EA013535B1 - Полимерный конъюгат биоактивного компонента (варианты), способ его получения и использования, фармацевтические продукты на его основе - Google Patents

Полимерный конъюгат биоактивного компонента (варианты), способ его получения и использования, фармацевтические продукты на его основе Download PDF

Info

Publication number
EA013535B1
EA013535B1 EA200501051A EA200501051A EA013535B1 EA 013535 B1 EA013535 B1 EA 013535B1 EA 200501051 A EA200501051 A EA 200501051A EA 200501051 A EA200501051 A EA 200501051A EA 013535 B1 EA013535 B1 EA 013535B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
cytokine
conjugate
growth factor
receptor
Prior art date
Application number
EA200501051A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200501051A1 (ru
Inventor
Шиям С. Бхаскаран
Мэрри Р. Шермэн
Марк Г. П. Сейфер
Л. Дэвид Уильямс
Original Assignee
Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк. filed Critical Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк.
Publication of EA200501051A1 publication Critical patent/EA200501051A1/ru
Publication of EA013535B1 publication Critical patent/EA013535B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1808—Epidermal growth factor [EGF] urogastrone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/30—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/02—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/12—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds derived from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/46—Polyesters chemically modified by esterification
    • C08G63/48—Polyesters chemically modified by esterification by unsaturated higher fatty oils or their acids; by resin acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

Представлены способы синтеза полимерных конъюгатов цитокинов, хемокинов, факторов роста, полипептидных гормонов и их рецептор-связывающих антагонистов, причем конъюгаты сохраняют необычайно высокую рецептор-связывающую активность. Получение полимерных конъюгатов согласно способам, соответствующим данному изобретению, снижает до минимума или позволяет избежать стерического ингибирования взаимодействий рецептор-лиганд, которое обычно является результатом присоединения полимеров к рецептор-связывающим участкам цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов, а также их агонистическим и антагонистическим аналогам. Изобретение представляет также конъюгаты и композиции, полученные данными способами. Конъюгаты, соответствующие данному изобретению, сохраняют повышенный уровень рецептор-связывающей активности по сравнению с полученными традиционными способами связывания полимеров, которые не направлены на то, чтобы избежать рецептор-связывающих доменов цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов. Конъюгаты, соответствующие данному изобретению, демонстрируют также увеличенный полупериод существования in vivo и in vitro по сравнению с неконъюгированными цитокинами, хемокинами, факторами роста и полипептидными гормонами. Данное изобретение представляет также наборы, содержащие данные конъюгаты и/или композиции, и способы использования таких конъюгатов и композиций во множестве диагностических, профилактических, терапевтических способов и биопроцессинге.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к областям биохимии белков, а также фармакологии и медицине. В частности, изобретение представляет способы получения конъюгатов между водорастворимыми полимерами (например, полиэтиленгликолем и его производными) и ряда биоактивных компонентов, которые имеют повышенную рецептор-связывающую активность по сравнению со стандартными конъюгатами полимер-биоактивного компонента. В частности, изобретение представляет способы получения полимерных конъюгатов ряда рецептор-связывающих белков с необычайно высокой рецептор-связывающей активностью. Изобретение представляет также конъюгаты, полученные данными способами, композиции, содержащие данные конъюгаты, наборы, содержащие данные конъюгаты, и композиции, а также способы применения конъюгатов и композиций для предупреждения, диагностики и лечения многих медицинских и ветеринарных состояний.
Сведения о предшествующем уровне техники
Цитокины представляют собой регуляторные белки, которые контролируют выживаемость, рост, дифференцировку и/или эффекторную функцию клеток эндокринным, паракринным или аутокринным образом (см. обзор Νίοοίη Ν.Ά. (1994) в монографии Руководство по цитокинам и их рецепторам (ОшбеЬоок 1о СуЮкшек апб Тйечг РесерЮгк). под ред. Νίοοίη Ν.Α., с.1-7, ОхГогб ИшуегШу Ргекк, №\ν Уогк). Хемокины представляют собой семейство структурно близких гликопротеинов с сильной активностью активации лейкоцитов и/или хемотактической активностью (см. обзор Орреийечт 1.1. и соавт. (1997), Сйп. Сапсег Кек., 3:2682-2686). Подобно их близкородственным соединениям, полипептидные гормоны и факторы роста, цитокины и хемокины инициируют свои регуляторные функции связыванием со специфическими рецепторными белками на поверхности их клеток-мишеней (см. обзоры КоккчакоГГ Α.Α. и соавт. (1998), Α6ν. Рго1еш Сйет., 52:67-108; ОпиГГег 1.1. и соавт. (2002), Тгепбк Рйагтасо1. 8ск, 23:459-467). Цитокины, хемокины, факторы роста и полипептидные гормоны имеют множество потенциальных вариантов применения в качестве терапевтических агентов вследствие их активности, специфичности, маленького размера и относительной простоты получения в рекобинантных организмах.
Два ключевых фактора препятствуют созданию цитокинов, в частности, и рекомбинантных белков в целом как терапевтических агентов - их, как правило, короткие полупериоды существования в системе кровообращения и их потенциальная антигенность и иммуногенность. Как используют в данном контексте и в целом в области техники, термин антигенность относится к способности молекулы связываться с ранее существующими антителами, тогда как термин иммуногенность относится к способности молекулы вызывать иммунный ответ ш νίνΌ, включает ли данный ответ образование антител (гуморальный ответ) или стимуляцию клеточных иммунных ответов. Для введения рекомбинантных терапевтических белков часто является желательным внутривенное (ί.ν.) введение с целью достижения наиболее высоких активностей в системе кровообращения и сведения к минимуму проблем биодоступности и распада. Однако полупериоды существования маленьких белков после внутривенного введения обычно являются чрезвычайно короткими (см. примеры в статьях Могбепй 1. и соавт. (1991), Рйагт. Кек., 8:13511359; Ки^аЬага Т. и соавт. (1995), Рйагт. Кек., 12:1466-1469). Белки с гидродинамическими радиусами, превышающими радиус сывороточного альбумина, который имеет радиус Стоукса приблизительно 36 А и молекулярную массу приблизительно 66000 Да (66 кДа), как правило, задерживаются в кровотоке здоровыми почками. Однако белки меньшего размера, включая цитокины, такие как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (0-С8Р), интерлейкин-2 (ИЛ-2), интерферон-α, (ИФН-α) и интерферон-γ (ИФН-γ), быстро выводятся из кровотока посредством гломерулярной (клубочковой) фильтрации (см. статьи Вгеппег В.М. и соавт. (1978), Αт. 1. Рйукю1. 234: Р455-Р460; Уепка1асйа1ат Μ.Ά. и соавт. (1978), Сис. Кек., 43:337-347; ХПкоп О., (1979), 1. Оеп. Рйукю1., 74:495-509; КпаиГ Μ. 1. и соавт. (1988), 1. Вю1. Сйет., 263:15064-15070; КПа Υ. и соавт. (1990), Эгид Иек. ИеНу., 6: 157-167; Кок1ашд Ь и соавт. (1998), 1. Αт. 8ос. №рйго1., 9: 2344-2348). В результате поддержание терапевтически эффективных концентраций маленьких рекомбинантных белков в системе кровообращения представляет собой проблему после инъекции. Вследствие этого, как правило, приходится вводить более высокие концентрации таких белков и проводить более частые инъекции. Полученные в результате схемы дозирования повышают стоимость терапии, снижают вероятность соответствия требованиям пациента и повышают риск неблагоприятных событий, например иммунных реакций. Оба, клеточный и гуморальный, иммунные ответы могут снижать циркулирующие в крови концентрации инъецированных рекомбинантных белков до той степени, которая может препятствовать введению эффективной дозы, или может привести к условиям, ограничивающим лечение, включая ускоренный клиренс, нейтрализацию эффективности и анафилаксию (см. статьи Кадпйаттаг Р. и соавт. (1994), В1ооб, 84:4078-4087; \ν;·ιά1ι\ν;·ι М. и соавт. (1999), Сйп. Сапсег Кек. 5:1353-1361; Н)е1т 8код Α.-Ь. и соавт. (2001), Сйп. Сапсег Кек., 7:1163-1170; Ы 1. и соавт. (2001), В1ооб, 98:3241-3248; Ваккег К.Ь. и соавт. (2002), В1ооб, 99:2599-2602; 8сйе11екепк Н., (2002), Сйп. Тйег., 24:1720-1740). Модификация рекомбинантных белков путем ковалентного присоединения полиэтиленгликоля (ПЭГ) широко исследовалась как средство, направленное на вышеописанные недостатки (см. обзор 811егшап М.К. и соавт. (1997) в монографии Полиэтиленгликоль: химия и биологическое применение (Ро1у(е111у1епе д1усо1): Сйетщйу апб Вю1од1са1 Αррйсайопк), под ред. Натк ГМ. и соавт. с. 155
- 1 013535
169, Атепсап Сйетюа1 δοοίοίν. \ν;·ΐ51ιίη§1οη. Э.С.; статью КоЬейк М.1. и соавт. (2002), Αάν. Эгид Όβΐίν. Кеу., 54:459-476).
Показано, что присоединение ПЭГ к белкам стабилизирует белки, улучшает их биодоступность и/или снижает их иммуногенность ίη νίνο. (Ковалентное присоединение ПЭГ к белку или другой субстанции называют в данном контексте, и оно известно в технике как ПЭГилирование). Кроме того, ПЭГилирование может существенно увеличить гидродинамический радиус белков. Когда маленький белок, такой как цитокин, хемокины, факторы роста и полипептидные гормоны, связывают с одной длинной цепью ПЭГ (например, имеющей молекулярную массу по меньшей мере приблизительно 18 кДа), полученный в результате конъюгат имеет гидродинамический радиус, превышающий радиус сывороточного альбумина, и его клиренс из системы кровообращения через почечные клубочки резко замедляется. Комбинированные эффекты ПЭГилирования - пониженный протеолиз, уменьшенное иммунное распознавание и уменьшенные скорости почечного клиренса - обусловливают существенные преимущества ПЭГилированных белков как терапевтических агентов.
С 1970-х гг. были сделаны попытки применить ковалентное присоединение полимеров для повышения безопасности и эффективности различных белков, предназначенных для фармацевтического применения (см., например, Όανίδ Е.Е. и соавт., патент США № 4179337). Некоторые примеры включают связывание ПЭГ или полиэтиленоксида (ПЭО) с аденозиндезаминазой (ЕС 3.5.4.4) для применения при лечении тяжелого заболевания, связанного с комбинированным иммунодефицитом (см. статьи Ωονίδ 8. и соавт. (1981), С1ш. Ехр. 1ттипо1., 46:649-652; Нег5ЙПе1б М.8. и соавт. (1987), N. Епд1. 1. Меб. 316:589596), с супероксиддисмутазой (ЕС 1.15.1.1) для лечения воспалительных состояний (см. 8айет М. и соавт., патенты США №№ 5006333 и 5080891) и с уратоксидазой (ЕС 1.7.3.3) для выведения избытка мочевой кислоты из крови и мочи (см. статьи Ке11у 8.1. и соавт. (2001), 1. Ат. 8ос. №рйто1., 12:1001-1009; \νί11ί;·ιιη5 Ь.Э. и соавт., публикация РСТ № νθ 00/07629 А2 и А3 и патент США № 6576235; 8йегтап М. К. и соавт., публикация РСТ № νθ 01/59078 А2).
ПЭО и ПЭГ представляют собой полимеры, состоящие из ковалентно связанных звеньев этиленоксида. Данные полимеры имеют следующую общую структуру:
К1-(ОСН2СН2)п-К2, в которой К2 может обозначать гидроксильную группу (или ее реакционное производное) и Κι может представлять собой водород, как в дигидроксиПЭГ (ПЭГдиол), метильную группу, как в монометоксиПЭГ (мПЭГ) или другую группу низшего алкила, например, как в изопропоксиПЭГ или третбутоксиПЭГ. Параметр η в общей структуре ПЭГ показывает число этиленоксидных звеньев в полимере и относится в данном контексте и в области техники к степени полимеризации. Полимеры такой же общей структуры, в которых Κι представляет собой С1-7-алкильную группу, были также обозначены как оксирановые производные (см. УакикойсЫ Т. и соавт., патент США № 6455639). ПЭГ и ПЭО могут быть линейными, разветвленными (см. статью Еике I. и соавт. (1994), 1. Соп1го1 Ке1еаке, 30:27-34) или звездообразной формы (см. статью Мет11 Ε.ν., (1993), 1. Вюта1ег. 8ск Ро1ут. Еб., 5:1-11). ПЭГ и ПЭО являются амфипатическими, т.е. они растворимы в воде и некоторых органических растворителях и могут прилипать к липидсодержащим материалам, включая вирусы с оболочками и мембраны животных и растительных клеток. Некоторые случайные или блок-, либо чередующиеся сополимеры этиленоксида (ОСН2СН2) и пропиленоксида, которые имеют следующую структуру:
СН2-СН-СН3
О обладают свойствами, которые достаточно близки свойствам ПЭГ, что, как полагают, делает данные сополимеры приемлемыми заместителями ПЭГ в ряде вариантов применения (см., например, Н1га(ап1 Н., патент США № 4609546 и 8айет М. и соавт., патент США № 5283317). Термин полиалкиленоксиды и аббревиатуру ПАО используют в данном контексте для обозначения таких сополимеров, а также для ПЭГс или ПЭОс и сополимеров поли(оксиэтиленоксиметилена) (см. Р1й С.С. и соавт., патент США № 5476653). Как используют в данном контексте, термин полиалкиленгликоли и аббревиатуру ПАГ'' используют для родового обозначения полимеров, пригодных для применения в конъюгатах, соответствующих изобретению, в особенности ПЭГ, в частности ПЭГ, содержащего одну реакционную группу (монофункционально активированный ПЭГ).
Для ковалентного присоединения ПЭГ или других полиалкиленоксидов к белку требуется превращение по меньшей мере одной концевой группы полимера в реакционную функциональную группу. Данный процесс часто называют активацией и продукт называют активированным ПЭГ или активированным полиалкиленоксидом. МонометоксиПЭГ, в которых кислород на одном конце закрыт нереакционной химически стабильной метильной группой (для образования метоксильной группы) и на другом конце - функциональной группой, которая реагирует с аминогруппами на молекуле белка, наиболее часто используют в данных подходах. Так называемые разветвленные мПЭГ, которые содержат две или более метоксильные группы, дистальные относительно единственной активированной функциональной группы, используют менее часто. Примером разветвленного ПЭГ является ди-мПЭГ-лизин, в котором ПЭГ связан с обеими аминогруппами, и карбоксильная группа лизина наиболее часто активирована
- 2 013535 эстерификацией Ν-гидроксисукцинимидом (см. Магбпе/ А. и соавт., патент США № 5643575; Сгееп\та1б В.В. и соавт., патент США № 5919455; Натлк 1.М. и соавт., патент США № 5932462).
Обычно активированные полимеры реагируют с биоактивным соединением, имеющим нуклеофильные функциональные группы, которые служат центрами присоединения. Одна нуклеофильная функциональная группа, которую обычно используют как центр присоединения, представляет собой ε-аминогруппу остатков лизина. Доступные для растворителей α-аминогруппы, группы карбоновых кислот, гуанидиногруппы, имидазольные группы, подходящим образом активируемые карбонильные группы, окисленные углеводные структуры и тиоловые группы также были использованы в качестве центров присоединения.
Гидроксильная группа ПЭГ была активирована цианурхлоридом перед присоединением к белкам (см. статьи АЬие1ю\\ък| А. и соавт. (1977), 1. Βΐοΐ. Сйет., 252:3582-3586; АЬисйо\\ък| А. и соавт. (1981), Сапсег Ттеа1. Вер., 65:1077-1081). Однако применение данного способа имеет недостатки, такие как токсичность цианурхлорида и его неспецифическая реакционность в отношении белков, имеющих функциональные группы, отличные от аминов, такие как доступные для растворителя остатки цистеина или тирозина, которые могут быть основными в осуществлении функции. Для того чтобы преодолеть данные и другие недостатки, вводили альтернативно активированные ПЭГ, такие как сукцинимидилсукцинатные производные ПЭГ (СС-ПЭГ) (см. статью АЬисйотек1 А. и соавт. (1984), Сапсег Вюсйет. Вюрйук., 7:175-186), сукцинимидилкарбонатные производные ПАГ(СК-ПАГ) (см. 8а1Гег М. и соавт., патент США № 5006333) и альдегидные производные ПЭГ (см. Воуег О.Р., патент США № 4002531).
Обычно несколько (например, 5-10) цепей одного или более ПАГ, например одного или более ПЭГ с молекулярной массой от приблизительно 5 до приблизительно 10 кДа, связывают с белком-мишенью через первичные аминогруппы (ε-аминогруппы остатков лизина и, возможно, α-аминогруппы аминоконцевой (Ν-концевой) аминокислоты). В последнее время были синтезированы конъюгаты, содержащие одну цепь мПЭГ более высокой молекулярной массы, например 12, 20 или 30 кДа. Продемонстрированы прямые корреляции между полупериодами существования конъюгатов в плазме и увеличения молекулярной массы и/или увеличения числа связанных цепей ПЭГ (см. статьи КпаиГ М.1. и соавт., см. выше; Ка1те Ν.ν., (1990), 1. 1ттипо1., 144:209-213; С1агк В. и соавт. (1996), 1. ΒίοΙ. Сйет., 271:21969-21977; Ьеопд 8.В. и соавт. (2001), Су1окше, 16:106-119). С другой стороны, по мере увеличения числа цепей ПЭГ, связанных с каждой молекулой белка, повышается вероятность того, что будет модифицирована аминогруппа на основном участке белка и, следовательно, будет нарушена биологическая функция белка, в особенности, если это белок, связывающий рецептор. Для более крупных белков, которые содержат много аминогрупп, и для ферментов с низкомолекулярными субстратами может быть приемлем компромисс между увеличенной продолжительностью действия и пониженной специфической активностью, поскольку он дает общее повышение биологической активности ПЭГ-содержащих конъюгатов ш у1уо. Однако для менее крупных белков, которые работают через взаимодействия с клеточными поверхностными рецепторами, таких как цитокины, хемокины, факторы роста и полипептидные гормоны, было показано, что относительно высокая степень замещения снижает функциональную активность до уровня, аннулирующего преимущество увеличенного полупериода существования в кровотоке (см. статью С1агк В. и соавт., см. выше).
Таким образом, конъюгирование полимеров представляет собой хорошо разработанную технологию пролонгирования биоактивности и снижения иммунореактивности терапевтических белков, таких как ферменты (см., например, предварительную заявку США № 60/436020, поданную 26 декабря 2002 г. и предварительные заявки США №№ 60/479913 и 60/479914, обе из которых поданы 20 июня 2003 г., описания которых включены в данном контексте в виде ссылки во всей их полноте). Однако конъюгирование полимеров с рецептор-связывающими белками, которые действуют путем связывания специфическим образом клеточных поверхностных рецепторов, обычно (1) нарушает данное связывание; (2) заметно снижает активности сигнальной трансдукции агонистов цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов и (3) заметно снижает конкурентные активности антагонистов цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов. Опубликованные примеры данных коньюгатов с пониженной активностью связывания рецепторов включают конъюгаты полимеров с человеческим гормоном роста (ЮН) (см. статью С1агк В. и соавт., см. выше); антагонистами йСН (см. статью Вокк В.1.М. и соавт. (2001), 1. С1ш. Еибоспиок Ме1аЬ., 86:1716-1723) и ИФН-α (см. статьи Вайоп Р. и соавт. (2001), Вюсопщд. Сйет. 12:195-202; ^уйе Э.С. и соавт. (2001), Рйагт. Век., 18:1354-1360 и \Уапд Υ.-8. и соавт. (2002), Абу. Эгид Эейу. Веу., 54:547-570) и О-С8Г (см. Кшкбет, О. и соавт., публикация РСТ № \¥О 96/11953; статью Во\теп 8. и соавт. (1999), Ехр. Неша1о1., 27:425-432) в числе прочих. В крайнем случае, связывание полимеров с интерлейкином-15 (ИЛ-15) превращает данный ИЛ-2-подобный фактор роста в ингибитор клеточной пролиферации (см. статью Ре1Ш Ό.Κ. и соавт. (1997), 1. Вю1. Сйет., 272:2312-2318). Не имея в виду быть связанными теорией, механизм данных нежелательных эффектов ПЭГилирования может включать стерические препятствия взаимодействий рецептора с объемными группами ПЭГ, нейтрализацию заряда или оба эффекта.
Таким образом, имеется потребность в способах получения ПАГ-содержащих (например,
- 3 013535
ПЭГ - и/или ПЭО-содержащих) конъюгатах, в особенности в конъюгатах между данными водорастворимыми полимерами и рецептор-связывающими белками при сохранении существенной биоактивности (например, по меньшей мере приблизительно 40%), почти полной биоактивности (например, по меньшей мере приблизительно 80%) или практически полной биоактивности (например, по меньшей мере приблизительно 90%). Данные конъюгаты будут иметь обусловленные полимерным компонентом преимущества в виде повышенной растворимости, стабильности, времени полужизни и биодоступности ίη νίνο и будут демонстрировать в значительной мере повышенную активность или применимость по сравнению с обычными полимерными конъюгатами у животных, которым данные конъюгаты введены с профилактическими, терапевтическими или диагностическими целями.
Сущность изобретения
Данное изобретение направлено на вышеописанные потребности и представляет способы получения конъюгатов водорастворимых полимеров, например полиэтиленгликоля и его производных, с биоактивными компонентами, в особенности рецептор-связывающими белками, в частности терапевтическими или диагностическими биоактивными компонентами, такими как цитокины, хемокины, полипептидные гормоны и полипептидные факторы роста. Изобретение представляет также конъюгаты, полученные данными способами. По сравнению с соответствующими неконъюгированными биоактивные компоненты, конъюгаты, соответствующие изобретению, обладают повышенной стабильностью (т.е. более длительным сроком хранения и более длительными полупериодами существования ίη νίνο). Кроме того, по сравнению с конъюгатами того же самого биоактивного компонента, полученными с использованием полимерных цепей, которые случайным образом присоединены к доступным для растворителя центрам на полипептидных цепях, конъюгаты, соответствующие изобретению, имеют повышенную рецепторсвязывающую активность, которую можно измерить или использовать ίη νίίτο, и повышенную эффективность ίη νίνο. Изобретение представляет также такие усовершенствованные конъюгаты для применения в промышленной клеточной культуре. Более того, изобретение представляет композиции, содержащие данные конъюгаты, наборы, содержащие такие конъюгаты, и композиции, и способы применения конъюгатов и композиций во множестве профилактических, диагностических и терапевтических схем. В одном варианте осуществления изобретение представляет способы сохранения рецептор-связывающей активности цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона, предусматривающие селективное связывание одного или более синтетических водорастворимых полимеров с аминоконцевой аминокислотой цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их антагониста, где аминоконцевая аминокислота находится в отдалении от одного или более рецептор-связывающих доменов цитокина. В близком варианте осуществления изобретение представляет способы сохранения рецептор-связывающей активности цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их антагониста, предусматривающие селективное связывание одного или более синтетических водорастворимых полимеров в или около центров гликозилирования цитокина, причем один или более центров гликозилирования находится/находятся в отдалении от одного или более рецептор-связывающих доменов цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их антагониста.
Подходящие полимеры для применения в данных способах, соответствующих изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, один или более полиалкиленгликолей (включая, но без ограничения перечисленным, один или более полиэтиленгликолей, один или более монометоксиполиэтиленгликолей и один или более моногидроксиполиэтиленгликолей, один или более полиалкиленоксидов, один или более полиоксиранов, один или более полиолефиновых спиртов, например поливиниловый спирт, один или более поликарбоксилатов, один или более поливинилпирролидонов, один или более полиоксиэтиленоксиметиленов, одну или более полиаминокислот, один или более полиакрилоилморфолинов, один или более сополимеров одного или более амидов и одного или более алкиленоксидов, один или более декстранов и одну или более гиалуроновых кислот. Полимеры, подходящие для применения в способах, соответствующих изобретению, как правило, имеют молекулярные массы от приблизительно 1 до приблизительно 100 кДа включительно или, в частности, молекулярные массы от приблизительно 1 до приблизительно 5кДа включительно, от приблизительно 10 до приблизительно 20 кДа включительно, от приблизительно 18 до приблизительно 60 кДа включительно, от приблизительно 12 до приблизительно 30 кДа включительно или приблизительно 10 кДа либо приблизительно от 20 до 30 кДа.
Множество цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов и аналогов, которые имитируют (т.е. проявляют агонизм) или проявляют антагонизм в отношении биологических эффектов соответствующего цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона, которые опосредуются их специфическими поверхностными клеточными рецепторами, пригодны для применения при получении настоящих конъюгатов. Они включают цитокины, хемокины, факторы роста или полипептидные гормоны, имеющие структуру четырехспирального пучка (включая, но без ограничения перечисленным гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Е), макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-С8Е), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (6М-С8Е), фактор ингибирования лейкоза (ЫЕ), эритропоэтин (Еро), тромбопоэтин (Тро), фактор стволовых клеток (8СЕ), лиганд Р113, онкостатин М (О8М), интерлейкин-2 (ИЛ-2), ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12 (субъединица р35), ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17, интерферон-α (ИФН-α), интерферон-β
- 4 013535 (ИФН-β) (включая ИФН-β-Ιό. консенсусный интерферон, пролактин и гормон роста и их мутеины, варианты, аналоги и производные): цитокины, хемокины, факторы роста или полипептидные гормоны, имеющие структуру β-складки или β-ствола (включая, но без ограничения перечисленным, фактор некроза опухоли α (ΤΝΕ-α), ИЛ-Ια, ИЛ-Ιβ, ИЛ-12 (субъединицу р40), ИЛ-16, эпидермальный фактор роста (ЕСЕ), инсулиноподобный фактор роста-1 (1СЕ-1), фактор роста основных фибробластов (ЬЕСЕ), кислый ЕСЕ, ЕСЕ-4 и фактор роста кератиноцитов (КСЕ; ЕСЕ-7), и их мутеины, варианты, аналоги и производные), и цитокины, хемокины, факторы роста или полипептидные гормоны, имеющие смешанную α/β структуру (включая, но без ограничения перечисленным, нейтрофил-активирующий пептид-2 (ΝΑΡ-2), фактор 1α из клеток стромы (8ЭЕ-1а), ИЛ-8, белок-1 хемоаттрактанта моноцитов (МСР-1) МСР-2, МСР-3, эотаксин-1, эотаксин-2, эотаксин-3, ΚΑΝΤΈ8, фактор-1, ингибирующий миелоидные предшественники (МР1Е-1), нейротактин, фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (М1Е) и СЕО/активность, стимулирующую рост меланомы (СКО-а/МС8А) и их мутеины, варианты, аналоги и производные). Полипептидные гормоны, пригодные для применения в данном изобретении, включают, но без ограничения перечисленным, инсулин и аналоги инсулина, которые имитируют или проявляют антагонизм в отношении биологических эффектов инсулина, которые опосредуются инсулиновыми рецепторами; пролактин и аналоги пролактина, которые имитируют или проявляют антагонизм в отношении биологических эффектов пролактина, которые опосредуются пролактиновыми рецепторами, и гормон роста (в особенности человеческий гормон роста) и его аналоги, которые имитируют или проявляют антагонизм в отношении биологических эффектов гормона роста, которые опосредуются рецепторами гормона роста.
Особенно предпочтительные цитокины, хемокины, факторы роста и полипептидные гормоны, пригодные для применения согласно данному изобретению, включают ИЛ-2, ИЛ-10, ИФН-α, ИФН-β, (включая ИФН^ЧЬ), ΤΝΡ-α, 1СЕ-1, ЕСЕ, ЬЕСЕ: ЬСН, пролактин и инсулин. Кроме того, особенно пригодными для применения являются конкурентные антагонисты вышеуказанных цитокинов, хемокины, факторы роста и полипептидные гормоны, например антагонисты ΤΝΡ-α, 11СН или пролактина, а также мутеины, варианты и производные данных цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов.
В ряде вариантов осуществления один или более полимеров ковалентно связан(ы) (в частности, посредством связи вторичного амина) с α-аминогруппой аминоконцевой аминокислоты на цитокине, хемокине, факторе роста и полипептидном гормоне. В других вариантах осуществления один или более полимеров ковалентно связан(ы) с химически реакционной группой боковой цепи (например, гидроксильной группой, сульфгидрильной группой, гуанидиновой группой, имидазольной группой, аминогруппой, карбоксильной группой или альдегидным производным) аминоконцевой аминокислоты на цитокине, хемокине, факторе роста и полипептидном гормоне. В дополнительных вариантах осуществления связывание полимера с цитокином, хемокином, фактором роста и полипептидным гормоном по аминоконцевой аминокислоте или в либо около одного или более центров гликозилирования имитирует благоприятные эффекты гликозилирования цитокина, хемокина, фактора роста и полипептидного гормона. В близких вариантах осуществления связывание полимера с цитокином, хемокином, фактором роста и полипептидным гормоном в или около одного или более центров гликозилирования на цитокине, хемокине, факторе роста и полипептидном гормоне имитирует положительные эффекты гипергликозилирования цитокина, хемокина, фактора роста и полипептидного гормона, где термин гипергликозилирование указывает на ковалентное присоединение простых или сложных углеводных молекул, кроме тех, которые присутствуют в нативной структуре.
Изобретение представляет также конъюгаты, полученные способами, соответствующими изобретению. Конъюгаты, соответствующие изобретению, содержат выбранный цитокин, выбранный хемокин, выбранный фактор роста, выбранный полипептидный гормон или его выбранный антагонист (такой как вышеописанные), связанный с одним или более синтетических водорастворимых полимеров (таких как вышеописанные), где один или более полимеров связан/связаны с аминоконцевой аминокислотой цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона и где аминоконцевая аминокислота находится в отдалении от одного или более рецептор-связывающих доменов выбранного цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона. Кроме того, конъюгаты, соответствующие изобретению, содержат выбранный цитокин, выбранный хемокин, выбранный фактор роста или выбранный полипептидный гормон или его выбранный антагонист (такой как вышеописанные), связанный с одним или более синтетических водорастворимых полимеров (таких как вышеописанные), где один или более полимеров связаны с одним или более центров гликозилирования выбранного цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их антагониста и где один или более центров гликозилирования находится/находятся в отдалении от одного или более рецептор-связывающих доменов цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их антагониста. Для полимерных конъюгатов агонистов, соответствующих изобретению, предпочтительно, чтобы центр(ы) присоединения полимеров был отдален от всех рецептор-связывающих доменов. Для полимерных конъюгатов ряда антагонистов, соответствующих изобретению, может быть предпочтительно, чтобы центр(ы) присоединения полимеров был отдален от некоторых рецептор-связывающих доменов, которые являются основными для осу
- 5 013535 ществления связывания, но отдаление от всех рецептор-связывающих доменов, которые важны для сигнальной трансдукции посредством агонистов, не является обязательным. Изобретение представляет также композиции, в особенности фармацевтические композиции, содержащие один или более конъюгатов, соответствующих изобретению, и один или более дополнительных компонентов, таких как один или более фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель. Изобретение представляет также наборы, содержащие один или более конъюгатов, композиций и/или фармацевтических композиций, соответствующих изобретению.
Изобретение представляет также способы предупреждения, диагностики или лечения физического нарушения у животного (например, млекопитающего, такого как человек), страдающего от или предрасположенного к физическому нарушению. Данные способы могут содержать, например, введение животному эффективного количества одного или более конъюгатов, композиций или фармацевтических композиций, соответствующих данному изобретению. Физические нарушения, которые надлежащим образом лечат или предупреждают согласно данным способам, соответствующим изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, формы рака (например, рак молочной железы, рак матки, рак яичников, рак простаты, рак яичка, рак легкого, лейкоз, лимфому, рак толстой кишки, желудочно-кишечный рак, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, рак почки, рак костей, неврологический рак, рак головы и шеи, рак кожи, саркому, аденому, карциному и миелому); инфекционные заболевания (например, бактериальные заболевания, грибковые заболевания, паразитарные заболевания и вирусные заболевания (такие как вирусный гепатит, заболевание, вызываемое кардиотропным вирусом, ВИЧ/СПИД и т.п.); и генетические нарушения (например, анемию, нейтропению, тромбоцитопению, гемофилию, карликовость и заболевание тяжелый комбинированный иммунодефицит (8СШ); аутоиммунные нарушения (например, псориаз, системную красную волчанку и ревматоидный артрит) и нейродегенеративные нарушения (например, различные формы и стадии рассеянного склероза; болезнь Крейцфельда-Якоба, болезнь Альцгеймера и т.п.).
Другие предпочтительные варианты осуществления данного изобретения будут очевидны обычному специалисту в свете следующих чертежей и описания изобретения и формулы изобретения.
Перечень чертежей
На фиг. 1-8 представлены молекулярные модели различных цитокинов и факторов роста, созданные с помощью программы КакМо1 (см. статью 8ау1е К.А. и соавт. (1995), Тгепбк Вюсйет. 8с1. 20: 374-376) на основе кристаллографических данных. Каждая из моделей представлена в формате ленты или рисунка за исключением некоторых остатков, представляющих особенный интерес, которые показаны в формате шариков и стрежней. Данные форматы являются вариантами, выбранными при использовании программы КакМо1. Темные части лент представляют домены цитокинов и факторов роста, которые, как описано, участвуют в связывании с их рецепторами. Для каждой структуры указан инвентарный код банка данных по белкам (Рго1ет Эа1а Вапк) (РИВ) (см. статьи Ьакколкк1 Κ.Ά., (2001), ИисШс Ас16к Кек., 29:221-222; РейксЬ М.С., (2002), Вюшкогтайсз, 18:934-938; 8сЬет С.Н., (2002), Сигг. Рйагт. Иек. 8:21132129).
На фиг. 1а показана модель интерферона-а-2а, (8ЕО ΙΌ N0:1), в которой четыре остатка лизина (Ьук 31, Ьук 121, Ьук 131 и Ьук 134), которые, как описано, являются первичными центрами ПЭГилирования в продукте ПЭГ-интерферон Косйе, Редакук®, представлены в формате шариков и стержней (на основе данных ВаПоп Р. и соавт., см. выше). Идентифицированы области, участвующие в связывании с его рецепторами (Связывающие центры 1 и 2). Все четыре остатка лизина, которые, как описано, ПЭГилированы, в Редакук находятся в области связывающего центра 1 (код РЭВ 1ΙΤΡ).
На фиг. 1Ь показана модель интерферона-а-2Ь, (8ЕО ΙΌ N0:2), в которой остатки, которые, как описано, являются основными центрами ПЭГилирования в РЕО-ΙΝΤΚΌΝ® 8сйегшд-Р1оидй (Н1к 34, Ьук 31, Ьук 121, Туг 129 и Ьук 131) представлены в формате шариков и стержней (на основе данных \УуНе И.С. и соавт., см. выше). Данные остатки аминокислот находятся в области связывающего центра 1.
На фиг. 1с показана модель интерферона-а-2Ь, в которой аминоконцевой остаток цистеина (Сук 1), мишень ПЭГилирования в соответствии с данным изобретением, представлена в формате шариков и стержней. Сук 1 отдален от связывающих центров 1 и 2.
На фиг. 16 показана та же самая модель интерферона-а-2Ь, что показана на фиг. 1с, к Ν-концевому остатку цистеина (Сук 1) которой присоединена одна цепь ПЭГ молекулярной массы 20 кДа. Структура ПЭГ получена с помощью адаптации программы, описанной Ьее Ь.8. и соавт. ((1999), Вюсоищд. Сйет., 10:973-981) и сделана в том же масштабе, что белок.
На фиг. 2 показана молекулярная модель человеческого интерферона-в-1а (см. 8Е0 ΙΌ N0: 3), в которой указано несколько остатков лизина, которые находятся в или вблизи от рецептор-связывающих доменов (Ьук 19, Ьук 33, Ьук 99 и Ьук 134). Кроме того, центр гликозилирования (Акп 80) и Ν-концевой остаток метионина (Ме1 1) представлены в формате шариков и стержней (на основе данных Кагрикак М. и соавт. (1997), Ргос. №И. Асаб. 8сЕ, И8А, 94:11813- 11818; Кагрикак М. и соавт. (1998), Се11 Мо1. ЫЕе 8ск, 54:1203-1216; Кипке1 Ь. и соавт. (2000), Вюсйетщйу, 39:2538-2551). Ме1 1 находится в отдалении от связывающих центров 1 и 2, тогда как некоторые остатки лизина расположены в рецептор-связывающих
- 6 013535 доменах, (код ΡΌΒ 1ЛИ1). Структура интерферона-в-1Ь отличается от структуры интсрфсрона-β-ΐα отсутствием Ν-концевого остатка метионина и углеводной частью, а также наличием остатка серина, замещенного неспаренным остатком цистеина (Сук 17).
На фиг. 3 показана молекулярная модель человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ОМ-С8Р, 8ЕО ΙΌ N0:5), в котором три остатка лизина (Ьук 72, Ьук 107 и Ьук 111), которые находятся в рецептор-связывающих доменах, а также первый остаток аминокислоты около аминоконца, который визуализируется в кристаллической структуре (Агд 4), показаны в формате шариков и стержней (на основе данных Βοζ\ν;·ΐΓκ1<ί И. А. и соавт. (1996), РгоЮпъ. 26:304-313). Аминоконцевая область ОМ-С8Р отдалена от связывающих центров 1 и 2 (код ΡΌΒ 2ОМР).
На фиг. 4 показана молекулярная модель человеческого интерлейкина-2 (ИЛ-2, 8Е0 ΙΌ N0:6), в которой остатки аминокислот, которые, как описано, включены в каждый из трех рецепторов (α, β и γ), представлены в формате шариков и стержней, как и несколько остатков лизина, которые находятся в или вблизи от рецептор-связывающих доменов. Ближайший к аминоконцу остаток аминокислоты, который визуализируется в кристаллической структуре, представляет собой серии 6 (8ег 6), который отдален от рецептор-связывающих доменов (на основе данных ВатЬотоидй Р. и соавт. (1994), 8йисЩте, 2:839-851; Рейй И.К. и соавт., см. выше) (код ΡΌΒ 3ΙΝΚ).
На фиг. 5 показана молекулярная модель человеческого эпидермального фактора роста (ЕОР, 8Е0 ΙΌ N0:7) в формате рисунка за исключением остатков, которые участвуют в связывании рецептора, и двух остатков лизина (Ьук 28 и Ьук 48), которые прилежат к рецептор-связывающим областям. Дисульфидные связи внутри цепи показаны пунктиром. Ближайший к аминоконцу остаток аминокислоты, который визуализируется в кристаллической структуре, на которой базируется данная модель, представляет собой цистеин 6 (Сук 6) (на основе данных Сатреп!ет О. и соавт. (1990), 1. ΒίοΙ. Сйет, 265:77097712; Ьи Н.-8. и соавт. (2001), 1. ΒίοΙ. Сйет., 276:34913-34917). Гибкая часть аминоконца ЕОР (остатки 15), которая не визуализируется в кристаллической структуре, по-видимому, не находится в рецепторсвязывающей области (код ΡΌΒ ИЬ9).
На фиг. 6 показана молекулярная модель фактора роста основных фибробластов (ЬРОР, 8Е0 ΙΌ N0:8) в формате рисунка, на котором остатки, участвующие в связывании с рецепторами и гепарином, идентифицированы представлением в формате шариков и стержней (на основе данных 8сЫеккшдет 1. и соавт. (2000), Мо1. Се11, 6:743-750). Первые 12 остатков аминокислот из аминоконца не участвовали в связывании рецептора (код ΡΌΒ 1Р09).
На фиг. 7 показана молекулярная модель инсулиноподобного фактора роста-1 (ЮР-1, 8Е0 ΙΌ N0:9) в формате рисунка за исключением остатков, участвующих в связывании рецептора (23-25 и 28-37), и остатка глутаминовой кислоты 3 (01и 3), который представляет собой ближайший к аминоконцу остаток аминокислоты, который визуализируется в кристаллической структуре. Идентифицировано два из остатков лизина, один из которых (Бук 27) прилежит к рецептор-связывающему домену, а другой отдален от рецептор-связывающего домена (на основе данных ΒίζοζονκΕί А.М. и соавт. (2002), Β^οсйет^κΐ^у, 41:93899397). Аминоконец ЮР-1 отдален от рецептор-связывающих доменов (код ΡΌΒ 1ΟΖΚ).
На фиг. 8 показана молекулярная модель интерферона-γ (ИФН-γ, 8Е0 ΙΌ N0:4), который представляет собой гомодимер. Для объяснения взаимодействий между двумя полипептидными цепями один из мономеров (цепь А) показан в формате ленты, а другой (цепь В) показан в формате линии. Остатки лизина (показаны в формате светлых шариков и стержней) расположены вдоль полипептидной цепи, включая области, которые участвуют в создании области контакта между мономерами или прилежат к остаткам аминокислот, которые участвуют в связывании белка. Аминоконцевая область ИФН-γ отдалена от области контакта при димеризации, но глутамин 1 (О1п 1) участвует в связывании рецептора, (см. статью ТЫе1 И.1. и соавт. (2000), 81тисШге, 8:927-936; код ΡΌΒ 1РО9).
На фиг. 9 показано фракционирование неПЭГилированного интерферона-а-2Ь (ИФН), моноПЭГилированного интерферона-а-2Ь (ПЭП-ИФН) и диПЭГилированного интерферона-а-2Ь (ПЭГ2-ИФН) с помощью катионообменной хроматографии реакционной смеси, содержащей ИФН, мПЭГ-альдегид молекулярной массы 20 кДа и восстановитель.
На фиг. 10 показаны данные анализа с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру реакционной смеси, фракционированной, как представлено на фиг. 9, и выбранных фракций, собранных с ионообменной колонки, результаты относительно которых показаны на фиг. 9.
На фиг. 11 показано фракционирование с помощью катионообменной хроматографии реакционной смеси, содержащей ИЛ-2 человека, мПЭГ-альдегид молекулярной массы 20 кДа и восстановитель. В указанных условиях элюции остаточный неПЭГилированный ИЛ-2 не элюировался с колонки в отличие от результатов, полученных для интерферона-а-2Ь, которые представлены на фиг. 9.
На фиг. 12 показаны данные анализа с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру реакционной смеси, фракционированной, как представлено на фиг. 11, и выбранных фракций, элюированных с данной колонки.
На фиг. 13 показаны данные электрофоретических анализов реакционной смеси ПЭГилированного интерлейкина-2 (ПЭГ-ИЛ-2) и фракции из катионообменной колонки, хроматограмма, относящаяся к
- 7 013535 которой, приведена на фиг. 11.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пока не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном контексте, имеют такие же значения, как обыкновенно имеются в виду обычным специалистом в области, к которой относится изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном контексте, могут быть использованы в практической реализации или тестировании данного изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны ниже.
Определения
Приблизительно: как используют в данном контексте, когда обращаются к любому числовому значению, термин приблизительно означает величину 10% от указанного значения (например, приблизительно 50°С'' охватывает интервал температур от 45 до 55°С включительно; аналогичным образом приблизительно 100 мМ охватывает интервал концентраций от 90 до 110 мМ включительно).
Остаток аминокислоты: как используют в данном контексте, термин остаток аминокислоты относится к конкретной аминокислоте, как правило, дегидратированной в результате ее участия в двух пептидных связях в полипептидном скелете или боковой цепи, но также при включении аминокислоты в одну пептидную связь, как происходит на каждом конце линейной полипептидой цепи. Остатки аминокислот обозначают трехбуквенными кодами или однобуквенными кодами, которые приняты в области техники.
Антагонист: как используют в данном контексте, термин антагонист относится к соединению, молекуле, структуре или комплексу, который снижает, значительно снижает или полностью ингибирует биологические и/или физиологические эффекты данного цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона на клетку, ткань или организм, которые опосредуются через рецепторы данного цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона. Антагонисты могут осуществлять такие эффекты множеством путей, включая, но без ограничения перечисленным, конкуренцию с агонистом за связывающий центр(ы) или рецептор(ы) на клеточной поверхности, взаимодействие с агонистом таким образом, чтобы снизить, значительно снизить или полностью ингибировать способность агониста связываться с клеточными поверхностными рецепторами; связыванием с клеточными поверхностными рецепторами и индукцией в них конформационного изменения, причем рецепторы приобретают структуру, с которой агонист не может более связываться (или может связываться только с пониженной или значительно пониженной аффинностью и/или эффективностью); индукцию физиологического изменения (например, увеличения внутриклеточных комплексов передачи сигнала, повышения уровня ингибиторов транскрипции, снижения экспрессии клеточного поверхностного рецептора лиганда и т.п.) в клетках, тканях или организмах, так что связывание агониста или физиологический сигнал, вызываемый агонистом при связывании с клеткой, снижается, значительно снижается или полностью ингибируется; и другие механизмы, посредством которых антагонисты могут осуществлять свои активности, которые знакомы обычным специалистам. Как будет понятно обычному специалисту, антагонист может иметь структуру, близкую лиганду, относительно которого он оказывает антагонистическое действие (например, антагонист может быть мутеином, вариантом, фрагментом или производным агониста) или может иметь совершенно неродственную структуру.
Биоактивный компонент: как используют в данном контексте, термин биоактивный компонент относится к соединению, молекуле, структуре или комплексу, которые имеют определенную биологическую активность ίη νίνο, ίη νίίτο или ех νίνο в отношении клетки, ткани, органа или организма и которые способны связываться с одним или более полиалкиленгликолей с образованием конъюгатов, соответствующих изобретению. Предпочтительные биоактивные компоненты включают, но без ограничения перечисленным, белки и полипептиды, такие как описаны в данном контексте.
Связанный: как используют в данном контексте, термин связанный относится к связыванию или присоединению, которое может быть ковалентным, например, посредством химического связывания, или нековалентным, например, ионными взаимодействиями, гидрофобными взаимодействиями, водородными связями и т.п. Ковалентные связи могут быть, например, сложноэфирными, эфирными, фосфоэфирными, сложнотиоэфирными, тиоэфирными, уретановыми, амидными, аминными, пептидными, имидными, гидразоновыми, тидразидными, сероуглеродными связями и фосфоруглеродными связями и т.п. Термин связанный включает такие термины, как спаренный, конъюгированный и присоединенный.
Конъюгат/конъюгирование: как используют в данном контексте, термин конъюгат относится к продукту ковалентного присоединения полимера, например, ПЭГ или ПЭО, к биоактивному компоненту, например белку или гликопротеину. Термин конъюгирование относится к образованию конъюгата, как описано в предыдущем предложении. Любой способ, обычно используемый компетентными специалистами в области конъюгирования полимеров с биологически активными материалами, может быть использован в данном изобретении.
Спаренный: термин спаренный, как используют в данном контексте, относится к присоединению посредством ковалентных связей или сильных нековалентных взаимодействий, обычно и предпочтительно к присоединению посредством ковалентных связей. Любой способ, обычно используемый компе
- 8 013535 тентными специалистами в области спаривания биологически активных материалов, может быть использован в данном изобретении.
Цитокин/хемокин: как используют в данном контексте, термин цитокин определяют как секретируемый регуляторный белок, который контролирует выживаемость, рост, дифференцировку и/или эффекторную функцию клеток эндокринным, паракринным или аутокринным образом (см. обзор в Νίοοία Ν.Α., см. выше; статью Ко881а1соТТ Α.Α. и соавт., см. выше). Аналогично, как используют в данном контексте, термин хемокин определяют как представитель семейства структурно близких гликопротеинов с сильными активностями активации лейкоцитов и/или хемотактической активностью (см. обзор Оррспйснп 1.1. и соавт., см. выше). Согласно данным определениям цитокины и хемокины включают интерлейкины, колониестимулирующие факторы, факторы роста и другие пептидные факторы, продуцируемые множеством клеток, включая, но без ограничения перечисленным, т. е. которые специально описаны или приведены в качестве примеров в данном контексте. Как близкие им соединения, полипептидные гормоны и факторы роста, цитокины и хемоктины инициируют свои регуляторные функции путем связывания со специфическими рецепторными белками на поверхности своих клеток-мишеней.
Заболевание, нарушение, состояние: как используют в данном контексте, термины заболевание или нарушение относятся к любому патологическому состоянию человека или животного, включая опухоли, рак, аллергии, аддикцию (привыкание к употреблению субстанций), аутоиммунитет, инфекцию, отравление или нарушение оптимальной умственной или физической функции. Термин состояния, как используют в данном контексте, включает заболевания и нарушения, но относится также к физиологическим состояниям. Например, способность к оплодотворению является физиологическим состоянием, но не заболеванием или нарушением. Композиции, соответствующие изобретению, пригодные для предупреждения беременности путем снижения способности к оплодотворению, будут вследствие этого описаны как средство для лечения состояния (способности к оплодотворению), но не как средство для лечения нарушения или заболевания. Другие состояния понятны обычным специалистам в данной области.
Эффективное количество: как используют в данном контексте, термин эффективное количество относится к количеству определенного конъюгата или композиции, которое является необходимым или достаточным для реализации желательного биологического эффекта. Эффективное количество определенного конъюгата или композиции, соответствующих данному изобретению, будет составлять количество, которое достигает заданного результата, и такое количество может быть определено рутинным образом компетентным специалистом в данной области при использовании анализов, который известны в области техники и/или описаны в данном контексте без необходимости проведения излишних экспериментов. Например, эффективным количеством для лечения иммунодефицита могло бы быть количество, необходимое, чтобы вызвать активацию иммунной системы, приводящее в результате к образованию антигенспецифического иммунного ответа при воздействии антигена. Термин также является синонимом термина достаточное количество. Эффективное количество для любого конкретного применения может варьировать в зависимости от таких факторов, как заболевание или состояние, которое предусматривается лечить, конкретной композиции, предназначенной для введения, способа введения, размера субъекта и/или тяжести заболевания или состояния. Обычный специалист в данной области может эмпирически определить эффективное количество конкретного конъюгата или композиции, соответствующих данному изобретению, без необходимости проведения излишних экспериментов.
Один или какой-либо неопределенный: когда термины один или какой-либо неопределенный используют в данном описании, они означают по меньшей мере один или один или более, пока не указывается иначе.
ПЭГ: как используют в данном контексте, термин ПЭГ включает все полимеры этиленоксида, как линейные или разветвленные, либо имеющие множество ветвей, так и блокированные на конце или заканчивающиеся гидроксилом. Термин ПЭГ включает те полимеры, которые известны в области техники как полиэтиленгликоль, метоксиполиэтиленгликоль или мПЭГ или полиэтиленгликоль-монометиловый эфир, алкоксиполиэтиленгликоль, полиэтиленоксид или ПЭО, а-метил-ш-гидроксиполи(оху1,2-этандиил) и полиоксиран в числе других названий, которые используют в области техники для полимеров этиленоксида.
ПЭГилирование, ПЭГилированный и ложно-ПЭГилированный: как используют в данном контексте, термин ПЭГилирование относится к любому процессу ковалентного связывания ПЭГ с биоактивной молекулой-мишенью, особенно рецептор-связывающим белком. Конъюгат, полученный таким образом, определяют как ПЭГилированный. Как используют в данном контексте, термин ложноПЭГилированный относится к части белка или другому биоактивному компоненту в реакционной смеси для ПЭГилирования, к которой не был ковалентно присоединен никакой ПЭГ. Тем не менее, ложноПЭГилированный продукт может быть изменен во время реакции или последующих стадий очистки, например как последствие воздействия восстановителя во время ПЭГилирования путем восстановительного алкилирования и/или посредством одного или более ингибирующих агентов, соединений и т.п., удален во время стадий обработки и/или очистки.
Полипептид: как используют в данном контексте, термин полипептид относится к молекуле, со
- 9 013535 стоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (известными также как пептидные связи). Он обозначает молекулярную цепь аминокислот и не относится к специфической длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды и белки включены в определение полипептида. Данный термин предназначен также для обозначения продуктов постэкспрессионных модификаций полипептида, например гликозилирования, гипергликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования и т.п. Полипептид может быть выделен из естественного биологического источника или получен технологией рекомбинантной ДНК, но необязательно, чтобы он был транслирован со сконструированной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть получен любым образом, включая химический синтез.
Белок и гликопротеин: как используют в данном контексте, термин белок относится к полипептиду, как правило, размером больше приблизительно 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более, либо 2000 или более аминокислот. Белки обычно имеют определенную трехмерную структуру, хотя они не обязательно имеют данную структуру, и их часто называют уложенными в противоположность пептидам и полипептидам, которые часто не обладают определенной трехмерной структурой, но могут принимать большое число различных конформаций, и их называют неуложенными. Однако пептиды также могут иметь определенную трехмерную структуру. Как используют в данном контексте, термин гликопротеин относится к белку, связанному по меньшей мере с одной углеводной молекулой, которая присоединена к белку посредством кислородсодержащей или азотсодержащей боковой цепи остатка аминокислоты, например остатка серина или остатка аспарагина.
Отдаленный (в отдалении): как используют в данном контексте, термин отдаленный (как в выражении отдаленная Ν-концевая аминокислота или отдаленный центр гликозилирования) относится к структуре, в которой положение одного или более центров присоединения для одного или более полимеров на белке находится/находятся дистально или пространственно отдалены от одного или более рецептор-связывающих областей или доменов белка, как определяют путем молекулярного моделирования. Конъюгирование полимера с таким отдаленным центром присоединения (как правило, Ν-концевой аминокислотой (для рецептор-связывающих белков, которые вследствие этого называют рецепторсвязывающие белки с отдаленным Ν-концом или ΚΝ рецептор-связывающие белки) или одной или более углеводных молекул или центров гликозилирования на гликопротеине (для рецепторсвязывающих белков, которые вследствие этого называют рецептор-связывающие белки с отдаленным гликозилированием или КО рецептор-связывающие белки)) не приводит к значительным стерическим препятствиям связывания белка с его рецептором(ами). Следовательно, полагают, что когда аминоконцевая аминокислота или центр гликозилирования на цитокине, хемокине, факторе роста или полипептидном гормоне находятся в отдалении от одного или более рецептор-связывающих доменов цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона, то конъюгирование (например, ковалентное присоединение) водорастворимого полимера с аминоконцевой аминокислотой или центром гликозилирования, соответственно, не нарушает существенным образом способности цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона связываться с его рецептором(ами), в особенности с клеточными поверхностными рецепторами. Конечно, признают, что данный цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон может содержать более одного рецептор-связывающего домена. В таких ситуациях аминоконцевая аминокислота или центр гликозилирования цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона могут находиться в отдалении от одного такого домена или от более чем одного из таких доменов, и, кроме того, рассматриваются как расположенные в отдалении от одного или более рецептор-связывающих доменов настолько, что конъюгирование аминоконцевой аминокислоты или центра гликозилирования не нарушает существенным образом связывания цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона с его рецептором(ами) посредством одного или более рецепторсвязывающих доменов. Нарушает или не нарушает существенным образом конъюгирование способность белка связываться с его рецептором(ами), можно легко установить с использованием известных в области техники анализов связывания лиганд-рецептора, которые знакомы обычным специалистам в данной области.
Способы оценки связывания лиганд-рецептора включают без ограничения перечисленным анализы конкурентного связывания, анализы связывания радиорецептора, анализы на основе клеток, измерения поверхностного плазменного резонанса, динамическое светорассеяние и ультрацентрифугирование.
Как показано на фиг. 16 данного описания, ПЭГ представляет собой высокообъемный и гибкий полимер, который занимает большой объем в растворе относительно белка близкой молекулярной массы. Хотя остаток аминокислоты, к которому присоединен ПЭГ, может находиться в отдалении от одного или более рецептор-связывающих центров, части полимера, тем не менее, могли бы до некоторой степени нарушать связывание рецептора. Вероятность такого нарушения повышается с увеличением молекулярной массы и, следовательно, объема, занимаемого полимером в растворе. Наконец, ПЭГилирование, которое находится в отделении от рецептор-связывающих областей, будет меньше нарушать связывание рецептора, чем случайное ПЭГилирование.
Существенный, существенно (в существенной мере): как используют в данном контексте, конъюги
- 10 013535 рование белка, как считают, не нарушает в существенной мере способность белка связываться со своим рецептором(ами), если скорость и/или количество связывания конъюгированного белка с рецептором составляет не меньше чем приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100% или более от скорости и/или количества связывания соответствующего цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона, который не был конъюгирован.
Лечение: как используют в данном контексте, термины лечение, лечат, леченый или проходящий лечение относятся к профилактике и/или терапии. При использовании в отношении инфекционного заболевания, например, термин может относиться к профилактическому лечению, которое повышает резистентность субъекта к инфекции патогена или, другими словами, снижает вероятность того, что субъект будет инфицирован патогеном или продемонстрирует признаки заболевания, присущие инфекции, а также к лечению после инфицирования субъекта с целью борьбы с инфекцией, например для снижения или уничтожения инфекции или для предупреждения ее ухудшения.
Общие положения
Данное изобретение представляет способы синтеза полимерных конъюгатов рецепторсвязывающих белков, которые сохраняют неожиданно высокую рецептор-связывающую активность относительно полимерных конъюгатов того же самого рецептор-связывающего белка, к которому один или более полимеров присоединен(ы) случайным образом. При использовании структурных анализов на основе рентгеновской кристаллографии и ядерного магнитного резонанса, мутационного анализа и компьютерной программы молекулярного моделирования данные авторы идентифицировали центры-мишени для ПЭГилирования цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов, которые участвуют или не участвуют в связывании со своими рецепторами. Как класс белков, данные агонисты и антагонисты цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов называют в данном контексте рецептор-связывающими белками. Посредством выбора стратегии синтеза, которая направляет присоединение полимера на область(и) рецептор-связывающих белков, которая не участвует во взаимодействиях рецептора, избегают некоторых нежелательных стерических препятствий, и полученные в результате полимерные конъюгаты сохраняют необычайно высокую активность. Данные рецепторсвязывающие белки, которые имеют аминоконцевой остаток, отдаленный от одного или более из их рецептор-связывающих областей или доменов, определены в данном контексте как рецептор-связывающие белки с отдаленным Ν-концом или ΚΝ рецептор-связывающие белки; они включают все цитокины, хемокины, факторы роста или полипептидные гормоны или их антагонисты, у которых аминоконцевая аминокислота находится в отдалении от рецептор-связывающего центра или центров белка.
В другом варианте осуществления изобретения получают конъюгаты, содержащие один или более синтетических полимеров (например, один или более полиэтиленгликолей), ковалентно связанных с цитокинами, хемокинами, факторами роста и полипептидными гормонами, которые имеют естественные центры гликозилирования, отдаленные от одного или более их рецептор-связывающих областей или доменов. Согласно данному аспекту изобретения биоактивные компоненты (например, белки) конъюгатов будут проявлять хорошо сохранившиеся рецептор-связывающие активности, когда синтетические полимеры связываются в области центра(ов) гликозилирования. Данную подгруппу рецептор-связывающих белков называют в данном контексте КС-рецептор-связывающими белками. Когда гидрофильный или амфипатический полимер селективно связаны с или около такого отдаленного центра гликозилирования, в особенности когда белок-мишень представляет собой негликозилированную форму белка, который в естественных условиях является гликозилированным, полимер может имитировать благоприятные эффекты природного углевода, например, на агрегацию, стабильность и/или растворимость. Таким образом, вследствие этого его присоединение называют в данном контексте псевдогликозилированием. Таким образом, данное изобретение представляет способы синтеза конъюгатов, в которых центр-селективное связывание синтетического полимера эффективно замещает естественные углеводные молекулы. Полученное в результате псевдогликозилирование способствует улучшенной растворимости, пониженной агрегации и задержанному выведению из кровотока по сравнению с другими негликозилированными формами белка. Вследствие этого данный подход является особенно перспективным для приготовления конъюгатов и композиций белков, которые получают технологией рекомбинантной ДНК в прокариотических клетках-хозяевах (например, бактериях, таких как ЕксйепсЫа сой), поскольку прокариотические организмы, как правило, не гликозилируют белок, который они экспрессируют.
Аналогично селективное ПЭГилирование углеводной части гликопротеина может в результате привести к псевдогипергликозилированию гликопротеина. Данный процесс представлен, например, С. Вопа и соавт. в публикации РСТ № \¥О 96/40731, описание которой включено в данном контексте в виде ссылки во всей полноте. Вследствие этого данный подход является особенно перспективным для приготовления конъюгатов и композиций белков, которые получают технологией рекомбинантной ДНК в эукариотических клетках-хозяевах (например, дрожжах, клетках растений и клетках животных (вклю
- 11 013535 чая клетки млекопитающих и насекомых)), поскольку эукариотические организмы, как правило, гликозилируют белки, которые они экспрессируют, если данные белки включают естественные сигналы гликозилирования или сигналы гликозилирования, интродуцированные посредством технологии рекомбинантной ДНК. Данные псевдогликозилированные и псевдогипергликозилированные ЯС рецепторсвязывающие белки входят в объем данного изобретения.
Таким образом, изобретение охватывает также полимерные конъюгаты ΚΝ рецепторсвязывающих белков, которые сохраняют существенную, почти полную или практически полную рецептор-связывающую активность, и псевдогликозилированных или псевдогипергликозилированных ЯС рецептор-связывающих белков, которые сохраняют существенную, почти полную или практически полную рецептор-связывающую активность. Как используют в данном контексте, считают, что цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон сохраняют существенную, почти полную или практически полную рецептор-связывающую активность при конъюгировании с одним или более водорастворимых полимеров, соответствующих данному изобретению, если конъюгирование цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона не нарушает в существенной мере способность белка связываться со своим рецептором(ами), т.е. если скорость и/или количество связывания конъюгированного белка с соответствующим ему рецептором(ами) составляет не меньше чем приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100% или более от скорости и/или количества связывания неконъюгированной формы соответствующего белка. В объем данного изобретения включены также полимерные конъюгаты данных рецептор-связывающих белков, которые классифицированы как оба, ΚΝ и ЯС, рецептор-связывающие белки. Двумя примерами последних белков являются интерферон-β (в частности, интерферон-в-1Ь) и ИЛ-2.
В дополнительных вариантах осуществления изобретение представляет способы синтеза полимерных конъюгатов рецептор-связывающих белков, которые сохраняют неожиданно высокую рецепторсвязывающую активность относительно полимерных конъюгатов этого же рецептор-связывающего белка, в котором один или более полимеров присоединены случайным образом. Изобретение представляет также конъюгаты, полученные данными способами, и композиции, содержащие один или более данных конъюгатов, соответствующих изобретению, которые далее могут содержать один или более дополнительных компонентов или реагентов, таких как одна или более буферных солей, один или более углеводных наполнителей, один или более белков-носителей, один или более ферментов, один или более детергентов, одну или более молекул нуклеиновых кислот, один или более полимеров, таких как неконъюгированный ПЭГ или полиалкиленгликоль, и т.п. Изобретение представляет также наборы, содержащие конъюгаты и/или композиции, соответствующие изобретению.
Изобретение представляет также фармацевтические или ветеринарные композиции, содержащие конъюгаты, соответствующие изобретению, и по меньшей мере один наполнитель или носитель, который является приемлемым для фармацевтического или ветеринарного применения. Изобретение представляет также способы лечения или предупреждения множества физических нарушений при использовании данных композиций, предусматривающие введение эффективного количества одного или более конъюгатов или композиций, соответствующих данному изобретению, животному, страдающему от физического нарушения или состояния или предрасположенному к нему.
Кроме того, изобретение представляет стабилизированные рецептор-связывающие белки и способы их получения для применения в промышленной клеточной культуре, причем получают неожиданно высокие активности в результате комбинированных эффектов существенного сохранения биоактивности и повышенной продолжительности действия при промышленном применении. Неожиданно высокие активности конъюгатов, соответствующих данному изобретению, могут отражаться в необыкновенно высокой продукции биомассы, необыкновенно высоких уровнях экспрессии рекомбинантных белков и других усовершенствованиях эффективности биопроцессинга.
Способы
Авторы обнаружили, что направленность полимеров на аминоконцевую аминокислоту ΚΝ рецептор-связывающего белка или участок, близкий к центру гликозилирования ЯС рецептор-связывающего белка, обеспечивает то, что полимер присоединяется к центру, который отдален от одного или более рецептор-связывающих областей или доменов белка, таким образом снижая до минимума стерическое препятствие взаимодействиям рецептора, создаваемое присоединенными молекулами полимера. Следовательно, можно сохранить более высокий процент рецептор-связывающей активности посредством конъюгирования белков согласно способам, соответствующим данному изобретению, чем было бы, если бы полимер был присоединен в или проксимально части молекулы, которая включена в связывание со своим рецептором(ами). Данный принцип, который может в результате привести к неожиданно высокому сохранению рецептор-связывающей активности, может быть продемонстрирован для рецепторсвязывающих белков, которые выбраны из фактора роста фибробластов (ЬТСТ или ТСТ-2), эпидер
- 12 013535 мального фактора роста (ЕСЕ), инсулиноподобного фактора роста-1 (1СЕ-1), интерферона-α (ИФНα), интерферона-β (ИФН-β'', включая, но без ограничения перечисленным, ИФН-β-Ιϋ), гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора (СМ-С8Е), колониестимулирующего фактора моноцитов (М-С8Е), лиганда Е1(3, фактора стволовых клеток (8СЕ), интерлейкинов 2, 3, 4, 6, 10, 12, 13 и 15, фактора некроза опухоли-α (ΤΝΕ-α), фактора некроза опухоли-β (ΊΝΕ-β), трансформирующего фактора роста-α (ТСЕ-α), трансформирующего фактора роста-β (ТСЕ-β), фактора роста кератиноцитов (КСЕ), человеческого гормона роста (НСН), пролактина, плацентарного лактогенного гормона, цилиарного нейротрофического фактора (СИТЕ), лептина и структурных аналогов данных рецепторсвязывающих белков, которые имитируют действия данных белков или которые являются их рецепторсвязывающими антагонистами. Напротив, не предполагается, что селективное присоединение большого полимера к аминоконцу ИФН-γ сохранит большую часть активности данного цитокина, поскольку такое связывание, как ожидают, нарушает связывание активного димера с его рецепторами (на основе данных ^а11ет М.К. и соавт. (1995), №(ите, 376:230-235 и ТЫе1 Ό.Ε и соавт., см. выше).
В близком данному варианте осуществления изобретения полимеры связаны с аминоконцевым остатком мутеинов рецептор-связывающих белков, которые работают как конкурентные антагонисты природного белка, связывая один или более тех же рецепторов без инициации сигнальной трансдукции. Примерами являются полимерные конъюгаты антагониста НСН, который содержит точечную мутацию С120К (см. статью 8ипйк1гот М. и соавт. (1996), 1. Βίο1. СНет., 271:32197-32203) и антагонист пролактина, который содержит точечную мутацию С129К (см. статьи СоГПп V. и соавт. (1997), 1. Маттагу С1апб Βίο1. №ор1ак1а, 2:7-17; СНеп ν.Υ. и соавт. (1999), С1т. Сапсег Кек., 5:3583-3593; СНеп ν.Υ., публикация РСТ № XVО 99/58142 А1). Другие антагонисты рецептор-связывающих белков могут быть получены с помощью селективных точечных мутаций, укорочений или делеций (см. например, статьи ТсНе1е( А. и соавт. (1997), Мо1. Се11 ЕпбосппоЕ 130:141-152; Ре(егкоп Е.С., (1998). Идентификация мотивов, ассоциированных с лактогенным и соматотропным действием человеческого гормона роста (Иеп(Шса(1оп оГ МоДГк Аккоаа(еб νί(Η (Не Ьас(одешс и 8ота(о(торю Асйопк оГ Нитап Сго\\111 Ногтопе), материалы диссертации на соискание степени Р11.Э. (доктора философских наук), ОЫо 8(а(е Ишуегкйу, ИМ1 # 9822357).
В другом варианте осуществления изобретения для КС рецептор-связывающих белков способы, соответствующие данному изобретению, приводят в результате к присоединению одного или более синтетических полимеров вблизи естественного центра присоединения углеводных молекул данных рецептор-связывающих белков, которые представляют собой гликопротеины. Это в результате дает псевдогликозилирование данных рецептор-связывающих белков (например, когда они экспрессировались с помощью технологий рекомбинантной ДНК в Е. сой или других прокариотических клетках, которые не осуществляют посттрансляционное гликозилирование) или приводит к псевдогипергликозилированию из гликопротеиновых форм (например, для продуцируемых в естественных условиях гликопротеинов или для гликопротеинов, продуцируемых эукариотическими клетками-хозяевами (например, дрожжами, клетками растений и клетками животных (включая клетки млекопитающих и насекомых)), которые осуществляют посттрансляционное гликозилирование). Примерами являются полимерные конъюгаты интерферонов α и β, а также эритропоэтин (Еро) и интерлейкин-2. Присоединение синтетических полимеров в или около центров естественного гликозилирования может быть проведено любым способом, который известен в области техники, включая мутационный способ, описанный К.1. Сообкоп и соавт. (см. Вю(есйпо1оду, (1990), 8:343-346) и способ, описанный К.8. Ьаткоп и соавт. (см. Вюсопщд. СНет., (2001), 12:861-869), который включает предшествующее окисление углевода; описания данных ссылок включены в данном контексте в виде ссылки во всей их полноте.
Аминоконцевая модификация некоторых белков была описана ранее (см., например, статью Э1хоп Н.В.Е., (1984), 1. Рто(еш СНет., 3:99-108). Например, описано, что Ν-концевая модификация белков стабилизирует некоторые белки в отношении действия аминопептидаз (см. статью Сиегга Р.Ь и соавт. (1998), РНагт. Кек., 15:1822-1827), улучшает растворимость белка (см. статью НшЙ8 К. и соавт. (2000), Вюсопщд. СНет., 11:195-201), уменьшает заряд на Ν-концевой аминогруппе или улучшает гомогенность полученных в результате конъюгатов (см. КшкБет О. и соавт., публикация Европейской патентной заявки № ЕР 0822199 А2; статью Кш8(1ет О. и соавт. (2002), Αάν. Эгид. Эе1ту. Кеу., 54:477-485) в числе прочих. Был описан альтернативный способ связывания полимеров с α-аминогруппой Ν-концевого остатка цистеина или гистидина путем адаптации способа, известного в области техники как нативное химическое лигирование (см. КоЬейк М.1. и соавт., публикация РСТ № νθ 03/031581 А2 и публикация патентной заявки США № 2003/0105224 А1). Однако существование подклассов ΚΝ и КС рецепторсвязывающих белков не учитывалось или не описывалось ранее в обычно используемых способах отбора представителей данных классов, а также получения и применения полимерных конъюгатов таких рецептор-связывающих белков в качестве пути сохранения неожиданно высокой функциональной активности ΚΝ рецептор-связывающих белков.
Следовательно, существует преимущество в том, чтобы определить, имеет или не имеет конкретный цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон Ν-конец и/или центр(ы) гликозилирования, которые отделаны от рецептор-связывающего центра(ов) лиганда. Возможность предсказать, яв
- 13 013535 ляется ли данный цитокин, хемокин, фактор роста, полипептид ΚΝ или КС лигандом перед конъюгированием лиганда с полимером, в существенной мере уменьшает необходимость проведения экспериментов для получения конъюгатов полимер-лиганд (например, цитокинов хемокинов, факторов роста или полипептидных гормонов или их антагонистов, конъюгированных с полимерами, например ПЭГ), где антигенность и иммуногенность конъюгата понижена относительно антигенности и иммуногенности неконъюгированного лиганда без существенного снижения рецептор-связывающей и физиологической активности конъюгированного лиганда.
Соответственно, в дополнительных вариантах осуществления данное изобретение представляет способы идентификации и отбора лигандов рецептор-связывающих белков (например, цитокинов, хемокинов, факторов роста или полипептидных гормонов и их антагонистов), которые имеют Ν-конец и/или центр(ы) гликозилирования, которые отдалены от рецептор-связывающих центров белковых лигандов (т.е. способы идентификации и отбора ΚΝ или КС белков). В некоторых из данных вариантов осуществления изобретения оптимальное положение для конъюгирования одного или более полимеров (например, одного или более ПЭГ) можно определить с использованием молекулярного моделирования, например, с учетом 3-мерной структуры белка (цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона или его антагониста) при использовании компьютерной программы молекулярного моделирования для предсказания положения(ий), в котором один или более полимеров могут быть присоединены к белку без существенной потери биологической или рецептор-связывающей активности белка (см. также 5>е11ст С.Н., выше). Аналогичный подход был продемонстрирован, например, для конъюгирования ПЭГ с С-С8Е в попытке повысить его устойчивость к протеолитическому разложению (см. опубликованную патентную заявку США № 2001/0016191 А1 Τ.Ό. О881ип6, описание которой включено в виде ссылки в данном контексте во всей ее полноте). Подходящая компьютерная программа молекулярного моделирования для применения в данном изобретении, такая как КА8МОЬ (см. работу 8ау1е и соавт., см. выше) и другие программы, использованные для создания баз данных макромолекулярных структур, депонированных в Банке данных по белкам (Рго1ет Эа1а Банк) (ΡΌΒ; см. статью Εη51<ο\ν51<ί К.А., выше), хорошо известны в области техники и должны быть знакомы обычным специалистам в данной области. При использовании такой компьютерной программы молекулярного моделирования можно предсказать или определить трехмерную структуру полипептида, например цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона или его антагониста с высокой степенью надежности, основываясь на кристаллографических анализах лигандов и их рецепторов. Таким образом, обычный специалист может легко определить, какие лиганды являются ΚΝ или КС лигандами, которые пригодны для применения согласно данному изобретению.
Для практической реализации данного изобретения одним из удобных способов ковалентного связывания водорастворимого полимера с α-аминогруппой Ν-концевого остатка аминокислоты белка является восстановительное алкилирование оснований Шиффа, образованных с полимерами, несущими одну альдегидную группу, например, как заявлено С.Р. Кзует (см. патент США № 4002531), но не как заявлено 1.М. НагШ и соавт. (см. патент США № 5252714), поскольку последние авторы заявляют только полимеры, дериватизированные по обоим концам альдегидными группами, которые представляют собой перекрестно-сшивающие агенты и вследствие этого неприемлемы для синтеза длительно действующих рецептор-связывающих белков, которые сохраняют существенную рецептор-связывающую активность.
Получение направленности восстановительного алкилирования оснований Шиффа ПЭГ-моноальдегидов на α-аминогруппу Ν-концевой аминокислоты рецептор-связывающего белка и от ε-аминогрупп его остатков лизина можно осуществить множеством способов, основанных на материалах, представленных Ι.Τ. ЕбкаЛ в главах 4 и 5 монографии Белки, аминокислоты и пептиды как ионы и биполярные ионы (РгоЮпъ Λιηίηο Λοίάδ апб РерИбез аз Ιοηκ и ΟίροΙατ Ιοηκ) ((1943), с.75-115, 116-139, Кет1ю1б РнЬНкШид ^τροταίίοη, №\ν ΥοτΕ), описание которой включено в данном контексте в виде ссылки во всей полноте. Константа кислотной диссоциации (рКа) α-аминогруппы Ν-концевой аминокислоты полипептида, как ожидают, составляет меньше 7,6, тогда как значения рКа ε-аминогруппы остатков лизина в полипептидах, как ожидают, составляет приблизительно 9,5. В статье ЕбкаЛ (см. (1943), см. выше) однозначно установлено, что альдегиды будут связываться с аминогруппой аминокислоты только в щелочной области ее изоэлектрической точки.
Следовательно, основываясь на настоящем описании и информации, которую легко получить в данной области техники, обычный специалист должен учитывать, что (1) селективная реакция альдегидов с α-аминогруппой белка будет преобладать в интервале рН ниже 9,5 (приблизительно рКа ε-аминогрупп в белке); (2) скорость реакции альдегидов с ε-аминогруппами будет снижаться, если значение рН реакции снижается до 7,6 (приблизительно рКа α-аминогруппы белка); (3) скорость реакции альдегидов с α-аминогруппами будет снижаться меньше, чем у ε-аминогруппы при снижении рН реакции до 7,6, и (4) селективность реакции альдегида с α-аминогруппой будет повышаться до некоторой степени по мере снижения значения рН до 6,6. Поскольку последнее значение приблизительно на одну единицу рН ниже значения рКа α-аминогруппы и на три единицы рН ниже значения рКа ε-аминогрупп, приблизительно 10% α-аминогрупп и приблизительно 0,1% ε-аминогрупп будут находиться в реакцион
- 14 013535 ном непротонированном состоянии. Таким образом, при рН 6,6 фракция непротонированных α-аминогрупп в 100 раз превышает фракцию непротонированных ε-аминогрупп. Вследствие этого будет получено очень незначительное повышение селективности при дальнейшем снижении рН реакции, например до 5,6, где теоретически 1% α-аминогрупп и 0,01% ε-аминогрупп могли бы находиться в реакционном непротонированном состоянии. Таким образом, в ряде вариантов осуществления изобретения белковые лиганды (в особенности ΒΝ или ВС лиганды, включая цитокины, хемокины, факторы роста или полипептидные гормоны и их антагонисты) конъюгируют с одним или более полимеров путем образования смеси между лигандом(ами) и одним или более реакционных полимеров при рН от приблизительно 5,6 до приблизительно 7,6; при рН от приблизительно 5,6 до приблизительно 7,0; при рН от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0; при рН от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,0; при рН от приблизительно 6,6 до приблизительно 7,6; при рН от приблизительно 6,6 до приблизительно 7,0 или при рН приблизительно 6,6. Данные способы, таким образом, существенно отличаются от известных в области техники, в которых связывание полимеров с α-аминогруппами на Ν-концевых остатках аминокислот лигандов осуществляют при рН приблизительно 5 (см. статью К1пк11ег О. и соавт. (2002), Αάν. Эе1В. Κον., 54:477-485; Европейская патентная заявка № ЕР 0822199 А2; патенты США №№ 5824784 и 5985265; статьи РоЬеПк М.1. и соавт. (2002), см. выше; Эе1дабо С. и соавт., патентная публикация США № 2002/0127244 А1), тогда как связывание полимеров с ε-аминогруппами остатков лизина в полипептидном скелете лиганда проводят при рН 8,0 (см. статью Кткбег О. и соавт., патентную заявку ЕР 0822199 А2; патенты США №№ 5824784 и 5985265). Некоторым образом настоящие способы также существенно отличаются от ферментативных способов, которые были использованы для связывания алкиламиновых производных полиэтиленгликоля с рядом белков с помощью трансглутаминазы, которое проводили при значении рН 7,5 (см. статью 8а1о Н., (2002), Αάν. Эгид. Эе1В. Κ^ν., 54:487-504).
Восстановление полученных в результате оснований Шиффа мягкими восстанавливающими агентами, такими как цианоборгидрид натрия или пиридинборан (см. статью СаЬасипдап ЕС. и соавт. (1982), Апа1. Вюсйет., 124:272-278), приводит к образованию вторичных аминных связей, которые сохраняют положительный заряд Ν-концевой α-аминогруппы белка при физиологическом значении рН. Данные связи, которые сохраняют такой же заряд, как у нативного белка, с большей вероятностью сохраняют его биологическую активность, чем альтернативные химические способы связывания, которые нейтрализуют заряд, например, посредством образования амидных связей (см. Вигд 1. и соавт., публикация РСТ № XVО 02/49673 А2; Кшкбег О. и соавт., Европейская патентная публикация № ЕР 0822199 А2; статьи К1П811ег О. и соавт. (1996), Рйагт. Век., 13:996-1002; Кйа Υ. и соавт., см. выше) или уретановые связи (см. СйЬей С^. и соавт., патент США № 6042822; статьи Стасе М. и соавт. (2001), 1. 1п1егГегоп Су1окше Век., 21:1103-1115; Υοπ^κΙογ 8. и соавт. (2002), Сигг. Рйагт. Эек., 8:2139-2157).
Компетентным специалистам в области техники известны альтернативные подходы к селективному связыванию полимеров с Ν-концевыми остатками аминокислот. Здесь включены способы связывания гидразид-, гидразин-, семикарбазид- или других аминсодержащих полимеров с Ν-концевым остатком серина или треонина, которые были окислительно разложены до альдегидов с помощью периодата (см. статью Э1хоп Н.В.Е., см. выше; Сеодйедап К.Е., патент США № 5362852; статью Саейиег Н.Е. и соавт. (1996), Вюсопщд. Сйет., 7:38-44; Эгиттопб В.1. и соавт., патент США № 6423685).
Подходящие полимеры
В некоторых вариантах осуществления изобретения требуется свести к минимуму образование внутримолекулярных и межмолекулярных перекрестных связей полимерами, такими как ПЭГ во время реакции, в которой полимер связывают с биоактивным компонентом для получения конъюгатов, соответствующих изобретению. Это можно осуществить путем использования полимеров, которые активированы только на одном конце (называемых в данном контексте монофункционально активированными ПЭГ или монофункционально активированными ПАГ'') или полимерных препаратов, в которых доля бифункционально активированных (называемых в случае линейных ПЭГ бис-активированными ПЭГдиолами) или мультифункционально активированных полимеров составляет меньше чем приблизительно 30%, или более предпочтительно меньше чем приблизительно 10%, или наиболее предпочтительно меньше чем приблизительно 2% (мас./мас.). Применение активированных полимеров, которые полностью или почти полностью монофункциональны, может свести к минимуму образование всех следующих вариантов: внутримолекулярных перекрестных связей внутри отдельных молекул белка, гантелеобразных структур, в которых одна цепь полимера соединяет две молекулы белка, и более крупных агрегатов или гелей.
Активированные формы полимеров, которые пригодны для применения в способах и композициях, соответствующих данному изобретению, могут включать любые линейные или разветвленные монофункционально активированные формы полимеров, которые известны в области техники. Например, включены формы с молекулярной массой (за исключением массы активирующей группы) в интервале от приблизительно 1 до приблизительно 100 кДа. Приемлемые интервалы молекулярных масс включают, но без ограничения перечисленным, приблизительно от 5 до приблизительно 30 кДа; приблизительно от 10 до приблизительно 20 кДа; приблизительно от 18 до приблизительно 60 кДа; приблизительно от 12 до
- 15 013535 приблизительно 30 кДа, приблизительно 5 кДа, приблизительно 10 кДа, приблизительно 20 или приблизительно 30 кДа. В случае линейного ПЭГ молекулярные массы, составляющие приблизительно 10, приблизительно 20 или приблизительно 30 кДа, соответствуют степеням полимеризации (п) приблизительно 230, приблизительно 450 или приблизительно 680 мономерных звеньев этиленоксида соответственно. Для применения ίη νίΐτο подходящие интервалы молекулярных масс активированных полимеров включают от приблизительно 1 до приблизительно 5 кДа. Следует отметить, что задолго до того, как было признано существование классов ΚΝ и КО рецептор-связывающих белков, были впервые отмечены преимущества связывания терапевтических белков с полимерами, имеющими относительно высокие молекулярные массы (т.е. > около 20-30 кДа) (см. 8айег М. и соавт., публикация РСТ № νθ 89/01033 А1, опубликованная 9 февраля 1989 г., которая включена в данном контексте в виде ссылки во всей полноте).
В других вариантах осуществления изобретения конъюгаты рецептор-связывающих белков с необычно высокой долей сохранившейся биоактивности могут быть получены для применения ίη νίΐτο, например, в клеточной культуре, посредством связывания монофункционально активированных полимеров молекулярной массы приблизительно 1 кДа, приблизительно 2 кДа или приблизительно 5 кДа согласно способам, соответствующим данному изобретению. Для таких применений ίη νίΐτο данный более низкий интервал молекулярных масс может быть предпочтителен.
Необязательно линейный полимер может иметь реакционную группу на одном конце или обоих концах, создавая таким образом реакционный полимер. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения может быть желательным использовать Ν-гидроксисукцинимидиловый сложный эфир производного монопропионовой кислоты ПЭГ, как описано РМ. Наггк и соавт. в патенте США № 5672662, который включен в данном контексте полностью в виде ссылки, или другие Ν-гидроксисукцинимидактивированные ПЭГ-монокарбоновые кислоты. В некоторых других вариантах осуществления может быть желательным применение либо моносукцинимидилкарбонатных производных ПЭГ (8С-ПЭГ), как описано М. 8;пГег и соавт. в патентах США №№ 5006333, 5080891, 5283317 и 5468478, либо моно-рнитрофенилкарбонатного производного ПЭГ, как описано в работах 8.1. Ке11у и соавт., см. выше; ЙЭ. \νί11ί;·ιιη5 и соавт., публикация РСТ № νθ 00/07629 А2, ΚΌ. \νί11ί;·ιιη5 и соавт., патент США № 6576235 и М.К. 811егшап и соавт., публикация РСТ № νθ 01/59078 А2 и А3. Более того, другие типы реакционных групп могут быть использованы для синтеза полимерных конъюгатов белков. Данные производные включают, но без ограничения перечисленным, моноальдегидные производные ПЭГ (см. Коуег О.Р., патент США № 4002531; Нат8 1.М. и соавт., патент США № 5252714), моноаминовые, монотрибромфенилкарбонатные, монокарбонилимидазоловые, монотрихлорфенилкарбонатные, монотрифторфенилкарбонатные, моногидразидные, моногидразиновые, моносемикарбазидные, монокарбазатные, монотиосемикарбазидные, моноиодацетамидные, мономалеимидные, моноортопиридилдисульфидные, монооксимовые, монофенилглиоксалевые, монотиазолидин-2-тионовые, монотиоэфирные, монотиоловые, монотриазиновые и моновинилсульфоновые производные ПЭГ. В дополнительных вариантах осуществления цитокины, хемокины, факторы роста, полипептидные гормоны и их антагонисты могут быть связаны с одним или более полимеров, как описано в находящейся в общем владении сопутствующей патентной заявке США № 10/669597, описание которой включено в данном контексте в виде ссылки во всей полноте.
Биоактивные компоненты
Как отмечено выше, конъюгаты, соответствующие изобретению, содержат один ПАГ или ПАО и, в частности, одну цепь ПЭГ, ковалентно присоединенную к одному или более биоактивных компонентов. Биоактивные компоненты, к которым ковалентно присоединен один или более полимеров (или их цепей), называют в данном контексте различно и эквивалентно конъюгированными биоактивными компонентами или модифицированными биоактивными компонентами. Данные термины должны быть отделены в данном контексте от терминов неконъюгированные биоактивные компоненты, исходные биоактивные компоненты или немодифицированные биоактивные компоненты, все из которых относятся к биоактивным компонентам, которые не содержат ковалентно присоединенных к ним полимеров. Однако следует иметь в виду, что неконъюгированный, немодифицированный или исходный биоактивный компонент может содержать другие неполимерные конъюгирования или модификации по сравнению с молекулой дикого типа или нативной молекулой и будут, тем не менее, рассматриваться как неконъюгированные, немодифицированные или исходные в соответствии с данным изобретением, поскольку биоактивный компонент остается неконъюгированным, немодифицированным или исходным в плане присоединения полимеров, как в случае биоактивных компонентов, которые называют в данном контексте ложноПЭГилированными.
Термин стабилизирующий биоактивный компонент (или способы стабилизации или стабилизированный биоактивный компонент) указывают на то, что биоактивный компонент был стабилизирован согласно способам, соответствующим данному изобретению (т. е. биоактивный компонент, к которому был ковалентно присоединен полимер согласно способам, соответствующим изобретению). Данные стабилизированные биоактивные компоненты будут проявлять некоторые измененные биохимические и биофизические свойства по сравнению с биоактивным компонентом, который не был стабилизирован (т.е. биоактивным компонентом, к которому не был ковалентно присоединен полимер). В данные изме
- 16 013535 ненные биохимические и биофизические параметры, в частности, для рецептор-связывающих белков, могут быть включены пониженная чувствительность к протеолитическому разложению и особенно поддержание активности рецептор-связывающего белка во время инкубирования в определенных жестких условиях окружающей среды и эксперимента. В ряде вариантов осуществления изобретения измененные биохимические и биофизические параметры могут включать, например, увеличенный полупериод существования в кровотоке ίη νίνο, повышенную биодоступность, увеличенную продолжительность действия ίη νίίτο и т.п.
Любой рецептор-связывающий белок (обычно цитокин, хемокин, фактор роста и полипептидный гормон), имеющий биологическую (т.е. физиологическую, биохимическую или фармацевтическую) активность, связанную с частями молекулы, которые отдалены от ее аминоконца или от естественного или мутационным путем интродуцированного центра гликозилирования, можно соответствующим образом использовать в данном изобретении в качестве исходного компонента. Данные биоактивные компоненты включают, но без ограничения перечисленным, пептиды, полипептиды, белки и т.п. Биоактивные компоненты также включают фрагменты, мутеины и производные данных пептидов, полипептидов, белков и т.п., в особенности такие фрагменты, мутеины и производные, обладающие биологической (т.е. физиологической, биохимической или фармацевтической) активностью.
Подходящие пептиды, полипептиды и белки, гликопротеины и т.п., которые используют как биоактивные компоненты в данном изобретении включают любой пептид, полипептид или белок и т.п., имеющий одну или более чем одну доступную аминогруппу, тиоловую группу или другую группу, которая отдалена от рецептор-связывающей области или областей биоактивного компонента и к которой могут быть селективно присоединены полимеры. Данные пептиды, полипептиды, белки, гликопротеины и т.п. включают цитокины, хемокины, факторы роста и полипептидные гормоны, которые могут иметь любую из множества структур (см. статьи Νίοοία Ν.Α., см. выше; Бейет С.Н., см. выше).
Например, подходящие пептиды, полипептиды и белки, представляющие интерес, включают, но без ограничения перечисленным, класс цитокинов, имеющих структуры, содержащие четыре α-спиральных пучка (оба из подклассов с длинной цепью и короткой цепью) (в качестве обзора см. статью Бейет С.Н., см. выше). Множество данных белков, имеющих четырехспиральные пучки, пригодны для применения в данном изобретении, включая, но без ограничения перечисленным, интерлейкины, например, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12 (субъединица р35), ИЛ-13, ИЛ-15 и ИЛ-17; колониестимулирующие факторы, например макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-СБР) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-СБР; см. статью Εοζ\ν;·ΐΓ81<ί Ό.Ά. и соавт. (1996), Рго1ешк, 26:304-313); интерфероны, например ИФН-α, ИФН-β (включая, но без ограничения перечисленным, ИФН-3-1Ь) и консенсусный ИФН; фактор ингибирования лейкоза (ЫР); эритропоэтин (Еро); тромбопоэтин (Тро); фактор роста и развития мегакариоцитов (МСИР); фактор стволовых клеток (БСР), известный также в области техники как фактор Б1ее1 (см. статьи Μοιτίδ^ν Р.1. и соавт. (1994) Се11 Iттиηο1., 157:118-131 ; Ме№еее Ι.Κ. и соавт. (1995), 1. ΡόιιΚοο. ΒίοΙ., 58:14-22); онкостатин М (ОБМ); белок, активирующий фосфолипазу (РЬАР); нейротрофические факторы и их пептидомиметики. Хотя пролактин и гормон роста являются классическими гормонами, которые широко циркулируют в организме, в отличие от цитокинов, которые, как правило, образуются около своих клеток-мишеней, пролактин и гормон роста принадлежат к тому же самому структурному классу, что цитокины с четырьмя α-спиральными пучками (см. статьи Νίοοία Ν.Α., см. выше; Οοίίΐη V. и соавт., см. выше), и они представляют собой аналогично пригодные мишени для спаривания с полимером и для получения настоящих конъюгатов в соответствии с данным изобретением. Аналоги, мутеины антагонисты, варианты и производные данных пептидов, полипептидов и белков также подходят для применения в изобретении и, вследствие этого, охватываются данным изобретением.
Рецептор-связывающие белки из структурных классов β-складки или β-ствола с длинной цепью (в качестве обзора см. Бейет С.Н., см. выше) также пригодны для применения при получении конъюгатов и композиций, соответствующих данному изобретению. Они включают, но без ограничения перечисленным: семейство цитокинов фактора некроза опухоли, например ΤΝΡ-α, ΤΝΡβ и лигандов Рак, которые представляют β-гелеобразные скрученные структуры; ИЛ-1 (включая ИЛ-1а и ΚΠ-1β) и семейства РОР (включая фактор роста основных фибробластов (ЬРОР), кислый РОР, РОР-4 и фактор роста кератиноцитов (КОР; РОР-7)), которые демонстрируют укладку в виде β-трилистника (см. статьи Бейет С.Н. и др., см. выше; Бсй1екктдег 1. и соавт., см. выше); ИЛ-12, ИЛ-16, эпидермальный фактор роста (ЕОР; см. статью Ьи Н.-Б. и соавт., см. выше) и факторы роста тромбоцитов (РИОР), трансформирующие факторы роста (включая трансформирующий фактор роста-α и трансформирующий фактор роста-β (ТОР-β)) и факторы роста нервов, которые принимают структуры цистинового узла. Аналоги, мутеины антагонисты, варианты и производные данных пептидов, полипептидов и белков также подходят для применения в изобретении и, вследствие этого, охватываются данным изобретением.
Дополнительный структурный класс белков, которые эффективно используют в конъюгатах и композициях, соответствующих данному изобретению, представляет собой класс богатых дисульфидом смешанных α/β цитокинов, хемокинов и факторов роста (в качестве обзора см. статью Бейет С.Н., вы
- 17 013535 ше), включая, но без ограничения перечисленным: семейство ЕСЕ, которое имеет структуру β-изгиба, ИЛ-8, ΒΑΝΤΕ8, нейтрофил-активирующий пептид-2 (ΝΑΡ-2), фактор 1α из клеток стромы (8ΌΕ-1α), белки хемоаттрактантов моноцитов (МСР-1, МСР-2 и МСР-3), эотаксины (например, эотаксин-1, эотаксин-2 и эотаксин-3), фактор-1, ингибирующий миелоидные предшественники (ΜΡΙΕ-1), нейротактин, фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (ΜΙΕ), онкоген, связанный с ростом/активность, стимулирующую рост меланомы (ΟΕΘ-α/ΜΟ8Α), соматомедины, а также инсулин и инсулиноподобные факторы роста (например, 1СЕ-1 и 1СЕ-2). Близкий структурный класс белков, пригодных для применения в конъюгатах и композициях, соответствующих данному изобретению, представляет собой цитокины с мозаичными структурами, которые включают факторы роста, такие как ИЛ-12 и фактор роста гепатоцитов (см. статью Νίοοία Ν.Α., см. выше).
Другие белки, представляющие интерес, включают, но без ограничения перечисленным: гормоны роста (в особенности человеческий гормон роста (ЙСН; см. Те11е1е1 А. и соавт. (1997), Μοί. Се11 Εηάοατηοί., 130:141152) и их антагонисты (см., например, ΞιιηάδίΓοιη М. и соавт. (1996), I. Βίοί. Сйет., 271:32197-32203), пролактин и его антагонисты, хорионический гонадотропин, фолликул-стимулирующий гормон, тироидстимулирующий гормон, пигментные гормоны, гипоталамические рилизинг-факторы, антидиуретические гормоны и рецептор-связывающие антагонисты цитокинов и факторов роста всех вышеперечисленных структурных классов. Многие такие белки существуют как в гликозилированной, так и в негликозилированной формах. Негликозилированные формы могут быть результатом их получения с использованием технологий рекомбинантной ДНК в прокариотах или при использовании химического синтеза. Данные негликозилированные продукты находятся в числе пептидов и белков, которые представляют собой подходящие биоактивные компоненты, соответствующие данному изобретению. Наконец, хотя некоторые антитела действуют как рецептор-связывающие агонисты или антагонисты (см., например, статью Μοττίδ ЕС. и соавт. (2000), Αηη. КЕеит. Όίδ., 59 (8ирр1 I): 1109-1114), такие иммуноглобулины не являются подходящими кандидатами на Ν-концевое связывание с полимером в объеме данного изобретения, т.е. они не являются ΚΝ рецептор-связывающими белками, поскольку аминоконцевые области обеих, легкой и тяжелой, цепей участвуют в распознавании антигена.
Особенно применимыми в качестве биоактивных компонентов для использования в получении полимерных конъюгатов, соответствующих данному изобретению, являются интерферон-α, интерферон-β (включая ИФН-в-1Ь), ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ΤΝΕ-айСН, пролактин, инсулин, 1СЕ-1, ЕСЕ, ЬЕСЕ и эритропоэтин (Еро). Также особенно применимыми являются мутеины и фрагменты данных биоактивных компонентов, в частности, те, которые способны связываться с рецепторами для соответствующих полипептидов дикого типа и интактных полипептидов, независимо от того, индуцирует или нет данное связывание биологический или физиологический эффект. В ряде данных вариантов осуществления мутеины и фрагменты биоактивных компонентов могут действовать как антагонисты соответствующих лигандов, которые снижают, существенно снижают или полностью ингибируют связывание лигандов со своими рецепторами и/или активность лигандов на их клетках-мишенях, тканях и/или организмах. Другие антагонисты, которые могут быть или могут не быть структурными аналогами, мутеинами, вариантами или производными лигандов, представляющих интерес, также подходят для получения конъюгатов согласно данному изобретению. Для практических целей можно определить, оказывает ли данный мутеин, фрагмент, вариант, производное или антагонист антагонистическое воздействие на биологические и/или физиологические эффекты данного лиганда без проведения излишних экспериментов, используя анализы биологических/физиологических эффектов самого лиганда, множество из которых хорошо известно в области техники и/или описано в данном контексте.
Структуры (первичные, вторичные, третичные и, где применимо, четвертичные) данных и других полипептидов, представляющих интерес, которые эффективно используют в соответствии с данным изобретением, хорошо известны в области техники и будут знакомы обычным специалистам, в особенности в свете структур, представленных в данном контексте, и в ссылках, приведенных в данном контексте, которые включены в данном контексте в виде ссылки во всей их полноте.
Конъюгаты
Данное изобретение представляет стабильные конъюгаты биоактивных компонентов, в частности цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов, для применения во множестве приложений. Данные конъюгаты, соответствующие изобретению, имеют ряд преимуществ относительно тех, которые были ранее известны в области техники, как показано путем следующих неограничивающих и приведенных в качестве примера сравнений известных в области техники конъюгатов: Н. ΗίηΙαηί (см. Европейский патент № ЕР 0098110 и патент США № 4609546) раскрывают конъюгаты сополимеров этиленоксида и пропиленоксида (ПЭГ-ИИГ, представителя общего класса ПАГ) с белками, включая интерфероны и интерлейкины, где не описано никакого предпочтения в плане избежания областей белков, участвующих в связывании рецептора. В данных ссылках интерфероны α, β и γ рассматривались как эквивалентные мишени для связывания ПАГ в отличие от данного изобретения, в котором не считают, что интерферон-γ является подходящей мишенью для Ν-концевого связывания, поскольку аминоконец находится внутри рецептор-связывающей области данного цитокина. Кроме того, ΗίΓαΙαηί раскрывает
- 18 013535 конъюгаты, синтезированные только с ПАГ молекулярной массы от 1 до 10 кДа, тогда как в способах, соответствующих данному изобретению, предпочитают спаривание водорастворимых, синтетических полимеров с молекулярными массами, превышающими 10 кДа, для терапевтического применения. Аналогично Ν.ν. Ка1ге (см. (1990), 1 1ттипо1., 144:209-213) описывает, что связывание большего числа цепей мПЭГ молекулярной массы 5 кДа с человеческим рекомбинантным интерлейкином-2 увеличивает полупериоды существования полученных в результате конъюгатов в кровотоке мышей и кроликов. Однако данная ссылка не раскрывает или не признает перспективности связывания меньшего числа более длинных цепей ПЭГ или связывания одной цепи высокомолекулярного ПЭГ с аминоконцом ИЛ-2, как представлено в данном изобретении.
С. 8йате (см. патент США № 4904584 и публикацию РСТ № \¥О 89/05824 А2) раскрывает способы индукции селективного в отношении центра присоединения амин-реакционных полимеров путем интродукции, замены или делеции остатков лизина в белке-мишени, в особенности в Еро, С-С8Е и ИЛ-2. Однако в отличие от описания данного изобретения эти ссылки не раскрывают, что амин-реакционные полимеры могут реагировать с любым амином в белке-мишени, отличным от ε-аминогрупп остатков лизина, четко отграничивая данные описания от настоящего изобретения.
Э.Е. №1еск| и соавт. (см. патент США № 4902502) раскрывают множество ПЭГилированных конъюгатов ИЛ-2, которые были получены из различных хлорформиатных производных ПЭГ, которые были предназначены для реакции с ε-аминогруппами остатков лизина. Однако в противоположность настоящим способам, данная ссылка не раскрывает ни способа, как избежать ПЭГилирования остатков лизина в областях белка ИЛ-2, которые участвуют в связывании рецептора, ни какой-либо осведомленности в том, что избежание данных центров является благоприятным.
Ν. Ка1ге и соавт. (см. патент США № 5206344) раскрывают конъюгаты ПЭГ-ИЛ-2, в которых ПЭГ связан с ε-аминогруппами остатков лизина, неспаренной сульфгидрильной группой естественного остатка цистеина в положении 125 (считая от аминоконца) или с сульфгидрильной группой остатка цистеина, который был мутационным путем интродуцирован между первым и двадцатыми остатками от аминоконца ИЛ-2. В группу мутеинов, которые описаны в патенте '344, включен дез-а1а-1 ИЛ-2, т.е. мутеин, в котором аминоконцевой аланин делетирован и который не является ПЭГилированным. Однако в противоположность настоящему описанию, патент '344 не раскрывает ни какого-либо способа избежания спаривания ПЭГ с остатками аминокислот, которые участвуют в связывании с рецепторами, ни какоголибо понимания того, что данный подход мог бы быть перспективным. В соответствии с данным замечанием и в противоположность настоящему изобретению широкий интервал точек присоединения, предложенный в патенте '344 не предполагает, что связывание ПЭГ с аминоконцом ИЛ-2 было бы особенно благоприятным.
В материалах 8.Р. Моикагкй и соавт. (1997), Апа1. Вюсйет., 247:434-440 и 8.Р. Моикагкй и соавт. (1997), в монографии под ред. НаггЦ 1.М. и соавт. Полиэтиленгликоль: химия и биологическое применение (Ро1у(е1йу1епе д1усо1): СйетМгу апб Вю1одюа1 Аррйсабопк), с.207-216, Атепсап С11етюа1 8ос1е1у, ^а§Ыпд!оп Э.С. описано, что реакция интерферона^^а с трехкратным молярным избытком активированного ПЭГ молекулярной массы 5300 Да дает одиннадцать позиционных изомеров моноПЭГинтерферона, соответствующих одиннадцати остаткам лизина в интерфероне-л-За. Не описано никакого ПЭГ-интерферона, в котором ПЭГ связан с α-аминогруппой на аминоконце интерферона. Одиннадцать позиционных изомеров, описанных в данных ссылках, проявляли антивирусные активности в клеточных культурах, которые лежали в интервале от 6 до 40% от активности немодифицированного интерферона и антипролиферативные активности в клеточных культурах, которые лежали в интервале от 9 до 29% от активности немодифицированного интерферона. Данные результаты ясно демонстрируют, что случайное ПЭГилирование остатков лизина, практически осуществленное данными исследователями, нарушало функции интерферона-α-2а, опосредованные его рецепторами, в противоположность конъюгатам, полученным способами, соответствующими данному изобретению. Кроме того, в отличие от конъюгатов, соответствующих данному изобретению, в конъюгатах, описанных в данных ссылках, отсутствовал интерферон, ПЭГилированный по Ν-концу.
О. Νίδΐιίιηιιπι и соавт. (см. патент США за законодательно установленным регистрационным номером изобретения № Н1662) раскрывает конъюгаты интерферона-α, интерферона-γ и ИЛ-2, которые получают путем восстановительного алкилирования активированных альдегидов метилового эфира полиэтиленгликоля цианоборгидридом натрия при рН 7,0 (для конъюгатов интерферона) или рН 7,15 (для конъюгатов ИЛ-2). Однако было описано, что конъюгаты, полученные данными способами, теряют до 95% биоактивности немодифицированных белков, вероятно, вследствие присутствия множества центров присоединения полимера, все из которых, как показано, находятся на ε-аминогруппах остатков лизина (см. фиг. 1 и 4 данного изобретения).
В статье Э.К. Ре(111 и соавт. (см. выше) раскрывают полимерные конъюгаты интерлейкина-15 (ИЛ-15). Однако конъюгированный ИЛ-15, описанный в данной ссылке, не только терял свою ИЛ-2подобную активность стимуляции роста в результате связывания полимеров с остатками лизина в областях белка, которые участвуют в связывании рецептора, но он также демонстрировал антагонизм, а не
- 19 013535 агонизм. Данные авторы заключают, что селективное ингибирование связывания ИЛ-15 с одним из нескольких клеточных поверхностных рецепторов может быть следствием конъюгирования полимера и что данное ингибирование может не только снизить уровень связывания с рецептором, но может привести к реверсии биологического эффекта белка. Избегая спаривания полимеров с частями рецепторсвязывающего белка, которые участвуют во взаимодействиях со своими рецепторами, в данном изобретении избегают данного нежелательного следствия связывания полимеров.
1. Нак1Ш1 и соавт. (см. патенты США №№ 5792834 и 5834594) раскрывает уретан-связанные конъюгаты ПЭГ с белками, включая интерферон-α, ИЛ-2, интерлейкин-1 (ИЛ-1) и антагонист рецептора ИЛ-1, которые, как сообщают, были получены с целью снижения иммуногенности, повышения растворимости и увеличения биологического полупериода существования соответствующих белков. В данных ссылках ПЭГ был связан с различными свободными аминогруппами без ссылки на Ν-концевое ПЭГилирование и без описания того, что Ν-концевые α-аминогруппы могут или должны быть ПЭГилированными. Данные патенты устанавливают также, что конъюгат, описанный в данном контексте, имеет по меньшей мере часть первоначальной биологической активности исходного белка, указывая, таким образом, на возможную потерю значительной биоактивности. Данный результат согласовывался бы с использованием способов ненаправленного ПЭГилирования, раскрываемых в данном контексте. В противоположность данному изобретению эти патенты не раскрывают никаких попыток улучшить сохранение биоактивности их конъюгатов путем изменения селективности процессов ПЭГилирования, раскрываемых в данном контексте.
О.В. К1П511ет и соавт. (см. публикация Европейской патентной заявки № ЕР 0822199 А2) раскрывает способ проведения реакции полиэтиленгликоля с α-аминогруппой аминокислоты на аминоконце полипептида, в особенности консенсусного интерферона и О-С8Е, которые представляют собой два из белков, производимых Атдеп, 1пс., представителем данной патентной заявки. Данная публикация показывает, что значение рН, достаточно кислое для селективной активации α-аминогруппы является необходимым признаком описанного способа. Напротив, в настоящем изобретении описано, что снижение рН уменьшает реакционность аминогрупп с альдегидами ПЭГ и что α-аминогруппа является более реакционной, когда она непротонирована, т.е. при значении рН выше ее рКа. Так, данные авторы обнаружили, что никакая величина рН не является достаточно кислой для того, чтобы селективно активировать α-аминогруппу любого из ΚΝ цитокинов, соответствующих данному изобретению. Объяснения рН-зависимости реакционности Ν-концевых α-аминогрупп с альдегидами, приведенные в работах ЕТ. Ей§а11 (см. выше) и К.8. Ьаткеп и соавт. ((2001), Вюсоищд. СЬет., 12:861-869), более совместимы с опытом настоящих авторов. Более того, КтЩет и соавт. сообщают о применении Ν-концевого ПЭГилирования полипептидов для получения повышенной гомогенности полученных в результате конъюгатов и защиты аминоконца от разложения протеиназами, но не раскрывает, что Ν-концевое ПЭГилирование может сохранить более высокую фракцию рецептор-связывающей активности ряда рецептор-связывающих белков (см., например, публикацию РСТ № XVО 96/11953; Европейский патент № ЕР 0733067 и патент США №№ 5770577, 5824784 и 5985265, все выданные К1пч(1ег О.В. и соавт.).
В Европейской заявке КшкИет и соавт. (ЕР 0822199 А2) также обобщают преимущества Ν-концевого ПЭГилирования для всех полипептидов, которые не входят в круг интересов настоящих авторов. В частности, поскольку аминоконцы молекул антител расположены проксимально антиген-связывающему участку белков антител (см. статью СЬартап А.Р. (2002), Αάν. Итид Ие11У. Кеу., 54:531-545), Ν-концевое ПЭГилирование антител неожиданно вредно сказывается на биоактивности по сравнению со случайным ПЭГилированием остатков лизина, как раскрывает Ьаткеп К.8. и соавт., см. выше. Аналогично ожидают, что Ν-концевое ПЭГилирование рецептор-связывающих белков, которые не являются ΚΝ рецепторсвязывающими белками, например интерферона-γ (см. фиг. 8), будет больше ингибировать взаимодействия с рецепторами, чем случайное ПЭГилирование остатков лизина таких рецептор-связывающих белков.
Таким образом, как отмечено выше, способы, соответствующие данному изобретению, отличаются от тех, которые раскрывают КпъБег и соавт. в публикациях, приведенных в данном контексте, в том плане, что конъюгаты, соответствующие данному изобретению, получают путем конъюгирования одного или более цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов или их антагонистов, которые выбраны как ΚΝ рецептор-связывающие белки с одним или более полимеров путем формирования смеси лиганда(ов) и одного или более полимеров при значении рН от приблизительно 5,6 до приблизительно 7,6, при значении рН от приблизительно 5,6 до приблизительно 7,0, при значении рН от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0, при значении рН от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,0, при значении рН от приблизительно 6,6 до приблизительно 7,6, при значении рН от приблизительно 6,6 до приблизительно 7,0 или при значении рН приблизительно 6,6. Напротив, способы КиъНег и соавт. основаны на конъюгировании лигандов при рН ниже 5,5, причем настоящие авторы обнаружили, что данный интервал является субоптимальным или худшим для получения препаратов лигандов, селективно конъюгированных с полимерами по отдаленным Ν-концевым аминокислотам и/или по отдаленным центрам гликозилирования.
- 20 013535
К.В. Рершкку В. и соавт. (см. публикацию РСТ № XVО 00/23114 и публикацию патентной заявки США № 2003/0021765 А1) раскрывают полимерные конъюгаты гликозилированного интерферона-в-1а, которые более активны, чем негликозилированный интерферон-в-1Ь в анализе на антивирусную активность. Данная ссылка раскрывает также, что полиалкиленгликоль может быть связан с интерфероном-в-1а через множество связывающих групп в различных положениях, включая аминоконец, карбоксильный конец и углеводную часть гликозилированного белка. Однако в данной публикации не раскрывают, что описанные способы могут быть распространены на другие белки: данные исследования показывают, что несмотря на сохранение консервативности между последовательностями интерферона-в-1а и интерферона-в-1Ь, они представляют собой различные биохимические структуры и, вследствие этого, многое из того, что известно об интерфероне-в-1Ь, неприменимо к интерферону-в-1а, и наоборот. Напротив, данное изобретение раскрывает общие черты, присущие ΚΝ и КО рецептор-связывающим белкам, как определено в данном контексте. Согласно данному изобретению, оба, интерферон-в-1а и интерферон-в-1Ь, являются ΚΝ рецептор-связывающими белками. Кроме того, интерферон-в-1Ь представляет собой КО рецептор-связывающий белок. Соответственно, в противоположность способам, соответствующим заявке νθ 00/23114, способы, соответствующие данному изобретению, используют для получения стабильных биоактивных конъюгатов как интерферона-в-1Ь, так и интерферона-в-1а.
Ζ. Ле1 и соавт. (см. патент США № 6077939) раскрывают способы связывания водорастворимых полимеров (в особенности ПЭГ) с Ν-концевым α-углеродным атомом полипептида (в особенности эритропоэтина), где амин на α-углероде Ν-концевой аминокислоты сначала трансаминируют до получения α-карбонильной группы, которая затем реагирует с производным ПЭГ с образованием оксима или гидразоновой связи. Хотя описанным объектом данной ссылки была разработка способа, который был бы применим к белкам в целом, не дается никаких предположений относительно сохранения рецепторсвязывающей активности, которое может быть результатом выбора аминоконца как центра ПЭГилирования ряда рецептор-связывающих белков. Таким образом, в противоположность описанию Ле1 и соавт. в данном изобретении не требуется отдаления Ν-концевой α-аминогруппы, но, напротив, можно сохранить заряд Ν-концевой α-аминогруппы при нейтральном значении рН посредством формирования вторичной аминной связи между белком и полимером.
Ον. ОйЬей и соавт. (см. патент США № 6042822; Европейский патент № ЕР 1039922) раскрывают желательность использования смеси позиционных изомеров ПЭГ-интерферон-а-2Ь, где особенно желательный изомер содержит ПЭГ, связанный с остатком гистидина интерферона-а-2Ь, в особенности гистидина-34, и демонстрируют, что связь ПЭГ с гистидином-34 нестабильна. Поскольку гистидин-34 лежит на поверхности интерферона-а-2Ь в области, которая должна находиться в тесном контакте с рецептором интерферона, чтобы включать сигнальную трансдукцию (см. фиг. 1Ь настоящего описания), нестабильность связи между ПЭГ и гистидином-34, описанная в данных ссылках, по-видимому, является важной для функции описанного в данном контексте конъюгата ПЭГ-интерферон. Практически чистые связанные через гистидин полимерные конъюгаты белков описаны 8. Ьее и соавт., см. патент США № 5985263. Напротив, настоящее изобретение демонстрирует, что одним из предпочтительных конъюгатов является конъюгат ПЭГ-интерферон, где ПЭГ стабильно связан с центром, который отдален от рецепторсвязывающих доменов интерферонового компонента.
Р. ВаНоп и соавт. (см. (2001), Вюсопщд. СНет.. 12:195-202), раскрывает, что интерферон-а-2а, который ПЭГилирован одной молекулой ди-мПЭГ-лизина молекулярной массы 40 кДа/молекулу интерферона, состоит из четырех основных позиционных изомеров. В данной ссылке описывают, что почти все из ПЭГ присоединены амидными связями к лизинам 31, 121, 131 или 134, каждый из которых находится в или прилежит к рецептор-связывающим доменам интерферона-а-2а (остатки 29-35 и 123-140 согласно данным ВаПоп и соавт.; см. фиг. 1а настоящего описания). Ν-концевое ПЭГилирование не было описано ВаПоп и соавт. Сообщают, что антивирусная активность выделенной смеси позиционных изомеров ПЭГ-интерферона в отношении инфекции вируса везикулярного стоматита клеток бычьей почки МабшЭагЬу ш νίΡΌ составляет 7% от уровня неконъюгированного интерферона-а-2а, который был тестирован. Существенная потеря биоактивности, которую наблюдают у данных конъюгатов ПЭГ-интерферона, не включает ПЭГилированный по Ν-концу интерферон, что, таким образом, четко отделяет конъюгаты, предложенные ВаЛоп и соавт., от конъюгатов, соответствующих данному изобретению.
К.В. Рершкку и соавт. (см. (2001), ί. РНагтасо1. Ехр. ТНег., 297:1059-1066), раскрывают синтез конъюгата, состоящего из (1) гликозилированного интерферона-в-1а, имеющего Ν-концевой остаток метионина и (2) ПЭГ-альдегида молекулярной массы 20 кДа. Конъюгат, который в данной ссылке рассматривают как моноПЭГилированный по Ν-концевому метионину, как показывают, сохраняет полную биоактивность в анализе на антивирусную активность, тогда как связывание более высокомолекулярного ПЭГ снижает или устраняет антивирусную активность. Хотя данные авторы описывают, что их выбор Ν-концевого центра для ПЭГилирования гликозилированного интерферона-в-1а был продиктован доступностью реагентов для центр-селективного ПЭГилирования и молекулярного моделирования, они признают, что некоторые эффекты являются специфическими для продукта. Более того и в противополож
- 21 013535 ность данному изобретению, описанные в данном контексте наблюдения не были обобщены так, чтобы включить класс рецептор-связывающих белков, которые определены в данном контексте как ΚΝ рецептор-связывающие белки.
1. Вигд и соавт. (см. публикацию РСТ № XVО 01/02017 А2) раскрывает получение алкоксиПЭГконъюгатов гликопротеинов эритропоэтина, в которых от одной до трех цепей метоксиПЭГ реагировала/реагировали с сульфгидрильными группами, которые были химически интродуцированы посредством модификации ε-аминогрупп остатков лизина на поверхности гликопротеина. Однако в противоположность данному изобретению, данная ссылка не раскрывает никаких попыток связать ПЭГ со свободной α-аминогруппой Ν-концевой аминокислоты эритропоэтина или избежать модификации остатков лизина в областях гликопротеина эритропоэтина, которые являются основными во взаимодействиях с эритропоэтиновыми рецепторами.
1. Вигд и соавт. (см. публикацию РСТ № νθ 02/49673 А2) раскрывает синтез связанных через Ν-концевой амид конъюгатов ПЭГ с природными и мутеиновыми гликопротеинами эритропоэтина способом, в котором используют селективно отщепляемые удлинения Ν-концевого пептида, которые отщепляют перед ПЭГилированием и после обратимого цитраконилирования всех ε-аминогрупп остатков лизина гликопротеина. Описанный рациональный момент для многостадийного процесса в данной ссылке состоял в том, чтобы сделать процесс ПЭГилирования селективным в отношении свободных α-аминогрупп Ν-концевой аминокислоты с целью получения гомогенных моноПЭГилированных конъюгатов, избегая таким образом необходимости отделять моноПЭГилированные конъюгаты от множественно ПЭГилированных производных. Данный способ отличается от способа, соответствующего данному изобретению по ряду важных аспектов, включая, но без ограничения перечисленным: (1) подход Вигд и соавт. ограничен гликопротеинами эритропоэтина, к которым алкоксиПЭГ присоединен через амидные связи, тогда как данное изобретение применимо к множеству биоактивных компонентов, конъюгированных при использовании множества синтетических полимеров; (2) данное изобретение касается как гликозилированных, так и негликозилированных ΚΝ и ЯС рецептор-связывающих белков, тогда как Вигд и соавт. раскрывают только конъюгирование гликопротеинов; (3) данное изобретение охватывает как алкоксиПЭГ, такие как мПЭГ, так и монофункционально активированные гидроксиПЭГ, тогда как Вигд и соавт. раскрывает только применение алкоксиПЭГ; и (4) в данном изобретении вторичные аминные связи между полимером и белком предпочтительны относительно амидных связей, использованных Вигд и соавт., поскольку последние более стабильны и сохраняют положительный заряд на аминогруппе. В аналогичной работе этой же группы 1. Вигд и соавт. (см. патент США № 6340742) раскрывают получение связанных с амидом конъюгатов гликопротеинов эритропоэтина, в которых от одной до трех цепей алкоксиПЭГ связана/связаны с от одной до трех аминогрупп белка. Однако в противоположность данному изобретению в этой ссылке не сообщают о предпочтительности α-аминогрупп Ν-концевой аминокислоты или аминогрупп, которые не находятся в областях, которые участвуют во взаимодействиях с рецепторами.
С. Ωοίβαάο и соавт. (патент США № 6384195) раскрывает конъюгаты гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора, который получают при использовании реакционного полимера, который представлен как трезилмонометоксиПЭГ и обозначен в данном контексте как ТМПЭГ. Данная ссылка показывает, что, когда ТМПЭГ контактирует с рекомбинантным человеческим СМ-С8Р, модифицированный материал содержит молекулы, не обладающие активностью и имеющие более высокую активность, чем немодифицированный материал. Как легко может понять обычный специалист, присутствие молекул, не обладающих активностью, нежелательно в смеси конъюгатов полимер-биоактивный компонент, в особенности в композициях для терапевтического применения, которые содержат такие конъюгаты, поскольку они могут способствовать возникновению риска введения конъюгата нуждающемуся в данном введении пациенту, не участвующего в создании положительных эффектов. Как отмечено в данном контексте, настоящее изобретение преодолевает это ограничение в области техники по меньшей мере в части избежания модификации СМ-С8Р и других рецептор-связывающих белков в центрах на белках, которые участвуют в их рецептор-связывающей активности, снижая таким образом или устраняя синтез молекул, не обладающих никакой активностью. Данное изобретение представляет также способы фракционирования и очистки конъюгатов, которые имеют различные размеры, разные заряды и/или различные степени защиты зарядов на белке посредством полимера (см. фиг. 9-12).
Заслуживает внимания, что в патенте США № 6384195 не упоминают Ν-концевое ПЭГилирование СМ-С8Р и, вследствие этого, не признают преимуществ способов, соответствующих данному изобретению. Наконец, патент США № 6384195 показывает преимущество конъюгатов, в которых более чем одна молекула ПЭГ связана с каждой молекулой СМ-С8Р, без какого-либо анализа того, где на молекуле СМ-С8Р присоединены данные молекулы ПЭГ (отличные от связанных с остатками лизина). Утверждая предпочтительность конъюгатов, содержащих до шести молекул ПЭГ/молекулу СМ-С8Р, ссылка, таким образом, утверждает предпочтительность конъюгатов, в которых ПЭГ мог быть присоединен ко всем возможным остаткам лизина, обеспечивая тем самым, что ПЭГ будет присоединен в положениях, которые стерически затрудняют близкий подход белка к его клеточным поверхностным рецепторам (см.
- 22 013535 фиг. 3 данного описания). Напротив, настоящее изобретение показывает нежелательность связывания ПЭГ с остатками лизина, за исключением тех случаев, когда данные остатки лизина отдалены от доменов рецептор-связывающего белка, которые являются основными для взаимодействий с рецепторами и, следовательно, для сигнальной трансдукции (в случае агонистов) или для конкурентного ингибирования сигнальной трансдукции (в случае антагонистов).
Т. №1катига и соавт. (см. публикацию РСТ № \¥О 02/32957 А1) показывает, что увеличение молекулярной массы ПЭГ, который связан с ε-аминогруппой остатка лизина в положении 52 гликопротеина эритропоэтина, повышает эритропоэтический эффект конъюгата ίη νίνο при снижении аффинности конъюгата в отношении эритропоэтиновых рецепторов. Однако в противоположность данному изобретению данная ссылка не раскрывает связывание ПЭГ на аминоконце или около центра гликозилирования и не признает каких-либо преимуществ осуществления этого.
Следовательно, данное изобретение представляет конъюгаты биоактивных компонентов и способы синтеза конъюгатов, связанные с синтетическими полимерами, которые имеют различные структурные и функциональные преимущества относительно тех, которые были описаны ранее.
Композиции
Изобретение представляет конъюгаты или комплексы, содержащие один или более биоактивных компонентов, соответственно один или более цитокинов, хемокинов, факторов роста или полипептидных гормонов, связанных с одним или более стабилизирующих полимеров, таких как один или более ПЭГ. Как правило, данные конъюгаты получают способами, соответствующими данному изобретению, описанными в данном контексте; однако конъюгаты, имеющие структуры и активности, отличные от тех, что описаны в данном контексте, независимо от способов, использованных для получения данных конъюгатов, считают эквивалентными тем, если они получены данными способами, и вследствие этого они охватываются данным изобретением. В близких аспектах изобретение представляет также композиции, содержащие один или более таких конъюгатов или комплексов. Композиции, соответствующие этому аспекту изобретения, должны содержать один или более (например, один, два, три, четыре, пять, десять и т.п.) вышеописанных конъюгатов или комплексов, соответствующих изобретению. В ряде таких аспектов композиции могут содержать один или более дополнительных компонентов, таких как одна или более буферных солей, один или более хаотропных агентов, один или более детергентов, один или более белков (например, альбумин или один или более ферментов), один или более несвязанных полимеров, один или более осмотически активных агентов и т.п. Композиции, соответствующие данному аспекту изобретения, могут быть в любой форме, включая твердую форму (например, сухой порошок) или раствор (в частности, в форме физиологически совместимого забуференного солевого раствора, содержащего один или более конъюгатов, соответствующих изобретению).
А. Фармацевтические композиции.
Некоторые композиции, соответствующие изобретению, в частности, приготовлены для применения в качестве фармацевтических композиций для использования в профилактических, диагностических или терапевтических приложениях. Данные композиции, как правило, будут содержать один или более конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих изобретению, и один или более фармацевтически приемлемых носителей или наполнителей. Термин фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель, как используют в данном контексте, относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу или вспомогательному составу любого типа, который может переноситься животным-реципиентом, включая человека или другое млекопитающее, которому введена фармацевтическая композиция, без вредных эффектов, происходящих от их добавления.
Фармацевтические композиции, соответствующие изобретению, могут быть введены реципиенту посредством любого подходящего способа введения, такого как перорально, ректально, парентерально, внутрисистемно, вагинально, внутрибрюшинно, наружно (как в виде порошков, мазей, капель или чрескожного пластыря), защечно, как пероральный или назальный спрей или путем ингаляции. Термин парентеральный, как используют в данном контексте, относится к способам введения, которые включают внутривенную, внутриартериальную, внутримышечную, интрацистернальную, подкожную и внутрисуставную инъекцию и инфузию.
Фармацевтические композиции, представленные в данном изобретении для парентеральной инъекции, могут содержать фармацевтически приемлемые стерильные водные или неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки для восстановления с образованием стерильных инъекционных растворов или дисперсий перед применением. Примеры подходящих водных и неводных носителей, разбавителей, растворителей или инертных наполнителей включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин и т.п., пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), карбоксиметилцеллюлозу и их приемлемые смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и пригодные для инъекций органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Надлежащую сыпучесть можно поддерживать, например, посредством применения покрывающих материалов, таких как лецитин, поддержанием требующегося размера частиц в случае дисперсий и путем применения поверхностно-активных веществ.
Данные фармацевтические композиции, соответствующие настоящему изобретению, могут также
- 23 013535 содержать вспомогательные средства, такие как консерванты, увлажняющие вещества, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предупреждение действия микроорганизмов может быть обусловлено включением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, бензилового спирта, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Может также потребоваться включение осмотических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и т.п. Пролонгированное всасывание инъекционной фармацевтической формы может быть осуществлено включением агентов, которые задерживают всасывание, таких как моностеарат алюминия, гидрогели и желатин.
В ряде случаев для того, чтобы пролонгировать эффект лекарственных препаратов требуется замедлить всасывание из подкожной или внутримышечной инъекции. Это можно осуществить посредством применения жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала с низкой растворимостью в водных жидкостях тела. Скорость всасывания лекарственного препарата тогда зависит от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от его физической формы. Альтернативно замедленное всасывание парентерально введенной лекарственной формы можно осуществить путем растворения или суспендирования лекарственного препарата в масляном носителе.
Инъекционные депо-формы получают формированием микроинкапсулированных матриц лекарственного препарата в биоразрушаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарства к полимеру-носителю и природы конкретного используемого полимера-носителя можно контролировать скорость высвобождения лекарственного препарата. Примеры других биоразрушаемых полимеров включают биосовместимые полиортоэфиры и полиангидриды. Инъекционные депопрепараты также готовят путем захватывания лекарственного препарата липосомами или микроэмульсиями, которые совместимы с тканями тела.
Инъекционные препараты могут быть простерилизованы, например, путем фильтрации через фильтр, задерживающий бактерии, или посредством введения стерилизующих агентов в форме стерильной твердой композиции, которую можно растворить или диспергировать в стерильной воде или другой стерильной инъекционной среде перед применением.
Твердые дозированные формы для перорального применения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В данных твердых дозированных формах активные соединения смешивают по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем, таким как цитрат натрия или дикальцийфосфат, и/или а) инертными наполнителями, либо агентами для увеличения объема, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота, Ь) связующими агентами, такими как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и гуммиарабик, с) увлажнителями, такими как глицерин, б) разрыхлителями, такими как агарагар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, ряд силикатов и карбонат натрия, е) агентами, замедляющими растворение, такими как парафин, Г) ускорителями всасывания, такими как соединения четвертичного аммония, д) смачивающими агентами, такими как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина, 1 ) адсорбентами, такими как каолин и бентонитовая глина, и ί) скользящими агентами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердый ПЭГ, лаурилсульфат натрия и их смеси. В случае капсул, таблеток и пилюль дозированная форма может также содержать забуферивающие агенты.
Твердые композиции подобного типа могут быть использованы также в качестве наполнителей в мягких и твердых наполненных желатиновых капсулах при использовании таких наполнителей, как лактоза (молочный сахар), а также высокомолекулярный ПЭГ и т. п.
Твердые дозированные формы таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул можно приготовить с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные и хрономодулирующие покрытия и другие покрытия, хорошо известные в области приготовления фармацевтических препаратов. Они могут необязательно содержать рентгеноконтрастные агенты и могут также быть такой композиции, при которой они высвобождают активный ингредиент(ы) только или предпочтительно в определенной части желудочнокишечного тракта, необязательно замедленным образом. Примеры композиций для заключения в них агентов, которые могут быть использованы, включают полимерные субстанции и воска. Активные соединения также могут быть в микроинкапсулированной форме, при необходимости, с одним или более вышеуказанных наполнителей.
Жидкие дозированные формы для перорального введения могут включать фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Кроме активных соединений жидкие дозированные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как, например, вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, из проростков растений, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, поли(этиленгликоли) и сорбитановые сложные эфиры жирных кислот и их смеси.
Кроме инертных разбавителей, пероральные композиции могут также включать вспомогательные агенты, такие как смачивающие агенты, эмульгаторы и суспендирующие агенты, подсластители, вкусовые добавки и отдушки.
- 24 013535
Суспензии, кроме активных соединений, могут содержать суспендирующие агенты, как, например, этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбита, микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар, трагакант и их смеси.
Наружное применение включает нанесение на кожу или слизистую оболочку, включая поверхности легкого и глаза. Композиции для наружного применения, включая предназначенные для ингаляции, могут быть приготовлены в виде сухого порошка, который может находиться под давлением или не находиться под давлением. В композициях порошка, не находящегося под давлением, активные ингредиенты в тонко измельченной форме могут быть использованы в смеси с более крупным по размеру фармацевтически приемлемым инертным носителем, содержащим частицы, имеющие размер, например, до 100 мкм в диаметре. Подходящие инертные носители включают сахара, такие как лактоза и сахароза. Желательно, чтобы по меньшей мере 95 мас.% частиц активного ингредиента имело эффективный размер частиц в интервале от 0,01 до 10 мкм.
Альтернативно фармацевтическая композиция может находиться под давлением и содержать сжатый газ, такой как азот, или сжиженный газ-пропеллент. Сжиженная среда пропеллента и вся композиция в целом могут быть предпочтительно такими, что активные ингредиенты не растворяются в ней до любой существенной степени. Композиция, находящаяся под давлением, содержит также поверхностноактивный агент. Поверхностно-активный агент может представлять собой жидкий или твердый неионогенный поверхностно-активный агент или может быть твердым анионогенным поверхностно-активным агентом. Предпочтительно использовать твердый анионогенный поверхностно-активный агент в форме натриевой соли.
Следующая форма для наружного применения представляет собой форму для введения в глаз. В данном способе введения конъюгаты или композиции, соответствующие изобретению, доставляют в фармацевтически приемлемом глазном носителе, так что активные соединения находятся в контакте с поверхностью глаза в течение достаточного периода времени, чтобы обеспечить проникновение соединений в конъюнктиву или роговицу и внутренние области глаза, как, например, в переднюю камеру, заднюю камеру, стекловидное тело, водянистую влагу, жидкую часть стекловидного тела, роговицу, радужную оболочку/ресничное тело, хрусталик, сосудистую оболочку/сетчатку и склеру. Фармацевтически приемлемый глазной носитель может, например, быть мазью, растительным маслом или инкапсулирующим материалом.
Композиции для ректального или вагинального введения представлены предпочтительно суппозиториями, которые могут быть получены при смешивании конъюгатов или композиций, соответствующих изобретению, с подходящими нераздражающими наполнителями или носителями, такими как масло какао, ПЭГ или воск для суппозиториев, который является твердым при комнатной температуре, но жидким при температуре тела и вследствие этого плавится в прямой кишке и полости вагины и высвобождает лекарственные препараты.
Фармацевтические композиции, используемые в данных терапевтических способах, могут быть также введены в форме липосом. Как известно в области техники, липосомы, как правило, получают из фосфолипидов или других липидных субстанций. Липосомы формируют одно- или многослойные гидратированные жидкие кристаллы, которые диспергированы в водной среде. Можно использовать любой нетоксичный физиологически приемлемый и метаболизируемый липид, способный формировать липосомы. Кроме одного или более конъюгатов или композиций, соответствующих изобретению, данные фармацевтические композиции в липосомальной форме могут также содержать один или более стабилизаторов, консервантов, наполнителей и т.п. Предпочтительными липидами являются фосфолипиды и фосфатидилхолины (лецитины), как естественные, так и синтетические. Способы формирования липосом известны в области техники (см., например, 2абрзку 8. и соавт., патент США № 5395619). Липосомы, которые содержат фосфолипиды, конъюгированные с ПЭГ, чаще всего фосфатидилэтаноламин, связанный с монометокси-ПЭГ, имеют перспективные свойства, включая пролонгированные периоды существования в системе кровообращения млекопитающих (см. Избег Ό., патент США № 6132763).
В. Применение.
Как отмечено в другом месте в данном контексте, способы, конъюгаты и композиции, соответствующие данному изобретению, преимущественно применяют в способах поддержания или повышения биоактивности биологических компонентов, не нарушая способности биологических компонентов связываться со своими рецепторами. Некоторые такие способы, соответствующие изобретению, могут осуществлять доставку одного или более конъюгатов и композиций в клетки, ткани, органы или организмы. В частности, изобретение представляет контролируемую доставку одного или более компонентов, комплексов или композиций в клетки, ткани, органы или организмы, давая тем самым пользователю возможность регулировать во времени и пространстве количество определенного компонента, которое высвобождается для воздействия на клетки, ткани, органы или организмы.
В общем, данные способы, соответствующие изобретению, включают одну или более активностей. Например, один из таких способов, соответствующих изобретению, предусматривает (а) получение одного или более конъюгатов или композиций, соответствующих изобретению, как детально описано в данном контексте; и (Ь) контактирование одной или более клеток, тканей, органов или организмов с од
- 25 013535 ним или более конъюгатов или композиций в условиях, способствующих связыванию одного или более конъюгатов или композиций, соответствующих изобретению, с клетками, тканями, органами или организмами. После того как биоактивные компоненты конъюгатов и/или композиций, соответствующих изобретению, связываются (или в ряде случаев интернализуются) клетками, тканями, органами или организмами, компоненты продолжают осуществлять свои заданные биологические функции. Например, пептидные компоненты могут связываться с рецепторами или другими компонентами на или в клетках, тканях, органах или организмах, участвовать в метаболических реакциях в клетках, тканях, органах или организмах, осуществлять, стимулировать, или активировать, или проводить даунрегуляцию, или ингибировать одну или более ферментативных активностей в клетках, тканях, органах или организмах, давать утраченный структурный компонент клеткам, тканям, органам или организмам, обеспечивать одну или более питательных потребностей клеток, тканей, органов или организмов, ингибировать, лечить, реверсировать или иным образом облегчать один или более процессов или симптомов заболевания или физического нарушения и т.п.
В дополнительных вариантах осуществления конъюгаты и композиции, соответствующие изобретению, могут быть использованы в промышленных клеточных культурах вследствие неожиданно высоких активностей биоактивных компонентов конъюгатов, которые получают как результат комбинированных эффектов существенного сохранения их биоактивности и увеличенной продолжительности действия даже в жестких условиях промышленного применения. Данные неожиданно высокие активности настоящих конъюгатов могут привести к необычайно высокой продукции биомассы, необычайно высоким уровням экспрессии рекомбинантных белков и другим усовершенствованиям эффективности биопроцессинга.
С. Схемы дозирования.
Конъюгаты, комплексы или композиции, соответствующие изобретению, могут быть введены ίη νίίτο, ех νίνο или ίη νίνο в клетки, ткани, органы или организмы с целью доставки в них одного или более биоактивных компонентов (т.е. одного или более цитокинов, хемокинов, факторов роста или полипептидных гормонов или их антагонистов). Обычный специалист должен принимать во внимание, что эффективные количества данного активного соединения, конъюгата, комплекса или композиции можно определить эмпирически и можно использовать в очищенной форме или, если данные формы имеются, в форме фармацевтически приемлемого препарата или пролекарства. Соединения, конъюгаты, комплексы или композиции, соответствующие изобретению, могут быть введены нуждающемуся в этом больному животному (включая млекопитающее, такое как человек) в виде ветеринарных или фармацевтических композиций в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемых наполнителей. Уровень терапевтически эффективной дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая тип и степень клеточного ответа, которого хотят достигнуть, идентичность и/или активность используемого специфического соединения(ий), конъюгата(ов), комплекса(ов) или композиции(ий), возраст, массу или площадь поверхности тела, общее состояние здоровья, пол и питание пациента, время введения, способ введения и скорость выведения активного соединения(ий), продолжительность лечения, другие лекарственные препараты, применяемые в комбинации или одновременно со специфическим соединением(ями), конъюгатом(ами), комплексом(ами) или композицией(ями) и подобные факторы, которые хорошо известны обычным специалистам в области фармацевтики и медицины. Например, в рамках обычной компетенции в данной области правильно начать с доз данного соединения, конъюгата, комплекса или композиции, соответствующих изобретению, на уровнях ниже, чем те, которые требуются для достижения желательного терапевтического эффекта и постепенно повышать дозировки до тех пор, пока не будет достигнуто желательного эффекта.
Схемы дозирования могут быть также подобраны с учетом конкретного больного с целью получения заданной концентрации данного активного соединения в крови, как определено с помощью методик, принятых и рутинных для данной области техники, например гель-фильтрации (эксклюзии по размеру), ионообменной или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), биоанализов или иммуноанализов. Таким образом, схемы дозирования для пациента можно подобрать с целью достижения относительно постоянных уровней в крови, как определяют с помощью ВЭЖХ или иммуноанализов согласно способам, которые являются рутинными и знакомы обычным специалистам в областях медицины, фармацевтики и/или фармакологии.
Ό. Диагностическое и терапевтическое применение.
Диагностическое применение конъюгата, соответствующего изобретению, могло бы быть проведено для определения положения клеток или тканей, имеющих необыкновенно высокую способность связывания с цитокином, хемокинов, факторов роста или полипептидных гормонов, например рака в теле животного, в особенности человека, путем введения конъюгата или композиции, соответствующих изобретению, в которых конъюгат (или один или более компонентов, т.е. биоактивный компонент и/или синтетический полимер) помечен или содержит одну или более определяемых меток, чтобы обеспечить определение, например, посредством оптической, радиометрической, флуоресцентной или резонансной детекции согласно способам, известным в области техники. Например, в большинстве случаев немелкоклеточный рак легкого экспрессирует необычно высокие концентрации рецепторов для эпидермального
- 26 013535 фактора роста (см. статью Випп РА. и соавт., (2002), 8етт. Опсо1., 29 (8ирр1. 14):38-44). Вследствие этого в другом аспекте изобретения конъюгаты и композиции, соответствующие изобретению, могут быть использованы в диагностических или терапевтических способах, например в диагностике, лечении или предупреждении множества физических нарушений у животного, в частности млекопитающего, такого как человек, предрасположенный или страдающий от такого нарушения. В данных подходах целью терапии является приостановить или предупредить развитие нарушения и/или вылечить, вызвать ремиссию или поддержать ремиссию нарушения и/или снизить или минимизировать побочные эффекты других терапевтических схем.
Следовательно, конъюгаты, комплексы и композиции, соответствующие данному изобретению, могут быть использованы для защиты, супрессии или лечения физических нарушений, таких как инфекции или заболевания. Термин защита от физического нарушения, как используют в данном контексте, охватывает предупреждение, супрессию и лечение. Предупреждение включает введение комплекса или композиции, соответствующих изобретению, до индуцирования заболевания или физического нарушения, тогда как супрессия включает введение конъюгата или композиции до клинического проявления заболевания, следовательно предупреждение и супрессию физического нарушения, как правило, предпринимают у животного, которое предрасположено или является чувствительным к нарушению, но которое еще не страдает от него. Однако лечение физического нарушения включает введение терапевтического конъюгата или композиции, соответствующих изобретению, после проявления заболевания. Следует иметь в виду, что в медицине и ветеринарии не всегда возможно провести границу между предупреждением и супрессией физического нарушения. Во многих случаях первичное индуцирующее событие или события могут быть неизвестными или латентными, и ни пациент, ни врач могут быть не осведомлены об индуцирующем событии достаточно долго после его появления. Вследствие этого обычно используют термин профилактика как отличный от термина лечение, для того чтобы охватить как предупреждение, так и супрессию, как определено в данном контексте. Поэтому термин защита, используемый согласно способам, соответствующим данному изобретению, подразумевает включение термина профилактика. Способы, соответствующие данному аспекту изобретения, могут содержать одну или более стадий, которые позволяют клиническому врачу достигнуть вышеописанных терапевтических целей. Один из таких способов, соответствующих изобретению, может предусматривать, например: (а) выявление животного (предпочтительно млекопитающего, такого как человек), страдающего от или предрасположенного к физическому нарушению, и (Ь) введение животному эффективного количества одного или более конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих данному изобретению, как описано в данном контексте, так что введение конъюгата, комплекса или композиции предупреждает, задерживает или диагностирует развитие, или излечивает либо вызывает ремиссию, или поддерживает физические нарушения у животного.
Как используют в данном контексте, животное, которое предрасположено к физическому нарушению определяют как животное, которое не проявляет множества явных физических симптомов нарушения, но которое генетически, физиологически или иным образом имеет риск развития нарушения. В данных способах выявление животного (такого как млекопитающее, включая человека), которое предрасположено к или имеет риск либо страдает от данного физического нарушения, может быть осуществлено согласно стандартным известным в области техники способам, которые должны быть известны врачу обычной квалификации, включая, например, радиологические анализы, биохимические анализы (например, анализы относительных уровней определенных пептидов, белков, электролитов и т.п., в образце, полученном от животного), хирургические способы, генетический скрининг, семейный анамнез, физическую пальпацию, патологические и гистологические тесты (например, микроскопическое исследование ткани или образцов жидкостей тела или мазков, иммунологические анализы и т.п.), тестирование жидкостей тела (например, крови, сыворотки, плазмы, спинно-мозговой жидкости, мочи, слюны, спермы и т.п.), визуализацию (например, радиологическую, флуоресцентную, оптическую, резонансную (например, с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или резонанса спина электрона (Е8К)), и т.п. После выявления животного с помощью одного или более данных способов животное можно активно и/или профилактически лечить с целью предупреждения, супрессии, задержки развития или излечения физического нарушения.
Физические нарушения, которые можно предупредить, диагностировать или лечить с использованием конъюгатов, комплексов, композиций и способов, соответствующих данному изобретению, включают любые физические нарушения, для которых биоактивный компонент (как правило, цитокин, компонент фактора роста, хемокина или полипептидного гормона или его антагонист) конъюгатов или композиций может быть применен при предупреждении, диагностике или лечении. Данные нарушения включают, но без ограничения перечисленным, многие формы рака (например, рак молочной железы, рак матки, рак яичников, рак простаты, рак яичка, лейкозы, лимфомы, рак легкого, неврологический рак, рак кожи, рак головы и шеи, рак костей, рак толстой кишки и другие желудочно-кишечные формы рака, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, рак почки и другие карциномы, саркомы, аденомы и миеломы), ятрогенные заболевания, инфекционные заболевания (например, бактериальные заболевания, грибковые заболевания, вирусные заболевания (включая гепатит, заболевания, вызываемые кардиотроп
- 27 013535 ными вирусами, ВИЧ/СПИД и т.п.), паразитарные заболевания и т.п.), генетические нарушения (например, кистозный фиброз, боковой амиотрофический склероз, мышечную дистрофию, болезнь Гоше, болезнь Помбе, нарушение типа тяжелого комбинированного иммунодефицита, карликовость и т.п.), анемию, нейтропению, тромбоцитопению, гемофилию и другие нарушения крови, нейродегенеративные нарушения (например, рассеянный склероз, болезнь Крейцфельда-Якоба, болезнь Альцгеймера и т.п., ферментативные нарушения (например, подагру, уремию, гиперхолестеринемию и т.п.), нарушения неясной и многоочаговой этиологии (например, сердечно-сосудистое заболевание, гипертензию, воспалительную болезнь кишки и т.п.), аутоиммунные нарушения (например, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, псориаз и т.п.) и другие важные с точки зрения медицины нарушения, которые должны быть хорошо знакомы обычному специалисту. Конъюгаты, комплексы, композиции и способы, соответствующие данному изобретению, могут быть также использованы для предупреждения прогрессирования заболевания, например для химиопрофилактики развития предзлокачественного повреждения в злокачественное повреждение.
Таким образом, в терапевтических способах, соответствующих изобретению, используют один или более конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих изобретению, или одну или более фармацевтических композиций, соответствующих изобретению, которые могут быть введены нуждающемуся в этом животному множеством способов введения, в том числе перорально, ректально, парентерально (включая внутривенную, внутриартериальную, внутримышечную, внутрибрюшинную, интрацистернальную, подкожную и внутрисуставную инъекцию и инфузию), внутрисистемно, вагинально, внутрибрюшинно, наружно (например, в виде порошков, мазей, капель или чрескожных пластырей), защечно, в виде орального или назального спрея или путем ингаляции. В рамках изобретения эффективное количество конъюгатов, комплексов или композиций можно ввести ίη νίΐτο, ех νίνο или ίη νίνο в клетки или животным, страдающим от или предрасположенным к определенному нарушению, таким образом предупреждая, задерживая развития, осуществляя диагностику или лечение нарушения у животного. Как используют в данном контексте, выражение эффективное количество конъюгата (или комплекса либо композиции) относится к количеству, в котором данный конъюгат (или комплекс, или композиция) реализует биологическую активность биоактивного компонента (т. е. цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидных гормонов или его антагониста) конъюгата, комплекса или композиции, тем самым предупреждая, задерживая развитие, осуществляя диагностику, лечение или излечение физического нарушения у животного, которому был введен конъюгат, комплекс или композиция, соответствующие изобретению. Обычный специалист будет принимать во внимание, что эффективные количества конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих изобретению, можно определить эмпирически согласно стандартным методам, хорошо известным обычным специалистам в области фармацевтики и медицины; см., например, работу под ред. Веегх М.Н. и соавт. (1999), Руководство по диагностике и терапии Мегск (Мегск Магша1 οί ΟίηβηοδΡ & Тйегару), 17 изд., Мегск и ί’ο.. Кайгау, Νί; монографию под ред. Нагбтаи к О. и соавт. (2001) Фармакологическая основа терапевтических препаратов Гудмана и Джилмана (Όοοώηαη аиб СбтаЮ Тйе Ρйа^тасο1οд^са1 ВахР οί Тйетареийск), 10 изд., МсСга\\-НП1 МебР са1 РиЫРйтд Όίνίδίοη, №\ν Υογ1<; монографию под ред. 8ре1дй1 Т.М. и соавт. (1997), Лекарственная терапия Авери (Агегу'х Эгид ТщаИиет), 4 изд., АбР Iηΐетаΐ^οηа1, АиНа^, №\ν Ζеа1аηб; монографию Ка1/ипд В.О., (2000), Общая и клиническая фармакология (Ва81с & Сйшса1 Ρйа^тасο1οду), 8 изд., Банде Меб1са1 Вοοк5/МсС^а\ν-Н^11. №\ν ΥογΚ данные ссылки и ссылки, приведенные в указанных изданиях, полностью включены в данном контексте в виде ссылки.
Следует понимать, что при введении больному человеку общие ежедневные, еженедельные и ежемесячные дозы конъюгатов, комплексов и композиций, соответствующих данному изобретению, будут определяться лечащим врачом в рамках обоснованного медицинского суждения. Например, удовлетворительные результаты получают при введении определенных конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих изобретению, в соответствующих дозах, зависящих от конкретного используемого биоактивного соединения, причем данные дозы будут хорошо знакомы обычному специалисту и их легко можно определить эмпирически при использовании только рутинных экспериментов. Согласно данному аспекту изобретения конъюгаты, комплексы или композиции можно вводить в один прием или в разделенных дозах, например один или два раза в день, один или два раза в неделю либо один или два раза в месяц и т.п. Соответствующие схемы дозировок для различных способов введения (например, парентерального, подкожного, внутримышечного, внутриглазного, интраназального и т.п.) легко можно определить эмпирически при использовании только рутинных экспериментов или они будут ясно очевидными для обычного специалиста в зависимости от особенностей биоактивного компонента (т.е. цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона или его антагониста) конъюгата, комплекса или композиции.
В дополнительных приложениях конъюгаты, комплексы и композиции, соответствующие изобретению, могут быть использованы для получения специфической направленности диагностического или терапевтического агента на клетку, ткань, орган или организм, который экспрессирует рецептор, связывает, инкорпорирует или иным способом может поглощать биоактивный компонент (т. е. цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон или его антагонист) конъюгата, комплекса или компози
- 28 013535 ции. Способы, соответствующие данному аспекту изобретения, могут предусматривать, например, контактирование клетки, ткани, органа или организма с одним или более конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих изобретению, которые дополнительно содержат один или более диагностических или терапевтических агентов, причем конъюгат, комплекс или композиция связываются или поглощаются клеткой, тканью, органом или организмом, доставляя таким образом диагностический или терапевтический агент в клетку, ткань, орган или организм. Диагностический или терапевтический агент, используемый согласно данному аспекту изобретения, может представлять собой, но без ограничения перечисленным, по меньшей мере один агент, выбранный из нуклеиновой кислоты, органического соединения, белка или пептида, антитела, фермента, гликопротеина, липопротеина, элемента, липида, сахарида, изотопа, углевода, визуализирующего агента, определяемого зонда или их любой комбинации, которая может быть определяемо помечена, как описано в данном контексте. Терапевтический агент, используемый в данном аспекте настоящего изобретения, может обладать терапевтическим эффектом в отношении клетки-мишени (или ткани, органа либо организма), причем эффектом, выбранным из, но без ограничения перечисленным, коррекции дефектного гена или белка, действия лекарственного препарата, токсического эффекта, эффекта стимуляции роста, эффекта ингибирования роста, метаболического эффекта, катаболического эффекта, анаболического эффекта, антивирусного эффекта, противогрибкового эффекта, антибактериального эффекта, гормонального эффекта, нейрогуморального эффекта, стимуляторного эффекта в отношении дифференцировки клеток, ингибирующего эффекта в отношении дифференцировки клеток, нейромодулирующего эффекта, эффекта против новообразований, противоопухолевого эффекта, эффекта стимуляции или ингибирования инсулина, эффекта стимуляции костного мозга, эффекта стимуляции плюрипотентных стволовых клеток, стимулирующего эффекта в отношении иммунной системы и другого известного терапевтического эффекта, который может быть обусловлен терапевтическим агентом, доставляемым в клетку (или ткань, орган либо организм) посредством системы доставки, соответствующей этому аспекту данного изобретения.
Данные дополнительные терапевтические агенты могут быть выбраны из, но без ограничения перечисленным, известных и новых соединений и композиций, включая антибиотики, стероиды, цитотоксические агенты, вазоактивные лекарственные препараты, антитела и другие терапевтические агенты. Неограничивающие примеры таких агентов включают антибиотики и другие лекарственные препараты, используемые при лечении бактериального шока, такие как гентамицин, тобрамицин, нафициллин, парентеральные цефалоспорины и т.п.; адренокортикостероиды и их аналоги, такие как дексаметазон, уменьшающие клеточное повреждение, вызываемое эндотоксинами; вазоактивные лекарственные препараты, такие как блокаторы α-адренергического рецептора (например, феноксибензамин), агонист β-адренергического рецептора (например, изопротеренол) и допамин.
Конъюгаты, комплексы и композиции, соответствующие изобретению, могут быть также использованы для диагностики заболевания и мониторирования терапевтического ответа. В ряде таких способов конъюгаты, комплексы или композиции, соответствующие изобретению, могут содержать одну или более определяемых меток (таких как описанные в других местах в данном контексте). В конкретных данных способах эти несущие определяемую метку конъюгаты, комплексы или композиции, соответствующие изобретению, могут быть использованы для детекции клеток, тканей, органов или организмов, экспрессирующие рецепторы или иным образом поглощающие биоактивный компонент (т.е. цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон или его антагонист) конъюгатов, комплексов или композиций. В одном примере данного способа клетки, ткани, органы или организмы контактируют с одним или более конъюгатов, комплексов или композиций, соответствующих изобретению, в условиях, способствующих связыванию или поглощению конъюгата клеткой, тканью или организмом (например, путем связывания конъюгата с клеточным поверхностным рецептором или посредством фагоцитоза либо диффузии конъюгата в клетку) с последующей детекцией конъюгата, связанного или инкорпорированного в клетку при использовании средств для детекции со специфичностью в отношении используемой метки (например, детекции флуоресценции для конъюгатов с флуоресцентной меткой, визуализации с помощью магнитного резонанса для конъюгатов с магнитной меткой, радиовизуализации для конъюгатов с радиоактивной меткой и т.п.). Другие варианты применения данных конъюгатов с определяемой меткой включают, например, визуализацию клетки, ткани, органа или организма либо внутренней структуры животного (включая человека) путем введения эффективного количества меченой формы одного или более конъюгатов, соответствующих изобретению, и измерение определяемой радиации, связанной с клеткой, тканью, органом или организмом (или животным). Способы детекции различных типов меток и их применения в диагностической и терапевтической визуализации хорошо известны обычным специалистам и описаны в других местах в данном контексте.
В другом аспекте конъюгаты и композиции, соответствующие изобретению, могут быть использованы в способах модуляции концентрации или активности специфического рецептора для биоактивного компонента конъюгата на поверхности клетки, которая экспрессирует данный рецептор. Под термином модуляция активности данного рецептора понимают, что конъюгат при связывании с рецептором либо активирует, либо ингибирует физиологическую активность (например, внутриклеточный каскад переда
- 29 013535 чи сигнала), опосредуемый через данный рецептор. Не подразумевая ограничения каким-либо конкретным механистическим объяснением регуляторной активности конъюгатов, соответствующих данному изобретению, данные конъюгаты могут антагонистически действовать на физиологическую активность клеточного рецептора путем связывания с рецептором посредством биоактивного компонента конъюгата, блокируя тем самым связывание естественного агониста (например, неконъюгированного биоактивного компонента) и препятствуя активации естественным агонистом, не индуцируя при этом значительную активацию физиологической активности самого рецептора. Способы, соответствующие данному аспекту изобретения, могут содержать одну или более стадий, например контактирование клетки (которое может быть осуществлено ίη νίίΓο, ех νίνο или ίη νίνο) с одним или более конъюгатов, соответствующих изобретению, в условиях, при которых данный конъюгат (т.е. часть биоактивного компонента конъюгата) связывается с рецептором для биоактивного компонента на клеточной поверхности, но не активирует рецептор существенным образом. Данные способы будут эффективны в множестве диагностических и терапевтических приложений, как может легко представить себе обычный специалист в данной области.
Наборы
Изобретение представляет также наборы, содержащие конъюгаты и/или композиции, соответствующие изобретению. Данные наборы, как правило, содержат упаковку, такую как коробка, картонная упаковка, трубка ампулы или т.п., в которой близко друг к другу лежат один или более контейнеров, таких как флаконы, пробирки, ампулы, бутылочки, шприцы и т.п., где первый контейнер содержит один или более конъюгатов и/или композиций, соответствующих данному изобретению. Наборы, охватываемые данным аспектом настоящего изобретения, могут, кроме того, содержать один или более дополнительных компонентов (например, реагентов и соединений), необходимых для реализации одного или более конкретных применений конъюгатов и композиций, соответствующих данному изобретению, таких как один или более компонентов, используемых для диагностики, лечения или предупреждения конкретного заболевания или физического нарушения (например, одно или более дополнительных терапевтических соединений или композиций, один или более диагностических реагентов, один или более носителей или наполнителей и т. п.), один или более дополнительных конъюгатов или композиций, соответствующих изобретению, и т. п.
Обычному специалисту в соответствующих областях будет легко увидеть, что можно сделать другие приемлемые модификации и адаптации способов и применений, описанных в данном контексте, не выходя из объема изобретения или любого варианта его осуществления. Теперь, после детального описания данного изобретения то же самое будет яснее пониматься со ссылкой на последующие примеры, которые включены в данный материал только с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения изобретения.
Пример 1. Конъюгаты ПЭГ-интерферон-α.
Интерферон-α представляет собой коммерчески важный белок медицинского назначения с уровнем продажи на мировом рынке в 2001 г., превышающим 2 млрд. долларов США, в основном для лечения больных с инфекциями вируса гепатита С (НСУ). В Соединенных Штатах Америки от трех до четырех миллионов человек заражены хроническим гепатитом С, и каждый год происходит приблизительно 10000 смертей, связанных с НСУ (см. статью СЬапбег С. и соавт. (2002), НераФ^ду, 36:5135-5144). Пытаясь повысить эффективность ИФН-α, обе компании, которые в основном занимаются его разработкой и маркетингом (δοΙκπηβ-ΡΙοιίβΙι С.огр. и Р. ΗοΓίΊη;·ιηη-Ε;·ι Κοοίκ АС), разработали и освоили коммерческий выпуск конъюгатов ИФН-α с монометоксиполиэтиленгликолем или мПЭГ. В каждом из случаев мПЭГ связан с каждой молекулой интерферона-α только в одной точке присоединения. В каждом из случаев продукт содержит смесь позиционных изомеров с заметно пониженной рецептор-связывающей активностью по сравнению с немодифицированным интерфероном. В каждом случае повышенная биодоступность и продолжительность действия конъюгата ίη νίνο более чем компенсирует пониженную биоактивность ίη νίίΓο, которая является результатом конъюгирования с ПЭГ, как измеряют по улучшенной клинической эффективности одной инъекции конъюгата в неделю по сравнению с тремя инъекциями немодифицированного белка в неделю при лечении хронической инфекции НСУ (см. статью Магтз М.Р. и соавт. (2001), ^апсеί, 358:958-965).
В конъюгате ПЭГ-интерферон^^а, разработанном фирмой Р. НοΓΓтаηп-^а ^сРе, ΡΕΟΑδΥδ®, две цепи мПЭГ молекулярной массы 20 кДа связаны с одним лизиновым линкером (так называемый разветвленный ПЭГ), который присоединен в основном к Ьуз 31, Ьуз 121, Ьуз 131 или Ьуз 134 (см. работу ΒηίΙοη Р. и соавт., см. выше), все из которых находятся внутри или прилежат к рецептор-связывающему домену интерферон^^а (см. связывающий центр 1 на фиг. 1а и 8Еф ΙΌ N0:1).
В конъюгате ПЭГ-интерферон-α-2Ь, разработанном фирмой ЗсРегтд-Р^идР С-Огр., одна цепь мПЭГ молекулярной массы 12 кДа связана в основном с остатком гистидина в положении 34 (Н1з 34; см. работы \Ууке О.С. и соавт., см. выше; СРРей С.\У. и соавт., патент США № 6042822; \У;тд Υ.-8. и соавт., см. выше), который находится в области, важной для связывания с рецептором (см. фиг. 1Р). Другие центры присоединения ПЭГ в ПЭГ-υΝΤΚΟΝ продукте, производимом ЗсРегтд-Р^идР (Ьуз 121, Туг 129 и Ьуз
- 30 013535
131), также, как считают, находятся в или около связывающего центра 1 (см. фиг. 1Ь и 8Е0 ΙΌ Ν0:2).
В противоположность данным двум коммерческим продуктам, конъюгат, соответствующий данному изобретению, имеет одну цепь водорастворимого синтетического полимера, предпочтительно ПЭГ или мПЭГ, связанную с Ν-концевым остатком аминокислоты, который отдален от рецепторсвязывающих областей белка (см. пространственная связь между Сук-1 и связывающими центрами на фиг. 1е и 16), демонстрируя, что интерферон-α представляет собой ΚΝ цитокин. На фиг. 9 и 10 представлены хроматограммы, полученные катионообменным способом и способом эксклюзии размера (гель-фильтрации), соответственно, иллюстративного конъюгата ПЭГ-интерферона-α, соответствующего данному изобретению. Реакционная смесь содержит интерферон-а-2Ь, в котором на аминоконце присутствует дополнительный остаток метионина, предшествующий Сук-1, который является первым остатком естественной последовательности. Реакционный ПЭГ представляет собой ПЭГ-альдегид молекулярной массы 20 кДа, который присутствует в концентрации 0,2 мМ. Восстановитель представлен цианоборгидридом натрия в конечной концентрации 14 мМ. Протекание реакции периодически мониторируют эксклюзионной хроматографией по размеру во время инкубирования при 4°С. Хотя ИФН-α имеет достаточную растворимость, для того чтобы быть ПЭГилированным в описанных условиях, другие цитокины, например ИФН-β, менее растворимы и для того, чтобы быть ПЭГилированными, могут нуждаться в присутствии поверхностно-активного вещества, как описано для ИФН-α С.Л. СЛЬеП и соавт. (см. патент США № 5711944) и для интерферонов α и β К.В. Сгееп\уа16 и соавт. (см. патент США № 5738846).
Катионообменная колонка, используемая для фракционирования, показанного на фиг. 9, представляет собой ТоуоРеаг1 МЭ-С 8Р (1 х 6,8 см; ТокоН Вюкер, МоШдотегууШе, РА), обработанную линейным градиентом 0-0,4 М №1С’1 в 20 мМ буфера на основе ацетата натрия, рН 4,6, при скорости потока 0,5 мл/мин. Колонка для эксклюзии размера, используемая для получения данных, показанных на фиг. 10, представлена ЗИРЕКОЕХ® 200 (НК 10/30; АтегкНат Вюкшепсек, Р1кса1а^ау, ΝΙ), элюируемая со скоростью 0,5 мл/мин 20 мМ буфером на основе ацетата натрия, содержащим 150 мМ №С1, рН 4,6. Другие подходящие хроматографические среды для ионообмена и эксклюзии размера и условия фракционирования известны компетентным специалистам в данной области. Анализ аминоконцевых аминокислот с помощью автоматизированного разложения по Эдману очищенного моноПЭГ -ИФН-α-2Ь, соответствующего данному изобретению, демонстрирует, что >90% ПЭГ присоединяется к Ν-концевому остатку. Анализ проводят в С’оттоп\уеа1111 Вю1есйно1од1ек, Лс. (Кюйтопб, УА).
Пример 2. Конъюгаты ПЭГ-интерлейкин-2.
Интерлейкин-2 (ИЛ-2) представляет собой цитокин, который проявляет иммуномодулирующую активность в отношении некоторых форм рака, включая карциному почечных клеток и злокачественную меланому. Однако клиническая эффективность является низкой, приводя в результате к тому, что только небольшая часть больных дает частичный или полный ответы (см. статью Летге1с11 Э.М. и соавт. (2002), 1. IттиηоιНе^.. 25:185-187). ИЛ-2 имеет короткий полупериод существования в кровотоке, который подразумевает его низкую скорость индукции ремиссии у онкологических больных. Попытки сделать ИЛ-2 более эффективным путем случайного ПЭГилирования остатков лизина не были оптимальными (см. статью СНеп 8.А. и соавт. (2000), 1. РНагтасо1. Ехр. 8Нег., 293:248-259). Попытки селективно присоединить ПЭГ к ИЛ-2 к его центру гликозилирования (см. работу Сообкоп К.1. и соавт., см. выше) или к неосновному цистеину (Сук 125) или к мутеинам ИЛ-2, содержащим цистеин между остатками 1 и 20 (см. Ка1ге Ν. и соавт., патент США № 5206344), не приводят к получению клинически применимых продуктов.
На фиг. 4 представлено распределение остатков лизина относительно рецептор-связывающих областей ИЛ-2, показывающее, что многие из поверхностно-доступных остатков лизина находятся в областях, которые участвуют в связывании рецептора. Действительно, Ьук-35 и Ьук-43 идентифицируют, как это необходимо для взаимодействия с α-рецептором для ИЛ-2, предполагая механизм инактивации ИЛ-2 путем ПЭГилирования остатков лизина (см. и 8ЕО ΙΌ Ν0:6). На фиг. 4 показано также, что Ν-концевой участок ИЛ-2 отделен от рецептор-связывающих областей белка, демонстрируя, что ИЛ-2 имеет структуру К№' цитокина. Наше заключение о том, что ИЛ-2 представляет собой К№' цитокин, согласуется с данными, полученными Н. 8а1о и соавт. (см. (2000), Вюсонщд. СНет., 11:502-509), который использует ферментативное трансглутаминирование для спаривания одной или двух цепей мПЭГ молекулярной массы 10 кДа с одной или двумя из остатков глутамина (Р) в последовательности ЛОО^М, которую данные авторы интродуцировали в мутеин ИЛ-2 в качестве Ν-концевого удлинения. 8а1о и соавт. сообщают, что полученный ими конъюгат, который ПЭГилирован около аминоконца путем трансглутаминирования полученного ими мутеина, сохраняет больше биоактивности, чем конъюгат, полученный посредством случайного ПЭГилирования лизинов в мутеине ИЛ-2. В качестве обзора аналогичных подходов к ПЭГилированию других белков см. работу 8а1о Н. (2002), см. выше. Основываясь на пространственном отдалении аминоконца ИЛ-2 от рецептор-связывающих областей белка, как показано на фиг. 4, можно понять, что центр гликозилирования на остатке ТНг-3 (не показано) делает ИЛ-2 КС рецепторсвязывающим белком, как определено в данном контексте. Таким образом, ИЛ-2 представляет собой как ΚN цитокин, так и КС цитокин.
На фиг. 11 и 12 показаны хроматограммы, полученные катионообменным способом и способом
- 31 013535 эксклюзии размера (гель-фильтрации), соответственно, иллюстративного конъюгата ПЭГ-ИЛ-2, соответствующего данному изобретению, который ПЭГилирован посредством Ν-концевого селективного восстановительного алкилирования, как в примере 1. Условия, используемые для фракционирования, такие же, как описаны для фиг. 9 и 10, соответственно. На фиг. 13 показан электрофоретический анализ в полиакриламидном геле того же самого конъюгата в присутствии додецилсульфата натрия (ЗЭЗ-РЛСЕ) до и после его очистки с помощью ионообменной хроматографии, как показано на фиг. 11. Гель содержит градиент 4-12% общего акриламида в бис-трис-буфере (номер по каталогу # ΝΡ0335, ΙηνίΐΓο^η, СагкЬаб, СΑ). Образцы, каждый из которых содержит приблизительно 1-2 мкг белка, нагревают при 90°С в течение 10 мин перед проведением анализа. Гель проводят при постоянном напряжении 117-120 В в течение приблизительно 135 мин при охлаждении. Одну часть геля окрашивают красителем для белковых гелей 8урго® КиЬу (ΜοΚα.ι1;·ΐΓ РгоЬек, Еидеие, ΟΚ), а другую часть окрашивают на ПЭГ путем адаптации способов, предложенных СЕ. Οΐιίΐάδ (см. (1975), ΜχγοΟκιιι. I., 20:190-192) и Β. 81<οο§ (см. (1979), νοχ 8апд, 37:345-349). Анализ аминоконцевых аминокислот посредством автоматизированного разложения по Эдману очищенного моноПЭГ-ИЛ-2 в каждом из двух пиков, представленный на фиг. 11, демонстрирует, что > больше чем 90% ПЭГ присоединяется к Ν-концевому остатку. Анализ проводят с помощью Соттοη^еаίΐй ΒίοΙοοΗηοίο^δ, 1пс. (Κίο^οηά, νΑ).
Пример 3. Синтез и анализ ПЭГилированного по Ν-концу ЕСЕ и 1СЕ-1.
Эпидермальный фактор роста (ЕСЕ, 8ЕО ΙΌ ΝΟ:7) и инсулиноподобный фактор роста-1 (1СЕ-1, 8ЕО ΙΌ ΝΟ:9) выбирают для Ν-концевого ПЭГилирования на основании молекулярных моделей, представленных на фиг. 5 и 7, соответственно, которые показывают, что ЕСЕ и ЮЕ-1 являются Κ.Ν факторами роста. 3 мМ раствор ПЭГ-альдегида молекулярной массы 5 кДа получают растворением ПЭГ-пропиональдегида молекулярной массы 5 кДа (ΝΟΕ ^ΓροΓαΐίοη, Τοкуο) в 1 мМ НС1 в конечной концентрации 15 мг/мл. Боран-пиридин готовят разведением 35 микролитров (мкл) 8 М боран-пиридина (Α16γχ1ι) в 0,3 мл ацетонитрила с добавлением 0,15 мл воды, что дает конечную концентрацию 0,58 М. Готовят буфер, содержащий по 0,2 М каждого из фосфата натрия и ацетата натрия, рН 6,3 и фильтруют через стерильный фильтр с размером пор 0,1 мкм. Рекомбинантный человеческий ЕСЕ фирмы Ιηνίΐτο^η Согр. (СагкЬаб, СΑ) растворяют в воде в концентрации 1 мг/мл. К 0,6 мл данного раствора добавляют 70 мкл 3 мМ раствора ПЭГ-альдегида, 35 мкл фосфатно-ацетатного буфера и 30 мкл 0,58 М раствора боран-пиридина и помещают смесь в холодильник. Аликвоты анализируют эксклюзионной ВЭЖХ по размеру на колонке 8ирегбех 75 НК 10/30 в буфере на основе карбоната натрия, рН 10,1, содержащем 100 мМ Ν;·ιΟ1 через четыре дня инкубирования при 4-8°С и мониторируют элюат по поглощению при длине волны 280 нм и по коэффициенту преломления. После введения 0,65 мл реакционной смеси, которую инкубируют в течение 5 дней, собирают фракции из центра главного пика поглощения при длине волны 280 нм. рН данного объема снижают до приблизительно 5,5 добавлением уксусной кислоты. Повторный анализ данного объединенного продукта эксклюзионной ВЭЖХ по размеру показывает, что 100% белка находится в положении, соответствующем ПЭГ1-ЕСЕ (моно-ПЭГ-ЕСЕ), и что концентрация белка в данном объединенном продукте составляет приблизительно 0,32 мг/мл. Анализ с помощью 8^8-ΡЛСΕ подтверждает, что весь белок состоит из конъюгата моно-ПЭГ с ЕСЕ. Перед тестированием в биоанализе на основе клеток, как описано в примере 4, объединенный продукт стерилизуют фильтрованием через шприц-фильтр ΟοΓπίη§. Конъюгат ЕСЕ с ПЭГ молекулярной массы 10 кДа синтезируют, очищают и анализируют аналогичным способом за исключением того, что вместо ПЭГ-альдегида молекулярной массы 5 кДа используют ПЭГ-пропиональдегид молекулярной массы 10 кДа фирмы ΝΟΕ Οοριοηΐίοη. Конечная концентрация белка конъюгата ПЭГ молекулярной массы 10 кДа составляет приблизительно 0,36 мг/мл.
Образцы рекомбинантного человеческого инсулиноподобного фактора роста-1 (ЮЕ-1) фирмы ΙηνίίΓο^η Οοη3. спаривают с ПЭГ-альдегидом молекулярной массы 5 или 10 кДа способами, описанными для соответствующих конъюгатов ЕСЕ. Продукт спаривания ПЭГ-альдегида молекулярной массы 5 кДа с ЮЕ-1 и очистки конъюгата, как описано для ПЭГ-ЕСЕ, составляет приблизительно 99% чистого конъюгата моно-ПЭГ-ЮЕ-1, и конечная концентрация белка составляет приблизительно 0,20 мг/мл. Анализы 8^8-ΡЛСΕ подтверждают, что белок в основном является конъюгатом моно-РЕС. Электрофоретический анализ показывает также присутствие следов конъюгата ди-ПЭГ при высокой нагрузке на гель. Анализ с использованием эксклюзионной ВЭЖХ по размеру продукта спаривания ПЭГ-альдегида молекулярной массы 10 кДа с ЮЕ-1 показывает, что продукт состоит из 95% конъюгата моно-ПЭГ и примерно 5% конъюгата ди-ПЭГ и имеет концентрацию общего белка приблизительно 0,23 мг/мл.
Пример 4. Биоанализы ПЭГилированного по Ν-концу ЕСЕ и ЮЕ-1.
Оценку, снижает ли Ν-концевое ПЭГилирование ЕСЕ и ЮЕ-1 рецептор-связывающую способность соответствующих факторов роста, проводят путем анализов на клеточных культурах. Для анализов ПЭГ-ЕСЕ используют фибробласты 3Т3, как описано ранее для ЕСЕ (см. статью СгоисЬ Μ.Ε. и соавт. (2001), I. Се11. Βίοί., 152:263-273). Для анализов ПЭГ-ЮЕ-1 используют клетки яичников китайского хомячка (СНО), как описано ранее для ЮЕ-1 (см. статьи Αιηοιιι М. и соавт. (2001), I. Еп^сйшЕ, 171:153162; Μογπ5 ΑΈ. и соавт. (2000), Βίο^ΐιηοΐ. Ргод., 16:693-697). Объединенные продукты ПЭГ-ЕСЕ и ПЭГ-ЮЕ-1, полученные, как описано в примере 3, стерилизуют фильтрованием через шприц-фильтр
- 32 013535
Согшпд с размером пор 0,2 мкм, а затем тестируют в биоанализе на основе клеток. Серийные разведения простерилизованного фильтрацией ЕСЕ и конъюгатов моно-ПЭГ, синтезированных с ПЭГ молекулярной массы 5 и 10 кДа, добавляют к культурам клеток 3Т3 в среде, содержащей более низкий процент сыворотки, чем требуется для оптимального роста. Клетки культивируют в стандартных условиях (температура 37°С, 5% СО2/воздух) и подсчитывают с помощью счетчика СоиБег (модель Ζ1, М1ат1, ЕЬ) через определенные интервалы времени в течение недели. Относительно числа клеток, наблюдаемых в отсутствие добавленного фактора роста, числа клеток увеличиваются, по меньшей мере, на такой же процент при использовании конъюгатов моно-ПЭГ, соответствующих данному изобретению, как с немодифицированным ЕСЕ. Аналогично серийные разведения профильтрованных стерилизацией конъюгатов моноПЭГ 1СЕ-1 и немодифицированного 1СЕ-1 добавляют к культурам клеток СНО, в среде, содержащей более низкий процент сыворотки, чем требуется для оптимального роста, и клетки инкубируют и подсчитывают, как описано выше для тест-культур для ЕСЕ. Как отмечают для ЕСЕ и его Ν-концевых конъюгатов моно-ПЭГ, числа клеток, отмечаемые через несколько дней, увеличиваются, по меньшей мере, на такой же процент при использовании конъюгатов моно-ПЭГ 1СЕ-1, как с немодифицированным фактором роста. Таким образом, показано, что оба, ЕСЕ и 1СЕ-1, являются полностью функциональными после Ν-концевого ПЭГилирования, как ожидают для белков, у которых ПЭГ присоединен к Ν-концевому остатку, который находится в отдалении от рецептор-связывающих областей.
Пример 5. Представители и непредставители класса ΚΝ рецептор-связывающих белков.
На фиг. 2, 3 и 5-8 представляют поверхностные распределения остатков лизина рецепторсвязывающих белков интерферона-β, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (СМ-С8Е), эпидермального фактора роста (ЕСЕ), основного фактора роста фибробластов (БЕСЕ, который известен в области техники также как ЕСЕ-2), инсулиноподобного фактор роста-1 (1СЕ-1) и интерферона-γ (ИФН-γ) относительно их рецептор-связывающих областей, а также демонстрируют, какие из данных белков являются ΚΝ цитокинами и факторами роста. Кроме того, на фиг. 2 показано, что интерферон-β представляет собой КС цитокин.
На фиг. 2 показаны остатки лизина, распределенные по областям связывающего центра 1 и связывающего центра 2 интерферона-β, тогда как аминоконец полипептидной цепи отдален от рецепторсвязывающих областей белка, демонстрируя, что ИФН-β представляет собой ΚΝ цитокин (см. 8ЕО ΙΌ N0:3).
На фиг. 3 показаны остатки лизина, распределенные по областям связывающего центра 1, который связывает α-рецептор, и связывающего центра 2, который связывает β-рецептор СМ-С8Е, тогда как аминоконец полипептидной цепи отдален от рецептор-связывающих областей белка, демонстрируя, что СМ-С8Е представляет собой ΚΝ цитокин (см. 8Е0 ΙΌ N0:5).
На фиг. 5 показаны остатки лизина, распределенные вдоль полипептидных цепей эпидермального фактора роста (ЕСЕ), включая остатки лизина, которые находятся в или около рецептор-связывающих областей белка, тогда как аминоконец полипептидной цепи больше отдален от рецептор-связывающих областей белка (см. 8Е0 ΙΌ N0:7).
На фиг. 6 показано, что несколько остатков лизина основного фактора роста фибробластов (БЕСЕ) участвуют в связывании с рецепторами или с гепарином, оба из которых необходимы для сигнальной трансдукции посредством БЕСЕ (см. статью 8сй1е85шдег 1. и соавт., см. выше). Аминоконец БЕСЕ отдален от гепарин-связывающей области БЕСЕ и может быть достаточно отдален от рецептор-связывающих центров, чтобы сделать БЕСЕ ΚΝ фактором роста (см. 8Е0 ΙΌ N0:8).
На фиг. 7 показано, что несколько остатков лизина инсулиноподобного фактора роста-2 (1СЕ-2) находятся в или прилежат к рецептор-связывающим областям полипептида, тогда как аминоконец 1СЕ-1 отдален от рецептор-связывающих доменов, демонстрируя, что 1СЕ-1 представляет собой КN фактор роста (см. 8Е0 ΙΌ N0:9).
На фиг. 8 показано, что интерферон-γ (ИФН-γ) существует в виде гомодимера, в котором две полипептидные цепи имеют широкие взаимодействия. Некоторые остатки лизина каждого полипептида прилежат к остаткам аминокислот ИФН-γ, которые участвуют в связывании с рецепторами или находятся на димеризационной границе. Формат шариков и стержней остатка аминокислоты С1п-1 предназначен для того, чтобы отразить доказательство функциональной важности данного №концевого остатка. (Кристаллическая структура, на которой основывается данная фигура, включает дополнительный остаток метионин, помеченный Ме! 0, который отсутствует в природном белке) (см. 8Е0 ΙΌ N0:4). Поскольку №концевые остатки ИФН-γ отдалены от димеризационной границы, при №концевом ПЭГилировании можно избежать ингибирующих эффектов ПЭГилирования лизина на гомодимеризацию ИФН-γ. С другой стороны, взаимодействия димера с его рецепторами, вероятно, будут ингибироваться связыванием полимеров с аминоконцом, в особенности при присоединении длинных цепей полимера.
ИФН-γ, ИЛ-10 и фактор стволовых клеток представляют собой примеры цитокинов, которые действуют как гомодимеры (см. работы \Уа11ег М.К. и соавт., выше; 1о8ерЙ8оп К. и соавт. (2000), 1. Βίο1. СБет., 275:13552-13557; ТБ1е1 Ό.Ε и соавт., см. выше Мс№есе Ι.Κ. и соавт., выше). Димеризация рецепторсвязывающих белков представляет специальный материал для характеризации их моноПЭГилированных
- 33 013535 по Ν-концу конъюгатов, поскольку в препаратах конъюгатов с близкими или идентичными размерами и формой могут присутствовать различные возможные молекулярные структуры. Например, димер, который состоит из одного диПЭГилированного мономера и одного неПЭГилированного мономера (ПЭГ2белощ + белок!), было бы трудно или невозможно отличить от димера, который состоит из двух ПЭГилированных по Ν-концу мономеров (РЕС1- белощ)2 при использовании большинства основанных на размере анализов димерного конъюгата (например, эксклюзионная хроматография по размеру или определение коэффициента седиментации, светорассеяния или коэффициента диффузии), причем рецепторсвязывающая активность данных двух конъюгатов, каждый из которых содержит в среднем одну молекулу ПЭГ/мономер белка, могла бы сильно отличаться.
Для рецептор-связывающих белков с длинной цепью и β-складкой, которые формируют гомотримеры, например фактора некроза опухолей α (ΤΝΕ-α), число изомеров тримеров РЕ63-белок3 еще больше, чем для рецептор-связывающих белков, которые находятся в растворе в виде гомодимеров. Поскольку показано, что химическая модификация ΤΝΕ близко к аминоконцу инактивирует данный цитокин (см. статью υΐκιιιηί Т. и соавт. (1992), Мо1. 1ттипо1., 29:77-81), маловероятно, что ΤΝΕ-α может не сохранять существенную активность при ПЭГилировании реагентами и в условиях, которые селективны для Ν-концевого остатка. Тем не менее, антагонист ΤΝΕ-α, такой как Аро2Ь/ТВА1Ь (см. статью Нуιηο\νι.ιΙζ 8.6. и соавт. (2000), Вюсйетййу, 39:633-640) пригоден для ПЭГилирования с использованием данного изобретения.
Для характеризации конъюгатов цитокинов, которые действуют как олигомеры, необходима комбинация аналитических способов. Анализ аминоконцевой последовательности может определить присутствие мономеров со свободными Ν-концевыми α-аминогруппами, и электрофоретический анализ диссоциированных мономеров (например 8Ό8-ΡΑΟΕ или капиллярный электрофорез) может показать присутствие неПЭГилированных и множественно ПЭГилированных мономеров рецептор-связывающих белков. Без такого доказательства синтез моноПЭГилированных конъюгатов данных гомодимер- и гомотример-формирующих белков не может быть однозначно продемонстрирован.
Данные примеры, в особенности графически проиллюстрированные фиг. 1-8, представляют легко визуализируемую основу для понимания потенциальной роли стерического препятствия взаимодействиям белок-рецептор посредством ПЭГилирования рецептор-связывающих белков в или около рецепторсвязывающих доменов данных биоактивных компонентов. Большой объем, который занимают широко распространяющиеся и гибкие цепи ПЭГ (см. фиг. 1б), также стерически препятствовал бы связыванию мономеров ряда рецептор-связывающих белков в функциональные гомодимеры или гомотримеры, если бы ПЭГ был связан с областями, которые, как сообщают, необходимы для взаимодействий между мономерами. Таким образом, направленность ПЭГилирования на центры, которые отдалены от рецепторсвязывающих областей рецептор-связывающих белков, уменьшает вероятность того, что ПЭГилирование будет нарушать межмолекулярные взаимодействия, которые требуются для осуществления их функции. Действуя согласно способу, соответствующему данному изобретению, можно реализовать больше преимуществ, которые ожидаются от ПЭГилирования рецептор-связывающих белков. Полученные в результате конъюгаты сочетают ожидаемые преимущества улучшенной растворимости, повышенной биодоступности, большей стабильности и пониженной иммуногенности с неожиданно высоким уровнем сохранения биоактивности.
Данное изобретение описано со ссылкой на некоторые варианты осуществления и ряд их примеров. Способы, соответствующие данному изобретению, аналогичным образом применимы для ряда рецепторсвязывающих пептидов и белков, отличных от цитокинов, хемокинов, факторов роста и полипептидных гормонов или их антагонистов и других реагентов для конъюгирования. Вследствие этого объем данного изобретения не ограничен описанными вариантами осуществления, но ограничен только объемом формулы изобретения. Специалисты средней квалификации в данной области могут легко принять во внимание, что возможна практическая реализация других вариантов осуществления без выхода из объема данного изобретения. Все такие варианты рассматривают как часть данного изобретения.
Все публикации, патенты и патентные заявки, упоминаемые в данном описании, указывают на уровень компетентности специалистов в области, к которой относится данное изобретение, и в данном контексте включены в виде ссылки в той же степени, как если бы для каждой отдельной публикации, патента или патентной заявки было специально и отдельно указано, что она включена в виде ссылки.
- 34 013535
Перечень последовательностей <110> Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк.
3475-5 Эдисон Вэй
Менлоу-Парк, Калифорния 94025
США <120> Полимерный конъюгат, содержащий цитокин, хемокин, фактор роста, пслипептидный гормон или их антагонист с сохраненной рецептор-связывающей активностью (варианты), способ его получения (варианты), фармацевтическая композиция (варианты) и набор (варианты) и способ предупреждения, диагностики или лечения физического нарушения с его использованием (варианты) <130> 2057.006РС02/0Α6/ΒГО <140> (Следует установить) <141> 2003-12-23 <150> ИЗ 60/479,914 <151> 2003-06-20 <150> из 60/436,020 <151> 2002-12-26 <160> 9 <170> ВаэбЗЕО для версии νϊίηάοΜΞ 4.0 <210> 1 <211> 165 <212> ПРТ <213> Ното зарцепз <400> 1
Суз Азр Ьеи Рго <31п ТЬг Н1з 8ег Ьеи 61у Зег Агд Агд ТЬг Ьеи МеЪ
1 5 10 15
Ьеи Ьеи А1а 61п Меб Агд Ьуз 11е 8ег Ьеи РЬе Зег Суз Ьеи Ьуз Азр
20 25 30
Агд Н1з Азр РЬе С1у РЬе Рго С1п С1и С1и РЬе С1у Азп С1п РЬе С1п
35 40 45
Ьуз А1а б1и ТЬг 11е Рго Уа1 Ьеи ΗΪ3 С1и Меб 11е С1п С1п 11е РЬе
50 55 60
Азп Ьеи РЬе Зег ТЬг Ьуз Аер Зег Зег А1а А1а Тгр Азр СЬи ТЬг Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Азр Ьуз РЬе Туг ТЫ 61и Ьеи Туг С1п С1п Ьеи Азп Азр Ьеи С1и
85 90 95
А1а Суз Уа1 11е 51п С1у Уа1 С1у Уа1 ТЬг С1и ТЬг Рго Ьеи Меб Ьуз
100 105 110
С1и Азр Зег 11е Ьеи А1а Уа1 Агд Ьуз Туг РЬе С1п Агд 11е ТЬг Ьеи
115 120 125
Туг Ьеи Ьуз С1и Ьуз Ьуз Туг Зег Рго Суз А1а Тгр (31и Уа1 Уа1 Агд
130 135 140
А1а 61и Не Меб Агд Зег РЬе Зег Ьеи Зег ТЫ Азп Ьеи С1п С1и 8ег
145 150 155 160
Ьеи Агд Зег Ьуз С1и
165
<210> 2 <211> 165 <212> ПРТ <213> Ното зар!епз
- 35 013535 <400> 2
Суз Азр Ьеи Рго 61п ТЬг ΗΪ8 Зег Ьеи 61у Зег Агд Агд ТЬг Ьеи МеЬ
1 5 10 15
Ьеи Ьеи А1а 61п Мер Агд Агд Не Зег Ьеи РЬе Зег Суз Ьеи Ьуз Азр
20 25 30
Агд ΗίΒ Азр РЬе 61у РЬе Рго С1п С1и 61и РЬе 61у Азп 61п РЬе 61п
35 40 45
Ьуз А1а 61и ТЬг 11е Рго Уа1 Ьеи Н13 61и МеЬ Не С1п 61п Не РЬе
50 55 60
Азп Ьеи РЬе Зег ТЬг Ьуз Азр Зег Зег А1а А1а Тгр АЗр С1и ТЬг Ьеи
65 70 75 80
Ьеи Азр Ьуз РЬе Туг ТЫ 61и Ьеи Туг 61п 61п Ьеи Азп Азр Ьеи С1и
85 90 95
А1а Суз Уа1 11е 61п 61у Уа1 61у Уа1 ТЬг 61и ТЬг РГО Ьеи МеЪ Ьуз
100 105 110
61и Азр Зег 11е Ьеи А1а Уа1 Агд Ьуз Туг РЬе 61п Агд 11е ТЬг Ьеи
115 120 125
Туг Ьеи Ъуз 61и Ьуз Ьуз Туг Зег Рго Суз А1а Тгр С1и Уа1 Уа1 Агд
130 135 140
А1а 61и Не МеЬ Агд Зег РЬе Зег Ьеи Зег ТЬг Азп Ьеи С1п 61и Зег
145 150 155 160
Ьеи Агд Зег Ьуз 61и
165 <210> 3 <211 > 166 <212> ПРТ <213> Ното зархепз <400> 3
МеЬ Зег Туг Азп Ьеи Ьеи С1у РЬе Ьеи (31п Агд Зег Зег Азп РЬе 61п
1 5 10 15
Суз С1п Ьуз Ьеи Ьеи Тгр 61п Ьеи Азп 61у Агд Ьеи 61и Туг Суз Ьеи
20 25 30
Ьуз Азр Агд МеЪ Азп РЬе Азр 11е Рго 61и 61и 11е Ьуз С1п Ьеи 61п
35 40 45
61п РЬе 61п Ьуз С1и Азр А1а А1а Ьеи ТЬг Не Тух 61и МеЪ Ьеи 61п
50 55 60
Азп Не РЬе А1а Не РЬе Агд <31п Азр Зег Зег Зег ТЬг 61у Тгр Азп
65 70 75 80
С1и ТЬг Не Уа1 61и Азп Ьеи Ьеи А1а Азп Уа1 Туг Н1з 61п Не Азп
85 90 95
Н1з Ьеи Ьуз ТЬг Уа1 Ьеи 61и 61и Ьуз Ьеи С1и Ьуз 61и Азр РЬе ТЬг
100 105 110
Агд 61у Ьуз Ьеи МеЬ Зег Зег Ьеи Н13 Ьеи Ьуз Агд Туг Туг 61у Агд
115 120 125
Не Ьеи Н1з Туг Ьеи Ьуз А1а Ьуз 61и Туг Зег Ηί3 Суз А1а Тгр ТЫ
130 135 140
Не Уа1 Агд Уа1 61и Не Ьеи Агд Азп РЬе Туг РЬе Не Азп Агд Ьеи
145 150 155 160
ТЬг 61у Туг Ьеи Агд Азп
165
<210> 4 <211> 143 <212> ПРТ <213> Ното зарьепз <400> 4
С1п Азр Рго Туг Уа1 Ьуз 61и А1а 61и Азп Ьеи Ьуз Ьуз Туг РЬе Азп
5 10 15
- 36 013535
А1а С1у Нгз Зег Азр ’7а1 А1а Азр Азп 25 61 у ТЬг Ьеи РЬе Ьеи 30 61у 11е
20
Ьеи Ьуз Азп Тгр Ьуз 61и 61и Зег Азр Агд Ьуз 11е МеЬ 61п Зег 61п
35 40 45
Не Уа1 Зег РЬе Туг РЬе Ьуз Ьеи РЬе Ьуз Азп РЬе Ьуз Азр Азр С1п
50 55 60
Зег не Е1п Ьуз Зег Уа1 61и ТЬг Не Ьуз 61и Азр Ме£ Азп Уа1 Ьуз
65 70 75 ао
РЬе РЬе Азп Зег Азп Ьуз Ьуз Ьуз Агд Азр Азр РЬе 61и Ьуз Ьеи ТЬг
85 90 95
Азп Туг Зег Уа1 ТЬг Азр Ьеи Азп Уа1 61п Агд Ьуз А1а Не Нгз 61и
100 105 110
Ьеи 11е 61п 7а1 МеЪ А1а 61и Ьеи Зег Рго А1а А1а Ьуз ТЬг 61у Ьуз
115 120 125
Агд Ьуз Агд Зег С1п МеС Ьеи РЬе Агд 61у Агд Агд А1а Зег 61п
130 135 140 <210> 5 <211> 127 <212> ПРТ <213> Ното зар!епз <400> 5
А1а 1 Рго А1а Агд Зег 5 Рго Зег Рго Зег ТЬг 10 61п Рго Тгр 61и Нйз 15 Уа1
Азп А1а Не С1п 61и А1а Агд Агд Ьеи Ьеи Азп Ьеи Зег Агд Азр ТЬг
20 25 30
А1а А1а 61и МеЬ Азп 61и ТЬг Уа1 61и Уа1 Не Зег С1и МеЬ РЬе Азр
35 40 45
Ьеи С1п 61и Рго ТЬг Суз Ьеи 61п ТЬг Агд Ьеи 61и Ьеи Туг Ьуз 61п
50 55 60
61у Ьеи Агд 61у Зег Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Ьуз С1у Рго Ьеи ТЬг МеЬ МеЬ
65 70 75 80
А1а Зег Н1з Туг Ьуз 61п Н1з Суз Рго Рго ТЬг Рго 61и ТЬг Зег Суз
85 90 95
А1а ТЬг 61п Не Не ТЬг РЬе 61и Зег РЬе Ьуз 31и Азп Ьеи Ьуз Азр
100 105 110
РЬе Ьеи Ьеи Уа1 Не Рго РЬе Азр Суз Тгр 61и Рго Уа1 61п 61и
115 120 125 <210> 6 .
<211> 133 <212> ПРТ <213> Ното заргепз <400 6
А1а 1 Рго ТЬг Зег Зег 5 Зег ТЬг Ьуз Ьуз ТЬг 61п 10 Ьеи 61п Ьеи С1и 15 ΗίΞ
Ьеи Ьеи Ьеи Азр Ьеи 61п Мер 11е Ьеи Азп 61у Не Азп Азп Туг Ьуз
20 25 30
Азп Рго Ьуз Ьеи ТЬг Агд МеЬ Ьеи ТЬг РЬе Ьув РЬе Туг МеЬ Рго Ьуз
35 40 45
Ьуз А1а ТЬг 61и Ьеи Ьуз Н13 Ьеи 61п Суз Ьеи 61и 61и 61и Ьеи Ьуз
50 55 60
Рго Ьеи 61и 61и Уа1 Ьеи Азп Ьеи А1а 61п Зег Ьуз Азп РЬе ΗΪ3 Ьеи
65 70 75 80
Агд Рго Агд Азр Ьеи Не Зег Азп Не Азп Уа1 Не Уа1 Ьеи 61и Ьеи
85 90 95
Ьуз 61у Зег 61и ТЬг ТЬг РЬе МеЬ Суз 61и Туг А1а Азр 61и ТЬг А1а
100 105 но
ТЬг Не Уа1 61и РЬе Ьеи Азп Агд Тгр Не ТЬг РЬе Суз 61п Зег 11е
115 120 125
- 37 013535
Не 8ег ТЬг Ьеи ТЬг
130 ^210> 7 <211> 53 <212> ПРТ <213> Ното зархепз <400> 7
Азп Зег Азр Зег б1и Суз Рго Ьеи Зег ΗΪ3 Азр 61у Туг Суз Ьеи ΗΪ5
1 5 10 15
Азр 61 у Уа1 Суз Мер Туг Не 61и А1а Ьеи Азр Ьуз Туг А1а Суз Азп
20 25 30
Суз Уа1 Уа1 С1у Туг Не 61у 61и Агд Суз 61П Туг Агд Азр Ьеи Ьуз
35 40 45
Тгр Тгр 6111 Ьеи Агд
<210> 8 <211> 146 <212> ПРТ
<213> Ногао зархепз
<400> 8
Рго А1а Ьеи Рго 61и Азр 61у 61у Зег 61 у А1а РЬе Рго Рго С1у Н1з
1 5 10 15
РЬе Ьуз Азр Рго ьуз Агд Ьеи Туг Суз Ьуз АЗП С1У 61у РЬе РЬе Ьеи
20 25 30
Агд 11е Н1з Рго Азр С1у Агд Уа1 Азр 61у Уа1 Агд С1и Ьуз Зег Азр
35 40 45
Рго Н1з Не Ьуз Ьеи 61п Ьеи С1п А1а С1и 61и Агд <31У Уа1 Уа1 Зег
50 55 60
Не Ьуз 61у Уа1 Суз А1а Азп Агд Туг Ьеи А1а МеЬ Ьуз 61и Азр 61у
65 70 75 80
Агд Ьеи Ьеи А1а Зег Ьуз Суз Уа1 ТЬг Азр 61и Суз РЬе РЬе РЬе 61и
85 90 95
Агд Ьеи 61и Зег Азп Азп Туг Азп ТЬг Туг Агд Зег Агд Ьуз Туг ТЬг
100 105 НО
Зег Тир Туг Уа1 А1а Ьеи Ьуз Агд ТЬг 61у 61п Туг Ьуз Ьеи 61у Зег
115 120 125
Ьуз ТЬг 61у Рго 61у 61п Ьуз А1а Не Ьеи РЬе Ьеи Рго Мер Зег А1а
130 135 140
Ьуз Зег
145 <210> 9 <211> 70 <212> ПРТ <213> Ното зарпепз
<400> 9
С1у Рго 61и ТЬг Ьеи Суз 61у А1а 61и Ьеи 17а 1 Азр А1а Ьеи 61п РЬе
1 5 10 15
νβΐ Суз 61у Азр Агд 61у РЬе Туг РЬе Азп Ьуз РГО ТЬг 61у Туг 61у
20 25 30
Зег Зег Зег Агд Агд А1а Рго 51п ТЬг 61у 11е Уа1 Азр 61и Суз Суз
35 40 45
РЬе Агд Зег Суз Азр Ьеи Агд Агд Ьеи 61и МеЬ Туг Суз А1а Рго Ьеи
55 60
Ьуз Ргс А1а Ьуз Зег А1а
70

Claims (68)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения конъюгата одного или более синтетических водорастворимых полимеров с цитокином, хемокином, фактором роста или полипептидным гормоном либо их мутеиновым полипептидным антагонистом, в котором осуществляют выбор цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их мутеинового полипептидного антагониста, который сохраняет большую ΐπ ν 11го рецептор-связывающую активность указанного цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их мутеинового полипептидного антагониста в сравнении с случайным спариванием указанных полимеров, основанный на удаленности аминоконцевой аминокислоты от одного или более рецептор-связывающих доменов указанного цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их мутеинового полипептидного антагониста, и проводят спаривание указанного одного или более полимеров селективно с указанной аминоконцевой аминокислотой, в котором указанный цитокин не ограничивается наличием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (С-С8Е), и интерлей
    - 38 013535 кина-1 (ИЛ-1), и интерлейкина-8 (ИЛ-8), и консенсусного интерферона.
  2. 2. Способ по п.1, в котором указанный один или более полимер выбран(ы) из группы, состоящей из одного или более полиалкиленгликолей, одного или более полиалкиленоксидов, одного или более поливиниловых спиртов, одного или более поликарбоксилатов, одного или более поливинилпирролидонов, одного или более полиоксиэтиленоксиметиленов, одной или более полиаминокислот, одного или более полиакрилоилморфолинов, одного или более сополимеров одного или более амидов и одного или более алкиленоксидов, одного или более декстранов и одной или более гиалуроновых кислот.
  3. 3. Способ по п.1, в котором указанные цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист имеют структуру четырехспирального пучка.
  4. 4. Способ по п.3, в котором указанные цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист выбраны из группы, состоящей из макрофагального колониестимулирующего фактора (М-СБР), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ОМ-СБР), фактора ингибирования лейкоза (ЫР), тромбопоэтина (Тро), эритропоэтина (Еро), фактора стволовых клеток (БСР), лиганда Р113, онкостатина М (ОБМ), интерлейкина-2 (ИЛ-2), ИЛ-3, ИЛ4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12 (субъединица р35), ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17, интерферона-α (ИФН-α), интерферона-β (ИФН-β), пролактина и гормона роста и их мутеинов, мутеиновых полипептидных антагонистов, вариантов, полипептидных аналогов и производных.
  5. 5. Способ по п.1, в котором указанные цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист имеют структуру β-складки или β-ствола.
  6. 6. Способ по п.5, в котором указанные цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист выбраны из группы, состоящей из фактора некроза опухоли α (ΤΝΕ-α), ИЛ-12 (субъединица р40), ИЛ-16, эпидермального фактора роста (ЕОР), основного фактора роста фибробластов (ЬРОР), кислого РОР, РОР-4 и фактора роста кератиноцитов (КОР, РОР-7) и их мутеинов, мутеиновых полипептидных антагонистов, вариантов, полипептидных аналогов и производных.
  7. 7. Способ по п.1, в котором указанные цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист имеют смешанную α/β структуру.
  8. 8. Способ по п.7, в котором указанные цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист выбраны из группы, состоящей из нейтрофилактивирующего пептида-2 (ΝΑΓ-2), фактора 1α из клеток стромы (БИР-1а), белка-1 хемоаттрактанта моноцитов (МСР-1) МСР-2, МСР-3, эотаксина-1 эотаксина-2, эотаксина-3, КАЭТЕБ, фактора-1, ингибирующего миелоидные предшественники (МР1Р-1), нейротактина, фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (М1Р) и онкогена, связанного с ростом/активности, стимулирующей рост меланомы (ОКОα/МОБА), и их мутеинов, мутеиновых полипептидных антагонистов, вариантов, полипептидных аналогов и производных.
  9. 9. Способ по п.1, в котором указанные цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист выбраны из группы, состоящей из интерферона-α, интерферона-β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ΤΝΕ-α, 1ОР-1, ЕОР, ЬРОР, инсулина, мутеинового полипептидного антагониста ΤΝΕ-α, мутеинового полипептидного антагониста йОН и мутеинового полипептидного антагониста пролактина.
  10. 10. Способ по п.9, в котором указанный цитокин представляет собой ИЛ-2.
  11. 11. Способ по п.9, в котором указанный цитокин представляет собой интерферон-α.
  12. 12. Способ по п.9, в котором указанный цитокин представляет собой ΤΝΕ-α.
  13. 13. Способ по п.9, в котором указанный антагонист цитокина представляет собой мутеиновый полипептидный антагонист ΤΝΓ-α.
  14. 14. Способ по п.9, в котором указанный фактор роста представляет собой ЕОР.
  15. 15. Способ по п.9, в котором указанный фактор роста представляет собой 1ОР-1.
  16. 16. Способ по п.1, в котором указанный полимер ковалентно связан с α-аминогруппой указанной аминоконцевой аминокислоты.
  17. 17. Способ по п.16, в котором указанное ковалентное связывание указанного полимера с указанной α-аминогруппой ίκ νία осуществляют посредством вторичной аминной связи.
  18. 18. Способ по п.1, в котором указанный полимер связан с химически реакционной группой боковой цепи указанной аминоконцевой аминокислоты.
  19. 19. Способ по п.18, в котором указанная реакционная боковая цепь выбрана из группы, состоящей из гидроксильной группы, сульфгидрильной группы, гуанидиногруппы, имидазольной группы, аминогруппы, карбоксильной группы и альдегидной группы.
  20. 20. Способ по п.1, в котором указанный водорастворимый полимер представляет собой полиалкиленгликоль.
  21. 21. Способ по п.20, в котором указанный полиалкиленгликоль выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, монометоксиполиэтиленгликоля и моногидроксиполиэтиленгликоля.
  22. 22. Способ по п.21, в котором указанный полиалкиленгликоль представляет собой монометоксипо- 39 013535 лиэтиленгликоль.
  23. 23. Способ по п.21, в котором указанный полиалкиленгликоль представляет собой моногидроксиполиэтиленгликоль.
  24. 24. Способ по п.20, в котором указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от приблизительно 1 до приблизительно 100 кДа включительно.
  25. 25. Способ по п.24, в котором указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от приблизительно 1 до приблизительно 5 кДа включительно.
  26. 26. Способ по п.24, в котором указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от приблизительно 10 до приблизительно 20 кДа включительно.
  27. 27. Способ по п.24, в котором указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от приблизительно 18 до приблизительно 60 кДа включительно.
  28. 28. Способ по п.24, в котором указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу от приблизительно 12 до приблизительно 30 кДа включительно.
  29. 29. Способ по п.28, в котором указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 20 кДа.
  30. 30. Способ по п.24, в котором указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 30 кДа.
  31. 31. Способ по п.4, в котором указанный полипептидный гормон или его мутеиновый полипептидный антагонист выбраны из группы, состоящей из пролактина и аналогов пролактина, которые имитируют или проявляют антагонизм в отношении биологических эффектов пролактина, которые опосредуются пролактиновыми рецепторами.
  32. 32. Способ по п.4, в котором указанный полипептидный гормон или его мутеиновый полипептидный антагонист выбраны из группы, состоящей из гормона роста и аналогов гормона роста, которые имитируют или проявляют антагонизм в отношении биологических эффектов гормона роста, которые опосредуются рецепторами гормона роста.
  33. 33. Способ по п.4, в котором указанные цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист выбраны из группы, состоящей из негликозилированного эритропоэтина и аналогов эритропоэтина, которые имитируют или проявляют антагонизм в отношении биологических эффектов эритропоэтина, которые опосредуются рецепторами эритропоэтина.
  34. 34. Способ по п.1, в котором связывание указанного полимера с указанным цитокином, хемокином, фактором роста или полипептидным гормоном либо их мутеиновым полипептидным антагонистом по указанной аминоконцевой аминокислоте имитирует положительные эффекты гликозилирования или гипергликозилирования указанного цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их мутеинового полипептидного антагониста.
  35. 35. Способ по п.1, в котором ίη νίίΐΌ активность связывания рецептора с конъюгатом измеряют одним или более методами, выбранными из группы, включающей ультрацентрифугирование, анализы на основе клеток, анализы конкурентного связывания, анализы с использованием радиорецептора, поверхностный плазменный резонанс и динамическое светорассеяние.
  36. 36. Полимерный конъюгат, содержащий цитокин, хемокин, фактор роста, полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист с сохраненной рецептор-связывающей активностью, полученный способом синтеза конъюгата, при котором указанный конъюгат одного или более синтетических водорастворимых полимеров с цитокином, хемокином, фактором роста, полипептидным гормоном либо их мутеиновым полипептидным антагонистом, который сохраняет большую ίη νίίΐΌ рецепторсвязывающую активность указанного цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их мутеинового полипептидного антагониста в сравнении с случайным спариванием указанных полимеров, в котором осуществляют выбор цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона или мутеинового полипептидного антагониста, основанного на удаленности аминоконцевой аминокислоты от одного или более рецептор-связывающих доменов указанного цитокина, хемокина, фактора роста или полипептидного гормона либо их мутеинового полипептидного антагониста, и спаривание указанного одного или более полимеров селективно с указанной аминоконцевой аминокислотой, в котором указанный цитокин не ограничивается наличием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (6-С8Е), и интерлейкина-1 (ИЛ-1), и интерлейкина-8 (ИЛ-8), и консенсусного интерферона.
  37. 37. Фармацевтическая композиция, проявляющая активность цитокина, хемокина, фактора роста, полипептидного гормона либо их антагониста, которая содержит один или более конъюгатов по п.36 и один или более фармацевтически приемлемых наполнителей или носителей.
  38. 38. Полимерный конъюгат, содержащий цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист с сохраненной рецептор-связывающей активностью, в котором указанный цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист выбран на основании того, что является представителем группы рецептор-связывающих белков и полипептидов, основанных на удаленности аминоконцевой аминокислоты от одного или более рецептор-связывающих доменов, и в котором один или более водорастворимых полимеров селективно связан/связаны с указанной аминоконцевой аминокислотой, в котором указанный
    - 40 013535 цитокин не ограничивается наличием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (С-С8Е), и интерлейкина-1 (ИЛ-1), и интерлейкина-8 (ИЛ-8), и консенсусного интерферона.
  39. 39. Конъюгат по п.38, в котором указанный один или более полимеров выбран/выбраны из группы, состоящей из одного или более полиалкиленгликолей, одного или более полиалкиленоксидов, одного или более поливиниловых спиртов, одного или более поликарбоксилатов, одного или более поливинилпирролидонов, одного или более полиоксиэтилен-оксиметиленов, одной или более полиаминокислот, одного или более полиакрилоилморфолинов, одного или более сополимеров одного или более амидов и одного или более алкиленоксидов, одного или более декстранов и одной или более гиалуроновых кислот.
  40. 40. Конъюгат по п.38, в котором указанные цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист имеют структуру четырехспирального пучка.
  41. 41. Конъюгат по п.40, в котором указанные цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист выбраны из группы, состоящей из макрофагального колониестимулирующего фактора (М-С8Е), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (СМ-С8Е), фактора ингибирования лейкоза (Ь1Е), тромбопоэтина (Тро), эритропоэтина (Еро), фактора стволовых клеток (8СЕ), лиганда Е113, онкостатина М (О8М), интерлейкина-2 (ИЛ-2), ИЛ3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12 (субъединица р35), ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17, интерферона-α (ИФН-α), интерферона-β (ИФН-β), пролактина и гормона роста и их мутеинов, мутеиновых полипептидных антагонистов, вариантов, полипептидных аналогов и производных.
  42. 42. Конъюгат по п.38, в котором указанные цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист имеют структуру β-складки или β-ствола.
  43. 43. Конъюгат по п.42, в котором указанные цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист выбраны из группы, состоящей из фактора некроза опухоли α (ΤΝΓ-α), ИЛ-12 (субъединица р40), ИЛ-16, эпидермального фактора роста (ЕСЕ), основного фактора роста фибробластов (ЬЕСЕ), кислого ЕСЕ, ЕСЕ-4 и фактора роста кератиноцитов (КСЕ, ЕСЕ-7) и их мутеинов, мутеиновых полипептидных антагонистов, вариантов, полипептидных аналогов и производных.
  44. 44. Конъюгат по п.38, в котором указанные цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист имеют смешанную а/β структуру.
  45. 45. Конъюгат по п.44, в котором указанные цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист выбраны из группы, состоящей из нейтрофилактивирующего пептида-2 (ΝΑΓ-2), фактора 1α из клеток стромы (8ОЕ-1а), белка-1 хемоаттрактанта моноцитов (МСР-1), МСР-2, МСР-3, эотаксина-1, эотаксина-2, эотаксина-3, КΑNΤЕ8, фактора-1, ингибирующего миелоидные предшественники (МР1Е-1), нейротактина, фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (М1Е) и СКО/активности, стимулирующей рост меланомы (СКО-α/ΜС8Α), и их мутеиновых полипептидных антагонистов, вариантов, полипептидных аналогов и производных.
  46. 46. Конъюгат по п.38, в котором указанные цитокин, хемокин, фактор роста или полипептидный гормон либо их мутеиновый полипептидный антагонист выбраны из группы, состоящей из интерферонаα, интерферона-β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ΤΝΈ-α, 1СЕ-1, ЕСЕ, ЬЕСЕ, инсулина и пролактина и их мутеиновых полипептидных антагонистов.
  47. 47. Конъюгат по п.46, в котором указанный цитокин представляет собой ИЛ-2.
  48. 48. Конъюгат по п.46, в котором указанный цитокин представляет собой интерферон-α.
  49. 49. Конъюгат по п.46, в котором указанный цитокин представляет собой ΤΝΡ-α.
  50. 50. Конъюгат по п.46, в котором указанный антагонист цитокина представляет собой мутеиновый полипептидный антагонист ΤΝΡ-α.
  51. 51. Конъюгат по п.46, в котором указанный фактор роста представляет собой ЕСЕ.
  52. 52. Конъюгат по п.46, в котором указанный фактор роста представляет собой 1СЕ-1.
  53. 53. Конъюгат по п.38, в котором указанный полимер ковалентно связан с α-аминогруппой указанной аминоконцевой аминокислоты.
  54. 54. Конъюгат по п.53, в котором указанное ковалентное связывание указанного полимера с указанной α-аминогруппой осуществляют посредством вторичной аминной связи.
  55. 55. Конъюгат по п.38, в котором указанный полимер связан с химически реакционной группой боковой цепи указанной аминоконцевой аминокислоты.
  56. 56. Конъюгат по п.55, в котором указанная реакционная боковая цепь выбрана из группы, состоящей из гидроксильной группы, сульфгидрильной группы, гуанидиногруппы, имидазольной группы, аминогруппы, карбоксильной группы и альдегидной группы.
  57. 57. Конъюгат по п.38, в котором указанный водорастворимый полимер представляет собой полиалкиленгликоль.
  58. 58. Конъюгат по п.57, в котором указанный полиалкиленгликоль выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, монометоксиполиэтиленгликоля и моногидроксиполиэтиленгликоля.
  59. 59. Конъюгат по п.58, в котором указанный полиалкиленгликоль представляет собой монометоксиполиэтиленгликоль.
    - 41 013535
  60. 60. Конъюгат по п.58, в котором указанный полиалкиленгликоль представляет собой моногидроксиполиэтиленгликоль.
  61. 61. Конъюгат по п.57, в котором указанный полиалкиленгликоль приблизительно 1 до приблизительно 100 кДа включительно.
  62. 62. Конъюгат по п.61, в котором указанный полиалкиленгликоль приблизительно 1 до приблизительно 5 кДа включительно.
  63. 63. Конъюгат по п.61, в котором указанный полиалкиленгликоль приблизительно 10 до приблизительно 20 кДа включительно.
  64. 64. Конъюгат по п.61, в котором указанный полиалкиленгликоль приблизительно 18 до приблизительно 60 кДа включительно.
  65. 65. Конъюгат по п.61, в котором указанный полиалкиленгликоль приблизительно 12 до приблизительно 30 кДа включительно.
  66. 66. Конъюгат по п.65, в котором указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 20 кДа.
  67. 67. Конъюгат по п.61, в котором указанный полиалкиленгликоль имеет молекулярную массу приблизительно 30 кДа.
  68. 68. Конъюгат по п.40, в котором указанный полипептидный гормон или его мутеиновый полипептидный антагонист выбраны из группы, состоящей из пролактина и аналогов пролактина, которые имитируют или проявляют антагонизм в отношении биологических эффектов пролактина, которые опосре
EA200501051A 2002-12-26 2003-12-23 Полимерный конъюгат биоактивного компонента (варианты), способ его получения и использования, фармацевтические продукты на его основе EA013535B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43602002P 2002-12-26 2002-12-26
US47991403P 2003-06-20 2003-06-20
PCT/US2003/041162 WO2004060300A2 (en) 2002-12-26 2003-12-23 Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200501051A1 EA200501051A1 (ru) 2007-02-27
EA013535B1 true EA013535B1 (ru) 2010-06-30

Family

ID=32717815

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501051A EA013535B1 (ru) 2002-12-26 2003-12-23 Полимерный конъюгат биоактивного компонента (варианты), способ его получения и использования, фармацевтические продукты на его основе

Country Status (19)

Country Link
US (2) US20040136952A1 (ru)
EP (1) EP1628618A4 (ru)
JP (2) JP2006519170A (ru)
KR (1) KR101162908B1 (ru)
AU (1) AU2003303636B2 (ru)
BR (1) BR0317752A (ru)
CA (1) CA2511815A1 (ru)
CR (1) CR7895A (ru)
EA (1) EA013535B1 (ru)
EC (1) ECSP055931A (ru)
GE (1) GEP20084487B (ru)
IS (1) IS7931A (ru)
MX (1) MXPA05006945A (ru)
NO (1) NO20053555L (ru)
NZ (1) NZ541122A (ru)
PL (2) PL396711A1 (ru)
RS (1) RS20050501A (ru)
TW (1) TWI364295B (ru)
WO (1) WO2004060300A2 (ru)

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002026265A2 (en) 2000-09-29 2002-04-04 Schering Corporation Pegylated interleukin-10
US6977072B2 (en) 2000-10-27 2005-12-20 Irx Therapeutics, Inc. Vaccine immunotherapy for immune suppressed patients
US20070154399A1 (en) * 2000-10-27 2007-07-05 Hadden John W Immunotherapy for immune suppressed patients
US20070025958A1 (en) * 2000-10-27 2007-02-01 Hadden John W Vaccine immunotherapy
AU2003303635B2 (en) * 2002-12-26 2009-07-23 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
TWI364295B (en) * 2002-12-26 2012-05-21 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
NZ543934A (en) * 2003-05-12 2008-06-30 Affymax Inc Novel spacer moiety for poly (ethylene glycol)-modified peptide-based compounds
CA2525464A1 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Qun Yin Novel poly(ethylene glycol) modified compounds and uses thereof
KR101227666B1 (ko) * 2003-05-12 2013-01-31 아피맥스, 인크. 에리스로포이에틴 수용체에 결합하는 펩티드
RU2392314C2 (ru) * 2003-12-30 2010-06-20 Аугустинус БАДЕР Способ регенерации ткани
CA2560289A1 (en) * 2004-03-23 2005-10-13 Amgen Inc. Chemically modified protein compositions and methods
AU2005275108B2 (en) * 2004-07-16 2011-05-12 Nektar Therapeutics Conjugates of a GM-CSF moiety and a polymer
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
WO2006060148A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-08 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
EP1674113A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and poly(ethylene glycol)
WO2006074179A2 (en) * 2005-01-04 2006-07-13 University Of Rochester Blockade of elr+cxc chemokines as a treatment for inflammatory and autoimmune disease
WO2007009208A1 (en) * 2005-06-02 2007-01-25 Cangene Corporation Poly(ethylene glocol) modified human gm-csf with increased biological activity
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7550433B2 (en) 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
WO2007014167A2 (en) * 2005-07-22 2007-02-01 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions for and methods of treating epithelial diseases with growth factors
EP1968625A2 (en) * 2005-12-15 2008-09-17 Laboratoires Serono SA New chemokine antagonists
WO2012024613A1 (en) * 2010-08-19 2012-02-23 Wintrance Corporation Synergistic biomolecule-polymer conjugates
MX2009001691A (es) 2006-08-31 2009-02-25 Hoffmann La Roche Metodo para produccion del factor de crecimiento i tipo insulina.
CL2007002502A1 (es) * 2006-08-31 2008-05-30 Hoffmann La Roche Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer.
AU2007314501B2 (en) 2006-09-28 2013-05-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Use of pegylated IL-10 to treat cancer
US20100035814A1 (en) * 2006-11-09 2010-02-11 Novo Nordisk A/S N-Terminal Pegylated Prolactin Receptor Molecules
EP1935428A1 (en) * 2006-12-22 2008-06-25 Antisense Pharma GmbH Oligonucleotide-polymer conjugates
HUE027603T2 (en) * 2007-04-20 2016-10-28 Sigma-Tau Rare Disease Ltd Stable, recombinant adenosine deaminase
CA2707840A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
DK2234642T3 (en) 2007-11-28 2018-01-08 Irx Therapeutics Inc PROCEDURE FOR INCREASING AN IMMUNOLOGICAL EFFECT
WO2009121551A1 (en) * 2008-04-03 2009-10-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Pegylated insulin-like-growth-factor assay
CA2765670C (en) 2008-06-24 2018-05-15 Bioactive Surgical, Inc. Surgical sutures incorporated with stem cells or other bioactive materials
CA2653866A1 (en) * 2008-07-03 2010-01-03 Induce Biologics Inc. Use of immobilized antagonists for enhancing growth factor containing bioimplant effectiveness
JP5639585B2 (ja) * 2008-07-31 2014-12-10 ファーマエッセンティア コーポレイション ペプチド−ポリマー共役体
CN102176882A (zh) 2008-08-07 2011-09-07 生物活性外科公司 医疗器械和植入物的干细胞捕获和固定涂层
MX2011002055A (es) 2008-08-25 2011-03-30 Viromed Co Ltd Conjugados de biopolimeros que contienen un analogo de interleucina-11.
US8492503B2 (en) * 2008-09-11 2013-07-23 Nektar Therapeutics Polymeric alpha-hydroxy aldehyde and ketone reagents and conjugation method
EP2350118B1 (en) 2008-09-19 2016-03-30 Nektar Therapeutics Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof
US8518888B2 (en) * 2008-10-14 2013-08-27 Csl Limited Method of treatment of gastrointestinal-type cancer with antagonistic antibodies to IL-11R
RU2549702C2 (ru) 2008-12-17 2015-04-27 Мерк Шарп И Доум Корп., Получение и применение моно- и ди-пэг il-10
US8648046B2 (en) * 2009-02-26 2014-02-11 Oncolix, Inc. Compositions and methods for visualizing and eliminating cancer stem cells
KR101672401B1 (ko) * 2009-02-26 2016-11-16 온코릭스, 아이엔씨. 암 줄기 세포를 가시화하고 제거하기 위한 조성물 및 방법
JP5797190B2 (ja) 2009-05-15 2015-10-21 アイ アール エックス セーラピューティクス， インコーポレイテッド ワクチン免疫療法
JP2011026294A (ja) * 2009-06-26 2011-02-10 Canon Inc 化合物
US20110081398A1 (en) * 2009-10-01 2011-04-07 Tyco Healthcare Group Lp Multi-mechanism surgical compositions
US8968785B2 (en) * 2009-10-02 2015-03-03 Covidien Lp Surgical compositions
US20110081701A1 (en) * 2009-10-02 2011-04-07 Timothy Sargeant Surgical compositions
CN103097543A (zh) 2009-12-08 2013-05-08 伊尔克斯治疗有限公司 逆转朗格汉斯细胞免疫抑制的方法
SG186302A1 (en) * 2010-06-16 2013-02-28 Abbott Lab Comparison of protein samples
CA3144697A1 (en) * 2010-11-12 2012-05-18 Nektar Therapeutics Conjugates of an il-2 moiety and a polymer
KR101309566B1 (ko) 2010-12-10 2013-09-17 포항공과대학교 산학협력단 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법
WO2012128810A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Abbott Laboratories Methods and systems for the analysis of protein samples
WO2012140650A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Hepacore Ltd. Conjugates of carboxy polysaccharides with fibroblast growth factors and variants thereof
WO2013020079A2 (en) * 2011-08-04 2013-02-07 Nektar Therapeutics Conjugates of an il-11 moiety and a polymer
EP2846822A2 (en) * 2012-05-11 2015-03-18 Prorec Bio AB Method for diagnosis and treatment of prolactin associated disorders
CN106913865A (zh) 2013-04-18 2017-07-04 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白细胞介素‑10治疗疾病和病症的方法
JP2016526014A (ja) * 2013-04-24 2016-09-01 アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド インターロイキン−１０組成物及びその使用
EP3010527B1 (en) 2013-06-17 2018-08-08 Armo Biosciences, Inc. Method for assessing protein identity and stability
CN105658232A (zh) 2013-08-30 2016-06-08 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白细胞介素-10治疗疾病和病症的方法
RU2016122957A (ru) 2013-11-11 2017-12-19 Армо Байосайенсиз, Инк. Способы применения интерлейкина-10 для лечения заболеваний и расстройств
UY35874A (es) * 2013-12-12 2015-07-31 Novartis Ag Un proceso para la preparación de una composición de proteínas pegiladas
CU20140003A7 (es) * 2014-01-08 2015-08-27 Ct De Inmunología Molecular Biofarmacuba Conjugado que comprende eritropoyetina y una estructura polimérica ramificada
WO2015187295A2 (en) 2014-06-02 2015-12-10 Armo Biosciences, Inc. Methods of lowering serum cholesterol
EA029942B1 (ru) * 2014-06-16 2018-06-29 Общество С Ограниченной Ответственностью "Форт" (Ооо "Форт") Стабильная фармацевтическая композиция на основе конъюгатов биологически активных белков с полиэтиленгликолем, содержащих азогруппу
AU2015333827A1 (en) 2014-10-14 2017-04-20 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-15 compositions and uses thereof
KR20170084033A (ko) 2014-10-22 2017-07-19 아르모 바이오사이언시스 인코포레이티드 질환 및 장애를 치료하기 위해 인터루킨-10을 사용하는 방법
CA2964390A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Pharmaessentia Corporation Dosage regimen for pegylated interferon
WO2016126615A1 (en) 2015-02-03 2016-08-11 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
TWI849231B (zh) * 2015-03-03 2024-07-21 香港商南沙生物科技（香港）有限公司 聚乙二醇化介白素-11之組合物及方法
WO2016145388A1 (en) * 2015-03-11 2016-09-15 Nektar Therapeutics Conjugates of an il-7 moiety and an polymer
WO2016191587A1 (en) 2015-05-28 2016-12-01 Armo Biosciences, Inc. Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer
WO2017035232A1 (en) 2015-08-25 2017-03-02 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
US9758786B2 (en) 2016-02-09 2017-09-12 Autotelic, Llc Compositions and methods for treating pancreatic cancer
MX2019013621A (es) 2017-05-15 2020-01-13 Nektar Therapeutics Agonistas del receptor de interleuquina-15 de accion prolongada y composiciones y metodos inmunoterapeuticos relacionados.
EP3630162A1 (en) * 2017-05-24 2020-04-08 Novartis AG Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use
WO2019014267A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Synthorx, Inc. INCORPORATION OF NON-NATURAL NUCLEOTIDES AND ASSOCIATED METHODS
US11358994B2 (en) * 2017-07-27 2022-06-14 Saint Louis University Fatty acid modified human epidermal growth factor
AU2018309172B2 (en) 2017-08-03 2022-12-15 Synthorx, Inc. Cytokine conjugates for the treatment of autoimmune diseases
AU2018372167B2 (en) * 2017-11-21 2023-12-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Partial agonists of interleukin-2
AU2019271148B2 (en) 2018-05-14 2023-07-06 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
KR20210021468A (ko) 2018-05-14 2021-02-26 웨어울프 세라퓨틱스, 인크. 활성화가능한 사이토카인 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법
EP3923974A4 (en) 2019-02-06 2023-02-08 Synthorx, Inc. IL-2 CONJUGATES AND METHODS OF USE THEREOF
WO2020232305A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Werewolf Therapeutics, Inc. Separation moieties and methods and use thereof
WO2021097376A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable cytokine polypeptides and methods of use thereof

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4902502A (en) * 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5264209A (en) * 1990-02-13 1993-11-23 Kirin-Amgen, Inc. Modified HIL-6
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5506107A (en) * 1991-05-10 1996-04-09 Genentech, Inc. Selecting ligand agonists and antagonists
US5559213A (en) * 1991-03-25 1996-09-24 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5597899A (en) * 1993-03-29 1997-01-28 Hoffmann-La Roche Inc. Tumor necrosis factor muteins
WO1999045026A1 (en) * 1998-03-05 1999-09-10 Chiron Corporation Method for increasing the serum half-life of a biologically active molecule

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
JPS6023084B2 (ja) * 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US6610830B1 (en) * 1980-07-01 2003-08-26 Hoffman-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferons
IT1139487B (it) * 1980-09-25 1986-09-24 Genentech Inc Produzione microbica di interferone di fibroblasti umani
DE3380726D1 (en) * 1982-06-24 1989-11-23 Japan Chem Res Long-acting composition
US4462940A (en) * 1982-09-23 1984-07-31 Cetus Corporation Process for the recovery of human β-interferon-like polypeptides
US4462946A (en) * 1982-10-12 1984-07-31 Goldsworthy Engineering, Inc. Apparatus and method for producing reinforced plastic composite articles of non-uniform shape and non-uniform volume
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
WO1985003934A1 (en) * 1984-03-06 1985-09-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein and process for its preparation
US4732863A (en) * 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4816440A (en) * 1985-09-26 1989-03-28 Cetus Corporation Stable formulation of biologically active proteins for parenteral injection
US5037969A (en) * 1986-07-03 1991-08-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Glycosyl derivatives and use thereof
US4894330A (en) * 1986-12-23 1990-01-16 Cetus Corporation Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC
US5006333A (en) * 1987-08-03 1991-04-09 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
JPH01128871A (ja) * 1987-11-13 1989-05-22 Kanzaki Paper Mfg Co Ltd 感熱記録体用基材
US5004605A (en) * 1987-12-10 1991-04-02 Cetus Corporation Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5349052A (en) * 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US6132763A (en) * 1988-10-20 2000-10-17 Polymasc Pharmaceuticals Plc Liposomes
GB8824591D0 (en) * 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
US5091176A (en) * 1988-11-02 1992-02-25 W. R. Grace & Co.-Conn. Polymer-modified peptide drugs having enhanced biological and pharmacological activities
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5219564A (en) * 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
JP3051145B2 (ja) * 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5362852A (en) * 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
ZA933926B (en) * 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US5395619A (en) * 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US5605976A (en) * 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
EP0730470B1 (en) * 1993-11-10 2002-03-27 Enzon, Inc. Improved interferon polymer conjugates
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5449090A (en) * 1994-03-11 1995-09-12 Martin Yale Industries, Inc. Label dispenser
KR100203824B1 (ko) * 1994-03-31 1999-06-15 스티븐 엠. 오드리 거핵구 성장 및 분화를 자극하기 위한 조성물 및방법
DE69533987T2 (de) * 1994-05-20 2006-03-16 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc., Tosu Protein oder polypeptid, verfahren zur seiner herstellung und entsprechende zwischenprodukte
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US20030053982A1 (en) * 1994-09-26 2003-03-20 Kinstler Olaf B. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) * 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5770577A (en) * 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
EP1131131A1 (en) 1995-04-23 2001-09-12 Electromagnetic Bracing Systems, Inc. Transdermal active drug delivery system and method
US5756593A (en) * 1995-05-15 1998-05-26 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkyene oxide carboxylic acids
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5747639A (en) * 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
ATE341344T1 (de) * 1996-08-02 2006-10-15 Ortho Mcneil Pharm Inc Polypeptide mit einzelnem kovalent gebundenen n- terminalen wasserlöslichen polymer
JP3814903B2 (ja) * 1996-12-25 2006-08-30 株式会社日立製作所 映像・データ表示方法及び装置
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
CN1269805A (zh) * 1997-07-14 2000-10-11 博尔德生物技术公司 生长激素和相关蛋白的衍生物
US6017876A (en) * 1997-08-15 2000-01-25 Amgen Inc. Chemical modification of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) bioactivity
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
AU2855499A (en) * 1998-03-24 1999-10-18 Nof Corporation Oxirane derivatives and process for producing the same
EA003789B1 (ru) * 1998-04-28 2003-10-30 Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. КОНЪЮГАТЫ ПОЛИОЛ-β-ИНТЕРФЕРОН
ATE498409T1 (de) * 1998-08-06 2011-03-15 Mountain View Pharmaceuticals Peg-uricase konjugate und verwendung davon
DK1121156T3 (da) * 1998-10-16 2006-06-06 Biogen Idec Inc Polymerkonjugater af interferon-beta-1a samt deres anvendelse
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
JP4593048B2 (ja) * 1999-12-24 2010-12-08 協和発酵キリン株式会社 分岐型ポリアルキレングリコール類
WO2002026265A2 (en) * 2000-09-29 2002-04-04 Schering Corporation Pegylated interleukin-10
US6887462B2 (en) * 2001-04-09 2005-05-03 Chiron Corporation HSA-free formulations of interferon-beta
US6908963B2 (en) * 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
JP2005517648A (ja) 2001-12-07 2005-06-16 インターミューン インコーポレイテッド 肝炎ウイルス感染症を治療するための組成物および方法
EP1507755A4 (en) 2001-12-11 2006-05-17 Sun Bio Inc NOVEL MONOFUNCTIONAL POLYETHYLENE GLYCOL ALDEHYDES
EP3669887A1 (en) * 2002-01-18 2020-06-24 Biogen MA Inc. Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
MXPA05002620A (es) * 2002-09-09 2005-05-05 Nektar Therapeutics Al Corp Alcanales polimericos solubles en agua.
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
NZ540043A (en) * 2002-11-18 2007-11-30 Maxygen Inc Isolated or recombinant Interferon-alpha polypeptides and conjugates
JP4412461B2 (ja) * 2002-11-20 2010-02-10 日油株式会社 修飾された生体関連物質、その製造方法および中間体
US8003117B2 (en) * 2002-11-20 2011-08-23 Nof Corporation Polyalkylene glycol derivative and modified bio-related substance
PA8588901A1 (es) * 2002-11-20 2005-02-04 Pharmacia Corp Conjugados de hormona de crecimiento humana pegilados n-terminales y proceso para su preparacion
US20040142870A1 (en) * 2002-11-20 2004-07-22 Finn Rory F. N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof
US8828373B2 (en) * 2002-11-20 2014-09-09 Nof Corporation Polyalkylene glycol derivative and modified bio-related substance
AU2003303635B2 (en) * 2002-12-26 2009-07-23 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
TWI364295B (en) * 2002-12-26 2012-05-21 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
WO2007079404A2 (en) * 2005-12-30 2007-07-12 Pharmaessentia Corp. Drug-polymer conjugates

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4902502A (en) * 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5264209A (en) * 1990-02-13 1993-11-23 Kirin-Amgen, Inc. Modified HIL-6
US5559213A (en) * 1991-03-25 1996-09-24 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5506107A (en) * 1991-05-10 1996-04-09 Genentech, Inc. Selecting ligand agonists and antagonists
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5597899A (en) * 1993-03-29 1997-01-28 Hoffmann-La Roche Inc. Tumor necrosis factor muteins
WO1999045026A1 (en) * 1998-03-05 1999-09-10 Chiron Corporation Method for increasing the serum half-life of a biologically active molecule

Also Published As

Publication number Publication date
NO20053555D0 (no) 2005-07-20
CR7895A (es) 2007-03-21
US20040136952A1 (en) 2004-07-15
AU2003303636B2 (en) 2010-08-05
JP2011051991A (ja) 2011-03-17
NO20053555L (no) 2005-09-23
JP2006519170A (ja) 2006-08-24
TWI364295B (en) 2012-05-21
GEP20084487B (en) 2008-09-25
KR101162908B1 (ko) 2012-07-06
CA2511815A1 (en) 2004-07-22
TW200501979A (en) 2005-01-16
EP1628618A2 (en) 2006-03-01
AU2003303636A1 (en) 2004-07-29
ECSP055931A (es) 2006-11-24
MXPA05006945A (es) 2005-12-14
US20080058246A1 (en) 2008-03-06
PL396711A1 (pl) 2011-12-19
WO2004060300A3 (en) 2006-07-13
PL380269A1 (pl) 2007-01-08
WO2004060300A2 (en) 2004-07-22
EP1628618A4 (en) 2009-09-09
RS20050501A (en) 2007-08-03
KR20050089860A (ko) 2005-09-08
NZ541122A (en) 2008-09-26
BR0317752A (pt) 2005-11-22
EA200501051A1 (ru) 2007-02-27
IS7931A (is) 2005-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013535B1 (ru) Полимерный конъюгат биоактивного компонента (варианты), способ его получения и использования, фармацевтические продукты на его основе
EA008866B1 (ru) ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
JP3747070B2 (ja) 改良型インターフェロン−ポリマーコンジュゲート
CN1302209A (zh) 多元醇干扰素β偶联物
JP2001526238A (ja) 実質的に純粋なヒスチジン結合タンパク質−ポリマー結合体
EA019043B1 (ru) Новый конъюгат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (г-ксф) с полиэтиленгликолем
ZA200505393B (en) Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY KZ RU

NF4A Restoration of lapsed right to a eurasian patent

Designated state(s): BY KZ RU

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY KZ

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU