KR102039493B1 - 신규 엑세나타이드 변이체-고분자 복합체 - Google Patents

신규 엑세나타이드 변이체-고분자 복합체 Download PDF

Info

Publication number
KR102039493B1
KR102039493B1 KR1020180008749A KR20180008749A KR102039493B1 KR 102039493 B1 KR102039493 B1 KR 102039493B1 KR 1020180008749 A KR1020180008749 A KR 1020180008749A KR 20180008749 A KR20180008749 A KR 20180008749A KR 102039493 B1 KR102039493 B1 KR 102039493B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
exenatide
polymer
complex
peg
Prior art date
Application number
KR1020180008749A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180087864A (ko
Inventor
이은규
티 녹 탄 응원
정수진
Original Assignee
한양대학교 에리카산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한양대학교 에리카산학협력단 filed Critical 한양대학교 에리카산학협력단
Publication of KR20180087864A publication Critical patent/KR20180087864A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102039493B1 publication Critical patent/KR102039493B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons

Abstract

본 발명은 신규 구조의 엑세나타이드-고분자 복합체 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 엑세나타이드-고분자 복합체는 종래의 엑세나타이드 단량체와 비교해서 더 높은 단백질 분해효소에 대한 저항력을 가지고, 저분자량에 의한 신장 배출, 체내 면역반응 유발 등의 문제점들을 극복하는 동시에 약물의 효능성을 약 57배 향상시킬 수 있어 궁극적으로 제2형 당뇨병 환자들에 대한 엑세나타이드 치료제의 용량 및 주사 빈도를 감소시켜, 종래의 엑세나타이드를 효과적으로 대체할 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법에 의하여 복합체를 제조하는 경우 유기용매의 사용 없이 고수율로 복합체의 제조가 가능하며 기존 방법 대비 경제성이 대폭 향상되는 장점이 있다.

Description

신규 엑세나타이드 변이체-고분자 복합체{NOVEL EXENATIDE VARIANTS-POLYMER COMPLEX}
본 발명은 신규 구조의 엑세나타이드 변이체-고분자 복합체 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
엑세나타이드(exenatide)는 GLP-1(glucagon-like peptide 1) 유사체인 Exendin-4의 합성 펩타이드로서 제2형 당뇨병 환자에서 인슐린 분비를 촉진시켜 혈당을 낮추기 위해 사용되는 약이다. 천연 GLP-1과는 약 53%의 상동성을 갖고 있어, GLP-1 수용체에 대한 작용제이면서 단백질 분해효소인 DPP-IV에 저항성을 보이며 반감기는 2-4시간이다. 초기 용량으로는 5 mcg 1일 2회 피하주사하며 최대 10 mcg 1일 2회까지 투여할 수 있다. 그러나, 아직 1형 당뇨병에서의 사용은 인정되지 않고 있다.
엑세나타이드에 대한 여러 연구들에서 일관되게 공복 및 식후 혈당, 당화혈색소, 체중을 감소시키는데 효과를 보였으나, 체내 반감기가 짧아 이를 향상 시키기 위한 노력이 계속 되고 있다. 엑세나타이드-고분자(고분자로는 주로 폴리에틸렌글리콜(PEG)가 이용) 복합체를 형성하는 방법에는 엑세나타이드 내 라이신(lysine) 잔기와 PEG-알데히드 사이의 아민 커플링(amine coupling) 반응을 이용한 공유결합 기술과 C-말단에 시스테인(cysteine) 잔기를 부착시킨 엑세나타이드(exenatide) 변이체를 생성한 후 PEG-MA (maleimide) 분자를 티올(thiol)기와 공유결합 시키는 기술이 있다.
그러나, 아민 커플링 반응을 이용하는 공유결합 기술은 2개의 라이신(lysine) 잔기가 모두 페길화(PEGylation) 되므로 부위특이적이지 못하고, 각 라이신 잔기에 결합한 위치이성체(positional isomer)의 분리가 매우 어렵다는 단점이 있다. 또한, C-말단에 시스테인 잔기를 부착시켜 선형 구조의 복합체를 제조하는 방법은 페길화 반응에 트리에틸아민(triethylamine; TEA) 또는 트리플루오로 아세트산(trifluoroacetic acid; TFA)이 포함된 디메틸석폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO)와 같은 유기용매가 사용되는데, DMSO는 높은 비등점 때문에 제거가 어렵고, TEA와 TFA 유기용매들은 독성을 지니고 있기 때문에 엑세나타이드 펩타이드의 변성을 유도할 수 있어, 향후 완벽하게 제거시킬 별도의 공정이 추가되어야 하는 단점이 있다.
따라서, 투여 횟수의 경감 등의 환자 편의와 제조 단가의 절감을 위한 고효율의 엑세나타이드-고분자 복합체의 생산을 위한 연구 및 개발이 지속적으로 요구되고 있다.
본 발명은 분리 및 정제가 어렵고, 고분자의 비특이적 결합에 의해 오히려 엑세나타이드의 생활성을 저하시키는 종래의 복합체 제조방법이 아닌, 개선된 복합체의 제조방법을 제공하고자 한다. 이를 통해서, 본 발명은 기존의 선형 구조의 엑세나타이드-고분자 복합체 대신 엑세나타이드의 중간 위치에 고분자를 접합시켜 T자 또는 Y자 형태의 가지 구조(branched structure)를 갖는 신규 구조의 엑세나타이드-고분자 복합체를 제공하고자 한다.
이러한 측면에서, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩타이드; 및 생체적합성 고분자를 포함하는 펩타이드-고분자 복합체에 관한 것이다.
또한 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩타이드;와 생체적합성 고분자를 1 : 1 내지 3의 몰 비율로 혼합하여 반응시키는 것; 및 상기 반응 혼합물로부터 양이온 교환 크로마토그래피를 이용해서 목적하는 펩타이드-고분자 복합체를 분리 및 정제하는 것을 포함하는, 펩타이드-고분자 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열의 엑세나타이드 펩타이드에서 12번째 라이신이 시스테인으로 치환(K12C)된 변이 또는 27번째 라이신이 시스테인으로 치환(K27C)되는 변이를 포함하는 엑세나타이드 변이체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 펩타이드-고분자 복합체의 제조방법은 위치특이적 결합을 유도하므로, 목적하는 복합체 및 분리정제가 용이하며, 따라서 제조 및 분리/정제 과정에서 유기용매를 사용하지 않아 펩타이드의 변성 등의 문제를 해결할 수 있고, 의약의 제조과정에 있어서, 유기용매를 제거하는 단계를 생략할 수 있으므로, 효율적이다. 또한, 펩타이드와 고분자의 비특이적 결합이 일어나지 않아 복합체에서 펩타이드의 생활성(bioactivity)을 감소시키는 등의 문제가 발생하지 않으며, 높은 수율로 복합체를 제조할 수 있고, 본 발명의 펩타이드-고분자 복합체는 체내 반감기를 현저히 향상시킬 수 있어 종래의 엑세나타이드 제제를 대체할 수 있는 바이오 개량약물(bio-better)로 이용될 수 있다.
도 1a 및 1b는 엑세나타이드 변이체의 페길화 여부를 확인한 결과를 나타낸다: (1a): 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색을 이용한 SDS-PAGE. (B) PEG 염색. 도 1a 및 1b에서 레인 #1: 마커(kD), #2: 엑세나타이드 변이체(K12C), #3: PEG-MA(10 kD), #4: K12C-PEG, #5: K27C-PEG를 의미한다.
도 2a, 2b, 2c 및 2d는 본 발명의 일 실시 예에 따라 제조된 엑세나타이드 변이체-고분자 복합체의 양이온 교환 크로마토그래피(HiTrap SP)를 이용한 분리를 나타낸다: (2a) 50%의 완충액 B의 K12C-PEG, 피크 #1-반응하지 않은 PEG-MA, 피크 #2-K12C-PEG; (2b) 60%의 Buffer B의 K27C-PEG, 피크 #3-K27C-PEG; (2c) 쿠마시 블루 SDS-PAGE; (2d) PEG 염색. 도 2c 및 2d에서 레인#1: 마커(kD); 레인#2: PEG-MA(10kD); 레인#3: 피크#1; 레인#4: 페길화(PEGylation) 혼합물로부터의 K12C-PEG (크로마토그래피 전); 레인#5: 피크#2(K12C-PEG); 레인#6: 페길화(PEGylation) 혼합물로부터의 K27C-PEG(크로마토그래피 전), 레인#7: 피크#3(K27C-PEG)를 의미한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 트립신 용액에서의 엑세나타이드(exenatide) 단량체와 본 발명의 일 실시예에 따른 K12C-PEG 복합체 및 K27C-PEG 복합체의 항 트립신(trypsin) 안정성 테스트 결과를 보여준다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 GLP-1R을 발현하는 CHO 세포에서 엑세나타이드(Exn) 단량체와 K12C-PEG 복합체 및 K27C-PEG 복합체의 농도에 따른 cAMP 생성 반응을 통해 생활성을 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서 PEG의 분자량에 따른 펩타이드-PEG 복합체의 cAMP 생성 반응을 통한 생활성을 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동종 이량 복합체 K12C-PEG 10kD-K12C의 양이온 교환 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸다.
