JP2011504506A - C型ナトリウム利尿ペプチドの変異体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、1つまたは複数の欠失;天然アミノ酸、非天然アミノ酸および/またはペプチド模倣体(ペプチド結合イソスターを含む)による付加および/または置換;アミノ酸延長部分;および/または、例えばポリエチレングリコールおよび疎水性酸などの他の化学部分を含むC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体を提供する。CNP変異体は、例えば、骨格異形成症および軟骨無形成症などの骨関連障害、ならびに、例えば、再狭窄およびアテローム動脈硬化症などの血管平滑筋障害を含むが、これらに限定されない、CNPに反応性を示す疾患の治療用の治療薬として有用である。
Description
(関連する出願への相互参照)
本願は、2007年11月21日に出願された米国仮特許出願第60/989,497号、および2008年6月13日に出願されたに米国仮特許出願第61/061,488号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第60/989,497号および同第61/061,488号のそれぞれの開示は、その全体が、参考により本明細書中に援用される。
本願は、2007年11月21日に出願された米国仮特許出願第60/989,497号、および2008年6月13日に出願されたに米国仮特許出願第61/061,488号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第60/989,497号および同第61/061,488号のそれぞれの開示は、その全体が、参考により本明細書中に援用される。
(発明の分野)
本発明の分野は、一般的に、C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体、CNP変異体を含む組成物、ならびに骨格異形成症(例えば、軟骨無形成症)などの骨関連障害および血管平滑筋障害を含むが、これらに限定されない、CNPに反応性を示す障害を治療するためのCNP変異体を用いる方法に関する。
本発明の分野は、一般的に、C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体、CNP変異体を含む組成物、ならびに骨格異形成症(例えば、軟骨無形成症)などの骨関連障害および血管平滑筋障害を含むが、これらに限定されない、CNPに反応性を示す障害を治療するためのCNP変異体を用いる方法に関する。
ナトリウム利尿ペプチドファミリーは、次の3つの構造的に関連するペプチドからなっている:心房ナトリウム利尿ペプチド(ANP)(GenBankアクセス番号NP_006163、ANP前駆体タンパク質NPPA)、脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)(GenBankアクセス番号NP_00215、BNP前駆体タンパク質NPPB)およびC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)(非特許文献1、(GenBankアクセス番号NP_077720、CNP前駆体タンパク質NPPC)(J. Hypertens.、10巻、907〜912頁(1992年))。これらの小さい一本鎖ペプチド(ANP、BNP、CNP)は、17アミノ酸ループ構造を有し(Levinら、N. Engl. J. Med.、339巻、863〜870頁(1998年))、複数の生物学的過程において重要な役割を有する。ANPおよびBNPは、グアニリルシクラーゼA(GC−A)とも呼ばれているナトリウム利尿ペプチド受容体A(NPR−A)に結合し、活性化して、より高い細胞内サイクリックグアノシン一リン酸(cGMP)レベルをもたらす。同様に、CNPは、NPR−B(GC−B)と相互作用して、cGMPの産生を刺激する(非特許文献2)。第3のタイプの受容体NPR−Cは、ナトリウム利尿ペプチドのそれぞれに高い親和力で結合し、細胞外コンパートメントからペプチドを捕捉するために主として機能し、上記ペプチドをリソソーム内に蓄積させ、そこでそれらが分解される(Science、238巻、675〜678頁(1987年))。ANPおよびBNPは、主として心臓の筋肉細胞内で産生され、心血管恒常性に重要な役割を有すると考えられている(Science、252巻、120〜123頁(1991年))。CNPは、中枢神経系内、生殖器官内、骨内および血管内皮内を含めた、より広い範囲で発現される(非特許文献3)。
ヒトにおいて、CNPは、最初にナトリウム利尿ペプチド前駆体C(NPPC)遺伝子により一本鎖126アミノ酸プレプロポリペプチドとして産生される(Biochem. Biophys. Res. Commun.、168巻、863〜870頁(1990年))。シグナルペプチドの除去により、プロCNPが生成し、エンドプロテアーゼであるフューリンによるさらなる切断により、活性な53アミノ酸ペプチド(CNP−53)が生成し、これが分泌され、未知の酵素による切断を再び受けて、成熟22アミノ酸ペプチド(CNP−22)が生成する(Wu、J. Biol. Chem.、278巻、25847〜852頁(2003年))。CNP−53とCNP−22は、それらの分布が異なり、CNP−53は組織中で優勢であるが、CNP−22は主として血漿および脳脊髄液中に認められる(J. Alfonzo、Recept. Signal. Transduct. Res.、26巻、269〜297頁(2006年))。軟骨中の優勢なCNPの形は不明である。CNP−53とCNP−22は、両方ともNPR−Bに同様に結合する。さらに、それらは両方とも用量依存的かつ同様の様態でcGMPの産生を誘導する(VT Yeung、Peptides、17巻、101〜106頁(1996年))。
天然CNP遺伝子およびポリペプチドは、以前に記載された。米国特許第5,352,770号は、ヒトCNPと配列が同一のブタ脳から分離され、精製されたCNP−22および心血管適応症の治療におけるその使用を開示している。米国特許第6,034,231号は、プロCNP(126アミノ酸)のヒト遺伝子およびポリペプチドならびにヒトCNP−53の遺伝子およびポリペプチドを開示している。
細胞外間隙からのCNPのクリアランスは、CNPを速やかに分解する、膜結合中性エンドペプチダーゼ(NEP)の作用(Biochem. J.、291巻(Pt1)、83〜88頁(1993年))と、CNPに結合し、かつCNPをリソソーム中に蓄積させる(そこでCNPが分解される)NPR−Cとを介して起こる。CNPは、正常人において2.6分のin vivo半減期を有することが示された(J. Clin. Endocrinol. Metab.、78巻、1428〜35頁(1994))。CNPの血漿濃度が低いこと(J. Bone. Moner. Res.、19(補1)巻、S20頁(2004年))および多くの組織においてそれがNPR−Bと共発現することから、CNPは、主としてオートクリン/パラクリンメカニズムにより機能することが示唆される。
上述のように、CNPは、グアニリルシクラーゼB(GC−B)とも呼ばれているナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR−B)に結合し、活性化して、より高い細胞内サイクリックグアノシン一リン酸(cGMP)レベルをもたらす。cGMPの産生により媒介される下流シグナリングは、軟骨内骨化を含む種々の生物学的過程に影響を及ぼす。したがって、この経路におけるいずれかの成分の上昇または抑制は、異常な骨成長につながる可能性がある。例えば、マウスモデルにおけるCNPまたはNPR−Bのノックアウトは、より短縮した長骨および椎骨を伴う矮小化表現型を有する動物をもたらす。適切なCNPシグナリングを遮断するヒトNPR−Bの突然変異が同定され、小人症をもたらす(Olneyら、J. Clin. Endocrinol. Metab.、91巻(4号)、1229〜1232頁(2006年)、Bartelsら、Am. J. Hum. Genet.、75巻、27〜34頁(2004年))。これに対して、CNPのレベルの上昇をもたらすように遺伝子工学により改変したマウスは、延長した長骨および椎骨を示す。
軟骨無形成症は、軟骨形成の異常を引き起こす、線維芽細胞成長因子受容体3(FGFR−3)の遺伝子における常染色体優性突然変異の結果である。FGFR−3は、通常、軟骨細胞の成長、そして、したがって、骨の成長に対する負の調節効果を有する。軟骨無形成症において、FGFR−3の突然変異形は、構成的に活性であり、骨の著しい短縮をもたらす。軟骨細胞の増殖および分化は、妨げられ、著しく短い成長板軟骨につながる(P. Krejciら、J. Cell Sci.、118巻、5089〜5100頁(2005年))。軟骨内骨化は、長骨の縦方向の成長を調節する過程である。成長板には、静止、増殖、肥大および石灰化帯という4つの帯域が存在する。成長板において、NPR−Bは増殖性細胞により発現されるが、NPR−Cは肥大性細胞により発現される(Yamashiteら、J. Biochem.、127巻、177〜179頁(2000年))。正常な軟骨内骨成長において、軟骨細胞は、柱に組織化し、成長板の増殖帯において増殖する。これらの柱は、軟骨無形成症患者では組織崩壊している。さらに、肥大帯は、細胞が大きくなり、最終的にアポトーシスされ(溶解し)、骨細胞の侵入および鉱質化につながる場所である。肥大軟骨細胞および肥大帯の全体的な大きさは、軟骨無形成症患者において正常患者よりはるかに小さい。CNPは、軟骨細胞および骨の成長の正の調節因子であるNPR−Bのアゴニストである。CNP/NPR−Bの下流シグナリングは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)のレベルにおけるFGFR−3経路を阻害する。MAPKにおける阻害は、成長板の増殖帯および肥大帯における軟骨細胞の増殖および分化を促進し、骨の成長をもたらす。
ヒトにおいて、FGFR−3の活性化突然変異が遺伝的小人症の主な原因である。活性化FGFR−3を有するマウスは、骨格異形成の最も一般的な形である軟骨無形成症のモデルとしての役割を果たし、CNPの過剰発現は、これらの動物を小人症から救出するものである。したがって、CNPおよびCNPの機能的変異体は、種々の骨格異形成の治療のための可能な治療薬である。
CNPの治療における使用は、ヒトにおいてin vivoで2.6分であることが示された(J. Clin. Endocrinol. Metab.、78巻、1428〜35頁(1994年))、その短い血漿半減期により現在のところ制限されている。ヒト血漿中に一般的に認められる内在性レベル(約5pM)以上にCNP濃度を高くするために、全身投与CNPを用いたすべてのヒトおよび動物試験において持続注入が必要であった。より長いin vivo血清半減期を有し、野生型CNPと同様または改善された活性を示すCNP変異体は、持続可能な治療戦略のために重要である。CNPの半減期をヒト血漿中において短縮させる2つのメカニズムは、中性エンドペプチダーゼ(NEP)による分解およびナトリウム利尿ペプチド受容体C(NPR−C)によるクリアランスである(Growth Horm. & IGF Res.、16巻、S6〜S14頁(2006年))。ペプチドの改変により、エンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼ切断に対する抵抗性を改善することができると報告されている(Amino Acids、30巻、351〜367頁(2006年)、Curr. Opin. Biotech.、17巻、638〜642頁(2006年))。
CNPの種々の類似体および誘導体の生物学的活性が評価された。Cys6およびCys22の代わりにS−メチルCysを用いることにより、Cys6−Cys22ジスルフィド結合によるペプチドの環化が、cGMPの産生の刺激におけるCNPの活性に重要であることが報告により示された(Biochem. Biophys. Res. Comm.、183巻、964〜969頁(1992年)、CNPの機能性に重要なアミノ酸を同定するためにアラニンスキャニングも用いる)。活性のさらなる有意な増大は、アミノ酸Leu9、Lys10およびLeu11の組み合わせられた存在に起因すると報告されている。米国特許第5,434,133号は、アミノ酸が6位におけるCysまたはPmp(ペンタシクロメルカプトプロピオン酸)、7位におけるPhe、4−クロロPhe、4−フルオロPhe、4−ニトロPheまたはCha(3−シクロヘキシルAla)、9位におけるGly、Val、AibまたはtLeu、11位におけるLeuまたはIle、および22位におけるCysまたはPmpから選択される、アミノ酸6、7、9、11または22位における置換を有するCNP−22を含むCNP類似体を記載している。
米国特許公開第2004/0138134号(現在は米国特許第7,276,481号)は、9、10、11、16、17、19または20位における他の天然アミノ酸の少なくとも1つの置換を含む、CNP−22のアミノ酸Cys6〜Cys22を含むCNP変異体(「CNP−17」)、Cys6とPhe7との間の報告されたNEP切断の主要な部位におけるHis残基の付加などの挿入および欠失によるCNP変異体、ならびに異常な骨における骨成長板のサイズの増加および異常な骨の延長のためのそのような変異体を使用する方法を述べている。しかし、cGMPの生成により測定される活性の有意な増加はこれらの変異体において得られず、in vitroでの細胞を用いた方法で認められたように、活性はほぼすべての変異体で低下した(実施例6)。さらに、CNP類似体の主張されたNEP抵抗性およびNPR−C抵抗性を実証する、例えば、in vitroでの安定性または薬物動態(PK)の改善のin vivoでの測定などの裏づけデータは提供されなかった。米国特許第6,743,425号は、NPR−B/GC−Bを活性化し、C型ナトリウム利尿ペプチドCNP−22およびCNP−53を含む、ペプチドまたは低分子量化合物である軟骨無形成症の治療用の物質を開示している。PCT公開番号WO94/20534は、ジスルフィドまたは二重結合の形成に起因する限られた数のアミノ酸置換および環状キメラペプチドである、バソナトリンペプチド(vasonatrin peptide)(VNP)と呼ばれるCNP−22およびANPの5アミノ酸C末端のキメラを開示している。
他のナトリウム利尿ペプチドファミリーメンバーの半減期を改善するためのアプローチは、NPR−Cに対するANPの親和性を低下させること(米国特許第5,846,932号)、NPR−Cのペンタペプチドアンタゴニストを利用すること(WO00/61631)およびチオルファンおよびカンドキサトリルなどのNEP阻害剤を併用投与すること(Clin. Exp. Pharma. Physiol.、25巻、986〜991頁(1997年)、Hyperten.、30巻、184〜190頁(1997年))などである。WO2004/047871は、BNPおよびBNP変異体と、ポリアルキレングリコール部分、糖部分、ポリソルベート部分、ポリカチオン性部分および循環中の半減期の改善を示すと報告され、急性鬱血性心不全の治療に有用であると報告されている他の親水性ポリマー部分との結合体を開示している。
Biochem. Biophys. Res. Commun.、168巻、863〜870頁(1990年)
J. Hypertens.、10巻、1111〜1114頁(1992年)
Hypertension、49巻、419〜426頁(2007年)
しかし、その機能性を保持すると同時に、NEPに対して抵抗性のあるCNPを調製することに成功した戦略に関する公表された報告は存在していなかった。
本発明は、骨関連障害(例えば、軟骨無形成症)および血管平滑筋障害の治療に有用であるC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体に関する。本発明は、CNPの機能性を保持すると同時に、例えば、中性エンドペプチダーゼ(NEP)に結合する能力の低下、NEPによるタンパク質分解に対するより大きい抵抗性および/またはクリアランスナトリウム利尿ペプチド受容体C(NPR−C)に対する親和性の低下の結果としての長い血清半減期を有するCNP変異体を含む。
CNP−22(本明細書では「wtCNP22」または「CNP22」と呼ぶ)の野生型配列を下に示す。
(N末端)Gly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−Lys10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22(配列番号1)
CNP22の6〜22位は、Cys6とCys22との間のジスルフィド結合により環状ドメインを形成している。17アミノ酸環状構造は、NPR−BへのCNPの結合に重要であることが示された(Schiller、Biochem. Biophys. Res. Commun.、138巻、880〜886頁(1986年))。CNP22の6〜22位のアミノ酸配列は、本明細書では「CNP17」と呼ぶ(配列番号2)。
(N末端)Gly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−Lys10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22(配列番号1)
CNP22の6〜22位は、Cys6とCys22との間のジスルフィド結合により環状ドメインを形成している。17アミノ酸環状構造は、NPR−BへのCNPの結合に重要であることが示された(Schiller、Biochem. Biophys. Res. Commun.、138巻、880〜886頁(1986年))。CNP22の6〜22位のアミノ酸配列は、本明細書では「CNP17」と呼ぶ(配列番号2)。
CNPは、Cys6−Phe7、Gly8−Leu9、Lys10−Leu11、Arg13−Ile14、Ser16−Met17およびGly19−Leu20などの多くの部位におけるNEP切断を受けやすい。1つの実施形態において、本発明は、(1)その全体的なサイズもしくは分子量を、例えば、約2.6kDaもしくは2.8kDaから約4kDa、4.2kDa、4.4kDa、4.6kDa、4.8kDa、5kDa、5.2kDa、5.4kDa、5.6kDa、5.8kDa、6kDa、6.2kDa、6.4kDaまでもしくは約7kDa、7.2kDaもしくは約8.2kDaまでの範囲に増加させるために改変され、かつ/または(2)上に示した部位の1、2、3、4、5つもしくは6つすべてにおけるNEP切断に対するその感受性を低下させるために改変されているCNP変異体を含む。CNP変異体のサイズまたは分子量は、様々な手段により、例えば、追加のアミノ酸および/または他の種類の化学(例えば、天然もしくは合成ポリマー)基を例えばN末端、C末端および/または側鎖におけるペプチド配列に結合させることにより、かつ/またはよりかさばった側鎖を有する天然アミノ酸、非天然アミノ酸および/またはペプチド模倣体を用いることにより、増加させることができる。CNP変異体は、他の機能または構造部分に場合によってさらに結合させることができる。本明細書で述べる実施形態のいずれかと場合によって組み合わせて、(1つまたは複数の)突然変異(例えば、(1つまたは複数の)置換、(1つまたは複数の)付加および/または(1つまたは複数の)欠失)をCNP22の特定の(1つまたは複数の)位置に導入して、NPR−Cに対するCNP変異体の親和性を低下させることができる。NEP抵抗性またはCNP活性に影響を及ぼすことのないさらなる改変、例えば、保存的置換、または当技術分野で公知の他の改変を行うことができる。
1つの実施形態において、CNP変異体は、次の一般式:(x)−Gly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−Lys10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号5)により表すことができ、ここで、
CNP変異体は、次のCNP残基:Gly1、Lys4、Gly5、Cys6、Phe7、Gly8、Leu9、Lys10、Leu11、Ile14、Gly15、Ser16、Met17、Gly19、Leu20およびGly21の1つまたは複数に対応する位置における修飾ペプチド結合(例えば、ペプチド結合イソスターの使用による)をもたらす可能性がある1つまたは複数の修飾アミノ酸を含み、
(x)および(z)は、独立に、非存在であってよく、またはナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、NPPC、ANP、BNP)もしくは非ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、IgG等)であってよい。
CNP変異体は、次のCNP残基:Gly1、Lys4、Gly5、Cys6、Phe7、Gly8、Leu9、Lys10、Leu11、Ile14、Gly15、Ser16、Met17、Gly19、Leu20およびGly21の1つまたは複数に対応する位置における修飾ペプチド結合(例えば、ペプチド結合イソスターの使用による)をもたらす可能性がある1つまたは複数の修飾アミノ酸を含み、
(x)および(z)は、独立に、非存在であってよく、またはナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、NPPC、ANP、BNP)もしくは非ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、IgG等)であってよい。
1つの実施形態において、CNP変異体は、(1)CNP22の6、7または8位(Cys6、Phe7またはGly8)の1つに対応するアミノ酸位置における改変、(2)1〜5位におけるアミノ酸(Gly1、Leu2、Ser3、Lys4およびGly5)のいずれかまたはすべての場合によって欠失、付加および/または置換ならびに(3)6〜22位に対応する位置における場合によって1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個までのさらなる改変(欠失、付加および/または置換)(そのうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個が保存的置換または本明細書で述べるもしくは当技術分野で公知の他の置換であってよい)を含む。
数による特定のアミノ酸位置への言及(例えば、CNP22の7位)は、当該CNP変異体における当該位置の数が先行する挿入または欠失のために変化したとしても、いずれかのCNP変異体における対応するアミノ酸位置を意味する。例えば、「7位」または「Phe7」への言及は、最初の5つのアミノ酸が欠失したCNP変異体の対応する2位を意味する。同様に、「7位」への言及は、1つのアミノ酸がN末端に付加されたCNP変異体の対応する8位を意味する。
本明細書で述べる実施形態のいずれかにおいて、CNP変異体は、CNP22の6および22に対応する位置の間の共有結合により環化させることができる。当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて共有結合を形成させることが考えられる。他の実施形態において、CNP変異体は、該ペプチドのN末端におけるまたはN末端の方にあるアミノ酸とC末端におけるまたはC末端の方にあるアミノ酸との間に形成される共有結合により環化させることができる(この目的のために「末端」アミノ酸と呼ぶ)。1つの実施形態において、共有結合は、2つの末端アミノ酸の側鎖またはCNP22の6および22の対応する位置におけるアミノ酸の間で形成させる。他の実施形態において、共有結合は、1つの末端アミノ酸の側鎖と他の末端アミノ酸の末端基との間で、または各末端アミノ酸の末端基との間で形成させる。例えば、ヘッド−テール、側鎖−側鎖、側鎖−ヘッド、または側鎖−テール結合が、末端アミノ酸の間、またはCNP22の6および22の対応する位置におけるアミノ酸の間で形成される共有結合について可能である。
1つの実施形態において、本発明は、CNPの機能性(例えば、cGMPの産生の刺激)を保持すると同時に、NEPに対する低い親和性、および/またはNEPによる切断に対するより大きい抵抗性および/または長いin vivo血清半減期を有するCNP変異体を提供する。NEPは、その活性部位の空洞のサイズが限られているため、約3kDaより小さい物質を選択的に認識する(Oefner、J. Mol. Biol.、296巻、341〜349頁(2000年))。1つの実施形態において、例えば、約0.6〜約5kDaのアミノ酸、親水性もしくは水溶性ポリマー、疎水性酸(脂肪酸を含む)および/または糖を付加することにより、全体的な分子量を例えば、約2.6もしくは2.8kDaから約4、4.6、5、5.2、5.8、6、6.4もしくは約7kDaまでの範囲に増加させるためにCNP変異体を改変する。特定の具体例としての実施形態において、CNP変異体は、約2.6kDa〜約7kDa、または約2.8kDa〜6kDa、または約2.8kDa〜5.8kDaの分子量を有する。特定の実施形態において、CNP変異体の総分子量を、例えば、約2.6kDaもしくは2.8kDaから約4kDa、4.2kDa、4.4kDa、4.6kDa、4.8kDa、5kDa、5.2kDa、5.4kDa、5.6kDa、5.8kDa、6kDa、6.2kDa、7.2kDa、8.2kDaもしくはより高い値までの範囲まで増加させるために、少なくとも約0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6もしくは1.8kDa、または2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8もしくは5kDaまでを加える。いくつかの実施形態において、そのようなCNP変異体は、CNP22のアミノ酸6〜22と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%もしくは95%同一または相同であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、そのようなCNP変異体は、他の天然または非天然アミノ酸またはペプチド模倣体との1、2、3、4、5、6もしくは7個のアミノ酸の置換、挿入または欠失を含む。保存的および非保存的置換または挿入がいずれかの位置において想像されるが、非保存的置換は、改変に耐性があることが以前に示された領域において行うことができるが、改変の導入は、例えば、CNP活性またはNPR−B結合に関与すると当技術分野で同定された領域における保存的置換によって始まる可能性がある。
他の実施形態において、CNP変異体は、Cys6とCys22の間の完全な環化部分、ならびに約1〜40、1〜20、5〜40、5〜35、10〜35、15〜35、5〜31、10〜31、もしくは15〜31個のアミノ酸を含み、CNPポリペプチドおよび/または非CNPポリペプチド由来の断片であるN末端および/またはC末端テールを有するCNPを含む。1つの実施形態において、そのようなCNP変異体は、約2.8kDa〜約4、4.6、5、5.2、5.8、6、6.4または7kDaの範囲の分子量を有する。そのようなCNP変異体の非限定的な例としては、ヒトもしくは他の種のナトリウム利尿ペプチド前駆体配列(例えば、ANP、BNPもしくはCNP)由来のN末端および/またはC末端延長部分を有する、野生型CNP22または1つもしくは複数のアミノ酸置換(例えば、K4R置換)を有するCNP22、アミノ酸置換、付加および/または欠失を有するナトリウム利尿ペプチド前駆体C(NPPC)変異体(例えば、CNP変異体は、約2.8kDa〜5.8kDaの分子量を有するペプチドをもたらすCNP−53の短縮体であってよい)、あるいは例えば、血清アルブミンまたはIgGタンパク質などの他の非CNPポリペプチド(例えば、CNP変異体は、ヒトもしくは他の種の血清アルブミンまたはIgGの断片を含むCNPキメラであってよい)などがある。
1つの実施形態において、NEP分解に対する抵抗性の増大を意図した、例えば、約2.6kDaもしくは2.8kDa〜約6もしくは7kDaの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有するCNP変異体は、以下の一般式
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(b)4−Gly5−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−(h)10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号6)により表され、式中、
(x)は、合成もしくは天然ポリマー基、またはその組合せであり、合成ポリマー基の非限定的な例は、ポリエチレングリコール(PEG、ポリエチレンオキシド(PEO)とも呼ばれる)であり、天然ポリマー基の非限定的な例は、1〜35アミノ酸を含み、NPPCまたは置換および/もしくは欠失を有するその変異体、ANP、BNP、あるいは例えば、血清アルブミン、IgG、ヒスチンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、オステオクリンまたは線維芽細胞成長因子2(FGF2)などの他の非CNP(ポリ)ぺプチド由来のアミノ酸配列であり、
(z)は、非存在であってよく、あるいは合成または天然ポリマー基、またはその組合せであってよく、合成ポリマー基の非限定的な例は、PEGであり、天然ポリマー基の非限定的な例は、ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、NPPC、CNP、ANPもしくはBNP)または非ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、血清アルブミンもしくはIgG)由来のアミノ酸配列であり、
(b)および(h)は、独立にそれぞれ、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、GluもしくはSerを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよい。1つの実施形態において、(b)はArgである。他の実施形態において、NEP抵抗の改善のために、(b)はGlyでない。他の実施形態において、(h)はArgでない。
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(b)4−Gly5−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−(h)10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号6)により表され、式中、
(x)は、合成もしくは天然ポリマー基、またはその組合せであり、合成ポリマー基の非限定的な例は、ポリエチレングリコール(PEG、ポリエチレンオキシド(PEO)とも呼ばれる)であり、天然ポリマー基の非限定的な例は、1〜35アミノ酸を含み、NPPCまたは置換および/もしくは欠失を有するその変異体、ANP、BNP、あるいは例えば、血清アルブミン、IgG、ヒスチンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、オステオクリンまたは線維芽細胞成長因子2(FGF2)などの他の非CNP(ポリ)ぺプチド由来のアミノ酸配列であり、
(z)は、非存在であってよく、あるいは合成または天然ポリマー基、またはその組合せであってよく、合成ポリマー基の非限定的な例は、PEGであり、天然ポリマー基の非限定的な例は、ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、NPPC、CNP、ANPもしくはBNP)または非ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、血清アルブミンもしくはIgG)由来のアミノ酸配列であり、
(b)および(h)は、独立にそれぞれ、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、GluもしくはSerを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよい。1つの実施形態において、(b)はArgである。他の実施形態において、NEP抵抗の改善のために、(b)はGlyでない。他の実施形態において、(h)はArgでない。
NPPCまたはその変異体由来のアミノ酸配列の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。
Arg、
Glu-Arg、
Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(配列番号7)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(配列番号8)、
Gly-Ala-Asn-Pro-Arg(配列番号9)、
Gly-Ala-Asn-Gln-Gln(配列番号10)、
Gly-Ala-Asn-Ser-Ser(配列番号11)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Gln(配列番号12)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Met(配列番号13)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Thr(配列番号14)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Ser(配列番号15)、
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala(配列番号16)、
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg(配列番号17)、
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg(配列番号18)、
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(配列番号19)、
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg、(配列番号20)
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(配列番号21)、および
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(配列番号22)。
Glu-Arg、
Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(配列番号7)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(配列番号8)、
Gly-Ala-Asn-Pro-Arg(配列番号9)、
Gly-Ala-Asn-Gln-Gln(配列番号10)、
Gly-Ala-Asn-Ser-Ser(配列番号11)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Gln(配列番号12)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Met(配列番号13)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Thr(配列番号14)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Ser(配列番号15)、
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala(配列番号16)、
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg(配列番号17)、
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg(配列番号18)、
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(配列番号19)、
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg、(配列番号20)
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(配列番号21)、および
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(配列番号22)。
例えば、ANP、BNP、血清アルブミンおよびIgGなどの非CNPポリペプチド由来のアミノ酸配列の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。
Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser(配列番号23);
Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(配列番号24);
Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(配列番号25);
Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(配列番号26);
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr(配列番号27);
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(配列番号28);
Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg(配列番号29);
Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr(配列番号30);
Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln(配列番号31);および
Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser(配列番号32)。
Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(配列番号24);
Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(配列番号25);
Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(配列番号26);
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr(配列番号27);
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(配列番号28);
Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg(配列番号29);
Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr(配列番号30);
Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln(配列番号31);および
Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser(配列番号32)。
1つの実施形態において、CNP22またはその変異体のN末端および/またはC末端は、独立に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40個のアミノ酸を含むアミノ酸延長部分に結合させることができる。1つの実施形態において、アミノ酸延長部分は、NPPC、CNP53、ANPまたはBNP由来である。特定の実施形態において、アミノ酸延長部分は、Gln−Glu−His−Pro−Asn−Ala−Arg−Lys−Tyr−Lys−Gly−Ala−Asn−Lys−Lys(配列番号33)である。関連実施形態において、この15アミノ酸延長部分をN末端に付加して、式Gln−Glu−His−Pro−Asn−Ala−Arg−Lys−Tyr−Lys−Gly−Ala−Asn−Lys−Lys−Gly1−Leu2−Ser3−(b)4−Gly5−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−(h)10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号34)のCNP変異体を得る。
1つの実施形態において、CNP変異体は、それらの全体的な分子サイズを約2.6kDaもしくは2.8kDaから約4、5、6もしくは7kDaまでの範囲に増加させるためにN末端および/またはC末端において親水性ポリマー(例えば、PEG)に結合させたwtCNP22またはその変異体(例えば、(1つまたは複数の)付加、(1つまたは複数の)欠失および/または例えば、K4R置換などの(1つまたは複数の)置換を有する)(配列番号35)を含む。そのようなCNP変異体は、N末端および/またはC末端において、例えば、アミノ酸、糖、疎水性酸および/またはリン脂質を含むポリマー基に場合によってさらに結合される。その非限定的な例は、1〜35、または5〜31個のアミノ酸を含むN末端アミノ酸延長部分である。1つの実施形態において、少なくとも約0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6もしくは1.8kDa、または2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8もしくは5kDaまでの親水性ポリマー(例えば、PEG)部分をwtCNP22またはその変異体のN末端および/またはC末端に付加させる。
本明細書で示すように、CNP22またはその変異体への約0.6kDaまたはそれ以上の親水性または水溶性PEG(またはPEO)ポリマーの結合により、NEP切断に対する抵抗性が著しく増加する。しかし、wtCNP22に0.6kDaと小さくてもPEGを付加させると、CNPの機能性(例えば、cGMPシグナリングの刺激)が低下する可能性があり、CNP22またはその変異体に約2または3kDaを超えるPEGを付加させると、CNPの機能活性がサイズ依存的に低下する可能性がある。しかし、約0.6kDaから約1.2kDaまで、または場合によっては約2kDaまでのPEG(またはPEO)ポリマーを、例えば、GANRR−CNP22(K4R)(CNP27(Arg4))(配列番号36)、GANPR−CNP22(K4R)(CNP27(Pro4))(配列番号37)、ER−CNP22(配列番号38)、ER−CNP22(K4R)(配列番号39)、R−CNP22(配列番号40)およびR−CNP22(K4R)(配列番号41)などの、生理的条件下で場合によっては正に荷電する可能性のある少なくとも1つの比較的に大きいアミノ酸(例えば、アルギニン)がCNP22のGlyに対応する位置の直前にある、N末端アミノ酸延長部分を有するCNP変異体に結合される場合、CNPの機能性(wtCNP22の機能性と少なくとも同等の)が保持される。
したがって、1つの実施形態において、PEG化CNP変異体は、CNP22またはその変異体(例えば、K4R置換を有するもの)のN末端に少なくとも1、2、3、4または5個のアミノ酸を含むアミノ酸延長部分を含んでおり、この場合に、PEGポリマーは、NEP切断に対する抵抗性の増大のための例えば、約2.6kDaもしくは2.8kDa〜約6もしくは7kDaの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を得るためにアミノ酸延長CNP変異体のN末端に結合させる。1つの実施形態において、CNPの機能性の向上のために、そのようなペグ化アミノ酸延長CNP変異体は、CNP22のGlyに対応する位置の直前にある、生理的条件下で場合によっては正に荷電する可能性のある少なくとも1つの比較的に大きい天然または非天然アミノ酸を含む。特定の実施形態において、ペグ化アミノ酸延長CNP変異体は、CNP22のGlyに対応する位置の直前に少なくとも1つのアルギニン残基を含む。
N末端および/またはC末端において例えばPEG(もしくはPEO)などの親水性もしくは水溶性ポリマーに結合したCNP変異体に加えて、本発明は、内部部位においてそのようなポリマーに結合したCNP変異体を含む。ここで簡潔さの目的のために、PEG(もしくはPEO)は、親水性もしくは水溶性ポリマーの代表的な例として用いることとする。(1)N末端のみにおけるPEG化、(2)C末端のみにおけるPEG化、(3)内部部位(例えば、Lys4)のみにおけるPEG化、(4)N末端およびC末端におけるPEG化、(5)N末端および内部部位におけるPEG化、ならびに(6)C末端および内部部位におけるPEG化を含むが、これらに限定されない、CNP変異体のPEG化の種々の部位が可能である。NEP分解に対する抵抗性の増大およびCNPの機能性の保持のために、特定の実施形態において、PEG化CNP変異体の総質量は、例えば、約2.6kDaもしくは2.8kDa〜約4、5、6もしくは7kDaまでの範囲の本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる。特定の実施形態において、CNP17、CNP22、CNP37(下で定義する)またはその変異体(アミノ酸付加、置換および/または欠失を有するものを含む)は、N末端においてのみPEG化されている。他の実施形態において、CNP変異体は、内部部位(例えば、Lys4)のみにおいてPEG化されている。他の実施形態において、CNP変異体は、N末端および内部部位(例えば、Lys4)においてPEG化されている。他の実施形態において、より良好な機能性を得るために、CNP変異体は、環状ドメイン内(CNP22のCys6〜Cys22に対応する)の部位(例えば、Lys10)においてPEG化させない。内部部位におけるPEG化を防ぐために、Lys4および/またはLys10は、例えば、Gly、Ser、Arg、Asn、Gln、Asp、Gluまたはシトルリン(Cit)などの側鎖に反応性第一級アミノ基を含まない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体で置換することができる。特定の実施形態において、Lys4および/またはLys10をArgで置換する。他の実施形態において、Lys10をArgで置換しない。
本発明は、種類(例えば、ホモポリマーまたはコポリマー;ランダム、交互またはブロックコポリマー;線状または分枝;単分散性または多分散性)、結合(例えば、アミド、イミン、アミナール、アルキレンまたはエステル結合などの加水分解性または安定結合)、結合部位(例えば、N末端および/またはC末端における;好ましくはCNPの環化領域における残基(CNP22の残基6〜22に対応する)のいずれにおけるものでない)、ならびに長さ(例えば、約0.2、0.4または0.6kDa〜約2、3、4または5kDa)が異なっていてよい親水性または水溶性ポリマー(例えば、PEG分子)の使用を予期する。親水性または水溶性ポリマーは、当技術分野で公知であるような、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)もしくはアルデヒドベースの化学または他の化学によりCNPペプチドに結合させることができる。そのようなCNP変異体は、例えば、wtCNP−22(2.2kDa)、wtCNP22の環化領域(残基6〜22)のみを保持するCNP−17、CNP22のN末端および/またはC末端におけるアミノ酸延長部分を有するCNP変異体、あるいはアミノ酸置換、付加および/または欠失を有する変異体、例えば、CNP27(Arg4)、CNP27(Pro4)、R−CNP22、R−CNP22(K4R)、ER−CNP22およびER−CNP22(K4R)を用いて生成させることができる。1つの実施形態において、例えば、約2.6kDaもしくは2.8kDa〜約6もしくは7kDaの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有するPEG−CNP変異体は、NHSもしくはアルデヒドベースの化学によりN末端および/またはC末端において結合した単分散性線状PEG(PEO)基、あるいはNHSベースの化学によりN末端および/またはC末端において結合した2アームもしくは3アーム分枝PEG基を含む。本発明は、カルボキシル化、硫酸化およびリン酸化化合物を含むが、これらに限定されない、腎クリアランスの減少を意図した負に荷電したPEG−CNP変異体をさらに予期する。
関連実施形態において、本発明は、nが12〜50の整数であり、PEGポリマーが分子量約2.5kDaまでのものである、式(CH2CH2O)nのNHSまたはアルデヒドベースのPEGを含むPEG−CNP結合体を予期する。特定の実施形態において、nは12または24である。1つの実施形態において、PEGポリマーの末端ヒドロキシル基は、非反応性基でキャップされている。特定の実施形態において、キャッピング基は、アルキル基、例えば、メチルなどの低級アルキル基である。
さらなる実施形態において、PEGポリマーまたはその誘導体は、約0.4kDa〜約2.5kDa、または約0.6kDa〜約1.5kDaの範囲のポリマー数平均分子量を有する。
さらなる実施形態において、wtCNPまたはCNP変異体ペプチドを、例えば、ビスホスホネート、糖、疎水性酸(脂肪酸など)またはアミノ酸配列などの部分に結合させる。そのようなアミノ酸配列は、例えば骨/軟骨ターゲティングに有用なポリAspまたはポリGluなどであるか、あるいは例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質等の融合タンパク質またはペプチド配列などの解明された骨ターゲティングドメインを有する骨タンパク質またはその誘導体であってよい。CNP22またはその変異体が骨もしくは軟骨ターゲティング部分に結合している本明細書で述べる実施形態において、ペプチドが軟骨細胞上のNPR−Bに結合し、活性化することができる場合、そのような部分は、改変CNPペプチドを骨成長板の軟骨細胞に到達させることを促進するように設計されている。
他の実施形態において、本発明は、NEPを含むペプチダーゼによる切断を受けにくいペプチド結合を有するCNP変異体を提供する。本発明は、エンドペプチダーゼ切断の部位に少なくとも1つの改変残基を含むCNP変異体を含む。1つの実施形態において、CNPにおけるNEP切断部位のCys6−Phe7ペプチド結合(−C(=O)−NH−)は、以下のペプチド結合イソスターのいずれかで置換することができる。
−CH2−NH−、
−C(=O)−N(R)−(ここで、アミド基が次のR基のいずれかによりアルキル化されている:メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチル)、
−C(=O)−NH−CH2−、
−CH2−S、
nが1または2である−CH2−S(O)n−、
−CH2−CH2−、
−CH=CH−、
−C(=O)−CH2−、
−CH(CN)−NH−、
−CH(OH)−CH2−、
−O−C(=O)−NH−、および
−NHC(=O)NH−
他の実施形態において、Phe7をその鏡像異性体D−Pheで置換する。他の実施形態において、D鏡像異性体をwtCNP−22内の1つまたは22位置すべてまでの複数の位置に導入する。さらなる実施形態において、3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸などのβ−アミノ酸でPhe7を置換し、これにより、側鎖の長さを減少させると同時に、主鎖の長さを増加させる。他の実施形態において、本発明は、ホモシステイン、ペニシラミン、2−メルカプトプロピオン酸および3−メルカプトプロピオン酸を含むが、これらに限定されない、Cys6位置におけるCys類似体を予期する。
−C(=O)−N(R)−(ここで、アミド基が次のR基のいずれかによりアルキル化されている:メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチル)、
−C(=O)−NH−CH2−、
−CH2−S、
nが1または2である−CH2−S(O)n−、
−CH2−CH2−、
−CH=CH−、
−C(=O)−CH2−、
−CH(CN)−NH−、
−CH(OH)−CH2−、
−O−C(=O)−NH−、および
−NHC(=O)NH−
他の実施形態において、Phe7をその鏡像異性体D−Pheで置換する。他の実施形態において、D鏡像異性体をwtCNP−22内の1つまたは22位置すべてまでの複数の位置に導入する。さらなる実施形態において、3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸などのβ−アミノ酸でPhe7を置換し、これにより、側鎖の長さを減少させると同時に、主鎖の長さを増加させる。他の実施形態において、本発明は、ホモシステイン、ペニシラミン、2−メルカプトプロピオン酸および3−メルカプトプロピオン酸を含むが、これらに限定されない、Cys6位置におけるCys類似体を予期する。
Cys6とPhe7の間のNEP抵抗性結合の存在下でさえも、Gly8−Leu9、Lys10−Leu11、Arg13−Ile14、Ser16−Met17およびGly19−Leu20などの他のペプチド結合は、NEPにより加水分解され得る。したがって、本発明は、CNP類似体の主鎖における複数の位置にペプチド結合イソスターを含むCNP類似体を含む。1つの実施形態において、CNP類似体または変異体は、複数のペプチダーゼ切断部位に改変を含む。さらなる実施形態において、そのような変異体は、NEP活性部位に対する結合に重要なアミノ酸残基における置換を有し、それにより、NEP分解に対する抵抗を増大させるCNPを含む。Gly8、Gly15、Ser18、Gly19および/またはGly21を含むが、これらに限定されない1つまたは複数のNEP結合性残基をより大きいサイズの天然または非天然アミノ酸残基で置換して、NEP活性部位に対する親和性を低下させる。他の実施形態において、Phe7、Leu9、Leu11、Ile14、Met17およびLeu20を含むが、これらに限定されない、NEP認識に必須の1つまたは複数の疎水性残基を、NEP結合性を減少させる天然もしくは非天然アミノ酸および/またはペプチド模倣体で置換する。他の実施形態において、CNPの最初の5個のアミノ酸の1〜5個を欠失させるか、または他の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣体で置換することができ、あるいは1つまたは複数の天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体をCNPの最初の5つの位置のいずれか1つまたはすべてに付加することができる。
さらなる実施形態において、CNP変異体は、NEPに対する抵抗性の増大のための約2.6kDaもしくは2.8kDa〜約6もしくは7kDaの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有し、以下の式
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(a)4−Gly5−(b)6−(c)7−(d)8−(e)9−(f)10−(g)11−Asp12−Arg13−(h)14−Gly15−Ser16−(i)17−Ser18−Gly19−(j)20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号46)により表され、式中、
(x)は、非存在であってよく、あるいは、例えば、ビスホスホネートなどの合成骨ターゲティング化合物;例えば、ポリAspおよびポリGluなどの骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列;例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質等の融合タンパク質またはペプチド配列などの解明された骨ターゲティングドメインを有する骨タンパク質由来のアミノ酸配列;例えば、荷電PEG分子などの腎クリアランスを減少させるポリマーまたは非ポリマー分子;ならびに例えば、ポリマー(例えば、PEGs)、糖、疎水性酸(脂肪酸を含む)および/またはアミノ酸を含む延長部分からなる群から選択されてよく、そのようなアミノ酸延長部分は、例えば、1〜31、もしくは1〜35、もしくは5〜35、もしくは10〜35、もしくは15〜35個のアミノ酸残基を含んでいてよく、NPPC、ANP、BNP、例えば、血清アルブミンもしくはIgGなどの他の非CNP(ポリ)ペプチド、あるいは置換、付加および/または欠失、またはその組合せを有する前述のポリペプチドの変異体由来であってよく、
(z)は、非存在であってよく、あるいは、例えば、ポリAspおよびポリGluなどの骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質などの骨タンパク質の骨ターゲティングドメインのアミノ酸配列、ならびに例えば、ANPまたはBNPなどの非CNP(ポリ)ペプチド由来のアミノ酸配列からなる群から選択されてよく、
(a)は、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換、またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、1つの実施形態において(a)はArgであり、
(b)は、Cysおよび例えば、Cys−CH2−NHなどのCys6とPhe7の間のペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;N−アルキル基がメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルである、PheのN−アルキル化誘導体;ならびにPhe類似体のベンゼン環の1つもしくは複数のオルト、メタおよび/またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝C1−6アルキル、線状もしくは分枝C1−6アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−C1−6アルキル、C3−10シクロアルキル、ヘテロシクリル、C6−14アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される1つもしくは複数の置換基で置換されている(例は、チロシン、3−クロロフェニルアラニン、2,3−クロロ−フェニルアラニン、3−クロロ−5−フルオロ−フェニルアラニン、2−クロロ−6−フルオロ−3−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない)か、あるいはPhe類似体のベンゼン環を他のアリール基(非限定的な例は1−および2−ナフチルアラニンなどである)またはヘテロアリール(非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである)で置換することができる、Phe類似体からなる群から選択され、
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly)、Thr、Ser、ValおよびAsnからなる群から選択され、
(e)は、Leu、Ser、Thrおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(f)は、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、1つの実施形態において(f)はArgでなく、
(g)は、Leuおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(h)は、Ile、tBu−Glyおよび例えば、N−Me−Ileなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(i)は、Met、Val、Asn、ベータ−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)および2−アミノ−イソ酪酸(Aib)からなる群から選択され、
(j)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tret−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Ser、Thr、Argおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(a)4−Gly5−(b)6−(c)7−(d)8−(e)9−(f)10−(g)11−Asp12−Arg13−(h)14−Gly15−Ser16−(i)17−Ser18−Gly19−(j)20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号46)により表され、式中、
(x)は、非存在であってよく、あるいは、例えば、ビスホスホネートなどの合成骨ターゲティング化合物;例えば、ポリAspおよびポリGluなどの骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列;例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質等の融合タンパク質またはペプチド配列などの解明された骨ターゲティングドメインを有する骨タンパク質由来のアミノ酸配列;例えば、荷電PEG分子などの腎クリアランスを減少させるポリマーまたは非ポリマー分子;ならびに例えば、ポリマー(例えば、PEGs)、糖、疎水性酸(脂肪酸を含む)および/またはアミノ酸を含む延長部分からなる群から選択されてよく、そのようなアミノ酸延長部分は、例えば、1〜31、もしくは1〜35、もしくは5〜35、もしくは10〜35、もしくは15〜35個のアミノ酸残基を含んでいてよく、NPPC、ANP、BNP、例えば、血清アルブミンもしくはIgGなどの他の非CNP(ポリ)ペプチド、あるいは置換、付加および/または欠失、またはその組合せを有する前述のポリペプチドの変異体由来であってよく、
(z)は、非存在であってよく、あるいは、例えば、ポリAspおよびポリGluなどの骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質などの骨タンパク質の骨ターゲティングドメインのアミノ酸配列、ならびに例えば、ANPまたはBNPなどの非CNP(ポリ)ペプチド由来のアミノ酸配列からなる群から選択されてよく、
(a)は、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換、またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、1つの実施形態において(a)はArgであり、
(b)は、Cysおよび例えば、Cys−CH2−NHなどのCys6とPhe7の間のペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;N−アルキル基がメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルである、PheのN−アルキル化誘導体;ならびにPhe類似体のベンゼン環の1つもしくは複数のオルト、メタおよび/またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝C1−6アルキル、線状もしくは分枝C1−6アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−C1−6アルキル、C3−10シクロアルキル、ヘテロシクリル、C6−14アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択される1つもしくは複数の置換基で置換されている(例は、チロシン、3−クロロフェニルアラニン、2,3−クロロ−フェニルアラニン、3−クロロ−5−フルオロ−フェニルアラニン、2−クロロ−6−フルオロ−3−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない)か、あるいはPhe類似体のベンゼン環を他のアリール基(非限定的な例は1−および2−ナフチルアラニンなどである)またはヘテロアリール(非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである)で置換することができる、Phe類似体からなる群から選択され、
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly)、Thr、Ser、ValおよびAsnからなる群から選択され、
(e)は、Leu、Ser、Thrおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(f)は、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、1つの実施形態において(f)はArgでなく、
(g)は、Leuおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(h)は、Ile、tBu−Glyおよび例えば、N−Me−Ileなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(i)は、Met、Val、Asn、ベータ−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)および2−アミノ−イソ酪酸(Aib)からなる群から選択され、
(j)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tret−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Ser、Thr、Argおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
1つの実施形態において、CNP変異体は、6、7、8、9、10、11、13、14、16、17、19および/または20位の1つまたは複数における改変を含み、本明細書で開示した他の位置のいずれかにおける改変を場合によって有していてよい。
CNP22またはその変異体を疎水性酸に結合させることができる、本明細書で述べる実施形態において、CNPペプチドを1つまたは複数の疎水性酸に結合させることができる。疎水性酸の非限定的な例としては、直鎖または分枝飽和または不飽和C5〜C12カルボン酸(例えば、ペンタン酸、ヘプタン酸等)および天然脂肪酸などがある。疎水性酸は、1つまたは複数のアミノ酸残基のN末端、C末端および/または側鎖に結合させることができる。1つの実施形態において、疎水性酸をN末端に結合させる。1つの実施形態において、疎水性酸へのCNP22またはその変異体の結合は、とりわけ、改変CNPペプチドと血清アルブミンとの非特異的相互作用を促進し、それにより、CNPペプチドのサイズを増加させ、例えば、NEPなどのプロテアーゼによる切断からそれを保護するように設計する。疎水性酸結合CNPペプチドとアルブミンの間の相互作用は、改変CNPペプチドが軟骨を通して拡散し、骨成長板の軟骨細胞に到達し、NPR−Bに結合し、活性化することができるように、強すぎないように設計する。
さらなる実施形態において、本発明は、wtCNP22の同じ濃度(例えば、1μM)のもとで産生されるcGMPレベルの少なくとも約50%の産生をin vitroで刺激し、(b)6、(c)7および/または(d)8位に少なくとも1つの改変アミノ酸を含み、以下の式
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(a)4−Gly5−(b)6−(c)7−(d)8−(e)9−(f)10−(g)11−Asp12−Arg13−(h)14−Gly15−Ser16−(i)17−Ser18−Gly19−(j)20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号47)により表されるCNP変異体を提供し、式中、
(x)は、非存在であってよく、あるいは、ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、NPPC、CNP、ANPもしくはBNP)または本明細書で述べたような非ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、HSA、IgG、骨ターゲティングタンパク質等)に由来する1〜5個のアミノ酸を含むペプチド配列であってよく、
(z)は、非存在であってよく、あるいは、例えば、ビスホスホネートなどの合成骨ターゲティング化合物;例えば、ポリAspおよびポリGluなどの骨/軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列;例えば、オステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質の融合タンパク質またはペプチド配列などの、骨ターゲティングドメインを有する骨タンパク質およびその誘導体;例えば、荷電PEGsなどの腎クリアランスを減少させる分子;ならびに本明細書で述べたようなNEP媒介性分解に対するCNPの抵抗性を増大させる分子からなる群から選択されてよく、
(a)は、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、1つの実施形態において(a)はArgであり、
(b)は、Cysまたは脱カルボキシシステインであってよく、あるいは(b)6−(c)7ペプチド結合(−C(=O)−NH−)は、以下のペプチド結合イソスター
−CH2−NH−;
アミド基が次のR基:メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルのいずれかによりアルキル化されている−C(=O)−N(R)−;
−C(=O)−NH−CH2−;
−CH2−S−、
nが1または2である、−CH2−S(O)n−;
−CH2−CH2−;
−CH=CH−;
−C(=O)−CH2−;
−CH(CN)−NH−;
−CH(OH)−CH2−;
−O−C(=O)−NH−;または
−NHC(=O)NH−
のいずれか1つで置換されていてよく、
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;N−アルキル基がメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルおよびtert−ブチルからなる群から選択される、PheのN−アルキル化誘導体などの、Pheのペプチド結合イソスター;ならびにPhe類似体のベンゼン環の1つもしくは複数のオルト、メタおよび/またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝C1−6アルキル、線状もしくは分枝C1−6アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−C1−6アルキル、C3−10シクロアルキル、C6−14アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される1つもしくは複数の置換基で置換されている(例は、チロシン、3−クロロフェニルアラニン、2,3−クロロ−フェニルアラニン、3−クロロ−5−フルオロ−フェニルアラニン、2−クロロ−6−フルオロ−3−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない)か、あるいはPhe類似体のベンゼン環を他のアリール基(非限定的な例は1−および2−ナフチルアラニンなどである)またはヘテロアリール(非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである)で置換することができる、Phe類似体からなる群から選択され、
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly)、Val、Ser、ThrおよびAsnからなる群から選択され、
(e)は、Leu、Ser、Thrおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(f)は、Arg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体であり、1つの実施形態において(f)はArgでなく、
(g)は、Leuおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(h)は、Ile、tBu−Glyおよび例えば、N−Me−Ileなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(i)は、Met、Val、Asn、ベータ−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)および2−アミノ−イソ酪酸(Aib)からなる群から選択され、
(j)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tert−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Ser、Thr、Argおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(a)4−Gly5−(b)6−(c)7−(d)8−(e)9−(f)10−(g)11−Asp12−Arg13−(h)14−Gly15−Ser16−(i)17−Ser18−Gly19−(j)20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号47)により表されるCNP変異体を提供し、式中、
(x)は、非存在であってよく、あるいは、ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、NPPC、CNP、ANPもしくはBNP)または本明細書で述べたような非ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、HSA、IgG、骨ターゲティングタンパク質等)に由来する1〜5個のアミノ酸を含むペプチド配列であってよく、
(z)は、非存在であってよく、あるいは、例えば、ビスホスホネートなどの合成骨ターゲティング化合物;例えば、ポリAspおよびポリGluなどの骨/軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列;例えば、オステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質の融合タンパク質またはペプチド配列などの、骨ターゲティングドメインを有する骨タンパク質およびその誘導体;例えば、荷電PEGsなどの腎クリアランスを減少させる分子;ならびに本明細書で述べたようなNEP媒介性分解に対するCNPの抵抗性を増大させる分子からなる群から選択されてよく、
(a)は、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、1つの実施形態において(a)はArgであり、
(b)は、Cysまたは脱カルボキシシステインであってよく、あるいは(b)6−(c)7ペプチド結合(−C(=O)−NH−)は、以下のペプチド結合イソスター
−CH2−NH−;
アミド基が次のR基:メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルのいずれかによりアルキル化されている−C(=O)−N(R)−;
−C(=O)−NH−CH2−;
−CH2−S−、
nが1または2である、−CH2−S(O)n−;
−CH2−CH2−;
−CH=CH−;
−C(=O)−CH2−;
−CH(CN)−NH−;
−CH(OH)−CH2−;
−O−C(=O)−NH−;または
−NHC(=O)NH−
のいずれか1つで置換されていてよく、
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;N−アルキル基がメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルおよびtert−ブチルからなる群から選択される、PheのN−アルキル化誘導体などの、Pheのペプチド結合イソスター;ならびにPhe類似体のベンゼン環の1つもしくは複数のオルト、メタおよび/またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝C1−6アルキル、線状もしくは分枝C1−6アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−C1−6アルキル、C3−10シクロアルキル、C6−14アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される1つもしくは複数の置換基で置換されている(例は、チロシン、3−クロロフェニルアラニン、2,3−クロロ−フェニルアラニン、3−クロロ−5−フルオロ−フェニルアラニン、2−クロロ−6−フルオロ−3−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない)か、あるいはPhe類似体のベンゼン環を他のアリール基(非限定的な例は1−および2−ナフチルアラニンなどである)またはヘテロアリール(非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである)で置換することができる、Phe類似体からなる群から選択され、
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly)、Val、Ser、ThrおよびAsnからなる群から選択され、
(e)は、Leu、Ser、Thrおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(f)は、Arg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体であり、1つの実施形態において(f)はArgでなく、
(g)は、Leuおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(h)は、Ile、tBu−Glyおよび例えば、N−Me−Ileなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(i)は、Met、Val、Asn、ベータ−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)および2−アミノ−イソ酪酸(Aib)からなる群から選択され、
(j)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tert−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Ser、Thr、Argおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
さらなる実施形態において、本発明は、wtCNP22の同じ濃度(例えば、1μM)のもとで産生されるcGMPレベルの少なくとも約50%の産生をin vitroで刺激し、NEP分解に対する抵抗性の増大のための例えば、約2.6kDaもしくは2.8kDa〜約6もしくは7kDaの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有し、以下の式
(x)−(y)−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−(h)10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号48)により表され、
(x)は、合成もしくは天然ポリマー基、またはその組合せであり、合成ポリマー基の非限定的な例は、ポリエチレングリコール(PEG)であり、天然ポリマー基の非限定的な例は、1〜35個のアミノ酸を含み、NPPCまたは置換および/もしくは欠失を有するその変異体、ANP、BNP、または例えば、血清アルブミン、IgG、ヒスチンリッチ糖タンパク質フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、オステオクリンまたはFGF2などの非CNP(ポリ)ぺプチド由来のアミノ酸配列であり、
(y)は、非存在であってよく、あるいは、Gly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5(CNP22の1〜5位に対応する)の1つまたは複数のアミノ酸および/または天然もしくは非天然アミノ酸を用いたそれらの位置の1つもしくは複数における置換(例えば、K4R置換)であってよく、
(h)は、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換、またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、1つの実施形態において(h)はArgでなく、
(z)は、非存在であってよく、あるいは合成または天然ポリマー基、またはその組合せであってよく、合成ポリマー基の非限定的な例は、PEGであり、天然ポリマー基の非限定的な例は、ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、NPPC、CNP、ANPもしくはBNP)または非ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、血清アルブミンもしくはIgG)由来のアミノ酸配列である。
(x)−(y)−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−(h)10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号48)により表され、
(x)は、合成もしくは天然ポリマー基、またはその組合せであり、合成ポリマー基の非限定的な例は、ポリエチレングリコール(PEG)であり、天然ポリマー基の非限定的な例は、1〜35個のアミノ酸を含み、NPPCまたは置換および/もしくは欠失を有するその変異体、ANP、BNP、または例えば、血清アルブミン、IgG、ヒスチンリッチ糖タンパク質フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、オステオクリンまたはFGF2などの非CNP(ポリ)ぺプチド由来のアミノ酸配列であり、
(y)は、非存在であってよく、あるいは、Gly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5(CNP22の1〜5位に対応する)の1つまたは複数のアミノ酸および/または天然もしくは非天然アミノ酸を用いたそれらの位置の1つもしくは複数における置換(例えば、K4R置換)であってよく、
(h)は、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換、またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、1つの実施形態において(h)はArgでなく、
(z)は、非存在であってよく、あるいは合成または天然ポリマー基、またはその組合せであってよく、合成ポリマー基の非限定的な例は、PEGであり、天然ポリマー基の非限定的な例は、ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、NPPC、CNP、ANPもしくはBNP)または非ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、血清アルブミンもしくはIgG)由来のアミノ酸配列である。
1つの実施形態において、(x)、(y)および(z)は、ともに約10〜約40個、または約15〜約35個のアミノ酸を含む。他の実施形態において、(x)は、1〜40個のアミノ酸、または1〜20個のアミノ酸を含むアミノ酸配列である。
wtCNP22の同じ濃度(例えば、1μM)のもとで産生されるcGMPレベルの少なくとも約50%の産生をin vitroで刺激し、以下の式
(y)−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−Lys10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22(配列番号138)を含むCNP変異体がさらに予期され、式中、
(y)は、Gly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5から選択される1つまたは複数のアミノ酸および/または天然もしくは非天然アミノ酸を用いたそれらの位置の1つもしくは複数における置換(例えば、K4R置換)を含み、0.6kDa〜約5kDaの分子量の親水性もしくは水溶性ポリマーをさらに含む。1つの実施形態において、親水性もしくは水溶性ポリマーをそのようなアミノ酸延長CNP変異体のN末端に結合させる。特定の実施形態において、親水性もしくは水溶性ポリマーは、PEG(またはPEO)である。
(y)−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−Lys10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22(配列番号138)を含むCNP変異体がさらに予期され、式中、
(y)は、Gly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5から選択される1つまたは複数のアミノ酸および/または天然もしくは非天然アミノ酸を用いたそれらの位置の1つもしくは複数における置換(例えば、K4R置換)を含み、0.6kDa〜約5kDaの分子量の親水性もしくは水溶性ポリマーをさらに含む。1つの実施形態において、親水性もしくは水溶性ポリマーをそのようなアミノ酸延長CNP変異体のN末端に結合させる。特定の実施形態において、親水性もしくは水溶性ポリマーは、PEG(またはPEO)である。
他の実施形態において、本発明は、wtCNP22の同じ濃度(例えば、1μM)のもとで産生されるcGMPレベルの少なくとも約50%の産生をin vitroで刺激するCNP変異体を提供し、該CNP変異体は、1〜15個のアミノ酸を含むN末端および/またはC末端ペプチド延長部分を含み、親水性もしくは水溶性ポリマーに結合している。1つの実施形態において、ペプチド延長部分は、5〜10個のアミノ酸を含む。他の特定の実施形態において、ペプチド延長部分は、5個のアミノ酸を含む。他の特定の実施形態において、親水性もしくは水溶性ポリマーは、PEG(またはPEO)である。
さらなる実施形態において、本発明のCNP変異体は、wtCNP22の同じ濃度(例えば、1μM)のもとで産生されるcGMPレベルの少なくとも約50%の産生をin vitroで刺激し、ナトリウム利尿ペプチド前駆体C(NPPC)由来の少なくとも15個のアミノ酸断片を含み、該断片は、同じ数のアミノ酸残基を含む野生型NPPCの配列と少なくとも70%相同である。
他の実施形態において、CNP変異体は、NEP抵抗性の増加のために例えば、約2.6kDaもしくは2.8kDa〜約6もしくは7kDaの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有し、以下の式
(x)−(b)6−(c)7−(d)8−(e)9−(f)10−(g)11−Asp12−Arg13−(h)14−Gly15−Ser16−(i)17−Ser18−Gly19−(j)20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号49)により表され、式中、
(x)は、非存在であって(すなわち、−NH2基を有するN末端)、あるいはGly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5からの1、2、3、4または5個のアミノ酸の配列;例えば、ポリAspまたはポリGluなどの骨/軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列;例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質などの骨タンパク質の骨ターゲティングドメイン;荷電PEG分子を含むが、これに限定されない、親水性もしくは水溶性ポリマーなどの腎クリアランスを減少させる分子;およびPEG、糖、疎水性酸、アミノ酸またはその組合せを含む部分からなる群から選択されてよく、そのような部分は、NPPCまたは例えば、BNP、ANP、血清アルブミンもしくはIgGなどの非CNP(ポリ)ペプチド由来のアミノ酸配列を含むが、これらに限定されないアミノ酸延長部分であってよく、
(z)は、非存在であってよく、あるいは例えば、ポリAspまたはポリGluなどの骨/軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列;例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質などの骨ターゲティングタンパク質由来のアミノ酸配列;および本明細書で述べたような、NPPCまたは非CNP(ポリ)ペプチド由来のアミノ酸配列からなる群から選択されてよく、
(b)は、Cysおよび例えば、Cys−CH2−NHなどのCys6とPhe7の間のペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;N−アルキル基がメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルである、PheのN−アルキル化誘導体;ならびにPhe類似体のベンゼン環の1つもしくは複数のオルト、メタおよび/またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝C1−6アルキル、線状もしくは分枝C1−6アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−C1−6アルキル、C3−10シクロアルキル、C6−14アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される1つもしくは複数の置換基で置換されている(例は、チロシン、3−クロロフェニルアラニン、2,3−クロロ−フェニルアラニン、3−クロロ−5−フルオロ−フェニルアラニン、2−クロロ−6−フルオロ−3−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない)か、あるいはPhe類似体のベンゼン環を他のアリール基(非限定的な例は1−および2−ナフチルアラニンなどである)またはヘテロアリール(非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである)で置換することができる、Phe類似体からなる群から選択され、
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly)、Val、Ser、ThrおよびAsnからなる群から選択され、
(e)は、Leu、Ser、Thrおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(f)は、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、1つの実施形態において(f)はArgでなく、
(g)は、Leuおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(h)は、Ile、tBu−Glyおよび例えば、N−Me−Ileなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(i)は、Met、Val、Asn、ベータ−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)および2−アミノ−イソ酪酸(Aib)からなる群から選択され、
(j)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tret−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Ser、Thr、Argおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
(x)−(b)6−(c)7−(d)8−(e)9−(f)10−(g)11−Asp12−Arg13−(h)14−Gly15−Ser16−(i)17−Ser18−Gly19−(j)20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号49)により表され、式中、
(x)は、非存在であって(すなわち、−NH2基を有するN末端)、あるいはGly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5からの1、2、3、4または5個のアミノ酸の配列;例えば、ポリAspまたはポリGluなどの骨/軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列;例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質などの骨タンパク質の骨ターゲティングドメイン;荷電PEG分子を含むが、これに限定されない、親水性もしくは水溶性ポリマーなどの腎クリアランスを減少させる分子;およびPEG、糖、疎水性酸、アミノ酸またはその組合せを含む部分からなる群から選択されてよく、そのような部分は、NPPCまたは例えば、BNP、ANP、血清アルブミンもしくはIgGなどの非CNP(ポリ)ペプチド由来のアミノ酸配列を含むが、これらに限定されないアミノ酸延長部分であってよく、
(z)は、非存在であってよく、あるいは例えば、ポリAspまたはポリGluなどの骨/軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列;例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質などの骨ターゲティングタンパク質由来のアミノ酸配列;および本明細書で述べたような、NPPCまたは非CNP(ポリ)ペプチド由来のアミノ酸配列からなる群から選択されてよく、
(b)は、Cysおよび例えば、Cys−CH2−NHなどのCys6とPhe7の間のペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;N−アルキル基がメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルである、PheのN−アルキル化誘導体;ならびにPhe類似体のベンゼン環の1つもしくは複数のオルト、メタおよび/またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝C1−6アルキル、線状もしくは分枝C1−6アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−C1−6アルキル、C3−10シクロアルキル、C6−14アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される1つもしくは複数の置換基で置換されている(例は、チロシン、3−クロロフェニルアラニン、2,3−クロロ−フェニルアラニン、3−クロロ−5−フルオロ−フェニルアラニン、2−クロロ−6−フルオロ−3−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない)か、あるいはPhe類似体のベンゼン環を他のアリール基(非限定的な例は1−および2−ナフチルアラニンなどである)またはヘテロアリール(非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである)で置換することができる、Phe類似体からなる群から選択され、
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly)、Val、Ser、ThrおよびAsnからなる群から選択され、
(e)は、Leu、Ser、Thrおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(f)は、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、1つの実施形態において(f)はArgでなく、
(g)は、Leuおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(h)は、Ile、tBu−Glyおよび例えば、N−Me−Ileなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(i)は、Met、Val、Asn、ベータ−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)および2−アミノ−イソ酪酸(Aib)からなる群から選択され、
(j)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tret−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Ser、Thr、Argおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
さらなる実施形態において、CNP変異体は、NEP抵抗性の増加のために例えば、約2.6kDaもしくは2.8kDa〜約6もしくは7kDaの本明細書で一般的に述べた範囲によって特徴づけられる総質量を有し、以下の式
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(a)4−Gly5−(b)6−(c)7−(d)8−(e)9−(f)10−(g)11−Asp12−Arg13−(h)14−(i)15−Ser16−(j)17−Ser18−Gly19−(k)20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号50)により表され、式中、
(x)および(z)は、独立に、非存在であってよく、あるいは例えば、ビスホスホネートなどの合成骨ターゲティング化合物;例えば、ポリAspまたはポリGluなどの骨/軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列;例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質等の融合タンパク質またはペプチド配列などの骨ターゲティングドメインを有する骨タンパク質由来のアミノ酸配列およびその誘導体;例えば、荷電PEG分子などの親水性または水溶性ポリマーを含むが、これらに限定されない、腎クリアランスを減少させる部分;ならびに例えば、親水性ポリマー(例えば、PEG)、糖、疎水性酸および/またはアミノ酸を含む部分などの合成骨ターゲティング化合物からなる群から選択されてよく、
(a)は、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、1つの実施形態において(a)はArgであり、
(b)は、Cysおよび例えば、Cys−CH2−NHなどのCys6とPhe7の間のペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;N−アルキル基がメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルである、PheのN−アルキル化誘導体;ならびにPhe類似体のベンゼン環の1つもしくは複数のオルト、メタおよび/またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝C1−6アルキル、線状もしくは分枝C1−6アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−C1−6アルキル、C3−10シクロアルキル、C6−14アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される1つもしくは複数の置換基で置換されている(例は、チロシン、3−クロロフェニルアラニン、2,3−クロロ−フェニルアラニン、3−クロロ−5−フルオロ−フェニルアラニン、2−クロロ−6−フルオロ−3−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない)か、あるいはPhe類似体のベンゼン環を他のアリール基(非限定的な例は1−および2−ナフチルアラニンなどである)またはヘテロアリール基(非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである)で置換することができる、Phe類似体からなる群から選択され、
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly、Thr、Ser、ValおよびAsnからなる群から選択され、
(e)は、Leu、Ser、Thrおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(f)は、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、1つの実施形態において(f)はArgでなく、
(g)は、Leu、Asnおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(h)は、Ile、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly)、Asnおよび例えば、N−Me−Ileなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(i)は、Gly、Arg、SerおよびAsnからなる群から選択され、
(j)は、Met、Val、Asn、ベータ−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)および2−アミノ−イソ酪酸(Aib)からなる群から選択され、
(k)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tert−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Arg、Thr、Serおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(a)4−Gly5−(b)6−(c)7−(d)8−(e)9−(f)10−(g)11−Asp12−Arg13−(h)14−(i)15−Ser16−(j)17−Ser18−Gly19−(k)20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号50)により表され、式中、
(x)および(z)は、独立に、非存在であってよく、あるいは例えば、ビスホスホネートなどの合成骨ターゲティング化合物;例えば、ポリAspまたはポリGluなどの骨/軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列;例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質等の融合タンパク質またはペプチド配列などの骨ターゲティングドメインを有する骨タンパク質由来のアミノ酸配列およびその誘導体;例えば、荷電PEG分子などの親水性または水溶性ポリマーを含むが、これらに限定されない、腎クリアランスを減少させる部分;ならびに例えば、親水性ポリマー(例えば、PEG)、糖、疎水性酸および/またはアミノ酸を含む部分などの合成骨ターゲティング化合物からなる群から選択されてよく、
(a)は、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、1つの実施形態において(a)はArgであり、
(b)は、Cysおよび例えば、Cys−CH2−NHなどのCys6とPhe7の間のペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;N−アルキル基がメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルである、PheのN−アルキル化誘導体;ならびにPhe類似体のベンゼン環の1つもしくは複数のオルト、メタおよび/またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝C1−6アルキル、線状もしくは分枝C1−6アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−C1−6アルキル、C3−10シクロアルキル、C6−14アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される1つもしくは複数の置換基で置換されている(例は、チロシン、3−クロロフェニルアラニン、2,3−クロロ−フェニルアラニン、3−クロロ−5−フルオロ−フェニルアラニン、2−クロロ−6−フルオロ−3−メチル−フェニルアラニンを含むが、これらに限定されない)か、あるいはPhe類似体のベンゼン環を他のアリール基(非限定的な例は1−および2−ナフチルアラニンなどである)またはヘテロアリール基(非限定的な例はピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンなどである)で置換することができる、Phe類似体からなる群から選択され、
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly、Thr、Ser、ValおよびAsnからなる群から選択され、
(e)は、Leu、Ser、Thrおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(f)は、上記位置における野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換またはArg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerもしくはGluを含むが、これらに限定されない、側鎖に反応性第一級アミンを有さない天然もしくは非天然アミノ酸またはペプチド模倣体により置換されていてよく、1つの実施形態において(f)はArgでなく、
(g)は、Leu、Asnおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(h)は、Ile、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly)、Asnおよび例えば、N−Me−Ileなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(i)は、Gly、Arg、SerおよびAsnからなる群から選択され、
(j)は、Met、Val、Asn、ベータ−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)および2−アミノ−イソ酪酸(Aib)からなる群から選択され、
(k)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tert−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Arg、Thr、Serおよび例えば、N−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
さらなる実施形態において、CNP変異体は、CNP22の1〜22位のいずれかの1つまたは複数の位置における(1つまたは複数の)アミノ酸置換を有し得る。1つの実施形態において、Gly1がArgまたはGluで置換されている。他の実施形態において、Lys4がArgで置換されている。他の実施形態において、Gly5がArg、GlnまたはSerで置換されている。他の実施形態において、Gly15がSer、Asn、ArgまたはCitで置換されている。さらなる実施形態において、Gly19がSer、ArgまたはAsnで置換されている。他の実施形態において、Gly21がSer、ThrまたはArgで置換されている。
1つの実施形態において、CNP変異体は、GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC(脱カルボキシ−Cysを用いて生成させた)(配列番号56)、GLSKGC−(N−Me−Phe)−GLKLDRIGSMSGLGC(配列番号57)、GLSKGC−(D−Phe)−GLKLDRIGSMSGLGC(配列番号136)、GLSKGCF−(tBuG)−LKLDRIGSMSGLGC(配列番号58)、GLSKGC−(3−Cl−Phe)−GLKLDRIGSMSGLGC(配列番号137)およびGLSKGC−[NHCH2CH(Ph)CO]−GLKLDRIGSMSGLGC(3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸を用いて生成させた)(配列番号59)からなる群から選択される。さらなる実施形態において、ジスルフィド結合が、Cys6、脱カルボキシCysまたはCys6位における他のスルフヒドリル含有システイン類似体と本明細書で述べるいずれかのCNP変異体のCys22との間に存在する。
他の実施形態において、CNP変異体は、CNP22またはCNP17のN末端および/またはC末端における
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP−53)(配列番号4);
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP−37、類似体BL)(配列番号60);
AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CA)(配列番号61);
AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CB)(配列番号62);
DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CC)(配列番号63);
RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号40);
ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号38);
GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号64);
GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号65);
GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号66);
GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号67);
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号144);および
SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(類似体CD)(配列番号68)(BNP由来のN末端およびC末端テールを有するCNP17)を含むが、これらに限定されないアミノ酸延長部分を含む。
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP−53)(配列番号4);
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP−37、類似体BL)(配列番号60);
AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CA)(配列番号61);
AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CB)(配列番号62);
DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CC)(配列番号63);
RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号40);
ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号38);
GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号64);
GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号65);
GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号66);
GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号67);
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号144);および
SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(類似体CD)(配列番号68)(BNP由来のN末端およびC末端テールを有するCNP17)を含むが、これらに限定されないアミノ酸延長部分を含む。
さらなる実施形態において、CNP変異体は、CNP22の4位におけるK4R置換を有する。CNP(K4R)変異体の非限定的な例としては、
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP27(Arg4))(類似体AY)((配列番号36);
GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP27(Pro4))(類似体CI)(配列番号37);
RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体AZ)(配列番号41);
ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体BA)(配列番号39);
GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CH)(配列番号69);および
GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CG)(配列番号70)などがある。
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP27(Arg4))(類似体AY)((配列番号36);
GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP27(Pro4))(類似体CI)(配列番号37);
RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体AZ)(配列番号41);
ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体BA)(配列番号39);
GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CH)(配列番号69);および
GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CG)(配列番号70)などがある。
1つの実施形態において、N末端にPEG(またはPEO)部分およびアミノ酸延長部分を有するCNP変異体は、CNP22のGly1に対応する位置の直前の位置にアルギニンを含む。そのようなPEG化CNP変異体は、NEP分解に対する抵抗性の増大、血清アルブミンに対する結合の減少およびCNP機能活性の増大(例えば、cGMPシグナリングの活性化)のために設計されている。そのようなPEG化CNP変異体の非限定的な例としては、PEO24−CNP27(Arg4)、PEO12−CNP27(Arg4)、PEO24−GANRR−CNP22、PEO12−GANRR−CNP22、PEO24−CNP27(Pro4)、PEO12−CNP27(Pro4)、PEO24−GANPR−CNP22、PEO12−GANPR−CNP22、PEO24−GANQQ−CNP22、PEO12−GANQQ−CNP22、PEO24−ER−CNP22(K4R)、PEO12−ER−CNP22(K4R)、PEO24−ER−CNP22、PEO12−ER−CNP22、PEO24−R−CNP22(K4R)、PEO12−R−CNP22(K4R)、PEO24−R−CNP22、およびPEO12−R−CNP22などがあり、PEO24は、単分散性の1.2kDaのPEGポリマーであり、PEO12は、単分散性の0.6kDaのPEGポリマーである。1つの実施形態において、PEG(またはPEO)ポリマーは、CNP変異体のN末端に付加されている。
さらなるCNP変異体は、
GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CS)(配列番号71);GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CT)(配列番号72);GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CU)(配列番号73);GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CW)(配列番号74);および
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体DB)(配列番号75)。
を含むが、これらに限定されない、フューリンプロテアーゼに対するin vivo抵抗性を改善するためにフューリン切断部位(下線付き)に突然変異を有し、かつ/またはピログルタミン酸塩の生成を防ぐためにグルタミンの前にグリシン(下線付き)を有するCNP37の誘導体を含むが、これらに限定されない。
GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CS)(配列番号71);GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CT)(配列番号72);GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CU)(配列番号73);GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CW)(配列番号74);および
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体DB)(配列番号75)。
を含むが、これらに限定されない、フューリンプロテアーゼに対するin vivo抵抗性を改善するためにフューリン切断部位(下線付き)に突然変異を有し、かつ/またはピログルタミン酸塩の生成を防ぐためにグルタミンの前にグリシン(下線付き)を有するCNP37の誘導体を含むが、これらに限定されない。
他の実施形態において、CNP変異体は、
GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CQ)(ヒスチジンリッチ糖タンパク質(HRGP)断片−CNP22キメラ)(配列番号76);
GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CR)(HRGP断片−CNP22キメラ)(配列番号77);
GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CX)(HRGP断片−CNP22キメラ)(配列番号78);
GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CF)(IgG1(Fc)断片−CNP22キメラ)(配列番号79);
GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CY)(ヒト血清アルブミン(HSA)断片−CNP22キメラ)(配列番号80);
GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CE)(HSA断片−CNP22キメラ)(配列番号81);
FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CZ)(オステオクリン「NPR C阻害剤」断片−CNP22キメラ)(配列番号82);および
GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体DA)(FGF2「ヘパリン結合ドメイン」断片−CNP22キメラ)(配列番号83)
を含むが、これらに限定されない、CNP22およびN末端ペプチド断片を含むキメラである。
GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CQ)(ヒスチジンリッチ糖タンパク質(HRGP)断片−CNP22キメラ)(配列番号76);
GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CR)(HRGP断片−CNP22キメラ)(配列番号77);
GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CX)(HRGP断片−CNP22キメラ)(配列番号78);
GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CF)(IgG1(Fc)断片−CNP22キメラ)(配列番号79);
GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CY)(ヒト血清アルブミン(HSA)断片−CNP22キメラ)(配列番号80);
GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CE)(HSA断片−CNP22キメラ)(配列番号81);
FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CZ)(オステオクリン「NPR C阻害剤」断片−CNP22キメラ)(配列番号82);および
GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体DA)(FGF2「ヘパリン結合ドメイン」断片−CNP22キメラ)(配列番号83)
を含むが、これらに限定されない、CNP22およびN末端ペプチド断片を含むキメラである。
さらなる実施形態において、CNP変異体は、
GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CK)(IgG1(Fc)断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号84);
GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CL)(HSA断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号85)
GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CM)(フィブロネクチン断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号86);
GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CN)(フィブリノーゲン断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号87);
GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CO)(フィブリノーゲン断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号88);および
GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CP)(亜鉛フィンガー断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号89)
を含むが、これらに限定されない、N末端ペプチド断片およびアルギニンがCNP22のLys4と置換されているCNP22(「CNP22(K4R)」)を含むキメラである。
GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CK)(IgG1(Fc)断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号84);
GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CL)(HSA断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号85)
GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CM)(フィブロネクチン断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号86);
GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CN)(フィブリノーゲン断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号87);
GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CO)(フィブリノーゲン断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号88);および
GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CP)(亜鉛フィンガー断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号89)
を含むが、これらに限定されない、N末端ペプチド断片およびアルギニンがCNP22のLys4と置換されているCNP22(「CNP22(K4R)」)を含むキメラである。
他の実施形態において、CNP変異体は、単量体または二量体であってよい。関連実施形態において、二量体CNP変異体の単量体は、リンカーを介して、またはリンカーなしにN末端をN末端に、リンカーを介して、またはリンカーなしにN末端をC末端に、あるいはリンカーを介して、またはリンカーなしにC末端をC末端に結合させることができる。
IgGおよびCNP22またはその変異体を含むキメラは、とりわけ、NEP分解に対する抵抗性の増大および血清アルブミンに対する結合の減少のために設計されている。HSAの表面断片を含むCNPキメラは、とりわけ、免疫原性の減少および血清アルブミンに対する結合の減少のために設計されている。陽イオン性、ヒスチジンリッチ、非リシン、非アルギニンである配列をN末端に含むHRGP−CNP22およびHRGP−CNP22(K4R)キメラは、とりわけ、プロテアーゼに対する安定性の増大のために設計されている。オステオクリン断片を含むキメラは、プロテアーゼ(例えば、フューリン)切断により、オステオクリン断片を骨成長板において放出し、そこで該断片がクリアランス受容体NPR−Cを阻害するように計画されている。FGF2ヘパリン結合断片を含むキメラに関しては、断片に結合したヘパリンは、キメラを分解から保護し、それにより、より長い血清半減期を与えるように計画されている。フィブロネクチン、フィブリノーゲンまたは亜鉛フィンガー断片を含むキメラは、他の有利な特徴の中で特に、血清アルブミンに対する結合の減少のために設計されている。
理論に束縛されるものではないが、wtCNP22と比較してNEP分解に対する高い抵抗性または改善された機能性(例えば、NPR−Bへの結合およびcGMPシグナリングの刺激)を有する約2.6kDaもしくは2.8kDa〜約6もしくは7kDaの分子量のCNP変異体は、血清アルブミンなどの血漿タンパク質に強固に結合しなければ、より有効である可能性がある。血漿タンパク質(例えば、血清アルブミン)に強固に結合しないCNP変異体は、軟骨を通して拡散し、骨成長板の軟骨細胞に到達し、NPR−Bに結合し、cGMPシグナリングのためにそれを活性化するのにより有効である可能性がある。1つの実施形態において、血漿タンパク質(例えば、血清アルブミン)に対する結合の減少のために設計されたCNP変異体は、CNP22またはその変異体およびIgGのペプチド断片を含むキメラである。他の実施形態において、血漿タンパク質に対する結合の減少のために設計されたCNP変異体は、CNP22またはCNP22(K4R)およびポリペプチド(例えば、IgG、HSA、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド等)の断片を含むキメラである。他の実施形態において、血漿タンパク質に対する結合の減少のために設計されたCNP変異体は、親水性または水溶性ポリマーに結合したCNP22またはその変異体を含む。1つの実施形態において、親水性または水溶性ポリマーは、PEG(またはPEO)である。他の実施形態において、親水性または水溶性ポリマー(例えば、PEG)は、例えば、カルボキシル、硫酸もしくはリン酸基、またはその組合せなどの生理的条件下でポリマーに負電荷を与える1つまたは複数の官能基により官能基化されている。
本明細書で開示する実施形態のいずれかにおいて、CNP変異体は、野生型CNP22と実質的に同じまたはそれより良好な生物学的活性を有する可能性がある。例えば、CNP変異体は、例えば、cGMPの産生を刺激するためのNPR−B(GC−B)との相互作用に関して、野生型CNP22の活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれ以上を保持する可能性があり、あるいは、CNP22より大きい活性を有する可能性がある。あるいは、またはさらに、CNP変異体は、軟骨細胞増殖、軟骨細胞分化、マイトジェン活性化プロテイン(MAP)キナーゼ/MEK(Raf−1)キナーゼシグナリング経路の阻害、および軟骨内骨化の促進を含むが、これらに限定されない、軟骨内骨成長および軟骨細胞活性の調節に関して、野生型CNP22の活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれ以上を保持する可能性があり、あるいは、CNP22より大きい活性を有する可能性がある。本明細書で開示する実施形態のいずれかにおいて、CNP変異体は、野生型CNP22のアミノ酸6〜22または1〜22と少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれ以上同一または相同であるアミノ酸配列を含む可能性がある。
さらなる実施形態において、本発明は、NPR−Bに結合し、それを活性化する能力を保持すると同時に、NPR−Cクリアランス受容体に対するより低い親和性を有するCNP22の変異体を提供する。本発明は、詳細な説明で述べるようなNPR−B/CNP複合体の相同性に基づく構造モデルから生成させた、または生成させることができる変異体を含む。他の実施形態において、CNP変異体は、NPR−Cと比べてNPR−Bに対する結合に関するそれらの特異性を増大させる可能性がある、立体配座の柔軟性を減少させるための1、5、8、15、19および21位における1つまたは複数のGly部位における置換を有する。NPR−Cに対する潜在的に低い親和性を有するCNPの変異体は、次の置換の1つまたは複数を有するものを含むが、それらに限定されない:G1R、G1E、G5R、G5Q、G5S、F7Y、G8T、G8S、G8V、G8N、L9S、L9T、K10Cit、K10Q、K10S、I14N、G15R、G15S、G15N、G15Cit、S16Q、M17V、M17N、G19S、G19R、G19N、L20V、L20R、L20T、L20S、G21S、G21TおよびG21R。
他の実施形態において、CNP変異体は、5、7、8、9、10、14、15、16、17、19、20および21位の1つまたは複数における改変および/または置換を有し、また本明細書で開示した他の位置のいずれかにおける改変および/または置換を場合によって有していてよい。さらなる実施形態において、CNP変異体は、例えば、骨/軟骨ターゲティングを促進し、腎クリアランスを減少させ、かつ/またはNEP分解に対する抵抗性を増大させるためにNおよび/またはC末端に(1つまたは複数の)結合部分または(1つまたは複数の)延長部分を場合によって有していてよい。そのような(1つまたは複数の)結合部分または(1つまたは複数の)延長部分は、例えば、ポリAsp、ポリGlu、骨もしくは軟骨ターゲティングペプチド、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質、PEGs、糖、疎水性酸、NPPCもしくは非CNP(ポリ)ペプチド、またはその組合せから形成される、または由来する分子または配列を含んでいてよい。
他の実施形態において、CNP変異体は、適切な場合に置換および/または付加されている(1つまたは複数の)天然もしくは非天然アミノ酸または(1つまたは複数の)ペプチド模倣体を用いて標準的な固相ペプチド合成法により調製する。さらなる実施形態において、CNP変異体のPEG化は、NHSもしくはアルデヒドベースの化学または当技術分野で公知の化学により行わせる複合反応によるペプチド合成の後またはその一部で起こる。他の実施形態において、CNP変異体は、ジスルフィド結合を含む。関連実施形態において、該ジスルフィド結合は、環状ペプチドを形成する。特定の実施形態において、該ジスルフィド結合は、CNP22の6および22位に対応する位置におけるシステイン残基の間に形成される。
CNP変異体を、例えば、ヘプタン酸、ペンタン酸または脂肪酸などの疎水性ポリマーまたは非ポリマー部分に結合させることができることがさらに予期される。疎水性部分は、リシン、セリン、トレオニンを含むが、これらに限定されないアミノ酸残基の側鎖に結合させることができ、あるいは、CNP変異体のN末端および/またはC末端に結合させることができる。
1つの実施形態において、本明細書で述べるCNP変異体は、約8〜約10.5または約8.5〜約10の範囲のpIを有する。
さらなる実施形態において、本発明は、CNP変異体、場合によって他の生物学的に活性な物質、および場合によって薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、注射に適する滅菌済み医薬組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、実質的に純粋な、例えば、少なくとも90%または95%純粋なCNP変異体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、約5%、4%、3%、2%、1%または0.5%未満の他のヒトタンパク質、ブタタンパク質またはCNP53もしくはその断片(所望のCNP変異体以外)などの混入物を含む。
本発明のCNP変異体は、有利なことにCNP活性を保持し、血清半減期の増加を示す。CNP活性の保持は、例えば、所望のin vivoでの生物学的効果の保持、または同じ濃度(例えば、1μMのCNPペプチドまたはED80を超える)のもとでのCNP22のcGMP刺激活性の少なくとも約50%の保持として示すことができる。いくつかの実施形態において、CNP変異体は、CNP22と比較して血清半減期の少なくとも約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍または40倍の増加を示す。
他の実施形態において、本発明は、治療上有効な量のCNP変異体または前述のものを含む組成物をそれを必要とする被検体に投与することを含む、CNPに反応性を示す状態または障害を治療する方法を提供する。1つの実施形態において、CNPに反応性を示す障害は、骨格異形成症および線維芽細胞成長因子受容体3(FGFR−3)突然変異に伴う障害などの遺伝的骨格奇形を含むが、これらに限定されない骨成長の障害である。特定の実施形態において、(1つまたは複数の)FGFR−3突然変異に伴う障害は、軟骨無形成症である。他の実施形態において、CNPに反応性を示す障害は、血管平滑筋細胞および組織に関連する障害である。さらなる実施形態において、CNP変異体は、骨(例えば、肢骨)の成長板のサイズを増加させるのに有用である。他の実施形態において、CNP変異体は、骨を延長または長骨の成長を増大させるのに有用である。他の実施形態において、CNP変異体は、軟骨細胞のマトリックス産生、増殖および分化を増大させるのに有用である。
本発明は、NEPおよび/またはNPR−Cに対する低い親和性、NEPによる切断および/またはNPR−Cによるクリアランスに対する低い感受性を有するCNPの新規な変異体、そのようなCNP変異体を含む医薬組成物、ならびに軟骨無形成症などの骨関連障害および血管平滑筋細胞および組織に関連する障害を含むが、これらに限定されない、CNPに反応性を示す障害を治療するためにそのようなCNP変異体を使用する方法に関する。
A.定義
特に断らない限り、本明細書および特許請求の範囲を含む本願書で用いる以下の用語は、下に示す定義を有する。
特に断らない限り、本明細書および特許請求の範囲を含む本願書で用いる以下の用語は、下に示す定義を有する。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いているように、不定冠詞「a」および「an」ならびに定冠詞「the」は、文脈上他の状態が明確でない限り、複数ならびに単数の言及した事柄を含む。
「約」または「おおよそ」という用語は、値を測定または求める方法に一部依存する、当業者が測定する個々の値の許容できる誤差を意味する。特定の実施形態において、「約」または「おおよそ」という用語は、1、2、3または4標準偏差以内を意味する。特定の実施形態において、「約」または「おおよそ」という用語は、所定の値または範囲の30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%または0.05%以内を意味する。
標準的な化学用語の定義は、CareyおよびSundberg、AdvancedOrganic Chemistry、第3版、AおよびB巻(Plenum Press、New York、1992年)を含む参考図書に見いだすことができる。本発明の実施は、特に示さない限り、当分野の技術の範囲内の合成有機化学、質量分析、分取および分析用クロマトグラフィー、タンパク質化学、生化学、組換えDNA技術ならびに薬理学の従来の方法を用いるものである。例えば、T.E. Creighton、Proteins: Structures and Molecular Properties(W. H. Freeman andCompany、1993年);A. L. Lehninger、Biochemistry(Worth Publishers, Inc.、第4版、2004年);Sambrookら、MolecularCloning: A Laboratory Manual(第2版、1989年);Methods In Enzymology(S. ColowickおよびN.Kaplan編、Academic Press, Inc.);Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版(Easton、Pennsylvania、MackPublishing Company、1990年)を参照のこと。
本明細書で引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、上か下かにかかわりなく、それらの全体として参照により組み込まれている。
以下のアミノ酸の略語を本文を通して用いる。
ポリペプチド配列を示すために本明細書では従来の表記法を用い、ポリペプチド配列の左端は、アミノ末端であり、ポリペプチド配列の右端は、カルボキシル末端である。
「保存的置換」は、機能的、構造的または化学的に類似な天然または非天然アミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を意味する。1つの実施形態において、以下の群は、それぞれ互いに保存的置換である天然アミノ酸を含む。
(1)アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T);
(2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
(3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
(4)アルギニン(R)、リシン(K);
(5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);および
(6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
(2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
(3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
(4)アルギニン(R)、リシン(K);
(5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);および
(6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
他の実施形態において、以下の群は、それぞれ互いに保存的置換である天然アミノ酸を含む。
(1)グリシン(G)、アラニン(A);
(2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
(3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
(4)アルギニン(R)、リシン(K);
(5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)、アラニン(A);
(6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);および
(7)セリン(S)、トレオニン(T)、システイン(C)。
(2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
(3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
(4)アルギニン(R)、リシン(K);
(5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)、アラニン(A);
(6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);および
(7)セリン(S)、トレオニン(T)、システイン(C)。
他の実施形態において、アミノ酸は、下に示すように分類することができる。
(1)疎水性:Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)主鎖の配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;および
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe、His。
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)主鎖の配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;および
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe、His。
1つの実施形態において、本明細書で述べるペプチドまたはポリペプチドは、CNP変異体をエンコードするポリヌクレオチドを用いて組換え手段により生成させる。したがって、本発明は、本明細書で述べるCNP変異体のいずれかをエンコードするポリヌクレオチド、発現制御配列に場合によって連結された、そのようなポリヌクレオチドを含む宿主細胞またはベクター、および本発明のCNP変異体を生成させるためのそのようなポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を用いる方法を含む。そのようなポリヌクレオチドにより発現されるCNP変異体は、CNP変異体をエンコードするポリヌクレオチドの発現に適する条件下で培地中で宿主細胞を増殖させる段階、および発現産物を宿主または培地から分離する段階を含む方法により産生させることができる。実際の発現産物は、翻訳後処理によってエンコードされたタンパク質産物とわずかに異なる可能性がある。
「ポリヌクレオチド」は、核酸単位により構成されているポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(「DNA」)およびリボ核酸(「RNA」)などの天然に存在する核酸ならびに核酸類似体を含む。「核酸」という用語は、一般的に大きいポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般的に約50ヌクレオチド以下の短いポリヌクレオチドを一般的に意味する。ヌクレオチド配列をDNA配列(すなわち、A、T、G、C)により表す場合、ヌクレオチド配列は、「T」を「U」で置換したRNA配列(すなわち、A、U、G、C)も含むことは理解されるであろう。「cDNA」は、一本鎖または二本鎖形のmRNAと相補的または同一であるDNAを意味する。
「発現制御配列」は、それに作用できるように連結されるヌクレオチド配列の発現を調節するヌクレオチド配列を意味する。「作用できるように連結される」は、1つの部分の活性(例えば、転写を調節する能力)が他の部分に対する作用(例えば、配列の転写)をもたらす、2つの部分の間の機能上の関係を意味する。発現制御配列は、例えば、かつ制限なしに、プロモーター(例えば、誘導または構成)、エンハンサー、転写ターミネータ、開始コドン(すなわち、ATG)、イントロンに対するスプライシングシグナルおよび停止コドンを含み得る。
「組換えポリヌクレオチド」は、天然では結合しない配列を有するポリヌクレオチドを意味する。増幅または集合組換えポリヌクレオチドを適切なベクターに含めることができ、ベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換することができる。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれる。次いで、遺伝子を組換え宿主細胞中で発現させて、例えば、「組換えポリペプチド」を産生させる。組換えポリヌクレオチドは、非コーディング機能(例えば、プロモーター、複製の起点、リボソーム結合部位等)も果たすことができる。
「キメラ」は、本明細書で用いているように、当技術分野で一般的に公知の技術、例えば、組換え発現または化学的架橋を用いて結合または連結させた少なくとも2つの異種ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列(すなわち、異なる供給源由来または天然に存在する配列として互いに関連性がない)を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。
2つまたはそれ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における「同一」または「同一性」の割合という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いて測定した、または目視検査により、最大の一致について比較し、アライメントしたときに、同じである、または同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の指定の割合を有する2つまたはそれ以上の配列もしくは部分配列を意味する。
2つの核酸またはポリペプチドにおける「実質的に相同」または「実質的に同一」という語句は、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いて測定した、または目視検査により、最大の一致について比較し、アライメントしたときに、少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%もしくは98%のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の同一性を有する2つまたはそれ以上の配列もしくは部分配列を一般的に意味する。特定の実施形態において、実質的な同一性は、長さが少なくとも約25、50、100または150残基である配列の領域にわたって存在する。他の実施形態において、配列は、いずれかまたは両比較生体高分子の全長にわたって実質的に同一である。
配列の比較の場合、一般的に1つの配列が、試験配列を比較する参照配列としての機能を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合に部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。配列比較アルゴリズムは、次に、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較して(1つまたは複数の)試験配列の配列同一性の割合を計算する。
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、SmithおよびWaterman、Adv.Appl. Math.、2巻、482頁(1981年)の局所相同性アルゴリズムにより、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol.、48巻、443頁(1970年)の相同性アライメントアルゴリズムにより、PearsonおよびLipman、Proc.Natl. Acad. Sci. USA、85巻、2444頁(1988年)の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software PackageにおけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WI)により、または目視検査により行うことができる。有用なアルゴリズムの1例は、FengおよびDoolittle、J.Mol. Evol.、35巻、351〜360(1987年)の漸進的アライメント法の簡略化を用いるPILEUPであり、HigginsおよびSharp、CABIOS、5巻、151〜153頁(1989年)により記載された方法と類似している。配列の多重アライメントを発生させるのに有用な他のアルゴリズムは、Clustal W(Thompsonら、NucleicAcids Research、22巻、4673〜4680頁(1994年))である。配列同一性の割合および配列類似性を測定するのに適するアルゴリズムの例は、BLASTアルゴリズムである(Altschulら、J.Mol. Biol.、215巻、403〜410頁(1990年);HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻、10915頁(1989年);KarlinおよびAltschul、Proc.Natl. Acad. Sci. USA、90巻、5873〜5787頁(1993年))。BLAST解析を実施するためのソフトウエアは、National Center for Biotechnology Informationを介して公式に入手可能である。
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるというさらなる徴候は、第1の核酸によりエンコードされるポリペプチドが、下で述べるように、第2の核酸によりエンコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、2つのペプチドが保存的置換のみが異なる場合、ポリペプチドは、第2のポリペプチドと一般的に実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるという他の徴候は、2つの分子が、下で述べるように、緊縮条件下で互いにハイブリッド形成することである。
「実質的に純粋な」または「分離された」は、対象となる種が存在する優勢な種である(すなわち、モル基準で、組成物中の他の個々の巨大分子種より豊富である)ことであり、実質的に精製された画分は、対象となる種が存在するすべての巨大分子種の少なくとも約50%(モル基準で)を含む、組成物である。1つの実施形態において、実質的に純粋な組成物は、問題とする種がモルまたは重量基準で組成物中に存在する巨大分子種の少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%またはそれ以上を含むことを意味する。組成物が単一巨大分子種から本質的になっている場合、対象となる種は、本質的な均質性になるまで精製されている(混入物種が従来の検出方法により組成物中に検出することができない)。溶媒種、小分子(<500ダルトン)、安定化剤(例えば、BSA)および元素イオン種は、この定義の目的のために巨大分子種とみなされない。1つの実施形態において、本発明の化合物は、実質的に純粋または分離されている。他の実施形態において、本発明の化合物は、それらの合成に用いられる巨大分子出発物質に関して実質的に純粋または分離されている。他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤、および場合によって、他の生物学的に活性な物質と混合された実質的に純粋または分離されたCNP変異体を含む。
物体に適用される「天然に存在する」は、物体を天然で見いだすことができることを意味する。例えば、生物(ウイルスを含む)に存在し、実験室で人間により意図的に改変されなかったポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。1つの実施形態において、「天然に存在する」物質は、ヒト由来のものである。
「野生型」(wt)は、種におけるポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列を含む、天然形態を意味する用語である。野生型形態は、(1つまたは複数の)遺伝的突然変異により生ずるポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質の突然変異型と区別される。
1つの実施形態において、第2のポリペプチドの「類似体」または「変異体」または「誘導体」である第1のポリペプチドは、第2のポリペプチドとの少なくとも約50%、60%または70%の配列相同性を有するが、100%未満の配列相同性を有するポリペプチドである。そのような類似体、変異体または誘導体は、ホモアルギニン、オルニチン、ペニシラミンおよびノルバリンを制限なしに含む天然に存在しないアミノ酸残基、ならびに天然に存在するアミノ酸残基により構成されていてよい。そのような類似体、変異体または誘導体は、1つまたは複数のD−アミノ酸残基により構成されていてもよく、またペプチド模倣体または2つもしくはそれ以上のアミノ酸もしくはペプチド模倣体残基間の非ペプチド結合などのペプチド結合イソスターを含んでいてもよい。他の実施形態において、第1のポリペプチドが第2のポリペプチドの公知の切断生成物でなく、または第2のポリペプチドの公知の前駆体でない場合、第1のポリペプチドが第2のポリペプチドと100%の配列相同性を有するか、または野生型配列を有していたとしても、第1のポリペプチドは、第2のポリペプチドの「類似体」または「変異体」または「誘導体」である。
1つの実施形態において、「に由来する」という用語は、本明細書で用いているように、野生型または天然に存在するポリペプチドまたはペプチド配列に基づき、1つもしくは複数の欠失、天然アミノ酸、非天然アミノ酸またはペプチド模倣体による付加および/または置換を有していてよい、ポリペプチドまたはペプチド配列を意味する。1つの実施形態において、誘導体配列は、野生型または天然に存在する配列と少なくとも約40%、50%、60%または70%の、しかし100%未満の配列類似性を共有している。他の実施形態において、誘導体は、ポリペプチドの断片であってよく、断片は、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50個のアミノ酸の長さにわたって野生型ポリペプチドと実質的に相同である(例えば、少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%または95%相同)。他の実施形態において、ポリペプチドが野生型ポリペプチドに存在しない、それに結合した部分(例えばPEGなどの、例えばポリマー)を有する場合、両ポリペプチドがそれらのアミノ酸配列における100%の相同性を共有しているとしても、ポリペプチドは、野生型ポリペプチド「に由来」する。
本明細書で用いているように、「NPPC由来」ポリペプチドは、一本鎖126アミノ酸プレプロポリペプチドであり、切断により、最終的にwtCNP22をもたらす、ナトリウム利尿ペプチド前駆体C(NPPC)ポリペプチドに由来するポリペプチドである。NPPCからの単一ペプチドの除去により、プロCNPが生成し、エンドプロテアーゼであるフューリンによるさらなる切断により、活性な53アミノ酸ペプチド(CNP−53)が生成し、これが分泌され、未知の酵素により再び切断して、成熟22アミノ酸ペプチド(CNP、またはCNP−22)が生成する。したがって、CNP22自体は、NPPCに由来することにより、「NPPC由来」ポリペプチドである。1つの実施形態において、NPPC由来ポリペプチドは、同じ数のアミノ酸残基にわたり野生型NPPCと少なくとも約40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%または95%相同である。NPPC由来ペプチドは、NPPCポリペプチドの約1〜約53、または1〜37、または1〜35、または1〜31、または1〜27、または1〜22、または10〜35、または約15〜約37残基を含むことがさらに予期される。1つの実施形態において、NPPC由来ポリペプチドは、NPPCポリペプチドに由来する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52または53アミノ酸の配列を含んでいてよい。
「有効な量」という用語は、被検体の健康状態、病状もしくは疾患に関する、または診断目的のための所望の結果をもたらすのに十分な用量を意味する。所望の結果は、用量の受容者における主観的または客観的な改善を含んでいてよい。「治療上有効な量」は、健康に対する意図する有用な効果をもたらすのに有効な薬剤の量を意味する。あらゆる個別の例における適切な「有効な」量は、常法による実験を用いて当業者が決定することができる。個々の患者に対する個別の用量および投与頻度は、異なる可能性があり、用いる個々の化合物の活性;当化合物の生物学的利用能、代謝安定性、排泄速度および作用の持続時間;該化合物の投与の方法および時間;患者の年齢、体重、一般的健康状態、性および食事;ならびに個々の状態の重症度などの様々な因子に依存することは理解されよう。
「治療」は、予防的治療または治療処置または診断的治療を意味する。特定の実施形態において、「治療」は、治療、予防または診断の目的のために被検体に化合物または組成物を投与することを意味する。
「予防的」治療は、健康異常を発現するリスクを低減する目的のために、疾患の徴候を示さない、または疾患の初期の徴候を示す被検体に適用する処置である。本発明の化合物または組成物は、健康異常を発現する可能性を低減するため、または発現した場合に健康異常の重症度を最小限にするために予防処置として投与することができる。
「治療」処置は、健康異常の徴候または症状を示す被検体に対して、それらの徴候または症状を減弱させるまたは消失させる目的のために適用する治療である。徴候または症状は、生化学的、細胞、組織学的、機能的、主観的または客観的であってよい。本発明の化合物は、治療処置として、または診断のために投与することもできる。
「診断」は、健康異常の状態の存在、程度および/または性質を特定することを意味する。診断方法は、それらの特異性および選択性が異なっている。特定の診断方法は状態の明確な診断を可能にしないことがあるが、該方法が診断の助けとなる陽性徴候を示すならば、十分である。
「医薬組成物」は、ヒトおよび哺乳動物を含む対象動物における薬学的用途に適する組成物を意味する。医薬組成物は、治療上有効な量のCNP変異体、場合によって他の生物学的に活性な物質、および場合によって薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む。1つの実施形態において、医薬組成物は、(1つまたは複数の)有効成分および担体を構成する(1つまたは複数の)不活性成分、ならびに2つまたはそれ以上の成分の組合せ、錯体形成または凝集により、あるいは1つまたは複数の成分の解離により、あるいは1つまたは複数の成分の他の種類の反応または相互作用により、直接または間接的に生ずる生成物を含む。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物と薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤とを混合することにより調製されるあらゆる組成物を含む。
「薬学的に許容される担体」は、リン酸緩衝生理食塩液、デキストロースの5%水溶液および乳剤(例えば、油/水または水/油型乳剤)などの標準的な医薬用担体、緩衝剤などのいずれかを意味する。賦形剤の非限定的な例は、アジュバント、結合剤、充填剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、湿潤剤、滑沢剤、流動促進剤、甘味料、着香料および着色剤などである。適切な医薬用担体、賦形剤および希釈剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第19版(Mack Publishing Co.、Easton、1995年)に記載されている。好ましい医薬用担体は、活性薬の投与方法に依存する。一般的な投与方法は、経腸(例えば、経口)または非経口(例えば、皮下、筋肉内、静脈内または腹腔内注射;または局所、経皮または経粘膜投与)などである。
「薬学的に許容される塩」は、金属塩(例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等)およびアンモニアもしくは有機アミンの塩を含むが、これらに限定されない、医薬用の複合物に製剤化することができる塩である。
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」は、生物学的に、または他の点で望ましくない物質を意味する。すなわち、該物質は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、あるいはそれが含まれる組成物の成分のいずれかと、または個体の身体上または体内に存在するいずれかの成分と有害な様態で相互作用することなく、個体に投与することができる。
「単位剤形」という用語は、各単位が、あらかじめ定められた量の計算された本発明の化合物を所望の効果をもたらすのに十分な量で、場合によって、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体または媒体と共に含む、ヒトおよび動物被検体用の単位用量として適する物理的に不連続な単位を意味する。本発明の新規な単位剤形の仕様は、用いられる個々の化合物、達成されるべき効果、および宿主における各化合物に関連する薬力学に依存する。
「生理的条件」は、動物(例えば、ヒト)の体内の条件を意味する。生理的条件は、体温ならびに生理的イオン強度、pHおよび酵素の水性環境を含むが、これらに限定されない。生理的条件はまた、大多数の被検体に存在する「正常な」条件と異なる、例えば、約37℃の正常なヒト体温と異なる、または約7.4の正常なヒト血液pHと異なる特定の被検体の体内の条件を含む。
「生理的pH」または「生理的範囲内のpH」は、約7.0〜8.0(7.0と8.0を含む)の範囲、より一般的には約7.2〜7.6(7.2と7.6を含む)の範囲のpHを意味する。
本明細書で用いているように、「被検体」という用語は、哺乳動物および非哺乳動物を含む。哺乳動物の例は、哺乳類綱のメンバー:ヒト、チンパンジーなどのヒト以外の霊長類、および他の無尾サルおよびサル種;ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの農場動物;ウサギ、イヌおよびネコなどの家畜;ラット、マウスおよびモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物などを含むが、これらに限定されない。非哺乳動物の例は、鳥、魚などを含むが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢または性を表さない。
「ポリエチレングリコール」、「PEG」、「ポリエチレンオキシド」および「PEO」という用語は、特に示さない限り、本明細書では同義で用いる。数nに関連する「PEOn」ポリマーにアミノ基を介して結合したCNPペプチド(CNP22またはその変異体)は、一般的に式CH3−[−O−CH2CH2−]n−C(=O)−NHRを有し、nは、エチレンオキシド単位の数であり、Rは、ペプチドの残りを表す。「PEOn」ポリマーは、アルキレン基(CH2)nを場合によって有していてよく、nは、カルボニル炭素と反復エチレンオキシド単位との間の1〜5の整数である。そのような「PEOn」(例えば、PEO12またはPEO24)ポリマーは、単分散性、すなわち、特定の分子量の単一の分離した分子である。同様に、数nKに関連する「PEGnK」ポリマーにアミノ基を介して結合したCNPペプチドは、一般的に式CH3−[−O−CH2CH2−]p−C(=O)−NHRを有し、pは、1より大きい整数である。「PEGnK」ポリマーもアルキレン基(CH2)nを場合によって有していてよく、nは、カルボニル炭素と反復エチレンオキシド単位との間の1〜5の整数である。しかし、そのような「PEGnK」(例えば、PEG1K、PEG2K、PEG5KまたはPEG20K)ポリマーは、多分散性、すなわち、分子量の分布を有するポリマーの混合物を含み、数nKは、キロダルトン単位のポリマー数平均分子量(Mn)を表す。例えば、CNPペプチドに結合している「PEG2K」は、約2kDaのポリマー数平均分子量を有する多分散性PEGポリマーである。
ポリマー(例えば、PEG)の質量の範囲が与えられている場合(例えば、kDa単位の)、範囲は、特に示さない限り、ポリマー数平均分子量の範囲を意味するのであって、多分散性混合物中の複数のポリマーの分子量の範囲を意味するものではない。
「ハロゲン」、「ハロゲン化物」または「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素および/またはヨウ素を意味する。
「アルキル」という用語は、線状または分枝飽和一価炭化水素遊離基を意味し、アルキルは、本明細書で述べるように1つまたは複数の置換基Qで場合によって置換されていてよい。特定の実施形態において、アルキルは、1〜20個(C1−20)、1〜15個(C1−15)、1〜12個(C1−12)、1〜10個(C1−10)または1〜6個(C1−6)の炭素原子を有する線状飽和一価炭化水素遊離基であるか、または3〜20個(C3−20)、3〜15個(C3−15)、3〜12個(C3−12)、3〜10個(C3−10)または3〜6個(C3−6)の炭素原子を有する分枝飽和一価炭化水素遊離基である。本明細書で用いているように、線状C1−6および分枝C3−6アルキル基は、「低級アルキル」とも呼ばれる。アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル(n−プロピルおよびイソプロピルを含むすべての異性体を含む)、ブチル(n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルおよびtert−ブチルを含むすべての異性体を含む)、ペンチル(すべての異性体を含む)ならびにヘキシル(すべての異性体を含む)を含むが、これらに限定されない。例えば、C1−6アルキルは、1〜6個の炭素原子の線状飽和一価炭化水素遊離基または3〜6個の炭素原子の分枝飽和一価炭化水素遊離基を意味する。
「アルコキシ」という用語は、−O−アルキル基を意味する。特定の実施形態において、アルコキシ基は、本明細書で述べるように1つまたは複数の置換基Qで場合によって置換されていてよい。
「ハロアルキル」という用語は、1つまたは複数のハロゲン原子で置換されているアルキル基を意味する。特定の実施形態において、ハロアルキル基は、1、2、3,4,5または6個のハロゲン原子で置換されている。特定の実施形態において、ハロアルキル基は、本明細書で述べるように1つまたは複数のさらなる置換基Qで場合によって置換されていてよい。
「シクロアルキル」という用語は、本明細書で述べるように1つまたは複数のさらなる置換基Qで場合によって置換されていてよい、環状飽和架橋および/または非架橋一価炭化水素遊離基を意味する。特定の実施形態において、シクロアルキルは、3〜20個(C3−20)、3〜15個(C3−15)、3〜12個(C3−12)、3〜10個(C3−10)または3〜7個(C3−7)の炭素原子を有する。シクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、デカリニルおよびアダマンチルを含むが、これらに限定されない。
「ヘテロシクリル」または「ヘテロ環式」という用語は、単環式非芳香環系または1つまたは複数の非芳香環を含む多環式系を意味し、1つまたは複数の非芳香環原子は、O、SまたはNから独立に選択されるヘテロ原子であり、残りの非芳香環原子は、炭素原子である。特定の実施形態において、ヘテロシクリルまたはヘテロ環式基は、3〜20個、3〜15個、3〜10個、3〜8個、4〜7個または5〜6個の環原子を有する。特定の実施形態において、ヘテロシクリルは、縮合または架橋環系を含んでいてよく、窒素または硫黄原子が場合によって酸化されていてよく、窒素原子が場合によって第四級化されていてよく、一部の環が部分的もしくは完全に飽和されているか、または芳香族であってよい、単環式、二環式、三環式または四環式環系である。ヘテロシクリルは、主構造に、安定な化合物の形成をもたらすヘテロ原子または炭素原子において結合していてよい。ヘテロ環式基の例は、アクリジニル、アゼピニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインドリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソオキサジニル、ベンゾジオキサニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾピラニル、ベンゾテトラヒドロフラニル、ベンゾテトラヒドロチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオピラニル、ベンゾオキサジニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロマニル、クロモニル、シンノリニル、クマリニル、デカヒドロイソキノリニル、ジベンゾフラニル、ジヒドロベンゾイソチアジニル、ジヒドロベンゾイソオキサジニル、ジヒドロフラニル、ジヒドロピラニル、ジオキソラニル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジオキソラニル、1,4−ジチアニル、フラノニル、フラニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、イミダゾチアゾリル、インダゾリル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、イソベンゾテトラヒドロフラニル、イソベンゾテトラヒドロチエニル、イソベンゾチエニル、イソクロマニル、イソクマリニル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、オキサジアゾリル、オキサゾリジノニル、オキサゾリジニル、オキサゾロピリジニル、オキサゾリル、オキシラニル、ペルイミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノオキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、4−ピペリドニル、プテリジニル、プリニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリドピリジニル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、キノオキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチエニル、テトラゾリル、チアジアゾロピリミジニル、チアジアゾリル、チアモルホリニル、チアゾリジニル、チアゾリル、チエニル、トリアジニル、トリアゾリルおよび1,3,5−トリチアニルを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ヘテロ環式基は、本明細書で述べるように1つまたは複数の置換基Qで場合によって置換されていてよい。
「アリール」という用語は、単環式芳香族基または少なくとも1つの芳香族炭化水素環を含む多環式一価芳香族基を意味する。特定の実施形態において、アリールは、6〜20個(C6−20)、6〜15個(C6−15)または6〜10個(C6−10)の環原子を有する。アリール基の例は、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アズレニル、アントリル、フェナントリル、ピレニル、ビフェニルおよびテルフェニルを含むが、これらに限定されない。アリールは、二環式または三環式炭素環も意味し、環の少なくとも1つは、芳香族であり、他は、飽和、部分的に不飽和または芳香族、例えば、ジヒドロナフチル、インデニル、インダニルおよびテトラヒドロナフチル(テトラリニル)であってよい。特定の実施形態において、アリール基は、本明細書で述べるように1つまたは複数の置換基Qで場合によって置換されていてよい。
「ヘテロアリール」という用語は、少なくとも1つの芳香環がO、SおよびNから独立に選択される1つまたは複数のヘテロ原子を含む、単環式芳香族基または多環式芳香族基を意味する。ヘテロアリール基の各環は、1つもしくは2個のO原子、1つもしくは2個のS原子および/または1〜4個のN原子を含んでいてよく、ただし、各環におけるヘテロ原子の総数は、4個またはそれ未満であり、各環は、少なくとも1個の炭素原子を含む。ヘテロアリールは、主構造に、安定な化合物の形成をもたらすヘテロ原子または炭素原子において結合していてよい。特定の実施形態において、ヘテロアリールは、5〜20個、5〜15個または5〜10個の環原子を有する。単環式ヘテロアリール基の例は、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チエニル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニルおよびトリアジニルを含むが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリール基の例は、インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、イソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾピラニル、インドリジニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロモニル、クマリニル、シンノリニル、キノキサリニル、インダゾリル、プリニル、ピロロピリジニル、フロピリジニル、チエノピリジニル、ジヒドロイソインドリルおよびテトラヒドロキノリニルを含むが、これらに限定されない。三環式ヘテロアリール基の例は、カルバゾリル、ベンゾインドリル、フェナントロリニル、アクリジニル、フェナントリジニルおよびキサンテニルを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ヘテロアリール基は、本明細書で述べるように1つまたは複数の置換基Qで場合によって置換されていてよい。
「場合によって置換された」は、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールなどの基が1つまたは複数の置換基Q(1つの実施形態において、1つ、2つ、3つまたは4つの置換基Q)で置換されていてよいことを意味し、各Qは、シアノ、ハロ、ニトロ、C1−6アルキル、C1−6アルコキシ、ハロ−C1−6アルキル、C3−7シクロアルキル、ヘテロシクリル、C6−14アリール、ヘテロアリール、−C(O)Re、−C(O)ORe、−C(O)NRfRg、−C(NRe)NRfRg、−ORe、−OC(O)Re、−OC(O)ORe、−OC(O)NRfRg、−OC(=NRe)NRfRg、−OS(O)Re、−OS(O)2Re、−OS(O)NRfRg、−OS(O)2NRfRg、−NRfRg、−NReC(O)Rf、−NReC(O)ORf、−NReC(O)NRfRg、−NReC(=NRh)NRfRg、−NReS(O)Rf、−NReS(O)2Rf、−NReS(O)NRfRg、−NReS(O)2NRfRg、−SRe、−S(O)Re、−S(O)2Reおよび−S(O)2NRfRgからなる群から独立に選択され、各Re、Rf、RgおよびRhは、独立に水素、C1−6アルキル、C3−7シクロアルキル、ヘテロシクリル、C6−14アリールもしくはヘテロアリールであり、またはRfおよびRgは、それらが結合しているN原子と一緒になってヘテロシクリルを形成している。
B.CNP変異体
CNP22の治療薬としての使用は、血漿中でのその半減期の短さから限られている(J.Clin. Endocrinol. Metab.、78巻:1428〜35頁(1994年))。ヒト血漿中で、CNP22の濃度は通常5ピコモル未満である。CNP22は、ヒトにおいてNEPおよびNPR−Cにより分解され、循環から取り除かれる。(GrowthHormone & IGF Res.、16巻:S6〜S14頁)。全身投与されたCNP22を使用したすべてのヒトおよび動物の研究において、対象中のCNP22濃度を上昇させるために持続注入が使用されている。長い半減期および少なくとも同様のレベルの機能性を有するCNPペプチドは、CNPに基づく治療戦略に有益であると思われる。
CNP22の治療薬としての使用は、血漿中でのその半減期の短さから限られている(J.Clin. Endocrinol. Metab.、78巻:1428〜35頁(1994年))。ヒト血漿中で、CNP22の濃度は通常5ピコモル未満である。CNP22は、ヒトにおいてNEPおよびNPR−Cにより分解され、循環から取り除かれる。(GrowthHormone & IGF Res.、16巻:S6〜S14頁)。全身投与されたCNP22を使用したすべてのヒトおよび動物の研究において、対象中のCNP22濃度を上昇させるために持続注入が使用されている。長い半減期および少なくとも同様のレベルの機能性を有するCNPペプチドは、CNPに基づく治療戦略に有益であると思われる。
本発明は、NEPおよび/またはNPR−Cに対して親和性が低下し、NEPによる切断および/またはNPR−Cによるクリアランスに対する感受性が減少しているが、野生型CNP22と実質的に同じまたはそれより優れた機能性を有するCNP変異体を提供する。
NEPの天然基質は低分子であり、ナトリウム利尿ペプチド(約2.2から約3.2kDa)は最も高分子の天然基質である。X線結晶解析によれば、NEPの活性部位は、中心腔内部に深く埋もれており、基質分子のサイズは、約3kDa以下に効果的に制限される(Oefnerら、J. Mol. Biol.、296巻:341〜349頁(2000年))。NPR−Bシグナル伝達の研究に基づいて、CNP−17(CNP22の環状ドメインのCys6〜Cys22のみを保有する)およびCNP−53(N末端において31個のアミノ酸延長を有するCNP−22)などのCNP−22の変異体は、なお2.2kDaのwtCNP−22と同様にNPR−Bに結合でき、NPR−Bを活性化できる。したがって、本発明は、CNP22変異体あるいはその変異体のN末端および/またはC末端において天然ポリマー(例えばペプチド)および/または合成ポリマー(例えば、PEG)に接合されたCNP変異体を包含し、これらはNEP耐性の上昇を示すが、NPR−Bシグナル伝達受容体に結合し、活性化する能力を保有している。
一実施形態において、本発明は、一般式:
(x)−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−Lys10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号139)、または
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−Lys10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号140)、
で表されるCNP変異体を包含し、式中、
(x)および(z)は、本明細書に記載のように、個々に独立して天然ポリマー(例えば、少なくとも1個のアミノ酸を含有するペプチド配列)および/または合成ポリマー(例えばPEG)であり、CNP変異体の総質量が、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲であることを特徴とする。一実施形態において、残基Cys6からCys22は、環状部分を形成する。ある実施形態において、(x)および/または(z)は、NPPCまたは非CNPポリペプチド(例えば、ANP、BNP、IgGなど)に由来するアミノ酸延長を含み、この延長は、1から40、1から35、1から31、5から35、5から31または5から15個のアミノ酸を含有する。別の実施形態において、CNP変異体は、CNP22の以下の位置:Gly1、Lys4、Gly5、Cys6、Phe7、Gly8、Leu9、Lys10、Leu11、Ile14、Gly15、Ser16、Met17、Gly19、Leu20およびGly21の1つまたは複数に、別の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣体および/またはペプチド結合イソスターによる1つまたは複数の改変および/または置換を含む。
(x)−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−Lys10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号139)、または
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−Lys10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号140)、
で表されるCNP変異体を包含し、式中、
(x)および(z)は、本明細書に記載のように、個々に独立して天然ポリマー(例えば、少なくとも1個のアミノ酸を含有するペプチド配列)および/または合成ポリマー(例えばPEG)であり、CNP変異体の総質量が、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲であることを特徴とする。一実施形態において、残基Cys6からCys22は、環状部分を形成する。ある実施形態において、(x)および/または(z)は、NPPCまたは非CNPポリペプチド(例えば、ANP、BNP、IgGなど)に由来するアミノ酸延長を含み、この延長は、1から40、1から35、1から31、5から35、5から31または5から15個のアミノ酸を含有する。別の実施形態において、CNP変異体は、CNP22の以下の位置:Gly1、Lys4、Gly5、Cys6、Phe7、Gly8、Leu9、Lys10、Leu11、Ile14、Gly15、Ser16、Met17、Gly19、Leu20およびGly21の1つまたは複数に、別の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣体および/またはペプチド結合イソスターによる1つまたは複数の改変および/または置換を含む。
別の実施形態において、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲であることを特徴とする総質量を有するCNP変異体は、NEP分解に対する耐性を増加させるために設計され、以下の一般式:
(x)−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−(h)10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号141)、または
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(b)4−Gly5−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−(h)10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号6)、で表され、式中、
(x)は、合成ポリマーまたは天然ポリマーの基あるいはそれらの組合せであり、合成ポリマー基の限定されない例はPEG(またはPEO)であり、天然ポリマー基の限定されない例は、1から35個のアミノ酸を含有し、置換および/または欠失を有するNPPCもしくはその変異体に由来するアミノ酸配列、ANP、BNPあるいは他の非CNP(ポリ)ペプチド、例えば血清アルブミン、IgG、ヒスチンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、オステオクリンまたは線維芽細胞増殖因子2(FGF2)である。
(x)−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−(h)10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号141)、または
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(b)4−Gly5−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−(h)10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号6)、で表され、式中、
(x)は、合成ポリマーまたは天然ポリマーの基あるいはそれらの組合せであり、合成ポリマー基の限定されない例はPEG(またはPEO)であり、天然ポリマー基の限定されない例は、1から35個のアミノ酸を含有し、置換および/または欠失を有するNPPCもしくはその変異体に由来するアミノ酸配列、ANP、BNPあるいは他の非CNP(ポリ)ペプチド、例えば血清アルブミン、IgG、ヒスチンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、オステオクリンまたは線維芽細胞増殖因子2(FGF2)である。
(z)は、非存在であってよく、あるいは合成ポリマーまたは天然ポリマーの基あるいはそれらの組合せであってよく、合成ポリマー基の限定されない例はPEGであり、天然ポリマー基の限定されない例は、ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、NPPC、CNP、ANPまたはBNP)または非ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、血清アルブミンまたはIgG)に由来するアミノ酸配列であり、
(b)および(h)は、独立して、上記位置で野生型Lysであってもよく、あるいは保存的アミノ酸置換により置き換えられていてもよく、あるいは天然または非天然のアミノ酸あるいは限定するものではないが、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、GluまたはSerを含む、側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体であってもよい。一実施形態において、(b)はArgである。別の実施形態において、NEP耐性の改善のために、(b)はGlyではない。さらに別の実施形態において、(h)はArgではない。
(b)および(h)は、独立して、上記位置で野生型Lysであってもよく、あるいは保存的アミノ酸置換により置き換えられていてもよく、あるいは天然または非天然のアミノ酸あるいは限定するものではないが、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、GluまたはSerを含む、側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体であってもよい。一実施形態において、(b)はArgである。別の実施形態において、NEP耐性の改善のために、(b)はGlyではない。さらに別の実施形態において、(h)はArgではない。
NPPCまたはその変異体に由来するアミノ酸配列の限定されない例は、
Arg、
Glu-Arg、
Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(配列番号7)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(配列番号8)、
Gly-Ala-Asn-Pro-Arg(配列番号9)、
Gly-Ala-Asn-Gln-Gln(配列番号10)、
Gly-Ala-Asn-Ser-Ser(配列番号11)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Gln、(配列番号12)
Gly-Ala-Asn-Arg-Met、(配列番号13)
Gly-Ala-Asn-Arg-Thr(配列番号14)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Ser(配列番号15)、
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala(配列番号16)、
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg(配列番号17)、
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg(配列番号18)、
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(配列番号19)、
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(配列番号20)、
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(配列番号21)、および
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(配列番号22)を含む。
Arg、
Glu-Arg、
Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(配列番号7)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(配列番号8)、
Gly-Ala-Asn-Pro-Arg(配列番号9)、
Gly-Ala-Asn-Gln-Gln(配列番号10)、
Gly-Ala-Asn-Ser-Ser(配列番号11)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Gln、(配列番号12)
Gly-Ala-Asn-Arg-Met、(配列番号13)
Gly-Ala-Asn-Arg-Thr(配列番号14)、
Gly-Ala-Asn-Arg-Ser(配列番号15)、
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala(配列番号16)、
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg(配列番号17)、
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg(配列番号18)、
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(配列番号19)、
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(配列番号20)、
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(配列番号21)、および
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(配列番号22)を含む。
非CNPポリペプチド、例えばANP、BNP、血清アルブミンおよびIgGなどに由来するアミノ酸配列の限定されない例は、
Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser(配列番号23);
Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(配列番号24);
Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(配列番号25);
Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(配列番号26);
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr(配列番号27);
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(配列番号28);
Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg(配列番号29);
Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr(配列番号30);
Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln(配列番号31);および
Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser(配列番号32)
を含む。
Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser(配列番号23);
Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(配列番号24);
Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(配列番号25);
Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(配列番号26);
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr(配列番号27);
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(配列番号28);
Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg(配列番号29);
Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr(配列番号30);
Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln(配列番号31);および
Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser(配列番号32)
を含む。
ある実施形態において(x)および/または(z)の基を有する任意のCNP変異体の、N末端(x)基および/またはC末端(z)基は、本明細書において記載のように、もしあれば、少数の酸性の天然または非天然アミノ酸(例えば、AspまたはGlu)を含有するアミノ酸配列を独立して含む。別の実施形態において、(x)および/または(z)は、CNP22(pI8.9)のpIと同様のアルカリのpIを維持するために、塩基性の天然または非天然アミノ酸(例えば、Lys、ArgまたはHis)に富んでいる。一実施形態において、CNP変異体のpIは約8から約10.5の範囲であり、CNP変異体が骨成長板の軟骨細胞周辺の細胞外マトリックスを介してより容易に拡散できるように設計される。より狭い範囲の実施形態において、CNP変異体のpIは約8.5から約10.5または約8.5から約10または約9から約10である。
まだ別の実施形態において、(x)および/または(z)は極性の天然または非天然アミノ酸に富んでおり、水溶解度を増加するために設計される。さらに別の実施形態において、(x)および/または(z)は、もしあれば、少数の疎水性の天然または非天然アミノ酸(例えば、Ala、Val、Leu、IleまたはMet)を含有する。
さらなる実施形態において、CNP変異体のN末端は少なくとも1個のグリシン残基で終結し、血清半減期を増加するために設計される。関連する実施形態において、ピログルタミン酸の形成を防ぐために、CNP変異体のN末端は、グルタミン酸で終結しない場合、グリシン残基で終結する。一実施形態において、(x)基はN末端が少なくとも1個のグリシン残基で終結するアミノ酸の延長を含有する。別の実施形態において、(x)および/または(z)は、2つの隣接する塩基性の天然または非天然アミノ酸(例えば、Lys−LysまたはArg−Arg)を含有せず、プロテアーゼのフューリンによる切断に対する感受性が減少するように設計される。ある実施形態において、(x)は、CNP22のGly1に対応する位置の直前に2つの隣接する塩基性アミノ酸を含有しない。
さらに別の実施形態において、CNP変異体の(x)基および/または(z)基は、NPPCに由来するアミノ酸配列(例えば、CNP53由来)を含む。ある実施形態において、(x)は、ANPまたはBNPのN末端テールに由来するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、(z)は、ANPまたはBNPのC末端テールに由来するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、(x)および/または(z)は、非ナトリウム利尿ポリペプチド、例えば、IgG、ヒト血清アルブミン(HSA)、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、FGF−2および骨ターゲティングタンパク質、(例えば、オステオクリン、オステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質など)に由来するアミノ酸配列を含む。
CNP22またはその変異体が、N末端(x)基および/またはC末端(z)基を有する、本明細書に記載の任意の実施形態において、(x)および/または(z)は、独立して、骨形成タンパク質(BMP)の機能的ドメインに由来するアミノ酸配列を含有することができる。BMPの機能的ドメインに由来するN末端および/またはC末端のアミノ酸延長は、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲であることを特徴とするCNP変異体の総質量を増加することによって、NEP耐性およびしたがってCNP変異体の血清半減期を増加させることができる。さらに、特定のBMPは、骨および軟骨の形成を誘導する成長因子およびサイトカインであるので、BMPの機能的ドメインに由来する断片は、CNP22またはその変異体の環状ドメインによりNPR−Bのグアニル酸シクラーゼ機能の活性化とは異なる機序により、軟骨細胞、軟骨または骨の成長を促進できる。骨の形成および発達、軟骨の形成および発達、および/または骨芽細胞分化を促進するBMPの限定されない例は、BMP1、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7およびBMP8aを含む。ある実施形態において、CNP22またはその変異体のN末端および/またはC末端は、BMP1、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7およびBMP8aのC末端部分の最後の140個のアミノ酸に由来するアミノ酸配列と独立して接合する。
一実施形態において、CNP変異体は、CNP22またはCNP17のN末端および/またはC末端におけるアミノ酸延長は、限定するものではないが、
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP−53)(配列番号4);
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP−37、類似体BL(配列番号60));
AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CA)(配列番号61);
AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CB)(配列番号62);
DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CC)(配列番号63);
RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号40);
ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号38);
GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号64);
GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号65);
GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号66);
GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号67);
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号144);および
SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(類似体CD)(BNPに由来するN末端およびC末端のテールを有するCNP17)(配列番号68)
を含む。
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP−53)(配列番号4);
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP−37、類似体BL(配列番号60));
AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CA)(配列番号61);
AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CB)(配列番号62);
DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CC)(配列番号63);
RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号40);
ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号38);
GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号64);
GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号65);
GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号66);
GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号67);
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(配列番号144);および
SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(類似体CD)(BNPに由来するN末端およびC末端のテールを有するCNP17)(配列番号68)
を含む。
別の実施形態において、CNP変異体は、CNP22の4位においてK4R置換を有する。CNP(K4R)変異体の限定されない例は、
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP27(Arg4))(類似体AY)(配列番号36);
GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP27(Pro4))(類似体CI)(配列番号37);
RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体AZ)(配列番号41);
ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体BA)(配列番号39);
GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CH)(配列番号69);および
GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CG)(配列番号70)
を含む。
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP27(Arg4))(類似体AY)(配列番号36);
GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP27(Pro4))(類似体CI)(配列番号37);
RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体AZ)(配列番号41);
ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体BA)(配列番号39);
GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CH)(配列番号69);および
GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CG)(配列番号70)
を含む。
別の実施形態において、CNP変異体は、CNP22およびN末端ペプチド断片を含むキメラであり、限定するものではないが、
GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CQ)(ヒスチジンリッチ糖タンパク質(HRGP)断片−CNP22キメラ)(配列番号76);
GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CR)(HRGP断片−CNP22キメラ)(配列番号77);
GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CX)(HRGP断片−CNP22キメラ)(配列番号78);
GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CF)(IgG1(Fc)断片−CNP22キメラ)(配列番号79);
GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CY)(ヒト血清アルブミン(HSA)断片−CNP22キメラ)(配列番号80);
GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CE)(HSA断片−CNP22キメラ)(配列番号81);
FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CZ)(オステオクリン「NPR C阻害剤」断片−CNP22キメラ)(配列番号82);および
GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体DA)(FGF2「ヘパリン結合ドメイン」断片−CNP22キメラ)(配列番号83)
を含む。
GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CQ)(ヒスチジンリッチ糖タンパク質(HRGP)断片−CNP22キメラ)(配列番号76);
GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CR)(HRGP断片−CNP22キメラ)(配列番号77);
GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CX)(HRGP断片−CNP22キメラ)(配列番号78);
GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CF)(IgG1(Fc)断片−CNP22キメラ)(配列番号79);
GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CY)(ヒト血清アルブミン(HSA)断片−CNP22キメラ)(配列番号80);
GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CE)(HSA断片−CNP22キメラ)(配列番号81);
FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CZ)(オステオクリン「NPR C阻害剤」断片−CNP22キメラ)(配列番号82);および
GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体DA)(FGF2「ヘパリン結合ドメイン」断片−CNP22キメラ)(配列番号83)
を含む。
まだ別の実施形態において、CNP変異体は、N末端ペプチド断片およびアルギニンがCNP22のLys4と置換されたCNP22(「CNP22(K4R)」)を含むキメラであり、限定するものではないが、
GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CK)(IgG1(Fc)断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号84);
GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CL)(HSA断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号85);
GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CM)(フィブロネクチン断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号86);
GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CN)(フィブリノーゲン断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号87);
GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CO)(フィブリノーゲン断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号88);および
GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CP)(亜鉛フィンガー断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号89)
を含む。
GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CK)(IgG1(Fc)断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号84);
GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CL)(HSA断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号85);
GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CM)(フィブロネクチン断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号86);
GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CN)(フィブリノーゲン断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号87);
GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CO)(フィブリノーゲン断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号88);および
GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CP)(亜鉛フィンガー断片−CNP22(K4R)キメラ)(配列番号89)
を含む。
IgGおよびCNP22またはその変異体を含むキメラは、とりわけ、NEP分解に対する耐性の増加および血清アルブミンに対する結合の減少のために設計される。HSAの表面断片を含むCNPキメラは、とりわけ、免疫原性の減少および血清アルブミンに対する結合の減少のために設計される。陽イオン性、ヒスチジンリッチ、非リジン、非アルギニンである配列をN末端に含有するHRGP−CNP22およびHRGP−CNP22(K4R)のキメラは、とりわけ、プロテアーゼに対する安定性の増加のために設計される。オステオクリン断片を含有するキメラは、プロテアーゼ(例えば、フューリン)による切断に対して、この断片がクリアランス受容体のNPR−Cを阻害すると思われる骨成長板において、オステオクリン断片を放出するために設計される。FGF2ヘパリン結合断片を含むキメラに関して、断片に結合するヘパリンは、キメラを分解から保護するために設計され、その結果、より長い血清半減期を提供する。フィブロネクチン、フィブリノーゲンまたは亜鉛フィンガー断片を含有するキメラは、他の特徴に加えて血清アルブミンに対する結合を減少させるために設計される。
理論に縛られることを意図するものではないが、NEP分解に対する耐性が増加し、wtCNP22と比較して同様または改善された機能性(例えば、NPR−Bに対する結合およびcGMPシグナル伝達の刺激)を有する、分子量約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaのCNP変異体は、血清アルブミンなどの血漿タンパク質と堅く結合しない場合、より有効であり得る。血漿タンパク質(例えば、血清アルブミン)と堅く結合しないCNP変異体は、軟骨を介した骨成長板の軟骨細胞に至る拡散およびcGMPシグナル伝達のためのNPR−Bへの結合および活性化においてより有効であり得る。一実施形態において、血漿タンパク質(例えば、血清アルブミン)への結合の減少のために設計されたCNP変異体は、CNP22またはその変異体およびIgG由来のペプチド断片を含むキメラである。別の実施形態において、血漿タンパク質との結合の減少のために設計されたCNP変異体は、CNP22またはCNP22(K4R)およびポリペプチド(例えば、IgG、HSA、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチドなど)由来の断片を含むキメラである。まだ別の実施形態において、血漿タンパク質との結合の減少のために設計されたCNP変異体は、親水性または水溶性のポリマーに接合されたCNP22またはその変異体を含む。一実施形態において、親水性または水溶性のポリマーはPEG(またはPEO)である。別の実施形態において、親水性または水溶性のポリマー(例えば、PEG)は、生理的条件下でポリマーに負の電荷を付与する、1つまたは複数の官能基、例えばカルボキシル基、硫酸基またはリン酸基あるいはそれらの組合せにより官能化される。
さらなる実施形態において、CNP変異体はCNP37の誘導体であり、これは、QEHPNARKYKGANKK−CNP22(配列番号60)である。CNP37変異体は、CNP37の37位のいずれか1つまたは複数において、アミノ酸の付加、欠失および/または天然または非天然アミノ酸またはペプチド模倣体(例えば、ペプチド結合イソスター)との置換を含有し得る。CNP37において実施され得る置換の限定されない例は、CNP22のナンバリングに基づいて、K4R、G5S、G5R、G8S、K10R、G15S、S16Q、M17N、G19Rおよびそれらの組合せを含む。ある実施形態において、CNP37誘導体は、メチオニンの硫黄原子の酸化を避けるために一部設計された、Met17と、天然(例えば、アスパラギン)または非天然アミノ酸あるいはペプチド模倣体との置換を含有する。別の実施形態において、CNP37変異体は、アルブミン結合を減少させるため一部に設計された、(CNP37のN末端からのナンバリングに基づいて)Lys8、Lys10、Lysl4および/またはLys15と、非塩基性の天然または非天然アミノ酸あるいはペプチド模倣体との置換を含有する。
さらにまたは代替的には、アミノ酸の付加、欠失、および/または置換のために、CNP37誘導体は、N末端、C末端および/または内部部位において、本明細書に記載の任意の部分に接合でき、これらは限定するものではないが、骨または軟骨ターゲティング部分(例えば、骨ターゲティングペプチドドメイン)、腎クリアランスを減少させる部分(例えば、負に荷電したPEG部分)、親水性ポリマー(例えば、PEG)、1つまたは複数のアミノ酸を含むアミノ酸配列(例えば、オステオクリン「NPR−C阻害因子」断片)、糖(例えば、骨成長板の細胞表面上の受容体によって認識される糖)、疎水性の酸(例えば、C5〜C12のカルボン酸および天然脂肪酸)およびそれらの組合せを含む。
一実施形態において、CNP変異体は、フューリンプロテアーゼに対するin vivoの耐性を改善するためにフューリン切断部位(下線)に突然変異/置換を有する、および/または血漿安定性の改善およびピログルタミン酸形成の阻止のためにN末端にグリシン(下線)を含有する、改変CNP37ペプチドである。このようなCNP37変異体は、限定するものではないが、
GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CS)(配列番号71);GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CT)(配列番号72);GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CU)(配列番号73);GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CW)(配列番号74);および
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体DB)(配列番号75)
を含む。
GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CS)(配列番号71);GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CT)(配列番号72);GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CU)(配列番号73);GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体CW)(配列番号74);および
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似体DB)(配列番号75)
を含む。
別の実施形態において、CNP変異体は、N末端および/またはC末端において細胞膜または細胞障壁を越えた変異体の転座を容易にする部分に接合したCNP22またはその変異体を含む。一実施形態において、CNP変異体はN末端および/またはC末端において、活性ペプチド輸送体経由を含む、細胞膜または細胞障壁を越えた変異体の輸送を容易にするペプチド配列に接合する。
さらなる実施形態において、CNP22またはその変異体のN末端および/またはC末端は、化学的部分、例えば、天然および/または合成のポリマーなどに接合し、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲であることを特徴とする改変CNPペプチドの総質量を増加させる。一実施形態において化学的部分は、生体適合性のある、親水性または水溶性の天然ポリマー(例えば、ペプチド、糖)または合成ポリマー(例えばPEG(またはPEO))である。
特定の実施形態において、CNP22またはその変異体のN末端および/またはC末端はPEG(またはPEO)ポリマーに接合し、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲であることを特徴とする総質量をもたらす。CNP22またはその変異体のPEG化は、とりわけ、免疫原性の低下および腎クリアランスの減少による半減期の改善およびプロテアーゼ耐性の増加のために設計される。PEG部分は、限定するものではないが、CNP−17(CNP22のCys6〜Cys22の環状部分)、CNP37およびN末端および/またはC末端にアミノ酸延長、アミノ酸置換および/またはアミノ酸欠失を有するCNP17、CNP22またはCNP37の変異体を含む、CNP22または本明細書に記載の任意の変異体のN末端および/またはC末端に結合できる。ある実施形態において、CNP17、CNP22またはCNP37あるいはそれらの変異体のLys4および/またはLys10残基は、天然または非天然アミノ酸(例えば、Arg、Gly、Ser、Gln、GluまたはCit)または側鎖に反応性第一級アミンを含有しないペプチド模倣体により置換され、これらのリジン残基のPEG化の可能性はいずれも排除される。一実施形態において、CNPペプチドのLys4および/またはLys10残基は、Argにより置換される。別の実施形態において、Lys10残基は、Argにより置換されない。
さらなる実施形態において、N末端にPEG(またはPEO)部分およびアミノ酸延長を有するCNP変異体(CNP22およびその変異体を含む)は、CNP22のGly1に対応する位置の直前にアルギニンを含有する。このようなPEG化CNP変異体は、NEP分解に対する耐性の増加、血清アルブミンに対する結合の減少およびCNPの機能的活性(例えば、cGMPシグナル伝達の活性化)の増強のために設計される。このようなPEG化CNP変異体の限定されない例は、PEO24−CNP27(Arg4)、PEO12−CNP27(Arg4)、PEO24−GANRR−CNP22、PEO12−GANRR−CNP22、PEO24−CNP27(Pro4)、PEO12−CNP27(Pro4)、PEO24−GANPR−CNP22、PEO12−GANPR−CNP22、PEO24−GANQQ−CNP22、PEO12−GANQQ−CNP22、PEO24−ER−CNP22(K4R)、PEO12−ER−CNP22(K4R)、PEO24−ER−CNP22、PEO12−ER−CNP22、PEO24−R−CNP22(K4R)、PEO12−R−CNP22(K4R)、PEO24−R−CNP22およびPEO12−R−CNP22,を含み、PEO24は、単分散の1.2kDaのPEGポリマーであり、PEO12は単分散の0.6kDaのPEGポリマーである。一実施形態において、PEG(またはPEO)ポリマーは、CNP変異体のN末端に接合する。
本発明は、型(例えば、ホモポリマーまたはコポリマー;ランダムコポリマー、交互コポリマーまたはブロックコポリマー;線状または分枝;単分散または多分散)、結合(例えば、加水分解性またはアミド、イミン、アミナール(aminal)、アルキレンまたはエステル結合などの安定性の結合)、結合部位(例えば、N末端および/またはC末端、(CNP22の残基6〜22に対応する)CNPの環状領域中の任意の残基ではないことが好ましい)および長さ(例えば、約0.2、0.4または0.6kDaから約2、3、4または5kDa)を変化させることができる親水性または水溶性ポリマー(例えば、PEG)の使用を企図する。親水性または水溶性ポリマーは、N−ヒドロキシ酸スクシンイミド(NHS)あるいはアルデヒドに基づく化学物質または他の化学物質を用いてCNPペプチドに接合でき、このことは当分野において公知である。このようなCNP変異体は、例えばwtCNP22(2.2kDa)、wtCNP22の環状領域(残基6〜22)のみを保有するCNP17、CNP22またはCNP17のN末端および/またはC末端にアミノ酸延長を有するCNP変異体あるいはアミノ酸の置換、付加および/または欠失を有する変異体、例えば、CNP27(Arg4)、CNP27(Pro4)、R−CNP22、R−CNP22(K4R)、ER−CNP22およびER−CNP22(K4R)などを使用して作製できる。ある実施形態において、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲であることを特徴とする総質量を有するPEG−CNP変異体は、NHSまたはアルデヒドに基づく化学物質を介してN末端および/またはC末端に接合する、単分散の線状PEG(またはPEO)部分あるいはNHSに基づく化学物質を介してN末端および/またはC末端に接合する、2アームまたは3アームの分枝PEG部分を含有する。本発明は、腎クリアランスの減少のために設計された、負に荷電したPEG−CNP変異体もまた包含し、限定するものではないが、カルボキシ化、硫酸化およびリン酸化化合物を含む(Caliceti、Adv. Drug Deliv. Rev.、55巻:1261〜77頁(2003年); Perlman, J.Clin. Endo. Metab.、88巻:3227〜35頁(2003年);Pitkin、Antimicrob. Ag. Chemo.、29巻:440〜444頁(1986年);Vehaskari,Kidney Int'l、22巻:127〜135頁(1982年))。一実施形態において、PEG(またはPEO)部分は、カルボキシル基、硫酸基および/またはリン酸基を含有する。
ある実施形態において、本発明は、式(CH2CH2O)nのPEG(またはPEO)に、NHSまたはアルデヒドに基づく化学物質を介して接合するCNP22またはその変異体を包含し、式中、nは約6から約100までの整数であり、PEGポリマーは、約0.3kDaから約5kDaまでである。別の実施形態において、nは、約12から約50までの整数であり、PEGポリマーは約0.6kDaから約2.5kDaまでである。まだ別の実施形態において、nは、約12から約24までであり、PEGポリマーは約0.6kDaから約1.2kDaまでである。さらに別の実施形態において、PEGポリマーの末端ヒドロキシル基は、非反応性基により覆われている。特定の実施形態において、末端を覆っている基はアルキル基、例えばメチルなどの低分子アルキル基である。
さらなる実施形態において、本発明は、1つまたは複数のペプチド結合または中性エンドペプチダーゼ(NEP)を含むペプチダーゼによる切断に対する感受性が減少したペプチド結合イソスターを有するCNP変異体を提供する。NEPは、高分子疎水性残基のアミノ末端において、基質のペプチド結合を切断する、膜結合亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。したがって、非天然のペプチドまたは非ペプチド結合に対する、NEPに関する切断部位におけるペプチド結合の改変は、NEP切断の有効性をなくす、または減少させることができる。
ANPおよびCNPに関しては、NEPによる切断が、まず環状領域内のCys6−Phe7結合に発生し、その後構造の残りの他のいたるところにおいて発生することが報告されている。BNPに関しては、切断はまずペプチドのN末端において発生し、その後環状構造内において発生することが報告されている。CNP上の第1のNEP切断部位は、Cys6−Phe7結合であることが報告されているが、wtCNP22がin vitroで2.5分NEP消化に曝露された場合、すべての候補部位は予想に反して加水分解され、Cys6−Phe7およびGly8−Leu9のペプチド結合は、実施例2に記載のように、若干最も不安定であった。
NEPの基質特異性は、2つの基質結合サブ部位、S1’およびS2’により主に決定される(Oefner ら、J. Mol. Biol. 296巻:341〜349頁(2000年))。S1’部位は、N末端ペプチド結合が加水分解される高分子の疎水性P1’残基(例えば、Phe、Leu、IleおよびMet)を受容する。S2’部位は、一般的により低分子の残基が好ましく、P2’(例えば、GlyまたはSer)と呼ばれる。CNPの場合、Phe7は、NEPのS1’部位に関して好ましいP1’残基であるが、一方Gly8は、S2’部位に関して好ましいP2’残基であることが報告されている。これらの2つのサブ部位は、特定の総サイズの側鎖とだけ一緒になって適合するので、CNPのP1’−P2’残基の総サイズの増加はいずれもNEP結合を崩壊させ得る可能性がある。例えば、P1’ Phe7芳香族環の3位における塩素原子の付加(すなわち、3−Cl−Phe7)は、CNPと、NEP切断部位、例えばS1’サブ部位との間の相互作用を改変(例えば、安定性を損なう)し得る可能性がある。3級ブチル基の、より低分子のP2’残基のGly8への付加(すなわちtBu−Gly8)は、CNPと、S2’サブ部位との相互作用を崩壊し得る可能性がある。
したがって、一実施形態において、本発明のCNP変異体は、活性部位において基質認識に干渉し、NEP切断に対する感受性を減少させるために、Phe7−Gly8などのサイズが大きくなったP1’−P2’残基を有するCNPを含む。天然アミノ酸、非天然アミノ酸および/またはペプチド模倣体部分は、限定するものではないが、Phe7、Leu9、Leu11、Ile14、Met17およびLeu20を含む、1つまたは複数の大きなP1’疎水性残基および/または限定するものではないが、Cys6、Gly8、Gly15、Ser16およびGly19を含む、1つまたは複数のより小さなP2’残基に置換される。
本発明は、基質認識および/またはNEPよる切断に関連する少なくとも1つの残基に、少なくとも1つの修飾アミノ酸および/または少なくとも1つの修飾ペプチド結合を含むCNP変異体を包含し、修飾アミノ酸および修飾ペプチド結合は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣体および/またはペプチド結合イソスターであり得る。一実施形態において、Cys6とPhe7との間のCNP上のNEP切断部位は改変される。関連する実施形態において、Cys6とPhe7との間のペプチド結合(−C(=O)−NH−)は、以下のペプチド結合イソスター:
−CH2−NH−、
−C(=O)−N(R)−、式中、アミド基は以下の任意のR基によりアルキル化される:メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチル、
−C(=O)−NH−CH2−、
−CH2−S−、
−CH2−S(O)n−、式中nは1または2である、
−CH2−CH2−、
−CH=CH−、
−C(=O)−CH2−、
−CH(CN)−NH−、
−CH(OH)−CH2−、
−O−C(=O)−NH−または
−NHC(=O)NH−
の1つと置き換えられる。
−CH2−NH−、
−C(=O)−N(R)−、式中、アミド基は以下の任意のR基によりアルキル化される:メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチル、
−C(=O)−NH−CH2−、
−CH2−S−、
−CH2−S(O)n−、式中nは1または2である、
−CH2−CH2−、
−CH=CH−、
−C(=O)−CH2−、
−CH(CN)−NH−、
−CH(OH)−CH2−、
−O−C(=O)−NH−または
−NHC(=O)NH−
の1つと置き換えられる。
別の実施形態において、CNP変異体は、式:
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5−(b)6−(c)7−(d)8−Leu9−Lys10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号90)で表され、
式中、
(x)および(z)は独立して、非存在であってもよく、あるいは合成骨ターゲティング化合物、例えばビスホスホネート;骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、ポリAspおよびポリGlu;骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するアミノ酸配列、例えばオステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質など(Wangら、Adv. Drug Delivery Rev.、57巻:1049〜76頁(2005年));腎クリアランスを減少させるポリマー分子および非ポリマー分子、例えば、負に荷電したPEGなど;ならびに天然ポリマー(例えば、アミノ酸、脂肪酸および/または糖を含有するもの)およびCNP変異体の総質量を、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲に増加させることによってNEP分解に対するCNP変異体の耐性を増加させる合成ポリマー(例えば、PEG);からなる群から選択されてもよく;
(b)および(c)は、野生型Cys6およびPhe7、別の天然アミノ酸または非天然アミノ酸であってもよく、あるいはNEP切断に対する耐性を増加させるために本明細書に記載のペプチド結合イソスターを含有してもよく;
(d)は、野生型Gly8であってもよく、あるいはNEPへの結合を減少させるためにより高分子の天然または非天然(例えば、t−Bu−Gly)アミノ酸またはペプチド模倣体であってもよい。
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5−(b)6−(c)7−(d)8−Leu9−Lys10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号90)で表され、
式中、
(x)および(z)は独立して、非存在であってもよく、あるいは合成骨ターゲティング化合物、例えばビスホスホネート;骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、ポリAspおよびポリGlu;骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するアミノ酸配列、例えばオステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質など(Wangら、Adv. Drug Delivery Rev.、57巻:1049〜76頁(2005年));腎クリアランスを減少させるポリマー分子および非ポリマー分子、例えば、負に荷電したPEGなど;ならびに天然ポリマー(例えば、アミノ酸、脂肪酸および/または糖を含有するもの)およびCNP変異体の総質量を、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲に増加させることによってNEP分解に対するCNP変異体の耐性を増加させる合成ポリマー(例えば、PEG);からなる群から選択されてもよく;
(b)および(c)は、野生型Cys6およびPhe7、別の天然アミノ酸または非天然アミノ酸であってもよく、あるいはNEP切断に対する耐性を増加させるために本明細書に記載のペプチド結合イソスターを含有してもよく;
(d)は、野生型Gly8であってもよく、あるいはNEPへの結合を減少させるためにより高分子の天然または非天然(例えば、t−Bu−Gly)アミノ酸またはペプチド模倣体であってもよい。
一実施形態において、このようなCNP変異体は、(b)、(c)および/または(d)に少なくとも1つの修飾アミノ酸を含有する。
Gly8−Leu9、Lys10−Leu11、Arg13−Ile14、Ser16−Met17およびGly19−Leu20の各結合を含む、CNP内の他のペプチド結合は、CNP22またはその変異体がNEP耐性ペプチド結合またはペプチド結合イソスターをCys6−Phe7に有していたとしても、切断され得る。したがって、本発明は、ペプチド結合イソスターを、Cys6−Phe7に加えて1つまたは複数の他のNEP切断部位に有するCNP変異体を包含し、ペプチド結合イソスターは、本明細書に記載のものを含む。
別の実施形態において、本発明は、限定するものではないが、ホモシステイン、ペニシラミン、2−メルカプトプロピオン酸および3−メルカプトプロピオン酸を含む、システイン類似体を、Cys6および/またはCys22に有するCNP変異体を包含する。ある実施形態において、このようなCNP変異体は、野生型Cys6または類似体とCys22または類似体との間のジスルフィド結合により形成された環状ドメインを有する。
まだ別の実施形態において、CNP22またはその変異体の1つまたはすべての残基までの複数の残基は、D−アミノ酸により置換される。L−アミノ酸のD−アミノ酸による置換は、側鎖をそのもともとの位置から本質的に約120°動かし、その結果、CNPペプチドとNEPとの結合を崩壊させる可能性がある。具体的な実施形態において、Phe7のL−Pheは、そのD−光学異性体のD−Pheで置換される。
さらに別の実施形態において、βアミノ酸、例えば、3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸(または2−フェニル−β−アラニン)により、野生型αアミノ酸のPhe7が置き換えられる。βアミノ酸の使用は、1つのメチレン単位によりペプチド骨格の長さを有効に延長する。プロテアーゼ耐性は、基質立体配座の変化またはアミノ酸側鎖間の距離の増加によりもたらされ得る。
非天然α−アミノ酸、β−アミノ酸またはペプチド結合イソスターを有するCNP22の変異体の限定されない例は、
GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC(類似体A)(配列番号56)、
GLSKGC-(N-Me-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(類似体B)(配列番号57)、
GLSKGC-(D-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(類似体E)(配列番号136)、
GLSKGCF-(tBu-Gly)-LKLDRIGSMSGLGC(類似体F)(配列番号58)、
GLSKGC-(3-Cl-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(類似体G)(配列番号137)、および
GLSKGC-[NHCH2CH(Ph)CO]-GLKLDRIGSMSGLGC(類似体H、3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸を使用して形成される)(配列番号59)を含む。
GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC(類似体A)(配列番号56)、
GLSKGC-(N-Me-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(類似体B)(配列番号57)、
GLSKGC-(D-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(類似体E)(配列番号136)、
GLSKGCF-(tBu-Gly)-LKLDRIGSMSGLGC(類似体F)(配列番号58)、
GLSKGC-(3-Cl-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(類似体G)(配列番号137)、および
GLSKGC-[NHCH2CH(Ph)CO]-GLKLDRIGSMSGLGC(類似体H、3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸を使用して形成される)(配列番号59)を含む。
さらなる実施形態において、CNP変異体は、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲であることを特徴とする総質量を有し、NEP分解に対する耐性を増加するために設計され、式:
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(a)4−Gly5−(b)6−(c)7−(d)8−(e)9−(f)10−(g)11−Asp12−Arg13−(h)14−Gly15−Ser16−(i)17−Ser18−Gly19−(j)20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号46)で表され、式中、
(x)および(z)は独立して、非存在であってもよく、あるいは合成骨ターゲティング化合物、例えばビスホスホネート;骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、ポリAspおよびポリGluなど;骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するアミノ酸配列、例えばオステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質など;腎クリアランスを減少させるポリマー部分および非ポリマー部分、例えば、負に荷電したPEGなど;アミノ酸、疎水性酸および/または糖を含有するポリマー;ならびに合成親水性ポリマー、例えば、PEGなど;からなる群から選択されてもよく;
(a)は、上記位置において野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換または天然もしくは非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体によって置き換えられてもよく、限定するものではないが、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerまたはGluを含み、ここで一実施形態において、(a)はArgであり;
(b)は、CysおよびCys6とPhe7との間のペプチド結合イソスター、例えば、Cys−CH2−NHからなる群から選択され;
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;N−アルキル基が、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルであるPheのN−アルキル化誘導体;ならびにPhe類似体のベンゼン環の1つもしくは複数のオルト、メタおよび/またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝C1〜6アルキル、線状もしくは分枝C1〜6アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−C1〜6アルキル、C3〜10シクロアルキル、ヘテロシクリル、C6〜14アリールおよびヘテロアリール(限定するものではないが、例は、チロシン、3−クロロフェニルアラニン、2,3−クロロフェニルアラニン、3−クロロ−5−フルオロ−フェニルアラニン、2−クロロ−6−フルオロ−3−メチル−フェニルアラニンを含む)からなる群から選択される1つもしくは複数の置換基により置換されているか、あるいはPhe類似体のベンゼン環が、別のアリール基(限定されない例は、1−および2−ナフチルアラニンを含む)またはヘテロアリール基(限定されない例は、ピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンを含む)により置き換えられ得るPhe類似体;からなる群から選択され、
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly)、Thr、Ser、ValおよびAsnからなる群から選択され;
(e)は、Leu、Ser、Thrおよび例えばN−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され;
(f)は、上記位置において野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換または天然もしくは非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体によって置き換えられてもよく、限定するものではないが、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerまたはGluを含み、一実施形態において、(f)はArgではない;
(g)は、Leuおよび例えばN−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され;
(h)は、Ile、tBu−GlyおよびN−Me−Ileなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され;
(i)は、Met、Val、Asn、β−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)および2−アミノイソ酪酸(Aib)からなる群から選択され;
(j)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tert−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Ser、Thr、Argおよび例えばN−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(a)4−Gly5−(b)6−(c)7−(d)8−(e)9−(f)10−(g)11−Asp12−Arg13−(h)14−Gly15−Ser16−(i)17−Ser18−Gly19−(j)20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号46)で表され、式中、
(x)および(z)は独立して、非存在であってもよく、あるいは合成骨ターゲティング化合物、例えばビスホスホネート;骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、ポリAspおよびポリGluなど;骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するアミノ酸配列、例えばオステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質など;腎クリアランスを減少させるポリマー部分および非ポリマー部分、例えば、負に荷電したPEGなど;アミノ酸、疎水性酸および/または糖を含有するポリマー;ならびに合成親水性ポリマー、例えば、PEGなど;からなる群から選択されてもよく;
(a)は、上記位置において野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換または天然もしくは非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体によって置き換えられてもよく、限定するものではないが、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerまたはGluを含み、ここで一実施形態において、(a)はArgであり;
(b)は、CysおよびCys6とPhe7との間のペプチド結合イソスター、例えば、Cys−CH2−NHからなる群から選択され;
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;N−アルキル基が、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルであるPheのN−アルキル化誘導体;ならびにPhe類似体のベンゼン環の1つもしくは複数のオルト、メタおよび/またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝C1〜6アルキル、線状もしくは分枝C1〜6アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−C1〜6アルキル、C3〜10シクロアルキル、ヘテロシクリル、C6〜14アリールおよびヘテロアリール(限定するものではないが、例は、チロシン、3−クロロフェニルアラニン、2,3−クロロフェニルアラニン、3−クロロ−5−フルオロ−フェニルアラニン、2−クロロ−6−フルオロ−3−メチル−フェニルアラニンを含む)からなる群から選択される1つもしくは複数の置換基により置換されているか、あるいはPhe類似体のベンゼン環が、別のアリール基(限定されない例は、1−および2−ナフチルアラニンを含む)またはヘテロアリール基(限定されない例は、ピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンを含む)により置き換えられ得るPhe類似体;からなる群から選択され、
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly)、Thr、Ser、ValおよびAsnからなる群から選択され;
(e)は、Leu、Ser、Thrおよび例えばN−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され;
(f)は、上記位置において野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換または天然もしくは非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体によって置き換えられてもよく、限定するものではないが、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerまたはGluを含み、一実施形態において、(f)はArgではない;
(g)は、Leuおよび例えばN−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され;
(h)は、Ile、tBu−GlyおよびN−Me−Ileなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され;
(i)は、Met、Val、Asn、β−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)および2−アミノイソ酪酸(Aib)からなる群から選択され;
(j)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tert−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Ser、Thr、Argおよび例えばN−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
別の実施形態において、CNP変異体は、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲であることを特徴とする総質量を有し、NEP切断に対する耐性を増加するために設計され、式:
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(a)4−Gly5−(b)6−(c)7−(d)8−(e)9−(f)10−(g)11−Asp12−Arg13−(h)14−(i)15−Ser16−(j)17−Ser18−Gly19−(k)20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号143)で表され、式中、
(x)および(z)は独立して、非存在であってもよく、あるいは合成骨ターゲティング化合物、例えばビスホスホネートなど;骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、ポリAspおよびポリGluなど;骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するアミノ酸配列およびそれらの誘導体、例えばオステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質などの融合タンパク質またはペプチド配列;限定するものではないが、親水性または水溶性ポリマー例えば、荷電PEG分子などを含む、腎クリアランスを減少させる部分、ならびに、例えばPEG、アミノ酸、糖および/または疎水性の酸を含む部分;からなる群から選択されてもよく;
(a)は、上記位置において野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換または天然もしくは非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体によって置き換えられてもよく、限定するものではないが、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerまたはGluを含み、一実施形態において、(a)はArgであり;
(b)は、CysおよびCys6とPhe7との間のペプチド結合イソスター、例えば、Cys−CH2−NHからなる群から選択され;
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;N−アルキル基が、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルであるPheのN−アルキル化誘導体、;ならびにPhe類似体のベンゼン環の1つもしくは複数のオルト、メタおよび/またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝C1〜6アルキル、線状もしくは分枝C1〜6アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−C1〜6アルキル、C3〜10シクロアルキル、C6〜14アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリール(限定するものではないが、例は、チロシン、3−クロロフェニルアラニン、2,3−クロロフェニルアラニン、3−クロロ−5−フルオロ−フェニルアラニン、2−クロロ−6−フルオロ−3−メチル−フェニルアラニンを含む)からなる群から選択される1つもしくは複数の置換基により置換されているか、あるいはPhe類似体のベンゼン環が、別のアリール基(限定されない例は、1−および2−ナフチルアラニンを含む)またはヘテロアリール基(限定されない例は、ピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンを含む)により置き換えられ得るPhe類似体;からなる群から選択され、;
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly、Thr、Ser、ValおよびAsnからなる群から選択され;
(e)は、Leu、Ser、Thrおよび例えばN−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され;
(f)は、Lys、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、GlnおよびSerからなる群から選択され;
(g)は、Leu、Asnおよび例えばN−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され;
(h)は、Ile、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly)、Asnおよび例えばN−Me−Ileなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され;
(i)は、Gly、Arg、SerおよびAsnからなる群から選択され;
(j)は、Met、Val、Asn、β−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)および2−アミノ−イソ酪酸(Aib)からなる群から選択され;
(k)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tert−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Arg、Thr、Serおよび例えばN−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(a)4−Gly5−(b)6−(c)7−(d)8−(e)9−(f)10−(g)11−Asp12−Arg13−(h)14−(i)15−Ser16−(j)17−Ser18−Gly19−(k)20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号143)で表され、式中、
(x)および(z)は独立して、非存在であってもよく、あるいは合成骨ターゲティング化合物、例えばビスホスホネートなど;骨または軟骨ターゲティングに有用なアミノ酸配列、例えば、ポリAspおよびポリGluなど;骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するアミノ酸配列およびそれらの誘導体、例えばオステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質などの融合タンパク質またはペプチド配列;限定するものではないが、親水性または水溶性ポリマー例えば、荷電PEG分子などを含む、腎クリアランスを減少させる部分、ならびに、例えばPEG、アミノ酸、糖および/または疎水性の酸を含む部分;からなる群から選択されてもよく;
(a)は、上記位置において野生型Lysであってよく、あるいは保存的アミノ酸置換または天然もしくは非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミンを有さないペプチド模倣体によって置き換えられてもよく、限定するものではないが、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerまたはGluを含み、一実施形態において、(a)はArgであり;
(b)は、CysおよびCys6とPhe7との間のペプチド結合イソスター、例えば、Cys−CH2−NHからなる群から選択され;
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;N−アルキル基が、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルであるPheのN−アルキル化誘導体、;ならびにPhe類似体のベンゼン環の1つもしくは複数のオルト、メタおよび/またはパラ位が、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝C1〜6アルキル、線状もしくは分枝C1〜6アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−C1〜6アルキル、C3〜10シクロアルキル、C6〜14アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリール(限定するものではないが、例は、チロシン、3−クロロフェニルアラニン、2,3−クロロフェニルアラニン、3−クロロ−5−フルオロ−フェニルアラニン、2−クロロ−6−フルオロ−3−メチル−フェニルアラニンを含む)からなる群から選択される1つもしくは複数の置換基により置換されているか、あるいはPhe類似体のベンゼン環が、別のアリール基(限定されない例は、1−および2−ナフチルアラニンを含む)またはヘテロアリール基(限定されない例は、ピリジルアラニン、チエニルアラニンおよびフリルアラニンを含む)により置き換えられ得るPhe類似体;からなる群から選択され、;
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly、Thr、Ser、ValおよびAsnからなる群から選択され;
(e)は、Leu、Ser、Thrおよび例えばN−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され;
(f)は、Lys、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、GlnおよびSerからなる群から選択され;
(g)は、Leu、Asnおよび例えばN−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され;
(h)は、Ile、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly)、Asnおよび例えばN−Me−Ileなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択され;
(i)は、Gly、Arg、SerおよびAsnからなる群から選択され;
(j)は、Met、Val、Asn、β−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)および2−アミノ−イソ酪酸(Aib)からなる群から選択され;
(k)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tert−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Arg、Thr、Serおよび例えばN−Me−Leuなどのペプチド結合イソスターからなる群から選択される。
CNP変異体の、骨関連障害(例えば、骨系統疾患)の標的部位への送達を改善するために、CNP変異体は、骨または軟骨ターゲティング部位に(例えば、N末端および/またはC末端で)結合することができる。骨または軟骨ターゲティング部位の限定されない例は、ビスホスホネート;ヒドロキシアパタイト;グルコサミン;コラーゲン(例えば、X型コラーゲン);ポリAsp;ポリGlu;および骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するアミノ酸配列、例えば、オステオクリン、オステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質などを含む。
NEP切断に対する感受性が低下することに加えて、CNP変異体は、NPR−Cクリアランス受容体に対する親和性が低下する可能性があるが、一方、CNPの機能性は保有する。NEPにより仲介される分解のほかに、CNP22の半減期は、クリアランス受容体のNPR−Cにより影響され、NPR−Bの細胞外ペプチド結合ドメインと58%の配列相同性を共有する。CNP22は、NPR−B(親和性7〜30pM)と堅く結合するだけではなく、NPR−C(11〜140pM)とも堅く結合する(Bennett, B.D.ら、J. Biol. Chem.、266巻:23060〜67頁(1991年);Koller K. J.& Goeddel, D.V.、Circulation、86巻:1081〜88頁(1992年);Suga, S.ら、Endocrinology、130巻:229〜39頁(1992年))。NPR−Bの結晶構造は未だに報告されていないにもかかわらず、NPR−CとNPR−Aとの結晶構造の間の配列相同性ならびに類似性(He,X. -L.ら、Science、293巻(5535号):1657〜62頁(2001年);Ogawa, H.ら、J. Biol. Chem.、279巻(27号):28625〜31頁(2004年);He,X.-L.、J. Mol. Biol.、361巻(4号):698〜714頁(2006年))は、NPR−Bにより、全体的な構造の折りたたみが類似であると推定されることを示唆している。
したがって、NPR−B相同モデルは、構造に基づく配列アライメントおよび以下の関連系:NPR−Cに結合したCNP、NPR−Aに結合したANPおよびNPR−Cに結合したANP、の結晶構造に基づいて構築された(He, X.-L.ら、Science、293巻(5535号):1657〜62頁(2001年);Ogawa, H.ら、J. Biol.Chem.、279巻(27号):28625〜31頁(2004年);He, X.-L.、J. Mol. Biol.、361巻(4号):698〜714頁(2006年))。受容体が、結合したペプチドの立体配座を決定すると思われるという観察およびNPR−Bが一次構造および機能特性に関して最もNPR−Aに近いという観察に基づいて、NPR−B/CNPの相同モデルを、NPR−A/ANP結晶構造をモデルとして用いて構築した。CNP変異体の公開されたシグナル伝達データ(米国特許第5,434,133号および米国特許出願第2004/0138134A1号)およびもはやNPR−Cに結合していないANP変異体の公開されたシグナル伝達データ(Cunningham、EMBO13巻(11号)2508〜15頁、1994年)を使用して、NPR−B/CNPモデルを改良し、解明した。
本発明は、NPR−B/CNP複合体の相同性に基づく構造モデルに基づいて、NPR−Bの選択性の改善のために設計されたCNP変異体を包含する。公開され機能データを有する様々な受容体に結合したナトリウム利尿ペプチドの、実験的構造データおよびコンピュータ的な構造データを組み合わせることにより、NPR−Bに結合し続けるが、NPR−Cクリアランス受容体に対する親和性が低下し得る可能性のあるCNP変異体を作製した。例えば、NPR−Cは、ペプチド結合部位のループ構造中に唯一の挿入を有し、そのループ残基を、NPR−AおよびNPR−B中のそれぞれのループ残基と比較して、CNP Gly8(またはANP Gly9)のようなペプチド残基により近く配置している。先行する研究は、ANPにおけるG9T突然変異が、NPR−Cに対する親和性の低下に寄与し、その結果、NPR−Aの選択性が改善されることを示した(Cunningham、EMBO J.、13巻(11号):2508〜15頁(1994年))。したがって、CNP変異体を、対応するGly8残基を、より高分子の残基(Ser、Val、ThrまたはAsn)に置き換えて作製し、CNPとNPR−Cとの結合を、NPR−Bに対する結合に影響を与えることなく崩壊させた。さらに、1つまたは複数の突然変異を、受容体/ペプチド複合体の詳細な構造解析に基づいて、受容体特異的残基と相互作用することが予測される、Gly15からGly21を包含するCNPのC末端に導入した。例えば、CNP22中のG19Rの突然変異は、NPR−Bシグナル伝達活性の有意な喪失をもたらさない。しかし、この突然変異は、近隣残基の立体配座を変えることなく、NPR−C/CNPの利用可能な結晶構造にモデル化できない。これらの観察は、G19Rの突然変異が、CNPと、特定の受容体、例えばNPR−Cとの結合を選択的に崩壊させ得ることを示唆する。
ある実施形態において、CNP変異体は、1、5、8、15、19および21位の1つまたは複数のGly部位に置換を有し、立体配座の柔軟性を低下させ、その結果受容体の特異性を増加させる。NPR−CおよびNPR−Aに結合したANPの結晶構造の比較分析(Ogawa, H.ら、J. Biol. Chem.、279巻:28625〜31頁(2004年);He, X.-L.、J. Mol.Biol.、361巻:698〜714頁(2006年))は、ANPの立体配座の柔軟性が、受容体の選択性の決定において非常に重要な役割を果たし得ることを示す。
一実施形態において、NPR−Cに対する親和性が低下した可能性のある、機能性CNP変異体は、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数を有する:G1R、G1E、G5R、G5Q、G5S、F7Y、G8T、G8S、G8V、G8N、L9S、L9T、K10Cit、K10Q、K10S、I14N、G15R、G15S、G15N、G15Cit、S16Q、M17V、M17N、G19S、G19R、G19N、L20V、L20R、L20T、L20S、G21S、G21TおよびG21R。ある実施形態において、CNP変異体は、1、5、7、8、9、10、14、15、16、17、19、20および/または21位にマルチポイントの置換を有し、場合により変異体のペプチド配列の任意の他の位置に改変を有することができる。
さらなる実施形態において、本明細書に記載のCNP変異体は、N末端、C末端および/または内部部位において、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲であることを特徴とする総質量までの部分に接合し、骨/軟骨ターゲティングを容易にし、NPR−Cおよび腎クリアランスを減少させ、NEP分解に対する耐性を増加させ、および/またはCNPの機能性を改善させることができる。一実施形態において、CNP変異体は、環状領域(CNP22のCys6からCys22に対応する)内のポリマー部分に結合されない。CNP変異体に結合できるポリマー部分または非ポリマー部分の限定されない例は、合成骨ターゲティング化合物、例えばビスホスホネート;骨/軟骨ターゲティングペプチド配列、例えば、ポリAspおよびポリGluなど;骨タンパク質の骨ターゲティングドメインに由来するペプチド配列、例えばオステオポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質など;骨形成タンパク質の機能ドメインに由来するペプチド配列、例えば、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7およびBMP8aなど;ナトリウム利尿起源のポリペプチドに由来するペプチド配列、例えば、NPPC、ANPおよびBNPなど;他の天然ポリマーまたは非ポリマー部分、例えば、糖、脂肪酸およびリン脂質;生体適合性合成親水性ポリマー、例えば、PEG(またはPEO)など;疎水性のポリマー部分または非ポリマー部分、例えば、ヘプタン酸およびペンタン酸;およびそれらの組合せを含む。
本明細書に記載のCNP変異体は、例えば、cGMP産生およびシグナル伝達の刺激に関して、CNP22と実質的に同様またはそれより優れた機能活性を有することができる。一実施形態において、CNP変異体は、wtCNP22と同じ濃度(例えば、1uM)において産生されたcGMPレベルの少なくとも約50%の産生を、in vivoで刺激する。特定の実施形態において、変異体は、野生型CNP22のcGMP刺激活性の少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%または100%を保有する。別の実施形態において、CNP変異体は、CNP22と比較して改善されたcGMP刺激活性を有する。
具体的に開示された任意のナトリウム利尿(例えば、CNP)ペプチド、断片および変異体ならびに限定するものではないが、米国特許第5,434,133号、米国特許第6,034,231号、米国特許第6,020,168号、米国特許第6,743,425号、米国特許第7,276,481号、WO94/20534号、WO02/047871号、WO2005/098490号、WO2004/047871号、EP0497368号、EP0466174号、およびFuruyaら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 183巻:964〜969頁(1992年)を含む、本明細書に参照された任意の先行文献中において実際に作製された任意のナトリウム利尿(例えば、CNP)ペプチド、断片および変異体は、本発明から場合により除外する。このような文献はすべて、その全体が参照により本明細書中に援用される。
一実施形態において、本発明は、野生型CNP53、野生型CNP22、野生型CNP17、野生型BNPおよび野生型ANPを、場合により除外する。別の実施形態において、本発明は、in vivoでタンパク質切断により作製されたNPPCまたはCNP53の断片を、場合により除外する。さらにまた別の実施形態において、以下の野生型CNP53の切断断片:CNP50、CNP46、CNP44、CNP39、CNP29およびCNP27を、場合により本発明から除外する。
ある実施形態において、本発明は、米国特許第7,276,481号に具体的に開示の配列番号1〜4および6〜71のペプチドを、場合により除外する。別の実施形態において、本発明は、米国特許第7,276,481号に一般的に開示された配列番号5のペプチドを場合により除外し、このようなペプチドは、Leu9、Lys10、Leu11、Ser16、Met17、Gly19および/またはLeu20において少なくとも1つの天然アミノ酸置換を有するCNP17変異体である。さらに別の実施形態において、CNP17またはその変異体がN−Me−Phe7またはN−Me−Phe7とN−Me−Leu11とを含有するCNP17変異体を、場合により除外する。さらなる実施形態において、本発明は、米国特許第7,276,481号に開示の、配列番号5のCNP17変異体を場合により除外し、これらは成長ホルモン(GH)、インスリン様成長因子1(IGF−1)または甲状腺ホルモン(TH)に融合または結合する。さらに別の実施形態において、CNP22がGH、IGF−1またはTHと融合する、あるいはリンカー(例えば、ペプチドリンカー)を介してGH、IGF−1またはTHに結合する、CNP22変異体を、場合により除外する。さらに別の実施形態において、CNP17またはその変異体が、N末端またはC末端においてビオチンまたはフルオレセインに結合するCNP17変異体を、場合により排除する。
さらなる実施形態において、本発明は、米国特許第5,434,133号に具体的に開示された、化合物番号1〜27および配列番号1〜17、22〜24、30、31および40〜42のペプチドを、場合により除外する。別の実施形態において、本発明は、米国特許第5,434,133号に一般的に開示された配列番号18〜21および25〜29のペプチドを場合により除外する。さらに別の実施形態において、本発明は、WO94/20534号に具体的に開示された配列番号1〜4および9のペプチドを、場合により除外する。
しかし、一部の実施形態において、本発明は、本明細書において場合により除外されたナトリウム利尿(例えば、CNP)ペプチド、断片および変異体の使用方法、ならびにナトリウム利尿(例えば、CNP)ペプチド、断片および変異体を含む医薬組成物(滅菌医薬組成物を含む)は、依然として包含する。
C.CNP変異体の合成および精製
一実施形態において、CNP変異体は、当分野において一般的に公知の技術を使用して、組換え体の発現を介して生産される。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor、N.Y.(1989年)); DNA Cloning: A Practical Approach、I およびII巻、D. N. Glover、編(1985年);およびCurrentProtocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.(1994年)を参照されたい。
一実施形態において、CNP変異体は、当分野において一般的に公知の技術を使用して、組換え体の発現を介して生産される。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor、N.Y.(1989年)); DNA Cloning: A Practical Approach、I およびII巻、D. N. Glover、編(1985年);およびCurrentProtocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.(1994年)を参照されたい。
組換えCNP変異体のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、発現されるヌクレオチド配列に動作可能に連結された発現調節配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクターにおいて発現される。発現ベクターは、十分な発現のためのシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞またはin vitro発現系によって補うことができる。発現ベクターは、限定するものではないが、コスミド、プラスミド(例えば、裸の、またはリポソームに包含された)および組換えポリヌクレオチドを組み込んだウイルスを含む、当分野において公知のすべてのベクターを含む。発現ベクターは、当分野において公知の技術を使用して、形質転換または形質移入を介してポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現のために、適切な宿主細胞に挿入される。例えば、Sambrook、Fritsch & Maniatis、Molecular Cloning: A LaboratoryManual、第2版、Cold Spring Harbor、N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年を参照されたい。
本明細書に記載のCNP変異体を作製するために使用する宿主細胞は、細菌、酵母、昆虫、非哺乳動物の脊椎動物または哺乳動物の細胞であってよい。哺乳動物細胞は、限定するものではないが、ハムスター、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヒトの細胞を含む。宿主細胞は、不死化細胞(細胞系)または非不死化(初代または第2代)細胞であってもよく、任意の広範囲の細胞型、例えば、限定するものではないが、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞(例えば、乳房上皮細胞、腸上皮細胞)、卵巣細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣すなわちCHO細胞)、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の生成成分(例えば、リンパ球、骨髄細胞)、軟骨細胞および他の骨由来細胞ならびにこれらの体細胞の前駆体であってよい。CNP変異体のDNAまたはRNAを含有する宿主細胞は、細胞の成長、DNAまたはRNAの発現およびCNP変異体を発現する細胞の同定/選択に適切な条件下で培養される。
別の実施形態において、CNP変異体は、Atherton およびSheppard、SolidPhase Peptide Synthesis: a Practical Approach、IRL Press(Oxford、England(1989年))の方法に従って合成および精製される。
ペプチドは、例えば、CNPの以下のペプチド配列:G1LS(KまたはR)GC6F7G8L(KまたはRまたはNleまたは6−OH−NIe)LDRIGSMSGLGC22に基づいて合成できる。
例示的CNP変異体は、限定するものではないが、
類似体A(GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC)(配列番号56)、骨格のC6の「−C=O」基を「−CH2」基に変換することによって作製した;
類似体B(GLSKGC(N−Me−Phe)GLKLDRIGSMSGLGC)(配列番号57)、骨格のF7の「−NH」基を「−N−CH3」基に変換することによって作製した;
類似体E(GLSKGC(D−Phe)GLKLDRIGSMSGLGC)(配列番号136)、F7のD−Pheを使用して作製した;
類似体F(GLSKGCF(tBu−Gly)LKLDRIGSMSGLGC)(配列番号58)、G8のtertiary−ブチル−Glyを使用して作製した;
類似体G(GLSKGC(3−Cl−Phe)GLKLDRIGSMSGLGC)(配列番号137)、F7のフェニル環のメタの位置に塩素原子を付加することによって作製した(同様の変異体を、Phe7のフェニル環のオルト、メタおよび/またはパラをCl、F、Br、OHおよび/またはCH3で置換することによって作製できる);および
