KR101352225B1 - 신규한 엑센딘 변형 및 이들의 콘쥬게이트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 엑센딘 변형 및 그 위에 폴리머를 콘쥬게이트하는 엑센딘 변형 콘쥬게이트, 이를 포함한 약학적 조성물 및 질병 치료, 예를 들면 혈당 저하, 당뇨병, 특히 타입 2 당뇨병의 치료에 이들의 사용을 제공한다. 본 발명은 체중 저하용 엑센딘 콘쥬게이트의 사용을 제공한다.

Description

신규한 엑센딘 변형 및 이들의 콘쥬게이트{Novel Exendin variant and conjugate thereof}
본 발명은 신규한 엑센딘 변형, 폴리머와 이들의 콘쥬게이트, 및 이들을 함유한 약학적 조성물, 또한 혈당 저하, 특히 당뇨병 (특히 타입 2 당뇨병) 치료시에, 엑센딘 변형, 콘쥬게이트 및 약학적 조성물의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 체중 감소시에 엑센딘 콘쥬게이트의 사용에 관한 것이다.
사회개발, 수명 연장 및 라이프스타일 변화에 따라서, 당뇨병은 전세계에서 주요한 건강문제 중 하나가 되었다. 선진국 및 개발도상국에서 당뇨병의 치사율은 빠르게 증가하고 있다. 2007년에 전세계에는 약 246,000,000 당뇨병 환자가 있고, 전세계에서 10초마다 한 명의 당뇨병 환자가 죽는다. 전세계에서 당뇨병 환자의 인구는 2025년까지 333,000,000에 도달할 것이다. 중국은 당뇨병이 심각한 지역이 되었다. 중국에서, 당뇨병 환자의 인구는 현재 40,000,000이고, 이는 세계에서 제 2위이고(제 1 위는 인도이다), 치사율은 약 5%이다. 당뇨병은 2개의 형태를 포함하는데: 하나는 인슐린-의존 당뇨병(타입 1 당뇨병)이고 다른 하나는 비-인슐린-의존 당뇨병(타입 2 당뇨병)이다. 이들 중에서, 타입 2는 당뇨병의 90% 초과에 기여한다. 타입 2 당뇨병은 인슐린 분비 또는 작용 실조 또한 β-세포 기능장애에 의해서 지질, 탄수화물 및 단백질 대사의 장애를 일으키는 것을 특징으로 한다. 만성적 고혈당을 일으키고 결국 미세혈관, 거대혈관 및 각종 기관에서 합병증을 유발한다. 현재, 당뇨병을 조절하기 위한 2종류의 약이 있는데: 1) 인슐린 분비 촉진제, 예를 들면 설포닐우레아, 메글리티나이드, 및 디펩티딜 펩티다아제 저해제, GLP-1 유사체; 및 2) 비-인슐린-분비 촉진제, 예를 들면 인슐린, α-글루코시다아제 저해제, 비구아나이드, 티아졸리딘디온 및 인슐린 유사체이다. 현재, 임상에서 일반적으로 사용된 대부분의 항-당뇨병 약물은 타입 2 당뇨병에 덜 효과적이다. 이들은 췌장 β-세포의 진행 손상을 정지시켜서 혈액내 HbAlc의 수준을 감소시키고 당뇨병 합병증, 예를 들면 심장병 및 신부전을 방지하지 못한다. 따라서, 타입 2 당뇨병의 치료에 대한 새로운 약물을 연구할 필요성이 있다.
1985년에 장 호르몬, 글루카곤 펩티드-1 (GLP-1)가 발견되었다. GLP-1는 섭취 후 프로글루카곤 유전자에 의해서 발현되고 장 점막에서 L세포에 의해서 주로 분비된다. GLP-1는 췌장 섬 β 세포를 자극해서 인슐린을 분비하고(J Med Chem, 47, 4128-4134, 2004), 및 혈당 수준을 안정화하는 데에 중요한 역할을 한다. GLP-1 투여에 의해서 타입 2 당뇨병 환자의 혈당을 정상 수준으로 조절할 수 있다(Diabetes Care, 15, 270-276, 1992; Lancet, 359, 824-830, 2002; Endoer. Rev, 16, 390-410, 1996; Diabetologia, 28, 565-573, 1985). GLP-1은 다음과 같이 기능한다: 인슐린 유전자의 전사를 촉진시키고 인슐린 생합성 및 분비를 증가시키기 위한 췌장섬 β-세포에 글루코스-의존 작용; 췌장섬 β-세포의 양을 증가시키기 위한 β-세포의 증식 및 분화를 자극하고 β-세포의 아포토시스를 억제하는 것; 글루카곤 분비 억제; 주변 세포에서 인슐린 수용체의 감도를 증가시키는 것; HbAlc 수준을 저하시키는 단계; 식욕 및 섭취 억제; 위내용물 배출 지연(Diabetic Med, 18, 144-149, 2001; Diabetes, 51, 1443-1452, 2002; Diabetologia, 45, 1263-1273, 2002; Diabetes, 50, 525-529, 2001; Diabetes, 50, 725, 2001; Diabetes, 52, 365-371, 2003; Recent Prog. Hormne Res. 56, 377-399, 2001; Disbetologia, 39, 1546-1553, 1996; Am. J. Physicl Endocrinol. Metab, 281, E242-247, 2001; U.S. patent 477967, 478017, 478425; Diabetes Care, 22, 403-408, 1999; J. Clin. Endocrinology and Metabolism, 88, 3082-3089, 2003; Diabetes, 44, 1295, 1995). 그러나, GLP-1은 체내에서 디펩티딜 펩티다아제(DPP IV)에 의해서 쉽게 열화되고, 2분 미만의 반감기를 가지므로, 유효한 항당뇨약으로 사용될 수 없다.
엑센딘-4는 Arizona and New Mexico of the United States에서 서식하는 길라 몬스터, 유독한 도마뱀의 타액에서 발견된 폴리펩티드이다(J. Biol. Chem, 265, 20259-20262, 1990; J. Biol. Chem, 267, 7402-7405, 1992). 엑센딘-4는 GLP-1 (7-36)과 높은 이형동원성을 갖는다(53%). 엑센딘-4는 GLP-1 수용체와 결합하고, GLP-1과 유사한 약리적인 아고니스트 효과를 나타낸다. 예를 들면 인슐린의 합성을 증가시키고, 글루코오스-의존과 같이 인슐린 분비를 촉진하고; β-세포의 양을 증가시키기 위해서, β-세포의 증식 및 재생을 자극하고 β-세포의 아포토시스를 저해하고; 글루카곤의 분비를 저해하고; 심각한 저혈당증을 유발하는 일없이 글리코겐의 발생을 억제하고; 섭취 후 위장의 운동성 및 분비를 억제하고; 식욕감소 및 음식물 섭취량을 감소시키고; 신경세포를 보호한다(Nat. Biotech, 23, 857-861, 2005; J. Biol. Chem., 266, 2897-2902, 1991; J. Biol. Chem., 266, 21432-21437, 1992; Diabetes, 44, 16-19, 1995; Nature, 379, 69-72, 1996). 인슐린 분비를 촉진시키고 섭취 후 글루카곤 분비 억제하기 위한 엑센딘-4의 효과는 혈당에 의존하고, 이는 현재 사용되는 설포닐우레아에 비해서 바람직하고, 특히 엑센딘-4는 저혈당증 유발에 덜 민감하고, 혈당 조절주기를 감소시키고 체중을 저하시킨다. Amylin 및 Eli Lilly에 의해서 함께 개발된 b.i.d(1일 2회)의 엑센딘-4 (엑세나타이드, Byetta로서 시판) 제제는 미국 및 유럽 시장에서 승인된다(U.S. patent 5,424,286, 6,858,576, 6,872,700, 6,902,744, 6,956,026, 7,297,761). 이와 같이, 이러한 형태의 약물은 전세계에서 비만 및 당뇨병 치료에 널리 사용되고 있다.
약학적 폴리펩티드는 체내에서 짧은 반감기 및 열화된 물리적 및 화학적 안정성을 갖고 다양한 프로테아제에 의해서 열화되기 쉽기 때문에 매일 다회 요법(multiple injections daily)을 필요로 한다. 엑세나타이드는 s.c 주사로서 1일 2회(b.i.d) 사용하고, 이는 환자에게 육체적, 심리적 및 경제적으로 심각한 부담을 주므로 환자의 준수를 제한한다. 따라서, 현재의 항당뇨약의 연구는 엑센딘-4의 혈장 반감기를 연장시키고 체계적인 약물 노출을 증가시키기 위해서 엑센딘-4를 구조적으로 변경하고 새로운 투여형태를 개발하는 데에 초점을 맞춘다.
폴리머 개질 방법은 1970년에 개발된 유력한 변경 방법으로, 페길화가 일반적인 방법이다. 이러한 방법은 단백질의 표면을 개질하기 위해서 PEG를 약학적 단백질에 화학적으로 콘쥬게이트하는 것이다. PEG 개질시에, 단백질의 분자량이 증가되고 신장의 여과율이 감소된다. 또한, 콘쥬게이트 PEG 사슬은 개질된 단백질 분자에 입체 장애를 일으켜서 혈관에서 프로테아제에 의한 단백질 가수분해를 저하시킨다. 따라서, 순환시에서 단백질의 체류를 효과적으로 연장시키고 혈장 반감기 및 체계적 약물 노출을 연장시켜서 효능을 개선시킨다.
현재, 페길화는 제 2 세대(second generation), 부위 특이적 페길화로 진행된다. 부위 특이적 페길화는 단백질에서 특정한 아미노산을 특이적으로 개질하는 데에 사용되어 랜덤한 개질을 방지할 수 있다. 이와 같이, 단백질에서 활성 중심의 구조는 덜 영향을 받고 특정한 항원 부위는 비-부위-특이성 페길화에 의해서 생물학적 활성 감소 및 불균일성 증가와 같은 문제점을 감소시킨다.
과학자들은 엑센딘-4의 폴리머 개질에 대한 일부 연구를 실시하였다. Young and Prickett (CN1372570A)은 엑센딘-4가 주로 신장 여과에 의해서 대사되는 것을 증명했다. 따라서, 이들은 500 내지 20,000 Dalton (Da)의 분자량을 갖는 PEG를 사용해서 엑센딘-4를 개질시켰다. Wenchao Bao, Hongjing Xu, Gang Yu, Yajun Zuo (CN101125207A) 는 20kDa 내지 50 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 사용해서 엑센딘-4에서 아미노산 개질을 실시했다.
그러나, 기존의 엑센딘-4 또는 이들의 변형 및 다양한 개질된 형태에서 높은 투여 주기에 따라서 환자에게 심각한 육체적, 심리적 및 경제적 부담을 일으키는 문제점을 갖는다. 이와 같이 환자의 준수를 제한하고, 이들 약물은 널리 사용될 수 없다. 따라서, 새로운 엑센딘-4-변형 및 폴리머에 의해서 개질된 변형을 필요로 한다.
이러한 점에서, 본 발명은 GLP-1 수용체 아고니스트의 활성을 갖는 엑센딘 변형을 제공하고, 야생형 엑센딘 서열과 비교해서 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된다. 엑센딘 변형에서 하나 이상의 아미노산이 선택적으로 결실되고, 첨가되고 및/또는 치환되고, 여기서 첨가 또는 치환에 의해서 포함될 아미노산은 천연 또는 비-천연 아미노산 또는 아미노산 유사체일 수 있다.
실시형태에서, 엑센딘 변형은 아미노산 서열을 갖는데, 야생형과 비교해서 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인 및 선택적으로 다른 아미노산에 의해서 치환된다.
엑센딘-4 서열
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 1), 또는
엑센딘-3 서열
His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 2), 또는 이들의 유사한 서열. 아미노산 치환은 각각 독립적으로 야생형 아미노산 서열의 N-말단, C-말단에 및/또는 그 내부 영역내에 위치된다.
바람직한 실시형태에서, 엑센딘 변형은 적어도 변형의 C-말단에서 시스테인 치환을 갖는다. 또한, 바람직하게 엑센딘 변형은 C-말단의 마지막 아미노산에서 시스테인 치환을 갖는다. 또한, 엑센딘 변형은 바람직하게 엑센딘-4 또는 엑센딘-3의 위치 20에서 Arg, 위치 25에서 Trp, 위치 35에서 Ala, 및 위치 39에서 Ser에 상응하는 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 위치에서 시스테인 치환을 갖는다.
또한 실시형태에서, 본 발명은 엑센딘 변형 콘쥬게이트를 제공하고, 하나 이상의 천연 또는 합성 폴리머 모이어티 (polymer moieties) (바람직하게 생리적으로 허용가능한 폴리머, 예를 들면 폴리알킬렌 글리콜, 보다 구체적으로 PEG)는 엑센딘 변형에 콘쥬게이트된다. 콘쥬게이트에 복합 폴리머 모이어티가 포함된 실시형태에서, 각각의 폴리머 모이어티는 동일하거나 그렇지 않다. 바람직하게, 폴리머 모이어티는 하나 이상의 시스테인을 통해서 엑센딘 변형에 콘쥬게이트된다. 실시형태에서, 폴리머 모이어티는 티오에테르 결합을 통해서 엑센딘 변형에 콘쥬게이트된다.
당업자에게 폴리머 모이어티와 함께 콘쥬게이트된 생분자에 있어서, 콘쥬게이트된 생분자는 생물학적 활성을 갖고, 이는 콘쥬게이트 모이어티의 분자량(예를 들면, 4kDa로부터 출발)이 증가함에 따라서 지수함으로적으로 감소된다(Bailon 등, 인터페론의 유력한, 지속적인 형태의 합리적인 설계, hepatitis C의 치료용 40 kDa 분기된 폴리에틸렌 글리콜-콘쥬게이트된 인테페론 α-2a, Bioconjugate Chem, 2001, 12:195-202; 폴리에틸렌 글리콜-콘쥬게이트된 그래뉼로사이트 콜로니 자극 요소 뮤테인(mutein)의 분자량과 활성기간 사이의 관계. 실험적인 혈액학, 1999, 27:425-32; Bailon et al. PEG-변경된 생물약제학. Expert Opin Deliv., 2009, 6:1-16). 당업자에게 콘쥬게이트 분자의 생물학적 반감기 및/또는 혈장 반감기 또한 전신 약물 노출은 콘쥬게이트 부분의 분자량이 증가함에 따라서 점진적으로 연장 또는 증가한다.
그러나, 본 발명자들은 놀랍게도 비콘쥬게이트된 엑센딘 변형에 비해서, 본 발명의 엑센딘 변형 콘쥬게이트 분자는 폴리머 모이어티의 분자량이 30 kDa까지 증가하더라도 여전히 대부분의 GLP-1 수용체 아고니스트 활성을 유지한다. PEG 부분의 분자량이 40 kDa 까지 증가하더라도, 본 발명의 엑센딘 변형 콘쥬게이트는 GLP-1 수용체 아고니스트의 실질적인 활성을 유지한다. 특히, 폴리머 모이어티의 분자량이 5kDa 내지 27kDa까지 증가하면, 엑센딘 변형 콘쥬게이트의 GLP-1 수용체 아고니스트 활성은 콘쥬게이트되지 않은 엑센딘 변형과 비교해서 실질적으로 동일하다.
따라서, 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 연장된 생물학적 반감기 및/또는 혈장 반감기를 갖는 엑센딘 변형 콘쥬게이트 및 GLP-1 수용체 아고니스트의 실질적인 활성을 제공한다.
일 실시형태에서, 폴리머는 폴리알킬렌 글리콜이고, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 특히 폴리프로필렌 글리콜을 포함한다. 하나 이상의 폴리머 모이어티는 임의의 적당한 분자량, 예를 들면 2 kDa 내지 50 kDa, 바람직하게 5 kDa 내지 30 kDa, 보다 바람직하게 20 kDa 내지 30 kDa, 예를 들면 21 kDa, 22 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 27 kDa, 28 kDa, 29 kDa, 및 30 kDa 또한 상기 분자량 사이의 임의의 값일 수 있다.
선택적으로, 엑센딘 변형 콘쥬게이트는 하나 이상의 다른 아미노산 잔기에서 동일하거나 그렇지 않은 하나 이상의 상기 폴리머와 함께 콘쥬게이트될 수 있다. 하나 이상의 다른 아미노산 잔기는 엑센딘 변형의 N-말단, C-말단 및/또는 그 내부 부분에서 독립적으로 위치될 수 있다.
본 발명에서, 콘쥬게이트 폴리머는 예를 들면 싱글 아암(arm), 더블 아암, 멀티 아암 및/또는 분기를 포함한 임의의 적당한 구성일 수 있고, 아암 또는 분기의 각각은 동일하거나 다를 수 있다.
본 발명은 상기 기재된 바와 같이 엑센딘 변형 콘쥬게이트의 제조 방법을 제공하는 것으로, 이는 엑센딘 변형을 폴리머와 접촉시키는 단계를 포함하고, 바람직하게 상기 폴리머는 반응성기와 접착시키거나 접촉시에 활성되어, 활성된 폴리머를 엑센된 변형의 하나 이상의 시스테인 잔기에 콘쥬게이트한다. 일 실시형태에서, 엑센딘 변형에서 시스테인은 특정한 활성화기 및 적당한 pH의 선택에 의해서 다른 길이의 폴리머 사슬을 갖는 PEG에 의해서 개질된다. 특별한 실시형태에서, 특정한 활성화기는 말레이미드기이다.
본 발명은 본 발명의 엑센딘 변형 및/또는 엑센딘 변형 콘쥬게이트를 포함한 약학적 조성물 또한 선택적으로 약학적으로 허용가능한 캐리어를 제공한다.
본 발명은 엑센딘 변형 및/또는 엑센딘 변형 콘쥬게이트 및/또는 본 발명의 약학적 조성물의 치료적 유효량을 그 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함한 질병을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 마찬가지로 본 발명은 질병을 치료하기 위한 약물 제조에 있어서 본 발명의 엑센딘 변형 및/또는 엑센딘 변형 콘쥬게이트 및/또는 약학적 조성물의 사용을 제공한다. 질병은 식후 덤핑 증후군(posprandial dumping syndrome), 식후 고혈당증, 내당능 장애, 글루카곤 분비 억제, 트리글리세라이드 수준 조절, 및/또는 음식 섭취량 저하에 의해서 완화될 수 있는 장애 또는 질병, 비만, 섭취장애, 인슐린 내성 신드롬, 당뇨, 고혈당 및 저혈당으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 질병은 당뇨병이다. 보다 바람직하게, 질병은 타입 1 당뇨 또는 타입 2 당뇨, 특히 타입 2 당뇨이다.
엑센딘은 비만 환자의 체중을 감소시키고, 메스꺼움 및 구토를 유발하고, 작용 메카니즘은 중추신경계에서 음식섭식중추의 억제 및 구토 중추 활성에 관한 것이다 (Larsen. Mechanisms behind GLP-1 은 체중 손실 유발. Br J Diabetes Vasc Dis 2008; 8: S34-41; Schick et al. 글루카곤 유사 펩티드 1 (7-36)-아미드는 쥐의 음식섭취를 억제하기 위해서 외측과 내측 시상하부에서 작용, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2003; 284:R1427-5). 엑센딘 또는 그 변형의 콘쥬게이트는 분자량이 증가하기 때문에 혈액뇌관벽을 통과시킬 수 없고, 따라서 엑센딘에 의해서 유발된 구토를 저하시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 개시전에, 본 발명자들은 엑센딘 또는 그 변형의 콘쥬게이트 이 중추신경계에 의해서 조절된 음식 섭취량 및 체중 저하 효과를 줄이는 것을 예상했었다. 그러나 본 발명자들은 놀랍게도 야생형 엑센딘 및 비-콘쥬게이트 엑센딘 변형이 체중 및 음식물 섭취량을 줄이더라도 엑센딘 또는 그 변형의 콘쥬게이트가 체중 및 음식 섭취량의 감소의 효과를 상당히 향상시키는 것을 발견했다.
따라서, 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 엑센딘 또는 이들의 변형의 콘쥬게이트 및/또는 이들 포함한 약학적 조성물을 투여함으로서 체중 감소방법을 제공한다. 본 발명은 체중을 감소시키기 위한 약제 제조에서 엑센딘 또는 이들의 변형의 콘쥬게이트 및/또는 이를 포함한 약학적 조성물의 사용을 제공한다. 일 실시형태에서 엑센딘 또는 이들의 변형의 콘쥬게이트는 상기 기재된 바와 같이 본 발명의 엑센딘 변형의 콘쥬게이트이다.
본 발명은 신규한 엑센딘 변형 및 그 위에 폴리머를 콘쥬게이트하는 엑센딘 변형 콘쥬게이트, 이를 포함한 약학적 조성물 및 질병 치료, 예를 들면 혈당 저하, 당뇨병, 특히 타입 2 당뇨병의 치료에 이들의 사용을 제공한다. 본 발명은 체중 저하용 엑센딘 콘쥬게이트의 사용을 제공한다.
도 1은 실시예 1에 얻어진 PB-105의 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 2는 PEG의 분자 구조를 도시한다.
도 3 은 HPLC 분석시에 실시예 2에서 얻어진 PB-110 (PEG5000-PB-105)의 순도 분석 결과를 도시한다.
도 4는 PEG5000b의 분자 구조를 도시한다.
도 5는 PEG5000c의 분자 구조를 도시한다.
도 6a 및 도 6b는 페길화 PB-105 콘쥬게이트의 요오드 염색 화상 및 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brillant blue ) 염색 화상을 도시하고, 각각의 레인은 다음과 같다: 1. 분자량 표준, 2. PB-106 (PEG20000-PB-105), 3. PB-107 (PEG30000-PB-105), 4. PB-108 (PEG40000-PB-105) 및 5. PB-109 (PEG20000*2-PB-105).
도 7은 HPLC 분석시에서 실시예 3에서 얻어진 PB-106(PEG20000-PB-105)의 순도 분석 결과를 도시한다.
도 8은 PEG20000b의 분자구조를 도시한다.
도 9은 PEG20000c의 분자구조를 도시한다.
도 10은 PEG20000d의 분자구조를 도시한다.
도 11은 PEG20000e의 분자구조를 도시한다.
도 12는 HPLC 분석시에 실시예 3에서 얻어진 PB-112(PEG20000-PB-111)의 순도 분석 결과를 도시한다.
도 13은 HPLC 분석시에 실시예 4에서 얻어진 PB-107(PEG30000-PB-105)의 순도 분석 결과를 도시한다.
도 14은 HPLC 분석시에 실시예 5에서 얻어진 PB-108(PEG40000-PB-105)의 순도 분석 결과를 도시한다.
도 15는 HPLC 분석시에 실시예 5에서 얻어진 PB-114(PEG40000-PB-113)의 순도 분석 결과를 도시한다.
도 16은 PEG20000×2의 분자 구조를 도시한다.
도 17은 HPLC 분석시에 실시예 6에서 얻어진 PB-109(PEG20000*2-PB-105)의 순도 분석 결과를 도시한다.
도 18은 PEG20000×2b의 분자 구조를 도시한다.
도 19는 PEG20000×2c의 분자 구조를 도시한다.
도 20은 PEG20000×2d의 분자 구조를 도시한다.
도 21는 HPLC 분석시에 실시예 7에서 얻어진 PB-119(PEG23000-PB-105)의 순도 분석 결과를 도시한다.
도 22는 HPLC 분석시에 실시예 8에서 얻어진 PB-120(PEG27000-PB-105)의 순도 분석 결과를 도시한다.
도 23a는 pH4.5, -20℃에서 60일동안 저장된 PB-106(PEG20000-PB-105)의 HPLC 분석 결과를 도시한다.
도 23b는 pH7.0, 4℃에서 60일동안 저장된 PB-106(PEG20000-PB-105)의 HPLC 분석 결과를 도시한다.
도 23c는 pH7.0, -20℃에서 60일동안 저장된 PB-106(PEG20000-PB-105)의 HPLC 분석 결과를 도시한다.
도 24는 PC12 세포의 세포간 cAMP에 대한 PB-101 및 PB-105의 효과의 투여량-반응 관계를 도시한다.
도 25는 실험관 내에서 세포간 cAMP 활성에 대한 PB-105 및 그 페길화 콘쥬게이트의 효과를 도시한다.
도 26a는 페길화 콘쥬게이트 내에서 PEG의 MW과 실험관 내의 약리적 활성 (LogEC50) 사이의 관계를 도시한다.
도26b는 페길화 콘쥬게이트 내의 PEG의 MW과 최대 약리 활성 (Emax) 사이의 관계를 도시한다.
도 27은 실험관 내에서 세포간 cAMP 활성에 대한 PB-105 및 이들의 페길화 콘쥬게이트의 영향을 도시한다.
도 28은 PB-101 및 PB-105의 혈당 감소 효과의 시간-반응 관계를 도시한다.
도 29는 PB-101 및 PB-105의 혈당 감소 효과의 투여량-반응 관계를 도시한다.
도 30은 PB-101 및 이들의 변형 PB-102의 혈당 감소 효과의 투여량-반응 관계를 도시한다.
도 31은 PB-105 및 이들의 페길화 콘쥬게이트의 혈당 감소 효과의 시간 반응 관계를 도시한다.
도 32a는 페길화 엑센딘 변형에서 PEG의 분자량과 생물학적 반감기(T1/2) 사이의 관계를 도시한다.
도 32b는 페길화 엑센딘 변형에서 PEG의 분자량과 최대 글루코오스 감소 효과(사전 투여 혈당 농도%) 사이의 관계를 도시한다.
도 32c는 글루코오스 감소 곡선의 곡선 상부 면적(AAC)와 페길화 엑센딘 변형에서 PEG의 MW 사이의 관계를 도시한다.
도 33은 PB-105와 그 페길화(PEG30000) 콘쥬게이트 PB-107의 상당한 혈당 저하 효과의 시간-반응 관계를 나타낸다.
도 34는 PB-105와 그 페길화(PEG20000) 콘쥬게이트 PB-106의 혈당저하 효과의 투여량-반응 관계를 도시한다.
도 35는 PB-105, PB-111 및 이들의 페길화 콘쥬게이트의 상당한 혈당 저하 효과의 시간-반응 관계를 도시한다. 실험 데이터는 평균±SEM으로 도시된다.
도 36은 PB-101, 그 변형 PB-105, PB-111, 및 PB-113, 또한 페길화 콘쥬게이트 PB-106, PB-112 및 PB-114의 혈당 감소 효과의 시간-반응 관계를 도시한다. 실험 데이터는 평균±SEM으로 도시된다.
도 37은 PB-105 및 페길화 콘쥬게이트의 상당한 혈당 감소 효과의 시간-반응 관계를 도시한다. 실험 데이터는 평균±SEM으로 도시된다. *는 PB-105 그룹과 비교해서 상당한 차이를 나타낸다(p<0.05).
도 38a 및 38b는 각각 비둘기의 구토 대기시간(vomiting latency) 및 구토 시간에 대한 PB-101, PB-105, PB-106 및 PB-120의 효과를 도시한다. 실험 데이터는 평균±SEM으로 도시된다. a는 PB-105군에 비해서 3mg/kg의 투여에서 통계적으로 상당한 차이를 나타내고(p<0.05); b는 PB-101 군 및 PB-105 군에 비해서 6mg/kg의 투여에서 통계적으로 상당한 차이를 나타낸다(p<0.05).
도 39는 조직적으로 면역된 기니아 피그에서 과민 반응에 대한 PB-101, PB-105 및 PB-106의 영향을 도시한다. 실험 데이터는 평균±SEM으로서 도시된다. a는 식염수 군과 비교해서 통계적으로 상당한 차이(p<0.05)를 나타타내고; b는 PB-101 그룹 또는 PB-105 그룹과 비교해서 통계적으로 상당한 차이를 나타낸다.
도 40a 및 40b는 PB-101, PB-105 및 PB-106의 투여 후 0-18 일 및 0-4일에 기니아 피그의 체중 증가에 대한 영향을 도시한다. 실험 데이터는 평균±SEM으로서 도시된다. a는 식염수 그룹과 비교해서 통계적으로 상당한 차이를 나타내고(p<0.05); b는 엑세나타이드 또는 PB-105 그룹(p<0.05)에 비해서 통계적으로 상당한 차이를 나타낸다.
도 41a 및 41c는 PB-105, PB-106, PB-119 및 PB-120의 투여 후 쥐의 체중 및 음식물 섭취량에 대한 영향을 도시한다. 도41b 및 41d는 투여후 각각의 그룹의 체중에 대한 AUC-시간 곡선 및 음식물 섭취량에 대한 AUC-시간 곡선을 도시한다. 실험 데이터는 평균±SEM으로 도시된다. a는 식염수 그룹과 비교해서 통계적으로 상당한 차이를 나타내고(p<0.05); b는 PB-105 그룹(p<0.05)과 비교해서 통계적으로 상당한 차이를 나타낸다.
도 42는 엑세나타이드 및 PB-105의 보러스 주사의 농도-시간 곡선을 도시한다.
도 43은 PB-105 및 그 페길화 엑센딘 콘쥬게이트의 보러스 내 주사의 농도-시간 곡선을 도시한다.
도 44a는 페길화 엑센딘 변형 콘쥬게이트 내에서 PEG의 MW와 혈장 반감기 사이의 관계를 도시한다.
도 44b는 페길화 엑센딘 변형 콘쥬게이트 내에서 PEG의 MW와 농도의 곡선 하부 면적(AUC)-시간 곡선 사이의 관계를 도시한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산"은 천연아미노산, 비중성 아미노산 및 아미노산 유사체, 또한 모든 D- 및 L-입체 이성질체를 포함한다. 비-중성 아미노산은 아제티딘 카르복실산, 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, β-알라닌, 알라닌, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프론산, 2-아미노헵탄산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노헵탄디온산, tert-부틸 글리신, 2,4-아미노이소부티르산, 2,2'-디아미노-헵탄디온산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸 글리신, N-에틸 아스파라긴, 호모프롤린, 하이드록시리신, 알로-하이드록시-리신, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸 알라닌, N-메틸 글리신, N-메틸 이소류신, N-메틸-아밀 글리신, N-메틸 발린, 알라닌 나프탈렌, 노르발린, 노르류신, 오르니틴, 글리신 아밀, 2-피페리딘산 및 티오프롤린을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 아미노산 유사체는 중성 아미노산 및 비-중성 아미노산을 포함하고, 여기서 C-말단에 카르복실기, N-말단에 아미노기 또는 측쇄기는 가역적으로 또는 비가역적으로 화학적으로 블록킹되거나, 다른 기능기, 예를 들면 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 술폰, S-(카르복시메틸)-시스테인, S-(카르복시메틸)-시스테인 설폭시드 및 S-(카르복시메틸)-시스테인 설폭시드로 화학적으로 개질된다.
본원에 사용된 바와 같이, "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 호환성 있게 공유결합(예를 들면 펩티드 결합)에 의해서 서로 결합된 일련의 적어도 2개의 아미노산 잔기를 의미하고, 이는 재결합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드, 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "시스테인 치환"은 천연 폴리펩티드(예를 들면 엑센딘-4)에서 하나 이상의 다른 아미노산 잔기를 유전자 공학 또는 인공적인 화학 합성에 의해서 시스테인 잔기로 변경하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "폴리펩티드 변형", "변형" 또는 "유사체"는 아미노산 서열이 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 융합, 절단 또는 이들의 조합에 의해서 다른 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드 변형은 충분히 기능적이거나 부족한 하나 이상의 기능성 활성이 부족한 것일 수 있다. 충분히 기능적인 변형은 변화, 예를 들면 단지 보존된 변화 또는 비-필수적인 잔기 또는 비-필수적인 영역에서의 변화를 포함할 수 있다. 기능적인 변형은 유사한 아미노산의 치환에 의해서 변화하지 않거나 미미한 기능적인 변화를 일으키는 것을 포함할 수 있다. 기능하기 위해서 중요한 아미노산은 종래에 공지된 방법, 예를 들면 부위 특이성 돌연변이 유발 또는 글리신 스캐닝 돌연변이 유발에 의해서 확인될 수 있다 (Cunningham, B. and Wells, J., Science, 244：1081-1085, 1989). 폴리펩티드의 활성에 대한 중요한 위치는, 예를 들면 결정화, NMR 또는 광친화성 표식(photoaffinity labeling)과 같은 구조적 분석에 의해서 결정될 수 있다(Smith, L. et al., J.Mol.Biol., 224：899-904, 1992; de Vos, A. et al., Science, 255：306-312, 1992). "티올 변형"은 티올이 치환, 삽입, 융합 또는 이들의 임의의 조합에 의해서 아미노산 서열에 존재한 폴리펩티드 변형을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "콘쥬게이트"는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 변형 및 본 발명의 개질 그룹의 공유결합 또는 비공유결합에 의해서 형성된 생성물을 의미한다. 개질 그룹은 상기 기재된 예를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "개질된 폴리펩티드" 또는 "개질된 폴리펩티드 변형"은 하나 이상의 아미노산이 화학적으로 개질된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 변형을 의미하고, 여기서 개질은 인산화, 글리코실화, 메틸화, 페길화, 비오티닐화, 수모일화(SUMOylation), 아세일화 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다양한 그룹의 공유 또는 비공유 개질이다.
본원에 사용된 바와 같이, "알킬"은 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 분기 알킬, 예를 들면 C1-C30 알킬, C1-C20 알킬, C2-C15 알킬 또는 C3-C10 알킬을 의미하고, 예를 들면 할로겐, 아미노, 니트로기 등으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기에 의해서 선택적으로 치환된다.
본원에 사용된 바와 같이, "시클로알킬기"는 치환 또는 비치환된 C3-C8 시클로알킬기를 의미하고, 여기서 C1-10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, 할로겐, 아미노 및 니트로기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기에 의해서 선택적으로 치환된다.
본원에 사용된 바와 같이, "알케닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 분기 알케닐을 의미하고, 여기서 2-20, 3-15, 4-10의 탄소원자가 존재하고, 할로겐, 아미노 및 니트로기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기에 의해서 선택적으로 치환된다.
본원에 사용된 바와 같이, "아릴"은 C6-C10 아릴을 의미하고, 선택적으로 C1-C10 알킬, C2-10 알케닐, C2-C10 알키닐, 할로겐, 아미노 및 니트로기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기에 의해서 치환된다.
본원에 사용된 바와 같이, "링커"는 PEG를 엑센딘에 결합한 유기기를 의미한다. 본 발명에서, 링커는 알킬, 에테르, 아미드, 에스테르, 티올 등일 수 있고, 링커는 예를 들면 30개 이하의 탄소원자, 예를 들면 1-25, 2-20, 3-15 또는 3-10 탄소원자를 포함할 수 있다.
일반적으로, 본원에 사용된 바와 같이, "폴리에틸렌 글리콜"은 당업자에게 이해된 의미이고, 달리 기재되어 있지 않으면, 폴리에틸렌 글리콜 그 자체 및 이들의 말단 개질한 유도체를 포함한다.
또한, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머에 대해서, 분자량을 결정하는 다양한 방법이 있다. 평균 분자량(특히 수평균 분자량 또는 중량 평균 분자량)은 일반적으로 폴리머의 분자량을 나타내는 데에 사용되는데, 이는 폴리머가 분포 범위내에서 다른 중합도를 갖는 분자에 의해서 형성되기 때문이다. 수평균 분자량 및 중량 평균 분자량은 폴리머의 중합도가 크게 다를 때에 임의의 정도까지 다를 수 있지만, 좁은 분포 범위를 갖는 폴리머와 동일하게 되는 경향이 있다. 본원에 기재된 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머에 대해서, 분자량은 언급된 경우에 대해서는 수평균 분자량 또는 중량평균 분자량일 수 있다.
엑센딘 변형
일 실시형태에서, 본 발명은 GLP-1 수용체 아고니스트의 활성을 갖는 엑센딘 변형에 관한 것으로, 야생형 엑센딘 서열과 비교해서 하나 이상의 (예를 들면 1,2,3,4,5 이상의) 아미노산 잔기가 시스테인에 의해서 치환된다. 시스테인 치환은 N-말단, C-말단 및/또는 엑센딘 변형 서열의 내부 위치에서 각각 독립적으로 위치된다. 일부 실시형태에서, 엑센딘 변형은 C-말단의 적어도 1, 2, 3, 또는 4 아미노산 잔기에서 시스테인 치환을 갖는다. 바람직하게, 엑센딘 변형은 C-말단의 마지막 아미노산에서 시스테인 치환을 갖는다. 일부 다른 실시형태에서, 바람직하게 엑센딘 변형은 C-말단, N-말단의 1, 2, 3, 4 이상의 아미노산 잔기 및/또는 엑센딘 변형의 내부 위치에서 시스테인 치환을 갖는다.
본 발명에 기재된 야생형 엑센딘 서열 또는 유사한 서열은 다양한 변형 또는 유사체 또는 이들의 아고니스트 서열을 포함한, 종래에 공지된 서열일 수 있다. 엑센딘에 대해서, Eng J. et al., J. Biol. Chem., 265: 20259-62, 1990; Eng J. et al., J. Biol. Chem., 267: 7402-05, 1992; WO00/66629 and WO00/41546을 참조하고, 각각은 본원에 참조로 포함되어 있다.
엑센딘 변형은 선택적으로 예를 들면 아미노산 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가를 포함한 하나 이상(예를 들면 1, 2, 3, 4, 5 이상) 아미노산 개질을 갖는다. 마찬가지로, 추가의 아미노산 개질은 엑센딘 서열의 N-말단, C-말단 및/또는 내부의 위치에 독립적으로 위치될 수 있다. 치환, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산은 임의의 천연 아미노산, 비-천연 아미노산 또는 아미노산 유사체 또는 D-또는 L-입체이성질체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가의 아미노산 개질은 보존된 아미노산 치환, 예를 들면 Ala/Gly, Ser/Thr, Glu/Asp, Gln/Asn, Ala/Val/Ile/Leu, Arg/Lys, Phe/Tyr, 등 사이의 치환이다. 보존된 아미노산 치환에 대해서, 많은 기재는 종래 기술, 예를 들면 WO2006/083301에 기재되어 있고, 본원에 참조로 포함되어 있다.
본 발명에서, 야생형 엑센딘은 엑센딘-3 또는 엑센딘-4일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 이러한 엑센딘 변형에 관한 것으로, 여기서 하나 이상(예를 들면 1,2,3,4,5 이상) 아미노산 잔기는 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 1; 엑센딘-4) 또는
His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 2; 엑센딘-3) 또는 유사한 서열과 비교해서 시스테인으로 치환된다. 바람직하게 엑센딘 변형은 서열번호 1 또는 2의 위치 20에서 Arg(알기니), 위치 25에서 Trp(트립토판), 위치 35에서 Ala(알라닌) 및 위치 39에서 Ser(세린)에 상응하는 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 위치에서 시스테인 치환을 갖는다.
바람직한 실시형태에서, 엑센딘 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Cys-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 3);
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys (서열번호 4);
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Cys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 5);
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Cys-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 6);
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys-Tyr (SEQ ID NO：7); 또는
His-dAla-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys (서열번호 8).
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 엑센딘 변형은 선택적으로 아미노산 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가를 포함한 하나 이상의 (예를 들면 1,2,3,4,5 이상)의 아미노산 개질을 가질 수 있다.아미노산 개질은 엑센딘 서열의 N-말단, C-말단 및/또는 내부 위치에서 독립적으로 위치될 수 있다. 치환된, 삽입된 및/또는 첨가된 아미노산은 임의의 천연 아미노산, 비-천연 아미노산 또는 아미노산 유사체 또는 D- 또는 L-입체이성질체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 아미노산 개질은 보존된 아미노산 치환, 예를 들면 Ala/Gly, Ser/Thr, Glu/Asp, Gln/Asn, Ala/Val/Ile/Leu, Arg/Lys, Phe/Tyr, 등 사이의 치환이다.
엑센딘 변형은 예를 들면 재결합 제조 방법, 화학 합성 등을 포함한 많은 종래의 방법에 의해서 얻어질 수 있다.
일 실시형태에서, 엑센딘 변형은 고상 펩티드 합성 화학에 의해서 합성된 후 실험실 스케일로 정제된 후, 예를 들면 역상 HPLC 칼럼에서 하나의 정제단계 또는 다른 적당한 크로마토그래피 방법에 의해서 정제된다.
또 다른 실시형태에서, 엑센딘 변형은 예를 들면 적당한 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 발현을 포함한 재결합 방법에 의해서 제조된 후, 본 발명에 따른 엑센딘 변형은 일련의 방법에 의해서 분리된다. 예를 들면 펩티드의 핵산 서열 인코딩은 화학적 합성 방법에 의해서 합성되고, 서열은 적당한 발현 벡터로 복제되어 적당한 프로모터의 제어하에서 발현된다. 또한, 엑센딘 변형의 헥산 서열 인코딩은 돌연변이 생성, 예를 들면 PCR 돌연변이 생성에 의해서 야생형 엑센딘으로부터 얻어진 후, 서열이 적당한 발현 벡터로 복제되어 적당한 프로모터의 제어하에서 발현된다. 이들 방법은 당업자에 대한 능력의 범위 내에 있고 많은 기재가 종래에 존재한다.
적당한 진핵생물 호스트 세포는 포유류 세포, 예를 들면 CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep 및 HepG2을 포함한다. 세포는 본 발명에 따른 엑센딘 변형의 발현에 적당한 조건에서 바람직하게 성장한다. 본 발명에 따른 엑센딘 변형을 제조하거나 분리하기 위한 시약 및 조건에 대해서, 특별한 제한은 없고, 임의의 공지된 또는 시판 시스템이 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 엑센딘 변형은 종래에 기재된 방법에 의해서 얻어질 수 있다.
많은 발현 벡터가 사용되어 엑센딘 및/또는 이들의 변형을 제조할 수 있고, 이들은 원핵 및 진핵 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 원핵 발현 벡터는 플라스미드, 예를 들면 pRSET, pET and pBAD 등을 포함하고, 유용한 프로모터는 예를 들면 lac, trc, trp, recA 또는 araBAD 을 포함한다. 진핵 발현 벡터는 하기와 같다: (i) 이스트에서 발현하기 위해서 사용된 벡터, 예를 들면 pAO, pPIC, pYES, pMET, 여기서 사용될 수 있는 프로모터, 예를 들면 AOXl, GAP, GALl, AUGl, 등; (ii) 곤충세포에서 발현하기 위해서 사용된 벡터, 예를 들면 pMT, pAc[delta], plB, pMIB, pBAC, etc., 여기서 사용될 수 있는 프로모터, 예를 들면 PH, p10, MT, Ac5, OplE2, gp64, polh, 등; (iii) 포유류 세포에서 발현하기 위해서 사용된 벡터, 예를 들면 pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, 등 및 바이러스 시스템으로부터 유도된 벡터, 예를 들면 바이러스 백신, 아데노 관련 바이러스, 포진 바이러스, 레트로바이러스, 여기서 사용될 수 있는 프로모터, 예를 들면 CMV, SV40, EF-1 , UbC, RSV, ADV, BPV 및 β-액틴. 바람직한 실시형태에서, 엑센딘 변형은 원핵 또는 진핵 세포의 시스템에서 발현되고, 코돈 최적화된 인코딩 서열이 사용된다. 바람직한 실시형태에서, 엑센딘 변형을 발현하기 위한 서열은 세포로부터 세포외부로 엑센딘 변형의 분비 후 분리 및 정제를 용이하게 하기 위해서 리딩 펩티드 및/또는 시그널 펩티드를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 엑센딘 변형을 발현하기 위한 서열은 리딩 펩티드 및/또는 시그널 펩티드를 포함하지 않는다. 엑센딘 변형은 세포외 영역으로 분비되지 하고 세포의 용해에 의해서 분리 및 정제된다.
엑센딘 변형 콘쥬게이트
엑센트 변형은 하나 이상의 폴리머 모이어티에 콘쥬게이트되고 엑센딘 변형의 콘쥬게이트를 형성한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "폴리머"는 수용액 또는 현탁액에서 용해가능하고, 폴리머-엑센딘 콘쥬게이트를 약학적 유효량으로 적용한 후 포유류에 대한 부작용과 같은 네거티브 작용을 갖지 않는 약학적으로 허용가능한 폴리머이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 폴리머는 특별한 제한을 갖지 않는다. 바람직하게, 폴리머는 항상 2 내지 약 3000 반복 유닛을 갖는다. 폴리머 모이어티는 천연 또는 합성 폴리머로부터 선택될 수 있고, 이는 예를 들면 폴리사카라이드, 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리에틸렌 옥사이드(PEO), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 코폴리머, 폴리비닐 알콜, 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 PEG 부분은 본 발명의 엑센딘 변형의 콘쥬게이트에서 콘쥬게이션에 의한 개질에 사용된다.
본 발명에서 폴리머는 특별한 구조로 한정되지 않고, 직쇄(예를 들면 알콕시 PEG 또는 2관능성 PEG), 분기 또는 멀티-암(폴리올 코어에 결합된 포크형 PEG 또는 PEG), 모수석이거나 분해성 결합을 가질 수 있다. 또한, 폴리머의 내부 구조는 임의의 수의 다른 패턴에서 조직화되고, 이는 호모폴리머, 교대 코폴리머, 랜덤 코폴리머, 블록 코폴리머, 교대 터폴리머, 랜덤 터폴리머 및 블록 트리머로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 폴리머는 폴리(알킬렌 옥사이드)폴리머, 폴리말레산 및 폴리(D,L-알라닌)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이들의 유도체이고, 예를 들면 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이다. 본원에 사용된 바와 같이, 달리 기재되지 않으면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)는 하이드록실 말단기를 갖는 것 및 다른 말단기를 갖는 것을 포함한다. 상기 다른 말단기는 알콕시, 시클로알콕시, 시클로알킬옥시, 알케닐, 아릴옥시, 또는 아릴알킬옥시를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 이러한 PEG 분자는 모두 종래에 공지되어 있고, 폴리펩티드 개질에서 일반적으로 사용되고 있다. PEG 측쇄는 직쇄, 분기, 포크형 또는 멀티 아암일 수 있다. 다른 폴리에틸렌 글리콜은 다른 길이의 중합성 사슬 및 폴리머 구조를 가질 수 있다.
본원에 사용된 PEG의 분자량은 특별하게 한정되지 않지만, 0.1 내지 200 kDa의 범위, 예를 들면 1 내지 150 kDa, 2 내지 100 kDa, 3 내지 80 kDa 또는 4 내지 50 kDa일 수 있고, 5 내지 40 kDa일 수 있다. 특히 유용한 PEG는 5 내지 30 kDa의 범위의 분자량을 갖는다. 일부 다른 유용한 PEG 분자는 예를 들면 WO 03/040211, US 6,566,506, US 6,864,350 및 US 6,455,639에 기재된 것을 포함한다. 특히, PEG는 일반식 HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH를 갖고, 여기서 n은 5 내지 4000의 범위 내이다. 상기 기재된 바와 같이, 본 발명에 사용된 PEG는 다른 말단기를 갖는 PEG, 예를 들면 메톡시 PEG, 분기 PEG, 및 포크 PEG를 포함한다. 적당한 분기 PEG는 U.S. 특허 5,932,462에 기재된 바와 같이 제조되고, 본원에 참조로 포함된다. 분기 PEG는 폴리머 사슬의 부위 근방 말단에서 분기된 PEG를 나타내고, 분기 PEG의 주쇄는 직쇄이거나 분기일 수 있다.
당업자에 의해서 공지된 바와 같이, 폴리머 모이어티와 콘쥬게이트된 생물학적 활성 분자에서, 콘쥬게이트된 분자의 생물학적 활성은 폴리머 모이어티의 분자량의 증가에 따라서 감소한다(Bailon 등. 유력한, 지속적인 형태의 인터페론의 합리적 설계: 헤파티스 C의 치료중에 40kDa 분기 폴리에틸렌 글리콜-콘쥬게이트 인터페론 α-2a, Bioconjugate Chem 2001 ; 12:195-202; Bowen 등. 폴리에틸렌 글리콜 콘쥬게이트 과립구 콜로니-자극 요소 변이의 분자량과 활성기간 사이의 관계, Experimental Hematology 1999; 27:425-32; Bailon 등, PEG-개질화된 생물약제학. Expert Opin Deliv. 2009; 6:1-16). 당업자에 의해서 공지된 바와 같이, 생물적 반감기 및/또는 혈장 반감기는 폴리머 모이어티의 분자량의 증가에 따라서 증가한다.
그러나, 놀랍게도, 본 발명에서 본 발명의 엑센딘 변형 콘쥬게이트는 폴리머 모이어티(예를 들면 PEG)의 분자량이 30 kDa 까지 증가하는 경우에도, 비-콘쥬게이트 엑센딘 변형과 비교해서 대부분의 GLP-1 수용체 아고니스트 활성(예를 들면 체내 활성)을 유지한다. PEG의 분자량은 40 kDa 이상 증가하더라도, 본 발명의 엑센딘 변형 콘쥬게이트는 실질적인 GLP-1 수용체 아고니스트 활성(예를 들면 체내 활성)을 유지한다. 특히, PEG의 분자량이 5 kDa 내지 27 kDa 까지 증가하면, 엑센딘 변형 콘쥬게이트의 GLP-1 수용체 아고니스트 활성은 실질적으로 비-콘쥬게이트 엑센딘 변형과 실질적으로 동일하게 유지한다.
긴 시간 동안 안정한 치료 효과를 제공하고 환자의 준수 향상을 위한 투여주기를 줄이기 위해서, GLP-1 수용체 아고니스트의 실질적인 활성을 유지하면서 가능한 한 엑센딘 변형 콘쥬게이트의 생물학적 반감기를 연장하는 것이 바람직하다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 GLP-1 수용체 아고니스트의 실질적인 활성 및 연장된 생물학적 반감기를 갖는 엑센딘 변형 콘쥬게이트를 제공하는 것이다.
특정한 실시형태에서, 엑센딘 변형의 콘쥬게이트에서 하나 이상의 폴리머 모이어티(예를 들면, PEG)의 분자량은 2 kDa 내지 50 kDa, 바람직하게 3 kDa 내지 40 kDa, 보다 바람직하게 4 kDa 내지 35 kDa, 더욱 바람직하게 5 kDa 내지 30 kDa, 예를 들면 5 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa 및 40 kDa, 또한 상기 기재된 바와 같이 임의의 분자량 사이의 임의의 값이다. 콘쥬게이트는 달리 기재되어 있지 않으면 하나를 초과해서 콘쥬게이트된 폴리머 모이어티를 포함하면, 엑센딘 변형의 콘쥬게이트에 콘쥬게이트된 폴리머 모이어티의 분자량이 상기 콘쥬게이트에서 모든 콘쥬게이트된 폴리머 모이어티의 전체 분자량으로 산출되는 것을 유의한다.
바람직한 실시형태에서, 엑센딘 변형의 콘쥬게이트에서 하나 이상의 폴리머 모이어티(예를 들면 PEG)의 분자량은 20 kDa 내지 30 kDa, 바람직하게 21 kDa 내지 29 kDa, 보다 바람직하게 23 kDa 내지 27 kDa, 예를 들면 20 kDa, 21 kDa, 22 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 27 kDa, 28 kDa, 29 kDa, 30 kDa, 또한 상기 기재된 바와 같은 임의의 분자량 사이의 임의의 값이다.
본 발명에 사용된 폴리머는 종래에 공지되어 있고, 이는 예를 들면 시판회사, CarboMer, Inc., J.T. Baker, The Dow Chemical Company, 등에 의해서 얻어질 수 있고, 또한 EP 1245608에 기재된 종래에 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다. 본 발명은 임의의 특정한 방법에 의해서 제조된 폴리머로 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 콘쥬게이트에서, 적어도 하나의 폴리머는 엑센딘에서 아미노기, 카르복실기, 하이드록실기, 및/또는 티올기 등에 의해서 엑센딘과 결합될 수 있다. 이러한 기는 종종 리신, 아스파테이트, 글루타메이트, 시스테인 등과 같은 α-아미노, α-카르복시, 및 아미노산의 측쇄에 위치된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리머 분자는 엑센딘 변형내에서 시스테인의 티올을 통해서 엑센딘 변형과 결합된다. 티올과 특이하게 반응하는 많은 시약이 존재하고 단백질 내의 유용한 티올은 이러한 리신 잔기의 자유 아미노기보다 훨씬 적기 때문에, 단백질 내의 시스테인 잔기의 티올에서 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머의 개질은 그 선택도를 증가시킬 수 있다
따라서, 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 폴리머 모이어티는 엑센딘 변형의 시스테인 잔기에 콘쥬게이트될 수 있고, 보다 바람직하게 티오에테르에 의해서 엑센딘 변형의 시스테인 잔기에 콘쥬게이트될 수 있다.
바람직하게, 엑센딘 변형은 야생형 엑센딘-3 또는 엑센딘-4의 위치 20, 위치 25, 위치 35 및/또는 위치 39에 상응하는 위치에서 하나 이상의 시스테인 치환을 갖고, 엑센딘 변형은 티올기를 통해서 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머에 결합된다. 보다 바람직하게, 엑센딘 변형은 야생형 엑센딘-3 또는 엑센딘-4의 위치 35 및/또는 위치 39에 상응하는 위치에서 시스테인 치환을 갖는다. 가장 바람직하게, 엑센딘 변형은 야생형 엑센딘-3 또는 엑센딘-4의 위치 39에 상응하는 위치에서 시스테인 치환을 갖는다.
특정한 실시형태에서, 폴리머 모이어티는 티오에테르 결합을 통해서 본 발명에 따른 엑센딘 변형에서 시스테인 잔기와 콘쥬게이트된다. 예를 들면, 말레이미드 활성 기와 폴리에틸렌 글리콜 분자에 대해서, 티오에테르 결합은 시스테인의 티올과 말레이미드의 알케닐 사이에 형성되어 본 발명에 따른 엑센딘 변형의 시스테인 잔기에 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 콘쥬게이트할 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 시스테인 잔기의 페길화는 예를 들면 PEG-비닐 술폰, PEG-이오도아세트아미드 또는 PEG-피리딘 디술피드에 의해서 행해질 수 있다. 폴리머 모이어티, 예를 들면 PEG를 폴리펩티드에 콘쥬게이트하기 위한 방법은 종래에 존재하고 이들 모든 방법은 본 발명에서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "페길화 엑센딘", "PEG 개질화된 엑센딘" 또는 "엑센딘 변형-EPG 콘쥬게이트"는 하나 이상의 PEG와 콘쥬게이트된 엑센딘 변형을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "페길화" 또는 "PEG 개질"은 엑센딘과 하나 이상의 PEG 모이어티를 콘쥬게이트하는 단계를 포함한다. 적당한 페길화 방법은 US 5,122,614 및 US5,539,063에 개시되고, 모든 개시된 페길화 방법은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 콘쥬게이트는 하기 식(1)의 구조를 갖는다.
Figure 112011092172939-pct00001
(1)
여기서, 엑센딘은 본 발명에 따른 엑센딘 변형을 나타내고, Y는 H 또는 RPEG-X-이고, 각각의 X 및 Z는 독립적으로 링커이고, PEG는 -(OCH2CH2)n- 이고, n은 양의 정수이고, R은 PEG의 말단기를 나타내고, 바람직하게 각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 알케닐, 아릴 또는 아릴알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구체적인 실시형태에서, 알킬은 C1-6 알킬, 바람직하게 C1-C4 알킬, 예를 들면 메틸, 에틸, N-프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸 및 tert-부틸일 수 있고, 시클로알킬은 C3-C7 시클로알킬일 수 있고, 예를 들면 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 및 시클로헵틸이고; 시클로알킬알킬은 시클로알킬 C1-C4 알킬, 예를 들면 시클로알킬메틸 및 시클로알킬에틸, 예를 들면 시클로헥실메틸 및 시클로헥실에틸 등일 수 있고, 아릴은 페닐, 메틸페닐 및 나프틸 등일 수 있고, 아릴알킬은 페닐메틸, 페닐에틸 및 나프틸메틸, 나프틸에틸일 수 있다. 다양한 말단기를 갖는 PEG 분자는 종래에 공지되어 있고, 이들 및 다른 PEG 분자는 필요에 따라서 선택될 수 있다. 필요한 말단기를 갖는 PEG 분자는 필요에 따라서 종래에 공지된 방법에 의해서 합성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 식(1)의 각각의 "RPEG-"는 독립적으로 하기와 같은 구조를 갖는다:
Figure 112011092172939-pct00002
여기서, k 및 n은 양의 정수, k= 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6; n = 40, 41, ... 45, 46, 47, 48, ......, 1200이다.
일부 다른 바람직한 실시형태에서, 식(1)에서 각각의 "RPEG-"은 독립적으로 하기와 같은 구조를 갖는다:
Figure 112011092172939-pct00003
Figure 112011092172939-pct00004
여기서, k 및 n은 정수로서 k는 0, 1, 2 또는 3; n은 40, 41, ..., 45, 46, 47, 48, ......, 1200이다.
일부 실시형태에서, 식(1)에서 각각 "-X-"은 독립적으로 하기와 같은 구조를 갖는다:
Figure 112011092172939-pct00005
여기서, p 및 m은 정수이고, p는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12; m 은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12이다.
일부 다른 실시형태에서, 식(1)에서 각각의 "-X-"은 독립적으로 하기와 같은 구조를 갖는다:
Figure 112011092172939-pct00006
여기서, p 및 m은 정수이고, p는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5; m은 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
일부 다른 실시형태에서, 식(1)에서 각각의 "-Z-엑센딘"은 독립적으로 하기와 같은 구조를 갖는다:
Figure 112011092172939-pct00007
바람직하게, 식(1)에서 "-Z-엑센딘"은 하기와 같은 구조를 갖는다:
Figure 112011092172939-pct00008
Figure 112011092172939-pct00009
여기서, i, j, q, w는 정수이고, i = 0 또는 1; j = 1, 2, 3, 4, 5 또는 6; q = 1, 2, 3, 4, 5 또는 6; w = 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
본 발명에 따른 엑센딘 변형의 콘쥬게이트는 임의의 적당한 방법에 의해서 합성될 수 있다. 폴리머를 단백질 또는 펩티드에 콘쥬게이트하기 위한 많은 방법은 종래에 공지되어 있고, 예를 들면 본 발명에 따른 엑센딘 변형을 갖는 폴리머(바람직하게 활성 폴리머)를 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜이고, 이는 활성되고, 예를 들면 시아노 브로마이드 방법, 카르보닐디이미다졸 방법, N-하이드록시숙신이미드 방법, 시아누르산 클로라이드 우레아 방법 등에 의해서 엑센딘 변형 콘쥬게이트된다. 또한, PEG는 특이하게 PEG-비닐 술폰, PEG-이오도아세트아미드 또는 PEG-피리딘 디술피드에 의해서 엑센딘 변형에서 시스테인 잔기의 티올에 콘쥬게이트될 수 있다.
일부 구체적인 실시형태에서, 활성화 PEG는 하기의 조건: 본 발명에 따른 엑센딘 변형과 함께 배양될 수 있고, pH 5.0-7.0에서 펩티드에 대한 PEG의 몰비는 1-10이고, 반응시간 0.5-12시간, 반응온도 0-50℃, 예를 들면 2-40℃ 또는 4-37℃이다.
콘쥬게이트 반응 후, 콘쥬게이트는 적당한 방법에 의해서 분리될 수 있다. 적당한 방법은 예를 들면 한외여과, 투석법 또는 크로마토그래피 등을 포함하고, 이는 당업자의 능력 범위 내에 있다.
약학적 조성물
본 발명에 따른 엑센딘 변형 및/또는 엑센딘 변형의 콘쥬게이트는 예를 들면 혈당을 저하시키기 위한 많은 사용을 갖는다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 엑센딘 변형 및 엑센딘 변형 콘쥬게이트의 치료적 유효량을 포함한 혈당을 저하시키기 위한 약학적 조성물, 또한 선택적으로 약학적으로 허용가능한 캐리어를 제공한다. 바람직하게, 약학적 조성물은 당뇨병 치료에 유용하고, 보다 바람직하게 타입 1 및/또는 타입 2 당뇨병 치료에 유용하고, 특히 타입 2 당뇨병 치료에 유용하다.
본 발명의 엑센딘 변형 및/또는 엑센딘 변형의 콘쥬게이트의 치료적 유효량은 투여경로, 대상 및 고려하에서 특정한 포유류의 물성에 의존한다. 이들 요소, 및 이들 요소와 결정된 투여량 사이의 관계는 당업자에게 공지되어 있다. 투여량 및 투여경로는 최적의 효과를 달성하도록 조절되어, 대상에 펩티드를 전달할 수 있다. 그러나, 공지의 요소, 예를 들면 체중, 식이요법, 동시에 투여약물 및 다른 요소에 의존하고, 약물 분야에서 당업자에게 공지된다.
약학적 조성물은 조합 치료에 투여될 수 있고, 즉 약학적 조성물은 하나 이상의 다른 약물과 함께 적용되고, 이들은 한꺼번에 또는 순차적으로 적용된다. 다른 실시형태에서, 상기 다른 약물은 본 발명의 하나 이상의 엑센딘 변형 및/또는 엑센딘 변형의 콘쥬게이트 또는 다른 약학적 조성물의 투여전, 중 또는 후에 투여될 수 있다. 본 발명에서 유용한 상기 다른 약물은 예를 들면 혈당을 저하시키기 위한 약물, 예를 들면 인슐린, 인슐린 유사체, 덱스트린 아고니스트 및 콜레시스토키닌 및/또는 다른 화합물 또는 질병을 치료하기 위해서 사용된 조성물을 포함한다. 바람직하게, 이러한 결합된 투여량은 조합된 또는 상승작용 효과를 달성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 캐리어" 또는 "생리적으로 허용가능한 캐리어"는 호환성 있게 사용될 수 있고, 하나 이상의 임의의 및 모든 생리적으로 상용가능한 염, 용제, 분산매, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 캐리어는 정맥내, 근육내, 피하, 척수 또는 표피 투여(예를 들면 주사 또는 주입)에 적당하다. 투여 경로에 따라서, 치료제는 이를 비활성시킬 수 있는 산 및 다른 중성 조건으로부터 치료제를 보호하기 위해서 특정한 물질로 코팅될 수 있다.
투여시, 본 발명에 따른 약학적 제제는 약학적 조성물을 약학적으로 허용가능한 양으로 투여한다. "약학적으로 허용가능한"은 활성 성분의 생물학적 활성을 방해하지 않는 비-독성 물질을 의미하는 것을 의도한다. 제제는 염, 버퍼, 보존제, 상용가능한 캐리어 및 선택적으로 다른 치료제, 예를 들면 보완 면역 향상제, 예를 들면 면역보조제, 케모카인, 및 시토카인을 포함한다. 염이 약제에 사용되는 경우, 염은 약학적으로 허용가능한 것을 필요로 하지만, 비-약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용가능한 염을 제조하기 위해서 용이하게 사용될 수 있으므로, 이들은 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는다.
필요에 따라서, 본 발명에 따른 엑센딘 변형 또는 엑센딘 변형의 콘쥬게이트는 약학적으로 허용가능한 캐리어와 결합될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 캐리어"는 하나 이상의 상용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 충전 물질을 의미하고, 이는 포유류, 예를 들면 인간에 적용하는 데에 적당하다. "캐리어"는 유기 또는 무기, 천연 또는 합성 성분을 나타내고, 이는 적용을 용이하게 하기 위해서 활성 성분과 결합된다. 약학적 조성물의 성분은 약제의 필요한 효능을 상당히 파괴하는 상호작용이 존재하지 않는 형태로 혼합될 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 버퍼 시스템을 포함하고, 바람직하게 버퍼시스템은 pH 약 3.0 내지 약 6.0까지의 아세트산 버퍼 용액 또는 pH 약 5.0 내지 약 9.0의 인산 버퍼액이다. 일부 구체적인 실시형태에서, 적당한 버퍼는 아세테이트, 시트레이트, 보레이트, 포스페이트를 포함한다.
선택적으로, 약학적 조성물은 적당한 보존제, 예를 들면 벤잘코늄 클로라이드; 클로라이드 tert-부틸 알콜; 파라벤 및 티메로살을 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 편리하게 단위 용량의 형태로서 사용되고, 약학 분야에서 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다. 모든 방법은 캐리어와 활성화제를 결합하는 단계를 포함하고, 캐리어는 하나 이상의 보조성분을 포함한다. 일반적으로, 활성화제 및 액체 캐리어, 미세하게 분할된 고체 캐리어 또는 둘다를 밀접하게 결합시켜 조성물을 제조하고, 필요에 따라서 차후에 생성물을 성형한다.
비경구 투여에 적당한 약학적 조성물은 하나 이상의 엑센딘 변형 또는 엑센딘 변형의 콘쥬게이트를 포함한 무균 수성 또는 비수성 제제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제제는 대상의 혈액과 비교해서 등장액이다. 적당한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제는 공지된 방법에 따라서 제제를 제조하기 위해서 사용될 수 있다. 주사용 무균 제제는 비독성 비경구 허용가능한 희석제 또는 용제에서 무균액 또는 현탁액, 예를 들면 1,3-부탄디올에서 용액을 포함한다. 유용한 허용가능한 캐리어 및 용제는 물, 링거액 및 등장 소디움 클로라이드 용액을 포함한다. 또한, 무균 비휘발성 오일은 용제 또는 현탁 배지로서 일상적으로 사용된다. 임의의 우수한 비휘발성 오일이 사용될 수 있고, 예를 들면, 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 포함한다. 또한, 지방산, 예를 들면 올레산은 주사용 제제에 사용될 수 있다. 경구, 피하, 정맥내, 근육내 등에 적당한 캐리어의 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA에 기재된다.
본 발명에 따른 엑센딘 변형 또는 엑센딘 변형 콘쥬게이트는 캐리어, 예를 들면 이식, 경피 패치 및 미세캡슐 전달 시스템을 포함한 조절된 방출 제제와 같은 캐리어와 함께 제조되고, 이는 빠른 열화로부터 엑센딘 변형 또는 엑센딘 변형의 콘쥬게이트를 보호한다. 생물학적으로 열화가능한, 생물학적으로 상용가능한 폴리머, 예를 들면 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 유용하게 될 수 있다. 이러한 제제를 제조하기 위한 많은 방법은 공지되어 있고, 예를 들면 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, etc.참조.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 종래의 경로, 예를 들면 시간 경과에 따른 주사 또는 주입에 의해서 투여될 수 있다. 예를 들면, 투여는 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 공동내, 종양내 또는 경피를 통해서 실시될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효량으로 투여된다. "유효량"은 본원에 제공된 엑센딘 변형 또는 엑센딘 변형의 콘쥬게이트의 양으로, 이는 바람직한 반응(예를 들면, 대상 내의 혈당 수준을 감소시킨다)을 다른 치료제와 별도로 또는 함께 제조한다. 이는 당뇨병의 진전을 단지 일시적으로 지연시키고, 또는 일부 실시형태에서 이것은 당뇨병의 진전을 영구적으로 종료시키는 것을 포함한다.
이러한 양은 치료될 특이한 질병, 질병의 심각성, 환자의 개인적 변수(예를 들면, 나이, 심리적 조건, 신장 및 체중), 치료기간, 동시에 진행하는 치료의 특성(필요에 따라서), 특이한 투여경로 및 건강 케어 전문가의 지식 내의 유사한 요소에 의존한다. 이들 요소는 당업자에게 공지되고, 용이하게 종래의 실험을 통해서 알려져 있다. 일반적으로, 각각의 성분 또는 그 조합의 최대 투여량이 바람직하게 사용되고, 즉 가장 높은 안전한 투여량은 합리적인 의료적 근거에 따라서 결정한다. 그러나, 당업자는 환자에게 의료의, 생리적인 또는 실질적으로 임의의 다른 이유에 기초해서 투여량 감소 또는 허용가능한 투여량 감소를 요구하는 것을 이해할 수 있다.
기존의 방법에서 사용된 약학적 조성물은 무균인 것이 바람직하고, 환자에게 투여하는 데에 적당한 체중 유닛 또는 체적 유닛으로 엑센딘 변형 또는 엑센딘 변형의 콘쥬게이트의 유효량을 포함하고, 이는 혈당 감소와 같은 필요한 반응을 얻기 위해서 또 다른 제제와 별도로 또는 혼합된다.
대상에게 투여된 엑센딘 변형 또는 엑센딘 변형 콘쥬게이트의 투여량은 다른 변수, 특히 사용되는 투여경로 및 대상의 상태에 따라서 선택될 수 있다. 다른 요소는 필요한 치료기간을 포함한다. 대상 내의 반응이 적용된 기존의 투여량으로 불충분하면 환자의 허용 범위까지 더 많은 투여량이 적용될 수 있다(또는 국부적인 다른 전달 경로를 통해서 유효하게 더 많은 투여량을 달성할 수 있다).
일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 0.20 mg/ml 내지 5mg/ml 엑센딘 변형 및/또는 4mg/ml 내지 40mg/ml 엑센딘 변형 콘쥬게이트, 바람직하게 0.20 mg/ml 내지 5mg/ml 엑센딘 변형 및/또는 4mg/ml 내지 40mg/ml 엑센딘 변형 콘쥬게이트, 보다 바람직하게 0.5 mg/ml 내지 2mg/ml 엑센딘 변형 및/또는 10mg/ml 내지 20mg/ml 엑센딘 변형 콘쥬게이트이다. 일반적으로, 본 발명에 따른 엑센딘 변형 또는 엑센딘 변형 콘쥬게이트의 투여량 범위는 환자의 체중 1kg 당 10㎍ 내지 환자의 체중 1kg 당 100,000㎍이다. 일부 실시형태에서, 투여량 범위는 약0.1mg/kg 내지 약 20mg/kg이다. 다른 실시형태에서, 투여량의 범위는 약0.1mg/kg 내지 약 5mg/kg, 약0.1mg/kg 내지 약 10mg/kg, 또는 약0.1mg/kg 내지 약 15mg/kg이다. 다른 실시형태에서, 투여량 범위는 약 1mg/kg 내지 약 5mg/kg, 약5mg/kg 내지 약 10mg/kg, 약10mg/kg 내지 약 15mg/kg 또는 약15mg/kg 내지 약 20mg/kg이다. 다른 실시형태에서, 투여량은 약 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 17 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg 또는 30 mg/kg 이다. 다른 실시형태에서, 투여량은 약 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg 또는 6 mg/kg이다. 상기 조성물에 기초하면, 투여량은 지속적으로 전달되거나(예를 들면 연속펌프에 의해), 또는 사이클에서 간헐적으로 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 엑센딘 변형 또는 엑센딘 변형 콘쥬게이트의 투여량은 정맥내에 투여될 때 0.1 내지 20 mg/kg 또는 그 범위 내의 임의의 값일 수 있다. 특별한 조성물의 복합 투여 사이의 소망의 시간 간격은 불필요한 실험 없이 당업자에 의해서 결정될 수 있다. 본원에 제공된 조성물의 다른 투여 프로토콜은 당업자에게 공지되어 있고, 투여량, 투여 일정, 투여 부위, 투여 경로 등은 상기 기재된 것과 다를 수 있다. 일 실시형태에서, 투여량은 정맥내 경로를 통해서 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 투여 프로토콜은 보러스 정맥내 투여이다.
엑센딘 변형 또는 엑센딘 변형의 콘쥬게이트(예를 들면 약학적 조성물) 및 지시사항을 포함한 키트는 본 발명의 범위 내에 있다. 키트는 적어도 하나의 다른 시약, 예를 들면 혈당 감소용 하나 이상의 다른 약물을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 용기 또는 일련의 용기 (예를 들면 시험관, 튜브, 플라스크, 병, 실린지, 등)를 단단히 수용하기 위해서 구획된 베이스를 포함한다. 키트의 성분은 수성 배지에 충전되거나 냉동건조될 수 있다.
본원에 제공된 조성물은 냉동건조된 형태이거나 수성 배지에 제공될 수 있다.
바람직하게, 대상은 척추동물이다. 보다 바람직하게, 대상은 포유류이다. 가장 바람직하게 대상은 인간이다. 그러나, 대상은 다른 동물, 예를 들면 애완동물(예를 들면, 개, 고양이, 등), 가축(예를 들면, 소, 양, 돼지, 말 등), 또는 실험 동물(예를 들면, 원숭이, 쥐, 생쥐, 토끼, 기니아 피그, 등)일 수 있다.
본 발명에 따른 엑센딘 변형 및/또는 엑센딘 변형 콘쥬게이트는 별도로 적용될 수 있다. 그러나, 약학적 조성물로서 적용하는 것이 바람직하고, 이는 목적의 투여경로에 따라서 선택된 항상 적당한 약물 부형제, 희석제 또는 캐리어를 포함한다. 이들은 임의의 적당한 수단에 의해서 환자/필요대상에 적용될 수 있다. 정확한 투여량은 엑센딘 변형 및 엑센딘 변형 콘쥬게이트의 정확한 특성을 포함한 다양한 요소에 따라서 다를 수 있다.
일부 적당한 투여 경로는 경구, 직장, 코, 국부(구강 및 혀 포함), 피하, 질내 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 진피내, 척수강 및 경막) 투여를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 등장화제 및/또는 보존제를 포함하고, 바람직하게 등장화제는 슈크로오스, 만니톨, 소디움 클로라이드 및 글리세롤 중 하나 이상이고, 보존제는 m-크레졸, 벤질 알콜, 메틸 p-하이드록시벤조에이트파라벤, 에틸 p-하이드록시벤조에이트, 프로필 p-하이드록시벤조에이트 및 부틸 p-하이드록시벤조에이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 당업자는 예를 들면 등장화 부형제, 예를 들면 생리식염수, 링거액 또는 락테이트 링거액 등을 사용함으로써 본 발명에 따른 엑센딘 변형 및 엑센딘 변형 콘쥬게이트의 적당한 용액을 제조할 수 있다. 필요에 따라서, 안정제, 버퍼제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 첨가될 수 있다. 경구 투여용 약학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 경구액, 등의 형태일 수 있다. 정제는 고체 캐리어, 예를 들면 젤라틴 또는 보조제를 포함할 수 있다. 액상 약학적 조성물은 항상 액상 캐리어, 예를 들면, 물, 석유, 동물 오일 또는 식물 오일, 광물 오일 또는 합성 오일을 포함한다. 생리식염수, 글루코스 또는 다른 탄수화물의 용액 또는 디올, 예를 들면 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 액상 제제 및/또는 냉동건조된 제제의 형태이다. 바람직하게 냉동건조된 제제는 냉동건조 방지제를 포함한다. 보다 바람직하게, 냉동건조 방지제는 슈크로오스, 락토오스, 만니톨, 트레할로스 및 다른 탄수화물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
엑센딘 변형 및/또는 엑센딘 변형의 콘쥬게이트는 바람직하게 "치료적 유효량" 또는 "유효량"으로 대상에게 투여된다. 조성물은 바람직하게 "치료적 유효량"으로 대상에게 투여하고 치료적 유효량 또는 유효량은 대상에게 혜택을 제공하기에 충분하다. 실제 투여량 및 투여속도 및 방법은 치료될 대상의 상태 및 심각성에 따라 다르다. 치료 처방(예를 들면 투여량 결정, 등)은 치료될 질병, 환자의 개별 상태, 전달 부위, 투여방법 및 의사에게 공지된 다른 요소에 의해서 결정된다.
일부 실시형태에서, 엑센딘 변형 및/또는 엑센딘 변형의 콘쥬게이트의 투여량 범위는 30 mg/kg body weight/day 내지 0.00001 mg/kg body weight/day, 또는 3 mg/kg/day 내지 0.0001 mg/kg/day, 또는 0.3 mg/kg /day 내지 0.01 mg/kg/day이다.
본 발명은 엑센딘 변형 및/또는 엑센딘 변형 콘쥬게이트의 치료적 유효량을 그 필요대상에게 투여하는 단계를 포함한 질병의 치료방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 질병은 식후 덤핑 증후군(posprandial dumping syndrome), 식후 고혈당증, 내당능 장애, 비만, 섭취장애, 인슐린 내성 신드롬, 당뇨병, 및 고혈당으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 질병은 타입 2 당뇨병이다.
공지된 바와 같이, 엑센딘은 비만의 환자의 체중을 감소시키고 메스꺼움 및 구토를 유발할 수 있고, 그 대사는 중추신경계에서 섭식중추의 억제 및 구토 중추의 활성에 관련된다(Larsen. Mechanisms behind GLP-1은 체중 손실 유발. Br J Diabetes Vasc Dis 2008; 8: S34-41; Schick et al. 글루카곤 유사 펩티드 1 (7-36)-아미드는 쥐의 음식섭취를 억제하기 위해서 외측과 내측 시상하부에서 작용, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2003; 284:R1427-5). 엑센딘 또는 그 변형의 콘쥬게이트는 분자량이 증가하기 때문에 혈액뇌관벽을 통과할 수 없고, 따라서 엑센딘에 의해서 유발된 구토를 저하시킬 수 있다. 따라서, 출원인은 본 발명의 개시전에, 엑센딘 또는 그 변형의 콘쥬게이트이 중추신경계에 의해서 조절된 음식 섭취량 및 체중 저하에서 엑센딘의 영향을 줄일 수 있는 것을 예상했다. 그러나 출원인들은 놀랍게도 야생형 엑센딘 및 비-콘쥬게이트 엑센딘 변형이 체중 및 섭취량을 감소시키더라도 엑센딘 또는 그 변형의 콘쥬게이트가 체중 및 음식 섭취량의 감소 효과를 현저히 향상시키는 것을 발견했다.
따라서, 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 엑센딘 또는 이들의 변형의 콘쥬게이트 및/또는 이들 포함한 약학적 조성물을 사용함으로서 체중을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 체중 감소하기 위한 약물 제조에서 엑센딘 또는 이들의 변형의 콘쥬게이트 및/또는 이를 포함한 약학적 조성물의 사용을 제공한다. 일 실시형태에서 엑센딘 또는 이들의 변형의 콘쥬게이트는 상기 기재된 바와 같이 본 발명의 엑센딘 변형의 콘쥬게이트이다.
본 발명은 하기에 기재된 실시예에 의해서 설명되지만 어떠한 상황에서도 제한되지 않는 것으로 이해된다. 본 출원에서 인용된 문헌(참조문헌, 등록특허, 공개 특허출원 및 동시계속 특허 출원을 포함)은 명백하게 본원에 참조로 포함되어 있다. 하기 실시예에서 사용된 시약 및 물질은 적어도 분석적인 순수한 또는 동등한 수준의 시판 제품이다.
실시예
하기 실시예에서 기술적 용액의 설명을 용이하게 하기 위해서 본 실시예에서 사용된 엑센딘, 엑센딘 변형 및 이들의 콘쥬게이트의 일련번호 및 간략한 설명은 하기 표에 제공된다.
일련번호 간략한 설명
PB -101 야생형 엑센딘 -4, 또한 엑세나타이드로 칭함
PB -102 위치 35에서 Cys 가 치환된 엑센딘 -4
PB -103 위치 30에서 Cys 가 치환된 엑센딘 -4
PB -104 위치 25에서 Cys 가 치환된 엑센딘 -4
PB -105 위치 39에서 Cys 가 치환된 엑센딘 -4
PB -106 PEG20000 와 콘쥬게이트된 PB -105
PB -106b PEG20000 , 더블 아암 PEGb 와 콘쥬게이트된 PB -105
PB -106c PEG20000 , 더블 아암 PEGc 와 콘쥬게이트된 PB -105
PB -106d PEG20000 , 더블 아암 PEGd 와 콘쥬게이트된 PB -105
PB -106e PEG20000 , 더블 아암 PEGe 와 콘쥬게이트된 PB -105
PB -107 PEG30000 와 콘쥬게이트된 PB -105
PB -108 PEG40000 와 콘쥬게이트된 PB -105
PB -109 PEG20000x2 , 더블 아암 PEG 와 콘쥬게이트된 PB -105
PB -109b PEG20000x2 , 더블 아암 PEGb 와 콘쥬게이트된 PB -105
PB -109c PEG20000x2 , 더블 아암 PEGc 와 콘쥬게이트된 PB -105
PB -109d PEG20000x2 , 더블 아암 PEGd 와 콘쥬게이트된 PB -105
PB -110 PEG5000 와 콘쥬게이트된 PB -105
PB -110b PEG5000b 와 콘쥬게이트된 PB -105
PB -110c PEG5000c 와 콘쥬게이트된 PB -105
PB -111 C 말단에서 Tyr 이 첨가된 PB -105
PB -112 PEG20000 와 콘쥬게이트된 PB -111
PB -113 위치 2에서 Gly 가 dAla 로 치환된 PB -105
PB -114 PEG40000 와 콘쥬게이트된 PB -113
PB -119 PEG23000 와 콘쥬게이트된 PB -105
PB -120 PEG27000 와 콘쥬게이트된 PB -105
실시예 1. 엑센딘-4 및 이들의 변형의 고상 합성
폴리펩티드 합성은 생화학 및 약학 분야에서 종래의 방법이다. 다양한 형태의 폴리펩티드 합성장치는 많은 영리조직(예를 들면, GE HealthCare, Applied Biosystems Inc.)으로부터 시판되고, 많은 영리조직(예를 들면 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Shanghai Biocolor BioScience&Technolgy Company)는 통상의 폴리펩티드 합성에 대한 서비스를 제공한다. 예를 들면, 특정한 배열을 갖는 폴리펩티드는 하기의 절차를 사용하여 폴리펩티드 합성장치에 의해서 합성될 수 있다.
엑센딘-4 및 티올기를 갖는 이들의 변형은 "Fmoc-Rinker Amide MBHA resin"형 고형 지지체를 사용하여 Fmoc 아미노기 보호 전략에 의해서 합성되었다. 제 1 단계: N,N-메틸포름아미드(DMF) 용제에서 Fmoc 보호된 아미노산은 축합제로서 HBTU/DIPEA를 사용하여 1-5시간동안 반응시키고 닌하이드린 방법을 사용하여 축합반응의 완료를 관찰했다. 제 2 단계:반응은 탈보호제로서 10-30% 피페리딘을 사용하여 30분동안 실시되었고 아미노산 보호기의 탈보호의 완료는 닌하이드린 방법을 사용하여 관찰되었다. 제 3 단계: 서열에서 마지막 아미노산이 결합될 때까지 목적의 폴리펩티드 서열에 따라서 각각의 아미노산을 사용하여 제 1 및 제 2 단계를 반복했다. 제 4 단계: 반응은 고상 지지체로서 폴리펩티드를 절단하고 동시에 탈보호하기 위해서 절단제로서 TFA를 사용하여 1-5시간동안 행했다. 제 5단계: 절단 후 폴리펩티드 용액은 에틸 에테르를 사용하여 석출시키고 여과했다. 여액을 수집했다. 그 다음에 C18형 크로마토그래피 칼럼은 이동상으로서 0.1% TFA/아세토니트릴-물에 의한 용리에 사용되고 분획을 수집하고 냉동건조하여 생성물을 얻었다. 제 6 단계: 생성물의 순도는 HPLC 방법을 사용하여 식별하고 그 생성물의 구조는 아미노산 서열 분석 및 질량 스펙트럼에 의해서 결정되었다.
출원인은 Chengdu Kaijie Biomedical science company에게 상기의 방법에 의해서 하기의 서열을 갖는 폴리펩티드의 합성을 요청했다:
PB-101：하기와 같은 아미노산 서열을 갖는 야생형 엑센딘-4:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 1);
PB-102：C-말단에서 위치 35가 Cys인, 하기와 같은 아미노산 서열을 갖는 Exendin-4 변형:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Cys-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 3);
PB-105：C-말단에서 위치 39가 Cys인, 하기와 같은 아미노산 서열을 갖는 Exendin-4 변형:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys (서열번호 4)
PB-103：C 말단에서 위치 30은 Cys인, 하기와 같은 아미노산 서열을 갖는 Exendin-4 변형:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Cys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 5);
PB-104：C 말단의 위치 25는 Cys인, 하기와 같은 아미노산 서열을 갖는 Exendin-4 변형:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Cys-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 6);
PB-111：C 말단에서 위치 39는 Cys로 치환되고 Tyr에 결합된, 하기와 같은 아미노산 서열을 갖는 Exendin-4 변형:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys-Tyr (SEQ ID NO：7); 및
PB-113：N 말단의 위치 2에서 Gly는 dAla로 치환되고, C 말단에서 위치 39는 Cys로 치환된, 하기와 같은 아미노산 서열을 갖는 Exendin-4 변형:
His-dAla-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys (서열번호 8)
실시예로서, 도 1은 PB-105의 질량 스펙트럼의 분석결과를 제공하고, PB-105의 M+1 피크(질량+1)는 MALDI-TOF MS에 의해서 결정된 4203.3Da이고, 이는 이론적인 질량(4202.8)과 상응한다.
실시예 2a PB-110의 제조 및 분석(PEG5000-PB-105)
2.0g의 PB-105를 20 mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 6.5)의 1mL에 용해되고, 5mg의 PEG5000(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 5000은 PEG의 분자량이 5kDa이고 분자구조가 도 2에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 적당하게 교반되었다. 반응은 20℃에서 1시간동안 실시하고 과잉의 시스테인 용액(0.5M 시스테인 용액의 0.1 mL)에 의해서 반응을 중단하고 마지막으로 -20℃에서 더욱 정제하였다.
시료는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에서 5배 희석하고, SP 이온 교환 크로마토그래피 칼럼(XK16/20 column, macroCap SP packing, GE Inc.)에 적재하고, 5배 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이뤘다. 적재 후, 상기 칼럼은 2배의 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이루고, 버퍼는 20배의 칼럼 체적에서 100% 버퍼 B(1M NaCl을 함유하는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5))까지 선형으로 증가시켰다. 용리 피크는 AKTA 정제장치에서 수집되었다. 결정된 바와 같이, 약 1mg의 펩티드를 얻었다.
분석 HPLC(Agilent 1200)에서 분석된 바와 같이, 기공크기 300A을 갖는 C4-역상 분석 칼럼(Jupiter C4 300A 4.6*250mm) 및 61/39 내지 54/46(10min)의 0.1% TFA 수용액/0.1% TFA 아세토니트릴 용액을 장착했다. 시료는 분석 HPLC(Agilent 1200)에 의해서 분석되고, 유지시간 10.4min이고, 순도는 100%(도 3참조)이었다. GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 97%이었다.
실시예 2b. PB-110b의 제조 및 분석(PEG5000b-PB-105)
2.0mg의 PB-105을 1mL의 22mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 5mg의 PEG5000b(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 분자구조가 도4에 도시된다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 다른 단계 실시예 2a와 동일하다. 마지막으로 GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고), 순도는 96.7%이었다.
실시예 2c PB-110c의 제조 및 분석(PEG5000c-PB-102)
2.0mg의 PB-105을 1mL의 22mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 5mg의 PEG5000c(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 분자구조가 도5에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 다른 단계 실시예 2a와 동일하다. 마지막으로 GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고), 순도는 97.8%이었다.
실시예 3a PB-106의 제조 및 분석(PEG20000-PB-105)
2.0mg의 PB-105을 1mL의 20mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 5mg의 PEG20000(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 20000은 PEG 분자량의 20kDa를 나타내고, 분자구조가 도2에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 반응은 20℃에서 1시간 동안 행하고, 과잉의 시스테인 용액(0.5M 시스테인 용액의 0.1 mL)에 의해서 반응을 중단하고, 마지막으로 -20℃에서 더욱 정제하였다.
상기 시료는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에서 5배 희석하고, SP 이온 교환 크로마토그래피 칼럼(XK16/20 column, macroCap SP packing, GE Inc.)에 적재하고, 상기 칼럼은 5배 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이뤘다. 적재 후, 상기 칼럼은 2배의 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이루고, 상기 버퍼는 20배의 칼럼 체적에서 100% 버퍼 B(1M NaCl을 함유하는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5))까지 선형으로 증가시켰다. 용리 피크는 AKTA 정제장치에서 수집되었다. 결정된 바와 같이, 약 1mg의 펩티드를 얻었다.
수집된 용액은 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해서 검출되고, Coomassie Brilliant Blue and iodo-staining(도 6a 및 6b 참조)에 의해서 염색했다. 용리는 기공크기 300Å을 갖는 C4-역상 분석 칼럼(Jupiter C4 300A 4.6*250mm) 및 61/39 내지 54/46(10min) 구배를 갖는 0.1% TFA 수용액/0.1% TFA 아세토니트릴 용액을 사용해서 행했다. 상기 시료는 분석 HPLC(Agilent 1200)에 의해서 분석하고, 유지시간 11.5min이고, 순도는 100%(도 7참조)이었다. GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 98.9%이었다.
실시예 3b. PB-106b의 제조 및 분석(PEG20000b-PB-105)
1.0mg의 PB-105을 1mL의 20mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 2.5mg의 PEG20000b(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 20000은 PEG 분자량의 20kDa를 나타내고, 분자구조가 도8에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해시키고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 다른 단계는 실시예 3a와 동일하다. 마지막으로, GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 98.2%이었다.
실시예 3c. PB-106c의 제조 및 분석(PEG20000c-PB-105)
2.0mg의 PB-105을 1mL의 20mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 20mg의 PEG20000c(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 20000은 PEG 분자량의 20kDa를 나타내고, 분자구조가 도9에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 다른 단계는 실시예 3a와 동일하다. 마지막으로, GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 97.2%이었다.
실시예 3d. PB-106d의 제조 및 분석(PEG20000d-PB-105)
2.0mg의 PB-105을 1mL의 20mM 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 20mg의 PEG20000c(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 20000은 PEG 분자량의 20kDa를 나타내고, 분자구조가 도10에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 다른 단계는 실시예 3a와 동일하다. 마지막으로, GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 97.5%이었다.
실시예 3e. PB-106e의 제조 및 분석(PEG20000e-PB-105)
2.0mg의 PB-105을 1mL의 20mM 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 20mg의 PEG20000e(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 20000은 PEG 분자량의 20kDa를 나타내고, 분자구조가 도11에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 다른 단계는 실시예 3a와 동일하다. 마지막으로, GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 95.8%이었다.
실시예 3f. PB-112의 제조 및 분석(PEG20000-PB-111)
2.0mg의 PB-111을 1mL의 20mM 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 19mg의 PEG20000(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 20000은 PEG 분자량의 20kDa를 나타내고, 분자구조가 도2에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 반응은 20℃에서 1시간동안 행하고 과잉의 시스테인 용액(0.5M 시스테인 용액의 0.1 mL)에 의해서 반응을 중단하고 마지막으로 -20℃에서 더욱 정제하였다.
상기 시료는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에서 5배 희석하고, SP 이온 교환 크로마토그래피 칼럼(XK16/20 column, macroCap SP packing, GE Inc.)에 적용하고 상기 칼럼은 5배 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이뤘다. 적재 후, 상기 칼럼은 2배의 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이루고, 20배의 칼럼 체적에서 100% 버퍼 B(1M NaCl을 함유하는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5))까지 선형으로 증가시켰다. 용리 피크는 AKTA 정제장치에서 수집되었다. 결정된 바와 같이, 약 1mg의 펩티드를 얻었다.
수집된 용액의 용리는 기공크기 300A을 갖는 C4-역상 분석 칼럼(Jupiter C4 300A 4.6*250mm) 및 61/39 내지 54/46(10min) 구배를 갖는 0.1% TFA 수용액/0.1% TFA 아세토니트릴 용액을 사용해서 행했다. 시료는 분석 HPLC에 의해서 분석되고, 유지시간 10.6min이고, 순도는 98.5%(도 12참조)이었다. GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 98.7%이었다.
실시예 4. PB-107의 제조 및 분석(PEG30000-PB-105)
2.0mg의 PB-105을 1mL의 20mM 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 30mg의 PEG30000(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 30000은 PEG 분자량의 30kDa를 나타내고, 분자구조가 도2에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 반응은 20℃에서 1시간동안 행하고 과잉의 시스테인 용액(0.5M 시스테인 용액의 0.1 mL)에 의해서 반응을 중단하고 마지막으로 -20℃에서 더욱 정제하였다.
상기 시료는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에서 5배 희석하고, SP 이온 교환 크로마토그래피 칼럼(XK16/20 column, macroCap SP packing, GE Inc.)에 적용하고 5배 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이뤘다. 적재 후, 상기 칼럼은 2배의 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이루고, 20배의 칼럼 체적에서 100% 버퍼 B(1M NaCl을 함유하는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5))까지 선형으로 증가시켰다. 용리 피크는 AKTA 정제장치에서 수집되었다. 결정된 바와 같이, 약 1mg의 펩티드를 얻었다.
수집된 용액은 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해서 검출되고, Coomassie Brilliant Blue and iodo-staining(도 6a 및 6b 참조)에 의해서 염색했다. 용리는 기공크기 300Å을 갖는 C4-역상 분석 칼럼(Jupiter C4 300Å 4.6*250mm) 및 61/39 내지 54/46(10min) 구배를 갖는 0.1% TFA 수용액/0.1% TFA 아세토니트릴 용액을 사용해서 행했다. 시료는 분석 HPLC에 의해서 분석되고, 유지시간 11.5min이고, 순도는 97.3%(도 13참조)이었다. GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 98.7%이었다.
실시예 5a. PB-108의 제조 및 분석(PEG40000-PB-105)
2.0mg의 PB-105을 1mL의 20mM 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 40mg의 PEG40000(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 40000은 PEG 분자량의 40kDa를 나타내고, 분자구조가 도2에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 반응은 20℃에서 1시간동안 행하고 과잉의 시스테인 용액(0.5M 시스테인 용액의 0.1 mL)에 의해서 반응을 중단하고 마지막으로 -20℃에서 더욱 정제하였다.
시료는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에서 5배 희석하고, SP 이온 교환 크로마토그래피 칼럼(XK16/20 column, macroCap SP packing, GE Inc.)에 적재하고 상기 칼럼은 5배 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이뤘다. 적재 후, 칼럼은 2배의 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이루고, 20배의 칼럼 체적에서 100% 버퍼 B(1M NaCl을 함유하는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5))까지 선형으로 증가시켰다. 용리 피크는 AKTA 정제장치에서 수집되었다. 결정된 바와 같이, 약 1mg의 펩티드를 얻었다.
수집된 용액은 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해서 검출되고, Coomassie Brilliant Blue and iodo-staining(도 6a 및 6b 참조)에 의해서 염색했다. 용리는 기공크기 300A을 갖는 C4-역상 분석 칼럼(Jupiter C4 300A 4.6*250mm) 및 61/39 내지 54/46(10min) 구배를 갖는 0.1% TFA 수용액/0.1% TFA 아세토니트릴 용액을 사용해서 행했다. 시료는 분석 HPLC(Agilent 1200)에 의해서 분석되고, 유지시간 11.4min이고, 순도는 100%(도 14참조)이었다. GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 97.2%이었다.
실시예 5b. PB-114의 제조 및 분석(PEG40000-PB-113)
2.0mg의 PB-113을 1mL의 20mM 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 40mg의 PEG40000(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 40000은 PEG 분자량의 40kDa를 나타내고, 분자구조가 도2에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 반응은 20℃에서 1시간동안 행하고 과잉의 시스테인 용액(0.5M 시스테인 용액의 0.1 mL)에 의해서 반응을 중단하고 마지막으로 -20℃에서 더욱 정제하였다.
시료는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)를 사용하여 5배 희석하고, SP 이온 교환 크로마토그래피 칼럼(XK16/20 column, macroCap SP packing, GE Inc.)에 적용하고 상기 칼럼은 5배 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이뤘다. 적재 후, 칼럼은 2배의 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이루고, 20배의 칼럼 체적에서 100% 버퍼 B(1M NaCl을 함유하는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5))까지 선형으로 증가시켰다. 용리 피크는 AKTA 정제장치에서 수집되었다. 결정된 바와 같이, 약 1mg의 펩티드를 얻었다.
수집된 용액의 용리는 기공크기 300Å을 갖는 C4-역상 분석 칼럼(Jupiter C4 300Å 4.6*250mm) 및 61/39 내지 54/46(10min) 구배를 갖는 0.1% TFA 수용액/0.1% TFA 아세토니트릴 용액을 사용해서 행했다. 시료는 분석 HPLC에 의해서 분석되고, 유지시간 12.6min이고, 순도는 97.9%(도 15참조)이었다. GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 98.4%이었다.
실시예 6a. PB-109의 제조 및 분석(PEG20000×2(더블-아암 PEG)-PB-105)
2.0mg의 PB-105을 1mL의 20mM 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 40mg의 PEG20000*2(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 20000은 PEG에서 하나의 암의 분자량의 20kDa를 나타내고, 분자구조가 도16에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 반응은 20℃에서 1시간동안 행하고 과잉의 시스테인 용액(0.5M 시스테인 용액의 0.1 mL)에 의해서 반응을 중단하고 마지막으로 -20℃에서 더욱 정제하였다.
시료는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)를 사용하여 5배 희석하고, SP 이온 교환 크로마토그래피 칼럼(XK16/20 column, macroCap SP packing, GE Inc.)에 적용하고 5배 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이뤘다. 적재 후, 상기 칼럼은 2배의 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이루고, 20배의 칼럼 체적에서 100% 버퍼 B(1M NaCl을 함유하는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5))까지 선형으로 증가시켰다. 용리 피크는 AKTA 정제장치에서 수집되었다. 결정된 바와 같이, 약 1mg의 펩티드를 얻었다.
수집된 용액은 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해서 검출되고, Coomassie Brilliant Blue and iodo-staining(도 6a 및 6b 참조)에 의해서 염색했다. 용리는 기공크기 300A을 갖는 C4-역상 분석 칼럼(Jupiter C4 300Å 4.6*250mm) 및 61/39 내지 54/46(10min) 구배를 갖는 0.1% TFA 수용액/0.1% TFA 아세토니트릴 용액을 사용해서 행했다. 시료는 분석 HPLC(Agilent 1200)에 의해서 분석되고, 유지시간 11.5min이고, 순도는 100%(도 17참조)이었다. GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 99.3%이었다.
실시예 6b. PB-109b의 제조 및 분석(PEG20000×2(더블-아암 PEG)b-PB-105)
2.0mg의 PB-105을 1mL의 20mM 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 40mg의 PEG20000×2b(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 20000×2은 PEG 분자량의 20×2kDa를 나타내고, 분자구조가 도18에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 다른 단계는 실시예 6a와 동일하다. 마지막으로, GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 99.2%이었다.
실시예 6c. PB-109c의 제조 및 분석(PEG20000×2(더블-아암 PEG)c-PB-105)
2.0mg의 PB-105을 1mL의 20mM 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 40mg의 PEG20000×2c(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 20000×2은 PEG 분자량의 20×2kDa를 나타내고, 분자구조가 도19에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 다른 단계는 실시예 6a와 동일하다. 마지막으로, GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 98.8%이었다.
실시예 6d. PB-109d의 제조 및 분석(PEG20000×2(더블-아암 PEG)d-PB-105)
2.0mg의 PB-105을 1mL의 20mM 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 40mg의 PEG20000×2d(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 20000×2은 PEG 분자량의 20×2kDa를 나타내고, 분자구조가 도20에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 다른 단계는 실시예 6a와 동일하다. 마지막으로, GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 99.2%이었다.
실시예 7. PB-119의 제조 및 분석(PEG23000-PB-105)
2.0mg의 PB-105을 1mL의 20mM 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 22mg의 PEG23000(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 23000은 PEG에서 하나의 암의 분자량의 23kDa를 나타내고, 분자구조가 도2에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 반응은 20℃에서 1시간동안 행하고 과잉의 시스테인 용액(0.5M 시스테인 용액의 0.1 mL)에 의해서 반응을 중단하고 마지막으로 -20℃에서 더욱 정제하였다.
시료는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)를 사용하여 5배 희석하고, SP 이온 교환 크로마토그래피 칼럼(XK16/20 column, macroCap SP packing, GE Inc.)에 적용하고 상기 5배 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이뤘다. 적재 후, 상기 칼럼은 2배의 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이루고, 20배의 칼럼 체적에서 100% 버퍼 B(1M NaCl을 함유하는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5))까지 선형으로 증가시켰다. 용리 피크는 AKTA 정제장치에서 수집되었다. 결정된 바와 같이, 약 1mg의 폴리펩티드를 얻었다.
수집된 용액의 용리는 기공크기 300Å을 갖는 C4-역상 분석 칼럼 (Jupiter C4 300Å 4.6*250mm) 및 61/39 내지 54/46(10min) 구배를 갖는 0.1% TFA 수용액/0.1% TFA 아세토니트릴 용액을 사용해서 행했다. 시료는 분석 HPLC(Agilent 1200)에 의해서 분석되고, 유지시간 11.6min이고, 순도는 96.0%(도 21참조)이었다. GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 97.1%이었다.
실시예 8. PB-120의 제조 및 분석(PEG27000-PB-105)
2.0mg의 PB-105을 1mL의 20mM 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 용해시키고, 24mg의 PEG27000(PegBio Co., Ltd. (Suzhou)에 의해서 공급되고, 27000은 PEG에서 하나의 암의 분자량의 27kDa를 나타내고, 분자구조가 도2에 도시된 것을 나타낸다)은 펩티드에 대한 PEG의 몰비 2:1에 따라서 무게를 재고 상기 용액에 첨가했다. PEG를 용해하고 펩티드와 균일한 혼합액을 형성하기 위해서 상기 용액을 적당하게 교반했다. 반응은 20℃에서 1시간동안 행하고 과잉의 시스테인 용액(0.5M 시스테인 용액의 0.1 mL)에 의해서 반응을 중단하고 마지막으로 -20℃에서 더욱 정제하였다.
시료는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에서 5배 희석하고, SP 이온 교환 크로마토그래피 칼럼(XK16/20 column, macroCap SP packing, GE Inc.)에 적용하고 상기 5배 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이뤘다. 적재 후, 상기 칼럼은 2배의 칼럼 체적의 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 의해서 균형을 이루고, 20배의 칼럼 체적에서 100% 버퍼 B(1M NaCl을 함유하는 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5))까지 선형으로 증가시켰다. 용리 피크는 AKTA 정제장치에서 수집되었다. 결정된 바와 같이, 약 1mg의 펩티드를 얻었다.
수집된 용액의 용리는 기공크기 300Å을 갖는 C4-역상 분석 칼럼(Jupiter C4 300Å 4.6*250mm) 및 61/39 내지 54/46(10min) 구배를 갖는 0.1% TFA 수용액/0.1% TFA 아세토니트릴 용액을 사용해서 행했다. 시료는 분석 HPLC(Agilent 1200)에 의해서 분석되고, 유지시간 12.1min이고, 순도는 97.7%(도 22참조)이었다. GPC 분석은 (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem)을 사용하고, 용리는 0.1M 소디움 니트레이트 용액의 조건하에서 1.0mL/min에서 실시되고, 순도는 98.4%이었다.
실시예 9. PB-105 폴리에틸렌 글리콜 콘쥬게이트의 안정성 시험
PB-110 (PEG5000-PB-105), PB-106 (PEG20000-PB-105), PB-107 (PEG30000-PB-105), PB-108 (PEG40000-PB-105) 및 PB-109 (PEG20000*2-PB-105)은 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5) 및 포스페이트 버퍼(pH 7.0)에서 4℃ 및 -20℃에서 각각 배치하고 안정성을 평가했다. 시료는 7, 15, 30, 60일에서 HPLC 분석을 실시했다. 60일 동안 결과는 시료가 pH 4.5 및 -20℃ (도 23a), 및 pH 7.0 및 4℃ 또는 -20℃에서 안정했다는 것을 나타냈다 (도 23b,23c).
실시예 10. 세포간 cAMP 활성에 대한 PB-101 및 PB-105의 실험관내 효과
PC12 세포가 소화되고, 105 세포/mL의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종되고, 48시간동안 배양했다(60-70% 컨플루언시). 배지를 제거하고 포스페이트 버퍼(PBS)를 사용하여 2회 세정하였다. 1% BSA를 함유한 1mL PBS를 첨가했다. C 말단의 위치 39에서 시스테인을 갖는 엑센딘-4 변형 PB-101 및 PB-105(10-11, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7 및 10-6 M)는 30분동안 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX, 최종농도 100μM)에 의해서 배양되었다. 배지를 제거했다. 500 ㎕ HCl(0.1M)를 첨가하여 효소에 의해서 cAMP의 열화를 중지시켰다. 세포를 수집하고 초음파에 의해서 용해했다. 세포 내의 단백질 함량은 BCA에 의해서 결정되었다. 표준곡선은 cAMP 효소 결합 면역 키트(U.S. RD System corporation) 지시사항을 사용하여 다른 농도를 갖는 일련의 표준 그룹을 설정함으로써 플롯팅되었다. 흡광도는 반응 후 ELISA 리더(U.S. Thermo Fisher Scientific Corporation)에서 450nm에서 결정되었다. 표준곡선에서 이러한 흡광도를 사용하여 CAMP 농도를 읽었다. 그 다음에, 시료의 cAMP 농도를 계산했다. 세포간 cAMP의 증가에 대한 PB-101 및 PB-105의 효과에 대한 투여량-반응관계는 Graphpad Prizm 소프트웨어를 사용하여 산출했다.
실험결과는 도 24에 도시되었다. PB-101는 투여량-의존에서와 같이 PC12 세포 내의 cAMP의 함량을 증가시키고, 증가된 cAMP의 최대값(Emax)는 133.2±7.2 pmol/100 ㎍(단백질)이고, EC50은 1.9×10-9 M이었다. PB-105는 PB-101에 비해서 PC12 세포에서 cAMP에 대한 유사한 실험관내 효과를 갖는다. PC-105의 증가된 cAMP(Emax)의 최대값은 129.4±6.8 pmol/100 ㎍ (단백질) (PB-105 vs PB-101, P > 0.05)이고; EC50 은 2.5x10-9 M이었다. 또한 분석은 PB-101 및 PB-105의 Log EC50은 각각 -8.71±0.15 및 -8.61±0.15 (PB-105 vs PB-101, P > 0.05)이다. PB-101의 생물학적인 활성은 C-말단의 위치 39에서 시스테인(티올)의 도입에 의해서 변경되지 않았다.
실시예 11. 세포간 cAMP 활성에 대한 PB-105 및 페길화 콘쥬게이트의 실험관내 효과
PC12 세포가 소화되고, 105 세포/mL의 밀도로 24-웰 플레이트에서 접종되고, 48시간동안 배양되었다(60-70% 컨플루언시). 배지를 제거하고 인산 버퍼(PBS)를 사용하여 2회 세정하였다. 1% BSA를 함유하는 1mL PBS를 첨가했다. PB-105, PB-105 페길화 (PEG5000) 콘쥬게이트 (PB-110), PB-105 페길화 (PEG20000) 콘쥬게이트 (PB-106), PB-105 페길화 (PEG30000) 콘쥬게이트 (PB-107), PB-105 페길화 (PEG40000) 콘쥬게이트 (PB-108) 및 PB-105 페길화 (PEG20000×2, 더블 아암) 콘쥬게이트 (PB-109) (10-11, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6 및 10-5 M) 는 30분동안 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX, 최종농도 100μM)에 의해서 배양되었다. 배지를 제거했다. 500 ㎕ HCl(0.1M)를 첨가하여 효소에 의해서 cAMP의 열화를 중지했다. 세포를 수집하고 초음파에 의해서 용해했다. 세포 내의 단백질 함량은 BCA에 의해서 결정되었다. 표준곡선은 cAMP 효소 결합 면역 키트(U.S. RD System corporation) 지시사항을 사용하여 다른 농도를 갖는 일련의 표준 그룹을 설정함으로써 플롯팅되었다. 흡광도는 반응 후 ELISA 리더(U.S. Thermo Fisher Scientific Corporation)에서 450nm에서 결정되었다. 이러한 흡광도를 사용하여 표준곡선에서 cAMP 농도를 읽었다. 그 다음에, 시료의 cAMP 농도를 계산했다. 세포간 cAMP의 증가에 대한 PB-106, PB-107, PB-108, PB-109 및 PB-110의 효과에 대한 투여량 반응관계는 Graphpad Prizm 소프트웨어를 사용하여 산출했다.
실험결과는 PB-105가 투여량-의존에서와 같이 PC12 세포 내의 cAMP의 함량을 증가시키고, 증가된 cAMP의 최대값(Emax)는 103.9±1.5 pmol/100 ㎍(단백질)이고, EC50은 1.3×10-9 M이었다. 페길화 개질은 투여량-반응 관계 곡선을 분자량-독립(5-40kDa)과 같이 우측으로 평행하게 이동시키고, PB-105의 생물학적 활성을 감소시킨다(도 25). PB-110, PB-106, PB-107, PB-108 및 PB-109의 EC50은 각각 1.1×10-9,1.1×10-9, 1.2×10-8, 9.7×10-8 및 1.3×10-7 M이었다. 5 kDa (PB-110) 및 20 kDa (PB-106)의 페길화 개질은 PB-105의 활성에 대한 효과가 거의 없고(활성은 각각 PB-105 활성의 115%이었다), 30 kDa (PB-107) 및 40 kDa(선형 및 더블 아암, PB-108 및 PB-109 포함) 페길화 변형은 PB-105의 활성을 약 90% 및 99%까지 감소시켰다. 페길화 콘쥬게이트에서 PEG의 분자량과 이들 약물의 활성(Log EC50)의 관계는 도 26a에 도시된다(도24에서 PB-105의 EC50을 포함).
실시예 12. 세포간 cAMP 활성에 대한 PB-105 및 페길화 콘쥬게이트의 실험관내 효과
PC12 세포가 소화되고 105 세포/mL의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종되고 48시간동안 배양했다(60-70% 커플루언시). 배지를 제거하고, 인산 버퍼(PBS)를 사용하여 2회 세정했다. 1% BSA를 함유하는 1mL PBS를 첨가했다. PB-105, PB-105 페길화 (PEG23000) 콘쥬게이트 (PB-119) 및 PB-105 페길화 (PEG27000) 콘쥬게이트 (PB-120 (10-11, 10-10, 10-9, 3×10-9, 10-8 및 10-7 M)는 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX, 최종농도 100μM)에 의해서 30분동안 배양되었다. 배지를 제거했다. 500 ㎕ HCl(0.1M)를 첨가하여 효소에 의해서 cAMP의 열화를 중지했다. 세포를 수집하고 초음파에 의해서 용해했다. 세포 내의 단백질 함량은 BCA에 의해서 결정되었다. 표준곡선은 cAMP 효소 결합 면역 키트(U.S. RD System corporation) 지시사항을 사용하여 다른 농도를 갖는 일련의 표준 그룹을 설정함으로써 플롯팅되었다. 흡광도는 반응 후 ELISA 리더(U.S. Thermo Fisher Scientific Corporation)에서 450nm에서 결정되었다. 이러한 흡광도를 사용하여 표준곡선에서 CAMP 농도를 읽었다. 그 다음에, 시료의 cAMP 농도를 계산했다. 세포간 cAMP의 증가에 대한 PB-105, PB-119, 및PB-120의 효과의 투여량 반응관계는 Graphpad Prizm 소프트웨어를 사용하여 산출했다.
실험결과는 PB-105가 투여량-의존에서와 같이 PC12 세포 내의 cAMP의 함량을 증가시키고, EC50은 2.7×10-9M이었다. PB-106 (PEG20000) 및 PB-119 (PEG23000) 은 cAMP에 대해 PB-105의 활성에 대한 효과가 없고, PB-120 (PEG27000) 는 투여량-반응 곡선을 우측으로 평행하게 이동시키고 cAMP에 대해 PB-105의 생물학적 활성을 약 50%까지 감소시켰다(도27). PB-106, PB-119 및 PB-120 의 EC50은 각각 1.5×10-9, 2.5×10-9 및 5.4×10-9 M이었다.
일반적으로 콘쥬게이트된 생체분자의 생물학적 활성은 콘쥬게이트된 기(예를 들면 4kDa)의 분자량의 증가에 따라서 지수함수적으로 감소할 것이다(Bailon et al. 인터페론의 유력한, 지속적인 형태의 합리적인 설계: 헤파티스 C의 처리동안 40kDa 분기 폴리에틸렌 글리콜-콘쥬게이트 인터페론 α-2a, Bioconjugate Chem 2001 ; 12:195-202; Bowen 등. 폴리에틸렌 글리콜 콘쥬게이트 과립구 콜로니-자극 요소 변이의 분자량 및 활성기간 사이의 관계, Experimental Hematology 1999; 27:425-32; Bailon 등, PEG-개질화 생물약제학. Expert Opin Deliv. 2009; 6:1-16). 그러나, 본 출원인들은 놀랍게도 도 25 및 27에서 콘쥬게이트된 폴리머기의 분자량과 실험관내 자극 cAMP에 대해 엑센딘 변형 콘쥬게이트의 활성 사이의 관계는 이러한 기대를 완전히 만족시키지 못한다. 23 kDa 이하의 분자량을 갖는 PEG에 의해서 콘쥬게이트된 엑센딘 변형의 콘쥬게이트에 대해서, 페길화 개질은 cAMP를 생성하기 위해서 실험관내 자극 세포에 대해서 엑센딘 변형의 콘쥬게이트 활성에 대한 효과가 없다( 및 PEG의 분자량이 27 kDa 이하인 경우, 단지 약한 효과가 있다). 반면, 페길화 개질은 cAMP 생성(Emax)을 자극하기 위해서 PB-105의 최대 효과를 나타내지 않는다. PB-110, PB-106, PB-107, PB-108 및 PB-109의 Emax는 각각 102.1±1.8, 111.9±2.1, 126.2±3.4, 100.4±1.7 및 115.5±3.5 pmol/100 ㎍ 단백질이다. 페길화 콘쥬게이트에서 PEG의 분자량은 이들 약물의 Emax와 상관관계를 갖지 않는다(도 26b 참조)(도 24에서 PB-105의 Emax를 포함).
본 발명자는 놀라운 결과에 기초해서 하기의 분석을 행했다. 많은 프로테이나제가 존재한 혈청을 함유한 배지는 이러한 실시예에서 반응계로서 사용되지 않고 프로테이나제는 반응 용액에 첨가되지 않고, 엑센딘 변형 및 이들의 콘쥬게이트의 효소 열화는 체내에서보다 상당히 낮다. 즉, 긴 작용 시간을 갖는 체내 시험의 경우에, 본 발명의 엑센딘 변형의 콘쥬게이트의 생물학적 활성이 더 높은 경우에도 본 발명에 따른 엑센딘 변형의 콘쥬게이트의 생물학적 활성의 감소 정도는 콘쥬게이트되지 않은 야생형 엑센딘 또는 엑센딘 변형보다 적다. 또다른 형태에서, 23 kDa 를 초과한 폴리머 모이어티가 사용되어 체내 생물학적 활성에 상당히 영향을 미치지 않고 엑센딘 변형을 콘쥬게이트할 수 있다. 본 발명은 이러한 이론에 한정되지 않고, 예상은 하기 실시예에 제공된다.
실시예 13. PB-101 및 PB-105의 혈당 저하작용의 시간-반응 실험
수컷 쿤밍 생쥐(체중 27-32g)를 제공했다. 생쥐는 실험전에 음식 또는 물을 제공했다. 이들은 각각의 그룹에서 6 마리씩 3개의 그룹으로 랜덤하게 분포되었다. 같은 부피의 식염수(10ml/kg), PB-101(10㎍/kg) 및 C-말단의 위치 39에서 시스테인을 갖는 엑센딘 변형 PB-105(10㎍/kg)는 보러스내 피하주사하였다. 주사 후 0, 1, 2, 4, 8, 12 시간에, 꼬리 끝에서 혈액 샘플링을 행했다. 혈당은 수반된 OneTouch 혈당 측정장치 및 시험 스트립(U.S.John & Johnson)를 사용하여 결정하였다. 혈당저하 작용의 시간-반응 곡선은 PB-101 및 PB-105의 혈당저하 작용의 생물학적 반감기를 산출하기 위해서 y축의 다른 시점에서 혈당 및 x축의 시점을 사용하여 플롯팅되었다. 결과는 도 28에 도시된다. 시스테인으로 치환된 엑센딘-4 변형 및 엑센딘-4의 반감기는 각각 4.7±0.2시간 및 4.4±0.2시간(PB-105 vs PB-101, P>0.05)이다. C-말단의 위치39에서 시스테인으로 치환된 엑센딘-4 변형 및 엑센딘-4는 유사한 반감기를 갖는 것을 나타낸다.
실시예 14. PB-101 및 PB-105의 혈당저하 작용의 투여량-반응 실험
수컷 쿤밍 생쥐(체중 23-27g)를 제공했다. 생쥐는 실험전에 음식을 3시간동안 절식하지만 물은 제공했다. 이들은 랜덤하게 각각의 그룹에서 6마리씩 3개의 그룹으로 분포했다. 동일한 부피의 식염수(10ml/kg), PB-101(0.01,0.1,0.3,1,3,10,100 ㎍/kg) 및 C-말단의 위치 39에서 시스테인을 갖는 엑센딘 변형 PB-105 (0.01,0.1,0.3,1,3,10,100 ㎍/kg)은 보러스내에 피하 주사했다. 주사 1시간후, 꼬리 끝에서 혈액 샘플링을 행했다. 혈당은 수반된 OneTouch 혈당 측정장치 및 시험 스트립(U.S.John & Johnson)를 사용하여 결정하였다. 혈당저하 작용의 시간-반응 곡선은 y축의 혈당값 및 x축의 투여량을 사용하여 플롯팅되었다(도 29). 이어서, PB-101 및 PB-105의 투여량-반응 관계 변수 (Emaxand ED50)는 Graphpad Prizm 소프트웨어를 사용하여 산출했다. 결과는 PB-101 및 PB-105의 보러스 주사의 최대 혈당저하 효율은 각각 32.2% 및 36.1%이고, ED50값은 각각 0.6 및 1.2㎍/kg이었다. 분석은 PB-101 및 PB-105의 Log ED50은 각각 -0.25±0.17 및 0.08±0.20 (PB-105 vs PB-101, P>0.05)인 것을 나타낸다. 실험결과는 C-말단의 위치 39에서 시스테인을 갖는 엑센딘-4 변형 PB-105는 혈당저하 작용에 대해서 엑센딘-4와 큰 차이는 없다.
실시예 15. PB-101 및 이들의 변형(PB-102)에 대한 혈당저하 작용의 투여량-반응 실험
수컷 쿤밍 생쥐(체중 22-26g)를 제공했다. 생쥐는 실험전에 음식을 3시간동안 절식하지만 물을 제공했다. 이들은 각각 그룹에서 6 마리씩 18 그룹으로 랜덤하게 분포시켰다. 동일한 부피의 식염수 (10mL/kg), PB-101(0.01,0.1,1,10,100 ㎍/kg), 및 C-말단의 위치 35에서 시스테인을 갖는 엑센딘 변형 PB-102(0.01,0.1,1,10,100 ㎍/kg) 는 보루내에 피하 주사되었다. 주사 1시간 후, 꼬리 끝에서 혈액 샘플링을 행했다. 혈당은 수반된 OneTouch 혈당 측정장치 및 시험 스트립(U.S.John & Johnson)를 사용하여 결정하였다. 혈당저하 작용의 투여량-반응 곡선은 y축의 혈당값 및 x축의 투여량을 사용하여 플롯팅 되었다(도 30). 이어서, PB-101 및 PB-102의 투여량-반응 관계 변수 (Emax 및 ED50)는 Graphpad Prizm 소프트웨어를 사용하여 산출했다. 결과는 PB-101 및 PB-102의 보러스 주사의 최대 혈당저하 효율은 각각 39.8% 및 32.8%이고, ED50값은 각각 0.5 및 2.5㎍/kg이었다. 분석은 PB-101 및 PB-105의 Log ED50은 각각 -0.2867±0.2272 및 0.4015±0.2946 (PB-102 vs PB-101, P>0.05)인 것을 나타낸다. 실험결과는 C-말단의 위치 35에서 시스테인을 갖는 엑센딘-4 변형 PB-102는 혈당저하 작용에 대해서 엑센딘-4와 큰 차이는 없다.
실시예 16. 등량의 PB-105 및 페길화 콘쥬게이트의 혈당저하 작용의 시간-반응 관계 실험
수컷 쿤밍 생쥐(체중 22-26g)를 제공했다. 생쥐는 실험전에 음식 또는 물을 제공했다. 이들은 각각의 그룹에서 12마리 쥐의 6개의 그룹으로 랜덤하게 분포했다. 같은 체적의 PB-105 (10 ㎍/kg), PB-105 페길화 (PEG5000) 콘쥬게이트 PB-110 (10 ㎍/kg), PB-105 페길화 (PEG20000) 콘쥬게이트 PB-106 (10 ㎍/kg), PB-105 페길화 (PEG30000) 콘쥬게이트 PB-107 (10 ㎍/kg), PB-105 페길화 (PEG40000) 콘쥬게이트 PB-108 (10 ㎍/kg) 및 PB-105 페길화 (PEG20000×2, 더블 아암) 콘쥬게이트 PB-109 (10 ㎍/kg)는 보러스내에 피하 주사했다. 주사 후 0, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 36 시간에, 꼬리 끝에서 혈액 샘플링을 행했다. 혈당은 수반된 OneTouch 혈당 측정장치 및 시험 스트립(U.S.John & Johnson)를 사용하여 결정하였다. PB-105 및 페길화 콘쥬게이트의 혈당저하 작용의 최대 혈당저하 작용 및 생물학적 반감기, 또한 혈당 저하 작용의 곡선 위의 면적(표1)을 계산하기 위해서, 혈당저하 작용의 시간-반응 곡선은 y축의 다른 시간 및 x축의 시간을 사용하여 플롯팅 되었다(도 31). 표 1로부터 알 수 있듯이, 이러한 실험에서 엑센딘 변형의 모든 콘쥬게이트는 유사한 또는 동일한 상당하게 더 높은 (PB-106) 누적된 혈당저하 작용(곡선 상부 면적 참조)을 갖고, 이들 엑센딘 변형의 콘쥬게이트는 콘쥬게이트 되지 않은 PB-105에 비해서 상당히 긴 생물학적 반감기를 갖는다. PEG 분자량 vs 생물학적 반감기, 최대 혈당저하 작용 및 혈당저하 작용의 곡선 위의 면적에 대한 분석은 PB-105, 페길화 콘쥬게이트 PB-106, PB-107, PB-108 및 PB-109 모두 상당하게 PB-105의 혈당저하 작용기간(반감기 t1/2)을 연장시키는 것을 나타낸다. 그러나, PEG 분자량은 5-20 kDa의 범위 내이면, 생물학적 반감기간 연장은 분자량에 비례하고, 20 kDa보다 크면, 혈당저하 작용의 기간(생물학적 반감기)는 동일하게 유지한다(도 32a). PEG 분자량이 5-20kDa의 범위이면 페길화 콘쥬게이트는 동일한 최대 혈당저하 작용을 갖지만, 20kDa보다 크면 페길화 콘쥬게이트는 PEG 분자량의 증가에 따라서 최대 혈당저하 작용이 감소한다(도 32b). 혈당저하 작용의 곡선 상부 면적에 대해서, 단지 PB-106(PEG 20kDa)는 PB-105보다 상당히 높은 누적 혈당저하 작용을 갖고, 다른 콘쥬게이트는 동일한 또는 약간 적은 효과를 갖는다(도 32c). 상기로부터 공지된 바와 같이, 부위-특이성 페길화 개질(PB-110 및 PB-106)은 적어도 PEG 분자량이 20 kDa이하이면 엑센딘 변형 콘쥬게이트(각각 PB-105의 96%) 의 최대 혈당저하 작용에 상당히 영향을 미치지 않는다. 페길화 개질은 PEG 분자량이 30 kDa 이상(PB-107, PB-108 및 PB-109)이면, 이들 콘쥬게이트는 유사한 누적된 혈당저하 작용 및 상당히 긴 생물학적 반감기를 갖지만 최대 혈당저하 작용을 상당히 저하시킨다. 이러한 결과는 높은 분자량을 갖는 콘쥬게이트 모이어티는 엑센딘 변형을 콘쥬게이트하는 데에 유용할 수 있다. 이와 같이, 단기간 내의 너무 낮게 감소하고 넓은 범위에서 변동하는 혈당 수준을 방지하기 위해서, 상당히 긴 생물학적 반감기 및 혈당의 더 완만한 및 안정한 수준이 얻어진다. 이러한 발견은 상기 기재된 실험관내 cAMP 실험의 결과에 일치한다.
PB-105 및 페길화 콘쥬게이트(각 그룹내 12마리 생쥐)의 생물학적 반감기, 최대 혈당저하 작용 및 혈당 저하의 곡선 상부 면적(AAC)
엑센딘 콘쥬게이트 T 1 /2 ( hrs ) 최대 혈당저하 작용
( 투여전 값%) 		혈당의 곡선 위의 면적
( AAC , mmol *h/L)
PB -105 4.9±0.1 38.0±4.3 32.8±5.4
PB -110 7.0±2.0 36.3±1.2 31.8±4.6
PB -106 13.4±0.5* 36.5±3.2 53.9±4.3*
PB -107 12.5±2.0* 24.3±2.8* 30.0±7.2
PB -108 10.8±2.0* 22.6±2.9* 25.3±5.7
PB -109 9.2±2.2* 20.2±3.2* 21.6±4.8
* P < 0.05 (vs PB-105)
실시예 17. 등량의 PB-105 및 페길화(PEG30000) 콘쥬게이트(PB-107)의 혈당저하 작용의 시간-반응 관계 실험
실험관내 PEG30000(PB-107)는 PB-105의 생물학적 활성을 약 90%까지 감소시키고(도 25), 체내에서는 PB-105의 생물학적 활성을 약 50%까지 감소시키고(도31), PB-105와 동일한 조건하에서 PB-107의 생물학적 반감기를 연구하기 위해서 PB-107의 투여량을 증가시켰다. 수컷 쿤밍 생쥐(체중 22-25g)을 제공했다. 생쥐는 실험전에 음식 또는 물을 제공했다. 이들은 각각의 그룹에서 6마리 생쥐의 2개의 그룹으로 랜덤하게 분포시켰다. PB-105(10㎍/kg) 및 PB-105 페길화 (PEG30000) 콘쥬게이트 PB-107 (100㎍/kg, 이 투여량은 10㎍/kg PB-105의 약 100% 혈당 저하를 생성)는 보러스 내에 피하 주사되었다. 주사 후 0, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 36, 48, 72 에서, 꼬리 끝에서 혈액 샘플링을 행했다. 혈당은 수반된 OneTouch 혈당 측정장치 및 시험 스트립(U.S.John & Johnson)를 사용하여 결정하였다. 혈당저하 작용의 시간-반응 곡선은 PB-105(10㎍/kg) 및 PB-107(100㎍/kg)의 생물학적 반감기를 산출하기 위해서, y축의 다른 시점에서 혈당값 및 x축의 시간을 사용하여 플롯팅하였다. 이러한 결과는 도 33에 도시되고, PB-105(10㎍/kg) 및 PB-107(100㎍/kg)의 생물학적 반감기는 각각 4.5±0.4 hrs 및 44.6±4.5 hrs (P > 0.05, PB-107 vs PB-105)이다. 동등한 투여량의 시간-반응관계에 대한 연구는 페길화(PEG30000)(PB-107)이 PB-105의 혈당저하 작용 기간을 10배까지 연장시키는 것을 나타낸다.
실시예 18. PB-105 및 페길화(PEG20000) 콘쥬게이트(PB-106)의 혈당저하 작용의 투여량-반응 실험
수컷 쿤밍 생쥐(체중 22-24g)를 제공했다. 생쥐는 실험전에 3시간동안 음식을 절식하지만 물은 제공하였다. 이들은 각각의 그룹에서 6마리 생쥐의 13개의 그룹으로 랜덤하게 분포했다. 같은 체적의 식염수(10ml/kg), PB-105(0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 ㎍/kg) 및 동등한 투여량의 페길화(PEG20000) 콘쥬게이트 PB-106(0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 ㎍/kg)는 보러스내에 피하 주사되었다. PB-105 그룹의 주사 1시간 후 (혈당의 감소 피크 시점, 도 28 및 31 참조), PB-106 그룹의 주사 4시간 후(혈당 감소 피크 시점, 도 31 참조), 꼬리 내의 혈액 샘플링을 행했다. 혈당은 수반된 OneTouch 혈당 측정장치 및 시험 스트립(U.S.John & Johnson)를 사용하여 결정하였다. 혈당저하 작용의 투여량-반응 곡선은 y축의 혈당값 및 x축의 투여량을 사용하여 플롯팅하였다(도 34). 이어서, PB-105 및 PB-106의 투여량 반응 관계 변수(Emin, Emax 및 ED50)은 Graphed Prizm 소프트웨어를 사용하여 산출하였다. PB-105 및 PB-106의 보러스 주사의 Emin은 각각 8.3 ±0.2 및 8.4 ±0.3 mmol/L이고; Emax는 각각 6.0 ±0.3 및 5.5±0.6 mmol/L 이었다(최대 혈당저하 효율은 각각 27.8% 및 34.5%이다). PB-105 및 PB-106의 ED50은 각각 1.2 및 3.3㎍/kg이었다. 분석은 PB-105 및 PB-106의 Log ED50은 각각 0.07±1.2 및 0.5±0.2(PB-106 vs . PB-105,P > 0.05) 이었다. 실험결과는 PB-105(PB-106)의 페길화(PEG20000) 콘쥬게이트는 혈당저하 작용(Emax 및 ED50)에 대해서 PB-105과 상당한 차이를 갖지 않는다.
실시예 19. 정상 생쥐내에서 PB-105, PB-111 및 페길화 콘쥬게이트(PB-106 및 PB-112)의 혈당저하 작용의 시간-반응 관계 실험
수컷 쿤밍 생쥐(체중 24-30g)을 제공했다. 생쥐는 실험전에 음식물 또는 물을 제공했다. 이들은 각각의 그룹에서 6마리 생쥐의 4개의 그룹으로 랜덤하게 분포되었다. PB-105 (10 ㎍/kg), PB-105의 페길화 (PEG20000) 콘쥬게이트 (PB-106) (10 ㎍/kg), PB-111 (10 ㎍/kg) 및 PB-111의 페길화 (PEG20000) 콘쥬게이트 (PB-112) (10 ㎍/kg)는 보러스내에 피하 주사되었다. PB-111은 PB-105 유도체이며, C-말단의 위치 39에서 시스테인이 티로신에 결합된다. 주사 0, 0.5,1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 후, 꼬리 끝에 혈액 샘플링을 행했다. 혈당은 수반된 OneTouch 혈당 측정장치 및 시험 스트립(U.S.John & Johnson)를 사용하여 결정하였다. 혈당저하 작용의 시간-반응 곡선은 PB-105, PB-111 및 페길화 콘쥬게이트의 최대 혈당저하 작용 및 생물학적 반감기를 산출하기 위해서, y축의 다른 시점에서 혈당 및 x축의 시간을 사용하여 플롯팅했다. 결과는 도 35에 도시되고, PB-105, PB-106, PB-111 및 PB-112는 시간-의존과 같은 방법으로 생쥐 내의 랜덤하게 혈당을 감소시켰다. PB-105 및 PB-111의 생물학적 반감기는 각각 4.6 시간 및 6.0시간이고, 최대 혈당저하 작용은 각각 44.7% 및 36.4%이다. PB-106 및 PB-112의 생물학적 반감기는 19.6 및 21.7시간이고, 최대 혈당저하 작용은 각각 37.3% 및 34.9%이다. 이러한 결과는 C-말단의 위치 39에서 가해진 티로신이 PB-105 및 페길화 콘쥬게이트(PB-106)의 혈당저하 작용의 활성 및 생물학적 반감기에 대한 효과가 없다.
실시예 20. STZ 당뇨병 생쥐에서 PB-101, 그 변형 PB-105, PB-111 및 PB-113, 또한 페길화 콘쥬게이트 PB-106, PB-112 및 PB-114의 혈당저하 작용에 대한 시간-반응 관계 실험
생쥐는 당뇨병을 유발하기 전에 14시간동안 절식시켰다. 혈액 시료는 혈당의 블랭크 값을 결정하기 위해서 꼬리 끝에서 채혈했다. 그 다음에, 새롭게 제조된 STZ(스트렙토조토신)(120mg/10mL/kg, 0.1M 질산 용액에서 새롭게 제조된, 용해된 것, pH 4.5)는 보러스에 피하 주사했다. 혈당은 3일후 결정했다. 랜덤한 혈당이 16.7mmol/L을 초과한 생쥐는 당뇨병을 성공적으로 유발한 생쥐로서 생각되었다. 생쥐는 실험전에 음식물 또는 물을 제공하였다. 이들은 각각의 그룹에서 4-6마리 생쥐의 7개 그룹으로 분포되었다. 0시간의 혈당은 꼬리 정맥에서 채혈하여 결정하였다. 동등한 부피의 PB-101(10㎍/10mL/kg), PB-105 (10 ㎍/kg), PB-106 (10 ㎍/kg), PB-111 (10 ㎍/kg), PB-112 (10 ㎍/kg), PB-113 (10 ㎍/kg) 및 PB-114 (10 ㎍/kg)은 보러스내에 피하 주사했다. PB-111은 PB-105유도체이고, 여기서 C-말단의 위치 39에서 시스테인이 티로신에 결합되고, PB-113은 PB-105 유도체이고, N-말단의 2위치에서 글리신이 D-알라닌으로 치환되었고, PB-114는 PB-113의 페길화(PEG40000) 콘쥬게이트이다. 주사 후 0, 0.5,1, 2, 4, 8, 12, 24, 48에서, 혈액 샘플링을 행하고 혈당을 결정했다. PB-101, PB-105, PB-106, PB-111, PB-112, PB-113 및 PB-114 의 혈당저하 작용의 시간-반응 곡선은 y축의 다른 시점에서 혈당값 및 x축의 시점을 사용하여 플롯팅되었다. 곡선은 GraphPad Prism 5 Demo 소프트웨어 (Prism v5, Graphpad 소프트웨어, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 플롯팅되고, PB-101, PB-105, PB-106, PB-111, PB-112, PB-113 및 PB-114 의 생물학적 반감기(t1 /2)를 산출하고 수학적 통계방법을 사용하여 비교했다.
도 36에 도시된 바와 같이, PB-101, PB-105, PB-106, PB-111, PB-112, PB-113 및 PB-114의 보러스 주사는 시간-의존과 같이 STZ-유발 당뇨병 생쥐에서 랜덤하게 혈당을 감소시켰다. 최대 효율은 각각 47.5%, 57.6%, 69.8%, 54.4%, 59.7%, 49.2% 및 17.9% (단지 PB-101에서는 38%)이었다. PB-101, PB-105, PB-106, PB-111, PB-112 및 PB-113의 생물학적 반감기는 각각 5.5, 5.5, 21.8, 5.0, 20.3 및 5.9 시간이고, PB-114의 생물학적 반감기는 혈당저하 작용 때문에 산출될 수 없다. 실험적인 결과는 C-말단의 39 위치에서 가해진 티로신 또는 N-말단의 위치 2에서 글리신의 D-알라닌으로 치환이 PB-105의 항혈당저하 활성을 감소시키지 않고, 페길화(PEG20000)는 PB-105 및 이들의 유도체의 활성을 감소시키지 않지만, 페길화(PEG40000)는 PB-105 및 이들 유도체의 활성을 상당히 감소시키지 않는 것을 나타냈다.
실시예 21. 등량의 PB-105 및 PB-106, PB-119 및 PB-120의 혈당저하 작용의 시간-반응 관계 실험
수컷 쿤밍 생쥐(체중 24-30g)을 제공했다. 생쥐는 실험전에 음식물 또는 물을 제공했다. 이들은 각각의 그룹에서 6마리 생쥐의 4개의 그룹으로 랜덤하게 분포되었다. PB-105 (10 ㎍/kg), PB-105의 페길화 (PEG20000) 콘쥬게이트 (PB-106) (10 ㎍/kg), PB-105의 페길화 (PEG23000) 콘쥬게이트 (PB-119) (10 ㎍/kg), 및 PB-105의 페길화 (PEG27000) 콘쥬게이트 (PB-120) (10 ㎍/kg)는 보러스내에 피하 주사되었다. 주사 0, 0.5,1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 후, 꼬리 끝에 혈액 샘플링을 행했다. 혈당은 수반된 OneTouch 혈당 측정장치 및 시험 스트립(U.S.John & Johnson)를 사용하여 결정하였다. 혈당저하 작용의 시간-반응 곡선은 PB-105 및 페길화 콘쥬게이트의 최대 혈당저하 작용 및 생물학적 반감기를 산출하기 위해서, y축의 다른 시점에서 혈당 및 x축의 시간을 사용하여 플롯팅했다. 결과는 도 37에 도시되고, PB-105, PB-106, PB-119 및 PB-120는 시간-의존과 같은 방법으로 생쥐 내의 랜덤하게 혈당을 감소시켰다. 이들의 생물학적 반감기는 각각 6.0, 21.7, 24.1 및 26.1이고, 생물학적 반감기는 PEG 분자량의 증가에 따라서 증가되었다. 혈당저하 작용의 피크시간은 각각 1 hr (PB-105) 및 4 hr (PB-106, PB-119 및 PB-120)이었다. 혈당저하 작용의 피크값은 35.0%, 50.9%, 48.2% 및 42.2% (도 37a)이다. 혈당저하 작용-시간 영역으로서 산출된 바와 같이, PB-106, PB-119 및 PB-120 모두 PB-105의 혈당저하 작용을 상당히 증가시켰다(3-4배까지 증가). 누적된 효과는 PEG 분자량의 증가에 따라서 증가하였다(도 37b). 실험결과는 페길화가 PB-105의 혈당저하 활성을 감소시키지 않고, 혈당저하 작용의 기간을 상당히 연장시키며 분자량이 20-27kDa일 때 누적된 혈당저하 작용을 증가시켰다. 이것으로부터 알 수 있듯이, PEG 분자량이 20-27kDa이면, 본 발명에 따른 엑센딘 변형의 콘쥬게이트, PB-106, PB-119 및 PB-120는 콘쥬게이트 되지 않은 PB-105에 비해서 혈당저하 작용의 높은 피크값을 제공한다. 또한, 이들 콘쥬게이트는더 양호한 결합된 혈당저하 작용을 제공하기 위해서, 상당히 긴 시간의 혈당저하 작용을 갖고 PEG 분자량의 증가에 따라서 누적된 혈당저하 작용이 증가한다.
실시예 22. PB-101, PB-105, PB-106 및 PB-120의 비둘기 구토 시험
건강한 수컷 또는 암컷 비둘기는 각각의 그룹에서 4-8마리 비둘기의 7개 그룹으로 분포되었다. PB-101 (3 mg/kg, N = 4 또는 6 mg/kg, N = 8), PB-105 (3 mg/kg, N = 4 또는 6 mg/kg, N = 8), PB-106 (3 mg/kg, N = 4 또는 6 mg/kg, N = 8) 및 PB-120 (6 mg/kg, N = 8) 는 별도로 보러스 피하주사되었다. 구토시간 및 구토 대기시간(투여로부터 제 1 구토까지의 기간)이 관찰되고 전자 모니터 시스템을 사용하여 투여 24시간 후에 기록했다. 구토시간은 목 신장, 입개구, 어깨 들어올림, 복부 수축 및 마지막으로 안정 또는 구토 끝의 1주기로서 정의되었다. 이전의 경험은 구토 반응이 예를 들면 비둘기 내의 투여없음과 같은 정상 상황에 의해서는 유발되지 않고, PB-101의 투여(3 및 6 mg/kg) 및 PB-105(3 및 6 mg/kg)의 투여는 투여량-의존과 같이 상당한 구토를 유발하는 것을 나타냈다. PB-106 (3 mg/kg 및 6 mg/kg) 및 PB-120 (6 mg/kg) 그룹에서, 구토 대기시간은 PB-101 및 PB-105의 상응하는 투여량의 그룹에 비해서, 상당히 연장되고(약 5-18배까지 연장된다, 도38a 참조), 구토 시간이 상당히 감소되었다(약 50-70%, 도 38b 참조). 6 mg/kg의 투여량에 대해서, 그 차이가 통계적으로 상당하였다(p<0.05). 페길화는 엑센딘 및 그 변형에 대한 구토 반응을 상당히 감소시키는 것을 나타냈다.
실시예 23. 기니아 피그에서 PB-101, PB-105 및 PB-106에 의해서 유발된 전신과민반응 및 체중에 대한 영향
44마리의 건강한 기니아 피크를 제공하고, 각각의 기니아 피그의 체중은 약 300g이었다. 이들은 5개의 그룹, 즉 식염수(N = 10), PB-101(N = 10), PB-105 (N = 10), PB-106 (N = 10) 및 알부민 그룹 (N = 4)으로 분포되었다. 식염수 (1 ml/kg), PB-101 (100 ㎍/kg), PB-105 (100 ㎍/kg), PB-106 (100 ㎍/kg) 및 치킨 오발부민 (80 mg/kg) 은 각각 연속 3회 하루 걸러 각각 주사했다. 마지막 주사 후 14일에 식염수(1 ml/kg), PB-101 (300 ㎍/kg), PB-105 (300 ㎍/kg), PB-106 (300 ㎍/kg) 및 알부민 (240 mg/kg) 의 자극량은 각각 꼬리 정맥을 통해서 주사되었다. 주사직후, 자극후 0-3시간동안 동물반응을 관찰했다. 동물내 과민 반응의 증상은 표2에 도시된 바와 같이 기록되고, 표 3(반-정량)에 도시된 바와 같이 평가되었다.
동물에서 과민반응 증상
0 정상 7 숨가쁨(shortness of breath) 14 보행불안(gait)
1 불안(Restless) 8 배뇨(urination) 15 점프(jump)
2 모간(hair shaft) 9 배변(defecation) 16 천식(respite)
3 떨림(trembling) 10 눈물 17 경련(cramps)
4 코긁음(scratch nose) 11 호흡곤란(breathing difficulty) 18 회전(rotation)
5 재채기(sneezes) 12 천명(wheezing) 19 조식호흡(tidal breathing)
6 기침(cough) 13 자반(purpura) 20 사망(dead)
동물에서 전신 과민반응의 평가도 및 반-정량 표준
0 - 0 네거티브 과민반응
1-4 증상 + 1 약한 네거티브 과민반응
5-10 증상 ++ 2 포지티브 과민반응
11-19 증상 +++ 3 강한포지티브 과민반응
20 ++++ 4 매우 강한 포지티브 과민반응
곡선은 도 39에 도시된 바와 같이, x축의 시점 및 y축의 과민반응 정도(반-정량)를 사용해서 플롯팅되었다. 임의의 과민반응은 식염수 대조군의 기니아 피그에서 발견되지 않고, 즉 네가티브 과민반응이다. 알부민 그룹에서의 기니아 피그는 자극 직후(<2분) 사망, 즉 매우 강한 포지티브 과민반응이다. PB-101 및 PB-105그룹에서 기니아 피그는 과민반응, 즉 포지티브 과민반응이다. PB-101 및 PB-105는 39 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드이고 장기간 투여후 체내에서 항체 생성을 유발할 수 있다(Buse 등, 타입 2 당뇨병을 갖는 술포닐우레아 치료된 환자에서 30주에 걸쳐서 혈당 제어에 대한 엑세나타이드(엑센딘-4)의 영향). 또한, PB-105 페길화(PEG20000) 콘쥬게이트 PB-106은 기니아 피그에서 약한 네가티브 과민반응을 일으켰다. 이러한 결과는 페길화(PB-106)가 PB-101 또는 PB-105의 면역성 및 과민반응을 상당히 저하시킬 수 있는 것을 나타냈다.
x축의 시점 및 y축의 기니아 피크 체중을 사용하여 플롯팅한 곡선은 감작동안 식염수 그룹에서 기니아피크의 체중을 증가시키는 것을 나타냈다(체중은 실험 18일동안 약 38%까지 증가했다). 체중은 생리식염수 그룹에 비해서 알부민의 2회 연속 투여 4일 후까지 감소하지 않았다. 그러나, 기니아 피크의 체중은 PB-101(100㎍/kg) 또는 PB-105(100㎍/kg)의 2회 연속 투여 4일 후에 약 8% 및 11%까지(p<0.05)까지 각각 감소했다. 기니아 피그의 체중은 PB-101 또는 PB-105에 비해서 동등한 양의 PB-106 의 투여후 더욱 감소했다. PB-106의 투여는 PB-101 및 PB-105의 투여에 비해서 약8% 및 11% 감소했다(p<0.05). PB-101, PB-105 및 PB-106 그룹에서 기니아 피그의 체중은 식염수 그룹과 비교해서 투여 중단 12일 후 회복되었다.
실시예 24. 쥐의 체중 및 음식물 섭취량에 대한 PB-105, PB-106, PB-119 및 PB-120의 영향
24마리의 건강한 SD 쥐를 제공하고, 체중은 약 200g이었다. 쥐는 5개 그룹: 식염수(1 ml/kg, N = 4), PB-105(100 ㎍/kg, N = 5), PB-106 (100 ㎍/kg, N = 5), PB-119 (100 ㎍/kg, N = 5) 및 PB-120 (100 ㎍/kg, N = 5)으로 분포했다. 식염수 및 약물은 각각 연속 3회동안 하루 걸러 피하 주사했다. 쥐의 체중 및 음식물 섭취변화량은 매일 관찰했다.
곡선은 x축의 시점 및 y축의 쥐의 체중을 사용하여 플롯팅된 곡선(도 41a)은 식염수 그룹에서 쥐의 체중은 투여중에 지속적으로 증가했다(체중은 실험 9일동안 33.4%까지 증가했다). 체중(지표로서 체중-시간 AUC에 의해서)은 식염수 그룹에 비해서 PB-105(100㎍/kg)의 연속 3회 투여 9일 후 약 5.3%까지 감소했다(p<0.05). 동등한 양의 PB-106, PB-119, 및 PB-120의 투여는 PB-105보다 더욱 체중 감소를 일으켰다. 체중(지표로서 체중-시간 AUC에 의해서)은 PB-105의 투여에 비해서 PB-106, PB-119 및 PB-120의 투여의 경우에 각각 약 7%, 8% 및 8% 까지 감소했다(p<0.05).
x축의 시점 및 y축의 쥐의 음식 섭취량을 사용하여 플롯팅된 곡선(도 41b)은 식염수 그룹의 쥐의 음식물 섭취량은 투여중에 실질적으로 유지되는 것을 나타냈다. 음식물 섭취량(지표로서 음식물 섭취량-시간 AUC에 의해서)는 식염수 그룹에 비해서 PB-105(100㎍/kg)의 연속 3회 투여후 약 16%까지 감소했다. 동등한 양의 PB-106, PB-119 및 PB-120 투여는 PB-105보다 음식물 섭취량의 감소를 일으켰다. 18%, 19% 및 19%(p<0.05)의 감소는 PB-105의 투여에 비해서 PB-106, PB-119 및 PB-120의 투여의 경우에 얻어졌다.
엑세나타이드는 비만환자의 체중을 감소시키고 메스꺼움 및 구토반응을 유발할 수 있고, 이러한 작용 메카니즘은 중추 신경계에서 섭식중추의 억제 및 구토 중추의 활성에 관련된다(Larsen. Mechanisms behind GLP-1는 체중손실을 유발하고, Br J Diabetes Vasc Dis 2008; 8 (Suppl 2): S34-41; Schick et al. 글루카곤 유사 펩티드 1 (7-36)-아미드는 쥐의 음식섭취를 억제하기 위해서 외측과 내측 시상하부에서 작용. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2003;284:R1427-35). 그러나, 엑센딘 또는 이들의 변형의 콘쥬게이트는 과량의 분자량 때문에 혈액뇌장벽을 통과하는 것은 곤란하므로 PB-101에 의해서 유발된 구토 반응을 감소시킬 수 있다(실시예 22 참조). 따라서, 이러한 연구를 시작하기 전에, 출원인은 엑센딘 또는 이들의 변형이 중추신경계에 의해서 조절된 음식물 섭취량 및 체중의 감소에서 엑센딘의 영향을 감소시키는 것을 예상했다. 그러나, 출원인은 야생형 엑센딘 및 콘쥬게이트되지 않은 엑센딘 변형이 체중 및 음식물 섭취를 감소시키더라도, 놀랍게도 엑센딘 또는 이들의 변형의 PEG 콘쥬게이트는 체중 및 음식물 섭취 감소의 상당히 향상된 효과를 갖는 것을 알아냈다.
실시예 25. PB-101 및 PB-105의 약물동태학 실험
수컷 SD 쥐(체중:250-300g, Shanghai Lab Animal Center, Chinese Science Academy로부터 구입)은 30% 클로랄 하이드레이트(300 mg/kg)를 가하여 마취시켰다. 대퇴동맥 및 정맥 카테터법은 큰 대퇴부의 상부 우측 에지를 절개하고 대퇴동맥 및 정맥을 해부함으로써 행했다(polyethylene PE50 tube, U.S. Becton Dickinson Corporation). 우측 동맥 카테터는 혈액 샘플링에 사용되고, 우측 정맥 카테터는 투여에 사용되었다. PE-50 튜브는 배면 피하를 통해서 목뒤에서 삽입했다. 카테터는 헤파린 용액(200U/mL)을 채우고 절개부분을 봉합했다. 수술후, 쥐는 별도의 케이지에 수용하고 12 시간 초과해서 회복되었다. 카테터를 갖는 쥐는 케이지에서 움직임 및 식단이 자유롭다. 쥐는 PB-101 및 PB-105 그룹으로 분포시켰다(각각의 그룹에서 3-6마리 쥐). 5㎍/kg의 제제는 우측 대퇴정맥에서 보러스 주사에 의해서 가해졌다. 혈액 시료는 각각 투여 0.08, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6 시간 후 채혈했다. 혈액 시료는 혈장 제조를 위해서 에펜도르프 튜브에 넣고 원심분리하고(5000 rpm, 5min), 사용할 때까지 -20℃에서 보관했다. 시료의 약물 농도를 혈장 시료의 모든 그룹의 완전 제조후 엑세나타이드 EIA 키트(Phoenix Pharmaceuticals, Inc. USA)에 의해서 결정되었다. PB-101 및 PB-105의 약물-시간 곡선은 y축의 혈장 농도 및 x축의 시간을 사용하여 플롯팅하였다. 결과는 PB-105 및 PB-101가 유사한 분포 및 쥐의 클리어런스를 갖는 것을 나타냈다.
비-구획 방법의 변수 통계학적 분석은 PB-101 및 PB-105의 약물통태학 변수(Cmax, AUC0 -t, AUC0 -∞, t1 /2, MRT, CL 및 Vss, etc.)를 산출하기 위해서 Kinetica 5.0 (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) 소프트웨어를 사용하여 실시하였다. 이러한 결과는 표 4에 나타냈다. PB-101 및 PB-105의 혈장 반감기는 각각 4.8±0.7 및 4.9±1.4 시간(PB-105 vs . PB-101, P > 0.05)이고, 약물-시간 곡선의 곡선 하부 면적은 각각 45.4±1.6 및 47.9±19.0 ng*hr/ml (PB-105 vs . PB-101, P > 0.05)이다. 실험결과는 PB-105 및 PB-101는 유사한 약물동태학 특성을 갖는 것을 나타냈다.
Figure 112011092172939-pct00010
실시예 26. PB-105 및 페길화 콘쥬게이트의 약물동태학 실험
수컷 SD 쥐(체중:250-300g, Shanghai Lab Animal Center, Chinese Science Academy로부터 구입)은 30% 클로랄 하이드레이트(300 mg/kg)를 가하여 마취시켰다. 대퇴동맥 및 정맥 카테터법은 큰 대퇴부의 상부 우측에지를 절개하고 대퇴동맥 및 정맥을 해부함으로써 행했다(polyethylene PE50 tube, U.S. Becton Dickinson Corporation). 우측 동맥 카테터는 혈액 샘플링에 사용되고, 우측 정맥 카테터는 투여에 사용되었다. PE-50 튜브는 배면 피하를 통해서 목뒤에서 삽입했다. 카테터는 헤파린 용액(200U/mL)을 채우고 절개부분을 봉합했다. 수술후, 쥐는 별도의 케이지에 수용하고 12 시간 초과해서 회복되었다. 카테터를 갖는 쥐는 케이지에서 움직임 및 식단이 자유롭다. 쥐는 6개의 그룹으로 분포시켰다(각각의 그룹에서 3마리 쥐):PB-105, PB-110, PB-106, PB-107, PB-108 및 PB-109. 5㎍/kg의 제제는 우측 대퇴정맥에서 보러스 주사에 의해서 가해지고, 다른 시점에서 0.2 mL 혈액을 채혈했다. 투여후 48 시간동안, 혈액 샘플링은 PE50 튜브를 사용하여 실시하고, 48시간 후, 혈액 샘플링은 꼬리 정맥을 통해서 행했다. 구체적으로, PB-105 group (투여 후 0.08, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6 시간), PB-110 group (투여 후 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 hrs), PB-106 group (투여 후 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 hrs), PB-107 group (투여 후 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144 hrs), PB-108 및 PB-109 group (투여 후 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168 hrs ). 혈액 시료는 혈장 제조를 위해서 에펜도르프 튜브에 넣고 원심분리하고(5000 rpm, 5min), 사용할 때까지 -20℃에서 보관했다. 시료에서 약물의 농도를 혈장 시료의 모든 그룹의 완전히 제조 후 엑세나타이드 EIA 키트(Phoenix Pharmaceuticals, Inc. USA)에 의해서 결정되었다. 페길화 콘쥬게이트의 약물-시간 곡선은 y축의 혈장 농도 및 x축의 시간을 사용하여 플롯팅하였다. PB-105 및 페길화 콘쥬게이트는 빠른 분배 및 느린 클리어런스를 나타냈다(도 43참조).
비-구획 방법의 변수 통계학적 분석은 PB-105 및 페길화 콘쥬게이트의 약물통태학 변수(Cmax, AUC0 -t, AUC0 -∞, t1 /2, MRT, CL 및 Vss, etc.)를 산출하기 위해서 Kinetica 5.0 (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) 을 사용하여 실시하였다. 이러한 결과는 표 5에 나타냈다. PB-105의 혈장 반감기는 2.9±0.1시간이고, 페길화 콘쥬게이트의 혈장 반감기는 PEG 분자량의 증가에 따라서 증가했다. PB-105의 약물-시간 곡선의 곡선 하부 면적은 18.2±1.9 ng*hr/ml 및 페길화 콘쥬게이트의 약물-시간 곡선의 곡선 하부 면적은 PEG 분자량의 증가에 따라서 증가했다. 도 44a 및 44b는 각각 페길화 콘쥬게이트의 PEG 분자량 및 혈장 반감기, 약물-시간 곡선의 곡선 하부 면적 사이의 관계를 제공하는 것을 나타냈다.
Figure 112011092172939-pct00011
본 발명에 따른 엑센딘 변형은 약물동태학 특성을 향상시키고, 상당히 혈당을 감소시키며 유사한 또는 양호한 생물학적 활성을 갖는다. 시스테인에서 티올을 통해서 폴리머에 부위-특이적으로 결합된 엑센딘 변형의 콘쥬게이트는 엑센딘 변형의 반감기를 상당히 연장시키고 높은 생물학적 활성을 유지한다.
본 발명은 구체적인 실시예에 의해서 설명되었다. 그러나, 당업자는 본 발명이 구체적인 실시예로 한정되지 않고, 당업자는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 범위내에서 일부 변경 및 변형할 수 있다. 이들 변형 및 변경은 본 발명의 범위 내에 있다.
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Claims (39)

  1. 하나 이상의 폴리머 모이어티 (moieties)가 엑센딘 변형(Exendin variant)의 시스테인 잔기에 콘쥬게이트되고, 상기 엑센딘 변형은 야생형 엑센딘 서열과 비교해서 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 아미노산 서열을 가지며, 상기 하나 이상의 폴리머 모이어티는 각각 독립적으로 폴리에틸렌 글리콜이고, 상기 하나 이상의 폴리머 모이어티가 21 kDa 내지 29 kDa의 분자량을 갖는, GLP-1 수용체 아고니스트(agonist)의 활성을 갖는 엑센딘 변형 콘쥬게이트.
  2. 청구항 1에 있어서, 하나 이상의 폴리머 모이어티는 23 kDa 내지 27 kDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 엑센딘 변형 콘쥬게이트.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 야생형 엑센딘 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 엑센딘 변형 콘쥬게이트:
    Exendin-4 서열
    His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 1),
    Exendin-3 서열
    His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 2).
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 엑센딘 변형은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 위치 39에서 Ser에 상응하는 위치에서 시스테인 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 엑센딘 변형 콘쥬게이트.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 엑센딘 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 엑센딘 변형 콘쥬게이트:
    His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Cys-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 3);
    His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys (서열번호 4);
    His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Cys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 5);
    His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Cys-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (서열번호 6);
    His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys-Tyr (SEQ ID NO：7); 또는
    His-dAla-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys (서열번호 8).
  6. 삭제
  7. 엑센딘 변형을 폴리머와 접촉시키는 단계를 포함한 청구항 1에 따른 엑센딘 변형 콘쥬게이트의 제조방법.
  8. 유효량의 청구항 1 에 따른 엑센딘 변형 콘쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 혈당 저하용, 타입 1 당뇨병 및 타입 2 당뇨병을 포함하는 당뇨병 치료용, 또는 혈당 저하 및 타입 1 당뇨병 및 타입 2 당뇨병을 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물.
  9. 삭제
  10. 청구항 8에 있어서, 유효량의 청구항 1 에 따른 엑센딘 변형 콘쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 타입 2 당뇨병 치료용 약학적 조성물.
  11. 청구항 1에 따른 엑센딘 변형 콘쥬게이트, 및 사용 지시사항을 포함한 키트.
  12. 체중감소용 청구항 1에 따른 엑센딘 변형 콘쥬게이트.
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