CN102421796B - Exendin变体及其缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型的Exendin变体以及其上缀合了聚合物的Exendin变体缀合物，含有它们的药物组合物以及它们在治疗疾病比如降低血糖、治疗糖尿病尤其是Ⅱ型糖尿病中的用途。本发明还提供了Exendin缀合物在降低体重中的用途。

Description

Exendin变体及其缀合物
技术领域
本发明涉及新型的Exendin变体及其与聚合物相缀合的缀合物，含有它们的药物组合物以及它们在降低血糖、尤其是治疗糖尿病特别是Ⅱ型糖尿病中的用途。本发明还涉及Exendin缀合物在降低体重中的用途。 
背景技术
随着经济社会的发展、人口平均寿命的延长和生活方式的变化，糖尿病已经成为世界各国主要的卫生保健问题。无论在发达国家或是发展中国家，糖尿病的发病率都在急剧上升。2007年全球约有2.46亿糖尿病患者，全球范围内每10秒钟就有一个糖尿病患者死亡，预计到2025年全世界糖尿病患者将达到3.33亿。我国已成为糖尿病发病的“重灾区”，目前有糖尿病患者4000万，糖尿病的发病率约为5％，是全球糖尿病第二大国(第一为印度)。糖尿病患者分为两种，一是胰岛素依赖型糖尿病(Ⅰ型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(Ⅱ型糖尿病)。其中，Ⅱ型糖尿病占糖尿病患者的90％以上。Ⅱ型糖尿病特点是胰岛素分泌或作用失调及β-细胞功能障碍，致使脂肪、碳水化合物以及蛋白质代谢紊乱，造成慢性血糖过高，最终导致各种微血管、大血管及各种脏器并发症出现。如今，控制糖尿病的药物有2类：1)促胰岛素分泌类，如磺酰脲类，氯茴苯酸类，二肽基肽酶抑制剂，GLP-1类似物；2)非促胰岛素分泌药物，如胰岛素，α-葡萄糖苷酶抑制剂，双胍类，噻唑烷二酮类，胰岛素类似物等。目前，临床上使用较多的传统糖尿病治疗药物对Ⅱ型糖尿病患者皆无能为力，不能遏制胰脏β-细胞的不断进行性的恶化，不能降低血液中糖化血红蛋白(HbA1c)水平，也不能阻止糖尿病的并发症如心脏病、肾衰 竭，且都伴随着不同程度的毒副作用。因此，需要研究新的Ⅱ型糖尿病治疗药物。 
1985年发现了一种肠激素胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1，GLP-1)，其是进食后由胰高血糖素原基因表达，主要在肠道黏膜L-细胞分泌的一种产物，它能刺激胰岛β-细胞分泌胰岛素(J Med Chem，47，4128-4134，2004)，对稳定血糖水平有重要作用。外源给予GLP-1能使Ⅱ型糖尿病患者的血糖水平正常化(Diabetes Care，15，270-276，1992；Lancet，359，824-830，2002；Endoer.Rev，16，390-410，1996；Diabetologia，28，565-573，1985)。GLP-1具有下列功能：以葡萄糖依赖方式作用于胰岛β-细胞，促进胰岛素基因的转录，增加胰岛素的生物合成和分泌；刺激β-细胞的增殖和分化，抑制β-细胞凋亡从而增加胰岛β-细胞数量；抑制胰高血糖素的分泌；增加周边细胞胰岛素受体的敏感性；降低HbA1c；抑制食欲及摄食；延缓胃内容物排空(Diabetic Med，18，144-149，2001；Diabetes，51，1443-1452，2002；Diabetologia，45，1263-1273，2002；Diabetes，50，525-529，2001；Diabetes，50，725，2001；Diabetes，52，365-371，2003；Recent Prog.Hormne Res.56，377-399，2001；Disbetologia，39，1546-1553，1996；Am.J.Physicl Endocrinol.Metab，281，E242-247，2001；U.S.patent 477967，478017，478425；Diabetes Care，22，403-408，1999；J.Clin.Endocrinology and Metabolism，88，3082-3089，2003；Diabetes，44，1295，1995)。但GLP-1在体内很容易被二肽基肽酶(DPPⅣ)降解，半衰期不足2分钟，几乎不能成为有效的抗糖尿病药物。 
Exendin-4是在毒蜥(美国亚利桑那州和北墨西哥州内陆爬行动物)的唾液分泌物中发现的多肽(J.Biol.Chem，265，20259-20262，1990；J.Biol.Chem，267，7402-7405，1992)，与胰高血糖素样肽-1(GLP-1(7-36))具有高度同源性(53％)。研究表明，Exendin-4同样可以与GLP-1受体结合，并在药理上表现出与GLP-1相类似的激动作用，如：增加胰岛素的合成及葡萄糖依赖性促胰岛素分泌；刺激β细胞增生和再生，抑制β细胞凋亡从而增加β细胞的数量；抑制胰高血糖素的分泌；抑制肝糖生成，但不会引起严重低血糖；抑制餐后胃肠道动力及分泌功能；降低 食欲，减少食物的摄入；对神经细胞具有保护作用(Nat.Biotech，23，857-861，2005；J.Biol.Chem.，266，2897-2902，1991；J.Biol.Chem.，266，21432-21437，1992；Diabetes，44，16-19，1995；Nature，379，69-72，1996)。Exendin-4促进胰岛素分泌和抑制餐后胰高血糖素分泌的作用具有血糖依赖性，优于目前所用的磺脲类降糖药，不易发生低血糖反应，能够极大减少血糖监测次数，并能减轻体重。由美国安米林(Amylin)和礼来(Eli Lilly)公司共同开发的一天注射两次的Exendin-4制剂(Exenatide，商品名：Byetta)相继于2005年和2006年在美国和欧洲上市(U.S.patent 5,424,286，6,858,576，6,872,700，6,902,744，6,956,026，7,297,761)，使得该类药物得到全世界糖尿病及肥胖治疗领域的广泛应用。 
由于多肽类药物普遍存在体内半衰期较短，物理、化学稳定性较差，易被体内各种蛋白酶降解等特性，使得这些药物通常需要在一天之内多次注射。Exenatide作为一种皮下注射制剂，需每天两次使用，给患者身体、心理和经济带来较大的负担，限制了患者用药依从性。因此，对Exendin-4进行结构改造及开发新的剂型，从而延长其血浆周期和增加其系统性药物暴露(systemic drug exposure)，是当前抗糖尿病药物研究的热点。 
聚合物修饰技术是上世纪70年代发展起来的一种强有力的修饰技术，其中尤以聚乙二醇化技术为代表。该技术是将聚乙二醇(PEG)与蛋白质药物化学结合，对蛋白质的表面进行修饰，通过PEG的修饰，一方面增加了蛋白质的分子量，降低了其在肾脏的排泄速率；另一方面，偶联的PEG链在被修饰的蛋白质分子表面产生空间位阻效应，减低血液中蛋白水解酶对该蛋白的水解作用，从而有效地延长了其在循环系统内的滞留时间，导致药物血浆周期延长和系统性药物暴露增加并提高疗效。 
目前聚乙二醇化技术已发展到第二代——定点聚乙二醇化技术(site specific PEGylation)。定点聚乙二醇化技术可以特异地修饰蛋白药物的某一特定氨基酸，从而避免随机修饰的盲目性。这样既较少影响蛋白质多肽活性中心结构，又能选择性干扰某些抗原位点，从而减少非定点聚乙二醇化所带来的生物活性降低及 均一性不高等缺点。 
科研人员对Exendin-4的聚合物修饰也已进行了一系列研究。杨和普里克特(CN1372570A)的研究证明了Exendin-4主要是通过肾清除来代谢，因此他们利用分子量范围在500至20,000道尔顿(Dalton，Da)的聚乙二醇对Exendin-4进行修饰。包文超、徐宏景、余刚、左亚军(CN101125207A)则利用分子量范围在20kDa至50kDa的聚乙二醇对Exendin-4进行了氨基修饰。 
但是，现在已有的Exendin-4或其变体以及各种修饰形式仍有一些缺点，包括在体内使用时给药频率较高，给患者身体、心理和经济带来较大的负担，限制了患者用药依从性，无法广泛应用。因此，仍然需要有新的Exendin-4变体及其聚合物修饰形式。 
发明内容
在一个方面中，本发明提供了一种具有GLP-1受体激动剂活性的Exendin变体，其与野生型Exendin序列相比有一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸所取代。任选地，与野生型Exendin序列相比，所述Exendin变体中还具有一个或多个进一步的氨基酸缺失、添加和/或替换，其中所添加或替换的氨基酸残基可以是天然或非天然氨基酸或者氨基酸类似物。 
在一个实施方案中，所述Exendin变体具有与野生型 
Exendin-4序列 
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：1)或 
Exendin-3序列 
His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：2)或者它们的相似序列相比有一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸置换以及任选地其它氨基酸置换的氨基酸序列。所述氨基酸置换各自独立 地位于野生型氨基酸序列的N-端、C-端和/或内部。 
在一个优选的实施方案中，所述Exendin变体至少在该变体C端具有半胱氨酸置换。还优选地，所述Exendin变体在C端最后一个氨基酸具有半胱氨酸置换。此外，所述Exendin变体优选至少在以下一个或多个位置具有半胱氨酸置换：与Exendin-4或Exendin-3中第20位Arg(精氨酸)、25位Trp(色氨酸)、35位Ala(丙氨酸)和第39位Ser(丝氨酸)相对应的位置。 
在另一个方面中，本发明提供了一种Exendin变体缀合物，其在所述Exendin变体中缀合了一个或多个天然或合成聚合物基团，优选生理可接受的聚合物基团，例如聚亚烷基二醇基团，更具体地如聚乙二醇基团。在含有多个聚合物基团的情形下，所述聚合物基团可以相同或不同。优选地所述聚合物基团通过一个或多个半胱氨酸残基缀合到所述Exendin变体上。在一个实施方案中，所述聚合物基团以硫醚键缀合到所述Exendin变体上。 
本领域技术人员已知的是，在缀合了聚合物基团的生物活性分子中，随着缀合基团分子量(如从4kDa起)的增加，缀合生物分子的生物活性将呈指数性逐渐降低(Bailon et al.Rational design of potent，long-lasting form of interferon：A 40kDa branched polyethylene glycol-conjugated interferonα-2a for the treatment of hepatitis C.Bioconjugate Chem 2001；12：195-202；Bowen et al.Relationship between molecular mass and duration of activity of polyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein.Experimental Hematology 1999；27：425-32；Bailon et al.PEG-modified biopharmaceuticals.Expert Opin Deliv.2009；6：1-16)。本领域技术人员还已知的是，随着所述聚合物基团分子量的增加，该缀合物分子的生物半衰期和/或血浆半衰期和系统性药物暴露逐渐延长或增加。 
然而，本发明出乎意料地发现，在本发明的Exendin变体缀合物中，即使所述聚合物基团的分子量增加到30kDa，与非缀合的Exendin变体相比，该缀合物分子仍然保留了大部分GLP-1受体激动剂活性。甚至在PEG分子量增加到40kDa或更高时，本 发明的Exendin变体缀合物仍保留相当的GLP-1受体激动剂活性。尤为突出的是，当所述聚合物基团的分子量从5kDa增加至27kDa时，与非缀合的Exendin变体相比，所述Exendin变体缀合物的GLP-1受体激动剂活性基本不变。 
因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供了具有延长的生物半衰期和/或血浆半衰期和显著的GLP-1受体激动剂活性的Exendin变体缀合物。 
在一个实施方案中，所述聚合物是聚亚烷基二醇，包括例如聚乙二醇、聚丙二醇等。所述一个或多个聚合物基团可以具有任意合适的分子量，例如其分子量可以为2kDa至50kDa，优选5kDa至30kDa，还优选20kDa至30kDa，例如21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa和30kDa以及上述分子量值之间的任意值。 
任选地，所述Exendin变体缀合物还可在一个或多个其它氨基酸残基位置处缀合一个或多个相同或不同的上述聚合物。所述一个或多个其它氨基酸残基位置可以各自位于Exendin变体的N-端、C-端和/或任意中间位置。 
在本发明中，所缀合的聚合物可以是任何合适的构型，包括例如单臂、双臂、多臂和/或分叉的，其中各臂或分叉可以相同或不同。 
本发明还提供了一种制备上述Exendin变体缀合物的方法，其包括使所述Exendin变体与所述聚合物相接触，优选地其中所述聚合物带有活化基团或者在接触时进行活化，以将所述活化聚合物连接到该Exendin变体的一个或多个半胱氨酸残基上。在一个实施方案中，通过选择特异性活化基团及适当的pH值，利用不同的聚合链长度和聚合结构的聚乙二醇(PEG)分别对Exendin变体的半胱氨酸进行特异性化学修饰。在一个具体实施方案中，该特异性活化基团为马来酰亚胺。 
本发明另外提供了一种药物组合物，其包含有本发明的Exendin变体和/或Exendin变体缀合物，以及任选地药学可接受 的载体。 
本发明又提供了一种治疗疾病的方法，其包括给有此需要的对象施用治疗有效量的本发明的Exendin变体和/或Exendin变体缀合物和/或药物组合物。相应地，本发明还提供本发明的Exendin变体和/或Exendin变体缀合物和/或药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。所述疾病可以选自例如餐后倾倒性综合征、餐后高血糖症、葡萄糖耐受不良、可以通过抑制胰高血糖素分泌、调节甘油三酯水平、减少进食量而缓解的病症或疾病、肥胖症、进食障碍、胰岛素抵抗综合征、糖尿病、高血糖症和低血糖症。优选地，所述疾病是糖尿病，更优选是I型糖尿病或II型糖尿病，特别是II型糖尿病。 
众所周知，Exendin可以降低肥胖病人体重并可引起恶心和呕吐反应，其作用机制与抑制中枢神经系统中摄食中枢和激动呕吐中枢有关(Larsen.Mechanisms behind GLP-1 induced weight loss.Br J Diabetes Vasc Dis 2008；8：S34-S41；Schick et al.Glucagonlike peptide 1(7-36)-amide acts at lateral and medial hypothalamic sites to suppress feeding in rats.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2003；284：R1427-35)，而Exendin或其变体的缀合物由于分子量加大，难以透过血脑屏障，故可减少Exendin所引发的呕吐反应。因此在本研究开始之前，发明人预期Exendin或其变体的缀合物也会减少Exendin由中枢神经系统介导的减少摄食量和降低体重的作用。然而，尽管野生型Exendin和未缀合的Exendin变体均降低体重和摄食量，但本发明出乎意料地发现，Exendin或其变体的缀合物却具有显著增强的降低体重和摄食量的作用。 
因此，在另一方面中，本发明提供了使用Exendin或其变体的缀合物和/或包含这种缀合物的药物组合物来降低体重的方法，此外还提供了Exendin或其变体的缀合物和/或包含这种缀合物的药物组合物在制备用于降低体重的药物中的用途。在一个实施方案中，所述Exendin或其变体的缀合物是上述本发明的Exendin变体缀合物。 
附图说明
图1图示了实施例1所得PB-105的质谱图。 
图2图示了PEG的一种分子结构。 
图3图示了经HPLC分析实施例2所得PB-110(PEG5000-PB-105)的纯度分析结果。 
图4图示了PEG5000b的分子结构。 
图5图示了PEG5000c的分子结构。 
图6图示了PB-105聚乙二醇化缀合物的(A)碘染色图像和(B)考马斯亮蓝染色图像，其中各泳道代表如下：1.分子量标准，2.PB-106(PEG20000-PB-105)，3.PB-107(PEG30000-PB-105)，4.PB-108(PEG40000-PB-105)，和5.PB-109(PEG20000*2-PB-105)。 
图7图示了经HPLC分析实施例3所得PB-106(PEG20000-PB-105)的纯度分析结果。 
图8图示了PEG20000b的分子结构。 
图9图示了PEG20000c的分子结构。 
图10图示了PEG20000d的分子结构。 
图11图示了PEG20000e的分子结构。 
图12图示了经HPLC分析实施例3所得PB-112(PEG20000-PB-111)的纯度分析结果。 
图13图示了经HPLC分析实施例4所得PB-107(PEG30000-PB-105)的纯度分析结果。 
图14图示了经HPLC分析实施例5所得PB-108(PEG40000-PB-105)的纯度分析结果。 
图15图示了经HPLC分析实施例5所得PB-114(PEG40000-PB-113)的纯度分析结果。 
图16图示了PEG20000×2的分子结构。 
图17图示了经HPLC分析实施例6所得PB-109(PEG20000*2-PB-105)的纯度分析结果。 
图18图示了PEG20000×2b的分子结构。 
图19图示了PEG20000×2c的分子结构。 
图20图示了PEG20000×2d的分子结构。 
图21图示了经HPLC分析实施例7所得PB-119(PEG23000-PB-105)的纯度分析结果。 
图22图示了经HPLC分析实施例8所得PB-120(PEG27000-PB-105)的纯度分析结果。 
图23A图示了PB-106(PEG20000-PB-105)在pH4.5和-20℃保存60天后的HPLC分析结果。 
图23B图示了PB-106(PEG20000-PB-105)在pH7.0和4℃保存60天后的HPLC分析结果。 
图23C图示了PB-106(PEG20000-PB-105)在pH7.0和-20℃保存60天后的HPLC分析结果。 
图24图示了PB-101和PB-105对PC12细胞内cAMP作用的量效关系. 
图25图示了PB-105及其聚乙二醇化缀合物在体外对细胞内cAMP活性的作用。 
图26A图示了聚乙二醇化缀合物中聚乙二醇的分子量与体外药物活性(LogEC50)的相关性。 
图26B图示了聚乙二醇化缀合物中聚乙二醇的分子量与药物最大活性(Emax)的相关性。 
图27图示了PB-105及其聚乙二醇化缀合物在体外对细胞内cAMP活性的作用。 
图28图示了PB-101和PB-105的降血糖作用时效关系。 
图29图示了PB-101和PB-105降血糖作用量效关系。 
图30图示了PB-101及其变体PB-102的降血糖作用量效关系。 
图31图示了PB-105及其聚乙二醇化缀合物的等量降血糖作用时效关系。 
图32A图示了聚乙二醇化Exendin变体中聚乙二醇的分子量与生物半衰期(T1/2)的相关性。 
图32B图示了聚乙二醇化Exendin变体中聚乙二醇的分子量与最大降糖作用(％给药前血糖浓度)的相关性。 
图32C图示了聚乙二醇化Exendin变体中聚乙二醇的分子量与降糖作用曲线上面积(Area Above Curve，AAC)的相关性。 
图33图示了PB-105及其聚乙二醇化(PEG30000)缀合物PB-107的等效量降血糖作用时效关系。 
图34图示了PB-105及其聚乙二醇化(PEG20000)缀合物PB-106降血糖作用量效关系。 
图35图示了PB-105、PB-111及其聚乙二醇化缀合物等量降血糖作用时效关系。实验数据以平均值±SEM表示。 
图36图示了PB-101及其变体PB-105、PB-111和PB-113以及聚乙二醇化缀合物PB-106、PB-112和PB-114降血糖作用时效关系。实验数据以平均值±SEM表示。 
图37图示了PB-105及其聚乙二醇化缀合物等量降血糖作用时效关系。实验数据以平均值±SEM表示。*代表与PB-105组比较差异有显著性(p＜0.05)。 
图38图示了PB-101、PB-105、PB-106和PB-120对鸽子呕吐潜伏期(A)和呕吐次数(B)的影响。实验数据以平均值±SEM表示。a代表在3mg/kg剂量时与PB-105组比较，差异存在统计学显著性(p＜0.05)；b代表在6mg/kg剂量时与PB-101和PB-105组比较差异均有统计学显著性(p＜0.05)。 
图39图示了PB-101、PB-105和PB-106对豚鼠全身免疫过敏反应的影响。实验数据以平均值±SEM表示。a代表与生理盐 水组比较差异有统计学显著性(p＜0.05)；b代表与PB-101或PB-105组比较差异有统计学显著性(p＜0.05)。 
图40图示了PB-101、PB-105和PB-106给药后(A)0-18天和(B)0-4天对豚鼠体重增长的影响。实验数据以平均值±SEM表示。a代表与生理盐水组比较差异有统计学显著性(p＜0.05)；b代表与Exenatide或PB-105组比较差异有统计学显著性(p＜0.05)。 
图41图示了PB-105、PB-106、PB-119和PB-120给药后对(A)大鼠体重和(C)摄食量的影响。B和D分别为给药后相应各组大鼠体重-时间曲线下面积图和摄食量-时间曲线下面积图。实验数据以平均值±SEM表示。a代表与生理盐水组比较差异有统计学显著性(p＜0.05)；b代表与PB-105组比较差异有统计学显著性(p＜0.05)。 
图42图示了单次静脉注射Exenatide和PB-105药-时曲线。 
图43图示了单次静脉注射PB-105及其聚乙二醇化Exendin缀合物药-时曲线。 
图44A图示了聚乙二醇化Exendin变体缀合物中聚乙二醇的分子量与血浆半衰期关系。 
图44B图示了聚乙二醇化Exendin变体缀合物中聚乙二醇的分子量与药-时曲线下面积(AUC)关系。 
具体实施方式
定义 
本文中使用的术语“氨基酸”包括天然氨基酸、非天然氨基酸、和氨基酸类似物以及所有它们的D和L立体异构体。非天然氨基酸包括但不限于氮杂环丁烷羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2，4-二氨基异丁酸、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基 丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟赖氨酸、别-羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链赖氨素、别-异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、2-哌啶酸和硫代脯氨酸。氨基酸类似物包括在其C-末端羧基、N末端氨基或其侧链基团可逆或不可逆地化学封闭的、或被化学修饰成另一官能团的天然氨基酸和非天然氨基酸，例如甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸、S-(羧甲基)-半胱氨酸亚砜和S-(羧甲基)-半胱氨酸砜。 
本文中使用的术语“多肽”或“蛋白”可互换地指通过共价键(例如肽键)相互连接的一串至少两个氨基酸残基，可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。 
本文中使用的术语“半胱氨酸置换”是指通过例如基因工程或人工化学合成的手段，用半胱氨酸残基代替天然多肽(例如Exendin-4)中的一个或多个其它氨基酸残基。 
本文中使用的术语“多肽变体”、“变体”或“类似物”是指通过一个或多个取代、缺失、插入、融合、截短或其任意组合在氨基酸序列上有所不同的多肽。变体多肽可以是完全功能性的或者可缺乏一种或多种活性的功能。完全功能性变体可含有例如仅仅保守性改变或非关键残基或非关键区域的改变。功能性变体还可包含相似氨基酸的替换，其导致功能未改变或不显著的改变。可以通过本领域已知的方法鉴定对于功能来说重要的氨基酸，所述方法例如定点诱变或甘氨酸扫描诱变(Cunningham，B.和Wells，J.，Science，244：1081-1085，1989)。可以例如通过结构分析如结晶、核磁共振或光亲和标记来确定对于多肽活性来说关键的位点(Smith，L.等，J.Mol.Biol.，224：899-904，1992；de Vos，A.等，Science，255：306-312，1992)。术语“巯基变体”是指通过取代、插入、融合或其任意组合而在氨基酸序列上带有巯基的多肽变体。 
本文中使用的术语“缀合物”是指多肽或多肽变体与本文所述的修饰基团共价或非共价连接后形成的产物，所述修饰基团包括 但不限于上文所述的例子。 
本文中使用的术语“经修饰多肽”或“经修饰多肽变体”是指其中一个或多个氨基酸被化学修饰的多肽或多肽变体，其中所述修饰是指不同类型基团的共价或非共价修饰，其包括但不限于：磷酸化、糖基化、甲基化、PEG化、生物素化、SUMO化、酰基化等等。 
本文中使用的术语“烷基”表示取代或未取代的直链或支链烷基，例如C1-C30烷基、C1-C20烷基、C2-C15烷基或C3-C10烷基，其中任选地可具有一个或多个独立地选自例如下述的取代基：卤素、氨基、硝基等。 
本文中使用的术语“环烷基”表示取代或未取代的C3-C8环烷基，其中任选地可具有一个或多个独立地选自例如下述的取代基：C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、卤素、氨基、硝基等。 
本文中使用的术语“烯基”表示其中具有一个或多个碳碳双键的取代或未取代的直链或支链烯基，其中可具有例如2-20个、3-15个、4-10个碳原子，并且任选地具有一个或多个独立地选自例如下述的取代基：卤素、氨基、硝基等。 
本文中使用的术语“芳基”表示C6-C10芳基，其任选地被一个或多个独立地选自例如下述的取代基所取代：C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、卤素、氨基、硝基等。 
本文中使用的术语“连接基”表示有机基团，其将PEG与Exendin相连接。在本发明中，连接基可以是烷基、醚基、酰胺、酯基、硫基等，其中可以包含例如多达30个碳原子，如1-25、2-20、3-15或3-10个碳原子。 
一般地，本文中使用的术语“聚乙二醇”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，既包括聚乙二醇本身，也包括其末端修饰的衍生物，除非另有明确说明。 
此外，对于聚合物如聚乙二醇来说，有多种方法测定其分子量。由于聚合物是由一定分布范围内的不同聚合度的分子构成，一般用平均分子量来表示聚合物的分子量，具体来说可以是数均 分子量或重均分子量。尽管在聚合物的聚合度差异较大时，数均分子量和重均分子量可能有一些偏差，但是对于分布范围较窄的聚合物来说，二者趋于相等。对于本文提及的聚合物如聚乙二醇，在提及其分子量时，既可以是重均分子量，也可以是数均分子量。 
Exendin变体 
本发明一方面涉及一种具有GLP-1受体激动剂活性的Exendin变体，其具有与Exendin野生型序列或者其相似序列相比有一个或多个，如1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基被半胱氨酸所置换的氨基酸序列。所述半胱氨酸置换可以各自独立地位于所述Exendin变体序列的N-端、C-端或内部。在一些实施方案中，所述Exendin变体至少在其C端的1、2、3或4个氨基酸残基处具有半胱氨酸置换。优选地，所述Exendin变体C端最后一个氨基酸被半胱氨酸置换。在又一些实施方案中，所述Exendin变体在其C端、N端和/或内部的1、2、3、4个或更多个氨基酸残基处具有半胱氨酸置换。 
本发明中所述的Exendin野生型序列或者相似序列可以是本领域中已知的任何序列，包括其各种变体或类似物或激动剂序列。有关Exendin的教导可参见例如Eng J.等人，J.Biol.Chem.，265：20259-62，1990；Eng J.等人，J.Biol.Chem.，267：7402-05，1992；WO00/66629和WO00/41546等，其全部内容均援引并入本文之中。 
本发明的Exendin变体还可任选地具有一个或更多个，例如1、2、3、4、5个或更多个进一步的氨基酸修饰，包括例如氨基酸取代、缺失、插入和/或添加。同样的，所述进一步的氨基酸修饰可以各自独立地位于Exendin序列的N-端、C-端和/或内部。取代、插入和/或添加的氨基酸可以是任何天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸类似物，或者它们的D或L立体异构体。在一些实施方案中，所述进一步的氨基酸修饰是保守性氨基酸取代，例如Ala/Gly、Ser/Thr、Glu/Asp、Gln/Asn、Ala/Val/Ile/Leu、Arg/Lys、Phe/Tyr等之间的互相取代。有关保守性氨基酸取代，现有技术中有众多的教导，例如可参阅WO/2006/083301等，其全部内容 通过援引并入本文之中。 
在本发明中，所述野生型Exendin可以是Exendin-3或Exendin-4。因此，在一些实施方案中，本发明涉及这样的Exendin变体，其具有与氨基酸序列 
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：1； 
Exendin-4)或 
His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：2；Exendin-3)或者其相似序列相比有一个或多个，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基被半胱氨酸置换的氨基酸序列。优选地，所述Exendin变体中至少在选自下列的一个或多个位置具有半胱氨酸置换：与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中第20位Arg(精氨酸)、25位Trp(色氨酸)、35位Ala(丙氨酸)和39位Ser(丝氨酸)相对应的位置。 
在一个优选的实施方案中，所述Exendin变体具有选自下述的氨基酸序列： 
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：3)； 
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Cys-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：4)； 
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Cys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：5)； 
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Cys-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：6)； 
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys-Tyr(SEQ ID NO：7)；或 
His-dAla-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：8)。 
如上文所述，在本发明的Exendin变体中，还可以任选地含有一个或更多个、例如1、2、3、4、5个或更多个进一步的氨基酸修饰，例如氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加。所述进一步的氨基酸修饰可以各自独立地位于Exendin序列的N-端、C-端和/或内部。取代、插入和/或添加的氨基酸可以是任何天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸类似物，或者它们的D或L立体异构体。在一些实施方案中，所述进一步的氨基酸修饰是保守性氨基酸取代，例如Ala/Gly、Ser/Thr、Glu/Asp、Gln/Asn、Ala/Val/Ile/Leu、Arg/Lys、Phe/Tyr等之间的互相取代。 
本发明的Exendin变体可以通过本领域公知的多种方式得到，包括例如重组制备方法、化学合成法等。 
在一个实施方案中，本发明的Exendin变体通过固相肽合成技术化学合成，然后在实验室规模纯化，例如通过在反相HPLC柱上进行单一纯化步骤或者通过其它合适的层析方法。 
在另一个实施方案中，本发明的Exendin变体通过重组方法产生，包括例如在合适的原核或真核宿主细胞中进行表达，然后通过常规技术从中分离出本发明的Exendin变体。例如，可以首先通过化学合成法合成编码所述肽的核苷酸序列，随后将所述序列克隆到合适的表达载体中在合适的启动子控制下进行表达。或者，还可以采用诱变法如PCR诱变法从野生型Exendin获得编码Exendin变体的核苷酸序列、并且随后将所述序列克隆到合适的表达载体中在合适的启动子控制下进行表达。这些技术完全在本领域普通技术人员的能力范围之内，并且在现有技术中有众多的教导。 
合适的真核宿主细胞有哺乳动物细胞，例如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep和HepG2。所述细胞优选地生长于适合表达本发明Exendin变体的条件下。至于用于生产或分离本发明的Exendin变体的试剂和条件，则没有任何特别的限制，本领域已知的或商业上可得到的任何体系均可应用。在一个优选的实施方案中，所述Exendin变体通过本领域中已描述的方法获得。 
有多种表达载体可用于制备Exendin和/或其变体，其可选自真核和原核表达载体。原核表达载体可包括例如质粒如pRSET、pET和pBAD等，其中可采用的启动子有例如lac、trc、trp、recA或araBAD等。真核表达载体包括有：(i)用于在酵母中表达的载体如pAO，pPIC，pYES，pMET，其中可使用诸如AOX1，GAP，GAL1，AUG1等的启动子；(ii)用于在昆虫细胞中表达的载体如pMT，pAc[delta]，plB，pMIB，pBAC等，其中可使用诸如PH，p10，MT，Ac5，OplE2，gp64，polh等的启动子；和(iii)用于在哺乳动物细胞中表达的载体如pSVL，pCMV，pRc/RSV，pcDNA3，pBPV等，以及源自病毒体系的载体如痘苗病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等，其中可使用诸如CMV，SV40，EF-1，UbC，RSV，ADV，BPV和β肌动蛋白等的启动子。在一个优选的实施方案中，所述Exendin变体在原核或真核细胞体系中进行表达，并且使用经过密码子优化的编码序列。在一个优选的实施方案中，表达所述Exendin变体的序列包含前导肽和/或信号肽，以利于所述Exendin变体从细胞中分泌到细胞外，从而进行分离纯化。在另一个优选的实施方案中，表达所述Exendin变体的序列不包含前导肽和/或信号肽，其不分泌到细胞外，通过裂解细胞对其进行分离纯化。 
Exendin变体缀合物 
本发明的Exendin变体可以与一个或多个聚合物基团相缀合，形成Exendin变体缀合物。本文所用的“聚合物”优选是生理可接受的，其包括在水溶液或悬液中可溶、并且以药学有效量施用该聚合物-Exendin缀合物后对哺乳动物没有负面影响如副作用 的聚合物。可在本发明中使用的聚合物没有特别的限制。所述聚合物通常优选具有2到约3000个重复单元。该聚合物基团可以选自天然或合成聚合物，其实例包括、但不限于例如多糖、聚亚烷基二醇，如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚氧化乙烯(PEO)、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚乙烯醇等或者其任何组合。在一个优选实施方案中，本发明Exendin变体缀合物中使用一个或多个PEG基团进行缀合修饰。 
在本发明中，所述聚合物并不限于特别的结构，其可以是线性的(如烷氧基PEG或双功能PEG)、分支或多臂的(如分叉PEG或连接到多元醇核心的PEG)、树枝状的或者可以具有可降解的连键。此外，聚合物的内部结构可以以任意数目的不同模式组织，其可选自均聚物、交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、交替三聚物、无规三聚物和嵌段三聚物等。所述聚合物还可包括聚(环氧烷)聚合物、聚马来酸、聚(D，L-丙氨酸)等。 
在一些实施方案中，所述聚合物是聚乙二醇(PEG)或其衍生物例如甲氧基聚乙二醇(mPEG)。在本文中，如果没有特别指明，所述聚乙二醇(PEG)既包括末端基团为羟基也包括末端为其它基团的类型。所述其它基团包括但不限于烷氧基、环烷氧基、环烷基氧基、烯基、芳氧基或芳烷基氧基。这些PEG分子类型都是现有技术中已知的，并且在多肽修饰中常规使用。PEG侧链可以是线性的、分枝的、分叉的或者由多个臂组成，不同的聚乙二醇可以具有不同的聚合链长度和聚合结构。 
本发明中对于所用PEG的分子量没有特别的限制，其分子量范围可以是0.1至200kDa，例如1至150kDa、2至100kDa、3至80kDa或4至50kDa，还可以是5至40kDa。一种特别有用的PEG具有5至30kDa范围的分子量。另一些有用的PEG分子包括例如WO 03/040211、US 6,566,506、US 6,864,350和US 6,455,639中公开的那些。特别地，所述PEG具有通式HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，其中n的范围是约5至4000。如上所述，本发明的PEG包括带其它末端基团的PEG，例如甲氧基PEG、分支PEG、分叉PEG等。合适的分支PEG 可按照美国专利No.5,932,462中所述进行制备，该专利的全部公开内容通过参考并入本文。所述分叉PEG是指在靠近聚合物链一端的地方具有分支的PEG，分叉PEG的主链可以是直链或支链的。 
本领域技术人员已知的是，在缀合了聚合物基团的生物活性分子中，随着所述聚合物基团分子量的增加，该缀合物分子的生物活性逐渐降低(Bailon et al.Rational design of potent，long-lasting form of interferon：A 40kDa branched polyethylene glycol-conjugated interferonα-2a for the treatment of hepatitis C.Bioconjugate Chem 2001；12：195-202；Bowen et al.Relationship between molecular mass and duration of activity of polyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein.Experimental Hematology 1999；27：425-32；Bailon et al.PEG-modified biopharmaceuticals.Expert Opin Deliv.2009；6：1-16)。本领域技术人员还已知的是，随着所述聚合物基团分子量的增加，该缀合物分子的生物半衰期和/或血浆半衰期逐渐延长。 
然而，本发明出乎意料地发现，在本发明的Exendin变体缀合物中，即使所述聚合物基团(如PEG)的分子量增加到30kDa，与非缀合的Exendin变体相比，该缀合物分子仍然保留了大部分GLP-1受体激动剂活性(如体内活性)。甚至在PEG分子量增加到40kDa或更高时，本发明的Exendin变体缀合物仍保留相当的GLP-1受体激动剂活性(如体内活性)。尤为突出的是，当所述聚合物基团的分子量从5kDa增加至27kDa时，与非缀合的Exendin变体相比，所述Exendin变体缀合物的GLP-1受体激动剂活性基本不变。 
为了在长时间内提供稳定的治疗作用，另外为了减少给药频率，以提高患者依从性，在保留显著的GLP-1受体激动剂活性的同时，希望尽可能延长所述Exendin变体缀合物的生物半衰期。因此，在一个实施方案中，本发明提供了具有延长的生物半衰期和显著的GLP-1受体激动剂活性的Exendin变体缀合物。 
在一个具体实施方案中，在本发明的Exendin变体缀合物中，所述一个或多个聚合物基团(如PEG)的分子量为2kDa至50kDa，优选3kDa至40kDa，更优选4kDa至35kDa，还优选5kDa至30kDa，例如5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、30kDa和40kDa以及上述各分子量值之间的任意值。需要指出的是，当描述一种Exendin变体缀合物中缀合聚合物基团的分子量时，如果该缀合物中有多个缀合聚合物基团，计算的是该缀合物中所有缀合聚合物基团的分子量总和，除非另外指明。 
在一个优选实施方案中，对于本发明的Exendin变体缀合物，其中所述一个或多个聚合物基团(如PEG)的分子量为20kDa至30kDa，优选21kDa至29kDa，更优选23kDa至27kDa，例如20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa、30kDa以及上述各分子量值之间的任意值。 
用于本发明中的聚合物是现有技术中已知的，其可通过多种途径得到，包括例如通过商业途径获得，如CarboMer，Inc.，J.T.Baker，The Dow Chemical Company等等，或者根据本领域中已知的方法自行制备，例如EP1245608中所述的。本发明并不局限于通过任何具体方法制得的聚合物。 
在本发明的缀合物中，所述至少一个聚合物可以通过Exendin上的氨基、羧基、羟基和/或巯基等与Exendin相偶联。这样的基团通常位于氨基酸残基如赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸等的α-氨基、α-羧基和侧链上。 
在一些实施方案中，有一个或更多个聚合物分子通过Exendin变体中半胱氨酸的巯基与Exendin变体相偶联。对蛋白质中半胱氨酸残基的巯基进行聚合物如聚乙二醇修饰，可以提高修饰的选择性，因为与巯基特异性反应的试剂有很多，而且蛋白质中有用的巯基要比例如赖氨酸残基的自由氨基少得多。 
因此，在一个优选实施方案中，所述一个或多个聚合物基团可以缀合在Exendin变体的半胱氨酸残基上，更优选地以硫醚键缀合到Exendin变体的半胱氨酸残基上。 
优选地，所述Exendin变体在与野生型exendin-3或exendin-4中第20位、25位、35位和/或第39位相对应的位置具有一个或多个半胱氨酸置换，并且通过其巯基与聚合物如聚乙二醇相偶联。更优选地，所述Exendin变体在与野生型exendin-3或exendin-4中第35位和/或第39位相对应的位置具有半胱氨酸置换。最优选地，所述Exendin变体在与野生型exendin-3或exendin-4中第39位相对应的位置具有半胱氨酸置换。 
在一个具体实施方案中，所述聚合物基团以硫醚键缀合到本发明Exendin变体的半胱氨酸残基上。例如，对于带有马来酰亚胺活化基团的聚乙二醇分子，可以在马来酰亚胺的烯基与半胱氨酸的巯基之间形成硫醚键，从而将一个或更多个聚乙二醇基团缀合到本发明Exendin变体的半胱氨酸残基上。在另一些实施方案中，半胱氨酸残基的PEG化也可通过使用例如PEG-乙烯砜、PEG-碘代乙酰胺或PEG-连硫基正吡啶进行。现有技术中已知有多种将聚合物基团如PEG缀合到多肽上的方法，这些都可以在本发明中使用。 
在本文中，“PEG化Exendin”、“PEG修饰Exendin”或“Exendin变体-PEG缀合物”包括与一个或多个PEG相缀合的Exendin变体。如本文中所用的，“PEG化”或“PEG修饰”包括将一个或多个PEG基团与Exendin相缀合。合适的PEG化方法公开在例如US 5,122,614和US5,539,063中，其中公开的所有PEG化方法均通过引用而全文并入本文之中。 
在一些实施方案中，所述缀合物具有如下式(I)的结构： 
其中，Exendin代表本发明的Exendin变体，Y为H或RPEG-X-，并且每个X和Z各自独立为连接基，PEG表示-(OCH2CH2)n-，n为正整数，R表示PEG的末端基团，优选地每个R各自独立地选自氢、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、芳基或芳烷基。 
在一些具体实施方案中，所述烷基可以是C1-C6烷基，优选是C1-C4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基；所述环烷基可以是C3-C7环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基；所述环烷基烷基可以是环烷基C1-C4烷基，例如环烷基甲基和环烷基乙基，包括环己基甲基和环己基乙基等；所述芳基可以是苯基、甲基苯基和萘基等；所述芳烷基可以是苯甲基、苯乙基以及萘甲基和萘乙基等。现有技术中已知带有多种末端基团的PEG分子，根据需要可以适当选择这些以及其它的PEG分子。并且还可以根据需要按照现有技术已知的方法来合成带有所需末端基团的PEG分子。 
在一些实施方案中，式(I)中所述的每个“RPEG-”独立地具有如下结构： 
CH3(CH2)k-(OCH2CH2)n-、(CH3)2CH-(OCH2CH2)n-、(CH3)3C-(OCH2CH2)n-、 
Figure BPA00001448481200221
其中：k和n都是整数，k＝0、1、2、3、4、5或6； 
n＝40、41、…、45、46、47、48、……、1200。 
在另一些优选实施方案中，式(I)中所述的每个“RPEG-”独立地具有如下结构： 
CH3(CH2)k-(OCH2CH2)n-、(CH3)2CH-(OCH2CH2)n-、 (CH3)3C-(OCH2CH2)n-、 
Figure BPA00001448481200231
其中：k和n都是整数，k＝0、1、2或3；n＝40、41、…、45、46、47、48、……、1200。 
在一些实施方案中，式(I)中所述的每个“-X-”独立地具有如下结构： 
Figure BPA00001448481200232
或-O-(CH2)m-， 
其中：p和m都是整数，p＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。 
在另一些实施方案中，式(I)中所述的每个“-X-”独立地具有如下结构： 
Figure BPA00001448481200233
或-O-(CH2)m-， 
其中：p和m都是整数，p＝0、1、2、3、4或5；m＝0、1、2、3或4。 
在一些实施方案中，式(I)中所述的“-Z-Exendin”具有如下结构： 
Figure BPA00001448481200234
优选地，式(I)中所述的“-Z-Exendin”具有如下结构： 
Figure BPA00001448481200241
Figure BPA00001448481200251
其中：i、j、q、w是整数，i＝0或1；j＝1、2、3、4、5或6；q＝1、2、3、4、5或6；w＝1、2、3、4、5或6。 
本发明的Exendin变体缀合物可以通过任何合适的方法进行制备。现有技术中已知多种可以将聚合物缀合到蛋白质或肽上的方法，其中包括在合适的条件下将本发明的Exendin变体与聚合物、优选经过活化的聚合物相温育。在一个实施方案中，所述聚合物是聚乙二醇，其可通过例如溴化氰法、羰基二咪唑法、N-羟基琥珀酰亚胺法、氰脲酰氯法等活化和缀合到Exendin变体上。或者，通过PEG-马来酰亚胺、PEG-乙烯基砜、PEG-碘代乙酰胺或PEG-连硫基正吡啶，可以将PEG特异性地缀合到Exendin变体中半胱氨酸残基的巯基上。 
在一些具体实施方案中，在如下条件下将经过活化的PEG与本发明的Exendin变体一起孵育：pH值5.0-7.0，PEG与肽的摩尔比值为1-10，反应时间为0.5-12小时，反应温度为0-50℃，例如2-40℃或4-37℃。 
缀合反应之后，可以通过合适的方法将缀合物分离出来。适用的方法包括例如超滤法、透析法或色谱法等，这些均在本领域普通技术人员的能力范围之内。 
药物组合物 
本发明的Exendin变体和/或Exendin变体缀合物可以有多种用途，包括例如用于降低血糖。因此，本发明还提供了一种用于降低血糖的药物组合物，其中包含治疗有效量的本发明的Exendin变体和/或Exendin变体缀合物，以及任选地药学上可接受的载体。优选地，所述药物组合物可用于治疗糖尿病，更优选地用于治疗I型糖尿病和/或II糖尿病，尤其优选地用于治疗II型糖尿病。 
本发明的Exendin变体或者Exendin变体缀合物的治疗有效量取决于给药途径、受试者类型以及所考虑的具体哺乳动物的身体特征。这些因素及其与确定该量之间的关系是医药领域中技术人员熟知的。可调整该量和施用方法以达到最佳效力，从而将肽递送到受试者，但是将取决于医药领域技术人员熟知的因素例如体重、饮食、同时用药和其它因素。 
本发明的药物组合物可在联合疗法中施用，即与一种或多种其它药剂联合应用，其中所述治疗剂一起施用，或者依次施用。在另一些实施方案中，所述其它药剂可在施用一种或多种本发明的Exendin变体和/或Exendin变体缀合物或者其药物组合物之前、期间或之后施用。可用于本发明的所述其它药剂包括例如可降低血糖的药剂，例如胰岛素、胰岛素类似物、糊精激动剂和缩胆囊素，和/或其它用于治疗疾病的化合物或组合物。优选地，这样的联合用药可以实现组合的、甚至协同的效果。 
本文所使用的“可药用载体”、“药学上可接受的载体”或“生理可接受载体”可互换使用，包括任何和所有的生理上相容的盐、溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等中的一种或多种。在一些实施方案中，所述载体适于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮给药(例如通过注射或灌注)。取决于给药途径，可用一定材料包被所述治疗剂，以保护该治疗剂免受酸和其它可能使该治疗剂失活的天然条件的作用。 
施用时，本发明的药物制剂以可药用量在可药用组合物中施用。术语“可药用的”意为不干扰活性成分的生物活性效力的无毒物质。这样的制剂通常含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容载体和任 选的其它治疗剂，例如补充性免疫增强剂，包括佐剂，趋化因子和细胞因子。当使用在药物中时，所述盐应该是可药用的，但是非可药用盐可方便的用于制备其可药用盐，它们并不排除在本发明的范围之外。 
如果需要，本发明的Exendin变体或Exendin变体缀合物可与可药用载体组合。本文所使用的术语“可药用载体”指一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质，其适于施用于哺乳动物例如人。术语“载体”表示有机或无机、天然或合成的成分，其与活性成分组合以便于应用。药物组合物的组分也能够以不存在可显著破坏所需药物疗效的相互作用的形式共混合。 
优选地，本发明的药物组合物可以包含缓冲体系，优选地所述缓冲体系为pH为约3.0～约6.0的醋酸盐缓冲溶液，或者pH为约5.0～约9.0的磷酸盐缓冲溶液。在一些具体实施方案中，合适的缓冲剂包括乙酸盐；柠檬酸盐；硼酸盐；磷酸盐。 
任选地，所述药用组合物也可含有合适的防腐剂，例如：苯扎氯铵；氯叔丁醇；对羟基苯甲酸酯类和硫柳汞。 
所述药用组合物可方便地以单位剂量形式存在，并可通过药学领域任何公知方法制备。所有方法包括将所述活性剂与载体联合的步骤，所述载体包含一种或多种辅助成分。通常，通过将所述活性化合物与液体载体、精细分割的固体载体或以上两者均一并密切地联合来制备所述组合物，必要时接着使产品成形。 
适于胃肠外给药的药物组合物可以是包含一种或多种Exendin变体或Exendin变体缀合物的无菌水性或非水性制剂。在一些实施方案中，所述制剂与受试者的血液等渗。可根据已知方法使用合适的分散剂或润湿剂以及助悬剂配制此制剂。所述无菌注射制剂也可以是在无毒胃肠外可接受稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬液，例如1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受载体和溶剂包括水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油常规用作溶剂或悬浮介质。为此，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸可用于注射制剂。适于经口、皮下、静脉内、肌内等施用的载体 配方可在Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA中找到。 
本发明的Exendin变体或Exendin变体缀合物可与保护其避免快速释放的载体制备在一起，例如受控释放配方，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。现有技术中已知许多制备这样的配方的方法，参阅如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978等。 
本发明的药物组合物可通过任何常规途径施用，包括注射或随时间逐渐输注。例如，所述施用可以是经口、静脉内、腹膜内、肌内、腔内、肿瘤内、或透皮。 
本发明的药物组合物以有效量施用。“有效量”是本文提供的任何Exendin变体或Exendin变体缀合物的量，其单独或者与进一步的剂量和/或其它治疗剂一起产生期望的应答(例如在受试者中降低血糖水平)。这可包括仅仅暂时减缓糖尿病的发展，或者在一些实施方案中，还包括使糖尿病的发展永久性停止。 
当然这样的量将取决于受治疗的具体疾病、所述疾病的严重程度、患者个体参数(包括年龄、生理状况、身高和体重)、治疗持续时间、同时进行的治疗的性质(如果有的话)、具体的给药途径以及在医疗卫生工作者知识范围内的类似因素。这些因素对本领域技术人员来说是公知的，仅仅使用常规实验就可获知。一般优选使用各个成分或其组合的最大剂量，也就是说根据合理医学判断的最高安全剂量。但是，本领域技术人员可以理解，患者可由于医学原因、心理原因或基本上任何其它原因而要求较低剂量或可容许的剂量。 
在前述方法中所使用的药物组合物优选是无菌的，且在适于施用给患者的重量单位或体积单位中含有有效量的单独或与另一种制剂组合的Exendin变体或Exendin变体缀合物，以产生期望的应答，例如血糖的降低。 
施用于受试者的Exendin变体或Exendin变体缀合物的剂量可根据不同参数进行选择，特别是根据所使用的给药模式和受试者的状态。其它因素包括所需的治疗时期。如果在所应用的最初剂量下受试者中的应答不足，可应用更高的剂量(或通过不同的更局部的递送途径实现的有效更高剂量)到患者容忍度允许的范围。 
在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含0.20mg/ml～5mg/ml Exendin变体和/或包含4mg/ml～40mg/ml Exendin变体缀合物，优选地0.20mg/ml～5mg/ml Exendin变体和/或包含4mg/ml～40mg/ml Exendin变体缀合物，更优选地0.5mg/ml～2mg/ml Exendin变体和/或包含10mg/ml～20mg/ml Exendin变体缀合物。一般地，本发明的Exendin变体或Exendin变体缀合物的剂量范围可从约10μg/kg患者体重到约100,000μg/kg患者体重。在一些实施方案中，所述剂量范围可从约0.1mg/kg到约20mg/kg。在另一些实施方案中，所述剂量范围可从约0.1mg/kg到5mg/kg、0.1mg/kg到10mg/kg或0.1mg/kg到15mg/kg。在另一些实施方案中，所述剂量范围可从约1mg/kg到5mg/kg、5mg/kg到10mg/kg、10mg/kg到15mg/kg或15mg/kg到20mg/kg。在另一些实施方案中，所述剂量约为0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、17mg/kg、20mg/kg、25mg/kg或30mg/kg。在另一个实施方案中，所述剂量约为1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg或6mg/kg。基于所述组合物，所述剂量可连续递送(例如通过连续泵)，或者以周期性间隔递送。在一些实施方案中，当静脉内给药时，本发明的Exendin变体或Exendin变体缀合物的剂量可以为0.1至20mg/kg或其中任何值。特定组合物多次给药的理想时间间隔可由本领域技术人员确定，而不需过度实验。所提供组合物的其它给药方案是本领域技术人员已知的，其中剂量、施用时间表、给药部位、给药模式等可以与前述有所不同。在一个实施方案中，所述剂量以静脉内给药。在另一个实施方案中，药剂施用方案是单次静脉内给药。 
包含Exendin变体或Exendin变体缀合物(例如在药物组合物中)和使用说明的药盒也在本发明的范围内。所述药盒可另外含有至少一种其它的试剂，例如一种或多种其它降低血糖的药剂。 在另一个实施方案中，药盒可包含载体，所述载体经区室化，以在其中紧密固定地容纳一个或多个容器装置或一系列容器装置(例如试管、管、烧瓶、瓶、注射器等)。所述药盒的成分可包装在水性介质中，或者为冻干形式。 
本文提供的组合物可以是冻干形式或在水性介质中提供。 
优选地，所述受试者是脊椎动物，更优选是哺乳动物，最优选是人，但也可以是其它动物，如家养动物(如狗、猫等)，家畜(如牛、羊、猪、马等)或实验动物(如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。 
本发明中的Exendin变体和/或Exendin变体缀合物可以单独施用，但优选地作为药物组合物施用，其通常包括根据施用的计划方式所选的适合的药物赋形剂、稀释剂或载体。其可以通过任何适合的方式适用于需要治疗的患者/受试者。精确的剂量将取决于多个因素，包括该Exendin变体和Exendin变体缀合物的精确性质。 
一些合适的施用方式包括(但不限于)口服、直肠、鼻部、局部(包括口腔和舌下)、皮下、阴道或胃肠外的(包括皮下、肌肉、静脉、皮内、鞘内和硬脑膜外)施用。 
在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含等渗调节剂和/或防腐剂，优选地所述等渗调节剂为蔗糖、甘露醇、氯化钠和丙三醇中的一种或多种，以及所述防腐剂选自间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯。本领域的技术人员通过使用例如等张赋形剂如生理盐水、林格氏注射液或乳酸林格氏注射液等，能够很好的制备本发明的Exendin变体或Exendin变体缀合物的适合的溶液。根据要求，还可以加入稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它一些添加剂。口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂或口服液等形式。片剂可以包括固体载体，如明胶或辅剂。液体药物组合物通常包括液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。也可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。在一些实施方案中，所述药物组合物为 液体制剂和/或冻干制剂的形式，优选地所述冻干制剂含有冻干保护剂，更优选地所述冻干保护剂选自蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖等糖。 
本文所述的Exendin变体和/或Exendin变体缀合物优选以“治疗有效量”或“有效量”施用给受试者。所述组合物优选以“治疗有效量”施用给受试者，所述治疗有效量或有效量足以显示其对于所述受试者的益处。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如确定剂量等)由医护人员决定，并且通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。 
在一些实施方案中，所述的Exendin变体和/或Exendin变体缀合物的剂量范围可以是30mg/kg体重/天至0.00001mg/kg体重/天，或者3mg/kg/天至0.0001mg/kg/天，或者0.3mg/kg/天至0.01mg/kg/天。 
本发明还提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的Exendin变体和/或Exendin变体缀合物。在一些实施方案中，所述疾病选自下述之中：餐后倾倒综合征、餐后高血糖、葡萄糖耐量降低、肥胖、进食紊乱、胰岛素耐受综合征、糖尿病和高血糖症。在一个优选的实施方案中，所述疾病是II型糖尿病。 
众所周知，Exendin可以降低肥胖病人体重并可引起恶心和呕吐反应，其作用机制与抑制中枢神经系统中摄食中枢和激动呕吐中枢有关(Larsen.Mechanisms behind GLP-1 induced weight loss.Br J Diabetes Vasc Dis 2008；8：S34-S41；Schick et al.Glucagonlike peptide 1(7-36)-amide acts at lateral and medial hypothalamic sites to suppress feeding in rats.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2003；284：R1427-35)，而Exendin或其变体的缀合物由于分子量加大，难以透过血脑屏障，故可减少Exendin所引发的呕吐反应。因此在本研究开始之前，发明人预期Exendin或其变体的缀合物也会减少Exendin由中枢神经系统 介导的减少摄食量和降低体重的作用。然而，尽管野生型Exendin和未缀合的Exendin变体均降低体重和摄食量，但本发明出乎意料地发现，Exendin或其变体的缀合物却具有显著增强的降低体重和摄食量的作用。 
因此，在另一方面中，本发明提供了使用Exendin或其变体的缀合物和/或包含这种缀合物的药物组合物来降低体重的方法，此外还提供了Exendin或其变体的缀合物和/或包含这种缀合物的药物组合物在制备用于降低体重的药物中的用途。在一个实施方案中，所述Exendin或其变体的缀合物是上述本发明的Exendin变体缀合物。 
本发明将通过以下实施例进行进一步说明，其不应以任何方式解释为进一步限制。本申请中所有引用的参考文献的全部内容(包含文章参考、授权的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)均明确地通过引用并入本文。以下实施例中，若未具体指出，所用试剂和材料是能够商业获得的至少分析纯或与此相当级别的产品。 
实施例 
为了方便理解以下实施例中的技术方案，以下列表提供实施例中所用各种Exendin、Exendin变体及其缀合物的编号和简要说明。 
  编号   简要说明
  PB-101   野生型Exendin-4，又称Exenatide
  PB-102   Exendin-4，35位Cys置换
  PB-103   Exendin-4，30位Cys置换
  PB-104   Exendin-4，25位Cys置换
  PB-105   Exendin-4，39位Cys置换
  PB-106   PB-105，缀合PEG20000
  PB-106b   PB-105，缀合PEG20000，双臂PEGb
  PB-106c   PB-105，缀合PEG20000，双臂PEGc
  PB-106d   PB-105，缀合PEG20000，双臂PEGd
 
  PB-106e   PB-105，缀合PEG20000，双臂PEGe
  PB-107   PB-105，缀合PEG30000
  PB-108   PB-105，缀合PEG40000
  PB-109   PB-105，缀合PEG20000x2，双臂PEG
  PB-109b   PB-105，缀合PEG20000x2，双臂PEGb
  PB-109c   PB-105，缀合PEG20000x2，双臂PEGc
  PB-109d   PB-105，缀合PEG20000x2，双臂PEGd
  PB-110   PB-105，缀合PEG5000
  PB-110b   PB-105，缀合PEG5000b
  PB-110c   PB-105，缀合PEG5000c
  PB-111   PB-105，C端添加Tyr
  PB-112   PB-111，缀合PEG20000
  PB-113   PB-105，2位Gly替换为dAla
  PB-114   PB-113，缀合PEG40000
  PB-119   PB-105，缀合PEG23000
  PB-120   PB-105，缀合PEG27000
实施例1固相合成Exendin-4及其变体 
多肽合成已经是生物化学和药学领域的常规技术，市场上有很多商业机构(例如GE HealthCare、Applied Biosystems Inc.等)可以商业供应众多型号的多肽合成仪，并且已经有众多的商业机构(如上海生工生物工程技术服务有限公司、上海博彩生物科技有限公司等)提供定制多肽的委托合成服务。例如，可以使用以下的方法利用多肽合成仪来合成具有指定序列的多肽。 
使用“Fmoc-Rinker Amide MBHA树脂”类型的固相载体，选择Fmoc氨基保护策略合成Exendin-4及其巯基变体。第一步：将Fmoc保护的氨基酸，用HBTU/DIPEA为缩合剂、在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，反应1-5小时时间，用茚三酮方法监测缩合反应是否完全。第二步：用10-30％哌啶为脱保护试剂，在DMF溶剂中，反应10-30分钟，用茚三酮方法监测氨基保护基是否完全脱除。第三步：按照目标多肽序列，依次使用相应的氨基酸，重复“第一步和第二步”，直到序列中的最后一个氨基酸偶联完毕。第四步：用三氟醋酸(TFA)为裂解试剂，反应1-5小时，将 多肽从固相载体上裂解下来，同时脱除各种保护基。第五步：对裂解下来的多肽溶液用乙醚进行沉淀；过滤收集沉淀，然后用C18类型的色谱柱，选择0.1％TFA/乙腈-水体系为流动相进行洗脱，收集组分溶液，冷冻干燥得到产物。第六步：用高效液相色谱方法鉴定产物纯度，用氨基酸序列分析和质谱测定产品结构。 
发明人委托成都凯捷生物医药科技发展公司根据上述方法定制合成了具有以下序列的多肽： 
PB-101：野生型Exendin-4，其氨基酸序列为： 
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：1)； 
PB-102：C端第35位为半胱氨酸(Cys)的Exendin-4变体，其氨基酸序列为： 
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Cys-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：3)； 
PB-105：C端第39位为半胱氨酸(Cys)的Exendin-4变体，其氨基酸序列为： 
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：4)； 
PB-103：C端第30位为半胱氨酸(Cys)的Exendin-4变体，其氨基酸序列为： 
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Cys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：5)； 
PB-104：C端第25位为半胱氨酸(Cys)的Exendin-4变体，其氨基酸序列为： 
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Cys-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：6)； 
PB-111：C端第39位被半胱氨酸(Cys)置换并连接酪氨酸(Tyr)的Exendin-4变体，其氨基酸序列为： 
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys-Tyr(SEQ ID NO：7)；和 
PB-113：N端第2位甘氨酸(Gly)被替代为D型丙氨酸(dAla)并且C端第39位被半胱氨酸(Cys)置换的Exendin-4变体，其氨基酸序列为： 
His-dAla-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：8)。 
作为实例，图1提供了PB-105的质谱分析结果，经MALDI-TOF质谱测定PB-105的M+1峰(分子量+1)为4203.3Da，与其理论分子量(4202.8)相符。 
实施例2a PB-110(PEG5000-PB-105)的制备与分析 
取2.0mg PB-105溶解于1ml 20mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取5mg PEG5000(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，5000代表PEG的分子量是5kDa，分子结构见图2)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀，在20℃条件下反应1小时，然后用过量的半胱氨酸溶液(0.1ml 0.5M半胱氨酸溶液)终止反应，最后放置于-20℃下为分离纯化备用。 
用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)5倍稀释样品，上样于用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡5个柱体积的SP离子交换层析柱(GE公司，XK16/20柱，macroCap SP填料)，上样后用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡2个柱体积，然后在20个柱体积内线性增加到100％B缓冲液(含1M NaCl的50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5))，在AKTA Purifier收集洗脱峰。含量检测 约1mg多肽。 
用300A孔径的C4反相分析柱(Jupiter C4 300A 4.6*250mm)，0.1％TFA水溶液/0.1％TFA乙腈溶液由61/39到54/46梯度洗脱(10min)，经分析性HPLC(Agilent1200)分析样品保留时间为10.4min，纯度为100％(见图3)。采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联)，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱，纯度为97％。 
实施例2b PB-110b(PEG5000b-PB-105)的制备与分析 
取2.0mg PB-105溶解于1ml 20mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取5mg PEG5000b(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，分子结构见图4)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀。其余同实施例2a，最后采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱)，纯度为96.7％。 
实施例2c PB-110c(PEG5000c-PB-102)的制备与分析 
取2.0mg PB-105溶解于1ml 20mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取5mg PEG5000c(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，分子结构见图5)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀。其余同实施例2a，最后采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱)，纯度为97.8％。 
实施例3a PB-106(PEG20000-PB-105)的制备与分析 
取2.0mg PB-105溶解于1ml 20mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取20mg PEG20000(由 派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，20000代表PEG的分子量是20kDa，分子结构见图2)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀，在20℃条件下反应1小时，然后用过量的半胱氨酸溶液(0.1ml 0.5M半胱氨酸溶液)终止反应，最后放置于-20℃下为分离纯化备用。 
用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)5倍稀释样品，上样于用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡5个柱体积的SP离子交换层析柱(GE公司，XK16/20柱，macroCap SP填料)，上样后用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡2个柱体积，然后在20个柱体积内线性增加到100％B缓冲液(含1M NaCl的50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5))，在AKTA Purifier收集洗脱峰。含量检测约1mg多肽。 
上述收集液用SDS-PAGE凝胶电泳检测，使用考马斯亮蓝染色法和碘染色法进行对照染色(见图6A和6B)。用300A孔径的C4反相分析柱(Jupiter C4 300A 4.6*250mm)，0.1％TFA水溶液/0.1％TFA乙腈溶液由61/39到54/46梯度洗脱(10min)，经分析性HPLC(Agilent1200)分析样品保留时间为11.5min，纯度为100％(见图7)。采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联)，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱，纯度为98.9％。 
实施例3b PB-106b(PEG20000b-PB-105)的制备与分析 
取1.0mg PB-105溶解于1ml 20mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取2.5mg PEG20000b(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，20000代表PEG的分子量是20kDa，分子结构见图8)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀。其余同实施例3a，最后采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱)，纯度为98.2％。 
实施例3c PB-106c(PEG20000c-PB-105)的制备与分析 
取2.0mg PB-105溶解于1ml 20mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取20mg PEG20000c(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，20000代表PEG的分子量是20kDa，分子结构见图9)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀。其余同实施例3a，最后采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱)，纯度为97.2％。 
实施例3d PB-106d(PEG20000d-PB-105)的制备与分析 
取2.0mg PB-105溶解于1ml 20mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取20mg PEG20000-3(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，20000代表PEG的分子量是20kDa，分子结构见图10)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀。其余同实施例3a，最后采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱)，纯度为97.5％。 
实施例3e PB-106e(PEG20000e-PB-105)的制备与分析 
取2.0mg PB-102溶解于1ml 20mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取20mg PEG20000e(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，20000代表PEG的分子量是20kDa，分子结构见图11)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀。其余同实施例3a，最后采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱)，纯度为95.8％。 
实施例3f PB-112(PEG20000-PB-111)的制备与分析 
取2.0mg PB-111溶解于1ml的20mM磷酸钠盐缓冲液(pH  6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取19mg PEG20000(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，20000代表PEG的分子量是20kDa，分子结构见图2)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀，在20℃条件下反应1小时，然后用过量的半胱氨酸溶液(0.1ml 0.5M半胱氨酸溶液)终止反应，最后放置于-20℃下为分离纯化备用。 
用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)5倍稀释样品，上样于用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡5个柱体积的SP离子交换层析柱(GE公司，XK16/20柱，macroCap SP填料)，上样后用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡2个柱体积，然后在20个柱体积内线性增加到100％B缓冲液(含1M NaCl的50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5))，在AKTA Purifier收集洗脱峰。含量检测约1mg多肽。 
上述收集液用300A孔径的C4反相分析柱(Jupiter C4 300A 4.6*250mm)，0.1％TFA水溶液/0.1％TFA乙腈溶液由61/39到54/46梯度洗脱(10min)，经分析性HPLC分析样品保留时间为10.6min，纯度为98.5％(见图12)。采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联)，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱，纯度为98.7％。 
实施例4 PB-107(PEG30000-PB-105)的制备与分析 
取2.0mg PB-105溶解于1ml的20mM磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取30mg PEG30000(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，30000代表PEG的分子量是30kDa，分子结构见图2)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀，在20℃条件下反应1小时，然后用过量的半胱氨酸溶液(0.1ml 0.5M半胱氨酸溶液)终止反应，最后放置于-20℃下为分离纯化备用。 
用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)5倍稀释样品，上样于用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡5个柱体积的SP离子交换 层析柱(GE公司，XK16/20柱，macroCap SP填料)，上样后用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡2个柱体积，然后在20个柱体积内线性增加到100％B缓冲液(含1M NaCl的50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5))，在AKTA Purifier收集洗脱峰。含量检测约1mg多肽。 
上述收集液用SDS-PAGE凝胶电泳检测，使用考马斯亮蓝染色法和碘染色法进行对照染色(见图6A和6B)。用300A孔径的C4反相分析柱(Jupiter C4 300A 4.6*250mm)，0.1％TFA水溶液/0.1％TFA乙腈溶液由61/39到54/46梯度洗脱(10min)，经分析性HPLC分析样品保留时间为11.5min，纯度为97.3％(见图13)。采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联)，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱，纯度为98.7％。 
实施例5a PB-108(PEG40000-PB-105)的制备与分析 
取2.0mg PB-105溶解于1ml 20mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取40mg PEG40000(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，40000代表PEG的分子量是40kDa，分子结构见图2)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀，在20℃条件下反应1小时，然后用过量的半胱氨酸溶液(0.1ml 0.5M半胱氨酸溶液)终止反应，最后放置于-20℃下为分离纯化备用。 
用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)5倍稀释样品，上样于用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡5个柱体积的SP离子交换层析柱(GE公司，XK16/20柱，macroCap SP填料)，上样后用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡2个柱体积，然后在20个柱体积内线性增加到100％B缓冲液(含1M NaCl的50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5))，在AKTA Purifier收集洗脱峰。含量检测约1mg多肽。 
上述收集液用SDS-PAGE凝胶电泳检测，使用考马斯亮蓝染 色法和碘染色法进行对照染色(见图6A和6B)。用300A孔径的C4反相分析柱(Jupiter C4 300A 4.6*250mm)，0.1％TFA水溶液/0.1％TFA乙腈溶液由61/39到54/46梯度洗脱(10min)，经分析性HPLC(Agilent1200)分析样品保留时间为11.4min，纯度为100％(见图14)。采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联)，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱，纯度为97.2％。 
实施例5b PB-114(PEG40000-PB-113)的制备与分析 
取2.0mg PB-113溶解于1ml的20mM磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取40mg PEG40000(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，40000代表PEG的分子量是40kDa，分子结构见图2)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀，在20℃条件下反应1小时，然后用过量的半胱氨酸溶液(0.1ml 0.5M半胱氨酸溶液)终止反应，最后放置于-20℃下为分离纯化备用。 
用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)5倍稀释样品，上样于用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡5个柱体积的SP离子交换层析柱(GE公司，XK16/20柱，macroCap SP填料)，上样后用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡2个柱体积，然后在20个柱体积内线性增加到100％B缓冲液(含1M NaCl的50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5))，在AKTA Purifier收集洗脱峰。含量检测约1mg多肽。 
上述收集液用300A孔径的C4反相分析柱(Jupiter C4 300A 4.6*250mm)，0.1％TFA水溶液/0.1％TFA乙腈溶液由61/39到54/46梯度洗脱(10min)，经分析性HPLC分析样品保留时间为12.6min，纯度为97.9％(见图15)。采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联)，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱，纯度为98.4％。 
实施例6a PB-109(PEG20000×2(双臂PEG)-PB-105)的制备与分析 
取2.0mg PB-105溶解于1ml 20mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取40mg PEG20000×2(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，20000代表PEG分子中一个臂的分子量是20kDa，分子结构见图16)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀，在20℃条件下反应1小时，然后用过量的半胱氨酸溶液(0.1ml 0.5M半胱氨酸溶液)终止反应，最后放置于-20℃下为分离纯化备用。 
用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)5倍稀释样品，上样于用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡5个柱体积的SP离子交换层析柱(GE公司，XK16/20柱，macroCap SP填料)，上样后用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡2个柱体积，然后在20个柱体积内线性增加到100％B缓冲液(含1M NaCl的50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5))，在AKTA Purifier收集洗脱峰。含量检测约1mg多肽。 
上述收集液用SDS-PAGE凝胶电泳检测，使用考马斯亮蓝染色法和碘染色法进行对照染色(见图6A和6B)。用300A孔径的C4反相分析柱(Jupiter C4 300A 4.6*250mm)，0.1％TFA水溶液/0.1％TFA乙腈溶液由61/39到54/46梯度洗脱(10min)，经分析性HPLC分析样品保留时间为11.5min，纯度为100％(见图17)。采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联)，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱，纯度为99.3％。 
实施例6b PB-109b(PEG20000×2(双臂PEG)b-PB-105)的制备与分析 
取2.0mg PB-105溶解于1ml 20mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取40mg PEG20000×2b(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，20000*2代表PEG 分子量是20*2kDa，分子结构见图18)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀。其余同实施例6a，最后采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱)，纯度为99.2％。 
实施例6c PB-109c(PEG20000×2(双臂PEG)c-PB-105)的制备与分析 
取2.0mg PB-105溶解于1ml 20mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取40mg PEG20000×2c(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，20000*2代表PEG分子量是20*2kDa，分子结构见图19)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀。其余同实施例6a，最后采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱)，纯度为98.8％。 
实施例6d PB-109d(PEG20000×2(双臂PEG)d-PB-105)的制备与分析 
取2.0mg PB-105溶解于1ml 20mM的磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取40mg PEG20000×2d(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，20000*2代表PEG分子量是20*2kDa，分子结构见图20)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀。其余同实施例6a，最后采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱)，纯度为99.2％。 
实施例7 PB-119(PEG23000-PB-105)的制备与分析 
取2.0mg PB-105溶解于1ml的20mM磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取22mg PEG23000(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，23000代表PEG的分子量是23kDa，其分子结构见图2)，加入上述溶液，适当摇匀而 使PEG溶解并与肽混合均匀，在20℃条件下反应1小时，然后用过量的半胱氨酸溶液(0.1ml 0.5M半胱氨酸溶液)终止反应，最后放置于-20℃下为分离纯化备用。 
用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)5倍稀释样品，上样于用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡5个柱体积的SP离子交换层析柱(GE公司，XK16/20柱，macroCap SP填料)，上样后用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡2个柱体积，然后在20个柱体积内线性增加到100％B缓冲液(含1M NaCl的50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5))，在AKTA Purifier收集洗脱峰。含量检测约1mg多肽。 
上述收集液用300A孔径的C4反相分析柱(Jupiter C4 300A 4.6*250mm)，0.1％TFA水溶液/0.1％TFA乙腈溶液由61/39到54/46梯度洗脱(10min)，经分析性HPLC(Agilent1200)分析样品保留时间为11.6min，纯度为96.0％(见图21)。采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联)，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱，纯度为97.1％。 
实施例8 PB-120(PEG27000-PB-105)的制备与分析 
取2.0mg PB-105溶解于1ml的20mM磷酸钠盐缓冲液(pH 6.5)，按PEG与肽摩尔比为2∶1的量称取24mg PEG27000(由派格生物医药(苏州)有限公司商业供应，27000代表PEG的分子量是27kDa，其分子结构见图2)，加入上述溶液，适当摇匀而使PEG溶解并与肽混合均匀，在20℃条件下反应1小时，然后用过量的半胱氨酸溶液(0.1ml 0.5M半胱氨酸溶液)终止反应，最后放置于-20℃下为分离纯化备用。 
用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)5倍稀释样品，上样于用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡5个柱体积的SP离子交换层析柱(GE公司，XK16/20柱，macroCap SP填料)，上样后用50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡2个柱体积，然后在20个柱体积内线性增加到100％B缓冲液(含1M NaCl的50mM醋 酸钠缓冲液(pH 4.5))，在AKTA Purifier收集洗脱峰。含量检测约1mg多肽。 
上述收集液用300A孔径的C4反相分析柱(Jupiter C4 300A 4.6*250mm)，0.1％TFA水溶液/0.1％TFA乙腈溶液由61/39到54/46梯度洗脱(10min)，经分析性HPLC(Agilent1200)分析样品保留时间为12.1min，纯度为97.7％(见图22)。采用GPC分析(岛津LC-20AD，SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联)，条件为0.1M硝酸钠溶液1.0ml/min洗脱，纯度为98.4％。 
实施例9 PB-105聚乙二醇化缀合物稳定性试验 
将PB-110(PEG5000-PB-105)，PB-106(PEG20000-PB-105)，PB-107(PEG30000-PB-105)，PB-108(PEG40000-PB-105)和PB-109(PEG20000*2-PB-105)分别放在pH值为4.5醋酸钠缓冲液和pH值为7.0磷酸盐缓冲液，温度为4℃和-20℃条件下，考察其稳定性。在7、15、30、60天分别取样用HPLC分析，60天结果表明，样品在pH 4.5和-20℃时保存稳定(图23A)，样品在pH 7.0时在4℃或-20℃保存均稳定(图23B，23C)。 
实施例10 PB-101与PB-105在体外对细胞内cAMP活性的影响 
将PC12细胞消化并按105细胞/ml密度接种于24孔板，培养48小时(到60-70％汇合)，弃去原培养液，并用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，加入1ml含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS，将受试的PB-101和C端第39位为半胱氨酸的Exendin-4变体PB-105(10-11，10-10，10-9，10-8，10-7和10-6M)与3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，终浓度为100μM)共同孵育30min，弃去孵药培养基，加入500μl HCl(0.1M)，终止酶对cAMP的降解，收集细胞，超声裂解细胞，按BCA检测法测定细胞蛋白含量。按cAMP酶联免疫试剂盒(美国RD System公司)说明进行操作，设立不同浓度的标准品组以建立标准曲线，反应完成后在酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)于450nm测定光吸收值， 用该吸收值在标准曲线上读出对应的cAMP浓度，最后计算样品中cAMP浓度。使用Graphpad Prizm软件，对PB-101和PB-105在体外增加细胞内cAMP量效关系结果进行计算。 
实验结果如图24所示，PB-101呈剂量依赖式地增PC12细胞内cAMP含量，增cAMP最大值(Emax)为133.2±7.2pmol/100μg(蛋白)，EC50值为1.9x10-9M。PB-105在体外对PC12细胞内cAMP的影响与PB-101非常相似。其中PB-105增加cAMP最大值(Emax)为129.4±6.8pmol/100μg(蛋白)(PB-105vs PB-101，P＞0.05)；EC50值为2.5x10-9M。进一步分析表明PB-101与PB-105的Log EC50值分别为-8.71±0.15和-8.61±0.15(PB-105 vs PB-101，P＞0.05)。说明在C端第39位引入半胱氨酸(巯基)，不改变PB-101本身的生物活性。 
实施例11 PB-105及其聚乙二醇化缀合物在体外对细胞内cAMP活性的影响 
将PC12细胞消化并按105细胞/ml密度接种于24孔板，培养48小时(到60-70％汇合)，弃去原培养液，并用PBS清洗2次，加入1ml含1％BSA的PBS，将受试药物PB-105，PB-105聚乙二醇化(PEG5000)缀合物PB-110，PB-105聚乙二醇化(PEG20000)缀合物PB-106，PB-105聚乙二醇化(PEG30000)缀合物PB-107，PB-105聚乙二醇化(PEG40000)缀合物PB-108和PB-105聚乙二醇化(PEG20000x2，双臂)缀合物PB-109(10-11，10-10，10-9，10-8，10-7，10-6和10-5M)与3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，终浓度为100μM)共同孵育30min，弃去孵药培养基，加入500μl HCl(0.1M)，终止酶对cAMP的降解，收集细胞，超声裂解细胞，按BCA检测法测定细胞蛋白含量。按cAMP酶联免疫试剂盒说明进行操作，设立不同浓度的标准品组以建立标准曲线，反应完成后在酶标仪于450nm测定光吸收值，用该吸收值在标准曲线上读出对应的cAMP浓度，最后计算样品中cAMP浓度。使用Graphpad Prizm软件，对PB-106、PB-107、PB-108、PB-109及PB-110在体外增加细胞内cAMP的量效关系 进行计算。 
实验结果表明，PB-105剂量依赖式地增加PC12细胞内cAMP含量，其增加cAMP最大值(Emax)为103.9±1.5pmol/100μg(蛋白)，EC50值为1.3x10-9M。聚乙二醇化修饰呈分子量(5-40kDa)-依赖式地平行右移量效关系曲线，降低PB-105生物活性(图25)。PB-110，PB-106，PB-107，PB-108和PB-109的EC50值分别为1.1x10-9，1.1x10-9，1.2x10-8，9.7x10-8和1.3x10-7M。其中5kDa(PB-110)和20kDa(PB-106)聚乙二醇化修饰几乎不影响PB-105的活性(分别为PB-105活性的115％)，而30kDa(PB-107)和40kDa(包括线性和双臂，PB-108和PB-109)聚乙二醇化修饰则分别降低PB-105的活性约90％和99％。聚乙二醇化缀合物中聚乙二醇的分子量与这些药物的活性(Log EC50)的相关性见图26A(包括图24中PB-105的EC50值)。 
实施例12 PB-105及其聚乙二醇化缀合物在体外对细胞内cAMP活性的影响 
将PC12细胞消化并按105细胞/ml密度接种于24孔板，培养48小时(到60-70％汇合)，弃去原培养液，并用PBS清洗2次，加入1ml含1％BSA的PBS，将受试药物PB-105，PB-105聚乙二醇化(PEG23000)缀合物PB-119和PB-105聚乙二醇化(PEG27000)缀合物PB-120(10-11，10-10，10-9，3x10-9，10-8和10-7M)与3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，终浓度为100μM)共同孵育30min，弃去孵药培养基，加入500μl HCl(0.1M)，终止酶对cAMP的降解，收集细胞，超声裂解细胞，按BCA检测法测定细胞蛋白含量。按cAMP酶联免疫试剂盒说明进行操作，设立不同浓度的标准品组以建立标准曲线，反应完成后在酶标仪于450nm测定光吸收值，用该吸收值在标准曲线上读出对应的cAMP浓度，最后计算样品中cAMP浓度。使用Graphpad Prizm软件，对PB-105、PB-119、和PB-120在体外增加细胞内cAMP的量效关系进行计算。 
实验结果表明，PB-105剂量依赖式地增加PC12细胞内cAMP 含量，EC50值为2.7x10-9M。PB-106(PEG20000)和PB-119(PEG23000)不影响PB-105对cAMP活性但PB-120(PEG27000)平行右移量效关系曲线，降低PB-105对cAMP生物效价约50％(图27)。PB-106，PB-119和PB-120的EC50值分别为1.5x10-9，2.5x10-9和5.4x10-9M。 
尽管一般认为随着缀合基团分子量(如从4kDa起)的增加，缀合生物分子的生物活性将呈指数性逐渐降低(Bailon et al.Rational design of potent，long-lasting form of interferon：A 40kDa branched polyethylene glycol-conjugated interferon α-2a for the treatment of hepatitis C.Bioconjugate Chem 2001；12：195-202；Bowen et al.Relationship between molecular mass and duration of activity of polyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein.Experimental Hematology 1999；27：425-32；Bailon et al.PEG-modified biopharmaceuticals.Expert Opin Deliv.2009；6：1-16)。然而由图25和图27中出乎意料地发现，所缀合聚合物基团的分子量与Exendin变体缀合物的体外刺激cAMP活性之间的关系与这种预期并不完全一致。至少对于所缀合PEG分子量高达23kDa的Exendin变体缀合物，聚乙二醇化修饰不影响Exendin变体缀合物体外刺激细胞产生cAMP的作用(而PEG分子量高达27kDa仅有轻度影响)。相反，聚乙二醇化修饰不影响PB-105的最大刺激cAMP生成作用(Emax)，PB-110，PB-106，PB-107，PB-108和PB-109的Emax值分别为102.1±1.8，111.9±2.1，126.2±3.4，100.4±1.7和115.5±3.5pmol/100μg蛋白。聚乙二醇化缀合物中聚乙二醇的分子量与这些药物的Emax值无相关性(见图26B)(包括图24中PB-105的Emax值)。 
基于这一出乎意料的试验结果，发明人进行了以下事后分析。由于本实施例没有使用含血清培养基(其中含丰富蛋白酶)作为反应体系，而且在反应溶液中也没有外加蛋白酶，因此在本实施例中体外条件下Exendin变体及其缀合物的酶促降解作用显著低于体内环境的情形。也就是说，如果是更长作用时间的体内试验，与未缀合的野生型Exendin或Exendin变体相比，很可能本发明Exendin变体缀合物的生物活性的降低程度更小，甚至比未缀合 Exendin或其变体的生物活性更高。从另一方面来说，甚至可以使用高于23kDa的聚合物基团来缀合Exendin变体，而不显著影响其体内生物活性。尽管本发明并不受这种理论推测的限制，这种预测结果已经在后续实施例中得到了证实。 
实施例13 PB-101和PB-105降血糖作用时效试验 
雄性昆明小鼠(体重27-32g)，实验前小鼠不禁食禁水，随机分为3组，每组6只。分别皮下单次注射等体积的生理盐水(10ml/kg)、PB-101(10μg/kg)和C端第39位为半胱氨酸的Exendin变体PB-105(10μg/kg)。注射后0，1，2，4，8，12小时尾尖采血，使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸检测血糖。以不同时间点的血糖值为纵坐标，时间为横坐标，建立降血糖作用的时效曲线，计算出PB-101及PB-105降血糖作用的生物半衰期。结果如图28所示，经半胱氨酸置换后的Exendin-4变体与Exendin-4的生物半衰期分别为4.7±0.2hrs和4.4±0.2hrs(PB-105 vs PB-101，P＞0.05)。表明在C端39位经半胱氨酸置换后的Exendin-4变体与Exendin-4具有相当的生物半衰期。 
实施例14 PB-101和PB-105降血糖作用量效试验 
雄性昆明小鼠(体重23-27g)，实验前小鼠禁食3h，但不禁水，随机分16组，每组18只。分别皮下单次注射等体积的生理盐水(10ml/kg)，PB-101(0.01，0.1，0.3，1，3，10，100μg/kg)和C端第39位为半胱氨酸的Exendin变体PB-105(0.01，0.1，0.3，1，3，10，100μg/kg)。注射后1小时尾尖采血，使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸检测血糖。以血糖值为纵坐标，剂量为横坐标，建立降血糖作用的量效曲线(图29)，并且运用Graphpad Prizm软件，计算PB-101和PB-105降糖作用量效关系参数(Emax和ED50)。结果表明，单次注射PB-101和PB-105的最大降糖效率分别为32.2％和36.1％，ED50值分别为0.6和1.2μg/kg。进一步分析表明，PB-101和PB-105的Log ED50值分别为-0.25±0.17和0.08±0.20 (PB-105 vs PB-101，P＞0.05)。实验结果显示，在C端39位经半胱氨酸置换后的Exendin-4变体PB-105与Exendin-4降血糖效应没有显著性差异。 
实施例15 PB-101及其变体PB-102降血糖作用量效试验 
雄性昆明小鼠(体重22-26g)，实验前小鼠禁食3h，但不禁水，随机分18组，每组6只。分别皮下单次注射等体积的生理盐水(10ml/kg)，PB-101(0.01，0.1，1，10，100μg/kg)和C端第35位为半胱氨酸的Exendin变体PB-102(0.01，0.1，1，10，100μg/kg)。注射后1小时尾尖采血，使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸检测血糖。以血糖值为纵坐标，剂量为横坐标，建立降血糖作用的量效曲线(图30)，并且运用Graphpad Prizm软件，计算PB-101和PB-102降糖作用量效关系参数(Emax和ED50)。结果表明，单次注射PB-101和PB-102的最大降糖效率分别为39.8％和32.8％，ED50值分别为0.5和2.5μg/kg。进一步分析表明，PB-101和PB-102的Log ED50值分别为-0.2867±0.2272和0.4015±0.2946(PB-102 vs PB-101，P＞0.05)。实验结果显示，在C端35位经半胱氨酸置换后的Exnedin-4变体PB-102与Exendin-4降血糖效应没有显著性差异。 
实施例16 PB-105及其聚乙二醇化缀合物等量降血糖时效试验 
雄性昆明小鼠(体重22-26g)，实验前小鼠不禁食禁水，随机分为6组，每组12只。分别皮下单次注射PB-105(10μg/kg)，PB-105聚乙二醇化(PEG5000)缀合物PB-110(10μg/kg)，PB-105聚乙二醇化(PEG20000)缀合物PB-106(10μg/kg)，PB-105聚乙二醇化(PEG30000)缀合物PB-107(10μg/kg)，PB-105聚乙二醇化(PEG40000)缀合物PB-108(10μg/kg)和PB-105聚乙二醇化(PEG20000x2，双臂)缀合物PB-109(10μg/kg)。注射后0，1，2，4，8，12，18，24，36小时尾尖采血，使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸检测血糖。以不同时间点的血糖值为纵 坐标，时间为横坐标，建立降血糖作用的时效曲线(图31)，并计算出PB-105及其聚乙二醇化缀合物降血糖作用的生物半衰期和最大降糖作用和降糖作用曲线上面积(表1)。从表1可以看出，与未缀合的PB-105相比，试验中所用各种Exendin变体缀合物都具有与之相似甚至显著更高(PB-106)的累积降血糖效果(见血糖曲线上面积)，而且这些Exendin变体缀合物都具有显著更长的生物半衰期。进一步采用PEG分子量vs.生物半衰期、最大降糖作用和降糖作用曲线上面积的相关分析结果表明，PB-105聚乙二醇化缀合物PB-106，PB-107，PB-108和PB-109都显著延长了PB-105降血糖作用的时间(生物半衰期t1/2)，但在PEG分子量在5-20kDa区间，其生物半衰期延长与分子量成正比，而在20kDa后降血糖作用时间(生物半衰期)基本维持不变(图32A)；聚乙二醇化缀合物在PEG分子量在5-20kDa区间最大降糖作用保持不变，但之后随着聚乙二醇分子量的增加而有所降低(图32B)；在降糖作用曲线上面积方面，仅PB-106(PEG20kDa)显著性高于PB-105，其它缀合物分子具有与PB-105接近或稍低的累积降糖作用(图32C)。由上可知，至少在PEG分子量高达20kDa时，定点聚乙二醇化修饰(PB-110和PB-106)不显著影响Exendin变体缀合物的最大降糖作用(分别为PB-105活性的96％)，而在PEG分子量为30kDa或更高时(PB-107、PB-108和PB-109)，聚乙二醇化修饰显著降低其最大降糖作用，尽管这些缀合物仍然具有相当的累积降糖作用和显著更长的生物半衰期。这一结果表明，可以用较高分子量的缀合基团来缀合Exendin变体，由此获得显著更长的生物半衰期以及更加平缓和稳定的血糖水平，从而避免血糖水平在短时间内下降过低以及其大范围波动。该发现与前述体外cAMP实验结果一致(见图26)。 
表1 PB-105及其聚乙二醇化缀合物降血糖作用的生物半衰期、最大降糖作用和血糖曲线上面积(Area Above Curve for lowering blood sugar，AAC)(每组12只小鼠) 
Figure BPA00001448481200511
*P＜0.05(vs PB-105) 
实施例17 PB-105及其聚乙二醇化(PEG30000)缀合物PB-107等效量降血糖作用时效试验 
由于PEG30000(PB-107)在体外降低了PB-105的生物活性约90％(图25)，并在体内降低了PB-105的生物活性约50％(图31)，本研究加大PB-107剂量从而在产生与PB-105等效的条件下，进一步研究PB-107的生物半衰期。雄性昆明小鼠(体重22-25g)，实验前小鼠不禁食禁水，随机分为2组，每组6只。分别皮下单次注射PB-105(10μg/kg)和PB-105聚乙二醇化(PEG30000)缀合物PB-107(100μg/kg，约产生10μg/kg PB-105的100％降血糖作用的剂量)。注射后0，1，2，4，8，12，18，24，36，48，72小时尾尖采血，使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸检测血糖。以不同时间点的血糖值为纵坐标，时间为横坐标，建立降血糖作用的时效曲线，计算出PB-105(10μg/kg)和PB-107(100μg/kg)降血糖作用的生物半衰期。结果如图33所示，PB-105(10μg/kg)和PB-107(100μg/kg)的生物半衰期分别为4.5±0.4hrs和44.6±4.5hrs(P＞0.05，PB-107 vs PB-105)。等效剂量的时效关系研究结果表明，聚乙二醇化(PEG30000)(PB-107)延长PB-105降血糖作用时间达10倍。 
实施例18 PB-105及其聚乙二醇化(PEG20000)缀合物PB-106降血糖作用量效试验 
雄性昆明小鼠(体重20-24g)，实验前小鼠禁食3h，但不禁水，随机分13组，每组6只。分别皮下单次注射等体积的盐水(10ml/kg)，PB-105(0.1，0.3，1，3，10，30μg/kg)和等剂量的聚乙二醇化 (PEG20000)缀合物PB-106(0.1，0.3，1，3，10，30μg/kg)。PB-105组于注射后1小时(降糖峰值时间，见图28和31)尾尖采血，PB-106组于注射后4小时(降糖峰值时间，见图31)尾尖采血，使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸检测血糖。以血糖值为纵坐标，剂量为横坐标，建立降血糖作用的量效曲线(图34)，并且运用Graphpad Prizm软件，计算PB-105和PB-106降糖作用量效关系参数(Emin，Emax和ED50)。单次注射PB-105和PB-106的Emin分别为8.3±0.2和8.4±0.3mmol/L；其Emax分别为6.0±0.3和5.5±0.6mmol/L(最大降糖效率分别为27.8％和34.5％)。PB-105和PB-106的ED50值分别为1.2和3.3μg/kg。进一步分析表明，PB-105和PB-106的Log ED50值分别为0.07±1.2和0.5±0.2(PB-106 vs.PB-105，P＞0.05)。实验结果显示，经聚乙二醇(PEG20000)修饰以后的PB-105缀合物PB-106与PB-105降血糖效应(包括Emax和ED50)没有显著性差异。 
实施例19 PB-105、PB-111和聚乙二醇化缀合物PB-106和PB-112对正常小鼠降血糖的时效试验 
雄性昆明小鼠(体重24-30g)，实验前小鼠不禁食禁水，随机分为4组，每组6只。分别皮下单次注射PB-105(10μg/kg)，PB-105聚乙二醇化(PEG20000)缀合物PB-106(10μg/kg)，PB-111(10μg/kg)和PB-111聚乙二醇化(PEG20000)缀合物PB-112(10μg/kg)。其中PB-111为在C端39位半胱氨酸连接酪氨酸的PB-105衍生物。注射后0，0.5，1，2，4，8，12，24，48小时尾尖采血，使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸检测血糖。以不同时间点的血糖值为纵坐标，时间为横坐标，建立降血糖作用的时效曲线，并计算出PB-105和PB-111及其聚乙二醇缀合物降血糖作用的生物半衰期和最大降糖作用。结果如图35所示，PB-105，PB-106，PB-111和PB-112均呈时间依赖式降低小鼠随机血糖。PB-105和PB-111的生物半衰期分别为4.6hrs和6.0hrs，最大降糖作用分别为44.7％和36.4％。PB-106和PB-112的生物半衰期分别为19.6hrs和 21.7hrs，最大降糖作用分别为37.3％和34.9％。结果表明在C端39位加上酪氨酸不影响PB-105及其聚乙二醇化缀合物PB-106的降糖活性和生物半衰期。 
实施例20 PB-101及其变体PB-105、PB-111和PB-113以及聚乙二醇化缀合物PB-106、PB-112和PB-114对STZ糖尿病小鼠降血糖时效试验 
糖尿病造模前小鼠禁食14小时，尾尖采血检测空白血糖值，随后皮下一次性注射新配制STZ(链脲佐菌素)(120mg/10ml/kg，新鲜配制，溶于pH 4.5的0.1M的柠檬酸缓冲液)，3天后检测血糖，小鼠随机血糖高于16.7mmol/L即为糖尿病造模成功小鼠。实验前小鼠不禁食禁水，分为7组，每组4-6只。尾静脉采血检测0h血糖，然后分别皮下单次注射等体积的PB-101(10μg/10ml/kg)、PB-105(10μg/kg)、PB-106(10μg/kg)、PB-111(10μg/kg)、PB-112(10μg/kg)、PB-113(10μg/kg)和PB-114(10μg/kg)。其中PB-111为在C端39位半胱氨酸连接酪氨酸的PB-105衍生物；PB-113为在N端第2位甘氨酸被D型丙氨酸替代的PB-105衍生物；PB-114为PB-113聚乙二醇化(PEG40000)缀合物。注射后于0.5，1，2，4，8，12，24，48hrs采血，并检测血糖。以不同时间点的血糖值为纵坐标，时间为横坐标，建立PB-101，PB-105，PB-106，PB-111，PB-112，PB-113和PB-114降血糖作用的时效曲线，用GraphPad Prism 5 Demo软件(Prism v5，Graphpad Software，Inc.，San Diego，CA)作图，运用数理统计学方法分析PB-101，PB-105，PB-106，PB-111，PB-112，PB-113和PB-114的生物半衰期t1/2，比较其差别。 
图36显示，单次注射PB-101，PB-105，PB-106，PB-111，PB-112，PB-113和PB-114对STZ诱导的糖尿病小鼠均呈时间依赖式降低随机血糖，其最大降糖效率分别为47.5％，57.6％，69.8％，54.4％，59.7％，49.2％和17.9％(仅为PB-101的38％)。PB-101，PB-105，PB-106，PB-111，PB-112和 PB-113生物半衰期分别为5.5，5.5，21.8，5.0，20.3和5.9hrs，PB-114的生物半衰期由于降糖作用小而未能测算。实验结果表明，在C端39位增加酪氨酸或在N端第2位由D型丙氨酸替代甘氨酸均不降低PB-105抗高血糖活性；聚乙二醇化(PEG20000)修饰不降低PB-105及其衍生物活性，但聚乙二醇化(PEG40000)明显降低PB-105及其衍生物活性。 
实施例21 PB-105及其聚乙二醇化缀合物PB-106，PB-119和PB-120等量降血糖时效试验 
雄性昆明小鼠(体重24-30g)，实验前小鼠不禁食禁水，随机分为4组，每组6只。分别皮下单次注射PB-105(10μg/kg)，PB-105聚乙二醇化(PEG20000)缀合物PB-106(10μg/kg)，PB-105聚乙二醇化(PEG23000)缀合物PB-119(10μg/kg)和PB-105聚乙二醇化(PEG27000)缀合物PB-120(10μg/kg)。注射后0，0.5，1，2，4，8，12，24，36，48小时尾尖采血，使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸检测血糖。以不同时间点的血糖值为纵坐标，时间为横坐标，建立降血糖作用的时效曲线，并计算出PB-105及其聚乙二醇化缀合物降血糖作用的生物半衰期和最大降糖作用。结果如图37所示，PB-105，PB-106，PB-119和PB-120均呈时间依赖式降低小鼠随机血糖，其生物半衰期分别为6.0，21.7，24.1和26.1hrs，并随PEG分子量增加而增加；其降糖作用峰值时间分别为约1小时(PB-105)和4小时(PB-106，PB-119和PB-120)，降血糖作用峰值分别为35.0％，50.9％，48.2％和42.2％(图37A)。采用降血糖-时间面积计算，PB-106，PB-119和PB-120均显著增加PB-105降糖作用(增加3-4倍)，其累积作用随PEG分子量增加而增加(图37B)。实验结果表明分子量在20-27kDa之间，聚乙二醇修饰不降低PB-105降血糖活性，显著延长了降血糖作用时间，并增加累积降血糖作用。由此可以看出，当PEG分子量在20-27kDa之间时，本发明的Exendin变体缀合物PB-106，PB-119和PB-120的降血糖作用峰值甚至超出 了未缀合的PB-105，并且这些缀合物具有显著更长的降血糖作用时间，并且它们的累积降血糖作用随PEG分子量的增加而增加，从而提供了更好的综合降血糖作用。 
实施例22 PB-101，PB-105，PB-106和PB-120鸽子呕吐试验 
健康家鸽，雌雄不拘，分为7组，每组4-8只。分别皮下单次注射PB-101(3mg/kg，N＝4或6mg/kg，N＝8)，PB-105(3mg/kg，N＝4或6mg/kg，N＝8)，PB-106(3mg/kg，N＝4或6mg/kg，N＝8)和PB-120(6mg/kg，N＝8)，采用电子监视系统观察并记录给药后24小时内呕吐次数和出现呕吐潜伏期(给药后至发生第一次呕吐的时间)。呕吐次数定义为伸脖、张口、耸肩、腹部收缩至恢复平静或呕吐动作停止记为一次。以前经验表明鸽子在未给予药物等正常情况下不引起呕吐反应，而给予PB-101(3和6mg/kg)和PB-105(3和6mg/kg)，鸽子均剂量依赖性地产生明显呕吐反应。与PB-101、PB-105相应剂量组比较，PB-106(3mg/kg和6mg/kg)和PB-120(6mg/kg)组家鸽呕吐潜伏期明显延长(延长约5-18倍，见图38A)，呕吐次数明显降低(降低约50-70％，见图38B)，其中在6mg/kg剂量时，差异有统计学显著性(p＜0.05)。结果显示，聚乙二醇化修饰明显降低了Exendin及其变体的呕吐反应。 
实施例23 PB-101，PB-105和PB-106对豚鼠全身免疫过敏反应和体重的影响 
雄性健康豚鼠44只，每只体重300g左右，分5组，即生理盐水组(N＝10)、PB-101(N＝10)、PB-105(N＝10)、PB-106(N＝10)和白蛋白给药组(N＝4)。隔天分别皮下注射生理盐水(1ml/kg)、PB-101(100μg/kg)、PB-105(100μg/kg)、PB-106(100μg/kg)和鸡卵清白蛋白(80mg/kg)，连续3次，在最后一 次皮下注射14天后脚趾静脉分别注射激发剂量的生理盐水(1ml/kg)、PB-101(300μg/kg)、PB-105(300μg/kg)、PB-106(300μg/kg)和白蛋白(240mg/kg)。注射后即刻观察动物反应，观察时间为激发后0-3小时，按表2计动物过敏反应症状，再按 
表3计动物过敏反应程度(半定量)。 
表2动物过敏反应症状计量 
 0正常   7呼吸急促   14步态不稳
 1躁动   8排尿   15跳跃
 2竖毛   9排粪   16喘息
 3颤抖   10流泪   17痉挛
 4搔鼻   11呼吸困难   18旋转
 5喷嚏   12哮鸣音   19潮式呼吸
 6咳嗽   13紫癜   20死亡
表3动物全身过敏性反应程度评价及半定量标准
  0   -   0   过敏反应阴性
  1-4症状   +   1   过敏反应弱阴性
  5-10症状   ++   2   过敏反应阳性
  11-19症状   +++   3   过敏反应强阳性
  20   ++++   4   过敏反应极强阳性
以时间为横坐标，过敏反应程度(半定量)为纵坐标作图39显示，生理盐水对照组豚鼠均未发生任何过敏反应，呈过敏反应阴性；白蛋白组豚鼠激发后均即刻(＜2min)死亡，过敏反应呈极强阳性；PB-101组和PB-105豚鼠产生过敏反应，呈阳性反应。PB-101和PB-105为39氨基酸残基的多肽，长期给药后能在体内产生抗体(Buse et al.Effects of exenatide(exendin-4)on glycemic control over 30 weeks in  sulfonylurea-treated patients with type 2 diabetes.Diabetes Care.2004；27：2628-2635.)。而PB-105聚乙二醇化(PEG20000)缀合物PB-106对豚鼠产生弱阴性过敏反应。结果表明聚乙二醇化(PB-106)能显著降低PB-101或PB-105免疫原性，减少过敏反应的产生。
以时间为横坐标，豚鼠体重为纵坐标作图(图40)显示，致敏期间生理盐水组豚鼠体重持续增长(实验过程18日内体重增加约38％)。与生理盐水组比较，连续2次给予白蛋白4日后不降低体重；但连续2次给予PB-101(100μg/kg)或PB-105(100μg/kg)4日后，豚鼠体重降低分别为约8％和11％(p＜0.05)。而给予同等剂量的PB-106后，其降低豚鼠体重作用比PB-101或PB-105强；与给予PB-101和PB-105相比较，给予PB-106分别进一步降低约8％和11％(p＜0.05)。停止给药12日后，PB-101、PB-105和PB-106组豚鼠体重恢复，与生理盐水组相当。 
实施例24 PB-105，PB-106，PB-119和PB-120对大鼠体重和摄食量的影响 
雄性健康SD大鼠24只，每只体重200g左右，分5组，即生理盐水组(1ml/kg，N＝4)、PB-105(100μg/kg，N＝5)、PB-106(100μg/kg，N＝5)、PB-119(100μg/kg，N＝5)和PB-120(100μg/kg，N＝5)。隔天分别皮下注射生理盐水和药物，连续3次，每天观察大鼠体重及摄食量变化。 
以时间为横坐标，大鼠体重为纵坐标作图(图41A)显示，给药期间生理盐水组大鼠体重持续增长(实验过程9日内体重增加了33.4％)，与生理盐水组比较，连续3次给予PB-105(100μg/kg)9日后，以体重-时间AUC为指标，大鼠体重降低约5.3％(p＜0.05)；而给予同等剂量的PB-106、PB-119和PB-120后，降低大鼠体重作用比PB-105强；与给予PB-105相比较，以体重-时间AUC为指标，给予PB-106、PB-119和PB-120分别进一步降低约7％，8％和8％(p＜0.05)。 
以时间为横坐标，大鼠摄食量为纵坐标作图41B显示，给药期间生理盐水组大鼠摄食量基本维持不变。与生理盐水组比较，以摄食量-时间AUC为指标，PB-105(100μg/kg)连续给药3次后，摄食量降低约16％；而给予同等剂量的PB-106，PB-119和PB-120后，降低大鼠摄食量作用比PB-105强；与给予PB-105相比较，给予PB-106、PB-119和PB-120分别进一步降低18％、19％和19％(p＜0.05)。 
众所周知，Exenatide可以降低肥胖病人体重并可引起恶心和呕吐反应，其作用机制与抑制中枢神经系统中摄食中枢和激动呕吐中枢有关(Larsen.Mechanisms behind GLP-1 induced weight loss，Br J Diabetes Vasc Dis 2008；8(Suppl 2)：S34-S41；Schick et al.Glucagonlike peptide 1(7-36)-amide acts at lateral and medial hypothalamic sites to suppress feeding in rats.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2003；284：R1427-35)，而Exendin或其变体的缀合物由于分子量加大，难以透过血脑屏障，故可减少PB-101所引发的呕吐反应(见实施例22)。因此在本研究开始之前，发明人预期Exendin或其变体的缀合物也会减少Exendin由中枢神经系统介导的减少摄食量和降低体重的作用。尽管野生型Exendin和未缀合的Exendin变体均降低体重和摄食量，但本发明出乎意料地发现，Exendin或其变体的PEG缀合物却具有显著增强的降低体重和摄食量的作用。 
实施例25 PB-101及PB-105药代动力学试验 
雄性SD大鼠(体重250-300g，购自中国科学院上海实验动物中心)，给予30％水合氯醛(300mg/kg，i.p.)麻醉，在右上缘大腹股沟切口，分离股动静脉，实施股动静脉插管术(聚乙烯PE50管，美国Becton Dickinson公司)，右股动脉插管用于采血取样，右股静脉插管用于给药，PE-50管经背部皮下从颈背部引出，将导管内充满肝素液(200U/ml)，缝合切口，术后大鼠独笼饲养，恢复12h以上。插管大鼠在饲养笼内保持自由活动状态，自由饮食，分为PB-101组和PB-105组(每组3-6只)，分别于右股静脉推注给药5μg/kg，分别于给药后0.08，0.25，0.5，1，1.5， 2，2.5，3，4，5和6小时通过PE50管取血。血样置Eppendorf管离心制备血浆(5000rpm，5min)，-20℃备用。各组血浆样品制备齐全后采用Exenatide EIA Kit(Phoenix Pharmaceuticals，Inc.USA)检测样品中药物浓度。结果以血药浓度值为纵坐标，时间为横坐标，分别建立PB-101和PB-105药-时曲线(图42)，结果表明PB-105与PB-101在大鼠体内呈现相似分布和消除规律。 
运用Kinetica 5.0(Thermo Fisher Scientific Inc.，USA)软件，进行非房室模型(Non-compartmental method)参数统计，计算出PB-101和PB-105的药代动力学参数(Cmax，AUC0-t，AUC0-∞，t1/2，MRT，CL和Vss等)，结果见表4。其中PB-101和PB-105的血浆半衰期分别为4.8±0.7和4.9±1.4hrs(PB-105 vs.PB-101，P＞0.05)；药-时曲线下面积分别为45.4±1.6和47.9±19.0ng*hr/ml(PB-105 vs.PB-101，P＞0.05)。实验结果显示PB-105和PB-101具有相似的药代动力学特性。 
表4 PB-101和PB-105的药代动力学参数(每组3-6只大鼠) 
Figure BPA00001448481200601
实施例26 PB-105及其聚乙二醇化缀合物药代动力学试验 
雄性SD大鼠(体重250-300g，购自中国科学院上海实验动物中心)，给予30％水合氯醛(300mg/kg，i.p.)麻醉，在右上缘大腹股沟切口，分离股动静脉，实施股动静脉插管术(聚乙烯PE50管，美国Becton Dickinson公司)，右股动脉插管用于采血取样，右股静脉插管用于给药，PE-50管经背部皮下从颈背部引 出，将导管内充满肝素液(200U/ml)，缝合切口，术后大鼠独笼饲养，恢复12h以上。插管大鼠在饲养笼内保持自由活动状态，自由饮食。分为6组(每组3只)：PB-105，PB-110，PB-106，PB-107，PB-108和PB-109。分别于右股静脉推注给药5μg/kg不同的时间点采血0.2ml，在给药后48小时前通过PE50管取血，48小时后采用尾静脉取血。具体如下：PB-105组(给药后0.08，0.25，0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，5，6小时)，PB-110组(给药后0.08，0.25，0.5，1，2，3，4，5，6，8，10小时)，PB-106组(给药后0.08，0.25，0.5，1，2，4，8，12，24，36，48，60，72，84，96小时)，PB-107组(给药后0.08，0.25，0.5，1，2，4，8，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120，132，144小时)，PB-108和PB-109组(给药后0.08，0.25，0.5，1，2，4，8，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120，132，144，156，168小时)。血样置Eppendorf管离心制备血浆(5000rpm，5min)，-20℃备用。各组血浆样品制备齐全后采用Exenatide EIA Kit(Phoenix Pharmaceuticals，Inc.USA)检测样品中药物浓度。结果以血药浓度值为纵坐标，时间为横坐标，建立聚乙二醇化缀合物药-时曲线，结果表明PB-105及其聚乙二醇化缀合物显示快速分布和慢速消除(见图43)。 
运用Kinetica 5.0(Thermo Fisher Scientific Inc.，USA)软件，进行非房室模型(Non-compartmental method)参数统计，计算出PB-105及其聚乙二醇化缀合物的药代动力学参数(Cmax，AUC0-t，AUC0-∞，t1/2，MRT，CL和Vss等)，结果见表5。其中，PB-105的血浆半衰期为2.9±0.1hrs，其聚乙二醇化缀合物的血浆半衰期随聚乙二醇分子量的增加而延长；PB-105药-时曲线下面积为18.2±1.9ng*hr/ml，其聚乙二醇化缀合物的药-时曲线下面积随聚乙二醇分子量的增加而增加。图44A和图44B分别显示聚乙二醇化缀合物中聚乙二醇分子量与血浆半衰期和药-时曲线下面积之间的关系。 
表5 PB-105及其聚乙二醇化缀合物的药代动力学参数(每组3只大鼠) 
Figure BPA00001448481200621
本发明的Exendin变体具有改善的药动学性质，能显著降低血糖，具有与Exendin相当或更优的生物学活性。通过半胱氨酸巯基定点偶联聚合物的Exendin变体缀合物显著延长了Exendin变体的半衰期，保持了高的生物活性。 
本发明已通过各个具体实施例作了举例说明。但是，本领域普通技术人员能够理解，本发明并不限于各个具体实施方式，普通技术人员在本发明的范围内可以作出各种改动或变型，而仍不背离本发明的精神和范围。这样的改动和变型均在本发明的范围之内。 
Figure IPA00001448480700011

Claims (10)

1.一种具有GLP-1受体激动剂活性的Exendin变体缀合物，其中一个或多个聚合物基团缀合至所述Exendin变体的半胱氨酸残基上，并且其中所述一个或多个聚合物基团的分子量为21kDa至29kDa，
其中所述一个或多个聚合物基团各自独立地是聚乙二醇，
其中所述Exendin变体的氨基酸序列是选自下述的氨基酸序列：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：4)；
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Cys-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：3)；
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Cys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：5)；
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Cys-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：6)；
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys-Tyr(SEQ ID NO：7)；或
His-dAla-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：8)。
2.权利要求1的缀合物，其中所述一个或多个聚合物基团的分子量为23kDa至27kDa。
3.一种制备权利要求1至2中任一项所述缀合物的方法，其中包括使所述Exendin变体与所述聚合物相接触。
4.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1-2中任一项所述的缀合物，以及任选地药学上可接受的载体。
5.权利要求1-2中任一项的缀合物在制备用于降低血糖的药物中的用途。
6.权利要求5的用途，其中所述药物用于治疗糖尿病。
7.权利要求5的用途，其中所述药物用于治疗I型糖尿病和II型糖尿病。
8.权利要求5的用途，其中所述药物用于治疗II型糖尿病。
9.一种试剂盒，其包含权利要求1-2中任一项的缀合物，以及使用说明书。
10.权利要求1-2中任一项的缀合物在制备用于降低体重的药物中的用途。
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