bereich bis zu dem Codon (AAG) des Leucin-Rests, der in den Positionen 1809-1811 der Basensequenz vorkommt, dem ersten Exon entspricht. Ein ähnlicher Vergleich zeigte außerdem, daß das zweite Exon mit dem Codon (GTC) des Valinrestes, der in den Position 2226-2258 der Basensequenz vorkommt, beginnt. Das untersuchte hgEco-2 ist ein DNA-Fragment, das für den Bereich des zweiten Exons in Position 2286 aufwärts der Basensequenz codiert. Diese Tatsachen werden auch durch das Folgende unterstützt: Basensequenzen ähnlich zu C/A AGGT und A/G AT, die als die Consensussequenzen eines Splicedonors bekannt sind, sind in der Nachbarschaft der Position 1810 der Basensequenz vorhanden; und eine Basensequenz ähnlich zu (Py)nNC/T AGG (Py bedeutet den Pyridinrest und N bedeutet entweder A, T, C oder G), die als Consensussequenz eines Spliceakzeptors bekannt ist, ist an der 5'-Seite der Position 2256 der Basensequenz vorhanden. Basierend auf diesen Beobachtungen nahmen die Erfinder an, daß der DNA-Bereich in den Positionen 1812-2255 der Basensequenz ein Intron ist und daß dieses Intron durch Splicen während der Bildung einer reifen mRNA, die für das hCNP-Vorläuferprotein codiert, entfernt wird. Mit anderen Worten wurde deutlich, daß das hCNP-Vorläuferprotein durch das erste Exon, das an der Position 1722 der Basensequenz beginnt und an der Position 1811 endet und auch durch das zweite Exon, das an der Position 2256 beginnt, codiert wurde und daß dieses Vorläuferprotein, wie im Schwein, ein Polypeptid ist, das gänzlich aus 126 Aminosäureresten zusammengesetzt ist.
- Das so identifizierte hCNP-Vorläuferprotein (das hier als das "prepro hCNP" bezeichnet wird) wurde in seiner primären Aminosäuresequenz mit der des pCNP-Vorläuferproteins verglichen. Es wurde festgestellt, daß die beiden Vorläuferproteine identisch sind, außer den Unterschieden in fünf Positionen der Aminosäuresequenz (Positionen 37, 40, 56, 90 und 101 der primären Aminosäuresequenz von prepro hCNP, die in Figur 3 gezeigt ist). Besonders interessant ist, daß die folgenden zwei Aminosäuresequenzen in Menschen und Schweinen vollständig die gleichen sind: Die primäre Aminosäuresequenz des Signalpeptids, die im N-terminalen Bereich von prepro CNP vorkommt, und von der bereits festgestellt wurde, daß sie am Mechanismus der Biosynthese von Schweine-CNP durch Sekretion des CNP-Vorläuferproteins teilnimmt; und die Aminosäuresequenz im Bereich in der Nähe des N-Terminus von CNP-22 und CNP-53, die während der Bildung von CNP-22 und CNP-53 aus prepro CNP durch prozessierende Enzyme erkannt und gespalten wird.
- Unter Berücksichtigung der oben diskutierten Tatsachen wird das menschliche CNP vermutlich durch den folgenden Weg biosynthetisiert, der ähnlich zu dem ist, der mit Schweinen assoziiert ist. Zunächst wird prepro-hCNP, umfassend 126 Aminosäurereste, durch mRNA translatiert. Anschließend wird das Signalpeptid, das im N-terminalen Bereich von preprohCNP vorhanden ist, im Verlauf der Sekretion zur Umwandlung zu pro-hCNP gespalten. Außerdem wird pro-hCNP durch prozessierende Enzyme an spezifischen Positionen gespalten (zwischen den Positionen 73 und 74 der primären Aminosäuresequenz, die in Figur 3 gezeigt ist, und zwischen den Positionen 104 und 105 der gleichen Aminosäuresequenz), wobei es durch Spaltung in menschliches CNP-53 (Positionen 74-126 der primären Aminosäuresequenz, die in Figur 3 gezeigt ist, das pCNP-53 entspricht, sowie auch in menschliches CNP-22 (Positionen 105-126 der gleichen Sequenz), das pCNP-22 entspricht) umgewandelt wird. Im Hinblick auf hCNP-22 ist seine primäre Aminosäuresequenz vollständig zu der von pCNP-22 identisch, daher gibt es keinen Zweifel daran, daß es die gleichen physiologischen Aktivitäten wie pCNP-22 (z.B. natriuretische und hypotensive Wirkungen) entfaltet.
