KR101309566B1 - 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법 - Google Patents

히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101309566B1
KR101309566B1 KR1020100126432A KR20100126432A KR101309566B1 KR 101309566 B1 KR101309566 B1 KR 101309566B1 KR 1020100126432 A KR1020100126432 A KR 1020100126432A KR 20100126432 A KR20100126432 A KR 20100126432A KR 101309566 B1 KR101309566 B1 KR 101309566B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hyaluronic acid
protein
aldehyde
protein conjugate
conjugate
Prior art date
Application number
KR1020100126432A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120089506A (ko
Inventor
양정아
한세광
박기태
김혜민
정현태
Original Assignee
포항공과대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 포항공과대학교 산학협력단 filed Critical 포항공과대학교 산학협력단
Priority to KR1020100126432A priority Critical patent/KR101309566B1/ko
Priority to JP2013543093A priority patent/JP5784142B2/ja
Priority to CA2821075A priority patent/CA2821075A1/en
Priority to EP11846761.2A priority patent/EP2650312A4/en
Priority to CN201180067381.XA priority patent/CN103492420B/zh
Priority to PCT/KR2011/009363 priority patent/WO2012077950A2/ko
Priority to US13/992,988 priority patent/US9221893B2/en
Publication of KR20120089506A publication Critical patent/KR20120089506A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101309566B1 publication Critical patent/KR101309566B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/217—IFN-gamma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate

Abstract

본 발명은 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체가 단백질의 N-말단과 결합되어 있는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 단백질 의약의 생접합율과 약효 지속성이 매우 우수하고, 히알루론산이 단백질의 N-말단과 특이적으로 결합되어 있어 단백질 의약의 활성이 뛰어나다. 또한, 히알루론산-알데하이드 유도체의 알데하이드 치환율을 조절함으로써 히알루론산의 간 표적 지향성을 자유롭게 조절할 수 있기 때문에 간 질환 치료용 의약뿐만 아니라, 간의 우회가 필요한 의약의 약효 지속성 확보를 위해서도 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 단백질의 약물 전달 시스템을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법{HYALURONIC ACID-PROTEIN CONJUGATE, AND PREPARATION METHOD THEREOF}
본 발명은 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
단백질 의약품의 장기 약효 지속 제형에 관한 연구는 최근까지 생체적합한 생분해성 고분자와의 컨쥬게이션 반응을 통한 제형 개발에 중점을 두고 진행되고 있다. 상기와 같은 단백질 의약품의 약효 지속 시간은 제형의 형태 및 컨쥬게이션 되는 유효 약효 성분에 따라 몇 주까지 연장되기도 한다. 상기와 같은 제형의 개발을 위해서는 제형의 약효 유지 및 약효 지속 시간의 증대와 더불어, 유효 약효 성분에 컨쥬게이션 되는 고분자의 생체적합성 유무에 관한 것도 고려해야 한다. 또한 고분자와의 컨쥬게이션에 의한 단백질 의약품의 활성도 감소의 문제가 고려되어야 한다.
이와 같은 제형 연구의 일예로, 최근에는 생체적합한 생분해성 폴리에틸렌 글리콜(poly ethylene glycol, PEG) 또는 히알루론산(hyaluronic acid, HA)과 유효 약효 성분을 컨쥬게이션하여 약물 전달 시스템에 응용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
하지만, 유효 약효 성분에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 컨쥬게이션하는 반응, 즉 소위 말하는 페길화(PEGylation) 반응에 사용되는 PEG는 FDA에서 공인한 대표적인 생체용 고분자 재료 중의 하나이지만, 약물전달체로 활용되는 PEG-Liposome 접합체를 반복 주사하게 되면 체내에서 투여된 약물의 소실이 빨리 일어나는 ‘accelerated blood clearance’ (ABC) 현상이 일어나는 것으로 보고된 바 있다. 실제로 간질환 치료용 단백질 의약품인 인터페론 알파의 경우 페길화된 상품이 주 1회 주사 제형으로 상품화 되어있지만, C형 감염 치료를 위한 페길화된 인터페론 약제의 경우 부작용이 심각하여 치료 도중 중단하는 환자가 많고 유전자형 1형의 경우 50% 정도의 항바이러스 효과 밖에 나타내지 않아 새로운 약물의 개발 필요하다. PEG를 이용한 약물전달체의 경우 특정 조직으로 전달특성이 존재하지 않고 단순히 체내 잔류 시간을 증가시켜주는 역할을 하기 때문에 특정 질환 치료를 위해 특정 조직으로 전달하기 위해서는 표적화 부위(targeting moiety)가 따로 필요하다.
한편, 히알루론산을 유효 약효 성분에 컨쥬게이션하게 되면 간 조직에 특이적으로 전달되는 장점이 있긴 하나, 이들 컨쥬게이트 반응의 생접합 효율이 낮아 이에 대한 한계점이 지적되어 왔다.
또한 PEG나 히알루론산과 같은 고분자와 단백질 의약품의 컨쥬게이트의 경우 고분자가 단백질의 아미노산 서열의 다양한 반응기와 비특이적으로 반응하여 단백질의 3차 구조를 깨뜨려 단백질 의약품의 생체 활성도를 낮추는 문제점이 지적되어 왔다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 극복하여, 단백질 의약품의 생체 활성도를 최대한으로 유지하면서 생접합 효율이 높고 다양한 수용성 유효 약효 성분에 적용 가능한 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 히알루론산-단백질 컨쥬게이트, 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체를 단백질의 N-말단과 반응시키는 것을 포함하는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체가 단백질의 N-말단과 결합되어 있는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 제공한다.
이하, 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법에 대해 보다 상세하게 설명한다.
히알루론산(Hyaluronic acid, HA)은 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid, GlcA) 및 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)기 β 1,3-글라이코시드 결합(β 1,3-glycosidic bond)에 의해 연결되어 있는 디시카라이드를 반복단위로 포함하는 고분자량의 선형 폴리사카라이드이다. 히알루론산의 디사카라이드 반복단위는 하기 화학식 1과 같다.
[화학식 1]
Figure 112013063063769-pat00023

삭제
본 발명에 있어서, 『히알루론산』은 상기 화학식 1의 디사카라이드를 반복단위로 포함하는 히알루론산뿐만 아니라, 화학식 1의 디사카라이드 골격으로부터 유도된 유도체를 반복단위로 포함하는 히알루론산의 유도체를 포함하는 것으로 해석된다. 히알루론산의 유도체는 상기 화학식 1의 디사카라이드 구조 중 카르복시기, 수산화기, 아세틸기, 또는 디사카라이드 반복 단위의 말단이 다른 치환기로 치환되어 있는 구조를 갖는 히알루론산을 의미한다. 예를 들어, 상기 치환기는 예를 들어, 수소, C1-6알킬기, C1-6알킬카르보닐기, 카르복시기, 수산화기 및 아세틸기로부터 선택되는 하나 이상의 치환기일 수 있다.
히알루론산의 염은 히알루론산 또는 히알루론산의 유도체의 염을 모두 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 알루미늄염 등이 예시된다.
본 발명은 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체를 단백질의 N-말단과 반응시키는 것을 포함하는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법을 제공한다.
히알루론산과 단백질과의 컨쥬게이션 방법으로 기존에는 히알루론산의 카르복실기와 단백질의 아민기를 결합시키는 방법을 사용하여 왔다. 그러나, 이러한 방법은 통상적으로 결합 형성을 위한 링커를 사용해야 했기 때문에 반응이 복잡하고, 반응의 효율, 즉, 생접합 효율이 떨어졌을 뿐만 아니라 단백질의 N-말단뿐만 아니라 단백질 아미노산 서열에 따라 다수 존재하는 라이신의 아민기와 비특이적으로 반응하는 등의 문제점이 있었다.
반면, 본 발명에서는 히알루론산의 카르복실기를 이용하는 대신 히알루론산-알데하이드 유도체를 이용함으로써, 히알루론산-단백질 컨쥬게이션의 생접합 효율 및 반응특이성을 현저하게 개선하였다.
본 발명에서 사용되는 『히알루론산-알데하이드 유도체』는 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산 또는 그의 염의 유도체를 모두 포함하는 것으로 해석된다.
한 구체예에서, 상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격에 하나 이상의 알데하이드기가 도입되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격에 알데하이드기를 포함하고 있기 때문에, 히알루론산의 디사카라이드 반복단위의 말단에 알데하이드기가 형성되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체를 사용하는 경우에 비해 알데하이드기의 치환율 조절이 자유롭다. 본 발명에 있어서, 알데하이드기의 치환율이라 함은 히알루론산 또는 그의 염의 특정 기능기가 알데하이드기로 대체되거나 수식되는 것을 의미한다. 알데하이드기로의 치환율은 전체 히알루론산 반복단위 중 알데하이드기로 치환된 반복단위의 비율로 정의되며, 정의상 0 초과 1이하의 수치, 또는 0% 초과 100% 이하의 수치, 또는 0몰% 초과 100몰% 이하의 수치로 표현될 수 있다. 알데하이드기의 치환율을 조절하면 히알루론산-알데하이드 유도체를 간으로 표적화할 것인지, 또는 간을 우회하도록 할 것인지를 제어할 수 있으므로 히알루론산과 컨쥬게이션되는 약물의 종류에 따라 간으로의 표적성을 조절할 수 있는 장점을 제공한다.
한 구체예에서, 상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격이 개환되어 있고 개환된 환의 말단에 하나 이상의 알데하이드기를 갖는 것일 수 있다. 예를 들어, 이러한 히알루론산-알데하이드 유도체는 하기 화학식 2의 반복단위를 하나 이상 포함하는 고분자를 포함한다.
[화학식 2]
Figure 112013063063769-pat00024
이러한 히알루론산-알데하이드 유도체를 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 당업자라면 공지의 방법을 사용하여 글루쿠론산을 개환시키고, 개환된 환의 말단에 하나 이상의 알데하이드기를 형성시킬 수 있을 것이다.
한 구체예에서, 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격이 개환되어 있고 개환된 환의 말단에 하나 이상의 알데하이드기를 갖는 상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염을 산화제와 반응시켜 얻을 수 있다. 하기 반응식 1은 상기 히알루론산-알데하이드 유도체의 형성 방법의 예를 모식화한 것이다.
[반응식 1]
Figure 112013063063769-pat00025
반응식 1과 같이, 히알루론산 또는 그의 염 중 일부 반복단위를 화학식 2의 구조로 유도할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 산화제는 글루쿠론산의 개환반응을 유도하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 이러한 산화제는 퍼리오데이트(periodate), 예컨대, 소듐 퍼리오데이트(sodium periodate), 포타슘 퍼리오데이트(potassium periodate) 등을 포함한다. 퍼리오데이트를 산화제로 이용할 경우, 히알루론산 또는 그의 염을 암 조건 하에서 퍼리오데이트와 2시간 반응시킴으로써 10%의 치환율을 갖는 히알루론산 유도체를 얻을 수 있으며 반응시간을 24시간까지 늘려 50%의 치환율을 갖는 히알루론산 유도체를 얻을 수 있다. 산화제와의 반응시간을 조절함에 따라 히알루론산의 알데하이드 치환율을 조절하는 것이 가능하며, 이는 당업자가 히알루론산과 컨쥬게이션시키고자 하는 단백질 의약의 종류에 따라 적절히 선택하여 조절할 수 있을 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격에 존재하는 카르복실 위치에 알데하이드기가 도입되어 있는 것일 수 있다. 히알루론산의 카르복실 위치에 알데하이드기를 도입하는 방법은 당업자에 의해 다양하게 선택될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 이러한 히알루론산-알데하이드 유도체는 하기 화학식 3의 반복단위를 하나 이상 포함하는 고분자를 포함한다.
[화학식 3]
Figure 112013063063769-pat00026
이러한 히알루론산-알데하이드 유도체를 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 당업자라면 공지의 방법을 사용하여 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격에 존재하는 카르복실 위치에 알데하이드기를 도입시킬 수 있을 것이다.
한 구체예에서, 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격에 존재하는 카르복실 위치에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그 유도체의 카르복실 그룹을 다이아민 또는 다이하이드라자이드 그룹을 가진 분자와 반응시킨 뒤, 그 유도체를 다이 알데하이드 그룹을 가진 분자와 반응시켜 얻을 수 있다. 하기 반응식 2는 상기 히알루론산-알데하이드 유도체의 형성 방법의 예를 모식화한 것이다.
[반응식 2]
Figure 112013063063769-pat00027

반응식 2와 같이 히알루론산 또는 그 염 일부 반복 단위의 카르복실기를 하이드라자이드 그룹 또는 아민 그룹을 말단에 가진 분자와 반응시켜 하이드라자이드 또는 아민 그룹을 가진 히알루론산 유도체를 합성한 후, 이를 양쪽 말단에 알데하이드기를 가진 물질과 반응시켜 알데하이드가 도입된 히알루론산 유도체를 합성할 수 있다. 양쪽 말단에 하이드라자이드 또는 아민 그룹을 가진 분자에는 양쪽 말단에 하이드라자이드 또는 아민그룹을 가진 분자로 그 한정이 없으며, 아디프산 다이하이드라자이드(Adipic acid dihydrazide, ADH), 헥산다이하이드라자이드(hexanedihydrazide), 헵탄다이하이드라자이드(heptanedihydrazide), 옥탄다이하이드라자이드(octanedihydrazide), 노난-1,9-다이아민(nonane-1,9-diamine), 옥탄-1,8-다이아민(octane-1,8-diamine), 헥사메틸렌 다이아민(hexamethlyene diamine, HMDA), 다이아미노 펜탄(diamino pentane), 다이아미노 부탄(diamino butane), 다이아미노 에탄(diamino ethane) 등을 포함한다. 또한 양 쪽 말단에 알데하이드가 도입되어 있는 분자에는 양쪽 말단에 알데하이드가 도입되어 있는 분자로 그 한정이 없으며, 아디프알데하이드(adipaldehyde), 헵탄다이알(heptanedial), 옥탄다이알(octanedial), 글루타알데하이드(glutaraldehyde) 등을 포함한다. ADH를 사용하여 유도체를 합성하는 경우 3분간 반응 시킬 때 20%, 2시간 반응시킬 때 70%의 ADH가 치환된 히알루론산 유도체를 얻을 수 있다. HA-ADH 유도체와 글루타알데하이드 (glutaraldehyde)를 이용하는 경우 ADH의 치환율에 따라 20%~70%의 히알루론산-알데하이드 유도체를 얻을 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 히알루론산-알데하이드 유도체를 이용하게 되면, 상기 히알루론산-알데하이드 유도체의 알데하이드 치환율을 조절함으로써 히알루론산과 컨쥬게이션시키는 단백질 약물의 종류에 따라 간으로 표적화할 것인지 또는 간을 우회하도록 할 것인지를 제어할 수 있게 된다.
본 발명의 히알루론산-알데하이드 유도체의 알데하이드 치환율은 예를 들어, 글루쿠론산의 개환 반응을 유도하는 산화제의 처리 시간을 조절함으로써 자유롭게 조절할 수 있다. 또한 히알루론산의 카르복실기와 다이하이드라자이드 또는 다이아민 그룹을 가진 분자와의 반응시간을 조절함으로써 카그복실기의 치환율을 자유롭게 조절할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 5% 이상 30% 미만의 알데하이드기 치환율을 가질 수 있다. 5% 이상 30% 미만의 알데하이드기 치환율을 갖는 히알루론산-알데하이드 유도체와 컨쥬게이션된 단백질은 간으로 표적화될 수 있게 된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 30%이상 100%이하의 알데하이드기 치환율을 가질 수 있다. 30%이상 100%이하의 알데하이드기 치환율을 갖는 히알루론산-알데하이드 유도체와 컨쥬게이션된 단백질은 간으로 표적화되지 않고 표적 비특이적인 특성을 갖게 된다.
하기 실시예에서는, 10% 치환된 저치환율의 히알루론산 알데하이드 유도체를 이용한 경우 체내 잔류 시간은 짧지만 간으로의 전달 특성이 좋았으며, 45% 치환된 고치환율의 히알루론산 알데하이드 유도체를 이용한 경우 체내 잔류 시간이 보다 길어지는 반면 간으로의 전달 특성이 낮아짐을 확인할 수 있다.
이렇게 얻어진 히알루론산-알데하이드 유도체를 단백질의 N-말단과 결합시킴으로써 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 제조할 수 있다.
본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 예를 들어, 히알루론산 중에 하기 화학식 4의 반복단위를 하나 이상 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 4]
Figure 112013063063769-pat00028
예를 들어, 화학식 2의 반복단위를 하나 이상 포함하는 히알루론산-알데하이드 유도체를 단백질과 컨쥬게이션시키게 되면, 하기 반응식 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 화학식 2에 존재하는 알데하이드기와 단백질의 N-말단의 아민기가 서로 반응하여 컨쥬게이션을 형성하게 되는 것이다.
[반응식 3]
Figure 112013063063769-pat00029
다른 구체예에서, 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 예를 들어, 히알루론산 중에 하기 화학식 5의 반복단위를 하나 이상 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 5]
Figure 112013063063769-pat00030
예를 들어, 화학식 3의 반복단위를 하나 이상 포함하는 히알루론산-알데하이드 유도체를 단백질과 컨쥬게이션시키게 되면, 하기 반응식 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 화학식 3에 존재하는 알데하이드기와 단백질의 N-말단의 아민기가 서로 반응하여 컨쥬게이션을 형성하게 되는 것이다.
[반응식 4]
Figure 112013063063769-pat00031

히알루론산-알데하이드 유도체와 단백질과의 컨쥬게이션은 바람직하게는 환원적 아미노화(reductive amination)를 유도하는 시약의 존재 하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyannoborohydride, NaBH3CN), 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드(sodium triacetoxyborohydride, NaBH(OCOCH3)3) 등과 같은 직접 환원적 아미노화 시약을 이용하면 단시간 내에 원스텝으로 히알루론산-단백질 컨쥬게이션을 유도할 수 있다.
상기 히알루론산-알데하이드 유도체와 단백질의 N-말단과의 반응은 pH 5 내지 7의 완충액 중에서 수행되는 것이 바람직하다. 완충액의 pH를 상기 범위로 조절함에 의해 히알루론산-알데하이드 유도체의 알데하이드기가 단백질의 다른 아민기를 가지는 라이신과 같은 아미노산과 반응하지 않고, 단백질의 N-말단과 특이적으로 반응하도록 할 수 있기 때문이다. 보다 바람직하게는 히알루론산-알데하이드 유도체와 단백질의 N-말단과의 반응은 pH 5.5 내지 6.5, 가장 바람직하게는 pH 6.0의 완충액 중에서 수행되는 것이 바람직하다.
한편, 히알루론산-알데하이드 유도체에서 단백질의 N-말단과 반응하지 않은 미반응 알데하이드기는 보호기를 사용하여 블로킹(blocking)할 수 있다. 히알루론산-알데하이드 유도체의 미반응 알데하이드기는 약물전달체의 제조 과정 또는 생체 내 투여 과정에서 단백질 의약의 다른 아미노산 잔기 또는 체내의 다른 단백질 물질 등과 불필요하게 반응할 가능성이 있으므로 이를 사전에 차단하는 것이 바람직할 수 있다.
미반응 알데하이드기를 블로킹하는 물질로는 에틸 카바제이트(ethyl carbazate), 테트라부틸 카바제이트(tetrabutyl carbazate)와 같은 알킬 카바제이트(alkyl carbazate), 아미노에탄올(aminoethanol)과 같은 아미노알콜(aminoalchol)을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로 알데하이드기의 보호기로 알려져 있는 아시랄 보호기(acylal protecting group), 아세탈 보호기(acetal protecting group), 케탈 보호기(ketal protecting group) 등을 사용하는 것도 가능하다.
이에 제한되는 것은 아니나, 위와 같은 미반응 알데하이드기의 블로킹 과정은 하기 반응식 5 또는 반응식 6과 같이 수행될 수 있다.
[반응식 5]
Figure 112013063063769-pat00032

[반응식 6]
Figure 112013063063769-pat00033

본 발명에 있어서, 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조를 위해 사용되는 히알루론산 또는 그의 염은 이에 제한되는 것은 아니나 10,000 내지 3,000,000 달톤(Da)의 분자량을 가질 수 있다. 상기 범위의 분자량을 갖는 히알루론산 또는 그의 염은 약물의 약효 지속을 위한 약물 전달체의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
한편, 히알루론산-알데하이드 유도체 한 분자 당 결합되는 단백질의 분자수는 히알루론산-알데하이드 유도체와 반응시키는 단백질 수용액의 농도에 따라 조절할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트에서 단백질은 히알루론산-알데하이드 유도체 한 분자 당 1 내지 20개 분자가 결합되어 있을 수 있다. 상기와 같은 범위 내의 분자수의 단백질이 결합된 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 원하는 약효 지속 시간을 나타낼 수 있으며 간 조직으로의 전달 특성이 좋아 간질환 치료제로 응용이 가능하다.
본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조에 사용되는 단백질 의약의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 상기 단백질 의약은 본 발명의 방법에 쉽게 적용할 수 있도록 수용성인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질약효의 장기 지속성 확보가 필요한 단백질 의약이라면 어떠한 것이라도 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 단백질은 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, GCSFs(granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulatingfactors), 인터루킨-1 알파, 인터루킨-1 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH(adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A(dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRHII(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20(enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin) 또는 지코노타이드일 수 있다.
본 발명은 또한 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체가 단백질의 N-말단과 결합되어 있는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트를 제공한다.
본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 앞서 설명한 방법에 의해 제조될 수도 있지만, 이와는 다른 방법으로 제조된 것도 모두 포함하는 것으로 의도된다.
하기 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, 히알루론산 또는 그의 염에 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체와 결합된 단백질은 생접합율이 95%에 이를 뿐만 아니라 안정성이 우수하고, 고분자의 결합에 의해 단백질의 입체 구조가 영향을 받지 않으며, 단백질 의약의 약효 지속성이 매우 우수한 확인되었다. 따라서, 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 단백질의 약물 전달 시스템을 위해 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 히알루론산의 리셉터와 바인딩 하는 카르복실기를 남겨둔 채 링 구조를 오픈하여 단백질을 컨쥬게이션한 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는, 히알루론산의 간 조직 특이적 전달 특성을 최대화하여 간질환 치료제로의 개발에 다양하게 응용될 수 있다. 또한, 히알루론산-알데하이드 유도체의 알데하이드 치환율을 조절함으로써 히알루론산의 간 표적 지향성을 자유롭게 조절할 수 있기 때문에 간의 우회가 필요한 약물의 약효 지속성 확보를 위해서도 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 단백질 의약의 생접합율과 약효 지속성이 매우 우수하고, 히알루론산이 단백질의 N-말단과 특이적으로 결합되어 있어 단백질 의약의 활성이 뛰어나다. 또한, 히알루론산-알데하이드 유도체의 알데하이드 치환율을 조절함으로써 히알루론산의 간 표적 지향성을 자유롭게 조절할 수 있기 때문에 간 질환 치료용 의약뿐만 아니라, 간의 우회가 필요한 의약의 약효 지속성 확보를 위해서도 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명의 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 단백질의 약물 전달 시스템을 위해 유용하게 사용될 수 있다.
도 1 (a)는 본 발명의 제조예 1에 따른 방법으로 제조된 치환율별 HA-adehyde-TBC 유도체의 1H-NMR 결과이다. (b)는 본 발명의 제조예 2에 따른 방법으로 제조된 치환율별 HA-adehyde-TBC 유도체의 1H-NMR 결과이다.
도 2는 본 발명의 제조예에 따른 방법으로 제조된 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 단백질의 GPC 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 히알루론산-인터페론 컨쥬게이트의 하나의 히알루론산 체인에 포함된 인터페론 분자수 및 단백질 분자수에 따른 생접합 효율을 나타낸 것이다.
도 4는 인터페론 알파와 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 Circular Dichroism (CD) 분석결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 이 제조예에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 인터페론 알파의 활성도 분석 결과를 ELISA assay를 통하여 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 이 제조예에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 인터페론 알파의 활성도 분석 결과를 daudi cell을 이용한 antiproliferation assay를 통하여 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 이 제조예에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 인터페론 알파의 항암치료 효과를 HepG2 간암세포를 이용한 antiproliferation assay를 통하여 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 일터페론의 인간 혈청 내에서 안정성을 비교하여 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 Pharmacokinetic analysis 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 제조예에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 쥐의 간에서의 항바이러스 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[ 실시예 ]
제조예 1: 히알루론산 알데하이드 유도체의 제조
히알루론산 (HA) (MW= 6.4kDa, 35kDa, 100kDa, 230kDa) 10mg/ml의 농도로 물에 녹인 후 소듐 퍼리오데이트 (Sodium periodate)를 단위체당 1 mole배로 첨가하고, 각각 2시간, 6시간, 12시간 동안 빛을 차단한 상태로 반응시켰다. 그런 다음, 상기 용액을 증류수에 대하여 투석하여 정제한 후 3일간 동결건조 시켜 치환율이 다른 히알루론산 알데하이드 유도체(HA-aldehyde 유도체)를 얻었다.
제조예 2: 히알루론산 알데하이드 유도체의 제조
히알루론산 (HA) (MW= 6.4kDa, 35kDa, 100kDa, 230kDa) 5mg/ml의 농도로 물에 녹인 후 HA 단위체의 20 mole배 분량의 Adipic Acid Dihydrazide (ADH)를 첨가한 후 HCl로 용액의 pH를 4.8로 맞춘 뒤, 30min 동안 stirring시킨 후 용액에 HA 단위체의 4 mole배의 분량의 N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-thylcarbodiimidehydro chloride (EDC, Mw=191.71)을 첨가한 뒤 각 3분, 2시간 동안 pH를 4.8로 유지하면서 반응을 시킨다. 그런 다음, 상기 용액을 증류수에 대하여 투석하여 정제한 후 3일간 동결건조 시켜 치환율이 다른 HA-ADH 유도체를 얻었다. 만들어진 HA-ADH 유도체를 10mg/ml의 농도로 pH 5.2의 소듐 아세테이트 완충액에 녹인 다음, 도입된 ADH의 10 mole배의 글루타알데하이드를 첨가한 후 24시간동안 반응 시킨다. 그런 다음, 용액을 증류수에 대하여 투석하여 정제한 후 3일간 동결건조 시켜 치환율이 다른 HA-ADH-Aldehyde 유도체를 얻었다.
실험예 1: 히알루론산 알데하이드 유도체의 치환율 분석
제조예 1에 따라 준비된 히알루론산 알데하이드 유도체를 5mg/ml의 농도로 pH 5.2의 소듐 아세테이트 완충액에 녹인 다음, 히알루론산 단위체당 5mole배의 테트라 뷰틸카바자이트(Tetrabutyl carbazate, TBC)와 소듐 시아노보로하이드라이드 (Sodium cyanoborohydride, NaBH3CN)를 첨가하여 24시간 반응 시켰다. 이 용액을 증류수에 대하여 투석한 후 3일간 동결건조하여 1H-NMR (DPX300, Bruker, Germany)으로 알데하이드의 치환율을 분석하였다.
그 결과, 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 1에 따른 HA-TBC의 1H-NMR 스펙트럼에서는 히알루론산의 피크 외에도, δ = 1.2 ~ 1.4 ppm에 9개의 수소를 나타내는 TBC의 3개의 메틸 피크가 나타났다. 정량분석을 위해 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 히알루론산의 아세토아미도 관능기의 메틸 공명(methyl resonance of acetamido moiety of HA)을 내부표준(internal standard)로 정했다. 제조예 1에 따른 HA-Aldehyde의 치환율은 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 피크 면적과 δ = 1.2 ~ 1.4 ppm의 피크 면적을 비교해서 구했다. 이러한 1H-NMR 분석 결과를 통해 히알루론산-알데하이드 유도체의 치환율을 계산해 본 결과 후 소듐 퍼리오데이트와의 반응 시간을 조절하여 10~50%의 치환율을 조절하여 얻을 수 있었다(2h: 10%, 12h:25%, 24h: 45%).
실험예 2: 히알루론산 알데하이드 유도체의 치환율 분석
제조예 2에 따라 준비된 히알루론산 알데하이드 유도체를 5mg/ml의 농도로 pH 5.2의 소듐 아세테이트 완충액에 녹인 다음, 히알루론산 단위체당 5mole배의 테트라 뷰틸카바자이트(Tetrabutyl carbazate, TBC)와 소듐 시아노보로하이드라이드 (Sodium cyanoborohydride, NaBH3CN)를 첨가하여 24시간 반응 시켰다. 이 용액을 증류수에 대하여 투석한 후 3일간 동결건조하여 1H-NMR (DPX300, Bruker, Germany)으로 알데하이드의 치환율을 분석하였다. 그 결과, 도 1-b에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 2에 따른 HA-TBC의 1H-NMR 스펙트럼에서는 히알루론산의 피크 외에도, δ = 1.2 ~ 1.4 ppm에 9개의 수소를 나타내는 TBC의 3개의 메틸 피크가 나타났다. 정량분석을 위해 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 히알루론산의 아세토아미도 관능기의 메틸 공명(methyl resonance of acetamido moiety of HA)을 내부표준(internal standard)로 정했다. 제조예 2에 따른 HA-Aldehyde의 치환율은 δ = 1.85 ~ 1.95 ppm의 피크 면적과 δ = 1.2 ~ 1.4 ppm의 피크 면적을 비교해서 구했다. 이러한 1H-NMR 분석 결과를 통해 히알루론산-알데하이드 유도체의 치환율을 계산해 본 결과 후 도입된ADH의 치환율에 따라 20~70%의 알데하이드 치환율을 조절하여 얻을 수 있었다.
제조예 3: 히알루론산- 알데하이드 유도체와 단백질과의 컨쥬게이트의 제조
제조예 1에서 얻어진 히알루론산-알데하이드 유도체를 10mg/ml의 농도로 pH 6의 아세테이트 완충액에 녹인 후 수용액 상태의 인터페론 알파를 히알루론산 1 체인 당 각각 1개, 4개, 6개, 9개가 되도록 첨가하였다. 히알루론산-알데하이드 유도체의 치환율에 따라 알데하이드의 5mole배로 소듐 시아노보로하이드라이드 (Sodium cyanoborohydride, NaBH3CN)를 첨가하여 24시간 동안 반응시켜, 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트 (HA-IFN conjugate)를 얻었다.
히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트 내에 반응하지 않고 남아있는 알데하이드를 블로킹(blocking)하기 위하여 에틸 카바자이트 (ethyl carbazate)를 알데하이드의 5mole배로 넣어준 후 24시간동안 더 반응 시키거나, 아미노 에탄올 (amino ethanol)을 알데하이드의 5mole배로 넣어준 후 pH 8에서 3시간동안 더 반응시켰다. 반응시킨 용액을 pH 7.4의 인산 완충 식염수 (PBS)에 대하여 투석한 후 -70?C에 보관하였다. .
실험예 3: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 GPC 분석
제조예 3에 따라 준비된 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 GPC 분석을 통해 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 형성을 확인하였다.
HPLC를 사용하여 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 GPC 분석하였다. 분석 조건은 하기와 같다.
GPC 분석 조건
펌프: Waters 1525 binary HPLC pump
흡광도 측정기: Waters 2487 dual λ absorbance detector
샘플러: Waters 717 plus auto-sampler
컬럼: Waters Ultrahydrogel 500 +Waters Ultrahydrogel 250
이동상: PBS at pH 7.4, flow rate는 0.5 mL/min.
측정 파장: 210 nm와 280 nm로 이중 측정(dual detection).
분석 결과, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 280nm의 파장에서 측정하였을 때, 고분자량의 히알루론산의 체류 시간(retention time)인 22분 대에서 피크가 나타나 히알루론산(HA)에 인터페론 알파가 컨쥬게이션 되었음을 확인하였다.
실험예 4: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 정량분석
상기 제조예 3에 따른 HA-인터페론 알파 컨쥬게이트 내의 인터페론 알파 함량은 GPC에서 피크 아래의 면적을 측정해 구하였다. 먼저 증류수에 1 mg/mL의 농도로 인터페론 알파 원액을 준비한 뒤, 희석시켜 인터페론 알파 표준용액을 준비하였다. 상기 실험예 3의 GPC 분석 조건에서 인터페론 알파 표준용액을 분석하여 인터페론 알파 농도에 따른 GPC 피크 아래 면적의 표준곡선 (stnadard curve)를 구하였다. 상기 제조예 3에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트를 같은 조건에서 분석해 얻은 GPC 피크 아래 면적을 표준곡선에 대입해 단백질 함량을 구했다.
분석 결과, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 3에 따른 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트 내의 단백질 함량은 feed내에서 HA 한 분자 당 반응시킨 단백질의 분자수에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다. HA 한 분자당 반응시킨 단백질의 분자수를 1, 4, 6, 9개로 변화시켰을 때, HA 한 분자 당 결합한 단백질의 평균 분자수는 1, 4, 6, 9개로 조절 가능했다. 생접합 효율(Bioconjugation efficiency) (%)은 분자수에 상관없이 95% 이상으로 나타났다.
실험예 5: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 CD 분석
인터페론의 농도를 기준으로 하여 (0.25mg/ml) 인터페론 알파 용액과 상기 제조예 3에 따른 히알루로산-인터페론 알파 컨쥬게이트 용액을 이용하여 Circular Dichroism 분석을 하였다. 분석 조건은 하기와 같다.
CD 분석 조건
UV spectrophotometer : JASCO J-715
측정 조건 : 25℃, 200~250 nm, N2 atmosphere
A quartz cuvette : 2 mm path length
Raw data : 0.2 mm intervals with a response time of 1 s.
분석 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 인터페론의 스렉트럼과 히알루론산-인터페론 컨쥬 게이트의 CD의 피크가 일치하는 것으로 보아 인터페론의 2차 구조가 히알루론산과 접합되어도 유지되는 것을 알 수 있다.
실험예 6: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 활성도 분석
ELISA/Bradford assay의 비율을 통하여 히알루론산-인터페론 컨쥬게이트의 활성도를 분석하였다. 먼저, 1mg/ml의 인터페론 알파 용액의 원액을 준비한 뒤, 희석시켜 인터페론 알파 표준용액을 준비하였다. Bradford assay를 이용하여 농도에 따른 흡광도를 측정하여 표준곡선을 구하였다. 상기 제조예 3에 따라 준비된 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 인터페론을 희석하여 같은 조건에서 Bradford assay로 흡광도를 측정한 후 스탠다드 커브에 대입해 인터페론 알파의 함량을 구했다. 또한 Bradford assay를 찍은 샘플과 표준 용액을 10000배 희석하여 ELISA를 통해 활성도를 가진 인터페론의 함량을 구했다. 그런 다음, ELISA/Bradford assay의 비율을 통하여 히알루론산-인터페론 컨쥬게이트의 활성도를 분석하였다.
분석 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 ELISA/Bradford assay의 비율이 70% 이상으로 나타났다. Bradford assay는 단백질의 리신(lysine)을 측정하는 분석 방법이고 ELISA는 인터페론 알파와 항체와의 결합을 이용하여 정량하는 분석 방법으로 이 비율을 통하여 존재하는 단백질 중에서 70% 이상이 활성을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다.
실험예 7: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 활성도 테스트
인터페론이 존재할 경우 증식을 잘 하지 못하는 세포로 알려져 있는 Human B-lymphoblastoid cell (Daudi cell)을 이용하여 인터페론의 활성도를 테스트하였다.
먼저, 1mg/ml의 인터페론 알파의 원액을 준비한 뒤, 희석시켜 인터페론 알파 표준용액을 준비하였다. Bradford assay를 이용하여 농도에 따른 흡광도를 측정하여 표준곡선을 구하였다. 상기 제조예 3에 따라 준비된 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 인터페론 알파를 희석하여 같은 조건에서 Bradford assay로 흡광도를 측정한 후 스탠다드 커브에 대입해 인터페론 알파의 함량을 구했다. Daudi cell을 각 표준용액과 희석한 샘플을 포함한 배지에서 5일 동안 인큐베이션한 후 MTS assay를 통하여 Daudi cell의 증식속도를 확인하였다.
분석 결과, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이 인터페론 알파 표준용액에 비하여 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 활성도가 떨어지지만 시중에 판매되는 PEGASYS의 경우와 비슷한 효율을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 8: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 항암 효과 분석
간암 세포인 HepG2 세포에 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트를 처리하고, MTT 어세이를 통하여 HepG2 세포의 생존율을 분석함으로써, 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 항암 효과를 시험하였다.
먼저, 1mg/ml의 인터페론 알파의 원액을 준비한 뒤, 희석시켜 인터페론 알파 표준용액을 준비하였다. Bradford assay를 이용하여 농도에 따른 흡광도를 측정하여 표준곡선을 구하였다. 상기 제조예 3에 따라 준비된 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트와 인터페론 알파를 희석하여 같은 조건에서 Bradford assay로 흡광도를 측정한 후 스탠다드 커브에 대입해 인터페론 알파의 함량을 구했다. 표준용액과 희석한 샘플을 포함한 각 배지에서 HepG2 세포를 3일 동안 인큐베이션한 후 MTT 어세이를 통하여 HepG2 세포의 생존율을 확인하였다.
분석 결과, 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이 인터페론 알파 표준용액과 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 항암효과가 비슷한 효과를 보이는 것을 알 수 있다.
실험예 9: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 반감기 분석( In vitro )
IFN와 HA-IFN 컨쥬게이트(10/6)(알데하이드기 치환율이 10% 이며 HA 한 ㅊ체인 당 6개의 IFN 분자가 결합하고 있는 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트)를 분석 샘플로 사용하여 이들의 반감기를 분석하였다.
위의 샘플을 IFN 농도가 1 mg/mL로 동일하도록 각각 인간 혈청에 용해시켜 37℃에서 120시간 동안 인큐베이션하였다. 정해진 시간이 되었을 때 일부를 샘플링하고, 인간 혈청의 영향을 막기 위해 PBS에 1000배로 희석한 후 냉동시켰다. 각 샘플의 생물학적 활성도는 IFN ELISA 키트와 Daudi 세포를 이용한 MTS 어세이를 사용해 측정하였다.
분석 결과, 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 인터페론 알파는 24시간 내에 빠르게 분해되었다. 하지만 HA-IFN 컨쥬게이트(10/6)는 120시간 이상으로 반감기가 연장되어, 인터페론에 비해 약 5배 길어진 반감기를 가졌다.
실험예 10: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 약리 ( PK ) 특성 분석 ( In vivo )
SD rat의 꼬리 정맥을 통해 PBS, IFN, HA-IFN 컨쥬게이트(치환도 10%, 25%, 45%)를 각각 투여한 후, 정해진 시간이 되었을 때 꼬리 정맥에서 혈액을 채취해 각 샘플의 혈중농도를 IFN ELISA kit를 사용해 측정하였다.
분석 결과, 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, IFN 혈중농도는 24시간 이전에 baseline으로 떨어졌으나, HA-IFN 컨쥬게이트 (45/6)의 혈중농도는 4일째에도 baseline으로 떨어지지 않았다.
실험예 11: 히알루론산-인터페론 알파 컨쥬게이트의 항바이러스 특성 분석 ( In Vivo )
Balb/c 마우스의 꼬리 정맥을 통해 PBS, IFN, HA-IFN (10/6), HA-IFN (45/6) 컨쥬게이트를 각각 투여한 후 (주사량 : 인터페론 기준 0.2mg/kg), 24시간 이후에 쥐의 간을 채취하여 간에서의 2'-5'-oligoadenylate synthetase 1 (OAS 1) level을 웨스턴 블럿을 통하여 정량하였다.
2'-5'-oligoadenylate synthetase 1 (OAS 1) 은 인터페론에 의해 발현되는 단백질로 항바이러스 특성을 갖는다. 도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, IFN 보다도 저 치환율의 HA-IFN 컨쥬게이트의 경우 간으로 전달이 잘되고 체내 잔류시간이 길어지기 때문에 간에서의 항바이러스 역할을 하는 OAS 1 level이 더 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 고 치환율의 HA-IFN 컨쥬게이트의 경우 저치환율의 HA-IFN 컨쥬게이트에 비해서는 간으로의 전달 특성이 떨어지지만 체내 잔류 시간을 늘려 IFN보다 OAS 1 level이 높아지는 것을 확인하였다.

Claims (25)

  1. 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격에 하나 이상의 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체를 단백질의 N-말단과 반응시키는 것을 포함하는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법.

  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격이 개환되어 있고 개환된 환의 말단에 하나 이상의 알데하이드기를 갖는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염을 산화제와 반응시켜 얻은 것인 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 산화제는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격을 개환시켜 하나 이상의 알데하이드기를 형성시킬 수 있는 것인 히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 산화제는 퍼리오데이트(periodate)인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  7. 제4항에 있어서,
    히알루론산 또는 그의 염과 산화제 간의 반응 시간을 조절함으로써 히알루론산 또는 그의 염의 알데하이드기 치환율을 조절하는 것을 포함하는
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격에 존재하는 카르복실 위치에 알데하이드기가 도입되어 있는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법.
  9. 제 8항에 있어서
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 히알루론산 또는 그 유도체의 카르복실 그룹을 다이아민 또는 다이하이드라자이드 그룹을 가진 분자와 반응시킨 뒤, 그 유도체를 다이알데하이드 그룹을 가진 분자와 반응시켜 얻은 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 5% 이상 30% 미만의 알데하이드기 치환율을 갖는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체는 30% 이상 100% 미만의 알데하이드기 치환율을 갖는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    히알루론산-알데하이드 유도체와 단백질의 N-말단과의 반응은 환원적 아미노화(reductive amination)를 유도하는 시약의 존재 하에서 수행되는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 환원적 아미노화를 유도하는 시약은 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyannoborohydride, NaBH3CN) 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드(sodium triacetoxyborohydride, NaBH(OCOCH3)3)인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체와 단백질의 N-말단과의 반응은 pH 5 내지 7의 완충액 중에서 수행되는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산-알데하이드 유도체와 단백질의 N-말단과의 반응은 pH 5.5 내지 6.5의 완충액 중에서 수행되는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  16. 제1항에 있어서,
    히알루론산-알데하이드 유도체에서 단백질의 N-말단과 반응하지 않은 미반응 알데하이드기를 보호기로 블로킹하는 단계를 추가로 포함하는
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  17. 제1항에 있어서,
    히알루론산 또는 그의 염은 10,000 내지 3,000,000 달톤(Da)의 분자량을 갖는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  18. 제1항에 있어서,
    히알루론산-알데하이드 유도체 한 분자 당 결합되는 단백질의 분자수는 1 내지 20개인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 단백질은 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, GCSFs(granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulatingfactors), 인터루킨-1 알파, 인터루킨-1 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH(adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A(dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRHII(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20(enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin) 또는 지코노타이드인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트의 제조방법.
  20. 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산 골격에 하나 이상의 알데하이드기가 도입되어 있는 히알루론산-알데하이드 유도체가 단백질의 N-말단과 결합되어 있는 히알루론산-단백질 컨쥬게이트.
  21. 제20항에 있어서,
    히알루론산 또는 그의 염은 10,000 내지 3,000,000 달톤(Da)의 분자량을 갖는 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트.
  22. 제20항에 있어서,
    히알루론산-알데하이드 유도체 한 분자 당 결합되어 있는 단백질의 분자수가 1 내지 20개인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 히알루론산-단백질 컨쥬게이트는 간 질환의 치료를 위한 것인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트.
  24. 제20항에 있어서,
    상기 단백질은 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, GCSFs(granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulatingfactors), 인터루킨-1 알파, 인터루킨-1 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH(adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A(dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRHII(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20(enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin) 또는 지코노타이드인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트.
  25. 제20항에 있어서,
    상기 단백질은 인터페론 알파인
    히알루론산-단백질 컨쥬게이트.
KR1020100126432A 2010-12-10 2010-12-10 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법 KR101309566B1 (ko)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100126432A KR101309566B1 (ko) 2010-12-10 2010-12-10 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법
JP2013543093A JP5784142B2 (ja) 2010-12-10 2011-12-05 ヒアルロン酸−タンパク質コンジュゲート及びその製造方法
CA2821075A CA2821075A1 (en) 2010-12-10 2011-12-05 Hyaluronic acid-protein conjugate and method for preparing same
EP11846761.2A EP2650312A4 (en) 2010-12-10 2011-12-05 HYALURONIC ACID-PROTEIN CONJUGATE AND METHOD FOR PREPARING THE SAME
CN201180067381.XA CN103492420B (zh) 2010-12-10 2011-12-05 透明质酸-蛋白质结合物及其制备方法
PCT/KR2011/009363 WO2012077950A2 (ko) 2010-12-10 2011-12-05 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법
US13/992,988 US9221893B2 (en) 2010-12-10 2011-12-05 Hyaluronic acid-protein conjugates and method for preparing same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100126432A KR101309566B1 (ko) 2010-12-10 2010-12-10 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120089506A KR20120089506A (ko) 2012-08-13
KR101309566B1 true KR101309566B1 (ko) 2013-09-17

Family

ID=46207583

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100126432A KR101309566B1 (ko) 2010-12-10 2010-12-10 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9221893B2 (ko)
EP (1) EP2650312A4 (ko)
JP (1) JP5784142B2 (ko)
KR (1) KR101309566B1 (ko)
CN (1) CN103492420B (ko)
CA (1) CA2821075A1 (ko)
WO (1) WO2012077950A2 (ko)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2009228217A1 (en) 2008-03-28 2009-10-01 The Regents Of The University Of California Polypeptide-polymer conjugates and methods of use thereof
EP2813515B1 (en) * 2012-02-07 2019-07-10 PHI Biomed Co., Ltd. Transdermally delivered hyaluronic acid-protein conjugate
WO2014071132A1 (en) * 2012-11-01 2014-05-08 The Johns Hopkins University Contact lens surface modification with hyaluronic acid (ha) binding peptide for ha accumulation and retention
KR101664444B1 (ko) * 2013-12-13 2016-10-12 재단법인 유타 인하 디디에스 및 신의료기술개발 공동연구소 생분해성 의료용 접착제 또는 실란트 조성물
WO2015088275A1 (ko) * 2013-12-13 2015-06-18 재단법인 유타 인하 디디에스 및 신의료기술개발 공동연구소 생분해성 의료용 접착제 또는 실란트 조성물
CN113546178A (zh) 2015-12-09 2021-10-26 加利福尼亚大学董事会 治疗眼部疾病或病症的方法
CN106046169A (zh) * 2016-06-01 2016-10-26 深圳市瀚德标检生物工程有限公司 一种磁微粒偶联抗体分子的方法
JP2019218265A (ja) * 2016-09-14 2019-12-26 生化学工業株式会社 ペプチドの血中滞留性を増強させる方法
KR20180040811A (ko) * 2016-10-13 2018-04-23 (주)웰빙해피팜 아민기가 포함된 생체 적합성 고분자로 가교시킨 히알루론산 조직수복용 생체 재료 및 이의 제조방법
CN109260457B (zh) * 2017-07-18 2023-06-13 苏州高泓利康生物科技有限公司 一种透明质酸-白介素10复合物、其制备方法及其应用
WO2020085734A1 (ko) * 2018-10-24 2020-04-30 주식회사 화이바이오메드 히알루론산 말단의 알데하이드 그룹을 이용하여 제조한 약물 접합체
KR102277785B1 (ko) * 2018-10-24 2021-07-15 (주)화이바이오메드 히알루론산 말단의 알데하이드 그룹을 이용하여 제조한 약물 접합체
CN112451542B (zh) * 2020-11-30 2022-02-11 西安交通大学 一种白蛋白/透明质酸纳米复合物-铂类前药及制备方法和应用
CN112569345A (zh) * 2020-12-10 2021-03-30 广东省科学院化工研究所 一种含生长因子的分散体及其制备方法与应用
CN113648427B (zh) * 2021-08-20 2023-07-28 山东大学 透明质酸-es2-af肽偶联物及其制备方法和应用
CN114805631A (zh) * 2022-03-01 2022-07-29 吉林省奇健生物技术有限公司 高活性透明质酸-多肽缀合物及其制备方法和应用
CN116789869A (zh) * 2023-06-25 2023-09-22 吉林省奇健生物技术有限公司 一种透明质酸-蛋白偶联体的制备方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040126361A1 (en) 2002-12-26 2004-07-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
US20040136952A1 (en) 2002-12-26 2004-07-15 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
US20050176208A1 (en) 2004-01-06 2005-08-11 Hiroaki Uchida Semiconductor wafer and manufacturing method thereof
EP1579873A1 (en) * 2004-03-23 2005-09-28 Complex Biosystems GmbH Polymeric prodrugs

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677276A (en) * 1994-12-23 1997-10-14 La Jolla Cancer Research Foundation Immobilization of peptides to hyaluronate
US5866165A (en) * 1997-01-15 1999-02-02 Orquest, Inc. Collagen-polysaccharide matrix for bone and cartilage repair
WO2001005434A2 (en) * 1999-07-20 2001-01-25 Amgen Inc. Hyaluronic acid-protein conjugates
WO2002090390A1 (en) * 2001-05-04 2002-11-14 University Of Utah Research Foundation Hyaluronic acid containing bioconjugates : targeted delivery of anti-cancer drugs to cancer cells
US20050176108A1 (en) * 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US20050176079A1 (en) * 2004-02-09 2005-08-11 Chu Yong L. Polypeptide bioconjugates, methods of making the bioconjugates and assays employing the bioconjugates
MX2007007877A (es) * 2004-12-27 2007-08-21 Baxter Int Conjugados de polimero-factor de von willebrand.
TW200643033A (en) * 2005-03-08 2006-12-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Conjugate of water-soluble modified hyaluronic acid and glp-1 analogue
WO2009048280A2 (en) * 2007-10-09 2009-04-16 Postech Academy-Industry Foundation Long acting hyaluronic acid - peptide conjugate
WO2010138074A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Hilborn Joens Hyaluronic acid based delivery systems

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040126361A1 (en) 2002-12-26 2004-07-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
US20040136952A1 (en) 2002-12-26 2004-07-15 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
US20050176208A1 (en) 2004-01-06 2005-08-11 Hiroaki Uchida Semiconductor wafer and manufacturing method thereof
EP1579873A1 (en) * 2004-03-23 2005-09-28 Complex Biosystems GmbH Polymeric prodrugs

Also Published As

Publication number Publication date
JP5784142B2 (ja) 2015-09-24
US9221893B2 (en) 2015-12-29
KR20120089506A (ko) 2012-08-13
EP2650312A4 (en) 2016-08-31
EP2650312A2 (en) 2013-10-16
CN103492420A (zh) 2014-01-01
CA2821075A1 (en) 2012-06-14
WO2012077950A3 (ko) 2012-08-23
WO2012077950A2 (ko) 2012-06-14
JP2014500272A (ja) 2014-01-09
US20130253170A1 (en) 2013-09-26
CN103492420B (zh) 2016-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101309566B1 (ko) 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법
Kong et al. Long acting hyaluronate–exendin 4 conjugate for the treatment of type 2 diabetes
AU2010277438B2 (en) Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
AU725195B2 (en) Interferon conjugates
US10092658B2 (en) Method for manufacturing transdermally delivered hyaluronic acid-protein conjugate and transdermally delivered hyaluronic acid-protein conjugate manufactured using same
EP3184553B1 (en) Derivative of hyaluronic acid modified with amino-carboxylic acid
JPH07508727A (ja) 生体分子と結合したポリオキシメチレン−オキシエチレン共重合体
KR20120073196A (ko) 비혈액 응고 단백질의 글리코폴리시알화
JP2022058911A (ja) 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化
US9925209B2 (en) Heparosan-polypeptide and heparosan-polynucleotide drug conjugates and methods of making and using same
EP2907876B1 (en) Reduction stimuli-responsive gene vector system and preparation and use thereof
CN112424239B (zh) 高分子化合物及使用了该高分子化合物的细胞内化合物导入促进剂
CN101475647A (zh) 双分枝聚唾液酸活性衍生物的制备方法和应用
KR102277785B1 (ko) 히알루론산 말단의 알데하이드 그룹을 이용하여 제조한 약물 접합체
JP5189243B2 (ja) 薬物複合体および薬物送達用担体
KR102039493B1 (ko) 신규 엑세나타이드 변이체-고분자 복합체
WO2020099513A1 (en) Glycopolysialylation of blinatumomab

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee