JPH04139199A - ヒトｃｎｐ遺伝子及び前駆体蛋白 - Google Patents
ヒトｃｎｐ遺伝子及び前駆体蛋白Info
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/12—Antidiuretics, e.g. drugs for diabetes insipidus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の分野］
本発明は、ヒトＣＮ Ｐ （ｈｕｍａｎ Ｃ−ｔｙｐｅ
ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ；ｈＣＮＰ
）の遺伝子及びこの遺伝子にコードされているｈＣＮＰ
前駆体タンパク（ｐｒｅｐｒｏｈｃＮＰ）に関する。
ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ；ｈＣＮＰ
）の遺伝子及びこの遺伝子にコードされているｈＣＮＰ
前駆体タンパク（ｐｒｅｐｒｏｈｃＮＰ）に関する。
［発明の背景］
近年、各種動物の心房及び脳から、ナトリウム利尿ペプ
チド（ｍｘｊｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ； Ｈ
Ｐ）と呼ばれる種々のペプチドが発見されてきた。現在
これらＮＰは、アミノ酸−次配列の類似性及びその前駆
体構造から、３つのタイプ、すなわちＡ型ＮＰ （Ａ−
ｔｙｐｅ ｎａｔｒｉｕｒｅ）ｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ；
ＡＮＰ） 、Ｂ型Ｎ Ｐ （Ｂ−ｔｙｐｅ ｎａｊｒ
ｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ； ＢＮＰ）及びＣ型
Ｎ Ｐ （Ｃ−ｔｙｐｅ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐ
ｅｐ目ｄｅ； ＣＮＰ）のいずれかに分類することがで
きる。このうち、ＡＮＰ −ＢＮＰは最初それぞれ心房
、脳から単離。
チド（ｍｘｊｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ； Ｈ
Ｐ）と呼ばれる種々のペプチドが発見されてきた。現在
これらＮＰは、アミノ酸−次配列の類似性及びその前駆
体構造から、３つのタイプ、すなわちＡ型ＮＰ （Ａ−
ｔｙｐｅ ｎａｔｒｉｕｒｅ）ｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ；
ＡＮＰ） 、Ｂ型Ｎ Ｐ （Ｂ−ｔｙｐｅ ｎａｊｒ
ｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ； ＢＮＰ）及びＣ型
Ｎ Ｐ （Ｃ−ｔｙｐｅ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐ
ｅｐ目ｄｅ； ＣＮＰ）のいずれかに分類することがで
きる。このうち、ＡＮＰ −ＢＮＰは最初それぞれ心房
、脳から単離。
同定されたことから、ＡＮＰは心房性ナトリウム利尿ペ
プチド（ａｔｒｉａｌ ｎｘｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅ
ｐｔｉｄｅ）、ＢＮＰは脳ナトリウム利尿ペプチド（ｂ
ｒｘｉｎ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）
とも呼ばれている（Ｍａｔｓｕｏ、［１゜ａｎｄ Ｎｘ
ｋａｚｚｔｏ、Ｈ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔｘｂ
、Ｃｌ１ｎ、Ｎｏｒｔｈ Ａｍ、、１６，４３，１９１
１７； ５ｕｄｏｈ、Ｔ、ｅｔ ａｌ、Ｎａｔａｒ
ｅ、３３２．）８，１９８８）。しかし、現在Ａ Ｎ
Ｐは心房のみならず脳にも存在していること、同様にＢ
ＮＰは脳のみならず心房にも存在していることが判って
きた。また、ＡＮＰ−ＢＮＰはいずれも顕著なナトリウ
ム利尿作用及び血圧降下作用を示すことから、ＡＮＰ
−ＢＮＰはいずれも心房から血中へ分泌されるホルモン
としてのみならず、脳内においては神経伝達物質として
も作用し、哺乳類の体液量及び血圧の恒常性を調節して
いることが明らかになってきｔこ。
プチド（ａｔｒｉａｌ ｎｘｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅ
ｐｔｉｄｅ）、ＢＮＰは脳ナトリウム利尿ペプチド（ｂ
ｒｘｉｎ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）
とも呼ばれている（Ｍａｔｓｕｏ、［１゜ａｎｄ Ｎｘ
ｋａｚｚｔｏ、Ｈ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔｘｂ
、Ｃｌ１ｎ、Ｎｏｒｔｈ Ａｍ、、１６，４３，１９１
１７； ５ｕｄｏｈ、Ｔ、ｅｔ ａｌ、Ｎａｔａｒ
ｅ、３３２．）８，１９８８）。しかし、現在Ａ Ｎ
Ｐは心房のみならず脳にも存在していること、同様にＢ
ＮＰは脳のみならず心房にも存在していることが判って
きた。また、ＡＮＰ−ＢＮＰはいずれも顕著なナトリウ
ム利尿作用及び血圧降下作用を示すことから、ＡＮＰ
−ＢＮＰはいずれも心房から血中へ分泌されるホルモン
としてのみならず、脳内においては神経伝達物質として
も作用し、哺乳類の体液量及び血圧の恒常性を調節して
いることが明らかになってきｔこ。
一方、ＧＮＰはごく最近５ｕｄｏｈらにより、ＡＮＰ
−ＢＮＰのいずれにも帰属されない第３のタイプに分類
されるＮＰとしてブタ脳から単離・同定された（Ｓｕｄ
ｏｈ、Ｔ、ｅ＋ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｂｙ
ｓ、Ｒｅｓ、Ｃ。
−ＢＮＰのいずれにも帰属されない第３のタイプに分類
されるＮＰとしてブタ脳から単離・同定された（Ｓｕｄ
ｏｈ、Ｔ、ｅ＋ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｂｙ
ｓ、Ｒｅｓ、Ｃ。
ｍｍｕｎ、、１６８，８６３．１９９０） 。すなわち
、まず最初に発見されたＧＮＰは２２アミノ酸残基より
成り（なお、本明細書においてこのペプチドを以下ｐＣ
ＮＰ−２２と略す）、ＡＮＰ−ＢＮＰと同様２個のシス
ティン残基を含んでおり、これが分子内でジスルフィド
結合を形成し、１７アミノ厳残基より構成された環状構
造をもっている。しかもこの環状構造を形成しているア
ミノ酸−次配列にはＡＮＰ −ＢＮＰのそれらと高い相
同性が見いだされた。
、まず最初に発見されたＧＮＰは２２アミノ酸残基より
成り（なお、本明細書においてこのペプチドを以下ｐＣ
ＮＰ−２２と略す）、ＡＮＰ−ＢＮＰと同様２個のシス
ティン残基を含んでおり、これが分子内でジスルフィド
結合を形成し、１７アミノ厳残基より構成された環状構
造をもっている。しかもこの環状構造を形成しているア
ミノ酸−次配列にはＡＮＰ −ＢＮＰのそれらと高い相
同性が見いだされた。
しかしｐＣＮＰ−２２はＡＮＰ−ＢＮＰかいずれも上記
環状構造のＣ−末端部分にさらに数個のアミノ酸が付加
したいわゆるテイル構造（ｔａｉｌ構造）ヲ持っている
のに対し、このｔａｉｌ構造を持っていない。すなわち
、ｐｃＮＰ−２２のＣ−末端はシスティン残基で終わっ
ている。このことからｒＣＮＰ−２２の構造はＡＮＰ
−ＢＮＰと似ているが、これらとは全く異なっているこ
とが判った。さらに、ｐＣＮＰ−２２はナトリウム利尿
作用及び血圧降下作用を示し、かつヒヨコ直腸標本を用
いた弛緩活性でＡＮＰ −ＢＮＰに比へ高い比活性を示
すことが判ったことから、ｐＣＮＰ−２２は新しいタイ
プに帰属されるＮＰであることが判り、このタイプに属
するペプチドはＧＮＰと命名された。
環状構造のＣ−末端部分にさらに数個のアミノ酸が付加
したいわゆるテイル構造（ｔａｉｌ構造）ヲ持っている
のに対し、このｔａｉｌ構造を持っていない。すなわち
、ｐｃＮＰ−２２のＣ−末端はシスティン残基で終わっ
ている。このことからｒＣＮＰ−２２の構造はＡＮＰ
−ＢＮＰと似ているが、これらとは全く異なっているこ
とが判った。さらに、ｐＣＮＰ−２２はナトリウム利尿
作用及び血圧降下作用を示し、かつヒヨコ直腸標本を用
いた弛緩活性でＡＮＰ −ＢＮＰに比へ高い比活性を示
すことが判ったことから、ｐＣＮＰ−２２は新しいタイ
プに帰属されるＮＰであることが判り、このタイプに属
するペプチドはＧＮＰと命名された。
また、ｐＣＮＰ−２２に続き、本発明者らにより、ＣＮ
Ｐに帰属される第２のペプチドがブタ脳から単離・同定
された。このペプチドはｐＧＮＰ−２２をＣ−末端に含
む５３アミノ酸残基から成るペプチドであることが判っ
ｆ−（以下、本明細書においてこのペプチドをｐｃＮＰ
−５３と略す）。
Ｐに帰属される第２のペプチドがブタ脳から単離・同定
された。このペプチドはｐＧＮＰ−２２をＣ−末端に含
む５３アミノ酸残基から成るペプチドであることが判っ
ｆ−（以下、本明細書においてこのペプチドをｐｃＮＰ
−５３と略す）。
言い換えれば、ｐＣＮＰ−５３はｐＣＮＰ−２２のＮ−
末端にさらに３１個のアミノ酸残基が付加したペプチド
であることが判った。なお、興味あることにブタ脳では
ｐｃＮＰ−５３がｐＣＮＰ−２２より多く存在している
ことが明らかにされている（特願平２−ｌＮ５ｇ２）。
末端にさらに３１個のアミノ酸残基が付加したペプチド
であることが判った。なお、興味あることにブタ脳では
ｐｃＮＰ−５３がｐＣＮＰ−２２より多く存在している
ことが明らかにされている（特願平２−ｌＮ５ｇ２）。
さらに、ごく最近の研究で、ｐＣＮＰ−２２、ｐＣＮＰ
−５３の前駆体タンパクの構造が遺伝子の解析から明ら
かにされ、これらのペプチドの生合成機構についても明
らかにされてきた（特願平２−１８６５８）。すなわち
、本発明者により、ｐＣＮＰ−２２、ｐＣＮＰ−５３を
コードするブタ染色体遺伝子及びｃＤＮＡが単離・同定
され、この解析から、ブタＧＮＰ前駆体タンパク（ｐｒ
ｅｐｒｏｐ ＣＮＰ）の構造が明らかにされると共に、
ｐｃＮＰ２２、ｐＣＮＰ−５３は最初１２６アミノ酸残
基からなるｐｒｅｐｒｏｐｃＮＰとしてｍＲＮＡから翻
訳され、次にこのＮ−末端領域に存在するシグナルペプ
チドが分泌過程で切断されｐｒｏｐＣＮＰに転換され、
さらにｐｒｏｐｃＮＰはプロセシング酵素により特異的
に切断されることによりｐＣＮＰ−５３とｐＣＮＰ−２
２に転換されることが判った。
−５３の前駆体タンパクの構造が遺伝子の解析から明ら
かにされ、これらのペプチドの生合成機構についても明
らかにされてきた（特願平２−１８６５８）。すなわち
、本発明者により、ｐＣＮＰ−２２、ｐＣＮＰ−５３を
コードするブタ染色体遺伝子及びｃＤＮＡが単離・同定
され、この解析から、ブタＧＮＰ前駆体タンパク（ｐｒ
ｅｐｒｏｐ ＣＮＰ）の構造が明らかにされると共に、
ｐｃＮＰ２２、ｐＣＮＰ−５３は最初１２６アミノ酸残
基からなるｐｒｅｐｒｏｐｃＮＰとしてｍＲＮＡから翻
訳され、次にこのＮ−末端領域に存在するシグナルペプ
チドが分泌過程で切断されｐｒｏｐＣＮＰに転換され、
さらにｐｒｏｐｃＮＰはプロセシング酵素により特異的
に切断されることによりｐＣＮＰ−５３とｐＣＮＰ−２
２に転換されることが判った。
以上のことから、ｐＣＮＰ−２２及びｐｃＮＰ５３につ
いてもＡＮＰ −ＢＮＰ同様共通の前駆体タンパク（ｐ
ｒｅｐｒ＠ ｐＣＮＰ）から生合成される分泌ペプチド
であることが判った。
いてもＡＮＰ −ＢＮＰ同様共通の前駆体タンパク（ｐ
ｒｅｐｒ＠ ｐＣＮＰ）から生合成される分泌ペプチド
であることが判った。
しかしながら、現在までの研究でＡＮＰ −ＢＮＰに帰
属されるペプチド類がいずれも心房から血中に分泌され
るホルモンとしてのみならず、脳内においては神経伝達
物質として作用し、体液量及び血圧の恒常性を調節して
いることが判っているのに対し、ＧＮＰの詳細な生体内
分布及び生理作用に関しては不明な点が多い。
属されるペプチド類がいずれも心房から血中に分泌され
るホルモンとしてのみならず、脳内においては神経伝達
物質として作用し、体液量及び血圧の恒常性を調節して
いることが判っているのに対し、ＧＮＰの詳細な生体内
分布及び生理作用に関しては不明な点が多い。
また、ＡＮＰ −ＢＮＰに関しては、現在までにヒトの
構造が明らかにされ、医薬への応用が進められているが
、ＣＮＰに関しては、現在までのところ、ヒトにおける
構造が明らかにされていない。
構造が明らかにされ、医薬への応用が進められているが
、ＣＮＰに関しては、現在までのところ、ヒトにおける
構造が明らかにされていない。
［本発明が解決すべき課題］
従って本発明は、ヒトにおけるＣＮＰ （ｈＣＮＰ）構
造、特にｐＣＮＰ−２２、ｐＣＮＰ−５３に対応するヒ
トＧＮＰ構造を明らかにすると共に、この前駆体タンパ
ク（ブタにおけるｐｒｅｐｒｏ ｐｃＮＰに対応する）
の構造をも明らかにすることを目的とする。
造、特にｐＣＮＰ−２２、ｐＣＮＰ−５３に対応するヒ
トＧＮＰ構造を明らかにすると共に、この前駆体タンパ
ク（ブタにおけるｐｒｅｐｒｏ ｐｃＮＰに対応する）
の構造をも明らかにすることを目的とする。
［課題を解決するための手段］
本発明者らは、まずＡＮＰのアミノ酸配列及びそれをコ
ードする遺伝子の塩基配列が各種動物間で強く保存され
ていることから、ＣＮＰの場合も同様の可能性か高いと
考えた。また、ブタ脳内におけるＧＮＰの存在量はＡＮ
Ｐ、ＢＮＰのそれに比べきわめて少量であり、しかもこ
れらペプチドの脳内における産生組織が特定されていな
いことから、直接ヒト脳からＣＮＰをペプチドとして単
離、同定すること、及びｃＤＮＡを単離し、これを解析
することによりヒトＧＮＰを同定することは困難である
と考えた。そこで、本発明者らは先に得たブタＧＮＰ遺
伝子またはｃＣＮＰをプローブとして用い、ヒト染色体
遺伝子を単離し、これを解析することにより、ヒトＧＮ
Ｐ前駆体タンパクの構造及びｐＧＮＰ−５３、ｐＣＮＰ
−２２に対応するヒトＣＮＰの構造を明らかにすること
を計画した。
ードする遺伝子の塩基配列が各種動物間で強く保存され
ていることから、ＣＮＰの場合も同様の可能性か高いと
考えた。また、ブタ脳内におけるＧＮＰの存在量はＡＮ
Ｐ、ＢＮＰのそれに比べきわめて少量であり、しかもこ
れらペプチドの脳内における産生組織が特定されていな
いことから、直接ヒト脳からＣＮＰをペプチドとして単
離、同定すること、及びｃＤＮＡを単離し、これを解析
することによりヒトＧＮＰを同定することは困難である
と考えた。そこで、本発明者らは先に得たブタＧＮＰ遺
伝子またはｃＣＮＰをプローブとして用い、ヒト染色体
遺伝子を単離し、これを解析することにより、ヒトＧＮ
Ｐ前駆体タンパクの構造及びｐＧＮＰ−５３、ｐＣＮＰ
−２２に対応するヒトＣＮＰの構造を明らかにすること
を計画した。
本発明では、まずｐＣＮＰｃＤＮＡ （特願平２１８６
５８３）から制限酵素Ｄｄｅ Ｉで切り出される約７０
０塩基のＤ Ｎ Ａ断片（ｐＣｃＤＮＡ）をプローブと
して用いる。このプローブは化学的に合成することもで
きる。このプローブを用いヒト染色体遺伝子ライブラリ
ー（λファージにヒト染色体遺伝子断片を組み込んだも
の）をスクリーニングした。このヒト染色体遺伝子ライ
ブラリーは当業者が容易に調製でき、また市販のライブ
ラリー、例えばクローンチック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）
社製のものを利用することもできる。その結果、ｐＣｃ
ＤＮＡにｈｙｄｒｉｄｉｘｅするクローン（λｈＣＮＰ
２）が得られた。このクローンを解析したところ、λｈ
ｃＨＰ２は約１５Ｋｂｐのヒト染色体遺伝子を含んでお
り、またこの１５Ｋｂｐうち、約２ＫｂｐからなるＥｃ
ｏＲＩＤＮＡ断片（ｈｇＥｃｏ−２）がｐ Ｃｃ ＤＮ
Ａプローブとｈｙｄｒｉｄｉｚｓすることが判った。こ
の約２ ｋＢＰからなるｈｇＥｃｏ−２を解析した結果
、このＤＮＡ断片がｈＣＮＰ遺伝子の一部を含むことが
明らかとなっｔ；。（なお、ｈｇＥｃｏ−２の制限酵素
地図および塩基配列決定のストラテジーを第１図に示す
。） 次に本発明者らは、ｈｃＮＰ前駆体タンパクの全
構造を明らかにする目的で、ｈｇＥｃｏ−２をプローブ
に用い、再度ヒト染色体遺伝子ライブラリーをスクリー
ニングした。この結果、ｈｇＥｃｏ−２プローブとｈｙ
ｄｒｉｄｉｚｅするクローン（λｈＣＮＰ １）を得た
。１ｈＣＮＰ１を解析したところ、このクローンは１５
Ｋｂｐ以上のヒト染色体遺伝子を含んでおり、またこの
うち、約４ ＫｂｐからなるＥｃｏＲｌ断片（ｈｇＥｃ
ｏ−１）がｈｇＥｃｏ−２プローブとｈｙｄｒｉｄｉｚ
ｅすることが確認された。そこでこのｈｇＥｃｏ−１断
片の制限酵素地図を作成し、すでに得ているｈｇＥｃｏ
−２と比較したところ（第１図）ｈｇＥｃｏ−１はｈｇ
Ｅｃｏ−２の５′側にさらに約２ Ｋｂｐのヒト染色体
遺伝子を含むＤＮＡであることが明らかとなった。そこ
で、このＤＮＡ断片の塩基配列を決定した（なお、ｈｇ
Ｅｃｏ−１の塩基配列決定のストラテジーを第１図に示
す）。この結果、第２図に示すようにこのｈｇＥｃｏ−
１は、ヒトＧＮＰ前駆体タンパクの全アミノ酸配列をコ
ードする構造遺伝子（ｓｕｕｃｔｕｒａｌｇｅｎｅ）領
域のみならず、ヒト染色体遺伝子のプロモーター領域を
も含んでいることが判った。すなわち、まずプロモータ
ー領域に関しては第２図に示すＤＮＡ塩基配列番号で１
５４６番目から１５５１番目に真核生物遺伝子のプロモ
ーター領域に共通して存在するＴＡＴＡボックス（ＴＡ
ＴＡ ｂｏｘ）が存在し、またこのＴＡＴＡ ｂｏｘの
上流には遺伝子発現の制御に関与していると思われるＧ
Ｃｂｏｘが２個、Ｙ ｂｏｘが１個存在していることが
判った。これらのことからこの領域はＧＮＰ前駆体遺伝
子のプロモーター領域であると判断しｔ二 。
５８３）から制限酵素Ｄｄｅ Ｉで切り出される約７０
０塩基のＤ Ｎ Ａ断片（ｐＣｃＤＮＡ）をプローブと
して用いる。このプローブは化学的に合成することもで
きる。このプローブを用いヒト染色体遺伝子ライブラリ
ー（λファージにヒト染色体遺伝子断片を組み込んだも
の）をスクリーニングした。このヒト染色体遺伝子ライ
ブラリーは当業者が容易に調製でき、また市販のライブ
ラリー、例えばクローンチック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）
社製のものを利用することもできる。その結果、ｐＣｃ
ＤＮＡにｈｙｄｒｉｄｉｘｅするクローン（λｈＣＮＰ
２）が得られた。このクローンを解析したところ、λｈ
ｃＨＰ２は約１５Ｋｂｐのヒト染色体遺伝子を含んでお
り、またこの１５Ｋｂｐうち、約２ＫｂｐからなるＥｃ
ｏＲＩＤＮＡ断片（ｈｇＥｃｏ−２）がｐ Ｃｃ ＤＮ
Ａプローブとｈｙｄｒｉｄｉｚｓすることが判った。こ
の約２ ｋＢＰからなるｈｇＥｃｏ−２を解析した結果
、このＤＮＡ断片がｈＣＮＰ遺伝子の一部を含むことが
明らかとなっｔ；。（なお、ｈｇＥｃｏ−２の制限酵素
地図および塩基配列決定のストラテジーを第１図に示す
。） 次に本発明者らは、ｈｃＮＰ前駆体タンパクの全
構造を明らかにする目的で、ｈｇＥｃｏ−２をプローブ
に用い、再度ヒト染色体遺伝子ライブラリーをスクリー
ニングした。この結果、ｈｇＥｃｏ−２プローブとｈｙ
ｄｒｉｄｉｚｅするクローン（λｈＣＮＰ １）を得た
。１ｈＣＮＰ１を解析したところ、このクローンは１５
Ｋｂｐ以上のヒト染色体遺伝子を含んでおり、またこの
うち、約４ ＫｂｐからなるＥｃｏＲｌ断片（ｈｇＥｃ
ｏ−１）がｈｇＥｃｏ−２プローブとｈｙｄｒｉｄｉｚ
ｅすることが確認された。そこでこのｈｇＥｃｏ−１断
片の制限酵素地図を作成し、すでに得ているｈｇＥｃｏ
−２と比較したところ（第１図）ｈｇＥｃｏ−１はｈｇ
Ｅｃｏ−２の５′側にさらに約２ Ｋｂｐのヒト染色体
遺伝子を含むＤＮＡであることが明らかとなった。そこ
で、このＤＮＡ断片の塩基配列を決定した（なお、ｈｇ
Ｅｃｏ−１の塩基配列決定のストラテジーを第１図に示
す）。この結果、第２図に示すようにこのｈｇＥｃｏ−
１は、ヒトＧＮＰ前駆体タンパクの全アミノ酸配列をコ
ードする構造遺伝子（ｓｕｕｃｔｕｒａｌｇｅｎｅ）領
域のみならず、ヒト染色体遺伝子のプロモーター領域を
も含んでいることが判った。すなわち、まずプロモータ
ー領域に関しては第２図に示すＤＮＡ塩基配列番号で１
５４６番目から１５５１番目に真核生物遺伝子のプロモ
ーター領域に共通して存在するＴＡＴＡボックス（ＴＡ
ＴＡ ｂｏｘ）が存在し、またこのＴＡＴＡ ｂｏｘの
上流には遺伝子発現の制御に関与していると思われるＧ
Ｃｂｏｘが２個、Ｙ ｂｏｘが１個存在していることが
判った。これらのことからこの領域はＧＮＰ前駆体遺伝
子のプロモーター領域であると判断しｔ二 。
次に、構造遺伝子領域に関しては、まず、前記のＴＡＴ
Ａ ｂｏｘの下流（３′側）塩基配列番号１７２２から
１７２４にＡ７Ｇが存在し、このＡＴＧはＴＡＴＡ ｂ
ＯＸの下流（３″側）で最初に現れるメチオニンコド〉
・であり、しかもこのコドンの周りの塩基配列は真核生
物で知られている翻訳開始コドンのフンセンサスンーク
エンスＡ／Ｇ ＮＮＡＴＧ （ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃいず
れかの塩基を示す）と一致していることから、本発明者
はこのＡＴＧがヒ）ＣＮＰ前駆体の翻訳開始コドンであ
ると推定した。次にもしこのＡＴＧを翻訳開始コドンと
すると、すでに明らかとなっているブタＣＮＰ染色体遺
伝子の構造との比較から、塩基配列番号１８０９−１８
１１８１１番目しているリジン残基のコドン（ＡＡＧ）
までが第１エキソンになる。また同様の比較から塩基配
列番号２２５６−２２５８２５８番目しているバリン残
基のコドン（ＧＴＣ）から第２エキソンか始まることに
なる。なお、初めに解析したｈｇＥｃｏ−２は第２エキ
ソン内の塩基配列番号２２８６以降をコードするＤＮＡ
断片となる。これらのことは、塩基配列番号で１８１０
付近にスプライシングドナーのコンセンサスシーフェン
スとして知られているＣ／Ａ ＡＧＧＴ Ａ／Ｇ ＡＧ
Ｔと似た塩基配列が存在すること、さらに、塩基配列番
号２２５６の５′側にはスプライシングアクセプターの
コンセンサスシーフェンスとして知られている（Ｐｙ）
ｎ Ｎ Ｃ／Ｔ ＡＧＧ（Ｐｙはピリジン塩基を示し
、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ，Ｇ、いずれかの塩基を示す）に似た
塩基配列が存在していることからも支持される。これら
のことから、本発明者らは塩基配列番号１８１２から２
２５５２５５番目ＤＮＡ領域はイントロン（１ｌｒｏｎ
）であり、この１ｎｊｒｏｎはｈｃＮＰ前駆体タンパク
をコードする成熟（ｍａｔｕｒｅ） ｍ ＲＮ Ａがで
きる際スプライソングにより除かれるのではないかと考
えた。つまり、ｈＣＮＰ前駆体タンパクは塩基配列番号
１７２２から始まり、１８１１で終わる第１エクソンと
２２５６から始まる第２エクソンによりコードされてお
り、ブタ同様全体ではアミノ酸１２６残基からなるポリ
ペプチドであることが明らかとなっｔこ 。
Ａ ｂｏｘの下流（３′側）塩基配列番号１７２２から
１７２４にＡ７Ｇが存在し、このＡＴＧはＴＡＴＡ ｂ
ＯＸの下流（３″側）で最初に現れるメチオニンコド〉
・であり、しかもこのコドンの周りの塩基配列は真核生
物で知られている翻訳開始コドンのフンセンサスンーク
エンスＡ／Ｇ ＮＮＡＴＧ （ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃいず
れかの塩基を示す）と一致していることから、本発明者
はこのＡＴＧがヒ）ＣＮＰ前駆体の翻訳開始コドンであ
ると推定した。次にもしこのＡＴＧを翻訳開始コドンと
すると、すでに明らかとなっているブタＣＮＰ染色体遺
伝子の構造との比較から、塩基配列番号１８０９−１８
１１８１１番目しているリジン残基のコドン（ＡＡＧ）
までが第１エキソンになる。また同様の比較から塩基配
列番号２２５６−２２５８２５８番目しているバリン残
基のコドン（ＧＴＣ）から第２エキソンか始まることに
なる。なお、初めに解析したｈｇＥｃｏ−２は第２エキ
ソン内の塩基配列番号２２８６以降をコードするＤＮＡ
断片となる。これらのことは、塩基配列番号で１８１０
付近にスプライシングドナーのコンセンサスシーフェン
スとして知られているＣ／Ａ ＡＧＧＴ Ａ／Ｇ ＡＧ
Ｔと似た塩基配列が存在すること、さらに、塩基配列番
号２２５６の５′側にはスプライシングアクセプターの
コンセンサスシーフェンスとして知られている（Ｐｙ）
ｎ Ｎ Ｃ／Ｔ ＡＧＧ（Ｐｙはピリジン塩基を示し
、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ，Ｇ、いずれかの塩基を示す）に似た
塩基配列が存在していることからも支持される。これら
のことから、本発明者らは塩基配列番号１８１２から２
２５５２５５番目ＤＮＡ領域はイントロン（１ｌｒｏｎ
）であり、この１ｎｊｒｏｎはｈｃＮＰ前駆体タンパク
をコードする成熟（ｍａｔｕｒｅ） ｍ ＲＮ Ａがで
きる際スプライソングにより除かれるのではないかと考
えた。つまり、ｈＣＮＰ前駆体タンパクは塩基配列番号
１７２２から始まり、１８１１で終わる第１エクソンと
２２５６から始まる第２エクソンによりコードされてお
り、ブタ同様全体ではアミノ酸１２６残基からなるポリ
ペプチドであることが明らかとなっｔこ 。
さらに、このようにして明らかにされたｈＣＮＰ前駆体
タンパク（以降、本発明ではｐｒｃｐｒｏ ｈＣＮＰと
略す）のアミノ酸−次配列をブタのそれと比較したとこ
ろ、全体で５カ所（第３図ｐｒｅｐｒｏ ｈＣＮＰのア
ミノ酸−次配列番号で３７．４０，５６．９０および１
０１番目）アミノ酸配列が異なっている以外、同じであ
ることが判った。特に、ブタＧＮＰの生合成機構で明ら
かにされている、ＧＮＰ前駆体タンパクの分泌に関与す
るｐｒｅｐｒｏｃＮＰのＮ−末端領域に存在するシグナ
ルペプチドのアミノ酸沈配列、及びｐｒｅｐｒｏＣＮＰ
からＣＮＰ−２２、ＣＮＰ−５３が生じる際プロセシン
グ酵素により認識、切断されるＣＮＰ−２２、ＧＮＰ−
５３のＮ−末端近傍のアミノ酸配列はヒトとブタで全く
同じであることが判った。
タンパク（以降、本発明ではｐｒｃｐｒｏ ｈＣＮＰと
略す）のアミノ酸−次配列をブタのそれと比較したとこ
ろ、全体で５カ所（第３図ｐｒｅｐｒｏ ｈＣＮＰのア
ミノ酸−次配列番号で３７．４０，５６．９０および１
０１番目）アミノ酸配列が異なっている以外、同じであ
ることが判った。特に、ブタＧＮＰの生合成機構で明ら
かにされている、ＧＮＰ前駆体タンパクの分泌に関与す
るｐｒｅｐｒｏｃＮＰのＮ−末端領域に存在するシグナ
ルペプチドのアミノ酸沈配列、及びｐｒｅｐｒｏＣＮＰ
からＣＮＰ−２２、ＣＮＰ−５３が生じる際プロセシン
グ酵素により認識、切断されるＣＮＰ−２２、ＧＮＰ−
５３のＮ−末端近傍のアミノ酸配列はヒトとブタで全く
同じであることが判った。
以上のことを総合的に考えると、ヒトＣＮＰの生合成経
路はブタ同様まず１２６アミノ酸残基からなる ｐｒｅ
ｐｒｏ ｈＣＮＰ がｍＲＮＡから翻訳（ｔｒａｎｓ
ｒａｔｉｏ＋＋）される。次に、このＮ−末端領域に存
在するシグナルペプチドは分泌過程で切断されｐｒｏｈ
ｃＮＰに転換される。さらに、ｐｒｏｈＣＮＰはプロセ
シング酵素により特異的に（第３図アミノ酸−次配列番
号で７３と７４の間、１０４と１０５の間）切断される
ことにより、ｐＧＮＰ−５３、ｐＣＮＰ−２２に対応す
るヒトＧ Ｎ Ｐ −５３（ｈｃＮＰ−２２、第３図ア
ミノ酸−次配列番号７４から１２６番目）、ヒトＧＮＰ
−２２ＣｂＣＮＰ−２２ｉ第３図アミノ酸−次配列番号
１０５から１２６番目）に転換されることが予測される
。
路はブタ同様まず１２６アミノ酸残基からなる ｐｒｅ
ｐｒｏ ｈＣＮＰ がｍＲＮＡから翻訳（ｔｒａｎｓ
ｒａｔｉｏ＋＋）される。次に、このＮ−末端領域に存
在するシグナルペプチドは分泌過程で切断されｐｒｏｈ
ｃＮＰに転換される。さらに、ｐｒｏｈＣＮＰはプロセ
シング酵素により特異的に（第３図アミノ酸−次配列番
号で７３と７４の間、１０４と１０５の間）切断される
ことにより、ｐＧＮＰ−５３、ｐＣＮＰ−２２に対応す
るヒトＧ Ｎ Ｐ −５３（ｈｃＮＰ−２２、第３図ア
ミノ酸−次配列番号７４から１２６番目）、ヒトＧＮＰ
−２２ＣｂＣＮＰ−２２ｉ第３図アミノ酸−次配列番号
１０５から１２６番目）に転換されることが予測される
。
ところで、ｈＣＮＰ−２２に関しては、ｐＣＮＰ＝２２
と全く同じアミノ酸−次配列であることから、ｐＣＮＰ
−２２と同じ生理活性作用（ナトリウム利尿作用、血圧
降下作用など）を示すことは疑う余地がない。
と全く同じアミノ酸−次配列であることから、ｐＣＮＰ
−２２と同じ生理活性作用（ナトリウム利尿作用、血圧
降下作用など）を示すことは疑う余地がない。
一方、ｈＣＮＰ−５３とＰＣＮＰ−５３では２力所アミ
ノ酸配列が異なる（第３図アミノ酸−次配列番号で９０
番目と１０１番目）ことから、ｈＣＮＰ−５３は新規の
ペプチドであり、その生理作用については不明である。
ノ酸配列が異なる（第３図アミノ酸−次配列番号で９０
番目と１０１番目）ことから、ｈＣＮＰ−５３は新規の
ペプチドであり、その生理作用については不明である。
そこで本発明者らは、ｈＣＮＰ−５３を化学合成し、こ
の新規ペプチドの生理活性を調へた。この結果ｈＣＮＰ
−５３はヒヨコ直腸弛緩作用を示すと共に、ラットに投
与すると明確なナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を
示すことを見いだした。
の新規ペプチドの生理活性を調へた。この結果ｈＣＮＰ
−５３はヒヨコ直腸弛緩作用を示すと共に、ラットに投
与すると明確なナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を
示すことを見いだした。
以上まとめると、本発明者らは、ｈＣＮＰ前駆体タンパ
クをコードする染色体遺伝子を単離し、これを解析する
ことにより、そのアミノ酸−次配列を明らかにすること
に成功した。またこの結果、ｐＣＮＰ−２２、ｐＧＮＰ
−５３に対応するヒトＧＮＰ （ｈＣＮＰ−２２、ｈＣ
ＮＰ−５３）の構造を明らかにすると共に、ｈＣＮＰ−
５３に関しては、これを化学合成し、その生理活性を確
認することにより本発明を完成させた。
クをコードする染色体遺伝子を単離し、これを解析する
ことにより、そのアミノ酸−次配列を明らかにすること
に成功した。またこの結果、ｐＣＮＰ−２２、ｐＧＮＰ
−５３に対応するヒトＧＮＰ （ｈＣＮＰ−２２、ｈＣ
ＮＰ−５３）の構造を明らかにすると共に、ｈＣＮＰ−
５３に関しては、これを化学合成し、その生理活性を確
認することにより本発明を完成させた。
なお、本発明で得られたｈＣＮＰ染色体遺伝子をそのま
ま、あるいは適当なプロモーター（例えはＳＭ４０初期
プロモーター）の下流に接続し、適当な哺乳動物細胞（
例えばサル腎臓細胞由来のＣＯ５細胞）に形質導入する
ことによりｈＣＮＰｃＤＮＡが得られることは自明の事
実である（特願平２−１ｇ６５ｇ３）。
ま、あるいは適当なプロモーター（例えはＳＭ４０初期
プロモーター）の下流に接続し、適当な哺乳動物細胞（
例えばサル腎臓細胞由来のＣＯ５細胞）に形質導入する
ことによりｈＣＮＰｃＤＮＡが得られることは自明の事
実である（特願平２−１ｇ６５ｇ３）。
このようにして得られるｈＣＮＰｃＤＮＡの全塩基配列
とこれにコードされるｈＣＮＰ前駆体タンパクのアミノ
酸−次配列を第３図に示した。
とこれにコードされるｈＣＮＰ前駆体タンパクのアミノ
酸−次配列を第３図に示した。
以下、実施例により本発明の詳細な説明する。
実施例１．ＤＮＡプローブ（ｐＣｃＤＮＡ）の作製
ヒトＣＮＰ前駆体タンパクをコードする染色体遺伝子を
クローニングするために用いるＤＮＡプローブ（ｐ Ｃ
ｃ ＤＮＡ）の作製は、ブタＣＮＰｃＤＮＡ （特願平
２−１８６５８３）を制限酵素Ｄｄｅ Ｉで切断し約７
００ｂｐのＤＮＡ断片を単離、このＤＮＡ断片を［ｇ−
３２Ｐ］ ｄＣＴＰを用い、ニックトランスレーション
で放射標識することにより作製しｔ二。
クローニングするために用いるＤＮＡプローブ（ｐ Ｃ
ｃ ＤＮＡ）の作製は、ブタＣＮＰｃＤＮＡ （特願平
２−１８６５８３）を制限酵素Ｄｄｅ Ｉで切断し約７
００ｂｐのＤＮＡ断片を単離、このＤＮＡ断片を［ｇ−
３２Ｐ］ ｄＣＴＰを用い、ニックトランスレーション
で放射標識することにより作製しｔ二。
４°Ｃに保存されたヒト染色体遺伝子ファージＤＮＡラ
イブラリーを大腸菌に１２株由来ＬＥ３９２に感染させ
、ＬＢ培地（１０ｇ Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ、
５ ｇ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ ｇ Ｎ
ａＣｌ、１．５％ＢＩＣＬＯ！ｇａｒ全量１１）に拡げ
、３７°Ｃで一夜培養した。
イブラリーを大腸菌に１２株由来ＬＥ３９２に感染させ
、ＬＢ培地（１０ｇ Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ、
５ ｇ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ ｇ Ｎ
ａＣｌ、１．５％ＢＩＣＬＯ！ｇａｒ全量１１）に拡げ
、３７°Ｃで一夜培養した。
プレートを４°Ｃで３０分間冷却した後、７アージプラ
ーク上にニトロセルロースフィルター（Ｓｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ＆ ５ｃｂｎｅｌ１社製）を５分間放置した。次
にこのフィルターをプレートからはがし、風乾後アルカ
リ変性液（０，ＳＭ ＮａＯＨ，１，ｓＭ ＮａＣ１）
に１分間浸し、次に中和液（０，５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ ｐＨ７，０，１，ｓＭＮＡＣｌ）に１分間浸した。
ーク上にニトロセルロースフィルター（Ｓｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ＆ ５ｃｂｎｅｌ１社製）を５分間放置した。次
にこのフィルターをプレートからはがし、風乾後アルカ
リ変性液（０，ＳＭ ＮａＯＨ，１，ｓＭ ＮａＣ１）
に１分間浸し、次に中和液（０，５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ ｐＨ７，０，１，ｓＭＮＡＣｌ）に１分間浸した。
その後、３ＸＳＳＣ溶液（２ｏｘｓｓｃ ＮａＣ１１７
ｓ、３（、クエン酸三ナトリウム８Ｌ２１全量１１）で
ニトロセルロースフィルターをすすぎ、風乾後、減圧下
８０°Ｃｌ２Ｏ分間熱処理を行っｌ二 。
ｓ、３（、クエン酸三ナトリウム８Ｌ２１全量１１）で
ニトロセルロースフィルターをすすぎ、風乾後、減圧下
８０°Ｃｌ２Ｏ分間熱処理を行っｌ二 。
このようにして調整したニトロセルロースフィルターを
用い、以下に示す条件でプラークハイプリダイゼ−７ヨ
ンを行った。すなわち、ニトロセルロースフィルターを
プレハイブリダイゼーンヨン液ＨＸＳＳＣ，１ｘデンハ
ート液（アルブミン、ポリヒニルビロリドン、フィコー
ル、各々 ０．２ｍｇ／ｍｌ） 、”ｊヶ精子Ｄ Ｎ
Ａ ５０ μｇ／＋１．０．１％ｓＤｓ］に加え、６０
℃にて３時間プレハイブリダイゼーシ３ンを行った。次
に２枚のニトロセルロースフィルターあたり、前記ｐ
Ｃｃ Ｄ Ｎ Ａプローブを１００万ｃｐｍ、及び前記
プレハイブリダイゼーンヨン溶液１＋ａｌを用い、６０
°Ｃにて一夜ハイブリダイゼーノヨンを行った。次にこ
のフィルターをＯ，１％ＳＤＳを含む３ＸＳＳＣ溶液で
６０°Ｃ３０分間、３回洗浄後、風乾し、オートラジオ
グラフィーを８０°Ｃで一昼夜行った。このようにして
約２０万クローンをスクリーニングする二とによりｐＣ
ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズするクローンが１個
得られた。このクローンをλｈＣＮＰ２と命名し、以後
の解析を行った。
用い、以下に示す条件でプラークハイプリダイゼ−７ヨ
ンを行った。すなわち、ニトロセルロースフィルターを
プレハイブリダイゼーンヨン液ＨＸＳＳＣ，１ｘデンハ
ート液（アルブミン、ポリヒニルビロリドン、フィコー
ル、各々 ０．２ｍｇ／ｍｌ） 、”ｊヶ精子Ｄ Ｎ
Ａ ５０ μｇ／＋１．０．１％ｓＤｓ］に加え、６０
℃にて３時間プレハイブリダイゼーシ３ンを行った。次
に２枚のニトロセルロースフィルターあたり、前記ｐ
Ｃｃ Ｄ Ｎ Ａプローブを１００万ｃｐｍ、及び前記
プレハイブリダイゼーンヨン溶液１＋ａｌを用い、６０
°Ｃにて一夜ハイブリダイゼーノヨンを行った。次にこ
のフィルターをＯ，１％ＳＤＳを含む３ＸＳＳＣ溶液で
６０°Ｃ３０分間、３回洗浄後、風乾し、オートラジオ
グラフィーを８０°Ｃで一昼夜行った。このようにして
約２０万クローンをスクリーニングする二とによりｐＣ
ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズするクローンが１個
得られた。このクローンをλｈＣＮＰ２と命名し、以後
の解析を行った。
まず常法に従いλｈＣＮＰ２ファージからＤＮＡを調整
した。次に、このファージＤＮＡを制［酵素ＥｃｏＲｌ
を用い切断し、切断されたＤＮＡ断片をアガロースゲル
電気泳動で分離・解析した。この結果、λｈＣＮＰ２は
約１５Ｋｂｐのヒト染色体遺伝子を含むファージである
ことが判った。まｔ：、ｐ Ｃｃ ＤＮＡプローブを用
い、サザンプロット解析を行った結果、λｈＣＮＰ２は
約２１［ｂｐのＥｃｏｌｉＩ ＤＮＡ断片（ｈｇＥｃｏ
−２）がｐ Ｃｃ ＤＮＡプローブとハイブリダイズす
ることが判った。
した。次に、このファージＤＮＡを制［酵素ＥｃｏＲｌ
を用い切断し、切断されたＤＮＡ断片をアガロースゲル
電気泳動で分離・解析した。この結果、λｈＣＮＰ２は
約１５Ｋｂｐのヒト染色体遺伝子を含むファージである
ことが判った。まｔ：、ｐ Ｃｃ ＤＮＡプローブを用
い、サザンプロット解析を行った結果、λｈＣＮＰ２は
約２１［ｂｐのＥｃｏｌｉＩ ＤＮＡ断片（ｈｇＥｃｏ
−２）がｐ Ｃｃ ＤＮＡプローブとハイブリダイズす
ることが判った。
Ｂ、ｈｇＥｃｏ−２ＤＮＡ断片の塩基配列決定まず、ｈ
ｇＥｃｏ−２ＤＮＡ断片の塩基配列を決定するために、
−旦、ｈｇＥｃｏ−２ＤＮＡ断片をプラスミドベクター
ｐＵＣ１１８（宝酒造）のＥｃｏＲＩサイトにサブクロ
ーニングし、ｐＵＣｈＣＮＰ２を作製した。次に、ｐＵ
ＣｈＣＮＰ２を適当な制限酵素を用いて切断し、得られ
たＤＮＡ断片をＭ１３ファージにサブクローニングし、
ジデオキ７法で塩基配列を決定した。
ｇＥｃｏ−２ＤＮＡ断片の塩基配列を決定するために、
−旦、ｈｇＥｃｏ−２ＤＮＡ断片をプラスミドベクター
ｐＵＣ１１８（宝酒造）のＥｃｏＲＩサイトにサブクロ
ーニングし、ｐＵＣｈＣＮＰ２を作製した。次に、ｐＵ
ＣｈＣＮＰ２を適当な制限酵素を用いて切断し、得られ
たＤＮＡ断片をＭ１３ファージにサブクローニングし、
ジデオキ７法で塩基配列を決定した。
その結果、このＤＮＡ断片がヒト染色体遺伝子の一部を
コードしていることが明らかとなった。
コードしていることが明らかとなった。
実施例２で示した方法により調整したニトロセルロース
フィルターを用い、以下に示す条件でプラークハイブリ
ダイゼーションを行った。プローブは前記λｈＣＮＰ２
由来のｈｇＥｃｏ−２約２Ｋｂｐにニックトランスレー
ション法でＣａ−”Ｐ］ｄｃＴＰを用いて放射標識しｔ
；ものを用いた。以後このプローブをｈｇＥｃｏ−２Ｄ
ＮＡと記す。
フィルターを用い、以下に示す条件でプラークハイブリ
ダイゼーションを行った。プローブは前記λｈＣＮＰ２
由来のｈｇＥｃｏ−２約２Ｋｂｐにニックトランスレー
ション法でＣａ−”Ｐ］ｄｃＴＰを用いて放射標識しｔ
；ものを用いた。以後このプローブをｈｇＥｃｏ−２Ｄ
ＮＡと記す。
マス、ニトロセルロースフィルターをプレハイブリダイ
ゼーンヨン液［３ＸＳＳＣ，ＬＸデンハート液（アルブ
ミン、ポリビニルピロリドン、フィコール、各々０．２
ｍｇ／ｍｌ） 、サケ精子ＤＮＡ５０μｇ／ａ＋Ｉ、
０．１％ＳＤＳ］に加え、６５℃にて３時間プレハイブ
リダイゼーショ〉を行った。次に２枚のニトロセルロー
スフィルターあたり、前記ｈｇＥｃｏ −２ＤＮＡプロ
ーブを１００万ｃｐｍ、及び前記プレハイブリグイゼー
ンヨン溶液１ｍ１ｌ用い、６５°Ｃにて一部ハイブリダ
イゼーションを行った。
ゼーンヨン液［３ＸＳＳＣ，ＬＸデンハート液（アルブ
ミン、ポリビニルピロリドン、フィコール、各々０．２
ｍｇ／ｍｌ） 、サケ精子ＤＮＡ５０μｇ／ａ＋Ｉ、
０．１％ＳＤＳ］に加え、６５℃にて３時間プレハイブ
リダイゼーショ〉を行った。次に２枚のニトロセルロー
スフィルターあたり、前記ｈｇＥｃｏ −２ＤＮＡプロ
ーブを１００万ｃｐｍ、及び前記プレハイブリグイゼー
ンヨン溶液１ｍ１ｌ用い、６５°Ｃにて一部ハイブリダ
イゼーションを行った。
次にこのフィルターを０．１％ＳＤＳを含む３×ｓｓｃ
溶液で６５℃３０分間、３回洗浄後、風乾し、オートラ
ジオグラフィーを一８０°Ｃで一昼夜行った。このよう
にして約５０万クローンをスクリーニングすることによ
りｈｇＥｃｏ−２ＤＮＡプローブとハイブリダイズする
クローンが５個得られた。これらのクローンのうちの一
つをλｈｃＮＰＩと命名し、以後の解析を行った。
溶液で６５℃３０分間、３回洗浄後、風乾し、オートラ
ジオグラフィーを一８０°Ｃで一昼夜行った。このよう
にして約５０万クローンをスクリーニングすることによ
りｈｇＥｃｏ−２ＤＮＡプローブとハイブリダイズする
クローンが５個得られた。これらのクローンのうちの一
つをλｈｃＮＰＩと命名し、以後の解析を行った。
まず常法に従いλｈｃＮＰ１ファージからＤＮＡを調整
した。次に、このファージＤ Ｎ Ａ ヲ制［酵素Ｅｃ
ｏＲｌを用い切断し、切断されたＤＮＡ断片をアガロー
スゲル電気泳動で分離・解析した。この結果、λｈｃＮ
Ｐ１は約１５Ｋｂｐ以上のヒト染色体遺伝子を含む７ア
ージであることが判った。
した。次に、このファージＤ Ｎ Ａ ヲ制［酵素Ｅｃ
ｏＲｌを用い切断し、切断されたＤＮＡ断片をアガロー
スゲル電気泳動で分離・解析した。この結果、λｈｃＮ
Ｐ１は約１５Ｋｂｐ以上のヒト染色体遺伝子を含む７ア
ージであることが判った。
また、ｈｇＥｃｏ−２ＤＮＡプローブを用い、サザンプ
ロット解析を行った結果、約４ ＫｂｐのＥｃｏＲＩ
ＤＮＡ断片（ｂｇＥｃｏ−１）がｈｇｌｉ、ｃｏ−２Ｄ
ＮＡプローフ゛とハイブリダイズすることが判っｔ二。
ロット解析を行った結果、約４ ＫｂｐのＥｃｏＲＩ
ＤＮＡ断片（ｂｇＥｃｏ−１）がｈｇｌｉ、ｃｏ−２Ｄ
ＮＡプローフ゛とハイブリダイズすることが判っｔ二。
そこで、ｈｇＥｃｏ−２ＤＮＡプローブとハイブリダイ
ズするＤＮＡ断片の塩基配列を、以下に示す方法で決定
した。
ズするＤＮＡ断片の塩基配列を、以下に示す方法で決定
した。
Ｂ、ｈｇＥｃｏ−ＩＤＮＡ断片の塩基配列決定まず、ｈ
ｇＥｃｏ−ＩＤＮＡ断片の塩基配列を決定するために、
−旦、ｈｇＥｃｏ−ＩＤＮＡ断片をプラスミドベクター
ｐＵＣ１１８（宝酒造）のＥｃｏＲｌサイトにサブクロ
ーニングし、ｐＵＣＣＮＰＩを作成した。次に、ｐＵｃ
ｃＮＰｌを適当な制限酵素を用いて切断し、得られたＤ
ＮＡ断片をＭ１３７アージにサブクローニングし、ジデ
オキシ法で塩基配列を決定した。以上述べた方法で決定
した塩基配列の領域を第１図に実線の矢印で示した。ま
た、ｈｇＥｃｏ−ＩＤＮＡ断片ｈｇＥｃｏ−１の１ｏｖ
ｅｒ ５ｔｒｘｎｄの塩基配列を決定するために、−旦
、ｈｇＥｃｏ−１をファージ゛ベクターＭ１３ｍｐ１８
のＥｃｏＲｌサイトにサブクローニングし、Ｍ１３ｈＣ
Ｎｐｔを作製した。次に、これをＩｅｆｆｌＰｌａｔｅ
にしてすでに決定された塩基配列を基に化学合成したオ
リゴヌクレオチドプライマー及び［１ｎｉｖｅｒｓａｌ
プライマーを用い、ジデオキ７法で塩基配列を決定した
。決定した領域を第１図に点線の矢印で示した。以上の
方法で決定した塩基配列にｈｇＥｃｏ−２ＤＮＡ断片の
塩基配列を合わせてｈｇＥｃｏ−ＩＤＮＡ断片の全塩基
配列を完成させた。この塩基配列及びこの塩基配列から
予想されるエクソン部位にコードされるアミノ酸配列を
第２図に示しｔ；。
ｇＥｃｏ−ＩＤＮＡ断片の塩基配列を決定するために、
−旦、ｈｇＥｃｏ−ＩＤＮＡ断片をプラスミドベクター
ｐＵＣ１１８（宝酒造）のＥｃｏＲｌサイトにサブクロ
ーニングし、ｐＵＣＣＮＰＩを作成した。次に、ｐＵｃ
ｃＮＰｌを適当な制限酵素を用いて切断し、得られたＤ
ＮＡ断片をＭ１３７アージにサブクローニングし、ジデ
オキシ法で塩基配列を決定した。以上述べた方法で決定
した塩基配列の領域を第１図に実線の矢印で示した。ま
た、ｈｇＥｃｏ−ＩＤＮＡ断片ｈｇＥｃｏ−１の１ｏｖ
ｅｒ ５ｔｒｘｎｄの塩基配列を決定するために、−旦
、ｈｇＥｃｏ−１をファージ゛ベクターＭ１３ｍｐ１８
のＥｃｏＲｌサイトにサブクローニングし、Ｍ１３ｈＣ
Ｎｐｔを作製した。次に、これをＩｅｆｆｌＰｌａｔｅ
にしてすでに決定された塩基配列を基に化学合成したオ
リゴヌクレオチドプライマー及び［１ｎｉｖｅｒｓａｌ
プライマーを用い、ジデオキ７法で塩基配列を決定した
。決定した領域を第１図に点線の矢印で示した。以上の
方法で決定した塩基配列にｈｇＥｃｏ−２ＤＮＡ断片の
塩基配列を合わせてｈｇＥｃｏ−ＩＤＮＡ断片の全塩基
配列を完成させた。この塩基配列及びこの塩基配列から
予想されるエクソン部位にコードされるアミノ酸配列を
第２図に示しｔ；。
実施例６．ｈＣＮＰ−５３の化学合成
ｈＣＮＰ−５３はアプライドバイオシステム社のペプチ
ド合成機を用い、固相法で合成し、フッ化水素で脱保護
し、分子内Ｓ−５結合を形成しｌ：後、精製した。
ド合成機を用い、固相法で合成し、フッ化水素で脱保護
し、分子内Ｓ−５結合を形成しｌ：後、精製した。
最終精製標品のアミノ酸／−クエン／ングの結果を第１
表に、また、アミノ酸分析値を第２表に示す。この結果
から、確かに化学合成したｈＣＮＰ−５３が目的とする
ｈＣＮＰ−５３であることを確認した。
表に、また、アミノ酸分析値を第２表に示す。この結果
から、確かに化学合成したｈＣＮＰ−５３が目的とする
ｈＣＮＰ−５３であることを確認した。
第１表は、化学合成したｈＣＮＰ−５３のエドマン分析
法により各サイクルごとに生じるＰＴＨ−アミノ酸の収
率を示す表である。なお各アミノ酸は一文字表記で表し
た。
法により各サイクルごとに生じるＰＴＨ−アミノ酸の収
率を示す表である。なお各アミノ酸は一文字表記で表し
た。
第２表は、化学合成したｈＣＮＰ−５３のアミノ酸分析
値を示す表である。
値を示す表である。
第１表・合成ヒトＣＮＰ
５３のアミ
ノ酸配列分析
サイクル番号
ｌ Ｄ ３４９．＆ｐｍｏ１
２ Ｌ ４０００．６
３ ＲＩＯ５，９
ｊ Ｖ ３０６０．１
５ Ｄ ２９２．０
６ Ｔ Ｈｌ、１
７ Ｋ ２Ｎ０．４
８ Ｓ ５９５．３
９ Ｒ２９０，６
０Ａ ２７６１．ｉ
ＩＩ Ａ ２７１１６
＋２ Ｗ １０３Ｌ４
ＨＡ ２３Ｂ６．８
１４ Ｒ１５１，６
Ｉｓ Ｌ ２６２ｇ、７
１６ Ｌ ２７０１．２
１７ Ｑ ７６２．３
１８ Ｅ ４１８．７
＋９ Ｈ７１，０
２０Ｐ Ｉｓｇ、。
２１ Ｎ ４７色、６
２２ ＾ ＨＨ，９
２３ＲＮａ、９
２４ Ｋ １１７６．９
２５ Ｙ ６７ｇ、９
２６ Ｋ １２０１．６
２７ Ｇ １６７４．０
サイクル番号
＋８ Ａ ｌ６２１．０
２９ Ｎ ｔ＋ｇ、３
３０ Ｋ １９１０．６
３１ Ｋ １１６１７
３２ Ｇ ７７１．０
３３ Ｌ １１７７．０
３４ ５ １５９．７
３５ Ｋ １２０４．８
３６ Ｇ ５５１ｇ
７ＣＮＤ
３８Ｆ ９９８．２
３９ Ｇ ６６１２
４０ Ｌ ９ｉ９．６
４１ Ｋ ６３４．２
４２ Ｌ １２５１．３
４３ Ｄ １４１．１
４４ ２ ３３９．１
４６ Ｇ ７０２．７
４７ Ｓ １６３．２
４８ Ｍ ＨＱ、９
４９ Ｓ ６Ｌ８
５Ｇ Ｇ ４３０．１
５１ Ｌ ４ＧＬ６
５２ Ｇ ２２３．７
３ＣＨＤ
第２表
合成ヒトＣＮＰ−５３のアミノ酸組成比ｓｘ
ｈｒ
ｅｒ
ｌｘ
ｌ ｙ
Ｐｒ。
ｌａ
１／２Ｃｙｓ
ａ１
ｅｔ
１ｅ
ｅｕ
ｙｒ
ｈｅ
ｙｓ
ｉｓ
ｒｐ
４．９５
０．９２
３．５９
２．０６
７．０４
１．０１
４．９０
１．２１
０．９７
０．９７
０．９９
０．９７
１．０２
６．９２
０．９７
Ｄ
実施例７．ｈＣＮＰ−５３の生理活性の測定ヒヨコ直腸
弛緩活性は、Ｃｕｒｒｉｅ等の方法（Ｃｕｒｒｉｅ ｃ
ｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、２２１．１−１３．１９８３
）に従い測定した。この結果、ｈＣＮＰ−５３のＥＣ，
。は０．８７±０゜ｌｎＭで、α−ＡＮＰの約３倍高い
活性を示した。
弛緩活性は、Ｃｕｒｒｉｅ等の方法（Ｃｕｒｒｉｅ ｃ
ｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、２２１．１−１３．１９８３
）に従い測定した。この結果、ｈＣＮＰ−５３のＥＣ，
。は０．８７±０゜ｌｎＭで、α−ＡＮＰの約３倍高い
活性を示した。
ナトリウム利尿作用及び血圧降下作用の測定は、ＤｅＢ
＋＋ｔｄ等の方法（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ、、２８Ｊ９−９
４．１９ｇ１）に従いラットを用いて測定した。この結
果、ｈＣＮＰ−５３は１００１００ｎ／ｋｇ投与で尿排
出量を２．５倍高め、さらに血圧を１０％低下させるこ
とが判った。
＋＋ｔｄ等の方法（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ、、２８Ｊ９−９
４．１９ｇ１）に従いラットを用いて測定した。この結
果、ｈＣＮＰ−５３は１００１００ｎ／ｋｇ投与で尿排
出量を２．５倍高め、さらに血圧を１０％低下させるこ
とが判った。
［発明の効果］
以上のように、本発明者らは、ｐｃＮＰｃＤＮＡをプロ
ーブとして、ヒト染色体遺伝子ライブラリーからｈＣＮ
Ｐ遺伝子の一部を単離し、さらにこれをプローブとして
、ｈＣＮＰ前駆体の全領域をコードする遺伝子を単離す
ることに成功した。
ーブとして、ヒト染色体遺伝子ライブラリーからｈＣＮ
Ｐ遺伝子の一部を単離し、さらにこれをプローブとして
、ｈＣＮＰ前駆体の全領域をコードする遺伝子を単離す
ることに成功した。
また、この遺伝子はｈＣＮＰのプロモーター領域をも含
むものであった。この結果、まずヒトにおいてもブタ同
様ＣＮＰをコードする遺伝子が存在することが明らかと
なり、さらにｈＣＮＰ前駆体タンパクの全構造か決定さ
れた。ｈＣＮＰ前駆体タンパクは、ブタ同様１２６個の
アミノ酸残基からなり、そのＣ−末端には、ブタ脳から
単離されたｐＧＮＰ−５３およびｐＣＮＰ−２２に対応
するアミノ酸配列が存在した。これらのペプチドのプロ
セシング部位のアミノ酸配列はブタとヒトで完全に一致
することからヒトにおいても、本発明者らがすでに明ら
かにしているブタ同様の生合成経路を経てこれらのペプ
チドが作られ、生体内の体液量及び血圧の恒常性を調節
するホルモンまたは神経伝達物質として作用することが
予想される。
むものであった。この結果、まずヒトにおいてもブタ同
様ＣＮＰをコードする遺伝子が存在することが明らかと
なり、さらにｈＣＮＰ前駆体タンパクの全構造か決定さ
れた。ｈＣＮＰ前駆体タンパクは、ブタ同様１２６個の
アミノ酸残基からなり、そのＣ−末端には、ブタ脳から
単離されたｐＧＮＰ−５３およびｐＣＮＰ−２２に対応
するアミノ酸配列が存在した。これらのペプチドのプロ
セシング部位のアミノ酸配列はブタとヒトで完全に一致
することからヒトにおいても、本発明者らがすでに明ら
かにしているブタ同様の生合成経路を経てこれらのペプ
チドが作られ、生体内の体液量及び血圧の恒常性を調節
するホルモンまたは神経伝達物質として作用することが
予想される。
本発明で特に注目すべきことは、ｈＣＮＰ−５３の構造
をｐｃＮＰ−５３と比較した場合、アミノ酸が２カ所異
なることか明らかとなった点にある。そこで、本発明者
らは、ｈＣＮＰ−５３を化学合成し、その生理活性をヒ
ヨコ直腸弛緩作用、ナトリウム利尿及び血圧降圧作用で
確認した。すなわちｈＣＮＰ−５３が生理活性ペプチド
であることを証明しにのである。このことはＧＮＰファ
ミリーに属するペプチドを医薬品に応用する上で、非常
に重要な意味をもつ。たとえば、ヒトと構造の異なるｐ
ＣＮＰ−５３を医薬品として使用したならば、おそらく
生体内では異物として認識され、抗体が産生される。そ
の結果、Ｉ）ＧＮＰ−５３の活性が中和されたり、抗原
抗体コンプレックスによる腎毒性が生じる可能性かある
。また、ヒト細胞のＧＮＰレセプターに対する親和性が
ｈＣＮＰ−５３に比へ弱い可能性もあり、その場合は作
用自体が弱くなる。同様のことは、ｈＣＮＰ−５３に限
らすｈＣＮＰ前駆体タンパクから生合成される可能性の
あるペプチド［ｐｒｅｐｒｏｈＣＮＰのアミノ酸−次配
列番号で２４から１０２番目の間には、少なくとも９個
のりジン残基（２４，３０，５１５２，５５，６５，８
９，９７および９９９番目と８個のアルギニン残基（３
３，６８，７０，）３，７６、Ｈ，８７および９５番目
）が存在し、ｐ ｒ ｏ ｈＣＮＰは生体内においてプ
ロセシング部位により、これら塩基性アミノ酸残基のＣ
−末端側が特異的に切断される可能性があり、生体内に
おいてｈＣＮＰ−２２およびｈＣＮＰ５３のＮ−末端に
さらにアミノ酸か付加したペプチドが存在している可能
性が高い。コにおいても言えることである。
をｐｃＮＰ−５３と比較した場合、アミノ酸が２カ所異
なることか明らかとなった点にある。そこで、本発明者
らは、ｈＣＮＰ−５３を化学合成し、その生理活性をヒ
ヨコ直腸弛緩作用、ナトリウム利尿及び血圧降圧作用で
確認した。すなわちｈＣＮＰ−５３が生理活性ペプチド
であることを証明しにのである。このことはＧＮＰファ
ミリーに属するペプチドを医薬品に応用する上で、非常
に重要な意味をもつ。たとえば、ヒトと構造の異なるｐ
ＣＮＰ−５３を医薬品として使用したならば、おそらく
生体内では異物として認識され、抗体が産生される。そ
の結果、Ｉ）ＧＮＰ−５３の活性が中和されたり、抗原
抗体コンプレックスによる腎毒性が生じる可能性かある
。また、ヒト細胞のＧＮＰレセプターに対する親和性が
ｈＣＮＰ−５３に比へ弱い可能性もあり、その場合は作
用自体が弱くなる。同様のことは、ｈＣＮＰ−５３に限
らすｈＣＮＰ前駆体タンパクから生合成される可能性の
あるペプチド［ｐｒｅｐｒｏｈＣＮＰのアミノ酸−次配
列番号で２４から１０２番目の間には、少なくとも９個
のりジン残基（２４，３０，５１５２，５５，６５，８
９，９７および９９９番目と８個のアルギニン残基（３
３，６８，７０，）３，７６、Ｈ，８７および９５番目
）が存在し、ｐ ｒ ｏ ｈＣＮＰは生体内においてプ
ロセシング部位により、これら塩基性アミノ酸残基のＣ
−末端側が特異的に切断される可能性があり、生体内に
おいてｈＣＮＰ−２２およびｈＣＮＰ５３のＮ−末端に
さらにアミノ酸か付加したペプチドが存在している可能
性が高い。コにおいても言えることである。
さらに、第２図にしめすｈＣＮＰ前駆体タンパクの遺伝
子は、このタンパクをコードする構造遺伝子領域のみな
らず、この構造遺伝子を発現させるプロモーター領域を
も含んでいることが判った。
子は、このタンパクをコードする構造遺伝子領域のみな
らず、この構造遺伝子を発現させるプロモーター領域を
も含んでいることが判った。
このプロモーター領域の下流に、例えばＣＡＴ （クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーセ）遺伝子
をつなぎ、適当なヒト細胞に形質導入することで、ｈｃ
ＮＰの発現調節機構を詳細に検討することが可能になる
。
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーセ）遺伝子
をつなぎ、適当なヒト細胞に形質導入することで、ｈｃ
ＮＰの発現調節機構を詳細に検討することが可能になる
。
以上述べたことから、本発明により明らかにされたｂＣ
ＮＰ前駆体タンパクの染色体遺伝子およびアミノ酸−次
配列の情報は、今後、ヒトにおけるＧＮＰの生合成、生
理作用のメカニズムを解明する上で、また、ＧＮＰファ
ミリーに属するペプチドを医薬品へと応用する上で大い
に貢献するものである。
ＮＰ前駆体タンパクの染色体遺伝子およびアミノ酸−次
配列の情報は、今後、ヒトにおけるＧＮＰの生合成、生
理作用のメカニズムを解明する上で、また、ＧＮＰファ
ミリーに属するペプチドを医薬品へと応用する上で大い
に貢献するものである。
第１図はｈｇＥｃｏ−２とｈｇＥｃｏ−１の制限酵素地
図及び塩基配列決定のストラテジーを示す図である。 第２図は、ｈＣＮＰ前駆体タンパクをフードするｈｇＥ
ｃｏ−１のＤＮＡ塩基配列と構造遺伝子領域のエクソン
にコードされているｈ ＣＮ、Ｐ前駆体タンパクのアミ
ノ酸配列を示す図である。 第３図は、ｈＣＮＰｃＤＮＡの全塩基配列とこれにコー
ドされるｈＣＮＰ前駆体タンパクのアミノ酸配列を示す
図である。 代 理 人 弁理士 湯 浅 恭 三（外４名） ＧＡＡＴＴＣＣτＧＴＴＴＣＣＴＡＡＧＣＡＡＡＧＴＧ
ＡＣＣＴＧＴＧＴＡＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧτ
τＧＴＧＡＧＴＣＡＧＧＧＴＡＴＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡ
ＡＧＧＧＧＴＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＴＧＣＣＧＡ
ＣＡＧＡＧＣＡＧＡＣＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧ ＣＣＧＣ
ＣＴ ＴＡＧＣＡＧ ＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＴ
ＣＡＣＴ ＧＡＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴＣＣＡ；心ＣＣＣＣＴＣＴＴ
ＣＡＣＴＣＣＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴ ＧＴＣＴＣＣＣＣＡＧＭ
〜ＴＣＣＴＧＣＧＧＣＡＡＣＡ ＧＣＡＧＣＣＡＧＴＣＡＴＡＧＡＴＴＣＣＴＧＣＴＣＴ
ＴＣＡＡＴＣＡＡＴＴＣＧＧＧＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＡ ＣＣＡＣＡＣＴＣＣＴＴＡＧＴＧＴＣＣＡＡＧＧＧＡＣ
ＣＣＡＣＧＧＧＧＡＣＣＴＣＴＣＴ ＴＧＧＣＧＡＧＣＡＴＡＣＧＡ ＡＧＡＧＣＡＧＴＡＡＣ ＴＧＡＧＣＡＴＧＡＡＴＡＴ ＴＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＡＣＣＴＡＡＣＣＧＧＡ
ＧＣＴＧＣＡＡＴＧＣＣＡ ＧＴＴＴＧＧＣ ＴＴＣＴＧＣＣＴＧＴＡ ＧＣＧＣＣＡＡＣＴ ＴＴＣＣＴＣＴＧＡＧＣＣ ＡＣＧＴＡＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＴＡＧＡＧＴＧＡＧ
ＴＧＣＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣＴ第２−１ ＣＡＣＣＧＡ − ＴＴＣＣＣＣＴＧＴＧＣＧＣＴＣＡＧしＧＡＧＣＣＣＧ
ＣＣＧＡＧＣＴＭＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧＣ
ＧＧＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧＴＧＴＣＡＴＴＧ
ＧＣＴＧＡＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＡＴＴ
Ａ ＧＡＧＣＣ；ＣＡＣＣＣＡＧＣ”
ＣＴＧＣＴＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣ ＧＣＣＣＣＴＣＧＡＣＣ ＣＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡ ＭｅヒＨ工５ＬｅｕＳｅｒＧｌｎＬｅｕＬｅｕＡｌａＣ
ｙｓＡｌａＬｅｕＬＴＧＣＴＣＡＣ ｅｕＬｅｕＴｈ ｒＬｅｕ Ｌｅ ｕＳ ｅ ｒＬｅ
ｕＡｒｇＰ ｒｏｓｅ ｒＧｌ ｕＡｌａＬｙｓＰ ｒ
ｏＧ ｌｙＡＣＧＣＣＧＣＣｒ ｌａＰｒｏＰｒｏＬｙｓ ＴＧＣＧＣＧＴＧ ＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＴＧＣ ＴＧＣＧＧＧＧ ＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡ ＡＣＡＣＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＣＣＣ ＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＣ ＧＡＣＡＧＧＴＣＣＣ ｖａｌＰｒｏＡｒｇＴｈｒＰｒｏＰｒｏＡｌａＧｌｕＧ
ｌｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＰｒｏＧｏ７０ ２１６゜ ２２５゜ 第２−２図 Ａ ＧＧＧＣ
ＧＡＣＭＧＧＣＴＣＣＣＧＧＧＧｌｎＡｌａＡｌａＧ
ｌ ｙＧｌｙＧ １ｙＧｌｎＬｙ ｓＬｙ ｓＧ １ｙ
Ａｓ ｐＬｙ ５ＡｌａＰ ｒｏＧ ｌ ｙＧＧＣＧＧ
ＧＧＧＣＧＣＣＭＴＣＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡｌ ｙＧｌ
ｙＧｌ ｙＡｌａＡｓ ｎＬｅｕＬｙｓＧｌｙＡｓｐＡ
ｒｇＳｅｒＡｒｇＬｅｕＬｅｕＡｒｇＡｓ ｐＬｅｕＡ
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ｇＡｌａＡｌａＴｒｐＡｌａＡｒｇＬｅｕＬｅ ｕＧｌ
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ｓｅｒＭｅセ５ｅｒＧｌｙＬｅｕＧｌｙＣｙｓ”★ＧＧ
ＴＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＡ
ＡＣＣＧＴＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＣ ＡＧＡＧＣＧＣ ＴＣＴＣＡＧＴＧＣＴＴＧＴＧＧＣＡ ３１５゜ 第 図 ＣＴＡＴＴＴＣＡＧＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＣ
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ＣＴＣＧＡＡＣＴＣＡＡＣＡＣＧＴＣＣＣＡＧＡＧＴＣ
ＣＣＴＣＡＣＣＡＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＧＡＣＣ ＣＡＣＣＣＣＧＣＡＣＴ
ＣＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴ
ＧＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＡＡＴＴＴＣＴＣＴＣＣＴ
ＣＴＴＴＣＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＡＴＴＣＣＴＧＣＣＧ
ＣＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＡＣＴＧＭＴＡＡＣＡＴＣ
ＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧＴＣＡＴＧ
ＴＧＣＧＴＴＡＧＧＡ
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ＡＧＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＣＡＧＧ
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ＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＴＣＡＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＡ
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ＣＣＴＧＣＡＣＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧ ３９
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ＡＧＣＡＴＣＭＧＴＴＣＡＡＡＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＴ
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ノ酸配列を示す図である。 第３図は、ｈＣＮＰｃＤＮＡの全塩基配列とこれにコー
ドされるｈＣＮＰ前駆体タンパクのアミノ酸配列を示す
図である。 代 理 人 弁理士 湯 浅 恭 三（外４名） ＧＡＡＴＴＣＣτＧＴＴＴＣＣＴＡＡＧＣＡＡＡＧＴＧ
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〜ＴＣＣＴＧＣＧＧＣＡＡＣＡ ＧＣＡＧＣＣＡＧＴＣＡＴＡＧＡＴＴＣＣＴＧＣＴＣＴ
ＴＣＡＡＴＣＡＡＴＴＣＧＧＧＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＡ ＣＣＡＣＡＣＴＣＣＴＴＡＧＴＧＴＣＣＡＡＧＧＧＡＣ
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ＴＧＣＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣＴ第２−１ ＣＡＣＣＧＡ − ＴＴＣＣＣＣＴＧＴＧＣＧＣＴＣＡＧしＧＡＧＣＣＣＧ
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ＧＧＴＴＣＧＴＡＣＣＴ ４１４０ＣＴＧＧＣＴＧ
ＴＣ ＧＡＴＧＣＴＧＴＧ ４２３０ ＴＡＧＧＡＧＧＭＴＣＣＡＣＡＴＴＧＴＴＭＧＭＴＴＣ
４２５８ｏ５０ ＧＡＧＧＣ ＴＡＧＭＣ ＧＧＡＡＴＧＣＧＣＡＴＣＣ
Claims (11)
- （１）下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド。 【遺伝子配列があります。】
- （２）請求項第１項記載のアミノ酸配列においてＮ末端
からシグナルペプチドが欠損しているポリペプチド。 - （３）請求項第１項記載のアミノ酸配列においてＮ末端
側の１位及至１０４位の何れか２個の隣接するアミノ酸
残基間が切断され、Ｎ末端のペプチドが欠損しているポ
リペプチド。 - （４）下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド。 【遺伝子配列があります。】
- （５）下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ。 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 - （６）下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ。 【遺伝子配列があります。】 - （７）下記の塩基配列を有する請求項第６項記載のＤＮ
Ａ。 【遺伝子配列があります。】 - （８）下記の塩基配列を有する請求項第６項記載のＤＮ
Ａ。 【遺伝子配列があります。】 - （９）請求項第１項記載のアミノ酸配列においてＮ末端
からシグナルペプチドが欠損しているポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ。 - （１０）請求項第１項記載のアミノ酸配列においてＮ末
端側の１位及至１０４位の何れか２個の隣接するアミノ
酸残基間が切断され、Ｎ末端のペプチドが欠損している
ポリペプチドをコードするＤＮＡ。 - （１１）第２図の塩基配列を有するＤＮＡ。
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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