- Auf der anderen Seite unterscheidet sich die hCNP-53 Aminosäuresequenz von der pCNP-53 in zwei Positionen (Positionen 90 und 101 der primären Aminosäuresequenz, die in Figur 3 gezeigt ist); daher ist hCNP-53 ein neues Peptid und seine physiologischen Wirkungen sind nicht bekannt. Folglich synthetisierten die Erfinder chemisch hCNP-53 und untersuchten die physiologischen Aktivitäten dieses neuen Peptids. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß hCNP-53 eine Rektum-relaxierende Wirkung am Huhnmodel zeigte; zur gleichen Zeit zeigte es, wenn es an Ratten verabreicht wurde, deutliche natriuretische und hypotensive Wirkungen.
- Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die Erfinder ein chromosomales Gen, das für das hCNP-Vorläuferprotein codiert, isolierten und daß sie es untersuchten, um seine primäre Aminosäuresequenz zu identifizieren. Folglich identifizierten sie erfolgreich die Struktur von menschlichen CNPs (hCNP-22 und hCNP-53, entsprechend pCNP-22 und pCNP-53). Zur gleichen Zeit synthetisierten sie chemisch hCNP-53 und belegten seine physiologischen Aktivitäten. Diese Erfindung wurde unter diesen Umständen vollendet.
- Es ist hier zu bemerken, daß, wenn das hCNP chromosomale Gen dieser Erfindung in eine geeignete Säugerzelle (z.B. COS-Zelle, die von Affennierenzellen abstammt) entweder direkt oder, da es an einem Bereich stromabwärts eines geeigneten Promotors (z.B. des Anfangspromotors von SV 40) gebunden ist, indirekt transduziert wird, kann hCNP cDNA erhalten werden und diese Tatsache liegt innerhalb des Umfangs dieser Erfindung (siehe Europäische Patentanmeldung Nr. 91 111 630.9).
- Die gesamte Basensequenz der so erhaltenen hCNP cDNA und die durch diese cDNA codierte primäre Aminosäuresequenz des hCNP-Vorläuferproteins sind in Figur 3 gezeigt.
- Die folgenden Beispiele werden zum Zweck der weiteren Darstellung dieser Erfindung zur Verfügung gestellt, sind aber keinesfalls als darauf begrenzt anzusehen.
- Die DNA-Sonde (PC cDNA), die für das Klonieren eines chromosomalen Gens, das das menschliche CNP-Vorläuferprotein codiert, verwendet wird, wurde durch das Verfahren, das aus der Spaltung der Schweine-CNP cDNA mit einem Restriktionsenzym Ddei besteht, hergestellt (siehe Europäische Patentanmeldung Nr. 91 111 630.9), wodurch ein DNA-Fragment von 700 bp isoliert wurde, woraufhin die DNA mit [α-³²p] dCTP durch Nick-Translation markiert wurde.
- Der von LE 392 abstammende E. coli Stamm K12 wurde mit einer menschlichen chromosomalen Genphagen-DNA-Bibliothek, die bei 4ºC aufbewahrt wurde, infiziert. Die Zellen wurden auf LB Medium plattiert (10 g, Bactytrypton; 5 g, Hefeextrakt; 5g, NaCl; 1,5 %, Bactoagar; Gesamtvolumen, 1 l) und über Nacht bei 37ºC kultiviert. Die Platte wurde bei 4ºC für 30 Minuten gekühlt und ein Nitrozellulosefilter (Erzeugnis von Schleicher & Schnell Co.) wurde auf dem Phagenplaque für 5 Minuten liegen gelassen. Anschließend wurde der Filter von der Platte abgelöst, in der Luft getrocknet, für 1 Minute in eine alkalische Zersetzungslösung (0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl) und anschließend für 1 Minute in eine Neutralisationslösung (0,5 M Tris-HCl; pH 7,0; 1,5 M NaCl) eingetaucht. Danach wurde der Nitrozellulosefilter mit einer 3 x SSC Lösung (20 x SSC NaCl; 175,3 g; Trinatriumcitrat, 88,2 g; Gesamtvolumen, 1 l) gewaschen, in der Luft getrocknet und unter Vakuum bei 80ºC für 120 Minuten wärmebehandelt.
- Unter Verwendung des so hergestellten Nitrozellulosefilters wurde unter den folgenden Bedingungen Plaquehybridisierung durchgeführt. Zunächst wurde ein Prähybridisierungslösung [3 x SEC, 1 x Denhardt's Lösung (bestehend aus Albumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll, wobei jedes 0,2 mg/l wiegt); Lachsspermien-DNA, 50 µg/ml; 0,1% SDS] zu dem Nitrozellulosefilter gegeben und Prähybridisierung wurde bei 60ºC für 3 Stunden durchgeführt. Anschließend wurde unter Verwendung von 106 cpm der pC cDNA- Sonde und 1 ml der Prähybridisierungslösung für 2 Blätter des Nitrozellulosefilters über Nacht bei 60ºC Hybridisierung durchgeführt. Anschließend wurde der Filter dreimal mit einer 3 x SEC-Lösung, enthaltend 0,1 % SDS, gewaschen, wobei jedes Waschen bei 60ºC für 30 Minuten erfolgte; der gewaschene Filter wurde in der Luft getrocknet und eine Autoradiographie bei -80ºC für 24 Stunden durchgeführt. Durch Screenen von ca. 2 x 10&sup5; Klonen auf diese Weise wurde ein Klon, der mit der pC cDNA-Eonde hybridisierte, erhalten. Dieser Klon wurde "λhCNP2" genannt und die in den folgenden Schritten beschriebene Analyse wurde durchgeführt.
- Die DNA wurde aus dem λhCNP2-Phagen auf gewöhnliche Weise hergestellt. Anschließend wurde die Phagen-DNA mit einem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und das resultierende DNA-Fragment wurde durch Elektrophorese auf einem Agarosegel getrennt und untersucht. Es wurde festgestellt, daß λhCNP2 ein Phage ist, der ein ca. 15 kbp menschliches chromosomales Gen enthält. Die Analyse durch Southern Blotting unter Verwendung der pC cDNA-Sonde zeigte, daß das EcoRI-Fragment von hCNP-2 (hgEco-2) mit einer Länge von ca. 2 kbp mit der pC cDNA-Sonde hybridisierte.
- Um die Basensequenz des hgEco-2 Fragments zu bestimmen wurde das letztere zunächst zur Herstellung von pUC hCNP-2 an der EcoRI Stelle subkloniert in einen Plasmidvektor pUC 18 (Takara Shuzo Co., Ltd.). puC hCNP wurde anschließend mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten und das resultierende DNA-Fragment wurde in einen M13 Phagen subkloniert. Die Basensequenz des hgEco-2 DNA-Fragments wurde durch das Didesoxyverfahren bestimmt.
- Als Ergebnis wurde festgestellt, daß das DNA-Fragment von Interesse ein Teil des menschlichen CNP-Gens codiert.
- Unter Verwendung des Nitrozellulosefilters, der durch das Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, konditioniert wurde, wurde Plaquehybridisierung unter den Bedingungen, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die zu verwendende Sonde wurde durch Markieren mit [α-³²P] dCTP von hCNP-2, das von hgEco-2 (ca. 2 kbp) abstammt, durch Nick-Translation hergestellt. Die so hergestellte Sonde ist hier als hgEco-2 DNA bezeichnet.
- Zunächst wurde eine Prähybridisierungslösung [3 x SSC; 1 x Denhardt's Lösung (bestehend aus Albumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll, wobei jedes 0,2 mg/l wiegt); Lachsspermien-DNA, 50 µg/ml und 0,1 % SDS] zu dem Nitrozellulosefilter gegeben und Prähybridisierung wurde bei 65ºC für 3 Stunden durchgeführt. Anschließend unter Verwendung von 10&sup6; cmp der hgEco-2 DNA- Sonde und 1 ml der Prähybridisierungslösung für 2 Blätter des Nitrozellulosefilters wurde Hybridisierung über Nacht bei 65ºC durchgeführt. Anschließend wurde der Filter dreimal mit einer 3 x SSC-Lösung, enthaltend 0,1 % SDS, gewaschen, wobei jedes Waschen bei 65ºC für 30 Minuten erfolgte; der gewaschenen Filter wurde in der Luft getrocknet und eine Autoradiographie bei -60ºC für 24 Stunden durchgeführt. Durch Screenen von ca. 5 x 10&sup5; Klonen auf diese Weise wurden fünf Klone, die mit der pC cDNA-Eonde hybridisierten, erhalten. Einer dieser Klon wurde "λhCNP1" genannt und die in den folgenden Schritten beschriebene Analyse wurde durchgeführt.
- Die DNA wurde von dem λhCNP1-Phagen auf gewöhnliche Weise hergestellt. Anschließend wurde die Phagen-DNA mit einem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und das resultierende DNA-Fragment wurde durch Elektrophorese auf einem Agarosegel getrennt und untersucht. Folglich wurde festgestellt, daß λhCNP1 ein Phage ist, der ein menschliches chromosomales Gen von ca. 15 kbp oder mehr enthält. Die Analyse durch Southern Blotting unter Verwendung der hgEco-2 DNA-Sonde zeigte, daß das EcoRI-DNA-Fragment (hgEco-1) von ca. 4 kbp mit der hgEco-2-Eonde hybridisierte. Folglich wurde die Basensequenz dieses DNA-Fragments, das mit dem hgEco-2-DNA-Fragment hybridisierte, durch das folgende Verfahren bestimmt.
- Um die Basensequenz des hgEco-1-Fragments zu bestimmen, wurde das letztere zur Herstellung von pUC hCNP-1 an der EcoRI Stelle in einen Plasmidvektor pUC 118 (Takara Shuzo Co., Ltd.) subkioniert. DaS puc hCNP1 wurde anschließend mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten und das resultierende DNA-Fragment wurde in einen M13 Phagen subkloniert. Die Basensequenz des DNA-Fragments von Interesse wurde durch das Didesoxyverfahren bestimmt. Der durch das oben beschriebene Verfahren bestimmte Bereich der Basensequenz ist durch ausgefüllte Pfeile in Figur 1 gezeigt.
- In einem getrennten Schritt zur Bestimmung des Basensequenz des niedrigeren Stranges des hgEco-1 DNA-Fragments (hgEco-1) wurde zur Herstellung von M13 hCNP-1 das letztere an der EcoRI Stelle in einen Phagenvektor M13 mp18 subkloniert. Anschließend, unter Verwendung dieser M13 hCNP-1 als Matrixe, wurde die Basensequenz des DNA-Fragments von Interesse durch das Didesoxyverfahren unter Verwendung eines universellen Primers und dem Oligonucleotidprimer, der chemisch auf Basis der bereits bestimmten Basensequenz synthetisiert wurde, bestimmt. Der so bestimmte Bereich ist durch gestrichelte Pfeile in Figur 1 gezeigt. Die durch das oben beschriebene Verfahren bestimmte Basensequenz wurde mit der Basensequenz des hgEco- 2 DNA-Fragments verbunden, um die gesamte Basensequenz des hgEco-1 DNA- Fragments zu vervollständigen. Die vollständige Basensequenz und die Aminosäuresequenz, die an der Exon-Etelle, wie von dieser Basensequenz vorhergesagt, codiert wird, sind in Figur 2 gezeigt.
- Die natriuretischen und hypotensiven Wirkungen von hCNP-53 wurden gemäß des Verfahrens von DeBold et al, das in Life Science 28, 89-94, 1981 beschrieben wird, gemessen. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß hCNP-53, wenn in einer Dosis von 100 nmol/kg verabreicht, die Urinclearance 2,5 x erhöht, während der Blutdruck 10 % verringert wird.
- Wie auf den vorgenannten Seiten beschrieben, isolierten die Erfinder einen Teil des hCNP-Gens aus einer menschlichen chromosomalen Genbibliothek unter Verwendung von pCNP cDNA als Sonde. Unter Verwendung des isolierten hCNP-Gens als Sonde wurde ein Gen, das für den gesamten Bereich des hCNP- Vorläufers codiert, erfolgreich isoliert. Das isolierte Gen enthielt auch den Promotorbereich von hCNP. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß ein Gen, das für CNP codiert, auch in Menschen so wie in Schweinen vorhanden ist. Außerdem wurde die gesamte Struktur des hCNP-Vorläuferproteins bestimmt. Wie in Schweinen war das hCNP-Vorläuferprotein aus 126 Aminosäureresten zusammengesetzt und enthielt am C-Terminus die Aminosäuresequenzen, die denen von dem Hirn von Schweinen isolierten pCNP-53 und pCNP-22 entsprechen. Da die Aminosäuresequenzen dieser Peptide an der Processing- Stelle in vollständiger Übereinstimmung zwischen Schweinen und Menschen waren, wurde vorhergesagt, daß diese Peptide auch in Menschen durch einen Weg, der ähnlich zu dem ist, der in Schweinen vorliegt,, biosynthetisiert werden können und daß sie auch als Hormone oder Nerventransmitter wirken, die das homeostatische Gleichgewicht des Körperflüssigkeitsvolumens und den Blutdruck in vivo steuern.
- Es ist insbesondere zu bemerken, daß in dieser Erfindung festgestellt wurde, daß hCNP-53 sich strukturell von pCNP-53 in zwei Positionen der Aminosäuresequenz unterscheidet. Die Erfinder synthetisierten daher hCNP- 53 chemisch und untersuchten seine physiologischen Aktivitäten in Bezug auf Rektum-relaxierende Wirkung am Huhnmodell, sowie seine natriuretischen und hypotensiven Wirkungen. Folglich erwies sich hCNP-53 als ein physiologisch aktives Peptid. Dies wird besondere Bedeutung im Hinblick auf die Verwendung dieser Peptide der CNP-Familie als Pharmazeutika haben. Zum Beispiel, wenn pCNP-53, das strukturell unterschiedlich zu hCNP-53 ist, als Pharmazeutikum verwendet wird, wird es vermutlich als Fremdmaterie im menschlichen Körper anerkannt und die Herstellung von Antikörpern verursachen. Als Konsequenz könnte die Aktivität von pCNP-53 neutralisiert oder Nephrotoxizität könnte durch einen Antigen-Antikörper-Komplex verursacht werden. Außerdem könnte pCNP-53 eine geringere Affinität für den CNP-Rezeptor menschlicher Zellen, als hCNP-53 besitzen, und, in diesem Fall, könnte die Wirkung von pCNP-53 als solches abgeschwächt werden. Diese Probleme kommen bei hCNP-53 nicht vor und das gleiche gilt auch für andere Peptide, die von dem hCNP-Vorläuferprotein biosynthetisiert werden können [zwischen den Positionen 24 und 102 der primären Aminosäuresequenz von prepro hCNP gibt es mindestens 9 Leucinreste (in den Positionen 24, 30, 51, 52, 55, 65, 89, 97 und 99) und mindestens 8 Argininreste (in den Positionen 33, 68,.70, 73, 76, 82, 87 und 96), und pro-hCNP kann in vivo durch prozessierende Enzyme an spezifischen Positionen an der C-terminalen Seite dieser basischen Aminosäurereste gespalten werden, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, daß in vivo solche Peptide, die zusätzliche Aminosäuren am N-Terminus von hCNP- 53 gebunden haben, vorkommen].
- Es wurde außerdem festgestellt, daß das Gen des hCNP-Vorläuferproteins, das in Figur 2 gezeigt ist, nicht nur den Strukturgenbereich, der für das Protein codiert, enthält sondern auch den Promotorbereich, der das Etrukturgen exprimiert. Durch Zusammenführen, zum Beispiel des CAT-Gens (Chloramphenicolacetyltransferase) an einen Bereich stromabwärts dieses Promotorbereichs und durch Transduzieren dieser Kombination in eine geeignete menschliche Zelle ist es möglich, den Mechanismus, der hinter der Regulation der hCNP-Expression steht, genau aufzuklären.
- Folglich werden die durch diese Erfindung erhaltenen Informationen bezüglich des chromosomalen Gens des hCNP-Vorläuferproteins und seiner primären Aminosäuresequenz einen großen Beitrag leisten nicht nur in Bezug auf zukünftige Studien zum Aufklären des Mechanismus, der hinter der Biosynthese steht und den physiologischen Wirkungen von CNPs im Menschen, sondern auch in Bezug auf Anstrengungen pharmazeutische Anwendungen dieser Peptide, die der CNP-Familie angehören, festzustellen.
Claims (8)
1. Polypeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz
2. Polypeptid gemäß Anspruch 1, dem ein Signalpeptid am N-Terminus
dieser Aminosäuresequenz fehlt und das die Aminosäuren Arg73 bis Cys126
umfaßt.
3. Polypeptid gemäß Anspruch 1, dem das Peptid am N-Terminus
fehlt, weil es zwischen irgendeinem der nebeneinanderliegenden
Aminosäureresten dieser Aminosäuresequenz an den Positionen 1 bis 73
gespalten ist.
4. DNA,
die für ein Polypeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz
codiert:
5. DNA gemäß Anspruch 4, die die folgende Basensequenz besitzt:
6. DNA, die für ein Polypeptid gemäß Anspruch 2 codiert.
7. DNA, die für ein Polypeptid gemäß Anspruch 3 codiert.
8. DNA mit der Basensequenz, die in Figur 2 gezeigt ist.
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