도 7a 및 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동종 이량 복합체 K12C-PEG 10kD-K12C의 양이온 교환 크로마토그래피로 분리된 결과물의 질량을 분석한 질량 스펙트럼 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 동종 이량 복합체 K12C-PEG 10kD-K12C 와 모노-펩타이드-고분자 복합체 K12C-PEG 10kD의 cAMP 생성 반응을 통한 생활성을 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드 및 펩타이드-고분자 복합체의 in vivo 반감기를 확인한 형광사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 펩타이드 및 펩타이드-고분자 복합체의 in vivo 반감기를 표기한 그래프이다.
본 발명은 서열번호 3의 엑세나타이드 펩타이드의 아미노산 서열에서 12번째 라이신이 시스테인으로 치환(K12C)된 변이 또는 27번째 라이신이 시스테인으로 치환(K27C)되는 변이를 포함하는 엑세나타이드 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 상기 엑세나타이드 변이체 펩타이드; 및 생체적합성 고분자를 포함하는 펩타이드-고분자 복합체에 관한 것이다.
상기 복합체는 생체적합성 고분자 1개당 펩타이드를 2개 포함하는 이량체(dimer) 형태의 복합체 일 수 있다. 즉, 서열번호 1의 펩타이드-고분자-서열번호 1의 펩타이드; 서열번호 1의 펩타이드-고분자-서열번호 2의 펩타이드; 서열번호 2의 펩타이드-고분자-서열번호 2의 펩타이드; 또는 서열번호 2의 펩타이드-고분자-서열번호 1의 펩타이드 형태의 복합체 일 수 있다.
본 발명은 또한, 이러한 측면에서, 펩타이드-고분자 복합체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드;와 생체적합성 고분자를 1 : 1 내지 3의 몰 비율로 혼합하여 반응시키는 것; 및 상기 반응 혼합물로부터 양이온 교환 크로마토그래피를 이용해서 목적하는 펩타이드-고분자 복합체를 분리 및 정제하는 것을 포함한다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 엑세나타이드 변이체는 종래 엑세나타이드 펩타이드(서열번호 3)의 서열에서 일부 아미노산이 치환된 펩타이드 서열을 갖는 것으로, 구체적으로 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩타이드 일 수 있다.
상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 종래 당뇨병 치료제로 이용되는 엑세나타이드의 변이체로서, 엑세나타이드가 당뇨병 치료효과와 관련된 GLP-1 수용체에 결합하는 능력에 영향이 없다면, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상 또는 90% 이상의 상동성을 가지는 경우도 본 발명에 포함될 수 있다.
본 발명의 엑세나타이드 변이체는 종래의 엑세나타이드 서열에서 12번째 라이신이 시스테인으로 치환(서열번호 1, K12C); 또는 27번째 라이신이 시스테인으로 치환(서열번호 2, K27C)된 것을 특징으로 한다. 이러한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드는 고분자와 복합체를 형성하는 경우, 12번째 시스테인 또는 27번째 시스테인에서 위치 특이적으로 고분자와 반응할 수 있어, 펩타이드-고분자 복합체의 제조수율 및 효능성을 향상시키므로 펩타이드-고분자 복합체의 제조에 매우 유리한 효과를 갖는다. 특히, 종래 엑세나타이드-고분자 복합체를 제조하는 방법은 아미노산 말단에 시스테인을 결합시켜 선형의 복합체를 제조하거나, 엑세나타이드 내 라이신 잔기와 PEG-알데히드 사이의 아민 커플링 반응을 이용해서 고분자와 결합시켰으나, 이는 복합체의 제조과정에서 두 개의 라이신 잔기 모두 결합에 참가할 수 있어 부위 특이적 반응을 일으키지 못하고, 각 라이신 잔기에 결합한 위치 이성체를 분리하는데 매우 큰 어려움이 있어 효율적이지 못했다. 그러나, 본 발명의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열의 엑세나타이드 변이체를 이용해서 고분자와 복합체를 형성하는 경우 변이가 일어난 시스테인 잔기와 고분자의 반응기 사이에서만 결합반응이 일어나므로, 위치특이적인 결합이 가능하고, 생성된 복합체의 분리 및 정제에도 어려움이 없다는 점에서 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 엑세나타이드 변이체-고분자 복합체의 제조에서 펩타이드와 고분자의 부위특이적 공유결합 반응의 수율은 95% 이상이었다(실시예 2).
이러한 측면에서 본 발명은 펩타이드-고분자 복합체, 바람직하게는 엑세나타이드 변이체-고분자 복합체에 관한 것이다.
본 발명의 펩타이드-고분자 복합체는 펩타이드와 고분자가 결합되어 있는 분자를 의미하는 것으로, 구체적으로 본 발명의 엑세나타이드 변이체와 생체적합성 고분자가 결합된 분자를 의미한다. 본 발명의 엑세나타이드 변이체-생체적합성 고분자 복합체에 종래 사용되던 엑세나타이드 치료제의 체내 반감기를 늘릴 수 있고, 역가(potency) 및 유효성(efficacy)을 향상시켜, 투여 횟수를 줄일 수 있는 등의 우수한 효과를 가질 수 있다.
상기 펩타이드-고분자 복합체는 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩타이드; 및 생체적합성 고분자를 포함하는 펩타이드-고분자 복합체에 관한 것 일 수 있다.
또한, 상기 복합체는 생체적합성 고분자 1개당 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열의 펩타이드를 2개 포함하는 이량체(dimer) 형태의 복합체 일 수 있다. 즉, 서열번호 1의 펩타이드-고분자-서열번호 1의 펩타이드; 서열번호 1의 펩타이드-고분자-서열번호 2의 펩타이드; 서열번호 2의 펩타이드-고분자-서열번호 2의 펩타이드; 또는 서열번호 2의 펩타이드-고분자-서열번호 1의 펩타이드 형태의 복합체 일 수 있다.
본 발명에서 역가(potency)는 본 발명의 펩타이드 변이체 또는 이를 포함하는 복합체가 효과를 나타낼 수 있는 최소 농도를 의미하는 것으로, 역가 값이 낮을수록 역가가 좋은(우수) 것으로 이해된다.
또한, 본 발명의 유효성(Efficacy)은 일정 농도에서 약물이 보이는 최대 효과를 의미하는 것으로, 유효성 값이 높을수록 유효성이 좋은(우수)한 것으로 이해된다.
본 발명에서 생체적합성 고분자는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알코올, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 폴리락트산(PLA, polylactic acid), 폴리락틱-글리콜산(PLGA, polylactic-glycolic acid), 지질 중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다. 또한, 본 발명의 기술분야에서 이미 알려진 유도체 또는 본 발명의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체도 본 발명에 포함된다.
상기 생체적합성 고분자는 본 발명의 펩타이드의 분자량을 증가시켜 신장에 의한 소실을 억제하고, 생체 내 단백질 분해효소에 대한 저항성을 높여 상기 펩타이드의 체내 반감기를 연장시켜주는 역할을 한다.
상기 고분자는 바람직하게는 5kD 초과의 분자량을 가지는 고분자 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 5kD 초과 내지 50kD 이하의 분자량을 갖는 것 일 수 있다. 상기 고분자의 분자량이 5kD 이하인 경우 서열번호 1 또는 2의 펩타이드와 복합체를 형성하여도 그 분자량이 작아 체내에서 신장에 의해 정제될 수 있으므로 상기 범위를 초과하는 고분자를 사용하는 것이 유리하다. 또한 50kD을 초과하는 분자량을 갖는 고분자를 이용하는 경우 고분자에 의한 펩타이드의 차폐가 너무 심할 수 있어, 펩타이드-고분자 복합체의 생물학적 역가(potency)를 저하시킬 수 있으므로, 50kD 이하의 고분자를 복합체에 포함할 수 있다. 그러나 복합체의 성질 및 약물의 제제화에 따라 상기 고분자의 중량은 달리 설정될 수 있다.
본 발명의 펩타이드와 생체적합성 고분자는 임의의 공유결합을 통해서 연결될 수 있고, 바람직하게는 펩타이드의 시스테인 잔기와 생체적합성 고분자의 반응기 사이에의 공유결합으로 연결된 것 일 수 있다. 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 12번째 시스테인 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 27번째 시스테인과 생체적합성 고분자가 공유결합으로 연결된 것 일 수 있다. 이러한 본 발명의 펩타이드-고분자 복합체는 가지 구조(branched structure)의 펩타이드-고분자 복합체로 나타낼 수 있다. 본 발명의 서열번호 1 또는 2의 엑세나타이드 변이체를 포함하는 가지 구조의 펩타이드-고분자 복합체 체내 반감기가 향상되며, 선형의 펩타이드-고분자 복합체와 비교해서 우수한 체내 반감기를 갖는다. 또한, 서열번호 1 또는 2의 엑세나타이드 변이체를 이용함으로써 위치특이적인 복합체의 제조 및 분리 정제가 용이하다는 장점이 있다.
이러한 측면에서, 본 발명의 생체적합성 고분자는 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 반응기를 가진 것 일 수 있다. 상기 말단의 반응기는 말레이미드(maleimide)기 및 숙신이미드(succinimide)기로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 숙신이미드기의 예에는 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트, 하이드록시 숙신이미딜, 숙신이미딜 카르복시메틸 또는 숙신이미딜 카보네이트가 포함될 수 있다. 또한, 상기 생체적합성 고분자의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 양쪽 말단에 하이드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 하이드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 제조할 수 있다.
특히, 본 발명의 생체적합성 고분자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 12번째 시스테인 또는 27번째 시스테인과 위치특이적 반응을 일으키기 위해서 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 말레이미드기를 갖는 것이 바람직하다. 이 경우, 위치 비특이적 반응이 최소화될 수 있고, 반응 수율 90% 이상으로 복합체를 생성할 수 있음을 본 발명의 실시예에서 확인하였다.
본 발명의 엑세나타이드 변이체는 또한, 펩타이드-고분자 복합체의 제조를 매우 용이하게 하고, 위치특이적인 펩타이드-고분자 복합체의 제조가 가능하며, 복합체의 분리 정제를 용이하게 하여, 펩타이드-고분자 복합체의 제조 수율 및 효율을 현저히 향상 시킬 수 있다는 점에서 우수성을 갖는다. 또한, 본 발명의 복합체는 체내 단백질 분해효소에 대한 내성이 향상되어, 우수한 체내 반감기를 갖는다.
이러한 측면에서 본 발명은 또한 펩타이드-고분자 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
상기한 본 발명의 엑세나타이드 변이체 및 생체적합성 고분자, 그리고 이를 포함하는 복합체에 대한 내용은 중복된 설명을 피하기 위해서 기재를 생략할 뿐 제조방법에 그대로 준용될 수 있다.
본 발명의 제조방법은 본 발명의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드와 생체적합성 고분자의 반응 몰비는 1 : 1 내지 3일 수 있고, 바람직하게는 1 : 1 내지 2의 몰비로 반응시키는 것을 포함한다. 상기 펩타이드와 고분자의 반응은 EDTA를 포함하는 완충액에서 수행될 수 있고, 상기 완충액은 pH 6.5 내지 8.0 일 수 있다. 상기 범위를 만족해서 반응시키는 경우, 펩타이드-고분자 복합체의 제조 수율을 높일 수 있다.
본 발명의 제조방법은 상기 반응 혼합물로부터 양이온 교환 크로마토그래피를 이용해서 목적하는 펩타이드-고분자 복합체를 분리 및 정제하는 것을 포함한다. 본 발명의 펩타이드-고분자 복합체의 제조방법은 기존의 엑세나타이드에서 K12C 또는 K27C 변이를 갖는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드를 이용함으로써 부위특이적이고, 안정적이면서 친환경적인 방법으로 복합체의 제조가 가능하고, 제조된 복합체의 분리 및 정제가 매우 용이하다는 점에 기술적 특징이 있다.
특히, 본 발명의 제조방법은 펩타이드와 생체적합성 고분자를 반응 시켜 복합체를 형성하는 단계에서 유기용매를 사용하지 않고, 수용성 완충액을 이용할 수 있다는 점에 기술적 특징이 있다. 상기 수용성 완충액은 종래 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 사용되는 완충액이라면 그 종류에 한정되지 않고 사용할 수 있다. 바람직하게는 EDTA를 포함하는 완충액을 사용할 수 있다.
일 예로, 상기 수용성 완충액은 인산 나트륨 완충액(sodium phosphate buffer; SPB), 인산 완충식염수(phosphate buffer saline; PBS), Tri HCl 완충액 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 완충액일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기와 같이, 반응용매로 수용성 완충액을 이용하는 경우 유기용매에 의한 독성으로 펩타이드가 변성되는 문제를 해결할 수 있고, 펩타이드-고분자 복합체 제조 이후 유기용매를 제거하는 과정을 생략할 수 있어, 복합체 및 제조방법 측면에서 매우 유리하다.
또한, 본 발명은 펩타이드-고분자 복합체를 분리정제 하는 과정에서도 유기용매의 이동상 대신 수용성 용매를 사용할 수 있어, 친환경 적이고, 분리정제가 용이하다는 특징을 갖는다.
특히, 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피에 이용될 수 있는 이동상 용매(용출 완충액)는 염화나트륨을 포함하는 수용액, 또는 완충액 일 수 있다. 상기 이동상 용매(용출 완충액)에서 염화나트륨의 농도에 따라 정전기 결합을 해리시켜 펩타이드-고분자 복합체를 해리시키는 바, 상기 이동상 용매의 염화나트륨의 농도는 구체적인 크로마토그래피 조건에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 엑세나타이드 변이체를 이용한 고분자 복합체의 제조방법은 유기용매를 사용하지 않고 제조하고자 하는 복합체의 분리를 용이하게 할 수 있다는 점에서 매우 우수하다.
본 발명의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 엑세나타이드 변이체 및 생체적합성 고분자를 포함하는 복합체는 단백질 분해효소인 트립신에 대한 저항력이 엑세나타이드 단량체 대비 약 50배 이상 향상되는 효과를 가짐을 실험적으로 확인하였고, 종래의 엑세나타이드 대비 생체 반감기도 매우 향상됨을 확인하였다. 또한, 본 발명의 제조방법을 이용하는 경우 복합체의 제조 수율이 95% 이상임을 구체적인 실시예로 확인하였는바, 이하 실시예를 통해서 보다 상세하게 설명한다.
하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] 엑세나타이드 ( Exenatide ) 변이체 합성
엑세나타이드의 Lys12을 시스테인으로 점변이 시킨 변이체 K12C와 Lys27을 Cys로 점변이 시킨 변이체 K27C를 화학적 합성 방법으로 생성하였다. 두 변이체 모두 분자량은 4,162 Da 이었다.
합성된 두 엑세나타이드 변이체의 아미노산 서열은 하기와 같다:
K12C 변이체: HGEGTFTSDLSCQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2
K27C 변이체: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLCNGGPSSGAPPPS-NH2.
[ 실시예 2] 부위특이적 페길화(PEGylation)를 통한 펩타이드 -고분자 복합체 제조
선형 구조의 PEG-MA(PEG maleimide, 분자량 10k Da)을 사용하여 변이체 중간의 시스테인 잔기와 말레이미드 사이의 공유결합을 유도하였다. 실시예 1에서 제조한 엑세나타이드 변이체와 PEG-MA를 각각 10 mM EDTA가 함유된 10 mM PBS 완충액(pH 7.0)에 녹인 후, 엑세나타이드 변이체와 PEG-MA의 몰 비율을 1: 1.5로 하여 혼합시킨 후 상온에서 16시간 이상 반응시켰다.
도 1a 및 1b에 나타낸 바와 같이, 반응 결과를 SDS-PAGE와 PEG 염색을 통해 분석한 결과, 부위특이적 공유결합 반응의 반응 수율은 95% 이상으로 매우 높았다.
[ 실시예 3] 엑세나타이드 변이체 - PEG 복합체의 분리정제
Hi-TrapTM SP-HP 레진(GE Healthcare 사에서 구입)으로 충진된 양이온교환 크로마토그래피를 이용해 상기 실시예 2에서 제조한 엑세나타이드 변이체-PEG 복합체와 미반응 PEG-MA를 분리하였다. 평형버퍼(완충액 A)는 10 mM 시트르산을 포함하며, pH 3.0 이었고, 레진에 결합된 복합체의 용출을 위해 완충액 B(100%에서 10 mM 시트르산 및 1M 염화나트륨 포함, pH 3.0)를 0%에서 60%의 선형 구배로 주입하였다. 상온에서 유속은 1 ml/min 이었고, 용출액 내 복합체는 280 nm 자외선 흡광도를 이용하여 검출하였다.
도 2를 참고하면, 첫 번째 피크(#1 peak)는 반응하지 않은 PEG-MA이고, 두 번째는 모노-페길화된 엑세나타이 변이체-PEG 복합체이다. K12C-PEG의 피크(#2 peak)는 22% 완충액 B(또는 0.22 M NaCl)에서 용출되었고, K27C-PEG의 피크(#3 peak)는 33% 완충액 B(또는 0.33 M NaCl)에서 용출되었다. 100% 완충액 B(1 M NaCl)에서 극소량의 미반응 엑세나타이드가 용출되었는데, 이는 실시예 2의 페길레이션 반응이 거의 100% 완료됨을 의미한다.
SDS-PAGE와 PEG 염색 결과, 도 2c와 2d에 나타낸 바와 같이, 두 변이체의 모노-페길화 반응 수율이 매우 높은 것을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 4] 엑세나타이드 변이체 - PEG 복합체의 생활성 ( bioactivity ) 확인
경쟁적 효소 ELISA 테스트로 면역 반응성을 측정한 결과, 원형의 엑세나타이드 단량체와 비교해 보았을 때, 엑세나타이드 변이체 및 엑세나타이드 변이체-PEG 복합체 모두에서 면역 반응성에 큰 차이가 없음을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 엑세나타이드 변이체와 엑세나타이드 변이체-PEG 복합체에서도 면역반응성은 이 잘 유지됨을 알 수 있다.
펩타이드 종류* ELISA에 의한 농도 (㎍/ml) Ratio
Exenatide (원형) 0.66 ± 0.11 100%
K12C 0.73 ± 0.04 110%
K27C 0.86 ± 0.24 130.3%
K12C-PEG 0.80 ± 0.28 121.2%
K27C-PEG 0.88 ± 0.15 133.3%
*모든 펩타이드의 농도는 모두 동일함: 1 ㎍/ml(Bradford 분석법에 의함)
또한, 각 펩타이드에 대해서 단백질 분해효소 일종인 트립신(trypsin)에 대한 저항성을 측정하였다. 트립신(1 mg/ml)을 10 mM PBS(pH 7.4)에 37℃에서 30분간 녹인 후 동일한 부피(100 ㎕)의 트립신 용액에 0.5 mg/ml의 엑세나타이드(원형) 단량체; K12C-PEG 10kD 복합체; 또는 K27C-PEG 10kD 복합체 각각을 섞고 37℃에서 배양하였다. 반응을 종결하기 위해 100 ㎕의 정지 용액(0.1% TFA 함유된 탈이온 증류수)를 넣어 주었다. 엑세나타이드의 분해 현상은 RP-HPLC(Shim-pack GIS-ODS) 컬럼을 통해 0.5, 1, 2, 3, 5, 10, 30, 60분 마다 분석하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 엑세나타이드 변이체-PEG 복합체(즉, 모노-페길화된 엑세나타이드 변이체)인 K12C-PEG와 K27C-PEG 각각은 모두 엑세나타이드 단량체와 비교 시 안정성이 약 50배 증가함을 보였다. 따라서, 본 발명에 따른 엑세나타이드 변이체와 PEG 고분자 복합체를 형성하는 경우 더욱 우수한 체내 안정성을 얻을 수 있음을 알 수 있다.
[ 실시예 5] 엑세나타이드 ( Exenatide )- PEG 복합체의 생물학적 활성(bioactivity) 평가
엑세나타이드 리간드가 GPCR(G-protein coupled receptor)에 결합할 때, 일련의 두 번째 메신저가 활성화되어 세포 신호에 반응한다. Gαs 수용체는 아데닐산고리화효소(adenylate cyclase)를 자극하고 다음으로 ATP에서 cAMP로 촉매하여, 인슐린의 분비를 유도할 수 있다. 이를 이용해서, 펩타이드의 활성을 확인하기 위해 엑세나타이드 변이체와 엑세나타이드-PEG 복합체의 생물학적 활성은 cAMP Hunter Exendin-4 Bioassay Kit(DiscoverX Corporation, Fremont, CA, USA)를 이용해서 측정하였다.
상기 키트에 포함된 CHO 세포를 96-well 플레이트에서 30시간 동안 배양하였다. 아스피레이션(aspiration) 후에, 상기 플레이트를 다양한 농도(10-7 내지 10-12 M)의 엑세나타이드(원형), K12C-PEG 10kD, 또는 K27C-PEG 10kD와 함께 상기 세포를 인큐베이션하였다. 각 농도 별 신호는 발광 플레이트 리더기(luminescence plate reader; Biotek SynergyTM MX Microplate Reader)로 측정하였다. 키트의 cAMP의 표준 농도를 기준으로, 로지스틱 함수 피팅 소프트웨어(logistic function fitting, Origin Pro 8)을 이용하여 엑세나타이드 및 엑세나타이드 변이체-고분자 복합체 처리시 각각의 cAMP 농도를 분석하였다. GLP-1 수용체에 결합하는 능력으로서 약물의 효과를 나타내는데 필요한 양을 의미하는 역가(potency, EC50)와 약물의 최대 효과를 의미하는 유효성(efficacy)를 각각 측정하여 표 2 및 도 4에 나타내었다. 유효성은 약물의 농도 10-8 M에서 측정하였다. 상기 실험을 3번 반복해서 수행하였고, 결과는 평균±SEM로 나타내었다.
펩타이드 유형 EC50 (M) 유효성(nM)
Exenatide (원형) 8.6x10-10 22.8 ± 5.9
K12C-PEG 2.0x10-11 16.9 ± 5.8
K27C-PEG 5.3x10-11 15.0 ± 1.6
