JP2011026294A - 化合物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】一般式(1)で表されるポリマーからなる化合物。L−Y−A (1)
(式中、Aは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Lはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Yはペプチド部であって、一本鎖抗体部Aとリンカー部Lとを連結する0個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Lはペプチド部YのN末端または一本鎖抗体部AのN末端に結合している)
【選択図】図1
Description
L−Y−A (1)
(式中、Aは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Lはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Yはペプチド部であって、一本鎖抗体部Aとリンカー部Lとを連結する0個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Lはペプチド部YのN末端または一本鎖抗体部AのN末端に結合している)
X−L−Y−A (2)
(式中、Aは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Lはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Yはペプチド部であって、一本鎖抗体部Aとリンカー部Lとを連結する0個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Lはペプチド部YのN末端または一本鎖抗体部AのN末端に結合している。Xはポリエチレングリコール、有機色素、有機ポリマー、粒子のいずれかである。)
L−Y−A (1)
(式中、Aは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Lはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Yはペプチド部であって、一本鎖抗体部Aとリンカー部Lとを連結する0個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Lはペプチド部YのN末端または一本鎖抗体部AのN末端に結合している。)
本発明の第一の実施形態に係る化合物は、一般式(1)で表されるポリマーからなる。
L−Y−A (1)
(式中、Aは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Lはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Yはペプチド部であって、一本鎖抗体部Aとリンカー部Lとを連結する0個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Lはペプチド部YのN末端または一本鎖抗体部AのN末端に結合している)
本実施形態において、抗原結合能力が阻害あるいは低減される、とは、一本鎖抗体部が修飾等をされていない状態で抗原と結合する能力が、なんらかの要因により、失われ、あるいは、弱められることを指す。また、抗原結合能力が回復するとは、失われ、あるいは弱められた抗原結合能力が、向上し、修飾等をされていない状態の一本鎖抗体部と、同じ、または近い状態になることをいう。
本発明において、一本鎖抗体部とは、抗体の重鎖可変(VH)領域と軽鎖可変(VL)領域とをペプチドからなるリンカーで連結した部位(抗原結合部位)からなるポリペプチドである。
ここで、抗体とは、ヒト、マウス、ラット、ラクダ、鳥、等、由来は問わず、さらにはキメラ体であってもよく、また、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAAALEHHHHHHGGC(配列番号1)
なお、一本鎖抗体部のC末端には、任意のアミノ酸が結合していてもよい。
本発明において、リンカー部とは、プロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。ここで、プロテアーゼ切断部位とは、プロテアーゼに特異的に認識されるアミノ酸配列を有しており、そのアミノ酸配列が活性状態のプロテアーゼに認識され、特異的に加水分解されて切断される部位を意味する。
プロテアーゼとしては、特に限定はなく用いられるが、マトリックスメタロプロテアーゼファミリーまたはセリンプロテアーゼファミリーが好ましく、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼー2(MMP−2)、マトリックスメタロプロテアーゼー9(MMP−9)、前立腺特異的抗原(PSA)、プラスミン、カテプシン、カスパーゼなどが標的プロテアーゼとして挙げられる。
プロテアーゼ切断部位については、それぞれのプロテアーゼが特異的に認識するアミノ酸配列であり、たとえば、MMP−2の切断部位としてアミノ酸配列PLGVR(配列番号2)を含むポリペプチドなどを利用できる。また、PSAの切断部位としてアミノ酸配列SSIYSQTEEQ(配列番号3)を含むポリペプチドなどを利用することができる。
リンカー部のN末端には任意のアミノ酸が結合していてもよい。
本発明において、ペプチド部とは、一本鎖抗体部とリンカー部とを連結する0個以上のアミノ酸からなる。そのアミノ酸の数は20個以下であることが好ましく、10個以下であることがさらに好ましい。アミノ酸の数が20個以上であると、そのアミノ酸配列が立体構造をとる可能性がある。その結果、プロテアーゼ切断部位がプロテアーゼによって切断された場合でも、一本鎖抗体部の抗原結合能力が阻害あるいは低減されたままとなってしまうおそれがあるためである。
抗原結合能力を阻害あるいは低減する機構については、種々の機構が考えられる。第一に、ペプチド部または一本鎖抗体部のN末端に結合したリンカー部が一本鎖抗体部の抗原結合部位と抗原の間に存在することにより立体的障害を生じさせることが考えられる。この場合、リンカー部が一本鎖抗体部の抗原結合部位を覆うため、他の抗体が抗原に結合できなくなることなどが考えられる。
以上のことは、リンカー部がペプチド部のN末端に結合し、ペプチド部が一本鎖抗体部のN末端に結合している場合についても同様のことが言える。
本実施形態に係る化合物には、一本鎖抗体部に信号発信分子を結合させることが可能である。
信号発信分子として、放射性核種、MRI信号を発信する分子、超音波信号を発信する分子、蛍光信号を発信する分子などの種々の分子を用いることができる。例えば、光を吸収し超音波信号や発光信号を発する信号発信分子としては、Alexa Fluor 680、Alaxa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790(以上商標、インビトロジェン株式会社)、Cy5、Cy5.5、Cy7(以上商標、GEヘルスケア)、HiLyte 647、HiLyte 680、HiLyte 750(以上商標、AnaSpec, Inc)、DY−680、DY−700、DY−730、DY−750、DY−782 (以上商標、Dyomics, Jena, Germany)などを利用することが可能である。また、光を吸収し超音波信号や発光信号を発する分子としては、生体透過性の優れた約600 nm以上約1000 nm以下の近赤外波長領域の光を吸収する近赤外光吸収色素を選択することが有効である。その他、微粒子としては、酸化鉄微粒子、金微粒子、金ナノロッド、白金、銀などの金属や金属酸化物の微粒子など種々の微粒子を利用することが可能であろう。また、本実施形態の一本鎖抗体部に抗癌剤などの治療用薬剤を結合し、病変部位へ治療用薬剤を送達することも可能であり、病変部位以外への治療用薬剤の送達を低減することによる副作用の低減が期待できる。
また、同様に、本発明の化合物のうち、信号発信分子が結合したものは、病変マーカーのイメージングに用いることが可能である。病変マーカーのイメージング方法は、以下の通りである。すなわち、本発明の化合物を個体に投与し、又は個体より得られた試料に添加し、信号を検出することにより、該個体中もしくは個体より得られた試料中の病変マーカーの存否、又は病変マーカーを産生する病変部位の存否をイメージングすることができる。
以下、本発明の第二の実施形態に係る化合物の説明をするが、第一の実施形態と共通のことに関しては説明を省略する。
本発明の第二の実施形態に係る化合物は、一般式(2)で表されるポリマーからなる化合物。
X−L−Y−A (2)
(式中、Aは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Lはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Yはペプチド部であって、一本鎖抗体部Aとリンカー部Lとを連結する0個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Lはペプチド部YのN末端または一本鎖抗体部AのN末端に結合している。Xはポリエチレングリコール、有機色素、有機ポリマー、粒子のいずれかである)
PEGの分子量は20kDa以上であることが好ましい。また、PEGの分子量が40kDa以下であることが好ましい。
本発明の第三の実施形態について説明する。本実施形態は、上記一般式(1)で表されるポリマーからなる化合物の製造方法に関する。具体的には以下の工程を有する。
(i)一本鎖抗体部Aをコードする塩基配列と、リンカー部Lをコードする塩基配列と、ペプチド部Yをコードする塩基配列と、を有する核酸をプラスミドに挿入する工程
(ii)前記核酸が挿入されたプラスミドを菌に導入する工程
(iii)前記プラスミドを導入した菌が発現した化合物を回収する工程
なお、本実施形態に係る化合物の製造方法は上記(i)から(iii)以外の工程を含んでいてもよい。
始めに、HER2へ結合するIgGの可変領域の遺伝子配列を基に、一本鎖抗体(scFv)部をコードする遺伝子断片を作製した。作製した遺伝子は発現産物のN末端に、MMP−2により特異的に切断されるアミノ酸配列PLGVR、C末端にはタンパク精製のためのヒスチジンが6残基連続した6 x Hisタグ、またそのさらに下流にスペーサーとしてグリシンを2残基挟み信号発信分子を導入するためのシステインが配置される様に設計した。比較として、N末端にMMP−2により特異的に切断されるアミノ酸配列PLGVRを含まない遺伝子についても同様に作製した。上記遺伝子断片をT7プロモーターの下流に挿入したプラスミドpET−22b (+)(Novagen社)を大腸菌(Escherichia coli BL21 (DE3))に導入し、発現用菌株を得た。得られた菌株をLB−Amp培地4 mlで一晩前培養後、全量を250 mlの2 x YT培地に添加し、28℃、120 rpmで8 時間振とう培養した。その後、終濃度1 mMでIPTGを添加し、28℃で一晩培養した。培養した大腸菌を8000x g、30 分、4℃で遠心分離し、その上清の培養液を回収した。得られた培養液の60%重量の硫酸アンモニウムを添加し、塩析によりタンパク質を沈殿させた。塩析操作した溶液を一晩4℃で静置後、8000xg、30 min、4℃で遠心分離することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を20 mM Tris・HCl / 500 mM NaClバッファーに溶解し、1 Lの同バッファーへ透析した。透析後のタンパク質溶液を、His・Bind(登録商標) Resin(Novagen社)を充填したカラムへ添加し、Niイオンを介した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したN末端MMP−2基質導入hu4D5−8 scFv (scFv−NM)と、N末端MMP−2基質未導入hu4D5−8 scFv (scFv−WT)は、SDS−PAGEによりシングルバンドを示し分子量は約28 kDaであることを確認した。
上記で調製したscFv−NMにMMP−2を添加することにより、ペプチドが切断されて生じる分子量の変化を測定した。TCNB buffer(50 mM Tris, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 0.05% Brij35, pH7.5)に透析したPEG化scFv 約4 μMに、活性型MMP−2(コスモ・バイオ株式会社)0.10 mg/mlを約15 nM添加し、約20時間反応を行い、分子量の変化を還元型SDS−PAGEにより測定した。その結果、図3に示すように、MMP−2を添加することにより、scFv−NMでは分子量の低下が検出された。一方、scFv−WTでは分子量の低下は検出されなかった。以上より、scFv−NMのペプチドがMMP−2により切断されることを確認した。
上記で作製したscFv−NM、scFv−WTと抗原であるHER2との相互作用をBiacore Xシステム(GEヘルスケア株式会社)を用いて測定し、MMP−2添加前と添加後でのscFvの結合能力の変化を測定した。抗原としては、Recombinant Human ErbB2 / Fc Chimera(R&D Systems,Inc.)を用いて、メーカーの推奨に従って、CM−5チップ表面のカルボキシメチルデキストラン鎖へのアミンカップリングにより固定した。固定化量は、約1000 RUであった。ランニングバッファーとしてはPBS−T(2.68 mM KCl / 137 mM NaCl / 1.47 mM KH2PO4 / 1mM Na2HPO4 / 0.005% Tween 20, pH7.4)を用いて、50 nMのscFvを流速20 μl/minの条件下でインジェクトし結合能力を評価した。その結果、図4に示すように、MMP−2添加前後でセンサーグラムの変化を確認でき、scFv−NMの抗原結合能力が向上することがわかった。一方、scFv−WTの抗原結合能力は、MMP−2添加前後ではほとんど変化しないことを確認した。
実施例1で調製したscFv−NMを100 mMリン酸バッファー(pH 5.0)にバッファー置換後、scFv−NMに対して40倍モル量の5 kDa、20 kDa、又は40 kDaの PEG−アルデヒド(日油株式会社)を添加し、終濃度20 mMで2−ピコリンボランを添加し、4℃で約3日間反応させた。反応後、TCNB buffer(50 mM Tris, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 0.05% Brij35, pH7.5)にバッファー交換し、 Superdex 200 GL 10/300カラム(GEヘルスケア株式会社)を用いてゲルろ過クロマトグラフィーにより、PEGが1分子結合したと考えられる画分を分取することで、N末端にPEG化されたと考えられるscFv−NMを得た。
上記で調製したN末端がPEG化されたと考えられるscFv−NMについて、MMP−2を添加することにより、分子量の変化を評価した。TCNB bufferに溶解したN末端にPEG化されたと考えられるscFv−NMに、活性型MMP−2(コスモ・バイオ株式会社)0.10 mg/mlを終濃度約10 nM添加し、約20 h反応を行い、 Superdex 200 GL 10/300カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーにより、分子量の変化を評価した。20 kDaのPEGを修飾したscFv−NMのMMP−2添加前後でのゲルろ過クロマトグラフィー(280 nmの吸収をモニタリング)の結果を図5に示す。図5に示すようにMMP−2を添加することにより、切断前にはなかった2つのピークが検出された。これらは、PEG未修飾のscFv−NMのモノマーとダイマーと考えられる。すなわち、この結果はN末端に導入したMMP−2基質をMMP−2が切断することにより、N末端に修飾されたPEGがscFv−NMより遊離したことを示している。つまり、N末端にPEGが修飾されていることを確認できた。また、MMP−2の添加により現れた、PEGが遊離したscFv−NMに相当すると考えられるピーク面積と、全体のピーク面積の割合を比較した結果、 PEG化scFv−NM全体のうちN末端がPEG化されていた割合は約50%程度であった。残りの50%はscFv−NM分子内のリジン残基のアミノ基に対してPEGが修飾されていたと考えられる。また、5 kDa、40 kDaのPEG−アルデヒドを用いた場合も同様に約50%程度がN末端にPEG化されていることを確認した。以上より、N末端PEG化scFv−NMの取得を確認した。
HER2へ結合するIgGの可変領域の遺伝子配列を基に、一本鎖抗体(scFv)部をコードする遺伝子断片を作製した。作製した遺伝子のカルボキシ末端には、MMP−2により特異的に切断されるアミノ酸配列PLGVR、抗原結合能を低下させる分子を連結するためのシステイン残基、及びタンパク精製のためのヒスチジンが6残基連続した6 x His タグを配置した。上記遺伝子断片をT7プロモーターの下流に挿入したプラスミドpET−22b (+)(Novagen社)を大腸菌(Escherichia coli BL21 (DE3))に導入し、発現用菌株を得た。得られた菌株をLB−Amp培地4 mlで一晩前培養後、全量を250 mlの2 x YT培地に添加し、28℃、120 rpmで8時間振とう培養した。その後、終濃度1 mMでIPTGを添加し、28℃で一晩培養した。培養した大腸菌を8000 x g、30 min、4℃で遠心分離し、その上清の培養液を回収した。得られた培養液の60%重量の硫酸アンモニウムを添加し、塩析によりタンパク質を沈殿させた。塩析操作した溶液を一晩4℃で静置後、8000xg、30 min、4℃で遠心分離することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を20 mM Tris・HCl / 500 mM NaClバッファーに溶解し、1 Lの同バッファーへ透析した。透析後のタンパク質溶液を、His・Bind (登録商標)Resin(Novagen社)を充填したカラムへ添加し、Niイオンを介した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したC末端MMP−2基質導入scFv(scFv−CM)は、SDS−PAGEによりシングルバンドを示し分子量は約28 kDaであることを確認した。
上記で調製したscFv−CMを5 mM EDTAを含むリン酸バッファー(2.68 mM KCl / 137 mM NaCl / 1.47 mM KH2PO4 / 1m M Na2HPO4 / 5 mM EDTA, pH7.4)にバッファー置換後、10〜20倍モル量のトリ(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)によって、25℃で2〜4時間、還元処理した。この還元処理したscFv−CMを、25℃で2〜4時間、10倍モル量の2 kDa、5 kDa、12 kDa、20 kDa、又は40 kDaの PEG−マレイミド(日油株式会社)と反応させた。PEG化されていることは、還元型SDS−PAGEにより確認した(図6)。また、反応後、Superdex 200 GL 10/300カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーにより、未反応のPEG−マレイミドを除去し、C末端PEG化scFv−CMを得た。
上記で調製したC末端PEG化scFv−CMのうち、20 kDa PEG−マレイミドを付加したものについて、MMP−2を添加することにより、分子量の変化を評価した。TCNB bufferに透析したC末端PEG化scFv−CMに、活性型MMP−2 (0.10 mg/ml)を終濃度約10 nM添加し、2時間、20時間と反応を行い、各時間での分子量の変化を還元型SDS−PAGEにより測定した。また、MMP−2活性阻害剤である1, 10−Phenanthroline(Sigma−aldrich)を1 mMで添加し、同様に20時間反応させた実験について行った。その結果、図7に示すように、MMP−2添加2時間でscFv−CMの分子量である28 kDa付近にバンドが検出され、20 時間でほぼscFv−CMがメインバンドとして検出された。また、このscFv−CMのバンドの検出は、1, 10−Phenanthroline添加により抑えられた。以上より、C末端PEG化scFv−CMのPEGがMMP−2特異的に切断されることにより、scFv−CMより遊離することを確認した。
始めに、HER2へ結合するIgGの可変領域の遺伝子配列を基に、一本鎖抗体(scFv)部をコードする遺伝子断片を作製した。作製した遺伝子のN末端には、ペプチドGGSGGGS、その下流に
MMP−2により特異的に切断されるアミノ酸配列PLGVR、C末端にはタンパク精製のためのヒスチジンが6残基連続した6 x Hisタグ、またそのさらに下流にスペーサーとしてグリシンを2残基挟み信号発信分子を導入するためのシステインを配置した。上記遺伝子断片をT7プロモーターの下流に挿入したプラスミドpET−22b (+)(Novagen社)を大腸菌(Escherichia coli BL21 (DE3))に導入し、発現用菌株を得た。得られた菌株をLB−Amp培地4 mlで一晩前培養後、全量を250 mlの2 x YT培地に添加し、28℃、120 rpmで8 時間振とう培養した。その後、終濃度1 mMでIPTGを添加し、28℃で一晩培養した。培養した大腸菌を8000 x g、30 分、4℃で遠心分離し、その上清の培養液を回収した。得られた培養液の60%重量の硫酸アンモニウムを添加し、塩析によりタンパク質を沈殿させた。塩析操作した溶液を一晩4℃で静置後、8000 x g、30 min、4℃で遠心分離することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を20 mM Tris・HCl / 500 mM NaClバッファーに溶解し、1 Lの同バッファーへ透析した。透析後のタンパク質溶液を、His・Bind(商標) Resin(Novagen社)を充填したカラムへ添加し、Niイオンを介した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したN末端ペプチドとMMP−2基質を導入したhu4D5−8 scFv (scFv−NPM)は、SDS−PAGEによりシングルバンドを示し分子量は約28 kDaであることを確認した。
上記で調製したscFv−NPMにMMP−2を添加することにより、ペプチドが切断されて生じる分子量の変化を測定した。TCNB bufferに透析したPEG化scFv 約4 μMに、活性型MMP−2 0.10 mg/mlを約10 nM添加し、約20時間反応を行い、分子量の変化を還元型SDS−PAGEにより測定した。その結果、図8に示すように、MMP−2を添加することにより、scFv−NPMでは分子量の低下が検出された。また、scFv−NM、scFv−CMも比較として示した。一方、scFv−WTでは分子量の低下は検出されなかった。以上より、scFv−NPMのペプチドがMMP−2により切断されることを確認した。
上記で作製した種々のscFvと抗原であるHER2との相互作用をBiacore Xシステム(GEヘルスケア株式会社)を用いて測定し、MMP−2添加前と添加後20時間での種々のscFvの結合能力の変化を測定した。抗原としては、Recombinant Human ErbB2 / Fc Chimera(R&D Systems, Inc.)を用いて、メーカーの推奨に従って、CM−5チップ表面のカルボキシメチルデキストラン鎖へのアミンカップリングにより固定した。固定化量は、約1000〜1300 RU程度であった。ランニングバッファーとしてはPBS−T(2.68 mM KCl / 137 mM NaCl / 1.47 mM KH2PO4 / 1m M Na2HPO4 / 0.005% Tween 20, pH7.4)を用いて、5〜100 nMに調製したサンプルを流速20 ul/minの条件下でインジェクトし結合能力を評価した。結合能力を評価したサンプルとしては、MMP−2非添加でのscFv−CM、MMP−2非添加でのscFv−CMのC末端に2、5、12、20、40 kDaのPEG−マレイミドを導入したサンプル、MMP−2添加後のscFv−CMのC末端に40 kDaのPEG−マレイミドを導入したサンプル、MMP−2を添加、非添加でのscFV−NM、MMP−2を添加、非添加でのscFv−NPM、MMP−2添加、非添加でのscFv−NMのN末端に5、20、40 kDaのPEG−アルデヒドを導入したサンプルについて結合能を評価した。図9には、作製したN末端PEG化scFv−NM、C末端PEG化scFv−CMのMMP−2添加、非添加での、HER2との相互作用をBiacore Xシステムを用いて測定して得られた結合速度定数konの対数を縦軸にPEGの分子量を横軸にとった結果を示す。図9に示すように、C末端に比べ、N末端にPEGを導入する方が、より大きくkonを低下させることが可能であり、MMP−2を添加することにより、konを大きく変化させることが可能であることを確認した。具体的には、N末端にPEG 5 kDaを導入したscFv−NMでは、C末端にPEG 12 kDaを導入したscFv−CMと同等のkonの値を示しており、C末端に比べN末端の方が、より低分子量のPEGで大きくkonを低下させることが可能であることを確認した。また、MMP−2添加によるkonの変化度はC末端にPEG 40 kDaを導入したscFv−CMでは約5倍程度であるのに対して、N末端にPEG 20 kDaを導入したscFv−NMでは約15倍であり、C末端に比べN末端の方が、より大きく結合能力を変化させることが可能であることを確認した。また、scFv−NMとscFv−NPMのMMP−2添加前後でのkonの変化についても比較したところ、ほぼ同等のkonの変化であることを確認した。
Claims (10)
- 一般式(1)で表されるポリマーからなる化合物。
L−Y−A (1)
(式中、Aは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Lはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Yはペプチド部であって、一本鎖抗体部Aとリンカー部Lとを連結する0個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Lはペプチド部YのN末端または一本鎖抗体部AのN末端に結合している) - 一般式(2)で表されるポリマーからなる化合物。
X−L−Y−A (2)
(式中、Aは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Lはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Yはペプチド部であって、一本鎖抗体部Aとリンカー部Lとを連結する0個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Lはペプチド部YのN末端または一本鎖抗体部AのN末端に結合している。Xはポリエチレングリコール、有機色素、有機ポリマー、粒子のいずれかである) - 前記ポリエチレングリコールの分子量が20kDa以上であることを特徴とする請求項2に記載の化合物。
- 前記ポリエチレングリコールの分子量が40kDa以下であることを特徴とする請求項2に記載の化合物。
- 前記リンカー部が、配列番号2または配列番号3のいずれか一方のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記一本鎖抗体部が、配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記一本鎖抗体部に信号発信分子が結合していることを特徴とする請求項1乃至6のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記信号発信分子が酸化鉄微粒子であることを特徴とする請求項7に記載の化合物。
- 病変マーカーの検出方法において、請求項7又は8に記載の化合物を個体に投与、又は個体より得られた試料に添加し、信号を検出することにより、該個体中もしくは個体より得られた試料中の病変マーカーの存否、又は病変マーカーを産生する病変部位の存否を検出する方法。
- 一般式(1)で表されるポリマーからなる化合物の製造方法であって、
一本鎖抗体部Aをコードする塩基配列と、リンカー部Lをコードする塩基配列と、ペプチド部Yをコードする塩基配列と、を有する核酸をプラスミドに挿入する工程と、
前記核酸が挿入されたプラスミドを菌に導入する工程と、
前記プラスミドを導入した菌が発現した化合物を回収する工程と、
を有することを特徴とする製造方法。
L−Y−A (1)
(式中、Aは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Lはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Yはペプチド部であって、一本鎖抗体部Aとリンカー部Lとを連結する0個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Lはペプチド部YのN末端または一本鎖抗体部AのN末端に結合している)
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