類似体H(GLSKGC[NHCH2CH(Ph)CO]GLKLDRIGSMSGLGC)(配列番号59)、F7の(±)−3−(アミノ)−2−フェニルプロピオン酸を使用して作製した、
を含む。
類似体A(GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC)(配列番号56)、骨格のC6の「−C=O」基を「−CH2」基に変換することによって作製した;
類似体B(GLSKGC(N−Me−Phe)GLKLDRIGSMSGLGC)(配列番号57)、骨格のF7の「−NH」基を「−N−CH3」基に変換することによって作製した;
類似体E(GLSKGC(D−Phe)GLKLDRIGSMSGLGC)(配列番号136)、F7のD−Pheを使用して作製した;
類似体F(GLSKGCF(tBu−Gly)LKLDRIGSMSGLGC)(配列番号58)、G8のtertiary−ブチル−Glyを使用して作製した;
類似体G(GLSKGC(3−Cl−Phe)GLKLDRIGSMSGLGC)(配列番号137)、F7のフェニル環のメタの位置に塩素原子を付加することによって作製した(同様の変異体を、Phe7のフェニル環のオルト、メタおよび/またはパラをCl、F、Br、OHおよび/またはCH3で置換することによって作製できる);および
類似体H(GLSKGC[NHCH2CH(Ph)CO]GLKLDRIGSMSGLGC)(配列番号59)、F7の(±)−3−(アミノ)−2−フェニルプロピオン酸を使用して作製した、
を含む。
例えば、天然または非天然アミノ酸またはペプチド結合イソスターによるアミノ酸の延長、置換および/またはポリマーまたは疎水性部分との結合を有する、CNP変異体の例は、限定するものではないが、
一実施形態において、CNP変異体は、Cys6とCys22との間にジスルフィド結合を形成することを介して環化される。Cys6は、例えば、ホモシステインまたはペニシラミンなどのシステイン類似体であり得る。さらなる実施形態において、CNP変異体はヘッド−テール、側鎖−側鎖、側鎖−ヘッドまたは側鎖−テールにより形成された共有結合により環化できる。ある実施形態において、共有結合は、ペプチドのN末端の、またはN末端の前のアミノ酸と、C末端のまたはC末端の前のアミノ酸(本文脈において、「末端」アミノ酸と称される)との間に形成される。別の実施形態において、共有結合は、2つの末端アミノ酸の側鎖の間に形成される。まだ別の実施形態において、共有結合は、1つの末端アミノ酸の側鎖と、他の末端アミノ酸の末端基との間、あるいは2つの末端アミノ酸の末端基の間に形成される。
末端アミンと末端カルボキシル基とのヘッド−テール環化は、多くの方法、例えば、p−ニトロフェニルエステル、2,4,5−トリクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、アジド法、混合無水物法、HATU、HOBt、HONSuまたはHoAtなどの触媒を用いたカルボジイミド(例えば、DIC、EDCまたはDCC)または樹脂上環化を使用して実施できる。
さらに、環状構造は、CNP変異体のアミノ酸残基および/または末端アミノ酸残基の側鎖を含む架橋基を介して形成されてもよい。架橋基は、ペプチドの2つの部分を環化できる化学的部分である。架橋基の限定されない例は、アミド、チオエステル、ジスルフィド、尿素、カーバメート、スルホンアミドなどを含む。このような架橋基を有する単位の組み込みに関する様々な方法が、当分野において公知である。例えば、ラクタム架橋(すなわち、環状アミド)は、N末端アミノ基または側鎖上のアミノ基と、C末端カルボン酸または側鎖、例えば、リジンまたはオルニチンの側鎖およびグルタミン酸またはアスパラギン酸の側鎖上のカルボキシル基との間に形成できる。チオエステルは、C末端カルボキシル基または側鎖上のカルボキシル基と、システインまたはシステイン類似体の側鎖上のチオール基との間に形成できる。
代替的には、架橋はランチオニン(チオジアラニン)残基を組み込み、チオエステル結合により共有結合されるアラニン残基と連結することによって形成できる。別の方法において、架橋剤、例えば、ジカルボン酸(例えば、スベリン酸(オクタン二酸))は、アミノ酸側鎖の官能基、例えば、遊離のアミノ基、ヒドロキシル基、およびチオール基を連結できる。
酵素により触媒された環化もまた使用できる。例えば、チロシジン合成酵素のチオエステラーゼドメインを使用して、チオエステル前駆体を環化でき、スブチリシン突然変異体を利用して、ペプチドグリコール酸フェニルアラニルアミドエステルを環化でき、抗体リガーゼ16G3を用いてp−ニトロフェニルエステルを環化できることが報告されている。ペプチドの環化の概説に関しては、Davies、J. Peptide Sci.、9巻:471〜501頁(2003年)を参照されたく、その全体は参照により本明細書に援用される。
特定の実施形態において、最終環化産物は、少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または少なくとも約99%の純度を有する。
D.化学改変CNP変異体
CNP22またはその変異体の化学改変により、改変CNPペプチドに有利な特性、例えば、安定性および半減期の増加、免疫原性の低下などをもたらし得る可能性がある(治療用タンパク質の化学改変の一般的議論に関しては、Pharmazie、57巻(1号):5〜29頁(2002年)を参照されたい)。例えば、CNPペプチドの総質量を、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲に増加させるために、天然または合成のポリマー部分または非ポリマー部分(例えば、PEG)と、CNPペプチドとの結合により、修飾ペプチドの、エキソペプチダーゼおよび/またはエンドペプチダーゼ(例えば、NEP)によるin vivoの切断に対する感受性を低下させることができる。PEG化、グリコシル化および他の化学誘導化手法、例えば、リン酸化、アミド化、カルボキシル化、アセチル化、メチル化による改変に加えて、および酸付加塩、アミド、エステルおよびNアシル誘導体の生成は、免疫原性領域および/またはタンパク質分解感受性領域をマスクできる可能性もある(Science、303巻:480〜482頁(2004年))。
CNP22またはその変異体の化学改変により、改変CNPペプチドに有利な特性、例えば、安定性および半減期の増加、免疫原性の低下などをもたらし得る可能性がある(治療用タンパク質の化学改変の一般的議論に関しては、Pharmazie、57巻(1号):5〜29頁(2002年)を参照されたい)。例えば、CNPペプチドの総質量を、本明細書において全般に記載の範囲、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲に増加させるために、天然または合成のポリマー部分または非ポリマー部分(例えば、PEG)と、CNPペプチドとの結合により、修飾ペプチドの、エキソペプチダーゼおよび/またはエンドペプチダーゼ(例えば、NEP)によるin vivoの切断に対する感受性を低下させることができる。PEG化、グリコシル化および他の化学誘導化手法、例えば、リン酸化、アミド化、カルボキシル化、アセチル化、メチル化による改変に加えて、および酸付加塩、アミド、エステルおよびNアシル誘導体の生成は、免疫原性領域および/またはタンパク質分解感受性領域をマスクできる可能性もある(Science、303巻:480〜482頁(2004年))。
化学改変の例は、限定するものではないが、安定性およびプロテアーゼ耐性の改善ならびに免疫原性の低下のためのBednarsakiのポリマー付加法およびAltus Corporationの架橋法を含む。Bednarsakiは、ポリマー付加が、タンパク質の温度安定性を改善できることを示し(J. Am. Chem. Soc.、114巻(1号):378〜380頁(1992年))、Altus Corporationは、グルタルアルデヒド架橋が酵素安定性を改善できることを発見した。
ポリペプチドの化学改変は、非特異的方法(誘導化種の混合をもたらす)または部位特異的方法(例えば、野生型巨大分子の反応性特異的誘導化および/または部位特異的変異誘発および化学改変の組合せを使用する部位選択改変に基づく)で、あるいは、発現タンパク質連結方法を使用して実施できる(Curr. Opin. Biotechnol.、13巻(4号):297〜303頁(2002年))。
PEG化CNP変異体
一実施形態において、安定性(例えば、NEP分解に対する耐性)の増加のために、CNP22またはその変異体(アミノ酸の付加、置換および/または欠失を有する変異体を含む)を親水性の天然または合成のポリマーに接合し、改変CNPペプチドの総質量を、約2.6kDaまたは2.8kDaから約4、5、6、7またはそれより大きいkDaの範囲に増加させる。特定の実施形態において、付加された親水性ポリマーは、約0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、または約5kDaの総質量を有する。
一実施形態において、安定性(例えば、NEP分解に対する耐性)の増加のために、CNP22またはその変異体(アミノ酸の付加、置換および/または欠失を有する変異体を含む)を親水性の天然または合成のポリマーに接合し、改変CNPペプチドの総質量を、約2.6kDaまたは2.8kDaから約4、5、6、7またはそれより大きいkDaの範囲に増加させる。特定の実施形態において、付加された親水性ポリマーは、約0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、または約5kDaの総質量を有する。
ある実施形態において、親水性ポリマーは、結合されたCNPペプチドが水性(例えば、生理的)環境中で沈殿しないように水溶性である。さらに、親水性ポリマーは生体適合性である、すなわち、in vivoで損傷、毒性または免疫反応を起こさない。
親水性ポリマーは、分枝または非分枝であってよい。一実施形態において、親水性ポリマーは分枝ではない。
親水性ポリマーに対するCNP22またはその変異体の様々な接合部位は、限定するものではないが、:(1)N末端のみ;(2)C末端のみ;(3)内部部位のみ(例えば、Lys4);(4)N末端およびC末端の両方;(5)N末端および内部部位;ならびに(6)C末端および内部部位、を含む。一実施形態において、CNP22またはその変異体は、N末端のみにおいて親水性ポリマーに結合される。別の実施形態において、結合は内部部位(例えば、Lys4)のみである。なお別の実施形態において、接合はN末端および内部部位(例えば、Lys4)である。さらに別の実施形態において、より優れた機能性のためにCNPペプチドは、環状ドメイン内(CNP22のCys6からCys22に対応する)の部位(例えば、Lys10)において親水性ポリマーと結合しない。親水性ポリマーとの結合が、CNPペプチド上の反応性第一級アミノ基との結合形成に基づく場合、内部部位(例えば、Lys4および/またはLys10)における結合は、Lys4および/またはLys10を、天然または非天然アミノ酸または側鎖(例えば、Gly、Ser、Arg、Asn、Gln、Asp、Gluまたはシトルリン(Cit))に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体と置換することによって妨害できる。特定の実施形態において、Lys4および/またはLys10は、Argと置き換えることができる。別の実施形態において、Lys10は、Argと置き換えることはできない。
親水性ポリマーの限定されない例は、カルボン酸担持モノマー(例えば、メタクリル酸(MA)およびアクリル酸(AA))から形成されるポリマー、ポリビニルアルコール、ヒドロキシル担持モノマー(例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)、ヒドロキシプロピルメタクリレート(HPMA)、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドおよび3−トリメチルシリルプロピルメタクリレート(TMSPMA))から形成されるポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリ(プロピレングリコール)、モノ−C1〜C10アルコキシ−PEG(例えば、モノメトキシ−PEG)、トレシルモノメトキシ−PEG、アリールオキシ−PEG、PEGアクリレート(PEGA)、PEGメタクリレート、PEGプロピオンアルデヒド、bis−スクシンイミジルカルボネートPEG、2−メタクリロイルオキシエチル−ホスホリルコリン(MPC)およびN−ビニルピロリドン(VP)のコポリマー、ヒドロキシ官能性ポリ(N−ビニルピロリドン)(PVP)、SIS−PEG(SISは、ポリスチレン−ポリイソブチレン−ポリスチレンブロックコポリマーである)、ポリスチレン−PEG、ポリイソブチレン−PEG、PCL−PEG(PCLは、ポリカプロラクトンである)、PLA−PEG(PLAは、ポリ乳酸である)、PMMA−PEG(PMMAは、ポリ(メチルメタクリレート)である)、PDMS−PEG(PDMSは、ポリジメチルオキサノン)、PVDF−PEG(PVDFは、ポリフッ化ビニリデンである)、PLURONICTM界面活性剤(ポリプロピレンオキシド−co−ポリエチレングリコール)、ポリ(テトラメチレングリコール)、ポリ(L−リジン−g−エチレングリコール)(PLL−g−PEG)、ポリ(L−リジン−g−ヒアルロン酸)(PLL−g−HA)、ポリ(L−リジン−g−ホスホリルコリン)(PLL−g−PC)、ポリ(L−リジン−g−ビニルピロリドン)(PLL−g−PVP)、ポリ(エチルイミン−g−エチレングリコール)(PEI−g−PEG)、ポリ(エチルイミン−g−ヒアルロン酸)(PEI−g−HA)、ポリ(エチルイミン−g−ホスホリルコリン)(PEI−g−PC)、ポリ(エチルイミン−g−ビニルピロリドン)(PEI−g−PVP)、PLL−co−HA、PLL−co−PC、PLL−co−PVP、PEI−co−PEG、PEI−co−HA、PEI−co−PC、PEI−co−PVP、セルロースおよびその誘導体(例えば、ヒドロキシエチルセルロース)、デキストラン、デキストリン、ヒアルロン酸およびその誘導体(例えば、ヒアルロン酸ナトリウム)、エラスチン、キトサン、アクリル硫酸、アクリルスルホン酸、アクリルスルファミン酸、メタクリル硫酸、メタクリルスルホン酸、メタクリルスルファミン酸、それらのポリマーおよびコポリマーならびにそれらの組合せのポリマーおよびコポリマーを含む。
特定の実施形態において、親水性ポリマーはポリ(エチレングリコール)(PEG)であり、ポリ(エチレンオキシド)(PEO)とも呼ばれる。本明細書において使用する場合、「PEG」または「PEO」という用語はPEGのすべての形態、分枝および非分枝を包含し、これらはポリペプチドを誘導化するために使用でき、限定するものではないが、モノ−(C1−C10)アルコキシ−PEGおよびアリールオキシ−PEGを含む。
一実施形態において、PEG−CNP結合体は、式(CH2CH2O)nのPEG(またはPEO)ポリマーを含み、式中、nは約6から約100までの整数であり、PEGポリマーは、約0.3kDaから約5kDaである。別の実施形態において、nは約12から約50までの整数であり、PEGポリマーは、約0.6kDaから約2.5kDaである。なお別の実施形態において、nは約12から約24までであり、PEGポリマーは、約0.6kDaから約1.2kDaである。さらなる実施形態において、PEGポリマーの末端ヒドロキシル基は、非反応性基により覆われている。特定の実施形態において、末端を覆っている基はアルキル基、例えばメチルなどの低分子アルキル基であるので、PEGポリマーはアルコキシ基で終結する。ある実施形態において、PEGポリマーは非分枝である。別の実施形態において、CNP22またはその変異体は、PEGポリマーとN末端のみで接合する。
PEGおよびPEOは、分子量の分散した分子を含む可能性があり、すなわち、それらが調製される手法によって、多分散である可能性がある。ポリマー調製物のサイズ/質量分布は、その重量平均分子量(Mw)および数平均分子量(Mn)によって統計的に特徴づけることができ、その比は、多分散指数(Mw/Mn)と呼ばれる。MwおよびMnは、質量分光法によって測定できる。1.5kDaより大きいPEG部分に結合したPEG−CNP変異体は、親PEG分子の多分散性により、様々な分子量を示すことがある。例えば、mPEG2K(Sunbright ME−020HS、NOF Co.)の場合、PEG分子の分子量は、約1.5kDaから約3kDaの範囲にわたって分散しており、多分散指数は1.036である。それに反して、Pierce Biotechnology(Rockford、Illinois)によるMS(PEG)n試薬(n=4、8、12または24、例えば「PEO12」または「PEO24」として表示される)を使用して、CNP22またはその変異体に接合されたPEGは単分散であり、個別の鎖長および規定分子量を有する。
PEG部分を含むポリペプチドの作製方法は、当分野において公知である(例えば、米国特許第5,824,784号を参照されたい)。PEG化CNPペプチドの調製方法は、(a)CNPペプチド(例えばN末端において)にPEGを結合するために適切な条件下でPEG化試薬を使用して、CNP22またはその変異体を反応させるステップ、および(b)反応産物を得るステップ、を一般的に含む。CNPペプチドのPEG化は、PEG部分のサイズおよびPEG化の位置次第でNPR−Bに対するその結合を有意に改変できるので、様々な種類のPEGおよびPEG化の反応条件を調査できる。CNPペプチドのPEG化に使用できる化学は、メトキシ−PEG(O−[(N−スクシンイミジルオキシカルボニル)−メチル]−O’−メチルポリエチレングリコール)のNHS−エステルを使用する、ペプチドの反応性第一級アミンのアシル化を含む。メトキシ−PEG−NHSまたはメトキシ−PEG−SPAを用いたアシル化は、元の第一級アミンの任意の電荷を排除するアミド連結をもたらす。記号「PEO12」または「PEO24」と名付けられるPEG−CNPペプチドならびに記号「PEG1K」、「PEG2K」、「PEG5K」または「PEG20K」と名付けられたPEG−CNPペプチドは、NHSエステル活性化の、メトキシ末端キャップ化PEG試薬を用いた、ペプチド上の第一級アミノ基の反応を介したPEG化である。PEG−CNP変異体は、他の方法、例えば、ペプチド上の第一級アミノ基およびPEGアルデヒド、例えば、PEG−プロピオンアルデヒドなど、あるいはそれらのモノ−C1−C10アルコキシまたはアリールオキシ誘導体に関与する還元アミノ化により調製できる(米国特許第5,252,714号を参照されたい)。
リボソームタンパク質合成とは異なって、合成ペプチドの合成は、C末端からN末端へと進む。したがって、(tert−ブチルオキシカルボニル(Boc)を含有する)Boc−PEGは、PEGを、ペプチドのC末端に結合する1つの方法である(R. B. Merrifield、J. Am. Chem. Soc.、85巻(14号):2149〜2154頁(1963年))。代替的には、Fmoc(フルオレニルメトキシカルボニル)化学を用いることができる(E.Atherton および R.C. Sheppard、Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach、IRLPress(Oxford、England (1989年))。
PEG−CNP変異体を調製するための本方法は、ポリマー−タンパク質結合体の実質的に均一な混合物を提供する。精製後、個別のPEG−CNP調製物は、in vivoおよびin vitroで生物特性を試験するために十分に純粋である。本明細書において実証されるように、特定のPEG−CNP変異体は、NEP切断に対する感受性の低下および実質的に同様またはより優れた機能性(例えば、cGMP産生の刺激)を示す。
本明細書に記載のように、適切なPEG化試薬/CNPペプチドの比および反応条件を使用する、CNP22またはその変異体のPEG化反応は、PEG−CNP誘導体を提供する。PEG化の特性および範囲は、例えば、PAGEおよびHPLC解析を使用して確定できる。特定の実施形態において、CNP22またはその変異体の少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%が、N末端においてモノPEG化される。CNPペプチドの生物特性についての、PEG化の有益な効果を最適化するために、ポリマーの長さ、立体配座(例えば、分枝または線状)および/またはPEG部分の官能化(例えば、負に荷電した基の付加)を変化させることができる。PEG化CNP変異体は、NEP耐性、薬物動態および生物活性(例えば、NPR−Bに対する結合能およびcGMP生成の刺激能)に関して試験される。NEP耐性の改善およびCNP22のcGMP−刺激活性の少なくとも約50%を示すPEG化CNP変異体は、例えば、ラットの軟骨肉腫細胞に基づく軟骨無形成症モデルにおいてin vitroで、およびマウス軟骨無形成症動物モデルにおいてin vivoで、さらに試験され得る。
E.CNP変異体の使用法、CNP変異体の医薬組成物および投与経路
CNP変異体の使用法
骨関連障害
線維芽細胞増殖因子(FGF)は、骨形成において重要な役割を果たし、FGF受容体遺伝子(FGFR1、2および3)における突然変異は、様々な遺伝性骨格形成異常を引き起こす(Curr. Biol.、5巻:500〜507頁(1995年))。特に、FGFR−3における突然変異の活性化は、ヒト遺伝性小人症の最も一般的な形態の軟骨無形成症(Nature、371巻:252〜254頁(1994年);Cell、78巻:335〜342頁(1994年))、より軽症の軟骨低形成症(Ann. N.Y. Acad. Sci.、785巻:182〜187頁(1996年))およびより重篤な新生致死の致死性骨異形成(TD)I型およびII型(Hum.Mol. Genet.、5巻:509〜512頁(1996年);Nat. Genet.、9巻:321〜328頁(1995年))を含む長骨の障害に関与する。FGF−2を過剰発現し、FGFR−3を連続活性化するマウスモデルは、長骨の短縮および大頭を示す(Mol.Biol. Cell、6巻:1861〜73頁(1995年))。このモデルに一致して、マウスのFGFR−3における欠損は、成長板が広くなる著しい骨格の過剰成長を示す(NatureGenet.、12巻:390〜397頁(1996年))。
CNP変異体の使用法
骨関連障害
線維芽細胞増殖因子(FGF)は、骨形成において重要な役割を果たし、FGF受容体遺伝子(FGFR1、2および3)における突然変異は、様々な遺伝性骨格形成異常を引き起こす(Curr. Biol.、5巻:500〜507頁(1995年))。特に、FGFR−3における突然変異の活性化は、ヒト遺伝性小人症の最も一般的な形態の軟骨無形成症(Nature、371巻:252〜254頁(1994年);Cell、78巻:335〜342頁(1994年))、より軽症の軟骨低形成症(Ann. N.Y. Acad. Sci.、785巻:182〜187頁(1996年))およびより重篤な新生致死の致死性骨異形成(TD)I型およびII型(Hum.Mol. Genet.、5巻:509〜512頁(1996年);Nat. Genet.、9巻:321〜328頁(1995年))を含む長骨の障害に関与する。FGF−2を過剰発現し、FGFR−3を連続活性化するマウスモデルは、長骨の短縮および大頭を示す(Mol.Biol. Cell、6巻:1861〜73頁(1995年))。このモデルに一致して、マウスのFGFR−3における欠損は、成長板が広くなる著しい骨格の過剰成長を示す(NatureGenet.、12巻:390〜397頁(1996年))。
CNP、NPR−BおよびNPR−Cを用いた補足実験により、受容体に対応するペプチドリガンドと、骨成長との間の関連性が示唆される。トランスジェニックマウス中のCNPの血漿濃度の上昇によるNPR−Bの活性化は、FGFR−3ノックアウトマウスの成長板軟骨の過剰成長(Nat. Genet.、4巻:390〜397頁(1996年))と組織学的に類似の、骨格の過剰成長(Nat. Med.、10巻:80〜86頁(2004年))を引き起こす。NPR−Cノックアウトマウスにおいて、CNPのNPR−C−仲介クリアランスは、除外されるべきであり、この予測に一致して、ノックアウト動物は、長骨の延長および脊柱後弯症を伴う椎骨の延長を示す(Proc.Natl. Acad. Sci. USA96巻:7403〜08頁(1999年))。反対に、CNPノックアウトマウスは、長骨および椎骨の短縮、軟骨無形成症の表現型と組織学的に類似の表現型により発育が止まり、不正咬合および小型の胸部による肺の制限の結果として死亡率が増加する(Proc.Natl. Acad. Sci. USA、98巻:4016〜4021頁(2001年))。NPR−Bの活性化因子としてのCNPの提唱された役割に一致して、NPR−Bノックアウトマウスは、CNPノックアウトマウスと同じ発育が停止した骨格表現型および死亡率の増加を有する(Proc.Natl. Acad. Sci USA、101巻:17300〜05頁(2004年))。さらに、軟骨においてFGFR−3が活性化された、軟骨無形成症のマウスモデルにおいて、軟骨細胞中のCNPのターゲティングされた過剰発現は、小人症と反対に作用する(Yasodaら、Nat.Med.、10巻:80〜86頁(2004年))。さらに、CNPは、限定するものではないが、軟骨細胞の増殖および分化、マイトジェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼ/MEK(Raf−1)キナーゼシグナル伝達経路の阻害および軟骨内骨化の促進(Yasodaら、Nat.Med.、10巻:80〜86頁(2004年))を含む、軟骨内骨成長および軟骨細胞活性の制御において役目を果たすことが示されている。これらの結果は、CNP/NPR−B系の活性化が、ヒト軟骨無形成症の治療のための治療戦略である可能性を示唆している。
マトリックスの産生、軟骨細胞の増殖および分化および長骨成長の増加を刺激することによって、本発明のCNP変異体は、例えば、骨格形成異常などの骨関連障害を患う、ヒトを含む哺乳動物の治療のために有用である可能性がある。CNP−応答骨関連障害の限定されない例は、軟骨無形成症、軟骨低形成症、低身長、小人症、骨軟骨異形成、致死性形成異常、骨形成不全、軟骨無発生症、点状軟骨形成不全、ホモ接合性軟骨無形成症、点状軟骨形成不全、屈肢異形成症、先天性致死性低ホスファターゼ血症、周産期致死型骨形成不全、短肢多指症候群、低軟骨形成症、近位肢短縮型点状軟骨形成不全、ジャンセン型骨幹端異形成症、先天性脊椎骨端異形成症、骨不全症、捻曲性骨異形成症、先天性短大腿骨、ランゲル型中間肢異形成症、ニーベルゲルト型中間肢異形成症、ロビノウ症候群、レインハルト症候群、先端異骨症、末梢骨形成不全症、クニエスト(Kniest)異形成症、線維性軟骨発生症、ロベルツ症候群、遠位中間肢異形成症、小肢症、モルキオ症候群、クニエスト症候群、異栄養異形成症および脊椎上骨幹端異形成症を含む。
CNP変異体は、変形性関節炎の治療にもまた、使用できる可能性がある。変形性関節炎は、関節の軟骨の変性疾患であり、高齢者にしばしば発生する。変形性関節炎は、関節成分の破壊によりもたらされる軟骨の破壊および骨および軟骨の増殖性変化に関与し、この変化は二次性関節炎(例えば、滑膜炎)をもたらす。変形性関節炎では、軟骨の機能エンティティである細胞外マトリックスタンパク質が減少し、軟骨細胞の数が減少する(Arth. Rheum.46巻(8号):1986〜1996頁(2002年))。マトリックスの産生、軟骨細胞の成長および分化を促進することによって、CNP変異体は、変形性関節炎の治療において有用であり得る可能性がある。
血管平滑筋の障害
CNPおよび他の血管作用ペプチド(ANP、BNPおよびウロジラチンを含む)は血管拡張および利尿特性を有し、心血管の恒常性において重要な役割を果たす(J. Cardiovasc. Pharmacol.、117巻:1600〜06頁(1998年);Kidney Int.、49巻:1732〜37頁(1996年);Am.J. Physiol.、275巻:H1826〜1833頁(1998年))。CNPは、心血管系において広範囲に分布し、特に、血管内皮細胞において高濃度である(J.Cardiovasc. Pharmacol.、117巻:1600〜06頁(1998年))。CNPは、血管平滑筋、特に冠循環においての強力な弛緩薬であり(Biochem.Biophys. Res. Commun.、205巻:765〜771頁(1994年))、平滑筋細胞増殖の阻害剤である(Biochem. Biophys.Res. Commun.、177巻:927〜931頁(1991年))。CNPの血管拡張効果はANPの血管拡張効果より低いが(約1:100)(Hypertens.Res.、21巻:7〜13頁(1998年)、Am. J. Physiol.、275巻:L645〜L652頁(1998年))、CNPmRNAはせん断応力に対する応答において増加し(FEBSLett.、373巻:108〜110頁(1995年))、CNPの血漿レベルは、炎症性心血管病理において上昇する (Biochem. Biophys. Res.Commun.、198巻:1177〜1182頁(1994年))。CNPは、ウサギの負傷した頸動脈においてマクロファージの侵入の阻害を介して炎症を抑制し(Circ.Res.、91巻:1063〜1069頁(2002年))、NPR−B/cGMP−依存性経路を介して心臓線維芽細胞増殖を直接阻害する(Endocrinology、144巻:2279〜2284頁(2003年))ことが示されている。
CNPおよび他の血管作用ペプチド(ANP、BNPおよびウロジラチンを含む)は血管拡張および利尿特性を有し、心血管の恒常性において重要な役割を果たす(J. Cardiovasc. Pharmacol.、117巻:1600〜06頁(1998年);Kidney Int.、49巻:1732〜37頁(1996年);Am.J. Physiol.、275巻:H1826〜1833頁(1998年))。CNPは、心血管系において広範囲に分布し、特に、血管内皮細胞において高濃度である(J.Cardiovasc. Pharmacol.、117巻:1600〜06頁(1998年))。CNPは、血管平滑筋、特に冠循環においての強力な弛緩薬であり(Biochem.Biophys. Res. Commun.、205巻:765〜771頁(1994年))、平滑筋細胞増殖の阻害剤である(Biochem. Biophys.Res. Commun.、177巻:927〜931頁(1991年))。CNPの血管拡張効果はANPの血管拡張効果より低いが(約1:100)(Hypertens.Res.、21巻:7〜13頁(1998年)、Am. J. Physiol.、275巻:L645〜L652頁(1998年))、CNPmRNAはせん断応力に対する応答において増加し(FEBSLett.、373巻:108〜110頁(1995年))、CNPの血漿レベルは、炎症性心血管病理において上昇する (Biochem. Biophys. Res.Commun.、198巻:1177〜1182頁(1994年))。CNPは、ウサギの負傷した頸動脈においてマクロファージの侵入の阻害を介して炎症を抑制し(Circ.Res.、91巻:1063〜1069頁(2002年))、NPR−B/cGMP−依存性経路を介して心臓線維芽細胞増殖を直接阻害する(Endocrinology、144巻:2279〜2284頁(2003年))ことが示されている。
CNPの心血管作用は、NPRサブタイプ、NPR−BおよびNPR−Cの活性化を介して仲介され(Endocrinology、130巻:229〜239頁(1992年))、後者はin vivoで発現されるNPRの95%を占める(Science、293巻:1657〜1662頁(2001年))。CNP/NPR−B経路は、心血管系の安定した第2メッセンジャーであるcGMPの上昇をもたらす。C末端由来のNPR−Cの37−アミノ酸部分は、ヘテロ三量体のGタンパク質Giと相互作用するコンセンサス配列を有し(J.Biol. Chem.、274巻:17587〜17592頁(1999年))、これはアデニル酸シクラーゼおよびホスホリパーゼCの活性を制御することが示されている(J.Biol. Chem.、276巻:22064〜70頁(2001年);Am. J. Physiol.、278巻:G974〜980頁(2000年);J.Biol. Chem.、271巻:19324〜19329頁(1996年))。CNPは、NPR−Cの活性化を介して、平滑筋の過分極および弛緩ならびにGタンパク質により制御された、内部修正K+チャネルの開放を仲介する(Proc.Natl. Acad. Sci. USA、100巻:1426〜1431頁(2003年))。同様に、CNPは、心臓線維芽細胞において重要な抗増殖効果を有し、NPR−Cとの相互作用を介して、平滑筋細胞の過分極化によって局所血流および全身血圧を制御する(R.Rose and W. Giles, J. Physiol.586巻:353〜366頁(2008年))。
血管平滑筋細胞上のNPR−Bと結合することによって、CNP22は、cGMP産生を刺激し、cGMPは、細胞内第2メッセンジャーとして作用し、最終的に血管の弛緩を引き起こす。CNPの降圧作用に基づいて、本発明CNP変異体は、高血圧、鬱血性心不全、心臓性浮腫、腎性浮腫、肝性浮腫、急性および慢性の腎不全などの治療にとって有用である可能性がある。さらに、cGMPシグナル伝達の活性化は、血管平滑筋細胞の成長を抑制する。したがって、本発明のCNP変異体は、限定するものではないが、再狭窄および動脈硬化を含む、血管平滑筋細胞の異常成長による病態および疾患の治療に使用できる可能性がある。
上記の研究は、CNPが血管平滑筋弛緩およびリモデリングのための治療候補であり得る可能性を示唆している。特定の障害に関するCNPの薬理学的効果は、一部、血管拡張活性ではなく血管保護効果に起因すると考えられている(Am. J. Respir. Crit. Care Med.、170巻:1204〜1211頁(2004年))。したがって、本発明のCNP変異体は、病態、例えば、CNPが、限定するものではないが、平滑筋弛緩の誘導および心臓組織へのマクロファージの侵入の阻害を含む血管保護効果を有すると思われる、血管平滑筋障害の治療に使用し得る可能性がある。一実施形態において、CNP変異体は、限定するものではないが、急性非代償性心不全および急性鬱血性心不全を含む心不全の治療に使用される。
CNP変異体の医薬組成物
本発明のさらなる実施形態は、有効量のCNP変異体、場合により別の生理活性物質ならびに1種または複数種の医薬的に許容可能な賦形剤、希釈剤、安定剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび/または担体を含む医薬組成物を対象とする。このような組成物は、様々な緩衝液内容(例えば、Tris−HCl、リン酸塩)、pHおよびイオン強度の希釈剤;添加剤、例えば、界面活性剤および可溶化剤(例えば、Polysorbate20、Polysorbate80)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存料(例えば、Thimerosol、ベンジルアルコール)および充填物質(例えば、ラクトース、マンニトール)を含むことができる。医薬組成物の製剤における賦形剤、希釈剤、担体などの使用は、当分野において公知である;例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、1435〜1712頁、Mack PublishingCo.(Easton、Pennsylvania(1990年))を参照されたく、これは参照によりその全体を本明細書に援用される。有効量の活性成分は、治療的に、予防的にまたは診断的に有効な量であり、これは、体重、年齢および治療の目的などの因子を考慮に入れることによって、当業者により容易に決定できる。
本発明のさらなる実施形態は、有効量のCNP変異体、場合により別の生理活性物質ならびに1種または複数種の医薬的に許容可能な賦形剤、希釈剤、安定剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび/または担体を含む医薬組成物を対象とする。このような組成物は、様々な緩衝液内容(例えば、Tris−HCl、リン酸塩)、pHおよびイオン強度の希釈剤;添加剤、例えば、界面活性剤および可溶化剤(例えば、Polysorbate20、Polysorbate80)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存料(例えば、Thimerosol、ベンジルアルコール)および充填物質(例えば、ラクトース、マンニトール)を含むことができる。医薬組成物の製剤における賦形剤、希釈剤、担体などの使用は、当分野において公知である;例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、1435〜1712頁、Mack PublishingCo.(Easton、Pennsylvania(1990年))を参照されたく、これは参照によりその全体を本明細書に援用される。有効量の活性成分は、治療的に、予防的にまたは診断的に有効な量であり、これは、体重、年齢および治療の目的などの因子を考慮に入れることによって、当業者により容易に決定できる。
CNP変異体を含む組成物は、所望の範囲内の溶液のpHを維持するために、さらに緩衝剤も含むことができる。例示的剤は、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを含む。これらの緩衝剤の混合物もまた使用できる。組成物に有用な緩衝剤の量は、使用する特定の緩衝液および溶液の所望のpHに大きく依存する。例えば、酢酸塩は、pH6よりもpH5においてより有効であり、したがって、pH5の溶液は、pH6の溶液より使用量を少なくできる。一実施形態において、本発明の組成物のpH範囲は、約pH3から約pH7.5である。
本発明の組成物は、溶液を等張のより注射に適合した状態にするために、等張性調整剤をさらに含むことができる。ある実施形態において、この物質は、0〜150mMの範囲の濃度内の塩化ナトリウムである。
本明細書に記載の治療方法は、CNP変異体ならびに1種または複数種の医薬として許容可能な賦形剤、希釈剤、担体および/または媒体、ならびに場合により他の治療および/または予防成分を含む医薬組成物を使用する。賦形剤の限定されない例は、例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸,エタノール、シクロデキストリン、改変シクロデキストリン(すなわち、スルホブチルエーテルシクロデキストリン)などの液体を含む。非液体製剤用の適切な賦形剤もまた、当業者に公知である。
医薬として許容可能な塩を本発明の組成物に使用でき、例えば、無機酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、など、ならびに有機酸塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、などを含む。医薬として許容可能な賦形剤および塩の徹底的な考察は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing Company、(Easton、Pennsylvania(1990年))において入手可能である。
補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、生理的緩衝化物質、界面活性剤などは、媒体中に存在させることもできる。生理的緩衝液は、薬理学的に許容可能であり、所望のpH、すなわち生理的に許容可能な範囲のpHの製剤を提供する、実際上任意の溶液であってよい。緩衝液の例は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、Tris緩衝化生理食塩水、Hank緩衝生理食塩水などを含む。
医薬組成物は、組成物の所望の投与様式に合わせることができる。経口投与に関しては、組成物は、錠剤、カプセルまたはソフトゲルカプセルの形態をとることができ、あるいは水性または非水性の溶液、懸濁液またはシロップであってよい。経口投与用の錠剤およびカプセルは、一般的に使用される1種または複数種の担体、例えばラクトースおよびコーンスターチを含むことができる。ステアリン酸マグネシウムまたはフマル酸ステアリルナトリウムなどの平滑剤もまた添加できる。液体懸濁液を使用する場合、活性成分は、乳化剤および懸濁化剤と混合できる。所望であれば、香味剤、着色剤および/または甘味剤もまた、固体製剤および液体製剤に添加できる。経口製剤に組み込むための他の任意選択の成分は、限定するものではないが、保存料、懸濁化剤、増粘剤などを含む。
固体組成物に関しては、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む。医薬的に投与可能な液体組成物は、例えば、活性物質および任意選択の医薬アジュバントを、賦形剤、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどに溶解、分散、懸濁し、溶液または懸濁液を形成することによって調製できる。所望であれば、医薬組成物は、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤、等張化剤などの微量の非毒性補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンラウリン酸モノエルテル、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンなどもまた、含有できる。固体および液体の剤形の調製方法は公知、または当業者には明らかであると思われる(例えば、上に参照したRemington's Pharmaceutical Sciencesを参照されたい)。
非経口製剤は、従来の形態、例えば、液体溶液または懸濁液、注射前に液体に溶液化または懸濁するために適切な固体形態あるいは乳化剤として調製できる。例えば、滅菌注射可能な懸濁液を、適切な担体、分散剤、湿潤剤、懸濁化剤などを使用して、当分野において公知の技術に従って製剤化できる。滅菌の注射可能な製剤は、非毒性、非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の、滅菌の注射可能な溶液または懸濁液であってよい。用いることができる許容可能な媒体および溶媒の1つは水、Ringer溶液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌の固定油、脂肪酸エステルおよび/またはポリオールを、溶媒または懸濁媒体として用いることができる。
本発明は、滅菌の注射可能な組成物を含む容器、例えば、バイアル、チューブ、ビンなどをさらに提供する。このような組成物を含むキットは、使用指示書および場合によりエアゾール分配装置、注射器および/または針などの分配装置をさらに含むことができる。一部の実施形態において、組成物は、注射器内に包装済である。
医薬組成物は、所望の期間、例えば、1週間、2週間または1ヶ月にわたって、比較的一定レベルの用量を維持するための徐放性、制御放出および持続放出系として処方できる。徐放性、制御放出または持続放出組成物は、例えば、生分解性ポリマー系を使用して調製でき、例えば、当分野において公知の微粒子の形態をとることができる。
用量
本明細書において使用する場合、活性物質(例えば、CNP変異体)の「治療有効量」という用語は、患者に治療的有用性を提供する量を指す。この量は、個人ごとに変化してよく、患者の全生理的状態を含む多くの因子に依存することができる。CNP変異体の治療有効量は、公的に入手可能な材料および手法を使用して、当業者により容易に確定できる。例えば、治療に使用するCNP変異体の量は、0〜17歳の軟骨無形成症の小児(214例の女児および189例の男児)に関する、年齢に対する身長、頭囲および部分的成長が記載された成長表に基づく成長の許容率が示されるべきである(Horton WA ら、Standard growth curves for achondroplasia, J. Pediatr.、93巻:435〜8頁(1978年))。CDC表は、年齢に対する体重および身長に対する体重または年齢に対するBMIを評価するために使用できる。事実上、より慢性である過程を有する二次的な結果もまた測定できる。
本明細書において使用する場合、活性物質(例えば、CNP変異体)の「治療有効量」という用語は、患者に治療的有用性を提供する量を指す。この量は、個人ごとに変化してよく、患者の全生理的状態を含む多くの因子に依存することができる。CNP変異体の治療有効量は、公的に入手可能な材料および手法を使用して、当業者により容易に確定できる。例えば、治療に使用するCNP変異体の量は、0〜17歳の軟骨無形成症の小児(214例の女児および189例の男児)に関する、年齢に対する身長、頭囲および部分的成長が記載された成長表に基づく成長の許容率が示されるべきである(Horton WA ら、Standard growth curves for achondroplasia, J. Pediatr.、93巻:435〜8頁(1978年))。CDC表は、年齢に対する体重および身長に対する体重または年齢に対するBMIを評価するために使用できる。事実上、より慢性である過程を有する二次的な結果もまた測定できる。
野生型CNP22より長い血清半減期を有するので、CNP変異体は、CNP22より投与の頻度を少なくできる可能性がある。特定の個人のための投与頻度は、治療すべき障害ならびに治療に対する個人の病態および応答を含む様々な因子に依存して変えることができる。特定の実施形態において、CNP変異体を含有する医薬組成物は、1日に約1回、2日に1回、3日に1回または週に1回対象に投与される。一実施形態において、骨関連障害(例えば、軟骨無形成症を含む骨格形成異常)の治療のために、CNP変異体の毎日の用量または毎週の用量を、成人になるまで、および/または成人の間、患者に投与する。
本明細書に記載のCNP変異体を、治療有効用量で患者に投与し、骨関連障害(例えば、軟骨無形成症を含む骨格形成異常)および病態(例えば、血管平滑筋障害)を、治療、改善または予防でき、CNPは、血管保護効果を提供できる。CNP変異体の安全性および治療効力は、細胞培養または実験動物において標準的な薬理学的手法によって、例えば、LD50(集団の50%が致死する用量)およびED50(集団の50%に治療的に有効な用量)を決定することによって決定できる。毒性と、治療効果との用量比は、治療指数であり、LD50/ED50比として表される。高い治療指数を示す活性物質が、普通好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを使用して、ヒトにおいて使用する用量範囲を処方できる。容量は、普通、ED50を含み、毒性がほとんどないまたは最小である循環濃度の範囲内にある。用量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変化する可能性がある。治療有効用量は、細胞培養アッセイおよび動物実験から決定できる。
投与方法
CNP変異体またはそれらを含む医薬組成物は、様々な方法、例えば、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または髄腔内に注射によって、対象に投与できる。ある実施形態において、CNP変異体は、単一の皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または髄腔内の注射を1日に1回投与される。CNP変異体は、疾患部位に、またはその近くに直接注射によってもまた、投与できる。さらに、CNP変異体は、作用の標的部位(例えば、異常または異形成の骨)にデポーを埋め込むことによって投与できる。代替的には、CNP変異体は、舌下(例えば、舌下錠)または肺への吸入(例えば、吸入器またはエアゾールスプレー)によって、鼻腔への送達(例えば、鼻腔内スプレー)によって、眼への送達(例えば、点眼薬)によって、または経皮送達(例えば、皮膚へのパッチを用いて)によって投与できる。CNP変異体は、マイクロスフェア、マイクロカプセル、リポソーム (非荷電、または荷電した(例えば、カチオン性))、ポリマー微粒子(例えば、ポリアミド)、マイクロエマルジョンなどの形態でも経口投与できる。組成物が他の様式でも投与できることは当業者には明らかであり、組成物の最も有効な様式の決定は、当業者の範囲内である。
CNP変異体またはそれらを含む医薬組成物は、様々な方法、例えば、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または髄腔内に注射によって、対象に投与できる。ある実施形態において、CNP変異体は、単一の皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または髄腔内の注射を1日に1回投与される。CNP変異体は、疾患部位に、またはその近くに直接注射によってもまた、投与できる。さらに、CNP変異体は、作用の標的部位(例えば、異常または異形成の骨)にデポーを埋め込むことによって投与できる。代替的には、CNP変異体は、舌下(例えば、舌下錠)または肺への吸入(例えば、吸入器またはエアゾールスプレー)によって、鼻腔への送達(例えば、鼻腔内スプレー)によって、眼への送達(例えば、点眼薬)によって、または経皮送達(例えば、皮膚へのパッチを用いて)によって投与できる。CNP変異体は、マイクロスフェア、マイクロカプセル、リポソーム (非荷電、または荷電した(例えば、カチオン性))、ポリマー微粒子(例えば、ポリアミド)、マイクロエマルジョンなどの形態でも経口投与できる。組成物が他の様式でも投与できることは当業者には明らかであり、組成物の最も有効な様式の決定は、当業者の範囲内である。
投与の意図される様式に依存して、医薬組成物は固体、半固体または液体の剤形、例えば、錠剤、坐薬、丸薬、カプセル、散剤、液体、懸濁液、クリーム、軟膏、ローションなどの、好ましくは、正確な用量の単回投与に適切な単位剤形の形態であり得る。組成物は、有効量のCNP変異体および1種または複数種の医薬として許容し得る賦形剤、担体または希釈剤(例えば、緩衝液)を含み、場合により、他の原料、例えば、アジュバントなどを含むことができる。CNP変異体に加えて、組成物は、場合により、別の活性物質をさらに含むことができ、これはCNP変異体の効果を増強できるか、またはCNP変異体の薬理学的効果に加えて他の薬理学的効果を発揮できる。
一般的に、CNP変異体は、経口(頬および舌下を含む)、直腸内、鼻腔内、局所、肺内、膣内または非経口(筋肉内、動脈内、髄腔内、皮下および静脈内を含む)投与に適切な医薬製剤を含む医薬製剤として、あるいは吸入または吹入による投与に適切な形態で投与できる。投与の一方法は、簡便な毎日または毎週の投与計画を使用する皮下投与であり、これは苦痛の度合いに従って調整できる。投与のさらなる方法は、浸透圧ポンプまたはミニポンプによる投与であり、これにより医薬製剤を所定の期間にわたって調節された連続送達ができる。
投与のさらなる方法は、浸透圧ポンプ(例えば、Alzetポンプ)またはミニポンプによる投与であり、これにより医薬製剤を所定の期間にわたって調節された連続送達ができる。浸透圧ポンプまたはミニポンプは、皮下または標的部位(例えば、手足の長骨、骨端など)の近くに埋め込むことができる。
上に説明したように、CNP変異体は、限定するものではないが、再狭窄および動脈硬化を含む、血管平滑筋細胞の異常成長により引き起こされる病態および疾患の治療に使用できる可能性がある。CNP変異体を疾患にかかった体内の管(例えば、血管)に局所送達するために、CNP変異体は、疾患部位に埋め込まれた医療装置(例えば、ステント)を用いて送達できる。一実施形態において、CNP変異体を、ポリマーマトリックスまたはステント上のポリマーコーティング中に含浸させる。別の実施形態において、CNP変異体は、ステントの本体内に形成された容器またはチャネルに含有され、CNP変異体が拡散できる多孔質ポリマー膜または層により覆われる。当分野において公知のように、ポリマーマトリックス、コーティング、膜または層は、少なくとも1種の生分解性(例えば、親水性)ポリマーを含むことができる。さらなる実施形態において、CNP変異体は、ステントの本体の微小孔に含有され得る。CNP変異体は、バースト放出、パルス放出、制御放出または持続放出あるいはそれらの組合せによって、ステントから送達され得る。例えば、ステントは、CNP変異体を疾患部位にバースト放出によって局所的に送達し、その後持続放出が続く。持続放出は、約2週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月または1年までの期間にわたることができる。
併用治療
一実施形態において、CNP変異体は治療に有用な1種または複数種の他の活性物質を組み合わせて使用して、例えば、骨関連障害(例えば、骨格形成異常)および血管平滑筋障害などのCNP応答性病態または障害を改善または予防できる。他の活性物質は、CNP変異体の効果を増強でき、またはCNP変異体の効果に加えて、他の薬理学的効果を発揮できる。本明細書に記載のCNP変異体と組み合わせて使用できる活性物質の限定されない例は、他のナトリウム利尿ペプチド(例えば、BNP)およびペプチダーゼ(例えば、NEPおよびフューリン)、NPR−Cおよびチロシンキナーゼ(例えば、FGFR−3)の阻害剤(例えば、拮抗薬)である。CNP変異体のNEP切断を予防することによって、NEP阻害剤は変異体の半減期を増加できる。NEP阻害剤の例は、限定するものではないが、チオルファンおよびカンドキサトリルを含む。NPR−C阻害剤の同時使用もまた、NPR−Cによる変異体のクリアランスの阻害を介してCNP変異体の半減期を増加できる。NPR−C阻害剤の限定されない例は、断片FGIPMDRIGRNPR(配列番号82)であり、これは、FGIPMDRIGRNPR−CNP22キメラ(類似体CZ)(配列番号82)またはCNP22の変異体(例えば、CNP22に関してアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含有する変異体)を含む類似のキメラのタンパク質分解切断についての標的部位(例えば、骨成長板)において放出される。チロシンキナーゼ阻害剤の同時使用は、軟骨細胞および骨成長の負の制御因子であるチロシンキナーゼ受容体FGFR−3を阻害することによって、CNP療法の効果を強化することができる。チロシンキナーゼ阻害剤の限定されない例は、米国特許第6,329,375号および第6,344,459号に開示されたチロシンキナーゼ阻害剤を含む。
一実施形態において、CNP変異体は治療に有用な1種または複数種の他の活性物質を組み合わせて使用して、例えば、骨関連障害(例えば、骨格形成異常)および血管平滑筋障害などのCNP応答性病態または障害を改善または予防できる。他の活性物質は、CNP変異体の効果を増強でき、またはCNP変異体の効果に加えて、他の薬理学的効果を発揮できる。本明細書に記載のCNP変異体と組み合わせて使用できる活性物質の限定されない例は、他のナトリウム利尿ペプチド(例えば、BNP)およびペプチダーゼ(例えば、NEPおよびフューリン)、NPR−Cおよびチロシンキナーゼ(例えば、FGFR−3)の阻害剤(例えば、拮抗薬)である。CNP変異体のNEP切断を予防することによって、NEP阻害剤は変異体の半減期を増加できる。NEP阻害剤の例は、限定するものではないが、チオルファンおよびカンドキサトリルを含む。NPR−C阻害剤の同時使用もまた、NPR−Cによる変異体のクリアランスの阻害を介してCNP変異体の半減期を増加できる。NPR−C阻害剤の限定されない例は、断片FGIPMDRIGRNPR(配列番号82)であり、これは、FGIPMDRIGRNPR−CNP22キメラ(類似体CZ)(配列番号82)またはCNP22の変異体(例えば、CNP22に関してアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含有する変異体)を含む類似のキメラのタンパク質分解切断についての標的部位(例えば、骨成長板)において放出される。チロシンキナーゼ阻害剤の同時使用は、軟骨細胞および骨成長の負の制御因子であるチロシンキナーゼ受容体FGFR−3を阻害することによって、CNP療法の効果を強化することができる。チロシンキナーゼ阻害剤の限定されない例は、米国特許第6,329,375号および第6,344,459号に開示されたチロシンキナーゼ阻害剤を含む。
併用治療において適切な治療結果を達成するために、所望の治療結果(例えば、骨成長の回復)を生み出すために有効な量で組み合わせたCNP組成物および他の治療薬を、一般に対象に投与するであろう。この過程は、CNP組成物および他の治療薬を同時に投与するステップを含むことができる。同時投与は、CNP変異体および他の治療薬の双方を含む単一組成物または薬理学的タンパク質製剤を投与することによって達成することができる。代替的には、他の治療薬を、CNP変異体の薬理学的製剤(例えば、錠剤、注射または飲み物)とほぼ同時に別々に摂取できる。CNP変異体はさらに、接種に適したブラウニー、パンケーキまたはケーキなどの食品に処方することもできる。
他の選択肢において、CNP変異体の投与は、数分から数時間の範囲の間隔で他の治療薬の投与の前後に実施できる。他の治療薬およびCNP組成物を別々に投与する実施形態において、一般的に、CNP変異体および他の治療薬の双方が、相乗的または相加的に、患者において有益な効果を発揮できるように、CNP変異体および他の治療薬を、互いに適切な時間内に投与することを確実にするであろう。例えば、CNP組成物を、他の治療薬の(前後)約0.5〜6時間内に投与できる。一実施形態において、CNP組成物を、他の治療薬の(前後)約1時間内に投与する。
患者集団の特定およびモニター
CNP療法に適切な対象を特定し、所与の患者がCNP療法に応答するかどうかを決定するプロトコルを確立できる。例えば、骨関連障害の治療のために、子宮内および新生児の長骨成長の測定ならびにCNP、cGMP、CollagenII、オステオカルシンおよび増殖性細胞核抗原(PCNA)などの骨成長のバイオマーカーの測定などの成長の指標を測定できる。
CNP療法に適切な対象を特定し、所与の患者がCNP療法に応答するかどうかを決定するプロトコルを確立できる。例えば、骨関連障害の治療のために、子宮内および新生児の長骨成長の測定ならびにCNP、cGMP、CollagenII、オステオカルシンおよび増殖性細胞核抗原(PCNA)などの骨成長のバイオマーカーの測定などの成長の指標を測定できる。
本発明の追加の態様および詳細は、以下の実施例により明らかであり、これらは限定ではなく例示目的である。
(実施例1)
CNP変異体の合成
CNP変異体を、本明細書に記載の方法を使用して調製した。表1〜3(実施例2に示す)に示すように、天然または非天然アミノ酸あるいはペプチド模倣体との置換を、CNP22の野生型配列のそれぞれのアミノ酸残基において実施した。特定の変異体において、さらなるアミノ酸を、野生型CNP22配列の全体または一部のN末端および/またはC末端に付加した(表3を参照されたい)。
CNP変異体の合成
CNP変異体を、本明細書に記載の方法を使用して調製した。表1〜3(実施例2に示す)に示すように、天然または非天然アミノ酸あるいはペプチド模倣体との置換を、CNP22の野生型配列のそれぞれのアミノ酸残基において実施した。特定の変異体において、さらなるアミノ酸を、野生型CNP22配列の全体または一部のN末端および/またはC末端に付加した(表3を参照されたい)。
さらに、PEG(またはPEO)部分がCNP22またはその変異体のN末端に接合されたCNP変異体を調製した(実施例2に示す表4を参照されたい)。PEG化試薬は、表5に示す商業的供給源から得ることができる。
CNP22またはその変異体をPEG化するために、反応条件および精製条件を、PEG−CNPの接合ごとに最適化する。一般的なPEG化手法に従って、反応混合物は、約1mMのCNP22またはその変異体および約1から5mMのNHS−活性化PEGを、pHが約5.0から6.5の間のリン酸カリウム緩衝液中に含有する。ペプチドのN末端において選択的にモノPEG化し、内部部位(例えば、CNP22のLys4)においてPEGを最小化するために、PEG化反応を、より酸性の条件下(例えば約5.5から6.5の間のpH)において実施し、リジン側鎖上のより塩基性の第一級アミノ基を選択的にプロトン化し、したがって非活性化することができる。室温において1〜3時間インキュベート後、水性グリシン緩衝液を加えることによって、PEG化反応を停止させる。その後、反応産物を、各PEG−CNP結合体に関して最適化した逆相HPLCによって分離する。分画試料を、スピードバックで乾燥させ、1mMのHCl中で再構成/製剤化する。各PEG−CNP産物の特定および純度は、液体クロマトグラフィー−質量分析(LC/MS)によって決定する。
(実施例2)
in vitroの中性エンドペプチダーゼによるCNP変異体の切断
中性エンドペプチダーゼ(NEP)切断に対するCNP変異体の感受性についての、アミノ酸置換、アミノ酸延長、骨格改変、側鎖改変およびPEG化の効果を決定するために、ペプチド切断アッセイを、非切断CNP変異体の消失をモニターしたin vitroアッセイを使用して実施した。
in vitroの中性エンドペプチダーゼによるCNP変異体の切断
中性エンドペプチダーゼ(NEP)切断に対するCNP変異体の感受性についての、アミノ酸置換、アミノ酸延長、骨格改変、側鎖改変およびPEG化の効果を決定するために、ペプチド切断アッセイを、非切断CNP変異体の消失をモニターしたin vitroアッセイを使用して実施した。
組換えヒトNEP(最終濃度1ug/mL)を、0.1M Tris、pH7で希釈した100uMのCNP変異体に加えた。反応混合物を、様々な時間の間37℃においてインキュベートし、EDTA(最終10mM)を用いて停止させ、その後熱変性させた。反応混合物を還元し、その後反応産物を、HPLCおよび質量分析を使用して分析した。CNP変異体の半減期を、時間に伴う完全なCNP変異体の消失に基づいて計算した。消化CNP変異体に関する結果を、平行したwtCNP22の消化と比較し、1mg/mLのNEPにより消化された100uMのCNP22に関する結果に対して正規化した(t1/2=80分)。
表1は、in vitroのNEP切断アッセイに基づいて、骨格または側鎖に改変を有する様々なCNP変異体の半減期を載せている。類似体Lの6つのNEP切断部位の3つを除去することにより、それにもかかわらず有意に短縮された半減期がもたらされる。NEP切断に対する最も優れた耐性は、類似体Nおよび類似体Mにより示され、類似体Nは、CNP22の22のアミノ酸すべてのD−光学異性体を含有し、類似体Mは、N−メチル化アミド結合をLeu9およびLeu11の双方に有する。しかし、類似体NおよびMの双方は、cGMP産生を刺激できなかった(下を参照されたい)。
類似体A、B、E、F、GおよびHに関して、半減期が類似体EおよびGより約1.5から約2.5倍長いことを決定した。これらの6種すべての類似体は、wtCNP22と比較して、Cys6−Phe7結合における切断に対する耐性または改善された耐性を示した(データ非掲載)。半減期に基づき、1ug/mlのNEPに対する類似体の耐性の順位は、類似体G(3−Cl−Phe)≧類似体E(D−Phe)>類似体H(「β−2Phe」)、類似体B(N−Me−Phe)および類似体F(t−Bu−Gly)=wtCNP22>類似体A(Cys−CH2−NH)である。類似体EおよびGは、wtCNP22と比較して約1.5倍長い半減期を有する。Cys6−Phe7結合の切断に対する耐性のほかに、類似体B、E、F、GおよびHは、1ug/mLNEPの存在下でGly8−Leu9結合の切断に対する耐性もまた示した(データ非掲載)。これらの結果は、Cys6およびGly8の間で骨格または側鎖に改変を有するCNP変異体は、Cys6−Phe7結合および/またはGly8−Leu9結合のNEP切断に対して耐性であり得るが、NEPに対する全体的耐性の改善またはCNP22より長い半減期は、必ずしも有していないことを示す。この結果は、NEPが、CNP22のCys6−Phe7結合を最初に切断し、その後他の場所を切断するという、文献の報告に反するように思われる。
図2は、N末端のアミノ酸延長を有するCNP変異体であるCNP37、CNP53およびCNP27(Arg4)(すなわち、GANRR−CNP22(K4R))のNEP耐性プロファイルを示す。明確に分かるように、CNP37およびCNP53の双方は、このin vitroアッセイにおいてNEP分解に対して耐性であったが、CNP27(Arg4)は、NEP加水分解に対してCNP22と同じ不安定性を有した。
図3は、N末端においてPEG(またはPEO)部分と接合されたCNP17およびCNP27(Arg4)のNEP耐性プロファイルを表す。CNP27(Arg4)のPEG化は、このCNP変異体のNEP耐性を非常に改善し、PEO24−CNP27(Arg4)は、160分間のアッセイの期間にわたってNEP切断に対して完全に耐性であった。約0.6kDa(PEO12)から約1.2kDa(PEO24)にPEO部分の質量が増加することにより、PEG化CNP27(Arg4)のNEP耐性は改善された。多分散PEG1K部分ではなく単分散PEO24部分にCNP27(Arg4)がPEG化されることにより、NEP耐性はさらに改善された。最終的に、PEO24−CNP27(Arg4)およびPEG2K−CNP17の双方は、同様の総質量を有するが(PEG2Kは多分散であることに留意されたい)、前者は、有意に優れたNEP耐性を表す。
(実施例3)
NIH3T3細胞におけるcGMP産生のCNP変異体による刺激
CNP変異体の機能活性を決定するために、GMPの産生を、CNP変異体に曝されたNIH3T3細胞において測定した。マウスNIH3T3細胞は、CNPシグナル伝達受容体のNPR−Bを内因的に発現し、これは、98%のタンパク質配列同一性をヒトNPR−Bと共有する。NIH3T3細胞を、10%ウシ胎児血清および抗生物質を添加した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地において、37℃で、5%CO2中で培養した。シグナル伝達の24から48時間前に、細胞を、12ウェルプレートに、2〜5×105細胞の密度/ウェルでアッセイ時に継代した。CNP変異体を、1mMHClに、ストック濃度1mg/mL(wtCNP22に関して455uM)に再懸濁し、次いでリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて、30uMの使用ストック溶液に希釈した。10倍連続希釈を、リン酸緩衝生理食塩水で調製した。培養培地を細胞から取り除き、0.75mMのイソブチルメチルキサンチンを含有する0.4mLのPBS/ダルベッコ改変イーグル培地(50/50、v/v)に置き換えた。プレートを37℃、5%CO2において15分間インキュベートし、その後、PBS中0.2mLのCNP変異体を添加し、37℃で、15分インキュベートを続けた。反応を、CatchPoint cGMPアッセイキット(Molecular Devices)で供給されている0.2mLの溶解緩衝液を加えることによって停止させ、cGMP産生をCatchPoint cGMP Assay(Molecular Devices)を用いて決定した。すべての刺激実験を2重に実施した。
NIH3T3細胞におけるcGMP産生のCNP変異体による刺激
CNP変異体の機能活性を決定するために、GMPの産生を、CNP変異体に曝されたNIH3T3細胞において測定した。マウスNIH3T3細胞は、CNPシグナル伝達受容体のNPR−Bを内因的に発現し、これは、98%のタンパク質配列同一性をヒトNPR−Bと共有する。NIH3T3細胞を、10%ウシ胎児血清および抗生物質を添加した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地において、37℃で、5%CO2中で培養した。シグナル伝達の24から48時間前に、細胞を、12ウェルプレートに、2〜5×105細胞の密度/ウェルでアッセイ時に継代した。CNP変異体を、1mMHClに、ストック濃度1mg/mL(wtCNP22に関して455uM)に再懸濁し、次いでリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて、30uMの使用ストック溶液に希釈した。10倍連続希釈を、リン酸緩衝生理食塩水で調製した。培養培地を細胞から取り除き、0.75mMのイソブチルメチルキサンチンを含有する0.4mLのPBS/ダルベッコ改変イーグル培地(50/50、v/v)に置き換えた。プレートを37℃、5%CO2において15分間インキュベートし、その後、PBS中0.2mLのCNP変異体を添加し、37℃で、15分インキュベートを続けた。反応を、CatchPoint cGMPアッセイキット(Molecular Devices)で供給されている0.2mLの溶解緩衝液を加えることによって停止させ、cGMP産生をCatchPoint cGMP Assay(Molecular Devices)を用いて決定した。すべての刺激実験を2重に実施した。
表1〜4は、それぞれ、骨格または側鎖のアミノ酸置換、N末端アミノ酸延長および/またはN末端PEG化改変を有するCNP変異体の、NIH3T3細胞においてcGMP産生を刺激する能力を要約している。4つの表すべてにおいて、10nMまたは1uMのCNP変異体に曝されたNIH3T3におけるcGMP産生に関する値を、1uMのwtCNP22の存在下の細胞数およびcGMP産生に対して正規化した。
表1の結果に関して、7位に3−Cl−Pheを有する類似体Gのみが、実質的に1uMのwtCNP22と同じNPR−B刺激活性を表した。表2に関しては、類似体BO、AB、BH、BK、BZ、BXおよびBRを含む、アミノ酸置換を有する様々なCNP変異体が、wtCNP22と実質的に類似のNPR−B刺激活性を示した。K4R置換を有する類似体AHが、wtCNP22より有意に優れたcGMP産生を刺激したことは、注目に値する。
表3の結果を考慮すれば、アミノ酸延長を含む、N末端および/またはC末端の改変を有する多くのCNP変異体は、wtCNP22に匹敵するNPR−B刺激活性を示す。機能性CNP変異体は、N末端においてヘプタン酸に結合したCNP22(G1E)である類似体BBおよびBNPのN末端およびC末端「テール」に接合したCNP22(Cys6からCys22の配列を保有する「CNP17」)の環状ドメインである類似体CDを含む。図4は、CNP27(Arg4)(すなわち、GANRR−CNP22(K4R))、CNP37およびCNP53はすべて、in vitroアッセイにおいてwtCNP22と同等のNPR−B刺激活性を有したことを例示している。
表3において注目すべきことは、CNPの機能性およびNEP耐性の双方に関して分析されたCNP変異体の中で、類似体AZ(R−CNP22(K4R))、類似体CA、類似体CB、類似体CC、類似体CF、類似体BL(CNP37)、類似体CE、類似体CSおよび類似体CD(N末端およびC末端にBNPテールを有するCNP17)はすべて、CNP22に匹敵するNPR−B刺激活性を有したが、CNP22よりNEP切断に対して耐性が高いことである。
表4の結果に関しては、1uMにおいて8種のN末端PEG化CNP変異体は、wtCNP22によって達成されるレベルの少なくとも70%にcGMP産生を刺激した。いくつかの興味深い態様が、表4に現れている。第1に、単分散PEOポリマー(PEO12は約0.6kDa、PEO24は約1.2kDaである)によるCNP27(Arg4)のN末端PEG化は、多分散PEGポリマー(PEG1Kは、ほぼ1kDaのポリマー数平均分子量(Mn)を有し、PEG2Kはほぼ2kDa)によるNPR−B機能性よりも有意に優れたNPR−B機能性をもたらした(さらに図5を参照されたい)。第2に、wtCNP22の、Mnの増加した多分散PEGポリマー(PEG1K、PEG2K、PEG5KおよびPEG20K)による、またはより質量の大きい単分散PEOポリマー(PEO12およびPEO24)によるN末端PEG化は、それに応じてCNP変異体のNPR−B活性化能力(さらに、図6を参照されたい)が減少した。第3に、N末端にGANRRの延長を有するPEO24−CNP27(Arg4)は、PEO24−CNP22およびPEO24−CNP22(K4R)より有意に優れたcGMP産生を刺激した。さらに注目すべきは、CNPの機能性およびNEP耐性の双方に関して分析されたN末端PEG化CNP変異体の中で、PEO12−R−CNP22(K4R)、PEO12−CNP27(Arg4)およびPEO24−CNP27(Arg4)はすべて、CNP22と実質的に同じNPR−B刺激活性を有するが、CNP22よりNEP分解に対してはるかに耐性が高いことである。
(実施例4)
NPR−A、NPR−BおよびNPR−Cに関する結合特異性
シグナル伝達競合アッセイ
クリアランス受容体のNPR−Cに関する、CNP変異体の結合特異性を決定するために、シグナル伝達競合アッセイを実施する。ヒトNPR−C(OriGeneより購入)のための発現プラスミドが、NIH3T3細胞において一時的に発現される。形質移入の24時間後、NIH3T3細胞を、実施例3に記載のNPR−B/cGMP刺激アッセイのために処理した。wtCNP22の添加により、内因性NPR−Bおよび一時的に発現したNPR−Cの双方に結合することが予想され、cGMP産生の減少および用量反応曲線の右へのシフトがもたらされる。NPR−Cに対する親和性が低下したCNP変異体は、用量反応曲線においてシフトを誘導しないこと、またはより小さいシフトを誘導することが予想される。
NPR−A、NPR−BおよびNPR−Cに関する結合特異性
シグナル伝達競合アッセイ
クリアランス受容体のNPR−Cに関する、CNP変異体の結合特異性を決定するために、シグナル伝達競合アッセイを実施する。ヒトNPR−C(OriGeneより購入)のための発現プラスミドが、NIH3T3細胞において一時的に発現される。形質移入の24時間後、NIH3T3細胞を、実施例3に記載のNPR−B/cGMP刺激アッセイのために処理した。wtCNP22の添加により、内因性NPR−Bおよび一時的に発現したNPR−Cの双方に結合することが予想され、cGMP産生の減少および用量反応曲線の右へのシフトがもたらされる。NPR−Cに対する親和性が低下したCNP変異体は、用量反応曲線においてシフトを誘導しないこと、またはより小さいシフトを誘導することが予想される。
代替的には、NPR−A、NPR−BおよびNPR−Cに対するCNP変異体の相対的親和性は、シグナル伝達競合アッセイにおいて決定される(米国特許第5,846,932号;B. Cunningham、EMBO J.13巻(11号):2508〜2515頁(1994年);H. Jinら、J. Clin.Invest. 98巻(4号):969〜976頁(1996年))。HEK293T細胞または適切に形質移入可能な別の細胞系(例えば、HeLa細胞、HEK293細胞など)に、NPR−A(OriGene)またはNPR−B(標準的分子生物学技術を用いて、pcDNA3.1にクローン化されたcDNA(Invitrogen))のための発現プラスミドを、NPR−C(OriGene)と共に、またはNPR−C(OriGene)なしで一時的に形質移入する。
NPR−A、NPR−BおよびNPR−Cに対する結合親和性(Ki)の決定
NPR−A、NPR−BおよびNPR−Cに対するCNP変異体の結合親和性(Ki)を、異種競合結合アッセイにおいて決定する(米国特許第5,846,932号;B. Cunningham、EMBO J.13巻(11号):2508〜2515頁(1994年);H. Jinら、J. Clin.Invest. 98巻(4号):969〜976頁(1996年))。ヒトNPR−A、NPR−BまたはNPR−Cを発現するHEK293細胞由来または適切に形質移入可能な別の細胞系(例えば、HeLa細胞)の膜を、放射標識リガンド結合アッセイのために調製する。膜の調製物を適切な緩衝液中で希釈し、濃度を変えたwtCNP22またはCNP変異体(競合因子)をI125標識wtCNP22(Bachem)に加える。試料を室温でインキュベートし、リガンド/受容体を平衡させ、結合ペプチドを、PVDFフィルター膜を介したろ過によって遊離のペプチドから分離する。フィルターを洗浄し、その後シンチラント(scintillant)を加え、シンチレーションカウンターにより計測する。結合は、競合因子ペプチドの各濃度に関して二重に測定した。CNP変異体の親和性(Ki、平衡解離定数)およびBmax(受容体数)を、非線形回帰分析および/またはCheng−Prusoffの式により計算する。
NPR−A、NPR−BおよびNPR−Cに対するCNP変異体の結合親和性(Ki)を、異種競合結合アッセイにおいて決定する(米国特許第5,846,932号;B. Cunningham、EMBO J.13巻(11号):2508〜2515頁(1994年);H. Jinら、J. Clin.Invest. 98巻(4号):969〜976頁(1996年))。ヒトNPR−A、NPR−BまたはNPR−Cを発現するHEK293細胞由来または適切に形質移入可能な別の細胞系(例えば、HeLa細胞)の膜を、放射標識リガンド結合アッセイのために調製する。膜の調製物を適切な緩衝液中で希釈し、濃度を変えたwtCNP22またはCNP変異体(競合因子)をI125標識wtCNP22(Bachem)に加える。試料を室温でインキュベートし、リガンド/受容体を平衡させ、結合ペプチドを、PVDFフィルター膜を介したろ過によって遊離のペプチドから分離する。フィルターを洗浄し、その後シンチラント(scintillant)を加え、シンチレーションカウンターにより計測する。結合は、競合因子ペプチドの各濃度に関して二重に測定した。CNP変異体の親和性(Ki、平衡解離定数)およびBmax(受容体数)を、非線形回帰分析および/またはCheng−Prusoffの式により計算する。
(実施例5)
ラット軟骨肉腫(RCS)細胞の成長およびRCS細胞におけるcGMP産生についてのCNP変異体の効果
骨成長を刺激するCNP変異体の能力を評価するために、ラット軟骨肉腫(RCS)細胞を線維芽細胞増殖因子2(FGF−2)により治療することによって、細胞培養において骨格形成異常を刺激し、線維芽細胞増殖因子2は、線維芽細胞増殖因子受容体3(FGFR−3)を活性化し、成長の停止を誘導する(Krejci ら、J. Cell Sci.、118巻(21号):5089〜5100頁(2005年))。
ラット軟骨肉腫(RCS)細胞の成長およびRCS細胞におけるcGMP産生についてのCNP変異体の効果
骨成長を刺激するCNP変異体の能力を評価するために、ラット軟骨肉腫(RCS)細胞を線維芽細胞増殖因子2(FGF−2)により治療することによって、細胞培養において骨格形成異常を刺激し、線維芽細胞増殖因子2は、線維芽細胞増殖因子受容体3(FGFR−3)を活性化し、成長の停止を誘導する(Krejci ら、J. Cell Sci.、118巻(21号):5089〜5100頁(2005年))。
最適なCNP治療のパラメーターは、CNP濃度(0.05、0.1、0.2および0.5uM)ならびに治療期間および間隔(連続;1日1回、2.5分、10分、30分、1時間、2時間、4時間、および8時間、;1日2回、2.5分、10分、30分、1時間、2時間、および4時間)を変えることによって決定される。72時間後、細胞を、自動細胞計測器を使用して計測し、細胞外マトリックスの量を、アルシアンブルー染色を使用して評価する。
その後、wtCNP22を用いた成長実験により決定された最適条件を使用して、RCS細胞をCNP変異体で処理する。cGMPの濃度を、未処理RCS細胞、CNPで処理したRCS細胞およびCNP変異体で処理したRCS細胞に関して、競合ELISAによって測定する。CNP変異体による処理によりもたらされた細胞成長およびマトリックスの合成をさらにモニターし、CNP処理によりもたらされた細胞成長およびマトリックスの合成と比較する。
ヒト細胞培養系におけるCNP変異体の効果を評価するために、アルギン酸ビーズ中の初代再分化ヒト軟骨細胞を、wtCNP22およびCNP変異体を用いて処理し、cGMP濃度を、有効なCNPシグナル伝達の指標として競合的ELISAによって決定する。
本明細書に記載の方法は、in vitroのcGMP産生およびラット軟骨肉腫細胞の成長を刺激する、CNP変異体の能力を評価するために用いることができる。
(実施例6)
ラット軟骨肉腫細胞における用量反応研究
軟骨細胞成長の負の制御因子であるチロシンキナーゼ受容体線維芽細胞増殖因子受容体3(FGFR−3)は、軟骨無形成症対象において構成的に作用している。ラット軟骨肉腫(RCS)細胞を線維芽細胞増殖因子2(FGF−2)に連続して曝すことで、FGFR−3を活性化することおよび増殖の停止を誘導することによって、細胞培養における軟骨無形成症を刺激する(Krejciら、J. Cell Sci.、118巻(21号):5089〜5100頁(2005年))。CNP変異体の用量および骨細胞の十分な成長を刺激する投与の頻度を決定するために、用量反応研究を、実施例5に記載のRCS細胞アッセイを使用して実施した。
ラット軟骨肉腫細胞における用量反応研究
軟骨細胞成長の負の制御因子であるチロシンキナーゼ受容体線維芽細胞増殖因子受容体3(FGFR−3)は、軟骨無形成症対象において構成的に作用している。ラット軟骨肉腫(RCS)細胞を線維芽細胞増殖因子2(FGF−2)に連続して曝すことで、FGFR−3を活性化することおよび増殖の停止を誘導することによって、細胞培養における軟骨無形成症を刺激する(Krejciら、J. Cell Sci.、118巻(21号):5089〜5100頁(2005年))。CNP変異体の用量および骨細胞の十分な成長を刺激する投与の頻度を決定するために、用量反応研究を、実施例5に記載のRCS細胞アッセイを使用して実施した。
RCS細胞を、24ウェルプレートに、10×103細胞/ウェルで播種し、24時間増殖させ、72時間処理し、その後計測した。RCS細胞を、FGF−2(5ng/mL)に連続して曝し、構造的活性化FGFR−3を刺激し、これは、細胞増殖の停止を誘導する(図7の、5番目の棒グラフを参照されたい)。野生型CNP22(0.2uM)を、毎日1時間または毎日2時間連続培養した(72時間)。全刺激物質は毎日交換した。RCS細胞を、5.0ng/mLのFGF−2の存在下で0.2uMのCNP22に連続して曝すことにより、FGF2誘導性増殖停止が部分的に逆転し、CNP22の不在下でおよそ100×103細胞/ウェル(図7の5番目の棒グラフ)と比較して、およそ200×103細胞/ウェル(図7の6番目の棒グラフ)の細胞増殖をもたらす。
1日に1回、1時間のCNP22(0.2uM)曝露、および1日に1回、2時間のCNP22(0.2uM)曝露は双方とも軟骨細胞成長についての連続CNP22(0.2uM)曝露の効果の約84%を達成した(図7の7番および8番目の棒グラフ)。これらの結果は、増殖停止軟骨細胞のCNP22への連続曝露は、細胞増殖停止の逆転には必要ないことを実証する。さらに、細胞外マトリックスの組織学的分析および細胞形態分析は、CNP22処理が、軟骨肉腫細胞外マトリックスのFGF2により仲介された損失を無効にし、マトリックス合成を増加することを示した(データ非掲載)。
類似の用量反応研究を、本明細書に記載のCNP変異体を用いて実施し、RCS細胞のFGF2誘導性増殖停止を逆転するためのそれらの有効用量を決定できる。
(実施例7)
頸骨および大腿骨の成長の刺激についてのEx Vivo研究
マウス頸骨器官培養モデルは、骨の縦成長を刺激する野生型CNP22の有効性を実証するために使用されている。野生型頸骨を、10−8、10−7または10−6MのCNP22で6日間処理することにより、それぞれ縦成長が31%、40%および42%増加した。組織学的評価は、さらに肥大部位の膨張、例えば、成長板中の肥大軟骨細胞の数およびサイズの増加もまた示した(Agoston ら、BMC Dev. Biol.7巻:18頁(2007年))。同様の発見が、FGFR3Achマウスから単離された頸骨において観察された(Yasodaら、Nat. Med.10巻:80〜86頁(2004年))。
頸骨および大腿骨の成長の刺激についてのEx Vivo研究
マウス頸骨器官培養モデルは、骨の縦成長を刺激する野生型CNP22の有効性を実証するために使用されている。野生型頸骨を、10−8、10−7または10−6MのCNP22で6日間処理することにより、それぞれ縦成長が31%、40%および42%増加した。組織学的評価は、さらに肥大部位の膨張、例えば、成長板中の肥大軟骨細胞の数およびサイズの増加もまた示した(Agoston ら、BMC Dev. Biol.7巻:18頁(2007年))。同様の発見が、FGFR3Achマウスから単離された頸骨において観察された(Yasodaら、Nat. Med.10巻:80〜86頁(2004年))。
骨の縦成長を刺激するCNP変異体の有効性を決定するために、CNP変異体を、野生型およびFGFR3wt/Ach(ヘテロ結合体)マウスにおいて軟骨内骨成長のマウス器官培養モデルで試験した。手短に言うと、野生型CNP22およびCNP変異体の薬理学的活性を、野生型およびFGFR3wt/Ach同腹子から単離した胎児または新生児マウスの頸骨の器官培養モデルにおいて比較する。全体の骨成長および成長板内の組織学的変化を評価する。馴化培養培地を、CNPならびに細胞内シグナル伝達(cGMP)、軟骨代謝(II型コラーゲン、他のコラーゲン、アグリカン、硫酸コンドロイチン)、骨代謝(骨アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、I型コラーゲン[C−テロペプチド、N−テロペプチド])および炎症(インターロイキン−1、インターロイキン−6、インターロイキン−11)のバイオマーカーに関して評価する。さらに野生型CNP22の様々な処理計画の効果を比較し、骨の縦成長を増強するための最適な条件を決定する。
有効なCNP変異体を、cGMP産生および骨の縦長の増加および成長板の肥大帯における細胞の膨張により測定される、骨成長を刺激するそれらの能力により同定する。
大腿骨の縦成長を刺激するwtCNP22、CNP37およびPEO24−CNP27(Arg4)(すなわち、PEO24−GANRR−CNP22(K4R))の有効性を、マウス器官培養モデルにおいて評価した。これらの実験のために、大腿骨を2〜3日齢の野生型マウスから単離し、0.2%のBSA、0.5mMのL−グルタミン、40単位のペニシリン/mLおよび40ugストレプトマイシン/mLを補給したαMEMにおいて8日間、ビヒクル、CNP22またはCNP変異体の存在下で培養した。処理は0日目から開始し、その後2日ごとに、培地を変えることで繰り返した。骨を処理前およびその後2日ごとに、1cmの接眼レンズ網目を取り付けた解剖用顕微鏡を使用して測定した。馴化培地を、バイオマーカー分析に使用した。8日目に、骨を、4%のパラホルムアルデヒド中で24時間固定し、5%のギ酸中で24時間脱灰し、パラフィン中で脱水および包埋した。骨を、5um(ミクロン)に切片化し、次いでこれを脱パラフィン化、再水和し、アルシアンブルーで30分間(pH2.5;MasterTech)およびファン−ギーソン(EM Sciences)で5分間染色した。アルシアンブルーは軟骨を青く染色し、ファン−ギーソンは類骨(非石灰化骨)を赤く染色する。染色した切片を、明視野顕微鏡により視覚化し、写真撮影した。成長板軟骨の肥大領域の厚さを、画像分析により決定した。
図8は、CNPペプチドを用いて2日ごとに処理した、3日齢の野生型大腿骨の縦成長についてのwtCNP22、CNP37およびPEO24−CNP27(Arg4)の効果を例示している。結果を、処理前の測定結果(0日目)に対して正規化した。この研究は、3重(媒体)または4重(CNPペプチド)に実施した。図8に示すように、CNP37およびPEO24−CNP27(Arg4)ならびにCNP22が、大腿骨の縦成長を刺激することにおいて有効であり、N末端PEG化CNP変異体が最も有効であった。
(実施例8)
in vitroのCNP変異体の血清/血漿における安定性
薬物動態(PK)研究のための調製において、血清および/または血漿におけるCNP変異体の安定性を評価する。
in vitroのCNP変異体の血清/血漿における安定性
薬物動態(PK)研究のための調製において、血清および/または血漿におけるCNP変異体の安定性を評価する。
簡潔に言うと、検体を、2%トリクロロ酢酸沈殿または1:3の血清:アセトニトリル沈殿のいずれかによって、血清または血漿のタンパク質を除去することによって単離する。沈降混合物を、14,000rpmで5分間ボルテックスにかけ、上清部分を除去し、水で希釈し、その後分析用のシラン処理したオートサンプラーバイアルに移す。次いで、血清抽出物を、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)およびエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI−MS)により分析する。CNP変異体に関して特異的であることが示された、単一質量(m/z)を、定量目的でモニターする。
まず、分析安定性および回収率を決定する。分析(RP−HPLCおよびESI−MS)パラメーターを、マトリックス標準(検体の後期沈殿により強化された血清抽出物)の分析を介して最適化する。最適化後、分析回収率を、公知の濃度の血清試料をスパイクし、検体反応と、同様の濃度で調製したマトリックス標準の反応とを比較することによって決定する。血清抽出物中の検体安定性をさらに決定し、血清沈殿の後および実際の分析の前に有意な損失がないことを確実にする。血清安定性についての凍結の効果を試験するために、2周期の凍結/解凍研究もまた実施する。この研究において、血清試料を、CNP変異体をスパイクし、分析後、−20℃において一晩凍結する。次いで、試料を室温において解凍し、再分析する。この過程を、第2の凍結/解凍周期のために反復する。
CNP変異体の血清安定性を、血清/血漿試料に、CNP変異体を10ug/mLの濃度でスパイクすることによって決定する。試料を37℃のウォーターバスに、3時間配置する。30分間隔で血清のアリコートを2重に取り出し、分析する。検体の急速な損失(30分の間に50%を超える)が明らかな場合、研究を10分の時点で反復してもよい。
マウス血漿中におけるCNP変異体の安定性を決定する例示的方法において、CNP変異体(約2.5〜5.0mg/mLのストック溶液の10uL)、ヘパリン化マウス血漿(50uL、Bioreclamation、CD−1 Lith Hep 62231)および5MのNaCl(10uL)の混合物を、37℃、5%CO2において、0〜5時間インキュベートし、次いで、10×プロテアーゼ阻害剤カクテル(15uL、SigmaP2714)を用いて反応を停止させる。抽出のために、150uLのMeOH/0.1%のFAを85uLの反応混合物に加え、得られた混合物を1分間ボルテックスにかけ、次いで15℃で15分間遠心分離器にかけた。75uLの上清を300uLの0.1%の水性FAに加える。得られた混合物の少量を、LC/MSによる分析に供する。
(実施例9)
ラットおよびマウスにおける薬物動態およびcGMP産生
正常なラットにおいて研究を実施し、CNPペプチドの単回の静脈内(i.v.)投与または皮下(s.c.)投与後の、CNP22および特定のCNP変異体の薬物動態(PK)プロファイルおよび血漿cGMP濃度の継時変化を評価した。血漿CNPの免疫活性を、抗CNPウサギポリクロナール抗体を用いた競合放射免疫測定(RIA)を使用して決定した。血漿cGMP濃度を、市販のキット(YAMASA cyclic GMP Assay kit、YAMASA Corporation)を使用して、RIAにより決定した。
ラットおよびマウスにおける薬物動態およびcGMP産生
正常なラットにおいて研究を実施し、CNPペプチドの単回の静脈内(i.v.)投与または皮下(s.c.)投与後の、CNP22および特定のCNP変異体の薬物動態(PK)プロファイルおよび血漿cGMP濃度の継時変化を評価した。血漿CNPの免疫活性を、抗CNPウサギポリクロナール抗体を用いた競合放射免疫測定(RIA)を使用して決定した。血漿cGMP濃度を、市販のキット(YAMASA cyclic GMP Assay kit、YAMASA Corporation)を使用して、RIAにより決定した。
7〜8週齢の正常なオスのラットを使用した。組換え野生型CNP22、CNP37およびPEO24−CNP27(Arg4)(すなわち、PEO24−GANRR−CNP22(K4R))を評価した。個々のCNPペプチドの20nmol/kg用量を、5%マンニトール中の溶液として、尾の静脈に1回注射、または個々のCNPペプチドの50nmol/kg用量を、l%(w/v)ベンジルアルコールおよび10%(w/v)スクロースを含む0.03mol/L酢酸緩衝液、pH4.0中の溶液として、背中に1回皮下注射した。
血漿CNP免疫活性を、抗CNPウサギポリクロナール抗体を使用して、競合RIAにより決定した。標準およびQC試料を調製した。50uLの標準、QCおよびアッセイ試料を、50uLのRIA緩衝液を含有する試験管にそれぞれ加えた。希釈した抗CNPウサギポリクロナール抗体(100uL)を管に加えた。AU管を、一晩4℃に保った。125I−[Tyr0]−CNP22溶液(100uL)およびウサギIgG溶液(100uL)を加え、およそ4℃において一晩放置した。10%ポリエチレングリコールを含有する1ミリリットルの抗ウサギIgGヤギ血清を加え、ボルテックスにかけ、およそ4℃において少なくとも1時間放置し、次いで、不溶性分画を、遠心分離により沈殿させた。上清の吸引後、堆積物中の放射線(γ線)量を、ガンマカウンターにより測定した。各試料を2重に測定し、平均を決定値として採用した。
i.v.投与後5、30、60および90分、またはs.c.投与後5、30、60、120および180分の試料中の血漿cGMP濃度を、抗cGMPモノクロナール抗体を使用して競合RIAにより決定した。標準試料を調製した。100uLのアッセイ試料(較正曲線のための標準溶液またはcGMP決定のための希釈血漿試料)を、試験管に移した。次いで、100uLの抗cGMPモノクロナール抗体溶液および100uLの125I標識スクシニルcGMPチロシンメチルエステル溶液を、それぞれ管に加えた。すべての管を、一晩4℃に保った。500uLのデキストランチャコール溶液を加えた後、管をボルテックスにかけ、次いで、氷上に10分間配置した。反応混合物を、遠心分離器にかけ、500uLの上清を、各試料から新しい試験管に移した。上清中の放射線(γ線)の量を、γカウンターにより測定した。各試料を2重に測定し、平均を決定値として採用した。
血漿CNP免疫活性を、薬物動態(PK)分析のために用いた。PK分析を、WINNONLIN(登録商標)Professional(Pharsight Corporation)を使用して実施した。i.v.投与後の、CNP22、CNP37およびPEO24−CNP27(Arg4)のPKプロファイルを、0時間の濃度(C0:外挿法、pmol/mL)、全身クリアランス(CLtot:mL/min/kg)、定常状態における分布容積(Vdss:mL/kg)、血漿濃度−時間曲線下面積(AUC:pmol−分/mL)、平均滞留時間(MRT:分)および半減期(T1/2:分)などのPKパラメーターを使用して計算した。s.c.投与後のCNPペプチドのPKプロファイルは、最大血漿濃度(Cmax:pmol/mL)、Cmaxに至るまでの時間(Tmax:分)、血漿濃度−時間曲線下面積(AUC:pmol−分/mL)、平均滞留時間(MRT:分)および半減期(T1/2:分)などのPKパラメーターを使用して計算した。
血漿スパイク回収率実験において、RIAによりCNP22、CNP37およびPEO24−CNP27(Arg4)が同様に検出された(データ非掲載)。
上記と同様の手法を用いて、マウスにおいてCNP22およびその変異体のPKプロファイルならびにcGMP産生を刺激するそれらの能力を研究する。
i.v.投与後の、3匹のラットにおけるCNP22、CNP37およびPEO24−CNP27(Arg4)のPKプロファイルを図9に例示する。図9に示されたように、CNP37およびPEO24−CNP27(Arg4)は、CNP22より非常に長い半減期および非常に大きい生体内利用率を有した。半減期、T1/2(分)は、CNP22に関して1.42(±0.45)、PEO24−CNP27(Arg4)に関して22.3(±1.5)およびCNP37に関して49.5(±28.0)である。曲線下面積、AUC(pmol−分/mL)は、CNP22に関して320(±54)、CNP37に関して1559(±568)およびPEO24−CNP27(Arg4)に関して2084(±424)である。
s.c.投与後の、3匹のラットにおける3種のCNPペプチドのPKプロファイルを、図10に表す。CNP22と比較して、PEO24−CNP27(Arg4)は、非常に長い半減期(78.1分(±16.4)対10.0(±5.0))および非常に大きい生体内利用率(60%(±6%)対19%(±9%))を有した。
i.v.投与後の、3匹のラットにおける3種のCNPペプチドの血漿cGMP濃度の継時変化を、図11に表示する。図11は、CNP37およびPEO24−CNP27(Arg4)の投与が、CNP22のi.v.投与より、30、60および90分において、はるかに高いcGMPの血漿レベルをもたらすことを明らかに実証する。
s.c.投与後の、3匹のラットにおける3種のCNPペプチドの血漿cGMP濃度の時間プロファイルを、図12に示す。PEO24−CNP27(Arg4)およびCNP37の皮下投与は、CNP22の皮下投与より実質的にはるかに高いcGMP血漿濃度をもたらし、CNP22と比較した差は、PEO24−CNP27(Arg4)に関しては時間とともに増加するが、CNP37に関しては時間とともに減少する。
ラットの研究は、wtCNP22と比較して、CNP変異体のCNP37およびPEO24−CNP27(Arg4)は、in vivoで実質的により長い半減期を有し、in vivoで実質的により大きな生体内利用率を有し、長期間ではin vivoでcGMP産生が実質的により高いレベルで刺激されたことを示している。CNP37およびPEO24−CNP27(Arg4)の、NEP分解に対する耐性は、in vivoのより長い血漿半減期と相関しており、これは、順に、in vivoのNPR−B/cGMPシグナル伝達の延長と相関する。これらの結果は、CNP22とは異なり、i.v.またはs.c.注射により投与された(例えば、1日1回)本発明のCNP変異体が、骨関連障害および血管平滑筋障害などのCNP−関連病態または障害の治療に有効であり得る可能性があることを示している。
(実施例10)
マウスにおける薬物動態研究
FGFR3achマウス(実施例11を参照されたい)における有効性研究に関して、NEP耐性が上昇したCNP変異体を決定するために、CNP変異体と野生型CNP22との薬物動態特性を比較する薬物動態(PK)研究を実施した。FGFR3achマウスは、FVBマウスのバックグラウンドに単一のトランス遺伝子を含有する、軟骨無形成症の突然変異マウスモデルである。
マウスにおける薬物動態研究
FGFR3achマウス(実施例11を参照されたい)における有効性研究に関して、NEP耐性が上昇したCNP変異体を決定するために、CNP変異体と野生型CNP22との薬物動態特性を比較する薬物動態(PK)研究を実施した。FGFR3achマウスは、FVBマウスのバックグラウンドに単一のトランス遺伝子を含有する、軟骨無形成症の突然変異マウスモデルである。
野生型CNP22またはその変異体を、単回静脈内(i.v.)用量として、6週齢の野生型FVBマウスに投与する。例示的PK研究を、wtCNP22を使用して実施した。6週齢のFVB/Nマウスに、wtCNP22を100nmol/kgの単回用量で静脈内投与した。CNP22の平均血漿レベルを計算し、CNP22の推定半減期を、0.76分から1.03分であると決定した。
NEP分解に対して優れた耐性を表すCNP変異体は、in vivoで時間とともに血清濃度の上昇およびより長い半減期を示すことが予測される。
(実施例11)
軟骨無形成症のマウスモデルにおける有効性
成長の増強、軟骨無形成症の修正におけるCNP22およびその変異体の有効性を、軟骨無形成症のマウスモデルで、突然変異ヒトFGFR−3遺伝子(FGFR3ach)を発現するトランスジェニックマウスの系統を使用して試験する(Wangら、Proc. Natl Acad. Sci. USA、96巻(8号):4455〜4460頁(1999年);Naskiら、DevelopmentUSA、125巻:4977〜4988頁(1998年);米国特許第6,265,632号および第6,136,040号)。
軟骨無形成症のマウスモデルにおける有効性
成長の増強、軟骨無形成症の修正におけるCNP22およびその変異体の有効性を、軟骨無形成症のマウスモデルで、突然変異ヒトFGFR−3遺伝子(FGFR3ach)を発現するトランスジェニックマウスの系統を使用して試験する(Wangら、Proc. Natl Acad. Sci. USA、96巻(8号):4455〜4460頁(1999年);Naskiら、DevelopmentUSA、125巻:4977〜4988頁(1998年);米国特許第6,265,632号および第6,136,040号)。
3週齢の、FGFR3achマウスおよびそれらの野生型同腹子を、2.5%のAvertinによって麻酔にかけ、側面全身X線画像をFaxitronにより得、以下の処理群に、体重によりランダム化する(n=8/群):(1)野生型/媒体、(2)FGFR3ach/媒体、(3)FGFR3ach/CNP22、(4)FGFR3ach/第1のCNP変異体、(5)FGFR3ach/第2のCNP変異体および(6)FGFR3ach/第3のCNP変異体。マウスに、1日に1回設計した被験物質を、5週間皮下投与する。サテライト群(n=3)を使用して、1日目の単回皮下投与の後に各被験物質の曝露を確認する。
37日目に、全マウスを、最終麻酔によって屠殺し、全動物を撮影し、FaxitronによりX線画像を撮る。左右の頸骨、大腿骨、上腕および尺骨を回収し、デジタルキャリパーを使用して測定する。個々の骨の左部分を、組織学的に処理し、右部分を保存のために急速凍結する。骨から得た試料を使用し、軟骨内骨成長についてのCNP22およびCNP変異体の効果を評価および比較する。
(実施例12)
CNP変異体の臨床評価
以下の実施例は、本発明の治療方法における、CNP22またはその変異体を含む組成物の臨床評価のために使用されるパラメーターに関するガイダンスを提供する。本明細書において議論されるように、CNP22またはその変異体は、骨および血管平滑筋の障害を含む、CNPに反応した障害の治療に使用されるであろう。安全性、薬物動態ならびに代替および定義された臨床的エンドポイントの両方の、初期反応のための、CNP22またはその変異体の投与量の評価を提供するであろう、臨床実験を実施することになる。実験は、必ずしも限定されないが、最低でも24週間実施し、約100例の評価可能な患者についての十分な安全性情報を収集する。実験のための初回投与量は、約0.001から約1.0mg/kg/週までで変更することがある。この範囲の初期投与量が有意な直接臨床的有益性を生み出さない事象において、投与量を、必要に応じてこの範囲内またはこれを超える範囲で増加し、必ずしも限定されないが、さらに最低でも24週間持続し、安全性を確立し、さらに有効性を評価するべきである。
CNP変異体の臨床評価
以下の実施例は、本発明の治療方法における、CNP22またはその変異体を含む組成物の臨床評価のために使用されるパラメーターに関するガイダンスを提供する。本明細書において議論されるように、CNP22またはその変異体は、骨および血管平滑筋の障害を含む、CNPに反応した障害の治療に使用されるであろう。安全性、薬物動態ならびに代替および定義された臨床的エンドポイントの両方の、初期反応のための、CNP22またはその変異体の投与量の評価を提供するであろう、臨床実験を実施することになる。実験は、必ずしも限定されないが、最低でも24週間実施し、約100例の評価可能な患者についての十分な安全性情報を収集する。実験のための初回投与量は、約0.001から約1.0mg/kg/週までで変更することがある。この範囲の初期投与量が有意な直接臨床的有益性を生み出さない事象において、投与量を、必要に応じてこの範囲内またはこれを超える範囲で増加し、必ずしも限定されないが、さらに最低でも24週間持続し、安全性を確立し、さらに有効性を評価するべきである。
安全性の測定結果は、有害事象、アレルギー反応、完全な臨床化学パネル(腎機能および肝機能を含む)、尿検査および差次的CBCを含む。さらに、臨床的有益性に関する他のパラメーターをモニターする。本実施例は、CNP22またはその変異体の、吸収、分布、代謝、排出ならびに血中の半減期および生体利用性を含む薬物動態パラメーターの決定をさらに含む。このような分析が臨床反応に対する関連投与量を手助けする。
方法
患者は、基本的病歴および健康診断ならびに臨床検査の標準セット(CBC、Panel20、CH50およびUAを含む)を受けることになる。患者は、毎週の診療所への訪問に厳密に従うことになる。患者は、治療期間の終了1週間後、完全な評価のために診療所に再来することになる。投与量の増加が必要であれば、患者は、上に概説した同じスケジュールに従うことになる。安全性は、実験を通してモニターする。
患者は、基本的病歴および健康診断ならびに臨床検査の標準セット(CBC、Panel20、CH50およびUAを含む)を受けることになる。患者は、毎週の診療所への訪問に厳密に従うことになる。患者は、治療期間の終了1週間後、完全な評価のために診療所に再来することになる。投与量の増加が必要であれば、患者は、上に概説した同じスケジュールに従うことになる。安全性は、実験を通してモニターする。
診断および試験対象患者基準
患者は、CNP反応性障害の可能性の診断が確認された、男性であっても、または女性であってもよい。CNP反応性の、骨関連障害可能性のある具体例は軟骨無形成症であり、このことは、遺伝子診断およびFGFR−3の突然変異または機能障害の他の徴候により確認できる。軟骨無形成症患者の理想の年齢範囲は、幼児(1歳未満)から思春期直前(13歳未満)までであろう。患者が、妊娠しているまたは授乳中である;研究開始前30日以内に試験研究中の薬を飲んでいる;あるいは内科的疾患、重篤な併発疾患または研究のコンプライアンスを有意に損ね得る他の酌量すべき状況を有する場合、患者はこの研究から除外されることになる。
患者は、CNP反応性障害の可能性の診断が確認された、男性であっても、または女性であってもよい。CNP反応性の、骨関連障害可能性のある具体例は軟骨無形成症であり、このことは、遺伝子診断およびFGFR−3の突然変異または機能障害の他の徴候により確認できる。軟骨無形成症患者の理想の年齢範囲は、幼児(1歳未満)から思春期直前(13歳未満)までであろう。患者が、妊娠しているまたは授乳中である;研究開始前30日以内に試験研究中の薬を飲んでいる;あるいは内科的疾患、重篤な併発疾患または研究のコンプライアンスを有意に損ね得る他の酌量すべき状況を有する場合、患者はこの研究から除外されることになる。
安全性
研究過程の間に有意な急性または慢性の薬物反応が起こらなかった場合、CNP22またはその変異体による治療は、安全であると決定されることになる。臨床検査、臨床検査室または他の適切な研究において、有意な異常が観察されなかった場合、薬剤の長期投与は、安全であることが決定されるであろう。
研究過程の間に有意な急性または慢性の薬物反応が起こらなかった場合、CNP22またはその変異体による治療は、安全であると決定されることになる。臨床検査、臨床検査室または他の適切な研究において、有意な異常が観察されなかった場合、薬剤の長期投与は、安全であることが決定されるであろう。
野生型CNP22と比較して、本発明の特定のCNP変異体は、in vitroのNEP分解に対してはるかに耐性であり、ラットにおいて非常に長い血漿半減期および生体利用性を有し、ラットにおいてはるかに高いレベルのcGMP産生を刺激し、野生型マウス由来の大腿骨の大量の骨成長を誘導することが示されている。さらに、CNP22を用いた短期間の投薬計画治療が、in vitroの軟骨細胞成長のFGF2誘導性停止を逆転することにおいて、連続CNP22治療とほとんど同じ程度に有効であることが示されている。これらの結果は、CNP関連病態または障害例えば、骨関連障害および血管平滑筋障害などの治療において、本発明のCNP変異体使用の可能性を実証する。
本明細書に記載の、本発明の個々の実施形態が、場合により本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせることができることは理解されるべきである。本明細書に引用された、個々の特許文献および個々の非特許文献は、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の実施形態および例示的実施例において説明したような、本発明に対する多くの改良および変形を、当業者が思いつくことが予測される。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に現れることのみに限定されるべきである。
(項目1)
約2.6kDa〜約7.0kDaの範囲の総質量を有し、以下の式:
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(a)4−Gly5−(b)6−(c)7−(d)8−(e)9−(f)10−(g)11−Asp12−Arg13−(h)14−(i)15−Ser16−(j)17−Ser18−Gly19−(k)20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号50)[式中、
(x)および(z)は、独立に、非存在であってよく、または骨もしくは軟骨ターゲティング部分;腎クリアランスを減少させる部分;親水性ポリマー;1つもしくは複数のアミノ酸を含むアミノ酸配列;炭水化物;疎水性酸;およびそれらの組合せからなる群から選択されるものでよく、
(a)は、上記位置において野生型Lysであってよく、あるいは天然アミノ酸、非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体で置換されていてよく、
(b)は、Cysおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;N−アルキル基がメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルもしくはtert−ブチルである、PheのN−アルキル化誘導体;ならびにPhe類似体であり、前記Phe類似体のベンゼン環の1つもしくは複数のオルト、メタおよび/またはパラ位がハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝C1−6アルキル、線状もしくは分枝C1−6アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−C1−6アルキル、C3−10シクロアルキル、C6−14アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される1つもしくは複数の置換基で置換されているか、あるいは前記Phe類似体の前記ベンゼン環が他のアリール基またはヘテロアリール基で置換されている、Phe類似体からなる群から選択され、
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly、Thr、Ser、ValおよびAsnからなる群から選択され、
(e)は、Leu、Ser、Thrおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(f)は、上記位置において野生型Lysであってよく、または天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくは側鎖に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体で置換されていてよく、
(g)は、Leu、Asnおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(h)は、Ile、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly),Asnおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(i)は、Gly、Arg、SerおよびAsnからなる群から選択され、
(j)は、Met、Val、Asn、ベータ−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)および2−アミノイソ酪酸(Aib)からなる群から選択され、
(k)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tert−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Arg、Thr、Serおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択される]
を有するC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体であって、
CNP−53でない、CNP変異体。
(項目2)
(b)がCysであり、
(c)がPheであり、
(d)がGlyであり、
(e)がLeuであり、
(g)がLeuであり、
(h)がIleであり、
(i)がGlyであり、
(j)がMetであり、
(k)がLeuである、
項目1に記載のCNP変異体。
(項目3)
(a)および(f)が独立にLys、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerまたはGluである、項目1または2のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目4)
(a)がArgであり、(f)がLysまたはArgである、項目3に記載のCNP変異体。
(項目5)
前記ペプチド結合イソスターが
−CH2−NH−;
アミド基が次のR基:メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルのいずれかによりアルキル化されている−C(=O)−N(R)−;
−C(=O)−NH−CH2−;
−CH2−S−;
nが1または2である−CH2−S(O)n−;
−CH2−CH2−;
−CH=CH−;
−C(=O)−CH2−;
−CH(CN)−NH−;
−CH(OH)−CH2−;
−O−C(=O)−NH−;および
−NHC(=O)NH−
からなる群から選択される、項目1から4のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目6)
約2.6kDa〜約7.0kDaの範囲の総質量を有し、以下の式:
(x)−(y)−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−(f)10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号142)[式中、
(x)および(z)は、独立に、非存在であってよく、または骨もしくは軟骨ターゲティング部分;腎クリアランスを減少させる部分;親水性ポリマー;1つもしくは複数のアミノ酸を含むアミノ酸配列;炭水化物;疎水性酸;およびそれらの組合せからなる群から選択されるものでよく、
(y)は、非存在であってよく、あるいはCNP−22の1〜5位に対応する配列Gly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5のうちの1〜5個のアミノ酸であり、これらの5アミノ酸のいずれが天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸で、場合によって置換されていてもよい1〜5個のアミノ酸を含んでいてよく、
(f)は、上記位置において野生型Lysであってよく、または天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくは側鎖に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体で置換されていてよい]
を有するC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体であって、
CNP−53でない、CNP変異体。
(項目7)
(y)がCNP−22のLys4に対応する位置にLysでなく、Argを含む、項目6に記載のCNP変異体。
(項目8)
(f)がLys、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerまたはGluである、項目6または7に記載のCNP変異体。
(項目9)
前記骨もしくは軟骨ターゲティング部分が、ビスホスホネート;ヒドロキシアパタイト;グルコサミン;X型コラーゲン;ポリAsp;ポリGlu;ならびにオステオクリン、オステポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質の骨ターゲティングドメイン由来のアミノ酸配列からなる群から選択される、項目1から8のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目10)
腎クリアランスを減少させる前記部分が、生理的条件下で負に荷電する少なくとも1つの官能基を含む親水性ポリマーである、項目1から9のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目11)
腎クリアランスを減少させる前記部分が、生理的条件下でカルボキシル基(複数可)、硫酸基(複数可)、リン酸基(複数可)またはその組合せを生成する官能基(複数可)を含むポリ(エチレングリコール)(PEG)ポリマーである、項目10に記載のCNP変異体。
(項目12)
前記親水性ポリマーがポリ(エチレングリコール)(PEG)ポリマーまたはその誘導体である、項目1から11のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目13)
前記PEGポリマーまたはその誘導体が約0.4kDa〜約2.5kDaの範囲のポリマー数平均分子量を有する、項目12に記載のCNP変異体。
(項目14)
前記PEGポリマーまたはその誘導体が約0.6kDa〜約1.5kDaの範囲のポリマー数平均分子量を有する、項目13に記載のCNP変異体。
(項目15)
前記PEGポリマーまたはその誘導体が単分散性である、項目12から14のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目16)
1つもしくは複数のアミノ酸を含む前記アミノ酸配列がナトリウム利尿ポリペプチドまたは非ナトリウム利尿ポリペプチド由来であり、前記アミノ酸配列が、前記ナトリウム利尿ポリペプチドまたは非ナトリウム利尿ポリペプチドの野生型配列と比較してアミノ酸付加(複数可)、欠失(複数可)および/または置換(複数可)を場合によって含んでいてよい、項目1から15のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目17)
前記ナトリウム利尿ポリペプチドが、CNP−22、CNP−53、ナトリウム利尿ペプチド前駆体C(NPPC)、心房ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、ナトリウム利尿ペプチド前駆体A(NPPA)、脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)およびナトリウム利尿ペプチド前駆体B(NPPB)からなる群から選択される、項目16に記載のCNP変異体。
(項目18)
前記非ナトリウム利尿ポリペプチドが、アルブミン、免疫グロブリン、ヒスチンリッチ糖タンパク質(HRGP)、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、線維芽細胞成長因子2(FGF−2)および骨形成タンパク質(BMP)からなる群から選択される、項目16に記載のCNP変異体。
(項目19)
1つもしくは複数のアミノ酸を含む前記アミノ酸配列がBMP1、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7およびBMP8aの機能的ドメイン由来である、項目18に記載のCNP変異体。
(項目20)
1つもしくは複数のアミノ酸を含む前記アミノ酸配列が1〜40個のアミノ酸を含む、項目1から19のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目21)
前記アミノ酸配列が1〜20個のアミノ酸を含む、項目20に記載のCNP変異体。
(項目22)
前記疎水性酸が天然脂肪酸および線状または分枝、飽和または不飽和C5〜C12カルボン酸からなる群から選択される、項目1から21のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目23)
(x)が1〜20個のアミノ酸を含むアミノ酸配列である、項目1から22のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目24)
(x)が、CNP−22のGly1に対応する位置の直前の位置に2つの連続する塩基性アミノ酸を含まない、項目23に記載のCNP変異体。
(項目25)
(x)のN末端がGlyで終わる、項目23または24に記載のCNP変異体。
(項目26)
PEGポリマーまたはその誘導体が前記変異体のN末端に結合しており、前記変異体が、1つもしくは複数のアミノ酸のアミノ酸配列を含む(x)基を含んでいても、含んでいなくてもよい、項目1から25のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目27)
CNP−22のGly1に対応する位置の直前にArg残基を含む、項目1から26のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目28)
C型ナトリウム利尿ペプチド22(CNP−22)(配列番号1)活性を保持しており、CNP−22と比較して循環中で少なくとも5倍長い半減期を示す、CNP−22の変異体であって、
約2.6kDa〜約7.0kDaの範囲の総質量を有し、
配列番号1のアミノ酸6〜22と少なくとも70%相同のアミノ酸配列を含み、
CNP−53でない、
CNP−22の変異体。
(項目29)
アルブミン、フィブリノーゲン、免疫グロブリンまたはナトリウム利尿ペプチドのうちの少なくとも5個の連続するアミノ酸を含む、項目28に記載のCNP変異体。
(項目30)
前記ナトリウム利尿ペプチドがANP、BNPまたはCNP−53である、項目29に記載のCNP変異体。
(項目31)
CNP−53(配列番号4)のアミノ酸1〜32の少なくとも5個の連続するアミノ酸を含む、項目30に記載のCNP変異体。
(項目32)
親水性ポリマーを含む、項目28に記載のCNP変異体。
(項目33)
前記親水性ポリマーがPEGである、項目32に記載のCNP変異体。
(項目34)
明細書における表1、2、3および4(配列番号1〜6および配列番号34〜144)に記載の以下のCNP変異体:
R−CNP22;
ER−CNP22;
GANQQ−CNP22;
GANRR−CNP22;
GANPR−CNP22;
GANSS−CNP22;
PEO12−R−CNP22;
PEO24−R−CNP22;
PEO12−ER−CNP22;
PEO24−ER−CNP22;
PEO12−GANQQ−CNP22;
PEO24−GANQQ−CNP22;
PEO12−GANRR−CNP22;
PEO24−GANRR−CNP22;
PEO12−GANPR−CNP22;
PEO24−GANPR−CNP22;
PEO12−GANSS−CNP22;および
PEO24−GANSS−CNP22;
からなる群から選択され、
CNP変異体は、CNP−17、CNP−22、CNP−53またはANPでない、
C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体。
(項目35)
R−CNP22(K4R)(類似体AZ)(配列番号41);
AAWARLLQEHPNA−CNP22(類似体CA)(配列番号61);
AAWARLLQEHPNAR−CNP22(類似体CB)(配列番号62);
DLRVDTKSRAAWAR−CNP22(類似体CC)(配列番号63);
GQPREPQVYTLPPS−CNP22(類似体CF)(配列番号79);
QEHPNARKYKGANKK−CNP22(CNP37、類似体BL)(配列番号60);
GERAFKAWAVARLSQ−CNP22(類似体CE)(配列番号81);
GHHSHEQHPHGANQQ−CNP22(類似体CQ)(配列番号76);
GQEHPNARKYKGANPK−CNP22(類似体CS)(配列番号71);
GQEHPNARKYKGANQK−CNP22(類似体CT)(配列番号130);
GAHHPHEHDTHGANQQ−CNP22(類似体CR)(配列番号77);
GQTHSSGTQSGANQQ−CNP22(K4R)(類似体CN)(配列番号87);
SPKMVQGSG−CNP17−KVLRRH(類似体CD)(配列番号68);
PEG1K−CNP22(配列番号1);
PEO12−CNP22(配列番号1);
PEO12−R−CNP22(K4R)(配列番号41);
PEO24−R−CNP22(K4R)(配列番号41);
PEO12−ER−CNP22(K4R)(配列番号39);
PEO24−ER−CNP22(K4R)(配列番号39);
PEG1K−GANRR−CNP22(K4R)(配列番号36);
PEO12−GANRR−CNP22(K4R)(配列番号36);
PEO24−GANRR−CNP22(K4R)(配列番号36);
PEO12−GANPR−CNP22(K4R)(配列番号37);
PEO24−GANPR−CNP22(K4R)(配列番号37);
PEO12−GANQQ−CNP22(K4R)(配列番号69);および
PEO24−GANQQ−CNP22(K4R)(配列番号69)
からなる群から選択される、項目34に記載のCNP変異体。
(項目36)
(a)親水性ポリマー、および
(b)CNP22(配列番号1)、GANRR−CNP22(K4R)(配列番号36)、GANPR−CNP22(K4R)(配列番号37)、ER−CNP22(K4R)(配列番号39)、R−CNP22(K4R)(配列番号41)、またはGANQQ−CNP22(K4R)(配列番号69)のいずれか
を含み、
前記親水性ポリマーがN末端、C末端もしくは内部部位、またはそれらの組合せにおいてペプチドに結合している、
約2.6kDa〜約7.0kDaの範囲の総質量を有するC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体。
(項目37)
CNP−22のCys6およびCys22に対応する位置の残基間におけるジスルフィド結合により形成された環状構造を有する、項目1から36のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目38)
約8.0〜約10.5の範囲のpIを有する、項目1から37のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目39)
約8.5〜約10.0の範囲のpIを有する、項目38に記載のCNP変異体。
(項目40)
約2.8kDa〜約6.0kDaの範囲の総質量を有する、項目1から39のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目41)
中性エンドペプチダーゼ(NEP)切断に対する感受性を評価するin vitroアッセイにおいて野生型CNP−22より少なくとも2倍長い半減期を有する、項目1から40のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目42)
野生型CNP−22の同じ濃度のもとで産生されるcGMPレベルの少なくとも約50%の産生をin vitroで刺激する、項目1から41のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目43)
項目1から42のいずれかに記載のCNP変異体および薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物。
(項目44)
軟骨無形成症、低軟骨形成症、低身長、小人症、骨軟骨異形成、致死性形成異常、骨形成不全、軟骨無発生症、点状軟骨形成不全、ホモ接合性軟骨無形成症、点状軟骨形成不全、屈肢異形成症、先天性致死性低ホスファターゼ血症、周産期致死型骨形成不全、短肢多指症候群、低軟骨形成症、近位肢短縮型点状軟骨形成不全、ジャンセン型骨幹端異形成症、先天性脊椎骨端異形成症、骨不全症、捻曲性骨異形成症、先天性短大腿骨、ランゲル型中間肢異形成症、ニーベルゲルト型中間肢異形成症、ロビノウ症候群、レインハルド症候群、先端異骨症、末梢骨形成不全症、クニエスト(Kniest)異形成症、線維性軟骨発生症、ロベルツ症候群、遠位中間肢異形成症、小肢症、モルキオ症候群、クニエスト症候群、異栄養異形成症および脊椎上骨幹端異形成症からなる群から選択される骨格異形成症の治療用の医薬の調製における項目1から42のいずれかに記載のCNP変異体の使用。
(項目45)
前記骨格異形成症が軟骨無形成症である、項目44に記載の使用。
(項目46)
高血圧、再狭窄、アテローム動脈硬化症、急性非代償性心不全、鬱血性心不全、心臓浮腫、腎性水腫、肝性浮腫、急性腎不全および慢性腎不全からなる群から選択される血管平滑筋障害の治療用の医薬の調製における項目1から42のいずれかに記載のCNP変異体の使用。
(項目1)
約2.6kDa〜約7.0kDaの範囲の総質量を有し、以下の式:
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(a)4−Gly5−(b)6−(c)7−(d)8−(e)9−(f)10−(g)11−Asp12−Arg13−(h)14−(i)15−Ser16−(j)17−Ser18−Gly19−(k)20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号50)[式中、
(x)および(z)は、独立に、非存在であってよく、または骨もしくは軟骨ターゲティング部分;腎クリアランスを減少させる部分;親水性ポリマー;1つもしくは複数のアミノ酸を含むアミノ酸配列;炭水化物;疎水性酸;およびそれらの組合せからなる群から選択されるものでよく、
(a)は、上記位置において野生型Lysであってよく、あるいは天然アミノ酸、非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体で置換されていてよく、
(b)は、Cysおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;N−アルキル基がメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルもしくはtert−ブチルである、PheのN−アルキル化誘導体;ならびにPhe類似体であり、前記Phe類似体のベンゼン環の1つもしくは複数のオルト、メタおよび/またはパラ位がハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝C1−6アルキル、線状もしくは分枝C1−6アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−C1−6アルキル、C3−10シクロアルキル、C6−14アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される1つもしくは複数の置換基で置換されているか、あるいは前記Phe類似体の前記ベンゼン環が他のアリール基またはヘテロアリール基で置換されている、Phe類似体からなる群から選択され、
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly、Thr、Ser、ValおよびAsnからなる群から選択され、
(e)は、Leu、Ser、Thrおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(f)は、上記位置において野生型Lysであってよく、または天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくは側鎖に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体で置換されていてよく、
(g)は、Leu、Asnおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(h)は、Ile、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly),Asnおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(i)は、Gly、Arg、SerおよびAsnからなる群から選択され、
(j)は、Met、Val、Asn、ベータ−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)および2−アミノイソ酪酸(Aib)からなる群から選択され、
(k)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tert−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Arg、Thr、Serおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択される]
を有するC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体であって、
CNP−53でない、CNP変異体。
(項目2)
(b)がCysであり、
(c)がPheであり、
(d)がGlyであり、
(e)がLeuであり、
(g)がLeuであり、
(h)がIleであり、
(i)がGlyであり、
(j)がMetであり、
(k)がLeuである、
項目1に記載のCNP変異体。
(項目3)
(a)および(f)が独立にLys、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerまたはGluである、項目1または2のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目4)
(a)がArgであり、(f)がLysまたはArgである、項目3に記載のCNP変異体。
(項目5)
前記ペプチド結合イソスターが
−CH2−NH−;
アミド基が次のR基:メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルのいずれかによりアルキル化されている−C(=O)−N(R)−;
−C(=O)−NH−CH2−;
−CH2−S−;
nが1または2である−CH2−S(O)n−;
−CH2−CH2−;
−CH=CH−;
−C(=O)−CH2−;
−CH(CN)−NH−;
−CH(OH)−CH2−;
−O−C(=O)−NH−;および
−NHC(=O)NH−
からなる群から選択される、項目1から4のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目6)
約2.6kDa〜約7.0kDaの範囲の総質量を有し、以下の式:
(x)−(y)−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−(f)10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号142)[式中、
(x)および(z)は、独立に、非存在であってよく、または骨もしくは軟骨ターゲティング部分;腎クリアランスを減少させる部分;親水性ポリマー;1つもしくは複数のアミノ酸を含むアミノ酸配列;炭水化物;疎水性酸;およびそれらの組合せからなる群から選択されるものでよく、
(y)は、非存在であってよく、あるいはCNP−22の1〜5位に対応する配列Gly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5のうちの1〜5個のアミノ酸であり、これらの5アミノ酸のいずれが天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸で、場合によって置換されていてもよい1〜5個のアミノ酸を含んでいてよく、
(f)は、上記位置において野生型Lysであってよく、または天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくは側鎖に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体で置換されていてよい]
を有するC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体であって、
CNP−53でない、CNP変異体。
(項目7)
(y)がCNP−22のLys4に対応する位置にLysでなく、Argを含む、項目6に記載のCNP変異体。
(項目8)
(f)がLys、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerまたはGluである、項目6または7に記載のCNP変異体。
(項目9)
前記骨もしくは軟骨ターゲティング部分が、ビスホスホネート;ヒドロキシアパタイト;グルコサミン;X型コラーゲン;ポリAsp;ポリGlu;ならびにオステオクリン、オステポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質の骨ターゲティングドメイン由来のアミノ酸配列からなる群から選択される、項目1から8のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目10)
腎クリアランスを減少させる前記部分が、生理的条件下で負に荷電する少なくとも1つの官能基を含む親水性ポリマーである、項目1から9のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目11)
腎クリアランスを減少させる前記部分が、生理的条件下でカルボキシル基(複数可)、硫酸基(複数可)、リン酸基(複数可)またはその組合せを生成する官能基(複数可)を含むポリ(エチレングリコール)(PEG)ポリマーである、項目10に記載のCNP変異体。
(項目12)
前記親水性ポリマーがポリ(エチレングリコール)(PEG)ポリマーまたはその誘導体である、項目1から11のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目13)
前記PEGポリマーまたはその誘導体が約0.4kDa〜約2.5kDaの範囲のポリマー数平均分子量を有する、項目12に記載のCNP変異体。
(項目14)
前記PEGポリマーまたはその誘導体が約0.6kDa〜約1.5kDaの範囲のポリマー数平均分子量を有する、項目13に記載のCNP変異体。
(項目15)
前記PEGポリマーまたはその誘導体が単分散性である、項目12から14のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目16)
1つもしくは複数のアミノ酸を含む前記アミノ酸配列がナトリウム利尿ポリペプチドまたは非ナトリウム利尿ポリペプチド由来であり、前記アミノ酸配列が、前記ナトリウム利尿ポリペプチドまたは非ナトリウム利尿ポリペプチドの野生型配列と比較してアミノ酸付加(複数可)、欠失(複数可)および/または置換(複数可)を場合によって含んでいてよい、項目1から15のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目17)
前記ナトリウム利尿ポリペプチドが、CNP−22、CNP−53、ナトリウム利尿ペプチド前駆体C(NPPC)、心房ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、ナトリウム利尿ペプチド前駆体A(NPPA)、脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)およびナトリウム利尿ペプチド前駆体B(NPPB)からなる群から選択される、項目16に記載のCNP変異体。
(項目18)
前記非ナトリウム利尿ポリペプチドが、アルブミン、免疫グロブリン、ヒスチンリッチ糖タンパク質(HRGP)、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、線維芽細胞成長因子2(FGF−2)および骨形成タンパク質(BMP)からなる群から選択される、項目16に記載のCNP変異体。
(項目19)
1つもしくは複数のアミノ酸を含む前記アミノ酸配列がBMP1、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7およびBMP8aの機能的ドメイン由来である、項目18に記載のCNP変異体。
(項目20)
1つもしくは複数のアミノ酸を含む前記アミノ酸配列が1〜40個のアミノ酸を含む、項目1から19のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目21)
前記アミノ酸配列が1〜20個のアミノ酸を含む、項目20に記載のCNP変異体。
(項目22)
前記疎水性酸が天然脂肪酸および線状または分枝、飽和または不飽和C5〜C12カルボン酸からなる群から選択される、項目1から21のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目23)
(x)が1〜20個のアミノ酸を含むアミノ酸配列である、項目1から22のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目24)
(x)が、CNP−22のGly1に対応する位置の直前の位置に2つの連続する塩基性アミノ酸を含まない、項目23に記載のCNP変異体。
(項目25)
(x)のN末端がGlyで終わる、項目23または24に記載のCNP変異体。
(項目26)
PEGポリマーまたはその誘導体が前記変異体のN末端に結合しており、前記変異体が、1つもしくは複数のアミノ酸のアミノ酸配列を含む(x)基を含んでいても、含んでいなくてもよい、項目1から25のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目27)
CNP−22のGly1に対応する位置の直前にArg残基を含む、項目1から26のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目28)
C型ナトリウム利尿ペプチド22(CNP−22)(配列番号1)活性を保持しており、CNP−22と比較して循環中で少なくとも5倍長い半減期を示す、CNP−22の変異体であって、
約2.6kDa〜約7.0kDaの範囲の総質量を有し、
配列番号1のアミノ酸6〜22と少なくとも70%相同のアミノ酸配列を含み、
CNP−53でない、
CNP−22の変異体。
(項目29)
アルブミン、フィブリノーゲン、免疫グロブリンまたはナトリウム利尿ペプチドのうちの少なくとも5個の連続するアミノ酸を含む、項目28に記載のCNP変異体。
(項目30)
前記ナトリウム利尿ペプチドがANP、BNPまたはCNP−53である、項目29に記載のCNP変異体。
(項目31)
CNP−53(配列番号4)のアミノ酸1〜32の少なくとも5個の連続するアミノ酸を含む、項目30に記載のCNP変異体。
(項目32)
親水性ポリマーを含む、項目28に記載のCNP変異体。
(項目33)
前記親水性ポリマーがPEGである、項目32に記載のCNP変異体。
(項目34)
明細書における表1、2、3および4(配列番号1〜6および配列番号34〜144)に記載の以下のCNP変異体:
R−CNP22;
ER−CNP22;
GANQQ−CNP22;
GANRR−CNP22;
GANPR−CNP22;
GANSS−CNP22;
PEO12−R−CNP22;
PEO24−R−CNP22;
PEO12−ER−CNP22;
PEO24−ER−CNP22;
PEO12−GANQQ−CNP22;
PEO24−GANQQ−CNP22;
PEO12−GANRR−CNP22;
PEO24−GANRR−CNP22;
PEO12−GANPR−CNP22;
PEO24−GANPR−CNP22;
PEO12−GANSS−CNP22;および
PEO24−GANSS−CNP22;
からなる群から選択され、
CNP変異体は、CNP−17、CNP−22、CNP−53またはANPでない、
C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体。
(項目35)
R−CNP22(K4R)(類似体AZ)(配列番号41);
AAWARLLQEHPNA−CNP22(類似体CA)(配列番号61);
AAWARLLQEHPNAR−CNP22(類似体CB)(配列番号62);
DLRVDTKSRAAWAR−CNP22(類似体CC)(配列番号63);
GQPREPQVYTLPPS−CNP22(類似体CF)(配列番号79);
QEHPNARKYKGANKK−CNP22(CNP37、類似体BL)(配列番号60);
GERAFKAWAVARLSQ−CNP22(類似体CE)(配列番号81);
GHHSHEQHPHGANQQ−CNP22(類似体CQ)(配列番号76);
GQEHPNARKYKGANPK−CNP22(類似体CS)(配列番号71);
GQEHPNARKYKGANQK−CNP22(類似体CT)(配列番号130);
GAHHPHEHDTHGANQQ−CNP22(類似体CR)(配列番号77);
GQTHSSGTQSGANQQ−CNP22(K4R)(類似体CN)(配列番号87);
SPKMVQGSG−CNP17−KVLRRH(類似体CD)(配列番号68);
PEG1K−CNP22(配列番号1);
PEO12−CNP22(配列番号1);
PEO12−R−CNP22(K4R)(配列番号41);
PEO24−R−CNP22(K4R)(配列番号41);
PEO12−ER−CNP22(K4R)(配列番号39);
PEO24−ER−CNP22(K4R)(配列番号39);
PEG1K−GANRR−CNP22(K4R)(配列番号36);
PEO12−GANRR−CNP22(K4R)(配列番号36);
PEO24−GANRR−CNP22(K4R)(配列番号36);
PEO12−GANPR−CNP22(K4R)(配列番号37);
PEO24−GANPR−CNP22(K4R)(配列番号37);
PEO12−GANQQ−CNP22(K4R)(配列番号69);および
PEO24−GANQQ−CNP22(K4R)(配列番号69)
からなる群から選択される、項目34に記載のCNP変異体。
(項目36)
(a)親水性ポリマー、および
(b)CNP22(配列番号1)、GANRR−CNP22(K4R)(配列番号36)、GANPR−CNP22(K4R)(配列番号37)、ER−CNP22(K4R)(配列番号39)、R−CNP22(K4R)(配列番号41)、またはGANQQ−CNP22(K4R)(配列番号69)のいずれか
を含み、
前記親水性ポリマーがN末端、C末端もしくは内部部位、またはそれらの組合せにおいてペプチドに結合している、
約2.6kDa〜約7.0kDaの範囲の総質量を有するC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体。
(項目37)
CNP−22のCys6およびCys22に対応する位置の残基間におけるジスルフィド結合により形成された環状構造を有する、項目1から36のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目38)
約8.0〜約10.5の範囲のpIを有する、項目1から37のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目39)
約8.5〜約10.0の範囲のpIを有する、項目38に記載のCNP変異体。
(項目40)
約2.8kDa〜約6.0kDaの範囲の総質量を有する、項目1から39のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目41)
中性エンドペプチダーゼ(NEP)切断に対する感受性を評価するin vitroアッセイにおいて野生型CNP−22より少なくとも2倍長い半減期を有する、項目1から40のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目42)
野生型CNP−22の同じ濃度のもとで産生されるcGMPレベルの少なくとも約50%の産生をin vitroで刺激する、項目1から41のいずれかに記載のCNP変異体。
(項目43)
項目1から42のいずれかに記載のCNP変異体および薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物。
(項目44)
軟骨無形成症、低軟骨形成症、低身長、小人症、骨軟骨異形成、致死性形成異常、骨形成不全、軟骨無発生症、点状軟骨形成不全、ホモ接合性軟骨無形成症、点状軟骨形成不全、屈肢異形成症、先天性致死性低ホスファターゼ血症、周産期致死型骨形成不全、短肢多指症候群、低軟骨形成症、近位肢短縮型点状軟骨形成不全、ジャンセン型骨幹端異形成症、先天性脊椎骨端異形成症、骨不全症、捻曲性骨異形成症、先天性短大腿骨、ランゲル型中間肢異形成症、ニーベルゲルト型中間肢異形成症、ロビノウ症候群、レインハルド症候群、先端異骨症、末梢骨形成不全症、クニエスト(Kniest)異形成症、線維性軟骨発生症、ロベルツ症候群、遠位中間肢異形成症、小肢症、モルキオ症候群、クニエスト症候群、異栄養異形成症および脊椎上骨幹端異形成症からなる群から選択される骨格異形成症の治療用の医薬の調製における項目1から42のいずれかに記載のCNP変異体の使用。
(項目45)
前記骨格異形成症が軟骨無形成症である、項目44に記載の使用。
(項目46)
高血圧、再狭窄、アテローム動脈硬化症、急性非代償性心不全、鬱血性心不全、心臓浮腫、腎性水腫、肝性浮腫、急性腎不全および慢性腎不全からなる群から選択される血管平滑筋障害の治療用の医薬の調製における項目1から42のいずれかに記載のCNP変異体の使用。
Claims (46)
- 約2.6kDa〜約7.0kDaの範囲の総質量を有し、以下の式:
(x)−Gly1−Leu2−Ser3−(a)4−Gly5−(b)6−(c)7−(d)8−(e)9−(f)10−(g)11−Asp12−Arg13−(h)14−(i)15−Ser16−(j)17−Ser18−Gly19−(k)20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号50)[式中、
(x)および(z)は、独立に、非存在であってよく、または骨もしくは軟骨ターゲティング部分;腎クリアランスを減少させる部分;親水性ポリマー;1つもしくは複数のアミノ酸を含むアミノ酸配列;炭水化物;疎水性酸;およびそれらの組合せからなる群から選択されるものでよく、
(a)は、上記位置において野生型Lysであってよく、あるいは天然アミノ酸、非天然アミノ酸または側鎖に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体で置換されていてよく、
(b)は、Cysおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;N−アルキル基がメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルもしくはtert−ブチルである、PheのN−アルキル化誘導体;ならびにPhe類似体であり、前記Phe類似体のベンゼン環の1つもしくは複数のオルト、メタおよび/またはパラ位がハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、線状もしくは分枝C1−6アルキル、線状もしくは分枝C1−6アルコキシ、線状もしくは分枝ハロ−C1−6アルキル、C3−10シクロアルキル、C6−14アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールからなる群から選択される1つもしくは複数の置換基で置換されているか、あるいは前記Phe類似体の前記ベンゼン環が他のアリール基またはヘテロアリール基で置換されている、Phe類似体からなる群から選択され、
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly、Thr、Ser、ValおよびAsnからなる群から選択され、
(e)は、Leu、Ser、Thrおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(f)は、上記位置において野生型Lysであってよく、または天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくは側鎖に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体で置換されていてよく、
(g)は、Leu、Asnおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(h)は、Ile、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly),Asnおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択され、
(i)は、Gly、Arg、SerおよびAsnからなる群から選択され、
(j)は、Met、Val、Asn、ベータ−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)および2−アミノイソ酪酸(Aib)からなる群から選択され、
(k)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tert−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Arg、Thr、Serおよびペプチド結合イソスターからなる群から選択される]
を有するC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体であって、
CNP−53でない、CNP変異体。 - (b)がCysであり、
(c)がPheであり、
(d)がGlyであり、
(e)がLeuであり、
(g)がLeuであり、
(h)がIleであり、
(i)がGlyであり、
(j)がMetであり、
(k)がLeuである、
請求項1に記載のCNP変異体。 - (a)および(f)が独立にLys、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerまたはGluである、請求項1または2のいずれかに記載のCNP変異体。
- (a)がArgであり、(f)がLysまたはArgである、請求項3に記載のCNP変異体。
- 前記ペプチド結合イソスターが
−CH2−NH−;
アミド基が次のR基:メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチルのいずれかによりアルキル化されている−C(=O)−N(R)−;
−C(=O)−NH−CH2−;
−CH2−S−;
nが1または2である−CH2−S(O)n−;
−CH2−CH2−;
−CH=CH−;
−C(=O)−CH2−;
−CH(CN)−NH−;
−CH(OH)−CH2−;
−O−C(=O)−NH−;および
−NHC(=O)NH−
からなる群から選択される、請求項1から4のいずれかに記載のCNP変異体。 - 約2.6kDa〜約7.0kDaの範囲の総質量を有し、以下の式:
(x)−(y)−Cys6−Phe7−Gly8−Leu9−(f)10−Leu11−Asp12−Arg13−Ile14−Gly15−Ser16−Met17−Ser18−Gly19−Leu20−Gly21−Cys22−(z)(配列番号142)[式中、
(x)および(z)は、独立に、非存在であってよく、または骨もしくは軟骨ターゲティング部分;腎クリアランスを減少させる部分;親水性ポリマー;1つもしくは複数のアミノ酸を含むアミノ酸配列;炭水化物;疎水性酸;およびそれらの組合せからなる群から選択されるものでよく、
(y)は、非存在であってよく、あるいはCNP−22の1〜5位に対応する配列Gly1−Leu2−Ser3−Lys4−Gly5のうちの1〜5個のアミノ酸であり、これらの5アミノ酸のいずれが天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸で、場合によって置換されていてもよい1〜5個のアミノ酸を含んでいてよく、
(f)は、上記位置において野生型Lysであってよく、または天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくは側鎖に反応性第一級アミノ基を有さないペプチド模倣体で置換されていてよい]
を有するC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体であって、
CNP−53でない、CNP変異体。 - (y)がCNP−22のLys4に対応する位置にLysでなく、Argを含む、請求項6に記載のCNP変異体。
- (f)がLys、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、SerまたはGluである、請求項6または7に記載のCNP変異体。
- 前記骨もしくは軟骨ターゲティング部分が、ビスホスホネート;ヒドロキシアパタイト;グルコサミン;X型コラーゲン;ポリAsp;ポリGlu;ならびにオステオクリン、オステポンチン、オステオカルシンおよびシアロタンパク質の骨ターゲティングドメイン由来のアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項1から8のいずれかに記載のCNP変異体。
- 腎クリアランスを減少させる前記部分が、生理的条件下で負に荷電する少なくとも1つの官能基を含む親水性ポリマーである、請求項1から9のいずれかに記載のCNP変異体。
- 腎クリアランスを減少させる前記部分が、生理的条件下でカルボキシル基(複数可)、硫酸基(複数可)、リン酸基(複数可)またはその組合せを生成する官能基(複数可)を含むポリ(エチレングリコール)(PEG)ポリマーである、請求項10に記載のCNP変異体。
- 前記親水性ポリマーがポリ(エチレングリコール)(PEG)ポリマーまたはその誘導体である、請求項1から11のいずれかに記載のCNP変異体。
- 前記PEGポリマーまたはその誘導体が約0.4kDa〜約2.5kDaの範囲のポリマー数平均分子量を有する、請求項12に記載のCNP変異体。
- 前記PEGポリマーまたはその誘導体が約0.6kDa〜約1.5kDaの範囲のポリマー数平均分子量を有する、請求項13に記載のCNP変異体。
- 前記PEGポリマーまたはその誘導体が単分散性である、請求項12から14のいずれかに記載のCNP変異体。
- 1つもしくは複数のアミノ酸を含む前記アミノ酸配列がナトリウム利尿ポリペプチドまたは非ナトリウム利尿ポリペプチド由来であり、前記アミノ酸配列が、前記ナトリウム利尿ポリペプチドまたは非ナトリウム利尿ポリペプチドの野生型配列と比較してアミノ酸付加(複数可)、欠失(複数可)および/または置換(複数可)を場合によって含んでいてよい、請求項1から15のいずれかに記載のCNP変異体。
- 前記ナトリウム利尿ポリペプチドが、CNP−22、CNP−53、ナトリウム利尿ペプチド前駆体C(NPPC)、心房ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、ナトリウム利尿ペプチド前駆体A(NPPA)、脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)およびナトリウム利尿ペプチド前駆体B(NPPB)からなる群から選択される、請求項16に記載のCNP変異体。
- 前記非ナトリウム利尿ポリペプチドが、アルブミン、免疫グロブリン、ヒスチンリッチ糖タンパク質(HRGP)、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、線維芽細胞成長因子2(FGF−2)および骨形成タンパク質(BMP)からなる群から選択される、請求項16に記載のCNP変異体。
- 1つもしくは複数のアミノ酸を含む前記アミノ酸配列がBMP1、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7およびBMP8aの機能的ドメイン由来である、請求項18に記載のCNP変異体。
- 1つもしくは複数のアミノ酸を含む前記アミノ酸配列が1〜40個のアミノ酸を含む、請求項1から19のいずれかに記載のCNP変異体。
- 前記アミノ酸配列が1〜20個のアミノ酸を含む、請求項20に記載のCNP変異体。
- 前記疎水性酸が天然脂肪酸および線状または分枝、飽和または不飽和C5〜C12カルボン酸からなる群から選択される、請求項1から21のいずれかに記載のCNP変異体。
- (x)が1〜20個のアミノ酸を含むアミノ酸配列である、請求項1から22のいずれかに記載のCNP変異体。
- (x)が、CNP−22のGly1に対応する位置の直前の位置に2つの連続する塩基性アミノ酸を含まない、請求項23に記載のCNP変異体。
- (x)のN末端がGlyで終わる、請求項23または24に記載のCNP変異体。
- PEGポリマーまたはその誘導体が前記変異体のN末端に結合しており、前記変異体が、1つもしくは複数のアミノ酸のアミノ酸配列を含む(x)基を含んでいても、含んでいなくてもよい、請求項1から25のいずれかに記載のCNP変異体。
- CNP−22のGly1に対応する位置の直前にArg残基を含む、請求項1から26のいずれかに記載のCNP変異体。
- C型ナトリウム利尿ペプチド22(CNP−22)(配列番号1)活性を保持しており、CNP−22と比較して循環中で少なくとも5倍長い半減期を示す、CNP−22の変異体であって、
約2.6kDa〜約7.0kDaの範囲の総質量を有し、
配列番号1のアミノ酸6〜22と少なくとも70%相同のアミノ酸配列を含み、
CNP−53でない、
CNP−22の変異体。 - アルブミン、フィブリノーゲン、免疫グロブリンまたはナトリウム利尿ペプチドのうちの少なくとも5個の連続するアミノ酸を含む、請求項28に記載のCNP変異体。
- 前記ナトリウム利尿ペプチドがANP、BNPまたはCNP−53である、請求項29に記載のCNP変異体。
- CNP−53(配列番号4)のアミノ酸1〜32の少なくとも5個の連続するアミノ酸を含む、請求項30に記載のCNP変異体。
- 親水性ポリマーを含む、請求項28に記載のCNP変異体。
- 前記親水性ポリマーがPEGである、請求項32に記載のCNP変異体。
- 明細書における表1、2、3および4(配列番号1〜6および配列番号34〜144)に記載の以下のCNP変異体:
R−CNP22;
ER−CNP22;
GANQQ−CNP22;
GANRR−CNP22;
GANPR−CNP22;
GANSS−CNP22;
PEO12−R−CNP22;
PEO24−R−CNP22;
PEO12−ER−CNP22;
PEO24−ER−CNP22;
PEO12−GANQQ−CNP22;
PEO24−GANQQ−CNP22;
PEO12−GANRR−CNP22;
PEO24−GANRR−CNP22;
PEO12−GANPR−CNP22;
PEO24−GANPR−CNP22;
PEO12−GANSS−CNP22;
PEO24−GANSS−CNP22;および
GHKSEVAHRFK−GANKK−CNP22(配列番号144)
からなる群から選択され、
CNP変異体は、CNP−17、CNP−22、CNP−53またはANPでない、
C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体。 - R−CNP22(K4R)(類似体AZ)(配列番号41);
GANRR−CNP22(K4R)(類似体AY)(配列番号36);
AAWARLLQEHPNA−CNP22(類似体CA)(配列番号61);
AAWARLLQEHPNAR−CNP22(類似体CB)(配列番号62);
DLRVDTKSRAAWAR−CNP22(類似体CC)(配列番号63);
GQPREPQVYTLPPS−CNP22(類似体CF)(配列番号79);
QEHPNARKYKGANKK−CNP22(CNP37、類似体BL)(配列番号60);
GQEHPNARKYKGANKK−CNP22(類似体DB)(配列番号75);
GERAFKAWAVARLSQ−CNP22(類似体CE)(配列番号81);
GHHSHEQHPHGANQQ−CNP22(類似体CQ)(配列番号76);
GQEHPNARKYKGANPK−CNP22(類似体CS)(配列番号71);
GQEHPNARKYKGANQK−CNP22(類似体CT)(配列番号130);
GAHHPHEHDTHGANQQ−CNP22(類似体CR)(配列番号77);
GQTHSSGTQSGANQQ−CNP22(K4R)(類似体CN)(配列番号87);
SPKMVQGSG−CNP17−KVLRRH(類似体CD)(配列番号68);
GHKSEVAHRFK−GANKK−CNP22(配列番号144);
PEG1K−CNP22(配列番号1);
PEO12−CNP22(配列番号1);
PEO12−R−CNP22(K4R)(配列番号41);
PEO24−R−CNP22(K4R)(配列番号41);
PEO12−ER−CNP22(K4R)(配列番号39);
PEO24−ER−CNP22(K4R)(配列番号39);
PEG1K−GANRR−CNP22(K4R)(配列番号36);
PEO12−GANRR−CNP22(K4R)(配列番号36);
PEO24−GANRR−CNP22(K4R)(配列番号36);
PEO12−GANPR−CNP22(K4R)(配列番号37);
PEO24−GANPR−CNP22(K4R)(配列番号37);
PEO12−GANQQ−CNP22(K4R)(配列番号69);および
PEO24−GANQQ−CNP22(K4R)(配列番号69)
からなる群から選択される、請求項34に記載のCNP変異体。 - (a)親水性ポリマー、および
(b)CNP22(配列番号1)、GANRR−CNP22(K4R)(配列番号36)、GANPR−CNP22(K4R)(配列番号37)、ER−CNP22(K4R)(配列番号39)、R−CNP22(K4R)(配列番号41)、またはGANQQ−CNP22(K4R)(配列番号69)のいずれか
を含み、
前記親水性ポリマーがN末端、C末端もしくは内部部位、またはそれらの組合せにおいてペプチドに結合している、
約2.6kDa〜約7.0kDaの範囲の総質量を有するC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体。 - CNP−22のCys6およびCys22に対応する位置の残基間におけるジスルフィド結合により形成された環状構造を有する、請求項1から36のいずれかに記載のCNP変異体。
- 約8.0〜約10.5の範囲のpIを有する、請求項1から37のいずれかに記載のCNP変異体。
- 約8.5〜約10.0の範囲のpIを有する、請求項38に記載のCNP変異体。
- 約2.8kDa〜約6.0kDaの範囲の総質量を有する、請求項1から39のいずれかに記載のCNP変異体。
- 中性エンドペプチダーゼ(NEP)切断に対する感受性を評価するin vitroアッセイにおいて野生型CNP−22より少なくとも2倍長い半減期を有する、請求項1から40のいずれかに記載のCNP変異体。
- 野生型CNP−22の同じ濃度のもとで産生されるcGMPレベルの少なくとも約50%の産生をin vitroで刺激する、請求項1から41のいずれかに記載のCNP変異体。
- 請求項1から42のいずれかに記載のCNP変異体および薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物。
- 軟骨無形成症、低軟骨形成症、低身長、小人症、骨軟骨異形成、致死性形成異常、骨形成不全、軟骨無発生症、点状軟骨形成不全、ホモ接合性軟骨無形成症、点状軟骨形成不全、屈肢異形成症、先天性致死性低ホスファターゼ血症、周産期致死型骨形成不全、短肢多指症候群、低軟骨形成症、近位肢短縮型点状軟骨形成不全、ジャンセン型骨幹端異形成症、先天性脊椎骨端異形成症、骨不全症、捻曲性骨異形成症、先天性短大腿骨、ランゲル型中間肢異形成症、ニーベルゲルト型中間肢異形成症、ロビノウ症候群、レインハルド症候群、先端異骨症、末梢骨形成不全症、クニエスト(Kniest)異形成症、線維性軟骨発生症、ロベルツ症候群、遠位中間肢異形成症、小肢症、モルキオ症候群、クニエスト症候群、異栄養異形成症および脊椎上骨幹端異形成症からなる群から選択される骨格異形成症の治療用の医薬の調製における請求項1から42のいずれかに記載のCNP変異体の使用。
- 前記骨格異形成症が軟骨無形成症である、請求項44に記載の使用。
- 高血圧、再狭窄、アテローム動脈硬化症、急性非代償性心不全、鬱血性心不全、心臓浮腫、腎性水腫、肝性浮腫、急性腎不全および慢性腎不全からなる群から選択される血管平滑筋障害の治療用の医薬の調製における請求項1から42のいずれかに記載のCNP変異体の使用。
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