상기 표 2 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 엑세나타이드 변이체-고분자 복합체 K12C-PEG와 K27C-PEG가 각각 원형-엑세나타이드 대비 각각 42.3배와 16.3배 증가된 역가(EC50)를 가졌으며, cAMP 생성 효과를 나타내는 유효성(efficacy)은 각각 74%와 65%이었다. 따라서 엑세나타이드-고분자 복합체가 더욱 개선된 수용체 결합능력을 갖는 것을 의미한다.
[ 실시예 6] PEG 사슬 길이에 따른 효과 확인
엑세나타이드-PEG 복합체에서 PEG 분자량의 영향을 조사하기 위하여 실시예 1에서 제조한 엑세나타이드 변이체와 5, 10, 20 또는 40 kD의 PEG 고분자를 이용해서 복합체를 제조하였다.
엑세타나이드 펩타이드와 5, 10, 20 또는 40kD PEG 각각을 10mM EDTA가 함유된 10mM PBS 완충액(pH 7.0)에 녹인 후, 펩타이드: PEG의 몰 비율이 1:1.3이 되도록 실온에서 혼합하여, 16시간 동안 놓아두고 페길레이션하였다. PEG 사슬의 분자량에 따른 복합체의 활성변화를 확인하기 위해서 실시예 5와 동일한 방법으로 CHO세포에서 방출되는 cAMP의 생성량을 측정하였다. 유효성은 약물의 농도 5x10-8 M에서 측정하였다. 상기 실험을 2번 반복해서 수행하였고, 데이터는 평균±SEM로 나타내었다.
종류 EC50 (M) 유효성(Efficacy) (nM)
K12C-PEG 5kD 5.5x10-11 18.3 ± 1.4
K12C-PEG 10kD 1.1x10-10 20.9 ± 1.7
K12C-PEG 20kD 3.9x10-11 19.5 ± 1.8
K12C-PEG 40kD 1.2x10-10 28.5 ± 2.0
표 3 및 도 5에 나타낸 바와 같이, PEG의 분자량이 증가함에 따라 유효성이 증가하고, 역가(EC50)는 감소하는 경향을 보였으나 그 차이는 2배 미만으로 유의한 차이라고 볼 수 없는 미미한 정도였다. 그 이유는 PEG의 분자량이 증가할수록 더 많은 수의 아미노산을 차폐함으로써 펩타이드-PEG 복합체와 수용체 사이의 친화력을 감소시키기 때문인 것으로 사료된다. 그러나, PEG 40kD 복합체는 10kD 또는 20kD PEG 복합체와 비교해서 cAMP 반응을 나타내는 유효성이 가장 우수함을 알 수 있다.
[ 실시예 7] 호모다이머 페길화(HOMODIMER PEGYLATION)를 통한 동종이량 복합체의 제조
두 분자의 K12C와 이관능성(bifunctional) PEG 말레이미드(MA-PEG-MA, 10kD)를 10mM PBS 완충액(pH 7.0)에 용해시켰다. 엑세나타이드 변이체 : MA-PEG-MA의 몰비율이 2:1이 되도록, K12C(1mg/ml)를 가볍게 교반하면서 천천히 첨가하였다. 상기 반응을 실온에서 16시간 동안 수행하여 동종 이량체 형태의 펩타이드-고분자 복합체를 제조하였다. 복합체가 잘 제조되었는지 확인하기 위해서, 0% 내지 40%의 완충액 B의 선형 구배 용출을 통해서 얻은 용출 크로마토그램(HiTrap SP)을 통해서 결과물을 분석하였다.
그 결과, 도 6에서와 같이 각각의 양이온 교환 컬럼에서 3개의 피크가 나타났고, 각 피크의 분획을 수득하여 질량 분석을 한 결과 피크 #1은 미반응 PEG, 피크 #2는 모노 K12C-PEG 복합체(모노 페길화된 복합체) 그리고 피크 #3이 동종이량 복합체(K12C-PEG 10kD-K12C)임을 확인하였다. 이러한 용출 순서는 위에서 설명한 이론과도 관련이 있는데, 모노 페길화된 복합체가 먼저 용리되고, 이어서 하나의 PEG 분자에 두 개의 펩타이드가 컨쥬게이트된 동종이량 복합체가 용리된다. 또한, K12C 엑세나타이드 변이체의 피크 #2 및 피크 #3의 분자량을 질량분석장치(MALDI-TOF MS)로 측정하고 피크 #2 및 피크 #3의 질량스펙트럼을 도 7a 및 7b에 나타내었다. 피크 #2는 모노-페길화된 K12C-PEG 복합체(15141Da)와 이량체 (19208Da)를 함유하고, 피크 #3에서 주요 피크를 나타내는 것은 동종이량체 K12C-PEG 10kD-K12C(19262Da)였다. 모든 실험의 질량-대-전하(m/z) 비율이 계산된 값과 거의 일치했다.
엑세나타이드(원형)에 대한 단량체 형태 및 동종 이량체의 펩타이드-PEG 복합체의 상승효과를 확인하기 위해서, 실시예 5와 동일한 방법으로 CHO 세포에서의 cAMP 생성 방출을 측정하였다. 유효성은 약물의 농도 10-8 M에서 측정하였다.
종류 EC50 (M) 유효성 (nM)
원형 엑세나타이드 6.1x10-10 24.4 ± 1.0
K12C-PEG 10kD 6.6x10-11 20.5 ± 0.7
K12C-PEG 10kD-K12C 4.4x10-11 19.8 ± 0.8
도 8 및 표 4로부터, EC50 값(GLP-1 수용체에 결합하는 능력)은 동종이량체(homodimer) K12C-PEG 10kD-K12C가 단량체(monomer) K12C-PEG 10kD와 비교하여 수용체 결합 능력이 1.5배, 원형 엑세나타이드와 비교해서 약 14배 향상된 것을 확인하였다. cAMP 생산 능력의 지표인 유효성(efficacy) 측면에서 모든 복합체는 생체 활성(bioactivity)이 원형의 엑세나타이드 단량체보다 낮았으나, 유의한 차이는 아니었다.
[ 실시예 8] IN VIVO 약물동력학 ( PHARMACOKINETICS ) 확인
누드마우스 모델(BALB/c; 수컷, 5주령; 오리엔트바이오사에서 구입)과 IVIS Lumina XRMS (Perkin Elmer 사)를 이용하여 형광 이미징 분석을 이용해서, 엑세나타이드, 엑세나타이드 변이체(K12C) 및 엑세나타이드 변이체-PEG 복합체의 생체 내 안정성(지속성)을 확인하였다.
1 mg/ml의 엑세나타이드(원형); 엑세나타이드 변이체(K12C); K12C-PEG 5kD 복합체; 및 K12C-PEG 10kD-K12C 복합체 각각을 50 mM 붕산 완충액(pH 8.77)에서 35℃, 차광 조건에서 16시간 동안 지속적으로 저어 주면서 5 mol 몰당량의 Flamma® 675 비닐술폰으로 표지 하였다. 다음, 혼합물을 PD MiniTrap® G-25(USA) 탈염칼럼으로 정제하고, 10 mM PBS 완충액(pH 7.4)으로 버퍼 교환하였다. 펩타이드-염료 컨쥬게이션의 농도는 제조자의 방법에 의해 결정되었다. 각 샘플을 누드 마우스에 피하 주사(s.c: subcutaneous) 하였다. 주입 후 0, 1, 2, 4, 8, 24 및 48 시간에, 전신 형광을 생체 내 이미징 시스템(IVIS; IVIS Lumina XRMS, Perkin Elmer, USA)를 이용해서 675nm의 여기(excitation) 파장과 691nm의 방출(emission) 파장에서 시각화 하였다.
또한, 종래의 엑세나타이드의 C 말단에 시스테인 잔기를 추가해서 PEG (40kD)와 결합시킨 선형의 펩타이드-고분자 복합체를 대조군으로 하여, 본 발명의 가지 형태(branched form)의 복합체와 동일한 방법으로 약물동력학을 확인하였다(C40-PEG 40kD 복합체).
단백질-염료 접합체(conjugate)의 정량 또는 염료와 단백질의 비율(ratio)은 UV-Vis 분광 광도계에 의한 흡광도 측정에 기초하여 별도로 측정된 단백질 또는 단백질-형광 접합체의 몰 농도에 의하여 계산되었다. 흡광도 측정에 의한 단백질-염료 접합체의 정량결과는 표 5에 나타내었다.
종류 A280 A675 단백질 농도(mM) 염료/단백질 비
엑세나타이드(원형) 1.633 2.170 0.261 0.038
K12C 1.260 1.983 0.192 0.046
K12C-PEG 5kD 0.816 2.189 0.113 0.088
K12C-PEG 40kD 0.567 2.050 0.0695 0.134
C40-PEG 40kD 0.651 2.055 0.0847 0.110
K12C-PEG 10kD-K12C 0.477 1.787 0.0575 0.141
A280 = 280nm에서 흡광도
A675 = 플라마(Flamma) 염료의 670nm에서 흡광도(염료분자에 대한 최대 파장 λmax)
Figure 112018008344079-pat00001

Figure 112018008344079-pat00002

CF = 보정계수, 280nm에서 염료에 의한 흡광도를 조정; CF = 0.09
ε = 단백질 몰 흡광 계수; ε= 5500
ε'= 형광 염료의 몰 흡광 계수(molar extinction coefficient); (ε'= 220,000)
누드 마우스에서 엑세나타이드(원형)과 엑세나타이드 변이체-PEG 복합체의 방출을 추적하기 위해 비 침습적 이미징을 수행했다. 누드 마우스의 등(back)에 주사 후 강한 NIR 형광이 검출되었다. 형광 신호는 다음의 [식 1]에 따라 정규화 되었다:
[식 1]
Figure 112018008344079-pat00003
각 샘플의 반감기를 계산하기 위해, 단일 투여량을 투여 한 후 형광 신호를 하기 식 2에 적용하여 계산하였다:
[식 2]
Ct = C0 e - kt
상기 식 2에서 Ct는 t 시간 이후의 형광 신호의 강도이고, C0는 초기의 형광 신호 강도(t = 0)이며, k는 제거율 상수이다.
제거율 상수와 반감기(t1/2) 사이의 관계를 다음 식 3에 나타내었다:
[식 3]
Figure 112018008344079-pat00004
누드 마우스에서 측정된 형광 강도(Flamma VS 675 염료)값을 상기 식에 따라 정규화한 각 시료의 반감기를 표 6에 나타내었다. 펩타이드 또는 펩타이드-고분자 복합체의 주입 후 1 시간 후에 모든 시료에서 형광 신호가 증가하여, 1 시간 이후의 형광은 0 내지 100% 사이에서 정규화되었다.
종류 반감기 결정계수(Coefficient of determination)- R2
엑세나타이드(원형) 1.6 h 0.969
K12C 2.5 h 0.985
K12C-PEG 5kD 1.7 h 0.977
K12C-PEG 40kD 5.5 h 0.996
C40-PEG 40kD 5.1 h 0.986
K12C-PEG 10kD-K12C 2.1 h 0.980
표 6, 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 엑세나타이드(원형)은 주사 후 2시간 이내에 사라졌다. 이것은 K12C-PEG 5kD 복합체와 유사했다. 따라서, PEG 5kD 의 작은 분자량(MW) 고분자와 복합체를 형성하는 경우, 반감기를 증가시키는 효과가 미미한 것을 알 수 있다. 그러나 K12C-PEG 40kD 복합체와 C40-PEG 40kD는 반감기가 5 시간 이상으로 연장된 되었는바, 이는 원형-엑세나타이드 대비 반감기가 약 3.5배 증가된 것으로 반감기 증가에 현저한 효과를 가짐을 알 수 있다. 동종 이량체 K12C-PEG 10kD-K12C의 경우도 그 효과가 미미하나 반감기가 엑세나타이드 원형보다는 증가된 것을 확인하였다. 반감기의 연장 효과가 미미한 이유는 동종 이량체 K12C-PEG 10kD-K12C의 분자량이 약 19kD으로 여전히 20 kD보다 낮아 신장여과에 의하여 비교적 쉽게 제거되기 때문인 것으로 예상된다. 그러나, 동종 이량체의 경우 반감기에 있어서는 약간의 증가만 보였으나, 유효성에 있어서 더욱 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, PEG 40kD 고분자와의 복합체 및 동종 이량체 형태의 복합체는 효능 또는 연장된 반감기 덕분에 엑세나타이드 투여 횟수를 줄이는 효과적임을 확인하였다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> NOVEL EXENATIDE VARIANTS-POLYMER COMPLEX <130> P18U22C0073 <150> KR 10-2017-0011919 <151> 2017-01-25 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A variant of Exenatide <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Cys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A variant of Exenatide <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Cys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exenatide sequence <400> 3 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35

Claims (12)

  1. 서열번호 3의 아미노산 서열에서 12번째 라이신이 시스테인으로 치환(K12C)된 펩타이드; 및 생체적합성 고분자로서 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 포함하는 펩타이드-고분자 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드-고분자 복합체는 생체적합성 고분자 1개 분자당 상기 펩타이드 2개 분자를 포함하는 이량체(dimer)인, 펩타이드-고분자 복합체.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 생체적합성 고분자가 상기 펩타이드에서 12번째 아미노산인 시스테인(Cys)에 결합된 것인, 펩타이드-고분자 복합체.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 5kD 초과 내지 50kD 이하의 분자량을 갖는 것인, 펩타이드-고분자 복합체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 복합체는 펩타이드의 시스테인 잔기와 고분자의 말레이미드 잔기 사이의 공유결합으로 연결된 것인, 펩타이드-고분자 복합체.
  8. 서열번호 3의 아미노산 서열에서 12번째 라이신이 시스테인으로 치환(K12C)된 펩타이드;와 생체적합성 고분자로서 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 1 : 1 내지 3의 몰 비율로 혼합하여 반응시키는 것; 및
    상기 반응 혼합물로부터 양이온 교환 크로마토그래피를 이용해서 목적하는 펩타이드-고분자 복합체를 분리 및 정제하는 것을 포함하는, 펩타이드-고분자 복합체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 혼합반응은 인산 나트륨 완충액(sodium phosphate buffer; SPB), 인산 완충식염수(phosphate buffer saline; PBS), Tri HCl 완충액 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 수용성 완충액 내에서 수행되는 것인, 펩타이드-고분자 복합체의 제조방법.
  10. 삭제
  11. 제8항에 있어서,
    상기 양이온 교환 크로마토그래피는 염화나트륨을 포함하는 이동상 용매를 이용해서 수행하는 것인, 펩타이드-고분자 복합체의 제조방법.
  12. 서열번호 3의 아미노산 서열의 엑세나타이드 펩타이드에서 12번째 라이신이 시스테인으로 치환(K12C)된 변이를 포함하는 엑세나타이드 변이체.
KR1020180008749A 2017-01-25 2018-01-24 신규 엑세나타이드 변이체-고분자 복합체 KR102039493B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20170011919 2017-01-25
KR1020170011919 2017-01-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180087864A KR20180087864A (ko) 2018-08-02
KR102039493B1 true KR102039493B1 (ko) 2019-11-04

Family

ID=63251661

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180008749A KR102039493B1 (ko) 2017-01-25 2018-01-24 신규 엑세나타이드 변이체-고분자 복합체

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102039493B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150374840A1 (en) * 2010-07-19 2015-12-31 Amidebio, Llc Modified peptides and proteins

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150374840A1 (en) * 2010-07-19 2015-12-31 Amidebio, Llc Modified peptides and proteins

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180087864A (ko) 2018-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5431874B2 (ja) ポリエチレングリコール−ｇｒｆ結合体の部位特異的調製方法
KR101352225B1 (ko) 신규한 엑센딘 변형 및 이들의 콘쥬게이트
JP5325884B2 (ja) ポリエチレングリコール化インターフェロンα２ｂならびにその製造方法および使用
EP2233504B1 (en) An erythropoietin mimetic peptide derivatives and its pharmaceutical salt, the preparation and uses thereof
Esposito et al. PEGylation of growth hormone-releasing hormone (GRF) analogues
JP2009503111A (ja) Ｇ−ｃｓｆ部分および重合体の複合体
KR100694994B1 (ko) 사람 과립구 콜로니 형성인자 동종체
AU2012237899A1 (en) Site-directed mono-substituted PEGylated Exendin analog and preparation method therefor
KR100507796B1 (ko) 생체내 반감기가 증가된 ｐｅｇ-생리활성 폴리펩티드 동종이량체 결합체 및 이의 제조방법
KR101483814B1 (ko) 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 인터페론 알파 2ａ, 이의 합성 방법 및 용도
KR20110014564A (ko) 이중-가닥 폴리에틸렌 글리콜-수식된 성장 호르몬, 이의 제조 방법 및 용도
Behi et al. Optimization of PEGylation reaction time and molar ratio of rhG-CSF toward increasing bioactive potency of monoPEGylated protein
KR102039493B1 (ko) 신규 엑세나타이드 변이체-고분자 복합체
KR101104574B1 (ko) 폴리에틸렌글리콜로 화학적으로 수식된 인간 성장 호르몬, 이의 제조방법 및 용도
KR100888371B1 (ko) 가지 달린 고분자 유도체와 인터페론 결합체를 포함하는 항바이러스제

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant