CN102421796A - 新型Exendin变体及其缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型的Exendin变体以及其上缀合了聚合物的Exendin变体缀合物，含有它们的药物组合物以及它们在治疗疾病比如降低血糖、治疗糖尿病尤其是Ⅱ型糖尿病中的用途。本发明还提供了Exendin缀合物在降低体重中的用途。

Description

说 明 书 新型 EXENDIN变体及其缀合物
技术领域
本发明涉及新型的 Exendin变体及其与聚合物相缀合的缀合 物， 含有它们的药物组合物以及它们在降低血糖、 尤其是治疗糖 尿病特别是 II型糖尿病中的用途。 本发明还涉及 Exendin缀合物 在降低体重中的用途。
背景技术
随着经济社会的发展、 人口平均寿命的延长和生活方式的变 化， 糖尿病已经成为世界各国主要的卫生保健问题。 无论在发达 国家或是发展中国家， 糖尿病的发病率都在急剧上升。 2007年全 球约有 2.46亿糖尿病患者， 全球范围内每 10秒钟就有一个糖尿 病患者死亡， 预计到 2025年全世界糖尿病患者将达到 3.33亿。 我国已成为糖尿病发病的"重灾区"， 目前有糖尿病患者 4000万， 糖尿病的发病率约为 5%，是全球糖尿病第二大国（第一为印度）。 糖尿病患者分为两种， 一是胰岛素依赖型糖尿病 （ I型糖尿病） 和非胰岛素依赖型糖尿病（ II型糖尿病）。 其中， II型糖尿病占糖 尿病患者的 90%以上。 II型糖尿病特点是胰岛素分泌或作用失调 及 β-细胞功能障碍，致使脂肪、碳水化合物以及蛋白质代谢紊乱， 造成慢性血糖过高， 最终导致各种微血管、 大血管及各种脏器并 发症出现。 如今， 控制糖尿病的药物有 2类： 1 ) 促胰岛素分泌 类， 如磺酰脲类， 氯茴苯酸类， 二肽基肽酶抑制剂， GLP-1类似 物； 2 ) 非促胰岛素分泌药物， 如胰岛素， α-葡萄糖苷酶抑制剂， 双胍类， 噻唑烷二酮类， 胰岛素类似物等。 目前， 临床上使用较 多的传统糖尿病治疗药物对 II型糖尿病患者皆无能为力， 不能遏 制胰脏 β-细胞的不断进行性的恶化， 不能降低血液中糖化血红蛋 白 （HbAlc ) 水平， 也不能阻止糖尿病的并发症如心脏病、 肾衰 竭， 且都伴随着不同程度的毒副作用。 因此， 需要研究新的 II型 糖尿病治疗药物。
1985年发现了一种肠激素胰高血糖素样肽 -1 ( Glucagon-like peptide-1 , GLP-1 )， 其是进食后由胰高血糖素原基因表达， 主要 在肠道黏膜 L-细胞分泌的一种产物，它能刺激胰岛 β-细胞分泌胰 岛素 （ J Med Chem, 47， 4128-4134， 2004 )， 对稳定血糖水平有重 要作用。外源给予 GLP-1能使 II型糖尿病患者的血糖水平正常化 ( Diabetes Care, 15， 270-276, 1992; Lancet, 359, 824-830, 2002; Endoer. Rev, 16， 390-410, 1996; Diabetologia, 28， 565-573, 1985 )„ GLP-1具有下列功能： 以葡萄糖依赖方式作用于胰岛 β-细胞， 促 进胰岛素基因的转录， 增加胰岛素的生物合成和分泌； 刺激 β-细 胞的增殖和分化， 抑制 β-细胞凋亡从而增加胰岛 β-细胞数量； 抑 制胰高血糖素的分泌； 增加周边细胞胰岛素受体的敏感性； 降低 HbAlc; 抑制食欲及摄食； 延緩胃内容物排空（Diabetic Med, 18， 144-149, 2001; Diabetes, 51， 1443-1452, 2002; Diabetologia, 45， 1263-1273, 2002; Diabetes, 50， 525-529， 2001; Diabetes, 50， 725, 2001; Diabetes, 52， 365-371, 2003; Recent Prog. Hormne Res. 56, 377-399, 2001; Disbetologia, 39, 1546-1553, 1996; Am. J. Physicl Endocrinol. Metab, 281， E242-247, 2001; U.S. patent 477967, 478017， 478425; Diabetes Care, 22， 403-408, 1999; J. Clin. Endocrinology and Metabolism, 88， 3082-3089, 2003; Diabetes, 44 1295， 1995 )。 但 GLP-1在体内很容易被二肽基肽酶（ DPPlV )降 解， 半衰期不足 2分钟， 几乎不能成为有效的抗糖尿病药物。
Exendin-4 是在毒蜥（美国亚利桑那州和北墨西哥州内陆爬 行动物） 的唾液分泌物中发现的多肽 （ J. Biol. Chem, 265， 20259-20262， 1990; J. Biol. Chem, 267, 7402-7405, 1992 )， 与胰高 血糖素样肽 -1 ( GLP-1 ( 7-36 ) )具有高度同源性（53% )。 研究表 明， Exendin-4同样可以与 GLP-1受体结合，并在药理上表现出 与 GLP-1相类似的激动作用， 如： 增加胰岛素的合成及葡萄糖依 赖性促胰岛素分泌； 刺激 β细胞增生和再生， 抑制 β细胞凋亡从 而增加 β细胞的数量； 抑制胰高血糖素的分泌； 抑制肝糖生成， 但不会引起严重低血糖； 抑制餐后胃肠道动力及分泌功能； 降低 食欲， 减少食物的摄入； 对神经细胞具有保护作用（ Nat. Biotech, 23, 857-861, 2005; J. Biol. Chem., 266, 2897-2902, 1991; J. Biol. Chem., 266, 21432-21437, 1992; Diabetes, 44, 16-19, 1995; Nature, 379, 69-72, 1996 )。 Exendin-4促进胰岛素分泌和抑制餐后胰高血 糖素分泌的作用具有血糖依赖性，优于目前所用的磺脲类降糖药， 不易发生低血糖反应， 能够极大减少血糖监测次数， 并能减轻体 重。 由美国安米林（Amylin )和礼来（Eli Lilly )公司共同开发 的一天注射两次的 Exendin-4制剂（Exenatide, 商品名： Byetta ) 相继于 2005年和 2006年在美国和欧洲上市（ U.S. patent 5,424,286 6,858,576, 6,872,700, 6,902,744, 6,956,026, 7,297,761 )， 使得该类 药物得到全世界糖尿病及肥胖治疗领域的广泛应用。
由于多肽类药物普遍存在体内半衰期较短， 物理、 化学稳定 性较差， 易被体内各种蛋白酶降解等特性， 使得这些药物通常需 要在一天之内多次注射。 Exenatide作为一种皮下注射制剂， 需每 天两次使用， 给患者身体、 心理和经济带来较大的负担， 限制了 患者用药依从性。 因此， 对 Exendin-4进行结构改造及开发新的 剂型， 从而延长其血浆周期和增加其系统性药物暴露（systemic drug exposure )， 是当前抗糖尿病药物研究的热点。
聚合物修饰技术是上世纪 70 年代发展起来的一种强有力的 修饰技术， 其中尤以聚乙二醇化技术为代表。 该技术是将聚乙二 醇 （PEG)与蛋白质药物化学结合， 对蛋白质的表面进行修饰， 通 过 PEG的修饰，一方面增加了蛋白质的分子量， 降低了其在腎脏 的排泄速率； 另一方面，偶联的 PEG链在被修饰的蛋白质分子表 面产生空间位阻效应， 减低血液中蛋白水解酶对该蛋白的水解作 用， 从而有效地延长了其在循环系统内的滞留时间， 导致药物血 浆周期延长和系统性药物暴露增加并提高疗效。
目前聚乙二醇化技术已发展到第二代——定点聚乙二醇化技 术（site specific PEGylation )„ 定点聚乙二醇化技术可以特异地 修饰蛋白药物的某一特定氨基酸， 从而避免随机修饰的盲目性。 这样既较少影响蛋白质多肽活性中心结构， 又能选择性干扰某些 抗原位点， 从而减少非定点聚乙二醇化所带来的生物活性降低及 均一性不高等缺点。
科研人员对 Exendin-4 的聚合物修饰也已进行了一系列研 究。 杨和普里克特 ( CN1372570A )的研究证明了 Exendin-4主要 是通过腎清除来代谢， 因此他们利用分子量范围在 500至 20,000 道尔顿 （Dalton, Da ) 的聚乙二醇对 Exendin-4进行修饰。 包文 超、 徐宏景、 余刚、 左亚军 （ CN101125207A ) 则利用分子量范 围在 20 kDa至 50 kDa的聚乙二醇对 Exendin-4进行了氨基修饰。
但是， 现在已有的 Exendin-4或其变体以及各种修饰形式仍 有一些缺点， 包括在体内使用时给药频率较高， 给患者身体、 心 理和经济带来较大的负担， 限制了患者用药依从性， 无法广泛应 用。 因此， 仍然需要有新的 Exendin-4变体及其聚合物修饰形式。
发明内容
在一个方面中，本发明提供了一种具有 GLP-1受体激动剂活 性的 Exendin变体， 其与野生型 Exendin序列相比有一个或多个 氨基酸残基被半胱氨酸所取代。 任选地， 与野生型 Exendin序列 相比， 所述 Exendin变体中还具有一个或多个进一步的氨基酸缺 失、 添加和 /或替换， 其中所添加或替换的氨基酸残基可以是天然 或非天然氨基酸或者氨基酸类似物。
在一个实施方案中， 所述 Exendin变体具有与野生型
Exendin-4序列
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Gl u-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO: 1)或
Exendin-3序列
His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Gl u-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO: 2)或者它 们的相似序列相比有一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸置换以及 任选地其它氨基酸置换的氨基酸序列。 所述氨基酸置换各自独立 地位于野生型氨基酸序列的 N-端、 C-端和 /或内部。
在一个优选的实施方案中， 所述 Exendin变体至少在该变体 C端具有半胱氨酸置换。 还优选地， 所述 Exendin变体在 C端最 后一个氨基酸具有半胱氨酸置换。 此外， 所述 Exendin变体优选 至少在以下一个或多个位置具有半胱氨酸置换： 与 Exendin-4或 Exendin-3中第 20位 Arg (精氨酸）、 25位 Trp (色氨酸）、 35位 Ala (丙氨酸)和第 39位 Ser (丝氨酸）相对应的位置。
在另一个方面中， 本发明提供了一种 Exendin变体缀合物， 其在所述 Exendin变体中缀合了一个或多个天然或合成聚合物基 团， 优选生理可接受的聚合物基团， 例如聚亚烷基二醇基团， 更 具体地如聚乙二醇基团。 在含有多个聚合物基团的情形下， 所述 聚合物基团可以相同或不同。 优选地所述聚合物基团通过一个或 多个半胱氨酸残基缀合到所述 Exendin变体上。 在一个实施方案 中， 所述聚合物基团以硫醚键缀合到所述 Exendin变体上。
本领域技术人员已知的是， 在缀合了聚合物基团的生物活性 分子中， 随着缀合基团分子量 (如从 4 kDa起)的增加， 缀合生物 分子的生物活性将呈指数性逐渐降低（Bailon et al. Rational design of potent, long-lasting form of interferon: A 40 kDa branched polyethylene gly col-conjugated interferon a -2a for the treatment of hepatitis C. Bioconjugate Chem 2001; 12： 195 -202; Bowen et al. Relationship between molecular mass and duration of activity of polyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein. Experimental Hematology 1999; 27: 425-32； Bailon et al. PEG-modified biopharmaceuticals. Expert Opin Deliv. 2009; 6: 1-16)。 本领域技术人员还已知的是， 随着所述聚合物基团分子量的增加， 该缀合物分子的生物半衰期 和 /或血浆半衰期和系统性药物暴露逐渐延长或增加。
然而， 本发明出乎意料地发现， 在本发明的 Exendin变体缀 合物中， 即使所述聚合物基团的分子量增加到 30 kDa， 与非缀合 的 Exendin变体相比，该缀合物分子仍然保留了大部分 GLP-1受 体激动剂活性。 甚至在 PEG分子量增加到 40 kDa或更高时， 本 发明的 Exendin变体缀合物仍保留相当的 GLP-1 受体激动剂活 性。 尤为突出的是， 当所述聚合物基团的分子量从 5 kDa增加至 27 kDa时， 与非缀合的 Exendin变体相比， 所述 Exendin变体缀 合物的 GLP-1受体激动剂活性基本不变。
因此， 在一个优选的实施方案中， 本发明提供了具有延长的 生物半衰期和 /或血浆半衰期和显著的 GLP-1 受体激动剂活性的 Exendin变体缀合物。
在一个实施方案中， 所述聚合物是聚亚烷基二醇， 包括例如 聚乙二醇、 聚丙二醇等。 所述一个或多个聚合物基团可以具有任 意合适的分子量， 例如其分子量可以为 2 kDa至 50 kDa， 优选 5 kDa至 30 kDa,还优选 20 kDa至 30 kDa,例如 21 kDa, 22 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 27 kDa, 28 kDa、 29 kDa和 30 kDa以及上述分子量值之间的任意值。
任选地， 所述 Exendin变体缀合物还可在一个或多个其它氨 基酸残基位置处缀合一个或多个相同或不同的上述聚合物。 所述 一个或多个其它氨基酸残基位置可以各自位于 Exendin变体的 N- 端、 C-端和 /或任意中间位置。
在本发明中， 所缀合的聚合物可以是任何合适的构型， 包括 例如单臂、 双臂、 多臂和 /或分叉的， 其中各臂或分叉可以相同或 不同。
本发明还提供了一种制备上述 Exendin变体缀合物的方法， 其包括使所述 Exendin变体与所述聚合物相接触， 优选地其中所 述聚合物带有活化基团或者在接触时进行活化， 以将所述活化聚 合物连接到该 Exendin变体的一个或多个半胱氨酸残基上。 在一 个实施方案中， 通过选择特异性活化基团及适当的 pH值， 利用 不同的聚合链长度和聚合结构的聚乙二醇（ PEG )分别对 Exendin 变体的半胱氨酸进行特异性化学修饰。 在一个具体实施方案中， 该特异性活化基团为马来酰亚胺。
本发明另外提供了一种药物组合物， 其包含有本发明的 Exendin变体和 /或 Exendin变体缀合物， 以及任选地药学可接受 的载体。
本发明又提供了一种治疗疾病的方法， 其包括给有此需要的 对象施用治疗有效量的本发明的 Exendin变体和 /或 Exendin变体 缀合物和 /或药物组合物。相应地，本发明还提供本发明的 Exendin 变体和 /或 Exendin 变体缀合物和 /或药物组合物在制备用于治疗 疾病的药物中的用途。所述疾病可以选自例如餐后倾倒性综合征、 餐后高血糖症、 葡萄糖耐受不良、可以通过抑制胰高血糖素分泌、 调节甘油三酯水平、 减少进食量而緩解的病症或疾病、 肥胖症、 进食障碍、 胰岛素抵抗综合征、 糖尿病、 高血糖症和低血糖症。 优选地，所述疾病是糖尿病，更优选是 I型糖尿病或 II型糖尿病， 特别是 II型糖尿病。
众所周知， Exendin 可以降低肥胖病人体重并可引起恶心和 呕吐反应， 其作用机制与抑制中枢神经系统中摄食中枢和激动呕 吐中粗有关 ( Larsen. Mechanisms behind GLP-1 induced weight loss. Br J Diabetes Vase Dis 2008; 8: S34— S41; Schick et al. Glucagonlike peptide 1 (7-36)-amide acts at lateral and medial hypothalamic sites to suppress feeding in rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2003; 284:R1427-35 )， 而 Exendin或 其变体的缀合物由于分子量加大， 难以透过血脑屏障， 故可减少 Exendin 所引发的呕吐反应。 因此在本研究开始之前， 发明人预 期 Exendin或其变体的缀合物也会减少 Exendin由中枢神经系统 介导的减少摄食量和降低体重的作用。然而，尽管野生型 Exendin 和未缀合的 Exendin变体均降低体重和摄食量， 但本发明出乎意 料地发现， Exendin 或其变体的缀合物却具有显著增强的降低体 重和摄食量的作用。
因此， 在另一方面中， 本发明提供了使用 Exendin或其变体 的缀合物和 /或包含这种缀合物的药物组合物来降低体重的方法， 此外还提供了 Exendin 或其变体的缀合物和 /或包含这种缀合物 的药物组合物在制备用于降低体重的药物中的用途。 在一个实施 方案中，所述 Exendin或其变体的缀合物是上述本发明的 Exendin 变体缀合物。 附图说明
图 1图示了实施例 1所得 PB-105的质谱图。
图 2图示了 PEG的一种分子结构。
图 3 图示了经 HPLC 分析实施例 2 所得 PB-110
(PEG5000-PB-105)的纯度分析结果。
图 4图示了 PEG5000b的分子结构。
图 5图示了 PEG5000C的分子结构。
图 6图示了 PB-105聚乙二醇化缀合物的（A )碘染色图像和 ( B )考马斯亮蓝染色图像， 其中各泳道代表如下： 1. 分子量标 准， 2· PB-106 (PEG20000-PB-105), 3. PB-107 (PEG30000-PB-105), 4. PB-108 (PEG40000-PB-105) ， 和 5. PB-109 (PEG20000*2-PB-105)。
图 7 图示了经 HPLC 分析实施例 3 所得 PB-106 (PEG20000-PB-105)的纯度分析结果。
图 8图示了 PEG20000b的分子结构。
图 9图示了 PEG20000C的分子结构。
图 10图示了 PEG20000d的分子结构。
图 11图示了 PEG20000e的分子结构。
图 12 图示了经 HPLC 分析实施例 3 所得 PB-112
(PEG20000-PB-111)的纯度分析结果。
图 13 图示了经 HPLC 分析实施例 4 所得 PB-107 (PEG30000-PB-105)的纯度分析结果。
图 14 图示了经 HPLC 分析实施例 5 所得 PB-108 (PEG40000-PB-105)的纯度分析结果。
图 15 图示了经 HPLC 分析实施例 5 所得 PB-114 (PEG40000-PB-113)的纯度分析结果。 图 16图示了 PEG20000X2的分子结构。
图 17 图示了经 HPLC 分析实施例 6 所得 PB-109 (PEG20000*2- PB-105)的纯度分析结果。
图 18图示了 PEG20000x2b的分子结构。
图 19图示了 PEG20000x2c的分子结构。
图 20图示了 PEG20000x2d的分子结构。
图 21 图示了经 HPLC 分析实施例 7 所得 PB-119 (PEG23000-PB-105)的纯度分析结果。
图 22 图示了经 HPLC 分析实施例 8 所得 PB-120 (PEG27000-PB-105)的纯度分析结果。
图 23A图示了 PB-106 (PEG20000-PB-105)在 ρΗ4·5和 -20。C保 存 60天后的 HPLC分析结果。
图 23B图示了 PB-106 (PEG20000-PB-105)在 ρΗ7·0和 4。C保 存 60天后的 HPLC分析结果。
图 23C图示了 PB-106 (PEG20000-PB-105)在 ρΗ7·0和 -20。C保 存 60天后的 HPLC分析结果。
图 24图示了 PB-101和 PB-105对 PC12细胞内 cAMP作用 的量效关系.
图 25图示了 PB-105及其聚乙二醇化缀合物在体外对细胞内 cAMP活，1 的作用。
图 26A图示了聚乙二醇化缀合物中聚乙二醇的分子量与体外 药物活性（LogEC5。） 的相关性。
图 26B图示了聚乙二醇化缀合物中聚乙二醇的分子量与药物 最大活性（Emax ) 的相关性。
图 27图示了 PB-105及其聚乙二醇化缀合物在体外对细胞内 cAMP活，1 的作用。
图 28图示了 PB-101和 PB-105的降血糖作用时效关系。
图 29图示了 PB-101和 PB-105降血糖作用量效关系。 图 30图示了 PB-101及其变体 PB-102的降血糖作用量效关 系。
图 31图示了 PB-105及其聚乙二醇化缀合物的等量降血糖作 用时效关系。
图 32A图示了聚乙二醇化 Exendin变体中聚乙二醇的分子量 与生物半衰期 （T1/2 ) 的相关性。
图 32Β图示了聚乙二醇化 Exendin变体中聚乙二醇的分子量 与最大降糖作用 （％给药前血糖浓度） 的相关性。
图 32C图示了聚乙二醇化 Exendin变体中聚乙二醇的分子量 与降糖作用曲线上面积（Area Above Curve, AAC ) 的相关性。
图 33 图示了 PB-105及其聚乙二醇化（PEG30000 ) 缀合物 PB-107的等效量降血糖作用时效关系。
图 34 图示了 PB-105及其聚乙二醇化（PEG20000 ) 缀合物 PB-106降血糖作用量效关系。
图 35图示了 PB-105、 PB-111及其聚乙二醇化缀合物等量降 血糖作用时效关系。 实验数据以平均值土 SEM表示。
图 36图示了 PB-101及其变体 PB-105、 PB-111和 PB-113以 及聚乙二醇化缀合物 PB-106、 PB-112和 PB-114降血糖作用时效 关系。 实验数据以平均值土 SEM表示。
图 37图示了 PB-105及其聚乙二醇化缀合物等量降血糖作用 时效关系。 实验数据以平均值土 SEM表示。 *代表与 PB-105组比 较差异有显著性（ p < 0.05 )。
图 38图示了 PB-101、 PB-105, PB-106和 PB-120对鸽子呕 吐潜伏期（ A )和呕吐次数（ B )的影响。实验数据以平均值 ± SEM 表示。 a代表在 3 mg/kg剂量时与 PB-105组比较， 差异存在统计 学显著性（ p < 0.05 ); b代表在 6 mg/kg剂量时与 PB-101和 PB-105 组比较差异均有统计学显著性（p < 0.05 )。
图 39图示了 PB-101、 PB-105和 PB-106对豚鼠全身免疫过 敏反应的影响。 实验数据以平均值土 SEM表示。 a代表与生理盐 水组比较差异有统计学显著性（p < 0.05 ); b代表与 PB-101或 PB-105组比较差异有统计学显著性（ p < 0.05 )。
图 40 图示了 PB-101、 PB-105和 PB-106给药后 （A ) 0-18 天和（ B )0-4天对豚鼠体重增长的影响。实验数据以平均值 ± SEM 表示。 a代表与生理盐水组比较差异有统计学显著性（p < 0.05 ); b代表与 Exenatide或 PB-105组比较差异有统计学显著性 ( < 0.05 )„
图 41图示了 PB-105、 PB-106, PB-119和 PB-120给药后对 ( A )大鼠体重和（C )摄食量的影响。 B和 D分别为给药后相应 各组大鼠体重-时间曲线下面积图和摄食量-时间曲线下面积图。 实验数据以平均值土 SEM表示。 a代表与生理盐水组比较差异有 统计学显著性（ p < 0.05 )； b代表与 PB-105组比较差异有统计学 显著性 ( < 0.05 )。
图 42图示了单次静脉注射 Exenatide和 PB-105药-时曲线。 图 43图示了单次静脉注射 PB-105及其聚乙二醇化 Exendin 缀合物药-时曲线。
图 44A图示了聚乙二醇化 Exendin变体缀合物中聚乙二醇的 分子量与血浆半衰期关系。
图 44B图示了聚乙二醇化 Exendin变体缀合物中聚乙二醇的 分子量与药-时曲线下面积 （AUC ) 关系。
具体实施方式
定义
本文中使用的术语 "氨基酸，，包括天然氨基酸、非天然氨基酸、 和氨基酸类似物以及所有它们的 D和 L立体异构体。非天然氨基 酸包括但不限于氮杂环丁烷羧酸、 2-氨基己二酸、 3-氨基己二酸、 β-丙氨酸、 氨基丙酸、 2-氨基丁酸、 4-氨基丁酸、 6-氨基已酸、 2- 氨基庚酸、 2-氨基异丁酸、 3-氨基异丁酸、 2-氨基庚二酸、 叔丁基 甘氨酸、 2， 4-二氨基异丁酸、 2， 2，-二氨基庚二酸、 2， 3-二氨基 丙酸、 N-乙基甘氨酸、 N-乙基天冬酰胺、 高脯氨酸、 羟赖氨酸、 别 -羟赖氨酸、 3-羟脯氨酸、 4-羟脯氨酸、 异锁链赖氨素、 别 -异亮 氨酸、 N-甲基雨氨酸、 N-甲基甘氨酸、 N-甲基异亮氨酸、 N-甲基 戊基甘氨酸、 N-甲基纈氨酸、 萘丙氨酸、 正缬氨酸、 正亮氨酸、 鸟氨酸、 戊基甘氨酸、 2-哌啶酸和硫代脯氨酸。 氨基酸类似物包 括在其 C-末端羧基、 N末端氨基或其侧链基团可逆或不可逆地化 学封闭的、 或被化学修饰成另一官能团的天然氨基酸和非天然氨 基酸， 例如甲硫氨酸亚砜、 甲硫氨酸砜、 S- (羧甲基) -半胱氨酸、 S- (羧甲基) -半胱氨酸亚砜和 S- (羧甲基) -半胱氨酸砜。
本文中使用的术语"多肽，，或"蛋白，，可互换地指通过共价键 (例如肽键）相互连接的一串至少两个氨基酸残基， 可以是重组 多肽、 天然多肽或合成多肽。
本文中使用的术语"半胱氨酸置换 "是指通过例如基因工程或 人工化学合成的手段， 用半胱氨酸残基代替天然多肽 （例如 Exendin-4 ) 中的一个或多个其它氨基酸残基。
本文中使用的术语"多肽变体"、 "变体 "或"类似物 "是指通过 一个或多个取代、 缺失、 插入、 融合、 截短或其任意组合在氨基 酸序列上有所不同的多肽。 变体多肽可以是完全功能性的或者可 缺乏一种或多种活性的功能。 完全功能性变体可含有例如仅仅保 守性改变或非关键残基或非关键区域的改变。 功能性变体还可包 含相似氨基酸的替换， 其导致功能未改变或不显著的改变。 可以 通过本领域已知的方法鉴定对于功能来说重要的氨基酸， 所述方 法例如定点 i秀变或甘氨酸扫描 i秀变 （Cunningham, Β·和 Wells, J., Science, 244: 1081-1085， 1989 )。 可以例如通过结构分析如 结晶、 核磁共振或光亲和标记来确定对于多肽活性来说关键的位 点 ( Smith, L等， J.Mol.Biol., 224: 899-904, 1992； de Vos, A. 等， Science, 255: 306-312, 1992 )。 术语"巯基变体，，是指通过取 代、 插入、 融合或其任意组合而在氨基酸序列上带有巯基的多肽 变体。
本文中使用的术语"缀合物 "是指多肽或多肽变体与本文所述 的修饰基团共价或非共价连接后形成的产物， 所述修饰基团包括 但不限于上文所述的例子。
本文中使用的术语"经修饰多肽，，或"经修饰多肽变体"是指其 中一个或多个氨基酸被化学修饰的多肽或多肽变体， 其中所述修 饰是指不同类型基团的共价或非共价修饰， 其包括但不限于： 磷 酸化、 糖基化、 甲基化、 PEG化、 生物素化、 SUMO化、 酰基化 等等。
本文中使用的术语"烷基，，表示取代或未取代的直链或支链烷 基， 例如 C1-C30烷基、 C1-C20烷基、 C2-C15烷基或 C3-C10 烷基， 其中任选地可具有一个或多个独立地选自例如下述的取代 基： 卤素、 氨基、 硝基等。
本文中使用的术语 "环烷基"表示取代或未取代的 C3-C8环烷 基，其中任选地可具有一个或多个独立地选自例如下述的取代基： C1-C10烷基、 C2-C10烯基、 C2-C10炔基、 卤素、氨基、硝基等。
本文中使用的术语"烯基"表示其中具有一个或多个碳碳双键 的取代或未取代的直链或支链烯基，其中可具有例如 2 - 20个、 3 - 15个、 4 - 10个碳原子， 并且任选地具有一个或多个独立地选 自例如下述的取代基： 卤素、 氨基、 硝基等。
本文中使用的术语"芳基，，表示 C6-C10芳基， 其任选地被一 个或多个独立地选自例如下述的取代基所取代： C1-C10 烷基、 C2-C10烯基、 C2-C10炔基、 卤素、 氨基、 硝基等。
本文中使用的术语"连接基 "表示有机基团， 其将 PEG 与 Exendin相连接。 在本发明中， 连接基可以是烷基、 醚基、 酰胺、 酯基、 硫基等， 其中可以包含例如多达 30个碳原子， 如 1 - 25、 2 - 20, 3 - 15或 3 - 10个碳原子。
一般地， 本文中使用的术语"聚乙二醇，，具有本领域普通技术 人员通常理解的含义， 既包括聚乙二醇本身， 也包括其末端修饰 的衍生物， 除非另有明确说明。
此外， 对于聚合物如聚乙二醇来说， 有多种方法测定其分子 量。 由于聚合物是由一定分布范围内的不同聚合度的分子构成， 一般用平均分子量来表示聚合物的分子量， 具体来说可以是数均 分子量或重均分子量。 尽管在聚合物的聚合度差异较大时， 数均 分子量和重均分子量可能有一些偏差， 但是对于分布范围较窄的 聚合物来说，二者趋于相等。对于本文提及的聚合物如聚乙二醇， 在提及其分子量时， 既可以是重均分子量，也可以是数均分子量。
Exendin变体
本发明一方面涉及一种具有 GLP-1 受体激动剂活性的 Exendin变体， 其具有与 Exendin野生型序列或者其相似序列相 比有一个或多个， 如 1、 2、 3、 4、 5或更多个氨基酸残基被半胱 氨酸所置换的氨基酸序列。 所述半胱氨酸置换可以各自独立地位 于所述 Exendin变体序列的 N-端、 C-端或内部。在一些实施方案 中， 所述 Exendin变体至少在其 C端的 1、 2、 3或 4个氨基酸残 基处具有半胱氨酸置换。 优选地， 所述 Exendin变体 C端最后一 个氨基酸被半胱氨酸置换。 在又一些实施方案中， 所述 Exendin 变体在其 C端、 N端和 /或内部的 1、 2、 3、 4个或更多个氨基酸 残基处具有半胱氨酸置换。
本发明中所述的 Exendin野生型序列或者相似序列可以是本 领域中已知的任何序列，包括其各种变体或类似物或激动剂序列。 有关 Exendin的教导可参见例如 Eng J.等人， J. Biol. Chem., 265: 20259-62， 1990; Eng J.等人， J. Biol. Chem., 267: 7402-05, 1992; WO00/66629和 WO00/41546等， 其全部内容均援引并入本文之 中。
本发明的 Exendin变体还可任选地具有一个或更多个， 例如 1、 2、 3、 4、 5 个或更多个进一步的氨基酸修饰， 包括例如氨基 酸取代、 缺失、 插入和 /或添加。 同样的， 所述进一步的氨基酸修 饰可以各自独立地位于 Exendin序列的 N-端、 C-端和 /或内部。 取代、 插入和 /或添加的氨基酸可以是任何天然氨基酸、 非天然氨 基酸或氨基酸类似物， 或者它们的 D或 L立体异构体。 在一些实 施方案中， 所述进一步的氨基酸修饰是保守性氨基酸取代， 例如 Ala/Gly, Ser/Thr, Glu/Asp, Gln/Asn, Ala/Val/Ile/Leu, Arg/Lys, Phe/Tyr 等之间的互相取代。 有关保守性氨基酸取代， 现有技术 中有众多的教导， 例如可参阅 WO/2006/083301等， 其全部内容 通过援引并入本文之中。
在本发明中， 所述野生型 Exendin可以是 Exendin-3或
Exendin-4。因此，在一些实施方案中，本发明涉及这样的 Exendin 变体， 其具有与氨基酸序列
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Gl u-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser ( SEQ ID NO: 1； Exendin-4 )或
His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Gl u-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser ( SEQ ID NO: 2； Exendin-3 )或者其相似序列相比有一个或多个， 例如 1、 2、 3、 4、 5或更多个氨基酸残基被半胱氨酸置换的氨基酸序列。优选地， 所述 Exendin变体中至少在选自下列的一个或多个位置具有半胱 氨酸置换：与 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 2中第 20位 Arg (精 氨酸）、 25位 Trp (色氨酸）、 35位 Ala (丙氨酸)和 39位 Ser (丝 氨酸）相对应的位置。
在一个优选的实施方案中， 所述 Exendin变体具有选自下述 的氨基酸序列：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Gl u-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys ( SEQ ID NO: 3 );
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Gl u-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Cys-Pro-Pro-Pro-Ser ( SEQ ID NO: 4 )；
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Me t-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-G ly- Cys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser ( SEQ ID NO: 5 )；
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Me t-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Cys-Leu-Lys-Asn-G ly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser ( SEQ ID NO: 6 )； His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Gl u-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys-Tyr ( SEQ ID NO: 7 ); 或
His-dAla-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-G lu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys ( SEQ ID NO: 8 )„ 如上文所述， 在本发明的 Exendin变体中， 还可以任选地含 有一个或更多个、 例如 1、 2、 3、 4、 5个或更多个进一步的氨基 酸修饰， 例如氨基酸残基的取代、 缺失、 插入和 /或添加。 所述进 一步的氨基酸修饰可以各自独立地位于 Exendin序列的 N-端、 C- 端和 /或内部。 取代、 插入和 /或添加的氨基酸可以是任何天然氨 基酸、 非天然氨基酸或氨基酸类似物， 或者它们的 D或 L立体异 构体。 在一些实施方案中， 所述进一步的氨基酸修饰是保守性氨 基酸取代， 例如 Ala/Gly、 Ser/Thr、 Glu/Asp、 Gln/Asn、 Ala/Val/Ile/Leu, Arg/Lys, Phe/Tyr等之间的互相取代。
本发明的 Exendin 变体可以通过本领域公知的多种方式得 到， 包括例如重组制备方法、 化学合成法等。
在一个实施方案中， 本发明的 Exendin变体通过固相肽合成 技术化学合成， 然后在实验室规模纯化， 例如通过在反相 HPLC 柱上进行单一纯化步骤或者通过其它合适的层析方法。
在另一个实施方案中， 本发明的 Exendin变体通过重组方法 产生， 包括例如在合适的原核或真核宿主细胞中进行表达， 然后 通过常规技术从中分离出本发明的 Exendin变体。 例如， 可以首 先通过化学合成法合成编码所述肽的核苷酸序列， 随后将所述序 列克隆到合适的表达载体中在合适的启动子控制下进行表达。 或 者， 还可以采用诱变法如 PCR诱变法从野生型 Exendin获得编 码 Exendin变体的核苷酸序列、 并且随后将所述序列克隆到合适 的表达载体中在合适的启动子控制下进行表达。 这些技术完全在 本领域普通技术人员的能力范围之内， 并且在现有技术中有众多 的教导。 合适的真核宿主细胞有哺乳动物细胞， 例如 CHO、 COS, HEK 293、 BHK、 SK-Hep和 HepG2。 所述细胞优选地生长于适 合表达本发明 Exendin变体的条件下。 至于用于生产或分离本发 明的 Exendin变体的试剂和条件， 则没有任何特别的限制， 本领 域已知的或商业上可得到的任何体系均可应用。 在一个优选的实 施方案中， 所述 Exendin变体通过本领域中已描述的方法获得。
有多种表达载体可用于制备 Exendin和 /或其变体，其可选自 真核和原核表达载体。 原核表达载体可包括例如质粒如 pRSET、 pET和 pBAD等，其中可采用的启动子有例如 lac、 trc、 trp、 recA 或 araBAD等。 真核表达载体包括有： （i) 用于在酵母中表达的 载体如 pAO， pPIC, YES, MET, 其中可使用诸如 AOX1， GAP, GAL1， AUG1等的启动子； (ii) 用于在昆虫细胞中表达的载体如 MT, pAc[delta], lB, MIB, pBAC等，其中可使用诸如 PH， lO, MT，Ac5，OplE2，gp64，polh 的启动子； 和 (iii) 用于在哺乳动物 ，
逆转录病毒等， 其中可使用诸如 CMV, SV40, EF-1 ， UbC, RSV, ADV，BPV和 β肌动蛋白等的启动子。在一个优选的实施方案中， 所述 Exendin变体在原核或真核细胞体系中进行表达， 并且使用 经过密码子优化的编码序列。 在一个优选的实施方案中， 表达所 述 Exendin 变体的序列包含前导肽和 /或信号肽， 以利于所述 Exendin 变体从细胞中分泌到细胞外， 从而进行分离纯化。 在另 一个优选的实施方案中， 表达所述 Exendin变体的序列不包含前 导肽和 /或信号肽， 其不分泌到细胞外， 通过裂解细胞对其进行分 离纯化。
Exendin变体缀合物
本发明的 Exendin 变体可以与一个或多个聚合物基团相缀 合， 形成 Exendin变体缀合物。 本文所用的"聚合物 "优选是生理 可接受的， 其包括在水溶液或悬液中可溶、 并且以药学有效量施 用该聚合物 -Exendin缀合物后对哺乳动物没有负面影响如副作用 的聚合物。 可在本发明中使用的聚合物没有特别的限制。 所述聚 合物通常优选具有 2到约 3000个重复单元。该聚合物基团可以选 自天然或合成聚合物， 其实例包括、 但不限于例如多糖、 聚亚烷 基二醇，如聚乙二醇（ PEG )、聚丙二醇 (PPG)、聚氧化乙烯（ PEO )、 乙二醇与丙二醇的共聚物、 聚乙烯醇等或者其任何组合。 在一个 优选实施方案中， 本发明 Exendin变体缀合物中使用一个或多个 PEG基团进行缀合修饰。
在本发明中， 所述聚合物并不限于特别的结构， 其可以是线 性的 （如烷氧基 PEG 或双功能 PEG )、 分支或多臂的 （如分叉 PEG或连接到多元醇核心的 PEG )、 树枝状的或者可以具有可降 解的连键。 此外， 聚合物的内部结构可以以任意数目的不同模式 组织， 其可选自均聚物、 交替共聚物、 无规共聚物、 嵌段共聚物、 交替三聚物、 无规三聚物和嵌段三聚物等。 所述聚合物还可包括 聚（环氧烷）聚合物、 聚马来酸、 聚（D，L -丙氨酸）等。
在一些实施方案中， 所述聚合物是聚乙二醇（PEG )或其衍 生物例如甲氧基聚乙二醇（mPEG )。 在本文中， 如果没有特别指 明， 所述聚乙二醇（PEG ) 既包括末端基团为羟基也包括末端为 其它基团的类型。所述其它基团包括但不限于烷氧基、环烷氧基、 环烷基氧基、 烯基、 芳氧基或芳烷基氧基。 这些 PEG分子类型都 是现有技术中已知的， 并且在多肽修饰中常规使用。 PEG侧链可 以是线性的、 分枝的、 分叉的或者由多个臂组成， 不同的聚乙二 醇可以具有不同的聚合链长度和聚合结构。
本发明中对于所用 PEG的分子量没有特别的限制，其分子量 范围可以是 0.1至 200 kDa, 例如 1至 150 kDa、 2至 100 kDa、 3 至 80 kDa或 4至 50 kDa， 还可以是 5至 40 kDa。 一种特别有用 的 PEG具有 5至 30 kDa范围的分子量。 另一些有用的 PEG分 子包括例如 WO 03/040211、 US 6,566,506, US 6,864,350和 US 6,455,639 中公开的那些。 特别地， 所述 PEG 具有通式 HO-CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-OH， 其中 n的范围是约 5 至 4000。如上所述，本发明的 PEG包括带其它末端基团的 PEG, 例如甲氧基 PEG, 分支 PEG、 分叉 PEG等。 合适的分支 PEG 可按照美国专利 No. 5，932，462中所述进行制备， 该专利的全部公 开内容通过参考并入本文。所述分叉 PEG是指在靠近聚合物链一 端的地方具有分支的 PEG, 分叉 PEG的主链可以是直链或支链 的。
本领域技术人员已知的是， 在缀合了聚合物基团的生物活性 分子中， 随着所述聚合物基团分子量的增加， 该缀合物分子的生 物活性逐渐降低 (Bailon et al. Rational design of potent, long-lasting form of interferon: A 40 kDa branched polyethylene glycol-conj ugated interferon a -2a for the treatment of hepatitis C. Bioconjugate Chem 2001 ； 12 ： 195 -202; Bowen et al. Relationship between molecular mass and duration of activity of polyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein. Experimental Hematology 1999; 27: 425 -32; Bailon et al. PEG-modified biopharmaceuticals. Expert Opin Deliv. 2009; 6: 1-16)。本领域技术人员还已知的是， 随^ "所述聚合 物基团分子量的增加，该缀合物分子的生物半衰期和 /或血浆半衰 期逐渐延长。
然而， 本发明出乎意料地发现， 在本发明的 Exendin变体缀 合物中，即使所述聚合物基团（如 PEG )的分子量增加到 30 kDa, 与非缀合的 Exendin变体相比， 该缀合物分子仍然保留了大部分 GLP-1受体激动剂活性（如体内活性）。 甚至在 PEG分子量增加 到 40 kDa或更高时，本发明的 Exendin变体缀合物仍保留相当的 GLP-1 受体激动剂活性（如体内活性）。 尤为突出的是， 当所述 聚合物基团的分子量从 5 kDa 增加至 27 kDa 时， 与非缀合的 Exendin变体相比， 所述 Exendin变体缀合物的 GLP-1受体激动 剂活性基本不变。
为了在长时间内提供稳定的治疗作用， 另外为了减少给药频 率， 以提高患者依从性， 在保留显著的 GLP-1受体激动剂活性的 同时， 希望尽可能延长所述 Exendin变体缀合物的生物半衰期。 因此， 在一个实施方案中， 本发明提供了具有延长的生物半衰期 和显著的 GLP-1受体激动剂活性的 Exendin变体缀合物。 在一个具体实施方案中，在本发明的 Exendin变体缀合物中， 所述一个或多个聚合物基团 （如 PEG ) 的分子量为 2 kDa至 50 kDa, 优选 3 kDa至 40 kDa, 更优选 4 kDa至 35 kDa, 还优选 5 kDa J. 30 kDa, 例如 5 kDa、 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa 和 40 kDa以及上述各分子量值之间的任意值。需要指出的是， 当 描述一种 Exendin变体缀合物中缀合聚合物基团的分子量时， 如 果该缀合物中有多个缀合聚合物基团， 计算的是该缀合物中所有 缀合聚合物基团的分子量总和， 除非另外指明。
在一个优选实施方案中，对于本发明的 Exendin变体缀合物， 其中所述一个或多个聚合物基团 （如 PEG ) 的分子量为 20 kDa 至 30 kDa, 优选 21 kDa至 29 kDa, 更优选 23 kDa至 27 kDa, 例如 20 kDa, 21 kDa, 22 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 27 kDa, 28 kDa, 29 kDa, 30 kDa以及上述各分子量值之间的任 意值。
用于本发明中的聚合物是现有技术中已知的， 其可通过多种 途径得到， 包括例如通过商业途径获得， 如 CarboMer，Inc.， J.T. Baker, The Dow Chemical Company等等， 或者根据本领域中已 知的方法自行制备， 例如 EP1245608中所述的。 本发明并不局限 于通过任何具体方法制得的聚合物。
在本发明的缀合物中， 所述至少一个聚合物可以通过 Exendin上的氨基、 羧基、 羟基和 /或巯基等与 Exendin相偶联。 这样的基团通常位于氨基酸残基如赖氨酸、 天冬氨酸、 谷氨酸、 半胱氨酸等的 α-氨基、 α-羧基和侧链上。
在一些实施方案中， 有一个或更多个聚合物分子通过 Exendin变体中半胱氨酸的巯基与 Exendin变体相偶联。 对蛋白 质中半胱氨酸残基的巯基进行聚合物如聚乙二醇修饰， 可以提高 修饰的选择性， 因为与巯基特异性反应的试剂有很多， 而且蛋白 质中有用的巯基要比例如赖氨酸残基的自由氨基少得多。
因此， 在一个优选实施方案中， 所述一个或多个聚合物基团 可以缀合在 Exendin变体的半胱氨酸残基上， 更优选地以硫醚键 缀合到 Exendin变体的半胱氨酸残基上。 优选地，所述 Exendin变体在与野生型 exendin-3或 exendin-4 中第 20位、 25位、 35位和 /或第 39位相对应的位置具有一个或 多个半胱氨酸置换，并且通过其巯基与聚合物如聚乙二醇相偶联。 更优选地， 所述 Exendin变体在与野生型 exendin-3或 exendin-4 中第 35位和 /或第 39位相对应的位置具有半胱氨酸置换。最优选 地， 所述 Exendin变体在与野生型 exendin-3或 exendin-4中第 39位相对应的位置具有半胱氨酸置换。
在一个具体实施方案中， 所述聚合物基团以硫醚键缀合到本 发明 Exendin变体的半胱氨酸残基上。 例如， 对于带有马来酰亚 胺活化基团的聚乙二醇分子， 可以在马来酰亚胺的烯基与半胱氨 酸的巯基之间形成硫醚键， 从而将一个或更多个聚乙二醇基团缀 合到本发明 Exendin变体的半胱氨酸残基上。 在另一些实施方案 中， 半胱氨酸残基的 PEG化也可通过使用例如 PEG -乙烯砜、 PEG -碘代乙酰胺或 PEG -连硫基正吡啶进行。现有技术中已知 有多种将聚合物基团如 PEG缀合到多肽上的方法，这些都可以在 本发明中使用。
在本文中， "PEG 化 Exendin"、 "PEG 修饰 Exendin，，或 "Exendin变体 - PEG缀合物"包括与一个或多个 PEG相缀合的 Exendin变体。 如本文中所用的， "PEG化，，或" PEG修饰"包括将 一个或多个 PEG基团与 Exendin相缀合。 合适的 PEG化方法公 开在例如 US 5,122,614和 US5, 539,063中， 其中公开的所有 PEG 化方法均通过引用而全文并入本文之中。 在一些实施方案中， 所述缀合物具有如下式（I ) 的结构：
RPEG— X— CH— Z— Exendin
Y ( I )
其中， Exendin 代表本发明的 Exendin 变体， Y 为 H 或 RPEG_X一， 并且每个 X 和 Z 各自独立为连接基， PEG 表示
-(OCH2CH2)n-， n为正整数， R表示 PEG的末端基团， 优选地每 个 R各自独立地选自氢、 烷基、 环烷基、 环烷基烷基、 烯基、 芳 基或芳烷基。 在一些具体实施方案中， 所述烷基可以是 C1-C6烷基， 优选 是 C1-C4烷基， 例如甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 异 丁基和叔丁基； 所述环烷基可以是 C3-C7环烷基， 例如环丙基、 环丁基、 环戊基、 环己基和环庚基； 所述环烷基烷基可以是环烷 基 C1-C4烷基， 例如环烷基甲基和环烷基乙基， 包括环己基甲基 和环己基乙基等； 所述芳基可以是苯基、 甲基苯基和萘基等； 所 述芳烷基可以是苯甲基、 苯乙基以及萘甲基和萘乙基等。 现有技 术中已知带有多种末端基团的 PEG分子，根据需要可以适当选择 这些以及其它的 PEG分子。并且还可以根据需要按照现有技术已 知的方法来合成带有所需末端基团的 PEG分子。
在一些实施方案中， 式 （I ) 中所述的每个" RPEG ""独立地具 有如下结构：
CH3(CH2)k— (OCH2CH2)n - (CH3)2CH— (OCH2CH2)n -
其中： k和 n都是整数， k = 0、 1、 2、 3、 4、 5或 6; n = 40、 41 45、 46、 47、 48 1200„ 在另一些优选实施方案中， 式（I ) 中所述的每个" RPEG ""独 立地具有如下结构：
CH3(CH2)k— (OCH2CH2)n ~ (CH3)2CH— (OCH2CH2)n ~ ■(OCH2CH2)- -CH2— (OCH2CH2)n - 其中： k和 n都是整数， k = 0、 1、 2或 3; n = 40、 41
45、 46、 47、 48 1200。 在一些实施方案中， 式（I ) 中所述的每个 "一 X一，，独立地具 有如下结构：
0
II
— 0— (CH2)p— C-NH— (CH2)m ~ 或 一 0— (CH2)m ~， 其中： p和 m都是整数， p = 0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11或 12; m = 0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11或 12。 在另一些实施方案中， 式（I ) 中所述的每个 "一 X一"独立地 具有如下结构：
0
— 0— (CH2)P— C-NH— (CH2)n — O— (CH2)r
其中： p和 m都是整数， p = 0、 1、 2、 3、 4或 5; m = 0、 1、 2、 3或 4。 在一些实施方案中， 式（I )中所述的" _Z—Exendin，，具有如下 结构:
xendin 优选地， 式（I )中所述的" _Z—Exendin "具有如下结构: o o
— CH20— (CH2)厂 N — CONH— (CH2)W— N
Exendin Exendin
O O
O
一 CH20— (CH2)— NHCO— (CH2)q- N
Exendin
O
O
— CH20— (CH2):— NHCO— (NH); -N
Exendin
O
O
― CONH— (CH2)W— NH ~ Exendin
HOOC
HOOC
— CONH— (CH2)W-NH 〉 ^ O Exendin 其中： i、 j、 q、 w是整数， i = 0或 1; j = l、 2、 3、 4、
5或 6; q = l、 2、 3、 4、 5或 6; w = l、 2、 3、 4、 5或 6。 本发明的 Exendin变体缀合物可以通过任何合适的方法进行 制备。 现有技术中已知多种可以将聚合物缀合到蛋白质或肽上的 方法， 其中包括在合适的条件下将本发明的 Exendin变体与聚合 物、 优选经过活化的聚合物相温育。 在一个实施方案中， 所述聚 合物是聚乙二醇， 其可通过例如溴化氰法、 欺基二咪唑法、 N-羟 基琥珀酰亚胺法、氰脲酰氯法等活化和缀合到 Exendin变体上。或 者， 通过 PEG -马来酰亚胺、 PEG-乙烯基砚、 PEG-破代乙酰胺 或 PEG-连碗基正吡啶， 可以将 PEG特异性地缀合到 Exendin变体 中半胱氨酸残基的巯基上。
在一些具体实施方案中， 在如下条件下将经过活化的 PEG与 本发明的 Exendin变体一起孵育： pH值 5.0-7.0， PEG与肽的摩尔 比值为 1-10， 反应时间为 0.5-12小时， 反应温度为 0-50°C， 例如 2-40。C或 4-37。C。
缀合反应之后， 可以通过合适的方法将缀合物分离出来。 适 用的方法包括例如超滤法、 透析法或色谱法等， 这些均在本领域 普通技术人员的能力范围之内。 药物组合物
本发明的 Exendin变体和 /或 Exendin变体缀合物可以有多种 用途， 包括例如用于降低血糖。 因此， 本发明还提供了一种用于 降低血糖的药物组合物，其中包含治疗有效量的本发明的 Exendin 变体和 /或 Exendin变体缀合物，以及任选地药学上可接受的载体。 优选地， 所述药物组合物可用于治疗糖尿病， 更优选地用于治疗 I 型糖尿病和 /或 II糖尿病， 尤其优选地用于治疗 II型糖尿病。
本发明的 Exendin变体或者 Exendin变体缀合物的治疗有效量 取决于给药途径、 受试者类型以及所考虑的具体哺乳动物的身体 特征。 这些因素及其与确定该量之间的关系是医药领域中技术人 员熟知的。 可调整该量和施用方法以达到最佳效力， 从而将肽递 送到受试者， 但是将取决于医药领域技术人员熟知的因素例如体 重、 饮食、 同时用药和其它因素。
本发明的药物组合物可在联合疗法中施用， 即与一种或多种 其它药剂联合应用， 其中所述治疗剂一起施用， 或者依次施用。 在另一些实施方案中， 所述其它药剂可在施用一种或多种本发明 的 Exendin变体和 /或 Exendin变体缀合物或者其药物组合物之前、 期间或之后施用。 可用于本发明的所述其它药剂包括例如可降低 血糖的药剂， 例如胰岛素、 胰岛素类似物、 糊精激动剂和缩胆嚢 素， 和 /或其它用于治疗疾病的化合物或组合物。 优选地， 这样的 联合用药可以实现组合的、 甚至协同的效果。
本文所使用的"可药用载体"、"药学上可接受的载体 "或 "生理 可接受载体"可互换使用， 包括任何和所有的生理上相容的盐、溶 剂、 分散介质、 包衣、 抗菌剂和抗真菌剂、 等渗和吸收延迟剂等 等中的一种或多种。 在一些实施方案中， 所述载体适于静脉内、 肌内、 皮下、 胃肠外、 脊髓或表皮给药 （例如通过注射或濯注）。 取决于给药途径， 可用一定材料包被所述治疗剂， 以保护该治疗 剂免受酸和其它可能使该治疗剂失活的天然条件的作用。
施用时， 本发明的药物制剂以可药用量在可药用组合物中施 用。 术语"可药用的"意为不干扰活性成分的生物活性效力的无毒 物质。 这样的制剂通常含有盐、 緩冲剂、 防腐剂、 相容载体和任 选的其它治疗剂， 例如补充性免疫增强剂， 包括佐剂， 趋化因子 和细胞因子。 当使用在药物中时， 所述盐应该是可药用的， 但是 非可药用盐可方便的用于制备其可药用盐， 它们并不排除在本发 明的范围之外。
如果需要， 本发明的 Exendin变体或 Exendin变体缀合物可与 可药用载体组合。 本文所使用的术语"可药用载体"指一种或多种 相容的固体或液体填充剂、 稀释剂或封装物质， 其适于施用于哺 乳动物例如人。术语"载体，，表示有机或无机、天然或合成的成分， 其与活性成分组合以便于应用。 药物组合物的组分也能够以不存 在可显著破坏所需药物疗效的相互作用的形式共混合。
优选地， 本发明的药物组合物可以包含緩冲体系， 优选地所 述緩冲体系为 pH为约 3.0 ~ 约 6.0的醋酸盐緩冲溶液，或者 pH为约 5.0 ~ 约 9.0的磷酸盐緩冲溶液。 在一些具体实施方案中， 合适的 緩冲剂包括乙酸盐； 柠檬酸盐； 硼酸盐； 磷酸盐。
任选地， 所述药用组合物也可含有合适的防腐剂， 例如： 苯 扎氯铵； 氯叔丁醇； 对羟基苯甲酸酯类和硫柳汞。
所述药用组合物可方便地以单位剂量形式存在， 并可通过药 学领域任何公知方法制备。 所有方法包括将所述活性剂与载体联 合的步骤， 所述载体包含一种或多种辅助成分。 通常， 通过将所 述活性化合物与液体载体、 精细分割的固体载体或以上两者均一 并密切地联合来制备所述组合物， 必要时接着使产品成形。
适于胃肠外给药的药物组合物可以是包含一种或多种 Exendin变体或 Exendin变体缀合物的无菌水性或非水性制剂。 在 一些实施方案中， 所述制剂与受试者的血液等渗。 可根据已知方 法使用合适的分散剂或润湿剂以及助悬剂配制此制剂。 所述无菌 注射制剂也可以是在无毒胃肠外可接受稀释剂或溶剂中的无菌注 射溶液或悬液， 例如 1,3-丁二醇中的溶液。 可使用的可接受载体 和溶剂包括水、 林格溶液和等渗氯化钠溶液。 另外， 无菌的不挥 发性油常规用作溶剂或悬浮介质。 为此， 可使用任何温和的不挥 发性油， 包括合成的甘油单酯或甘油二酯。 另外， 脂肪酸如油酸 可用于注射制剂。 适于经口、 皮下、 静脉内、 肌内等施用的载体 配方可在 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co" Easton，PA中找到。
本发明的 Exendin变体或 Exendin变体缀合物可与保护其避免 快速释放的载体制备在一起， 例如受控释放配方， 包括植入物、 透皮贴剂和微胶嚢递送系统。 可使用生物可降解、 生物相容性聚 合物， 例如乙烯乙酸乙烯酯、 聚酐、 聚乙醇酸、 胶原、 聚原酸酯 和聚乳酸。 现有技术中已知许多制备这样的配方的方法， 参阅如 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed.， Marcel Dekker, Inc., New York, 1978等。
本发明的药物组合物可通过任何常规途径施用， 包括注射或 随时间逐渐输注。 例如， 所述施用可以是经口、 静脉内、 腹膜内、 肌内、 腔内、 肿瘤内、 或透皮。
本发明的药物组合物以有效量施用。 "有效量，，是本文提供的 任何 Exendin变体或 Exendin变体缀合物的量， 其单独或者与进一 步的剂量和 /或其它治疗剂一起产生期望的应答（例如在受试者中 降低血糖水平）。这可包括仅仅暂时减緩糖尿病的发展，或者在一 些实施方案中， 还包括使糖尿病的发展永久性停止。
当然这样的量将取决于受治疗的具体疾病、 所述疾病的严重 程度、 患者个体参数（包括年龄、 生理状况、 身高和体重）、 治疗 持续时间、 同时进行的治疗的性质（如果有的话）、 具体的给药途 径以及在医疗卫生工作者知识范围内的类似因素。 这些因素对本 领域技术人员来说是公知的， 仅仅使用常规实验就可获知。 一般 优选使用各个成分或其组合的最大剂量， 也就是说根据合理医学 判断的最高安全剂量。 但是， 本领域技术人员可以理解， 患者可 由于医学原因、 心理原因或基本上任何其它原因而要求较低剂量 或可容许的剂量。 在前述方法中所使用的药物组合物优选是无菌的， 且在适于 施用给患者的重量单位或体积单位中含有有效量的单独或与另一 种制剂组合的 Exendin变体或 Exendin变体缀合物， 以产生期望的 应答， 例如血糖的降低。 施用于受试者的 Exendin变体或 Exendin变体缀合物的剂量可 根据不同参数进行选择， 特别是根据所使用的给药模式和受试者 的状态。 其它因素包括所需的治疗时期。 如果在所应用的最初剂 量下受试者中的应答不足， 可应用更高的剂量（或通过不同的更 局部的递送途径实现的有效更高剂量）到患者容忍度允许的范围。
在一些实施方案中， 本发明的药物组合物包含 0.20 mg/ml ~ 5 mg/ml Exendin变体和 /或包含 4mg/ml - 40 mg/ml Exendin变体缀 合物，优选地 0.20 mg/ml〜 5 mg/ml Exendin变体和 /或包含 4mg/ml ~ 40 mg/ml Exendin变体缀合物， 更优选地 0.5 mg/ml ~ 2 mg/ml Exendin变体和 /或包含 10mg/ml〜 20 mg/ml Exendin变体缀合物。 一般地， 本发明的 Exendin变体或 Exendin变体缀合物的剂量范围 可从约 10 g/kg患者体重到约 100,000 g/kg患者体重。在一些实施 方案中， 所述剂量范围可从约 0.1 mg/kg到约 20 mg/kg。 在另一些 实施方案中，所述剂量范围可从约 0.1 mg/kg到 5 mg/kg, 0.1 mg/kg 到 10 mg/kg或 0.1 mg/kg到 15 mg/kg。 在另一些实施方案中， 所述 剂量范围可从约 1 mg/kg到 5 mg/kg、5 mg/kg到 10 mg/kg, 10 mg/kg 到 15 mg/kg或 15 mg/kg到 20 mg/kg。 在另一些实施方案中， 所述 剂量约为 0.1 mg/kg、 0.5 mg/kg、 1 mg/kg、 2 mg/kg、 3 mg/kg、 5 mg/kg、 7 mg/kg、 10 mg/kg、 12 mg/kg、 15 mg/kg、 17 mg/kg、 20 mg/kg、 25 mg/kg或 30 mg/kg。 ^另一个实施方案中， 所述剂 量约为 l mg/kg、 3 mg/kg、 5 mg/kg或 6 mg/kg。 基于所述组合物， 所述剂量可连续递送（例如通过连续泵），或者以周期性间隔递送。 在一些实施方案中， 当静脉内给药时， 本发明的 Exendin变体或 Exendin变体缀合物的剂量可以为 0.1至 20 mg/kg或其中任何值。 特定组合物多次给药的理想时间间隔可由本领域技术人员确定， 而不需过度实验。 所提供组合物的其它给药方案是本领域技术人 员已知的， 其中剂量、 施用时间表、 给药部位、 给药模式等可以 与前述有所不同。 在一个实施方案中， 所述剂量以静脉内给药。 在另一个实施方案中， 药剂施用方案是单次静脉内给药。
包含 Exendin变体或 Exendin变体缀合物 （例如在药物组合物 中）和使用说明的药盒也在本发明的范围内。 所述药盒可另外含 有至少一种其它的试剂， 例如一种或多种其它降低血糖的药剂。 在另一个实施方案中， 药盒可包含载体， 所述载体经区室化， 以 在其中紧密固定地容纳一个或多个容器装置或一系列容器装置 (例如试管、 管、 烧瓶、 瓶、 注射器等）。 所述药盒的成分可包装 在水性介盾中， 或者为冻干形式。
本文提供的组合物可以是冻干形式或在水性介质中提供。 优选地， 所述受试者是脊推动物， 更优选是哺乳动物， 最优 选是人， 但也可以是其它动物， 如家养动物 （如狗、 猫等） ， 家 畜 （如牛、 羊、 猪、 马等）或实验动物 （如猴子、 大鼠、 小鼠、 兔子、 豚鼠等） 。
本发明中的 Exendin变体和 /或 Exendin变体缀合物可以单独 施用， 但优选地作为药物组合物施用， 其通常包括根据施用的计 划方式所选的适合的药物赋形剂、 稀释剂或载体。 其可以通过任 何适合的方式适用于需要治疗的患者 /受试者。精确的剂量将取决 于多个因素， 包括该 Exendin变体和 Exendin变体缀合物的精确性 质。
一些合适的施用方式包括（但不限于） 口服、 直肠、 鼻部、 局部（包括口腔和舌下）、 皮下、 阴道或胃肠外的（包括皮下、 肌 肉、 静脉、 皮内、 鞘内和硬脑膜外）施用。
在一些实施方案中， 本发明的药物组合物包含等渗调节剂和 / 或防腐剂， 优选地所述等渗调节剂为蔗糖、 甘露醇、 氯化钠和丙 三醇中的一种或多种， 以及所述防腐剂选自间甲酚、 苄醇、 对羟 基苯甲酸甲酯、 对羟基苯甲酸乙酯、 对羟基苯甲酸丙酯和对羟基 苯甲酸丁酯。 本领域的技术人员通过使用例如等张赋形剂如生理 盐水、 林格氏注射液或乳酸林格氏注射液等， 能够很好的制备本 发明的 Exendin变体或 Exendin变体缀合物的适合的溶液。 根据要 求，还可以加入稳定剂、緩冲剂、抗氧化剂和 /或其它一些添加剂。 口服施用的药物组合物可以是片剂、胶嚢、粉剂或口服液等形式。 片剂可以包括固体载体， 如明胶或辅剂。 液体药物组合物通常包 括液体载体， 如水、 石油、 动物或植物油、 矿物油或合成油。 也 可以包括生理盐水溶液、 葡萄糖或其它糖溶液或二醇类， 如乙二 醇、 丙二醇或聚乙二醇。 在一些实施方案中， 所述药物组合物为 液体制剂和 /或冻干制剂的形式，优选地所述冻干制剂含有冻干保 护剂， 更优选地所述冻干保护剂选自蔗糖、 乳糖、 甘露醇、 海藻 糖等糖。
本文所述的 Exendin变体和 /或 Exendin变体缀合物优选以"治 疗有效量，，或"有效量，，施用给受试者。 所述组合物优选以"治疗有 效量"施用给受试者，所述治疗有效量或有效量足以显示其对于所 述受试者的益处。 施用的实际量， 以及施用的速率和时间过程会 取决于所治疗者的自身情况和严重程度。 治疗的处方 （例如确定 剂量等） 由医护人员决定， 并且通常考虑所治疗的疾病、 患者个 体的情况、 递送部位、 施用方法以及对于医生来说已知的其它因 素。
在一些实施方案中，所述的 Exendin变体和 /或 Exendin变体缀 合物的剂量范围可以是 30 mg/kg体重 /天至 0.00001 mg/kg体重 / 天， 或者 3 mg/kg/天至 0.0001 mg/kg/天， 或者 0.3 mg/kg /天至 0.01 mg/kg/天。
本发明还提供一种治疗疾病的方法， 所述方法包括向有此需 要的受试者施用治疗有效量的 Exendin变体和 /或 Exendin变体缀 合物。 在一些实施方案中， 所述疾病选自下述之中： 餐后倾倒综 合征、 餐后高血糖、 葡萄糖耐量降低、 肥胖、 进食紊乱、 胰岛素 耐受综合征、 糖尿病和高血糖症。 在一个优选的实施方案中， 所 述疾病是 II型糖尿病。
众所周知， Exendin 可以降低肥胖病人体重并可引起恶心和 呕吐反应， 其作用机制与抑制中枢神经系统中摄食中枢和激动呕 吐中粗有关 ( Larsen. Mechanisms behind GLP-1 induced weight loss. Br J Diabetes Vase Dis 2008; 8: S34-S41; Schick et al. Glucagonlike peptide 1 (7-36)-amide acts at lateral and medial hypothalamic sites to suppress feeding in rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2003; 284: Rl 427-35 )， 而 Exendin或 其变体的缀合物由于分子量加大， 难以透过血脑屏障， 故可减少 Exendin 所引发的呕吐反应。 因此在本研究开始之前， 发明人预 期 Exendin或其变体的缀合物也会减少 Exendin由中枢神经系统 介导的减少摄食量和降低体重的作用。然而，尽管野生型 Exendin 和未缀合的 Exendin变体均降低体重和摄食量， 但本发明出乎意 料地发现， Exendin 或其变体的缀合物却具有显著增强的降低体 重和摄食量的作用。
因此， 在另一方面中， 本发明提供了使用 Exendin或其变体 的缀合物和 /或包含这种缀合物的药物组合物来降低体重的方法， 此外还提供了 Exendin 或其变体的缀合物和 /或包含这种缀合物 的药物组合物在制备用于降低体重的药物中的用途。 在一个实施 方案中，所述 Exendin或其变体的缀合物是上述本发明的 Exendin 变体缀合物。
本发明将通过以下实施例进行进一步说明， 其不应以任 何方式解释为进一步限制。 本申请中所有引用的参考文献的 全部内容（包含文章参考、 授权的专利、 公开的专利申请和 共同未决的专利申请） 均明确地通过引用并入本文。 以下实 施例中， 若未具体指出， 所用试剂和材料是能够商业获得的 至少分析纯或与此相当级别的产品。 为了方便理解以下实施例中的技术方案， 以下列表提供实施 例中所用各种 Exendin, Exendin 变体及其缀合物的编号和简要 说明。
PB-106e PB-105, 缀合 PEG20000, 双臂 PEGe
PB-107 PB-105, 缀合 PEG30000
PB-108 PB-105, 缀合 PEG40000
PB-109 PB-105, 缀合 PEG20000x2, 双臂 PEG
PB-109b PB-105, 缀合 PEG20000x2, 双臂 PEGb
PB-109c PB-105, 缀合 PEG20000x2, 双臂 PEGc
PB-109d PB-105, 缀合 PEG20000x2, 双臂 PEGd
PB-110 PB-105, 缀合 PEG5000
PB-110b PB-105, 缀合 PEG5000b
PB-llOc PB-105, 缀合 PEG5000c
PB-111 PB-105, C端添加 Tyr
PB-112 PB-111, 缀合 PEG20000
PB-113 PB-105, 2位 Gly替换为 dAla
PB-114 PB-113, 缀合 PEG40000
PB-119 PB-105, 缀合 PEG23000
PB-120 PB-105, 缀合 PEG27000
实施例 1 固相合成 Exendin-4及其变体
多肽合成已经是生物化学和药学领域的常规技术， 市场上有 很多商业机构（例如 GE HealthCare, Applied Biosystems Inc.等） 可以商业供应众多型号的多肽合成仪， 并且已经有众多的商业机 构 （如上海生工生物工程技术服务有限公司、 上海博彩生物科技 有限公司等）提供定制多肽的委托合成服务。 例如， 可以使用以 下的方法利用多肽合成仪来合成具有指定序列的多肽。
使用 "Fmoc-Rinker Amide MBHA树脂"类型的固相载体， 选 择 Fmoc氨基保护策略合成 Exendin-4及其巯基变体。 第一步： 将 Fmoc保护的氨基酸， 用 HBTU/DIPEA为缩合剂、 在 N，N-二 甲基甲酰胺 (DMF)溶剂中， 反应 1-5 小时时间， 用茚三酮方法监 测缩合反应是否完全。 第二步： 用 10-30%哌啶为脱保护试剂， 在 DMF溶剂中， 反应 10-30分钟， 用茚三酮方法监测氨基保护基是 否完全脱除。 第三步： 按照目标多肽序列， 依次使用相应的氨基 酸， 重复"第一步和第二步"， 直到序列中的最后一个氨基酸偶联 完毕。 第四步： 用三氟醋酸 (TFA)为裂解试剂， 反应 1-5小时， 将 多肽从固相载体上裂解下来， 同时脱除各种保护基。 第五步： 对 裂解下来的多肽溶液用乙醚进行沉淀；过滤收集沉淀，然后用 C18 类型的色谱柱， 选择 0.1% TFA/乙腈-水体系为流动相进行洗脱， 收集组分溶液， 冷冻干燥得到产物。 第六步： 用高效液相色谱方 法鉴定产物纯度， 用氨基酸序列分析和质谱测定产品结构。
发明人委托成都凯捷生物医药科技发展公司根据上述方法定 制合成了具有以下序列的多肽：
PB-101: 野生型 Exendin-4， 其氨基酸序列为：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Gl u-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser ( SEQ ID NO: 1 );
PB-102: C端第 35位为半胱氨酸（Cys ) 的 Exendin-4变体， 其 氛基酸序列为：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Gl u-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Cys-Pro-Pro-Pro-Ser ( SEQ ID NO: 3 )；
PB-105: C端第 39位为半胱氨酸（Cys ) 的 Exendin-4变体， 其 氛基酸序列为：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Gl u-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys ( SEQ ID NO: 4 );
PB-103: C端第 30位为半胱氨酸（Cys ) 的 Exendin-4变体， 其 氛基酸序列为：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Gl u-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-C ys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser ( SEQ ID NO: 5 )；
PB-104: C端第 25位为半胱氨酸（Cys ) 的 Exendin-4变体， 其 氛基酸序列为：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Gl u-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Cys-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser ( SEQ ID NO: 6 ); PB-111 : C端第 39位被半胱氨酸（ Cys )置换并连接酪氨酸（ Tyr ) 的 Exendin-4变体， 其氨基酸序列为：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Gl u-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys-Tyr ( SEQ ID NO: 7 ); 和
PB-113: N端第 2位甘氨酸 (Gly)被替代为 D型丙氨酸 (dAla)并且 C端第 39位被半胱氨酸（ Cys ) 置换的 Exendin-4变体， 其氨基 酸序列为：
His-dAla-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-G lu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys ( SEQ ID NO: 8 )„
作为实例， 图 1 提供了 PB-105 的质谱分析结果， 经 MALDI-TOF质谱测定 PB-105的 M+1峰 (分子量 +1 )为 4203.3 Da, 与其理论分子量（ 4202.8 )相符。
实施例 2a PB-110 (PEG5000-PB-105)的制备与分析
取 2.0 mg PB-105溶解于 1 ml 20 mM的碑酸钠盐緩冲液 (pH 6.5)， 按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 5 mg PEG5000 (由派 格生物医药 （苏州）有限公司商业供应， 5000代表 PEG的分子 量是 5 kDa，分子结构见图 2 )，加入上述溶液，适当摇匀而使 PEG 溶解并与肽混合均匀，在 20 Ό条件下反应 1小时， 然后用过量的 半胱氨酸溶液（ 0.1 ml 0.5M半胱氨酸溶液）终止反应， 最后放置 于 -20 Ό下为分离纯化备用。
用 50 mM醋酸钠緩冲液（ pH 4.5 ) 5倍稀释样品， 上样于用 50 mM醋酸钠緩冲液 ( H 4.5 )平衡 5个柱体积的 SP离子交换 层析柱（GE公司， XK16/20柱， macroCap SP填料）， 上样后用 50 mM醋酸钠緩冲液 ( H 4.5 )平衡 2个柱体积， 然后在 20个 柱体积内线性增加到 100% B緩冲液（含 1 M NaCl的 50 mM醋 酸钠緩冲液 (pH 4.5) )， 在 AKTA Purifier收集洗脱峰。 含量检测 约 lmg多肽。
用 300A 孔径的 C4 反相分析柱 （ Jupiter C4 300A 4.6*250mm )， 0.1%TFA水溶液 /0.1%TFA 乙腈溶液由 61/39到 54/46梯度洗脱 ( 10 min )， 经分析性 HPLC ( Agilentl200 )分析 样品保留时间为 10.4 min, 纯度为 100% (见图 3)。 采用 GPC分 析（岛津 LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串 联）， 条件为 0.1 M 硝酸钠溶液 1.0 ml/min洗脱， 纯度为 97%。
实施例 2b PB-110b (PEG5000b-PB-105)的制备与分析
取 2.0 mg PB-105溶解于 1 ml 20 mM的碑酸钠盐緩冲液 (pH 6.5)， 按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 5 mg PEG5000b (由 派格生物医药 （苏州）有限公司商业供应， 分子结构见图 4 )， 加 入上述溶液，适当摇勾而使 PEG溶解并与肽混合均勾。其余同实 施例 2a，最后采用 GPC分析（岛津 LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联， 条件为 0.1 M 硝酸钠溶液 1.0 ml/min 洗脱）， 纯度为 96.7%。
实施例 2c PB-llOc (PEG5000c-PB-102)的制备与分析
取 2.0 mg PB-105溶解于 1 ml 20 mM的磚酸钠盐緩冲液 (pH 6.5)， 按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 5 mg PEG5000c (由 派格生物医药 （苏州）有限公司商业供应， 分子结构见图 5 )， 加 入上述溶液，适当摇勾而使 PEG溶解并与肽混合均勾。其余同实 施例 2a，最后采用 GPC分析（岛津 LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联， 条件为 0.1 M 硝酸钠溶液 1.0 ml/min 洗脱）， 纯度为 97.8%。
实施例 3a PB-106 (PEG20000-PB-105)的制备与分析
取 2.0 mg PB-105溶解于 1 ml 20 mM的碑酸钠盐緩冲液 (pH 6.5)， 按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 20mg PEG20000 (由 派格生物医药 （苏州）有限公司商业供应， 20000代表 PEG的分 子量是 20 kDa，分子结构见图 2 )， 加入上述溶液， 适当摇勾而使 PEG溶解并与肽混合均匀， 在 20 °C条件下反应 1小时， 然后用 过量的半胱氨酸溶液 (0.1 ml 0.5M半胱氨酸溶液)终止反应， 最后 放置于 -20 °C下为分离纯化备用。
用 50 mM醋酸钠緩冲液（ pH 4.5 ) 5倍稀释样品， 上样于用 50 mM醋酸钠緩冲液（pH 4.5 )平衡 5 个柱体积的 SP离子交换 层析柱（GE公司， XK16/20柱， macroCap SP填料）， 上样后用 50 mM醋酸钠緩冲液（ pH 4.5 )平衡 2个柱体积， 然后在 20个 柱体积内线性增加到 100% B緩冲液（含 1 M NaCl的 50 mM醋 酸钠緩冲液 (pH 4.5) )， 在 AKTA Purifier收集洗脱峰。 含量检测 约 lmg多肽。
上述收集液用 SDS-PAGE凝胶电泳检测，使用考马斯亮蓝染 色法和碘染色法进行对照染色（见图 6A和 6B )。 用 300A孔径的 C4反相分析柱 ( Jupiter C4 300A 4.6*250mm )， 0.1% TFA水溶 液 /0.1% TFA乙腈溶液由 61/39到 54/46梯度洗脱 ( 10 min )， 经 分析性 HPLC(Agilentl200)分析样品保留时间为 11.5 min, 纯度 为 100% (见图 7)。 采用 GPC 分析 （岛津 LC-20AD , SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联），条件为 0.1 M 硝酸钠溶液 l.O ml/min洗脱， 纯度为 98.9%。
实施例 3b PB-106b (PEG20000b-PB-105)的制备与分析
取 1.0 mg PB-105溶解于 1 ml 20 mM的磚酸钠盐緩冲液 (pH 6.5)，按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 2.5 mg PEG20000b (由 派格生物医药 （苏州）有限公司商业供应， 20000代表 PEG的分 子量是 20 kDa，分子结构见图 8 )， 加入上述溶液， 适当摇勾而使 PEG溶解并与肽混合均匀。 其余同实施例 3a， 最后采用 GPC分 析（岛津 LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串 联， 条件为 0.1 M 硝酸钠溶液 l.O ml/min洗脱）， 纯度为 98.2%。 实施例 3c PB-106c (PEG20000c-PB-105)的制备与分析
取 2.0 mg PB-105溶解于 1 ml 20 mM的碑酸钠盐緩冲液 (pH 6.5),按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 20 mg PEG20000c (由 派格生物医药 （苏州）有限公司商业供应， 20000代表 PEG的分 子量是 20 kDa，分子结构见图 9 )， 加入上述溶液， 适当摇勾而使 PEG溶解并与肽混合均匀。 其余同实施例 3a， 最后采用 GPC分 析（岛津 LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串 联， 条件为 0.1 M 硝酸钠溶液 l.O ml/min洗脱）， 纯度为 97.2%。
实施例 3d PB-106d (PEG20000d-PB-105)的制备与分析
取 2.0 mg PB-105溶解于 1 ml 20 mM的磚酸钠盐緩冲液 (pH 6.5)，按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 20 mg PEG20000-3 (由 派格生物医药 （苏州）有限公司商业供应， 20000代表 PEG的分 子量是 20 kDa，分子结构见图 10 )， 加入上述溶液， 适当摇勾而使 PEG溶解并与肽混合均匀。 其余同实施例 3a， 最后采用 GPC分 析（岛津 LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串 联，条件为 0.1 M 硝酸钠溶液 1.0 ml/min洗脱）， 纯度为 97.5 %。
实施例 3e PB-106e (PEG20000e-PB-105)的制备与分析
取 2.0 mg PB-102溶解于 1 ml 20 mM的碑酸钠盐緩冲液 (pH 6.5),按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 20 mg PEG20000e (由 派格生物医药 （苏州）有限公司商业供应， 20000代表 PEG的分 子量是 20 kDa，分子结构见图 11 )， 加入上述溶液， 适当摇勾而使 PEG溶解并与肽混合均匀。 其余同实施例 3a， 最后采用 GPC分 析（岛津 LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串 联，条件为 0.1 M 硝酸钠溶液 1.0 ml/min洗脱）， 纯度为 95.8 %。
实施例 3f PB-112(PEG20000-PB-111)的制备与分析
取 2.0 mg PB-111溶解于 1 ml的 20 mM磚酸钠盐緩冲液 (pH 6.5)， 按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 19 mg PEG20000 (由 派格生物医药（苏州）有限公司商业供应， 20000代表 PEG的分子 量是 20 kDa, 分子结构见图 2 )， 加入上述溶液， 适当摇勾而使 PEG溶解并与肽混合均匀， 在 20 Ό条件下反应 1小时， 然后用 过量的半胱氨酸溶液 (0.1 ml 0.5M半胱氨酸溶液)终止反应， 最后 放置于 -20 °C下为分离纯化备用。
用 50 mM醋酸钠緩冲液（ pH 4.5 ) 5倍稀释样品， 上样于用 50 mM醋酸钠緩冲液（pH 4.5 )平衡 5 个柱体积的 SP离子交换 层析柱（GE公司， XK16/20柱， macroCap SP填料）， 上样后用 50 mM醋酸钠緩冲液 ( H 4.5 )平衡 2个柱体积， 然后在 20个 柱体积内线性增加到 100% B緩冲液（含 1 M NaCl的 50 mM醋 酸钠緩冲液 (pH 4.5) )， 在 AKTA Purifier收集洗脱峰。 含量检测 约 lmg多肽。
上述收集液用 300A孔径的 C4反相分析柱 (Jupiter C4 300A 4.6*250mm)， 0.1% TFA水溶液 /0.1% TFA乙腈溶液由 61/39到 54/46梯度洗脱（ 10 min )， 经分析性 HPLC分析样品保留时间为 10.6 min，纯度为 98.5% (见图 12)。采用 GPC分析（岛津 LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联），条件为 0·1 M 硝 酸钠溶液 1.0 ml/min洗脱， 纯度为 98.7%。
实施例 4 PB-107 (PEG30000-PB-105)的制备与分析
取 2.0 mg PB-105溶解于 1 ml的 20 mM碑酸钠盐緩冲液 (pH 6.5)， 按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 30 mg PEG30000 (由 派格生物医药 （苏州）有限公司商业供应， 30000代表 PEG的分 子量是 30 kDa,分子结构见图 2 )， 加入上述溶液， 适当摇勾而使 PEG溶解并与肽混合均匀， 在 20 。C条件下反应 1小时， 然后用 过量的半胱氨酸溶液 (0.1 ml 0.5M半胱氨酸溶液)终止反应， 最后 放置于 -20 °C下为分离纯化备用。
用 50 mM醋酸钠緩冲液（ pH 4.5 ) 5倍稀释样品， 上样于用 50 mM醋酸钠緩冲液（pH 4.5 )平衡 5 个柱体积的 SP离子交换 层析柱（GE公司， XK16/20柱， macroCap SP填料）， 上样后用 50 mM醋酸钠緩冲液 ( H 4.5 )平衡 2个柱体积， 然后在 20个 柱体积内线性增加到 100% B緩冲液（含 1 M NaCl的 50 mM醋 酸钠緩冲液 (pH 4.5) )， 在 AKTA Purifier收集洗脱峰。 含量检测 约 lmg多肽。
上述收集液用 SDS-PAGE凝胶电泳检测，使用考马斯亮蓝染 色法和碘染色法进行对照染色（见图 6A和 6B )。 用 300A孔径的 C4反相分析柱 (Jupiter C4 300A 4.6*250mm)， 0.1% TFA水溶液 /0.1% TFA乙腈溶液由 61/39到 54/46梯度洗脱（ 10 min )， 经分 析性 HPLC分析样品保留时间为 11.5 min, 纯度为 97.3% (见图 13)„ 采用 GPC 分析 （岛津 LC-20AD , SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联），条件为 0.1 M 硝酸钠溶液 1.0 ml/min 洗脱， 纯度为 98.7%。
实施例 5a PB-108 (PEG40000-PB-105)的制备与分析
取 2.0 mg PB-105溶解于 1 ml 20 mM的碑酸钠盐緩冲液 (pH 6.5)， 按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 40 mg PEG40000 (由 派格生物医药 （苏州）有限公司商业供应， 40000代表 PEG的分 子量是 40 kDa，分子结构见图 2 )， 加入上述溶液， 适当摇勾而使 PEG溶解并与肽混合均匀，在 20Ό条件下反应 1小时， 然后用过 量的半胱氨酸溶液 (0.1 ml 0.5M半胱氨酸溶液)终止反应， 最后放 置于 -20 °C下为分离纯化备用。
用 50 mM醋酸钠緩冲液（ pH 4.5 ) 5倍稀释样品， 上样于用 50 mM醋酸钠緩冲液（pH 4.5 )平衡 5 个柱体积的 SP离子交换 层析柱（GE公司， XK16/20柱， macroCap SP填料）， 上样后用 50 mM醋酸钠緩冲液 ( H 4.5 )平衡 2个柱体积， 然后在 20个 柱体积内线性增加到 100% B緩冲液（含 1 M NaCl的 50 mM醋 酸钠緩冲液 (pH 4.5) )， 在 AKTA Purifier收集洗脱峰。 含量检测 约 lmg多肽。
上述收集液用 SDS-PAGE凝胶电泳检测，使用考马斯亮蓝染 色法和碘染色法进行对照染色（见图 6A和 6B )。 用 300A孔径的 C4反相分析柱 (Jupiter C4 300A 4.6*250mm)， 0.1% TFA水溶液 /0.1 % TFA乙腈溶液由 61/39到 54/46梯度洗脱（ 10 min )， 经分 析性 HPLC ( Agilentl200 )分析样品保留时间为 11.4 min, 纯度 为 100% (见图 14)。 采用 GPC 分析（岛津 LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联）， 条件为 0.1 M 硝酸钠溶 液 1.0 ml/min洗脱， 纯度为 97.2%。
实施例 5b PB-114(PEG40000-PB-113)的制备与分析
取 2.0 mg PB-113溶解于 1 ml的 20 mM碑酸钠盐緩冲液 (pH 6.5)， 按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 40 mg PEG40000 (由 派格生物医药 （苏州）有限公司商业供应， 40000代表 PEG的分 子量是 40 kDa， 分子结构见图 2 )， 加入上述溶液， 适当摇勾而使 PEG溶解并与肽混合均匀，在 20Ό条件下反应 1小时， 然后用过 量的半胱氨酸溶液 (0.1 ml 0.5M半胱氨酸溶液)终止反应， 最后放 置于 -20 °C下为分离纯化备用。
用 50 mM醋酸钠緩冲液（ pH 4.5 ) 5倍稀释样品， 上样于用 50 mM醋酸钠緩冲液（pH 4.5 )平衡 5 个柱体积的 SP离子交换 层析柱（GE公司， XK16/20柱， macroCap SP填料）， 上样后用 50 mM醋酸钠緩冲液 ( H 4.5 )平衡 2个柱体积， 然后在 20个 柱体积内线性增加到 100% B緩冲液（含 1 M NaCl的 50 mM醋 酸钠緩冲液 (pH 4.5) )， 在 AKTA Purifier收集洗脱峰。 含量检测 约 1 mg多肽。
上述收集液用 300A孔径的 C4反相分析柱 (Jupiter C4 300A 4.6*250mm)， 0.1% TFA水溶液 /0.1% TFA乙腈溶液由 61/39到 54/46梯度洗脱（ 10 min )， 经分析性 HPLC分析样品保留时间为 12.6 min，纯度为 97.9% (见图 15)。采用 GPC分析（岛津 LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联）， 条件为 0·1 M 硝 酸钠溶液 1.0 ml/min洗脱， 纯度为 98.4%。 实施例 6a PB-109(PEG20000x2 (双臂 PEG ) -PB-105)的制备与 分析
取 2.0 mg PB-105溶解于 1 ml 20 mM的磚酸钠盐緩冲液 (pH 6.5)，按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 40mg PEG20000x2 (由 派格生物医药 （苏州）有限公司商业供应， 20000代表 PEG分子 中一个臂的分子量是 20 kDa，分子结构见图 16 )， 加入上述溶液， 适当摇匀而使 PEG溶解并与肽混合均匀， 在 20 。C条件下反应 1 小时， 然后用过量的半胱氨酸溶液（0.1 ml 0.5 M 半胱氨酸溶液） 终止反应， 最后放置于 -20 。C下为分离纯化备用。
用 50 mM醋酸钠緩冲液（ pH 4.5 ) 5倍稀释样品， 上样于用 50 mM醋酸钠緩冲液（pH 4.5 )平衡 5 个柱体积的 SP离子交换 层析柱（GE公司， XK16/20柱， macroCap SP填料）， 上样后用 50 mM醋酸钠緩冲液（ pH 4.5 )平衡 2个柱体积， 然后在 20个 柱体积内线性增加到 100% B緩冲液（含 1 M NaCl的 50 mM醋 酸钠緩冲液 (pH 4.5) )， 在 AKTA Purifier收集洗脱峰。 含量检测 约 lmg多肽。
上述收集液用 SDS-PAGE凝胶电泳检测，使用考马斯亮蓝染 色法和碘染色法进行对照染色（见图 6A和 6B )。 用 300A孔径的 C4反相分析柱 (Jupiter C4 300A 4.6*250mm)， 0.1% TFA水溶液 /0.1% TFA乙腈溶液由 61/39到 54/46梯度洗脱（ 10 min )， 经分 析性 HPLC分析样品保留时间为 11.5 min, 纯度为 100% (见图 17)。 采用 GPC 分析 （岛津 LC-20AD , SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串联），条件为 0.1 M 硝酸钠溶液 1.0 ml/min 洗脱， 纯度为 99.3%。
实施例 6b PB-109b(PEG20000x2 (双臂 PEG ) b-PB-105)的制备 与分析
取 2.0 mg PB-105溶解于 1 ml 20 mM的碑酸钠盐緩冲液 (pH 6.5)， 按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 40 mg PEG20000x2b (由派格生物医药（苏州）有限公司商业供应， 20000*2代表 PEG 分子量是 20*2 kDa，分子结构见图 18 )， 加入上述溶液， 适当摇匀 而使 PEG溶解并与肽混合均匀。其余同实施例 6a，最后采用 GPC 分析（岛津 LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱 串联，条件为 0.1 M 硝酸钠溶液 l.O ml/min洗脱），纯度为 99.2%。
实施例 6c PB-109c(PEG20000x2 (双臂 PEG ) c-PB-105)的制备 与分析
取 2.0 mg PB-105溶解于 1 ml 20 mM的碑酸钠盐緩冲液 (pH 6.5)， 按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 40mg PEG20000x2c (由派格生物医药（苏州）有限公司商业供应， 20000*2代表 PEG 分子量是 20*2 kDa，分子结构见图 19 )， 加入上述溶液， 适当摇匀 而使 PEG溶解并与肽混合均匀。其余同实施例 6a，最后采用 GPC 分析（岛津 LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱 串联，条件为 0.1 M 硝酸钠溶液 l.O ml/min洗脱），纯度为 98.8%。
实施例 6d PB-109d(PEG20000x2 (双臂 PEG ) d-PB-105)的制备 与分析
取 2.0 mg PB-105溶解于 1 ml 20 mM的碑酸钠盐緩冲液 (pH 6.5)， 按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 40 mg PEG20000x2d (由派格生物医药（苏州）有限公司商业供应， 20000*2代表 PEG 分子量是 20*2 kDa，分子结构见图 20 )， 加入上述溶液， 适当摇匀 而使 PEG溶解并与肽混合均匀。其余同实施例 6a，最后采用 GPC 分析（岛津 LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱 串联，条件为 0.1 M 硝酸钠溶液 l.O ml/min洗脱），纯度为 99.2%。
实施例 7 PB-119(PEG23000-PB-105)的制备与分析
取 2.0 mg PB-105溶解于 1 ml的 20 mM磚酸钠盐緩冲液 (pH 6.5), 按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 22 mg PEG23000 (由 派格生物医药 （苏州）有限公司商业供应， 23000代表 PEG的分 子量是 23 kDa， 其分子结构见图 2 )， 加入上述溶液， 适当摇匀而 使 PEG溶解并与肽混合均匀， 在 20°C条件下反应 1小时， 然后 用过量的半胱氨酸溶液（ 0.1ml 0.5M半胱氨酸溶液）终止反应， 最后放置于 -20 °C下为分离纯化备用。
用 50 mM醋酸钠緩冲液（ pH 4.5 ) 5倍稀释样品， 上样于用 50 mM醋酸钠緩冲液（pH 4.5 )平衡 5 个柱体积的 SP离子交换 层析柱（GE公司， XK16/20柱， macroCap SP填料）， 上样后用 50 mM醋酸钠緩冲液（ pH 4.5 )平衡 2个柱体积， 然后在 20个 柱体积内线性增加到 100% B緩冲液（含 1 M NaCl的 50 mM醋 酸钠緩冲液 (pH 4.5) )， 在 AKTA Purifier收集洗脱峰。 含量检测 约 1 mg多肽。
上述收集液用 300A孔径的 C4反相分析柱 (Jupiter C4 300A 4.6*250mm)， 0.1% TFA水溶液 /0.1% TFA乙腈溶液由 61/39到 54/46梯度洗脱（ 10 min )， 经分析性 HPLC ( Agilentl200 )分析 样品保留时间为 11.6 min， 纯度为 96.0% (见图 21)。 采用 GPC分 析（岛津 LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串 联）， 条件为 0.1 M 硝酸钠溶液 l.O ml/min洗脱， 纯度为 97.1%。
实施例 8 PB-120(PEG27000-PB-105)的制备与分析
取 2.0 mg PB-105溶解于 1 ml的 20 mM磚酸钠盐緩冲液 (pH 6.5), 按 PEG与肽摩尔比为 2: 1的量称取 24 mg PEG27000 (由 派格生物医药 （苏州）有限公司商业供应， 27000代表 PEG的分 子量是 27 kDa， 其分子结构见图 2 )， 加入上述溶液， 适当摇匀而 使 PEG溶解并与肽混合均匀， 在 20 C条件下反应 1小时， 然后 用过量的半胱氨酸溶液（ 0.1ml 0.5M半胱氨酸溶液）终止反应， 最后放置于 -20 °C下为分离纯化备用。
用 50 mM醋酸钠緩冲液（ pH 4.5 ) 5倍稀释样品， 上样于用 50 mM醋酸钠緩冲液（pH 4.5 )平衡 5 个柱体积的 SP离子交换 层析柱（GE公司， XK16/20柱， macroCap SP填料）， 上样后用 50 mM醋酸钠緩冲液（ pH 4.5 )平衡 2个柱体积， 然后在 20个 柱体积内线性增加到 100% B緩冲液（含 1 M NaCl的 50 mM醋 酸钠緩冲液 (pH 4.5) )， 在 AKTA Purifier收集洗脱峰。 含量检测 约 1 mg多肽。
上述收集液用 300A孔径的 C4反相分析柱 (Jupiter C4 300A 4.6*250mm)， 0.1% TFA水溶液 /0.1% TFA乙腈溶液由 61/39到 54/46梯度洗脱（ 10 min )， 经分析性 HPLC ( Agilentl200 )分析 样品保留时间为 12.1 min， 纯度为 97.7% (见图 22)。 采用 GPC分 析（岛津 LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ三柱串 联）， 条件为 0.1 M 硝酸钠溶液 l.O ml/min洗脱， 纯度为 98.4%。
实施例 9 PB-105聚乙二醇化缀合物稳定性试验
将 PB-110 (PEG5000-PB-105), PB-106 (PEG20000-PB-105), PB-107 (PEG30000-PB-105), PB-108 (PEG40000-PB-105 ) 和 PB-109 (PEG20000*2-PB-105)分别放在 pH值为 4.5醋酸钠緩冲液 和 pH值为 7.0磷酸盐緩冲液， 温度为 4 °C和 -20。C条件下， 考察 其稳定性。 在 7、 15、 30、 60天分别取样用 HPLC分析， 60天结 果表明， 样品在 pH 4.5和 -20 。( 时保存稳定（图 23A ), 样品在 pH 7.0时在 4。〇或-20。C保存均稳定（图 23B，23C )。
实施例 10 PB-101与 PB-105在体外对细胞内 cAMP活性的影响 将 PC12细胞消化并按 105细胞 /ml密度接种于 24孔板， 培 养 48小时（到 60-70%汇合）， 弃去原培养液， 并用磷酸盐緩冲液
( PBS )清洗 2次，加入 1 ml含 1%牛血清白蛋白（BSA )的 PBS, 将受试的 PB-101和 C端第 39位为半胱氨酸的 Exendin-4变体 PB-105 ( 10 n, 10 10， 10 9 , 10 8， 10 7和 10 6 M ) 与 3-异丁基 -1- 甲基黄嘌呤（IBMX，终浓度为 100 μΜ )共同孵育 30 min, 弃去 孵药培养基， 加入 500 l HCl (0.1 M)， 终止酶对 c AMP的降解， 收集细胞， 超声裂解细胞， 按 BCA检测法测定细胞蛋白含量。 按 cAMP酶联免疫试剂盒（美国 RD System公司）说明进行操作， 设立不同浓度的标准品组以建立标准曲线， 反应完成后在酶标仪
(美国 Thermo Fisher Scientific公司）于 450 nm测定光吸收值， 用该吸收值在标准曲线上读出对应的 cAMP浓度， 最后计算样品 中 cAMP浓度。使用 Graphpad Prizm软件，对 PB-101和 PB-105 在体外增加细胞内 cAMP量效关系结果进行计算。
实验结果如图 24所示， PB-101 呈剂量依赖式地增加 PC12 细胞内 cAMP 含量， 增加 cAMP 最大值 （Emax ) 为 133·2±7·2 pmol/100 (蛋白）， EC50值为 1.9x10 9 M。 PB-105在体外对 PC12细胞内 cAMP的影响与 PB-101非常相似。 其中 PB-105增 加 cAMP最大值（Emax )为 129·4±6·8 pmol/100 (蛋白 ) (PB-105 vs PB-101, P > 0.05 )； EC50值为 2.5x10 9 M。 进一步分析表明 PB-101与 PB-105的 Log EC50值分别为 -8.71±0.15和 -8.61±0.15 (PB-105 vs PB-101, P > 0.05)。 说明在 C端第 39位引入半胱氨酸 (巯基）， 不改变 PB-101本身的生物活性。
实施例 11 PB-105 及其聚乙二醇化缀合物在体外对细胞内 cAMP活 '!±的影响
将 PC12细胞消化并按 105细胞 /ml密度接种于 24孔板， 培 养 48小时 （到 60-70%汇合）， 弃去原培养液， 并用 PBS清洗 2 次， 加入 1 ml含 1%BSA的 PBS， 将受试药物 PB-105 , PB-105 聚乙二醇化 （PEG5000 ) 缀合物 PB-110 , PB-105 聚乙二醇化 ( PEG20000 )缀合物 PB-106 , PB-105聚乙二醇化（ PEG30000 ) 缀合物 PB-107, PB-105聚乙二醇化 ( PEG40000 )缀合物 PB-108 和 PB-105聚乙二醇化（ PEG20000x2，双臂）缀合物 PB-109 ( 10 n , ΙθΛ 10 9， 10 8， 10 7， 10 6 和 10 5 Μ ) 与 3-异丁基 -1-甲基黄嘌 呤（ΙΒΜΧ，终浓度为 100 μΜ )共同孵育 30 min， 弃去解药培养 基，加入 500 μΐ HC1 (0.1 Μ)，终止酶对 cAMP的降解，收集细胞， 超声裂解细胞， 按 BCA检测法测定细胞蛋白含量。 按 cAMP酶 联免疫试剂盒说明进行操作， 设立不同浓度的标准品组以建立标 准曲线， 反应完成后在酶标仪于 450 nm测定光吸收值， 用该吸 收值在标准曲线上读出对应的 cAMP 浓度， 最后计算样品中 cAMP浓度。 使用 Graphpad Prizm软件， 对 PB-106、 PB-107, PB-108, PB-109及 PB-110在体外增加细胞内 cAMP的量效关系 进行计算。
实验结果表明， PB-105剂量依赖式地增加 PC12细胞内 cAMP 含量， 其增加 cAMP最大值（ Emax )为 103·9±1·5 pmol/100 (蛋 白）， EC5。值为 1.3xl0 9 M。聚乙二醇化修饰呈分子量（5-40 kDa ) -依赖式地平行右移量效关系曲线，降低 PB-105生物活性（图 25 )。
PB-110, PB-106, PB-107, PB-108和 PB-109的 EC5。值分别为 1.1x10 9,1.1χ10 9, 1.2x10 8， 9.7x10 8和 1.3x10 7 M。 其中 5 kDa (PB-110) 和 20 kDa (PB-106) 聚乙二醇化修饰几乎不影响 PB-105的活性 (分别为 PB-105活性的 115%)，而 30 kDa (PB-107) 和 40 kDa (包括线性和双臂， PB-108和 PB-109) 聚乙二醇化修饰 则分别降低 PB-105的活性约 90%和 99%。 聚乙二醇化缀合物中 聚乙二醇的分子量与这些药物的活性（Log EC50 ) 的相关性见图 26A (包括图 24中 PB-105的 EC5()值）。
实施例 12 PB-105 及其聚乙二醇化缀合物在体外对细胞内 cAMP活'1 的影响
将 PC12细胞消化并按 105细胞 /ml密度接种于 24孔板， 培 养 48小时 （到 60-70%汇合）， 弃去原培养液， 并用 PBS清洗 2 次， 加入 1 ml含 1%BSA的 PBS， 将受试药物 PB-105, PB-105 聚乙二醇化（PEG23000 )缀合物 PB-119和 PB-105聚乙二醇化 ( PEG27000 ) 缀合物 PB-120 ( 10"11, 10 10， 10 9 , 3x10 9， 10 8 和 10·7 Μ ) 与 3-异丁基 -1-甲基黄嘌呤（ΙΒΜΧ，终浓度为 100 μΜ ) 共同孵育 30 min， 弃去孵药培养基， 加入 500 μΐ HC1 (0.1 M)， 终 止酶对 cAMP的降解， 收集细胞， 超声裂解细胞， 按 BCA检测 法测定细胞蛋白含量。 按 cAMP酶联免疫试剂盒说明进行操作， 设立不同浓度的标准品组以建立标准曲线， 反应完成后在酶标仪 于 450 nm测定光吸收值， 用该吸收值在标准曲线上读出对应的 cAMP浓度，最后计算样品中 cAMP浓度。使用 Graphpad Prizm 软件， 对 PB-105、 PB-119, 和 PB-120在体外增加细胞内 cAMP 的量效关系进行计算。
实验结果表明， PB-105剂量依赖式地增加 PC12细胞内 cAMP 含量， EC5。值为 2.7x10 9 M。 PB-106 ( PEG20000 )和 PB-119 ( PEG23000 )不影响 PB-105对 cAMP活性但 PB-12( PEG27000 ) 平行右移量效关系曲线，降低 PB-105对 cAMP生物效价约 50% (图 27 )。 PB-106, PB-119和 PB-120的 EC5。值分别为 1.5x10 9， 2.5x10 9和 5.4x10 9 M。
尽管一般认为随着缀合基团分子量 (如从 4 kDa起)的增加， 缀合生物分子的生物活性将呈指数性逐渐降低 (Bailon et al. Rational design of potent, long-lasting form of interferon: A 40 kDa branched polyethylene glycol-conj ugated interferon a-2a for the treatment of hepatitis C. Bioconjugate Chem 2001； 12： 195 -202; Bowen et al. Relationship between molecular mass and duration of activity of polyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein. Experimental Hematology 1999; 27: 425 -32； Bailon et al. PEG-modified biopharmaceuticals. Expert Opin Deliv. 2009; 6: 1-16)。然而由图 25和图 27中出乎意料地发现， 所缀合聚合物基团的分子量与 Exendin 变体缀合物的体外刺激 cAMP活性之间的关系与这种预期并不完全一致。 至少对于所缀 合 PEG分子量高达 23 kDa的 Exendin变体缀合物， 聚乙二醇化 修饰不影响 Exendin变体缀合物体外刺激细胞产生 cAMP的作用 (而 PEG分子量高达 27 kDa仅有轻度影响）。相反，聚乙二醇化 修饰不影响 PB-105的最大刺激 cAMP生成作用（ Emax )， PB-110, PB-106, PB-107, PB-108和 PB-109的 Emax值分别为 102.1±1.8， 111·9±2·1， 126.2±3.4, 100.4±1.7和 115·5±3·5 pmol/100 蛋白。聚 乙二醇化缀合物中聚乙二醇的分子量与这些药物的 £„^值无相关 性（见图 26B ) (包括图 24中 PB-105的 Emax值）。
基于这一出乎意料的试验结果，发明人进行了以下事后分析。 由于本实施例没有使用含血清培养基（其中含丰富蛋白酶）作为 反应体系， 而且在反应溶液中也没有外加蛋白酶， 因此在本实施 例中体外条件下 Exendin变体及其缀合物的酶促降解作用显著低 于体内环境的情形。也就是说，如果是更长作用时间的体内试验， 与未缀合的野生型 Exendin或 Exendin变体相比， 很可能本发明 Exendin 变体缀合物的生物活性的降低程度更小， 甚至比未缀合 Exendin 或其变体的生物活性更高。 从另一方面来说， 甚至可以 使用高于 23 kDa的聚合物基团来缀合 Exendin变体，而不显著影 响其体内生物活性。 尽管本发明并不受这种理论推测的限制， 这 种预测结果已经在后续实施例中得到了证实。
实施例 13 PB-101和 PB-105降血糖作用时效试验
雄性昆明小鼠（体重 27-32 g )， 实验前小鼠不禁食禁水，随机 分为 3组，每组 6只。 分别皮下单次注射等体积的生理盐水（10 ml/kg )、 PB-IOK 10 g/kg )和 C端第 39位为半胱氨酸的 Exendin 变体 PB-105 ( 10 g/kg )。 注射后 0， 1， 2， 4， 8， 12小时尾尖采 血， 使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸检测血糖。 以不 同时间点的血糖值为纵坐标， 时间为横坐标， 建立降血糖作用的 时效曲线， 计算出 PB-101及 PB-105降血糖作用的生物半衰期。 结果如图 28 所示， 经半胱氨酸置换后的 Exendin-4 变体与 Exendin-4的生物半衰期分另 'J为 4·7±0·2 hrs和 4·4±0·2 hrs (PB-105 vs PB-101, P>0.05 表明在 C 端 39 位经半胱氨酸置换后的 Exendin-4变体与 Exendin-4具有相当的生物半衰期。
实施例 14 PB-101和 PB-105降血糖作用量效试验
雄性昆明小鼠（体重 23-27 g )， 实验前小鼠禁食 3 h， 但不禁 水，随机分 16组，每组 18只。分别皮下单次注射等体积的生理盐水 (10 ml/kg ) ,ΡΒ-101 (0.01,0.1,0.3,1,3,10,100 g/kg)和 C端第 39位 为半胱氨酸的 Exendin 变体 PB-105 (0.01,0.1,0.3,1,3,10,100 g/kg )。 注射后 1小时尾尖采血， 使用美国强生公司稳豪型血糖 仪及配套试纸检测血糖。 以血糖值为纵坐标， 剂量为横坐标， 建 立降血糖作用的量效曲线（图 29 )，并且运用 Graphpad Prizm软 件，计算 PB-101和 PB-105降糖作用量效关系参数（ Emax和 ED50 )。 结果表明， 单次注射 PB-101 和 PB-105 的最大降糖效率分别为 32.2%和 36.1%， ED5。值分别为 0.6 和 1.2 g/kg。 进一步分析表 明， PB-101和 PB-105的 Log ED50值分别为 -0.25±0.17和 0.08±0.20 (PB-105 vs PB-101， Ρ>0·05)。 实验结果显示， 在 C端 39位经半胱 氨酸置换后的 Exendin-4变体 PB-105与 Exendin-4降血糖效应没 有显著性差异。
实施例 15 PB-101及其变体 PB-102降血糖作用量效试验
雄性昆明小鼠（体重 22-26 g )， 实验前小鼠禁食 3 h， 但不禁 水，随机分 18组，每组 6只。 分别皮下单次注射等体积的生理盐水 ( 10 ml/kg ) ,ΡΒ-101 (0.01,0.1,1,10,100 g/kg)和 C端第 35位为半 胱氨酸的 Exendin变体 PB-102 ( 0.01,0.1,1,10,100 g/kg )。 注射 后 1小时尾尖采血， 使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸 检测血糖。 以血糖值为纵坐标， 剂量为横坐标， 建立降血糖作用 的量效曲线（图 30 )，并且运用 Graphpad Prizm软件，计算 PB-101 和 PB-102降糖作用量效关系参数（Emax和 ED5。）。 结果表明， 单 次注射 PB-101和 PB-102的最大降糖效率分别为 39.8%和 32.8%， ED5。值分别为 0.5 和 2.5 g/kg。 进一步分析表明， PB-101 和 PB-102 的 Log ED50值分别为 -0·2867±0·2272 和 0.4015±0.2946 (PB-102 vs PB-101, Ρ>0·05)。 实验结果显示， 在 C端 35位经半胱 氨酸置换后的 Exnedin-4变体 PB-102与 Exendin-4降血糖效应没 有显著性差异。
实施例 16 PB-105及其聚乙二醇化缀合物等量降血糖时效试验 雄性昆明小鼠（体重 22-26 g )， 实验前小鼠不禁食禁水，随机 分为 6组，每组 12只。分别皮下单次注射 PB-105( 10 g/kg )，PB-105 聚乙二醇化 ( PEG5000 ) 缀合物 PB-110 ( 10 g/kg )， PB-105聚 乙二醇化（ PEG20000 )缀合物 PB-106 ( 10 g/kg )， PB-105聚乙 二醇化（ PEG30000 )缀合物 PB-107 ( 10 g/kg )， PB-105聚乙二 醇化（ PEG40000 )缀合物 PB-108 ( 10 g/kg )和 PB-105聚乙二 醇化（ PEG20000x2，双臂 )缀合物 PB-109 ( 10 g/kg )。 注射后 0， 1， 2， 4， 8， 12， 18， 24， 36小时尾尖采血， 使用美国强生公司 稳豪型血糖仪及配套试纸检测血糖。 以不同时间点的血糖值为纵 坐标， 时间为横坐标， 建立降血糖作用的时效曲线 （图 31 )， 并 计算出 PB-105及其聚乙二醇化缀合物降血糖作用的生物半衰期 和最大降糖作用和降糖作用曲线上面积（表 1)。从表 1可以看出， 与未缀合的 PB-105相比， 试验中所用各种 Exendin变体缀合物 都具有与之相似甚至显著更高 （PB-106 ) 的累积降血糖效果（见 血糖曲线上面积），而且这些 Exendin变体缀合物都具有显著更长 的生物半衰期。 进一步采用 PEG分子量 ra.生物半衰期、 最大降 糖作用和降糖作用曲线上面积的相关分析结果表明， PB-105 聚乙 二醇化缀合物 PB-106, PB-107, PB-108和 PB-109都显著延长了 PB-105降血糖作用的时间 （生物半衰期 t1/2 )， 但在 PEG分子量 在 5-20 kDa区间， 其生物半衰期延长与分子量成正比， 而在 20 kDa后降血糖作用时间 （生物半衰期）基本维持不变 （图 32A ); 聚乙二醇化缀合物在 PEG分子量在 5-20 kDa区间最大降糖作用 保持不变， 但之后随着聚乙二醇分子量的增加而有所降低 （图 32B ); 在降糖作用曲线上面积方面， 仅 PB-106 ( PEG20 kDa )显 著性高于 PB-105, 其它缀合物分子具有与 PB-105接近或稍低的 累积降糖作用 （图 32C )。 由上可知， 至少在 PEG分子量高达 20 kDa时， 定点聚乙二醇化修饰 （PB-110和 PB-106 ) 不显著影响 Exendin 变体缀合物的最大降糖作用 （分别为 PB-105 活性的 96% )， 而在 PEG分子量为 30 kDa或更高时 （ PB-107、 PB-108 和 PB-109 ), 聚乙二醇化修饰显著降低其最大降糖作用， 尽管这 些缀合物仍然具有相当的累积降糖作用和显著更长的生物半衰 期。这一结果表明，可以用较高分子量的缀合基团来缀合 Exendin 变体， 由此获得显著更长的生物半衰期以及更加平緩和稳定的血 糖水平， 从而避免血糖水平在短时间内下降过低以及其大范围波 动。 该发现与前述体外 cAMP实验结果一致（见图 26 )。
表 1 PB-105及其聚乙二醇化缀合物降血糖作用的生物半衰 期、 最大降糖作用和血糖曲线上面积 （Area Above Curve for lowering blood sugar, AAC ) (每组 12只小鼠）
Exendin缀合物 ~~ T1/2 (hrs) 最大降糖作用 血糖曲线上面积
(%给药前值） （AAC， mmol*h/L ) PB-105 4.9±0.1 38.0±4.3 32.8±5.4
PB-110 7.0±2.0 36.3±1.2 31.8±4.6
PB-106 13.4±0.5* 36.5±3.2 53.9±4.3*
PB-107 12.5±2.0* 24.3±2.8* 30.0±7.2
PB-108 10.8±2.0* 22.6±2.9* 25.3±5.7
PB-109 9.2±2.2* 20.2±3.2* 21.6±4.8
* P < 0.05 (vs PB-105)
实施例 17 PB-105及其聚乙二醇化（ PEG30000 )缀合物 PB-107 等效量降血糖作用时效试验
由于 PEG30000 ( PB-107 )在体外降低了 PB-105的生物活性 约 90% (图 25 )，并在体内降低了 PB-105的生物活性约 50% (图 31 )， 本研究加大 PB-107剂量从而在产生与 PB-105等效的条件 下，进一步研究 PB-107的生物半衰期。雄性昆明小鼠（体重 22-25 g ), 实验前小鼠不禁食禁水，随机分为 2组，每组 6只。分别皮下单 次注射 PB-105 ( 10 g/kg )和 PB-105聚乙二醇化 ( PEG30000 ) 缀合物 PB-107 ( 100 g/kg， 约产生 10 g/kg PB-105的 100%降 血糖作用的剂量）。 注射后 0, 1， 2， 4， 8， 12， 18， 24， 36 , 48， 72小时尾尖采血，使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸检 测血糖。 以不同时间点的血糖值为纵坐标， 时间为横坐标， 建立 降血糖作用的时效曲线， 计算出 PB-105 ( 10 g/kg )和 PB-107 ( 100 g/kg )降血糖作用的生物半衰期。结果如图 33所示， PB-105 ( 10 g/kg )和 PB-107 ( 100 g/kg )的生物半衰期分别为 4.5±0.4 hrs和 44·6±4·5 hrs (P > 0.05, PB-107 PB-105)。等效剂量的时效 关系研究结果表明， 聚乙二醇化 （PEG30000 ) ( PB-107 ) 延长 PB-105降血糖作用时间达 10倍。
实施例 18 PB-105 及其聚乙二醇化 （PEG20000 ) 缀合物 PB-106降血糖作用量效试验
雄性昆明小鼠（体重 20-24 g )， 实验前小鼠禁食 3 h， 但不禁 水，随机分 13组，每组 6只。 分别皮下单次注射等体积的盐水（ 10 ml/kg ) ,ΡΒ-105 (0.1,0.3,1,3,10,30 g/kg)和等剂量的聚乙二醇化 ( PEG20000 ) 缀合物 PB-106 (0.1,0.3,1,3,10,30 g/kg )。 PB-105 组于注射后 1小时 （降糖峰值时间， 见图 28和 31 )尾尖采血， PB-106组于注射后 4小时（降糖峰值时间， 见图 31 )尾尖采血， 使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸检测血糖。 以血糖值 为纵坐标， 剂量为横坐标， 建立降血糖作用的量效曲线（图 34 )， 并且运用 Graphpad Prizm软件， 计算 PB-105和 PB-106降糖作 用量效关系参数（ Emin， Emax和 ED5。）。单次注射 PB-105和 PB-106 的 Emin分别为 8.3士 0.2 和 8.4 ±0.3 mmol/L; 其 Emax分别为 6.0士 0.3和 5.5 ± 0.6 mmol/L (最大降糖效率分别为 27.8%和 34.5%)„ PB-105和 PB-106的 ED5。值分别为 1.2和 3.3 g/kg。进一步分析 表明， PB-105和 PB-106的 Log ED50值分别为 0.07 ± 1.2和 0.5 士 0.2(PB-106 ra. PB-105，P > 0.05)。 实验结果显示， 经聚乙二醇
( PEG20000 )修饰以后的 PB-105缀合物 PB-106与 PB-105降血 糖效应 （包括 Emax和 ED5。） 没有显著性差异。
实施例 19 PB-105、 PB-111 和聚乙二醇化缀合物 PB-106 和 PB-112对正常小鼠降血糖的时效试验
雄性昆明小鼠 （体重 24-30 g ), 实验前小鼠不禁食禁水， 随机分为 4 组，每组 6 只。 分别皮下单次注射 PB-105 ( 10 g/kg ) ,ΡΒ-105聚乙二醇化 ( PEG20000 )缀合物 PB-106 ( 10 g/kg )， PB-111 ( 10 g/kg )和 PB-111聚乙二醇化（ PEG20000 ) 缀合物 PB-112 ( 10 g/kg )。 其中 PB-111为在 C端 39位半胱 氨酸连接酪氨酸的 PB-105衍生物。 注射后 0, 0.5,1， 2， 4， 8， 12， 24， 48 小时尾尖采血， 使用美国强生公司稳豪型血糖仪 及配套试纸检测血糖。 以不同时间点的血糖值为纵坐标， 时间 为横坐标， 建立降血糖作用的时效曲线， 并计算出 PB-105和 PB-111 及其聚乙二醇缀合物降血糖作用的生物半衰期和最大 降糖作用。结果如图 35所示， PB-105，PB-106， PB-111和 PB-112 均呈时间依赖式降低小鼠随机血糖。 PB-105和 PB-111的生物 半衰期分别为 4.6 hrs和 6.0 hrs, 最大降糖作用分别为 44.7% 和 36.4%。 PB-106和 PB-112的生物半衰期分别为 19.6 hrs和 21.7 hrs, 最大降糖作用分别为 37.3%和 34.9%。 结果表明在 C端 39位加上酪氨酸不影响 PB-105及其聚乙二醇化缀合物 PB-106的降糖活性和生物半衰期。
实施例 20 PB-101及其变体 PB-105、 PB-111和 PB-113以及 聚乙二醇化缀合物 PB-106、 PB-112和 PB-114对 STZ糖尿病 小鼠降血糖时效试验
糖尿病造模前小鼠禁食 14小时， 尾尖采血检测空白血糖 值， 随后皮下一次性注射新配制 STZ (链脲佐菌素） （120 mg/10 ml/kg，新鲜配制，溶于 pH 4.5的 0.1M的柠檬酸緩冲液）， 3天后检测血糖， 小鼠随机血糖高于 16.7 mmol/L即为糖尿病 造模成功小鼠。 实验前小鼠不禁食禁水， 分为 7组， 每组 4 - 6 只。 尾静脉采血检测 O h血糖， 然后分别皮下单次注射等体积 的 PB-101 ( 10 g/10ml/kg )、 PB-105 ( 10 g/kg )、 PB-106 ( 10 g/kg )、 PB-111 ( 10 g/kg )、 PB-112 ( 10 g/kg )、 PB-113 ( 10 g/kg )和 PB-114 ( 10 g/kg )。 其中 PB-111为在 C端 39位半 PB-105衍生物； PB-113为在 N端第 2 位甘氨酸被 D 型丙氨酸替代的 PB-105 衍生物； PB-114 为 PB-113聚乙二醇化（PEG40000 ) 缀合物。 注射后于 0.5， 1， 2， 4， 8， 12， 24， 48 hrs采血， 并检测血糖。 以不同时间点 的血糖值为纵坐标， 时间为横坐标， 建立 PB-101 , PB-105, PB-106, PB-111 , PB-112, PB-113和 PB-114降血糖作用的时 效曲线， 用 GraphPad Prism 5 Demo 软件 ( Prism v5， Graphpad Software, Inc., San Diego, CA )作图， 运用数理统 计学方法分析 PB-101， PB-105, PB-106, PB-111 , PB-112, PB-113和 PB-114的生物半衰期 t1/2， 比较其差别。
图 36显示，单次注射 PB-101 , PB-105, PB-106, PB-111 , PB-112, PB-113和 PB-114对 STZ诱导的糖尿病小鼠均呈时 间依赖式降低随机血糖， 其最大降糖效率分别为 47.5%， 57.6% , 69.8% , 54.4% , 59.7% , 49.2%和 17.9% (仅为 PB-101 的 38% )。 PB-101 , PB-105, PB-106, PB-111 , PB-112 和 PB-113生物半衰期分别为 5.5, 5.5, 21.8, 5.0, 20.3和 5.9 hrs, PB-114 的生物半衰期由于降糖作用小而未能测算。 实验结果 表明，在 C端 39位增加酪氨酸或在 N端第 2位由 D型丙氨酸 替代甘氨酸均不降低 PB-105 抗高血糖活性； 聚乙二醇化 ( PEG20000 )修饰不降低 PB-105及其衍生物活性，但聚乙二 醇化（PEG40000 ) 明显降低 PB-105及其衍生物活性。
实施例 21 PB-105及其聚乙二醇化缀合物 PB-106, PB-119和 PB-120等量降血糖时效试验
雄性昆明小鼠 （体重 24-30 g ), 实验前小鼠不禁食禁水， 随机分为 4组，每组 6只。分别皮下单次注射 PB-105( 10 g/kg )， PB-105聚乙二醇化 ( PEG20000 )缀合物 PB-106 ( 10 g/kg )， PB-105聚乙二醇化 ( PEG23000 ) 缀合物 PB-119 ( 10 g/kg ) 和 PB-105聚乙二醇化（ PEG27000 )缀合物 PB-120( 10 g/kg )。 注射后 0， 0.5, 1， 2， 4， 8， 12， 24， 36, 48小时尾尖采血， 使用美国强生公司稳豪型血糖仪及配套试纸检测血糖。以不同 时间点的血糖值为纵坐标， 时间为横坐标， 建立降血糖作用的 时效曲线， 并计算出 PB-105及其聚乙二醇化缀合物降血糖作 用的生物半衰期和最大降糖作用。结果如图 37所示， PB-105, PB-106， PB-119和 PB-120均呈时间依赖式降低小鼠随机血糖， 其生物半衰期分别为 6.0， 21.7， 24.1和 26.1 hrs, 并随 PEG 分子量增加而增加； 其降糖作用峰值时间分别为约 1 小时 ( PB-105 )和 4小时 （ PB-106，PB-119和 PB-120 )， 降血糖作 用峰值分别为 35.0%， 50.9% , 48.2%和 42.2% (图 37A )。 采 用降血糖-时间面积计算， PB-106, PB-119和 PB-120均显著 增加 PB-105降糖作用 （增加 3-4倍）， 其累积作用随 PEG分 子量增加而增加（图 37B )。 实验结果表明分子量在 20-27 kDa 之间， 聚乙二醇修饰不降低 PB-105降血糖活性， 显著延长了 降血糖作用时间， 并增加累积降血糖作用。 由此可以看出， 当 PEG分子量在 20-27 kDa之间时， 本发明的 Exendin变体缀 合物 PB-106, PB-119和 PB-120的降血糖作用峰值甚至超出 了未缀合的 PB-105, 并且这些缀合物具有显著更长的降血糖 作用时间， 并且它们的累积降血糖作用随 PEG分子量的增加 而增加， 从而提供了更好的综合降血糖作用。
实施例 22 PB-101 , PB-105, PB-106和 PB-120鸽子呕吐试 验
健康家鸽， 雌雄不拘， 分为 7组， 每组 4-8只。 分别皮下 单次注射 PB-101 (3 mg/kg, N = 4或 6 mg/kg, N = 8 ), PB-105 ( 3 mg/kg, N = 4或 6 mg/kg, N = 8 ), PB-106 ( 3 mg/kg, N = 4 或 6 mg/kg, N = 8 )和 PB-120 ( 6 mg/kg, N = 8 ), 采用电子监 视系统观察并记录给药后 24小时内呕吐次数和出现呕吐潜伏 期 (给药后至发生第一次呕吐的时间）。 呕吐次数定义为伸脖、 张口、 耸肩、 腹部收缩至恢复平静或呕吐动作停止记为一次。 以前经验表明鸽子在未给予药物等正常情况下不引起呕吐反 应， 而给予 PB-101 (3和 6 mg/kg )和 PB-105 ( 3和 6 mg/kg )， 鸽子均剂量依赖性地产生明显呕吐反应。 与 PB-101、 PB-105 相应剂量组比较， PB-106 ( 3 mg/kg和 6 mg/kg )和 PB-120 ( 6 mg/kg )组家鸽呕吐潜伏期明显延长 (延长约 5 - 18倍， 见图
38A), 呕吐次数明显降低 (降低约 50-70%， 见图 38B), 其中 在 6 mg/kg剂量时， 差异有统计学显著性（p < 0.05 )。 结果显 示， 聚乙二醇化修饰明显降低了 Exendin及其变体的呕吐反 应。
实施例 23 PB-101 , PB-105和 PB-106对豚鼠全身免疫过敏反应 和体重的影响
雄性健康豚鼠 44只， 每只体重 300 g左右， 分 5组，即生 理盐水组 (N = 10)、 PB-101(N = 10)、 PB-105 (N = 10)、 PB-106 (N = 10)和白蛋白给药组（N = 4 )。 隔天分别皮下注射生理盐 水 (1 ml/kg), PB-101 (100 g/kg)、 PB-105 (100 g/kg)、 PB-106 (100 g/kg)和鸡卵清白蛋白 （80 mg/kg)， 连续 3次， 在最后一 次皮下注射 14天后脚趾静脉分别注射激发剂量的生理盐水 (1 ml/kg), PB-101 ( 300 g/kg )、 PB-105 (300 g/kg)、 PB-106 (300 g/kg)和白蛋白（240 mg/kg)。 注射后即刻观察动物反应， 观察 时间为激发后 0 - 3小时， 按表 2计动物过敏反应症状， 再按 表 3计动物过敏反应程度 (半定量）。
表 2 动物过敏反应症状计量
表 3 动物全身过敏性反应程度评价及半定量标准
以时间为横坐标， 过敏反应程度（半定量）为纵坐标作图
39 显示， 生理盐水对照组豚鼠均未发生任何过敏反应， 呈过 敏反应阴性； 白蛋白组豚鼠激发后均即刻 （< 2 min ) 死亡， 过敏反应呈极强阳性； PB-101组和 PB-105豚鼠产生过敏反 应， 呈阳性反应。 PB-101和 PB-105为 39氨基酸残基的多肽， 长期给药后能在体内产生抗体 （Buse et al. Effects of exenatide (exendin-4) on glycemic control over 30 weeks in sulfonylurea-treated patients with type 2 diabetes. Diabetes Care. 2004； 27： 2628-2635. )。 而 PB-105 聚乙二醇化 ( PEG20000 )缀合物 PB-106对豚鼠产生弱阴性过敏反应。结 果表明聚乙二醇化（PB-106 ) 能显著降低 PB-101 或 PB-105 免疫原性， 减少过敏反应的产生。
以时间为横坐标， 豚鼠体重为纵坐标作图 （图 40 )显示， 致敏期间生理盐水组豚鼠体重持续增长（实验过程 18 日内体 重增加约 38% )。 与生理盐水组比较， 连续 2次给予白蛋白 4 日后不降低体重； 但连续 2 次给予 PB-101 (100 g/kg)或 PB-105 (100 g/kg) 4日后，豚鼠体重降低分别为约 8%和 11% ( p < 0.05 )„ 而给予同等剂量的 PB-106后， 其降低豚鼠体重 作用比 PB-101或 PB-105强； 与给予 PB-101和 PB-105相比 较， 给予 PB-106分别进一步降低约 8%和 11 % ( p < 0.05 )„ 停止给药 12 日后， PB-101、 PB-105和 PB-106组脉鼠体重恢 复， 与生理盐水组相当。
实施例 24 PB-105, PB-106 , PB-119和 PB-120对大鼠体重和摄 食量的影响
雄性健康 SD大鼠 24只， 每只体重 200 g左右， 分 5组， 即生理盐水组（1 ml/kg, N = 4)、 PB-105(100 g/kg， N = 5)、 PB-106 (100 g/kg， N = 5)、 PB-119 (100 g/kg， N = 5)和 PB-120 (100 g/kg，N = 5)。 隔天分别皮下注射生理盐水和药物， 连续 3次， 每天观察大鼠体重及摄食量变化。
以时间为横坐标， 大鼠体重为纵坐标作图（图 41A )显示， 给药期间生理盐水组大鼠体重持续增长（实验过程 9日内体重 增加了 33.4% )，与生理盐水组比较，连续 3次给予 PB-105 (100 g/kg)9日后，以体重 -时间 AUC为指标，大鼠体重降低约 5.3% ( p < 0.05 ); 而给予同等剂量的 PB-106、 PB-119和 PB-120 后， 降低大鼠体重作用比 PB-105强； 与给予 PB-105相比较， 以体重 -时间 AUC为指标， 给予 PB-106、 PB-119和 PB-120 分别进一步降低约 7%， 8%和 8% ( p < 0.05 )。 以时间为横坐标， 大鼠摄食量为纵坐标作图 41B显示，给 药期间生理盐水组大鼠摄食量基本维持不变。与生理盐水组比 较， 以摄食量 -时间 AUC为指标， PB-105 (100 g/kg)连续给 药 3次后， 摄食量降低约 16%; 而给予同等剂量的 PB-106, PB-119和 PB-120后， 降低大鼠摄食量作用比 PB-105强； 与 给予 PB-105相比较， 给予 PB-106、 PB-119和 PB-120分别进 一步降低 18%、 19%和 19% ( p < 0.05 )„
众所周知， Exenatide可以降低肥胖病人体重并可引起恶 心和呕吐反应，其作用机制与抑制中枢神经系统中摄食中枢和 激动呕吐中枢有关 （ Larsen. Mechanisms behind GLP-1 induced weight loss, Br J Diabetes Vase Dis 2008; 8 (Suppl 2): S34― S41; Schick et al. Glucagonlike peptide 1 (7-36)-amide acts at lateral and medial hypothalamic sites to suppress feeding in rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2003;284:R1427-35 ), 而 Exendin或其变体的缀合物由于分子 量加大， 难以透过血脑屏障， 故可减少 PB-101所引发的呕吐 反应 （见实施例 22 )。 因此在本研究开始之前， 发明人预期 Exendin或其变体的缀合物也会减少 Exendin由中枢神经系统 介导的减少摄食量和降低体重的作用。 尽管野生型 Exendin 和未缀合的 Exendin变体均降低体重和摄食量，但本发明出乎 意料地发现， Exendin或其变体的 PEG缀合物却具有显著增 强的降低体重和摄食量的作用。
实施例 25 PB-101及 PB-105药代动力学试验
雄性 SD大鼠（体重 250-300 g， 购自中国科学院上海实验动 物中心）， 给予 30 %水合氯醛（ 300 mg/kg, i.p. )麻醉， 在右上 缘大腹股沟切口， 分离股动静脉， 实施股动静脉插管术（聚乙烯 PE50管， 美国 Becton Dickinson公司）， 右股动脉插管用于采血 取样， 右股静脉插管用于给药， PE-50 管经背部皮下从颈背部引 出， 将导管内充满肝素液（ 200 U/ml ), 缝合切口， 术后大鼠独笼 饲养， 恢复 12 h以上。 插管大鼠在饲养笼内保持自由活动状态， 自由饮食，分为 PB-101组和 PB-105组（每组 3-6只），分别于右股 静脉推注给药 5 g/kg， 分别于给药后 0.08， 0.25, 0.5, 1， 1.5, 2， 2.5 , 3 , 4， 5和 6小时通过 PE50管取血。 血样置 Eppendorf 管离心制备血浆 ( 5000 rpm , 5 min )， -20 C备用。 各组血浆样品 制备齐全后采用 Exenatide EIA Kit (Phoenix Pharmaceuticals, Inc. USA)检测样品中药物浓度。 结果以血药浓度值为纵坐标， 时 间为横坐标， 分别建立 PB-101和 PB-105药-时曲线（图 42)， 结果 表明 PB-105与 P HB-101在大鼠体内呈现相似分布和消除规律。
运用 Kinetica 5.0( Thermo Fisher Scientific Inc., USA )软件， 进行非房室模型 （ Non-compartmental method )参数统计， 计算 出 PB-101和 PB-105的药代动力学参数（ Cmax， AUC。- 1， AUC。-∞， t1/2, MRT, CL和 Vss等）， 结果见表 4。 其中 PB-101和 PB-105的血浆 半衰期分别为 4.8士 0.7和 4.9士 1.4 hrs ( PB-105 vs. PB-101, P > 0.05 ); 药-时曲线下面积分别为 45.4 ± 1.6和 47.9 ± 19.0 ng*hr/ml ( PB-105 vs. PB-101, P > 0.05 )。 实验结果显示 PB-105和 PB-101 具有相似的药代动力学特性。 表 4 PB-101和 PB-105的药代动力学参数 （每组 3-6只 大鼠)
N C (ng/ml) AUC0-t(ng*h/ml) AUC0-∞ (ng*h/ml)
PB-101 3 33.0±2.0 45.4±1.6 85.2±4.4
PB-105 6 36.8±10.6 47.9±19.0 103.8±51.1
MRT (h) CL (ml/(h*kg)) Vss (ml/kg)
PB-101 4.8±0.7 6.9±0.7 59.0±3.1 403.2±21.3 PB-105 4.9±1.4 7.2±2.2 117.7±58.5 563.8±186.1
实施例 26 PB-105及其聚乙二醇化缀合物药代动力学试验
雄性 SD大鼠（体重 250-300 g， 购自中国科学院上海实验动 物中心）， 给予 30 %水合氯醛（ 300 mg/kg, i.p. )麻醉， 在右上 缘大腹股沟切口， 分离股动静脉， 实施股动静脉插管术（聚乙烯 PE50管， 美国 Becton Dickinson公司）， 右股动脉插管用于采血 取样， 右股静脉插管用于给药， PE-50 管经背部皮下从颈背部引 出， 将导管内充满肝素液（ 200 U/ml )， 缝合切口， 术后大鼠独笼 饲养， 恢复 12 h以上。 插管大鼠在饲养笼内保持自由活动状态， 自由饮食。分为 6组（每组 3只 ): PB-105, PB-110，PB-106，PB-107， PB-108和 PB-109。分别于右股静脉推注给药 5 g/kg不同的时间 点采血 0.2 ml, 在给药后 48小时前通过 PE50管取血， 48小时后 采用尾静脉取血。 具体如下： PB-105组（给药后 0.08， 0.25， 0.5， 1， 1.5 , 2， 2.5, 3 , 4， 5， 6小时）， PB-110组（给药后 0.08， 0.25 , 0.5 , 1， 2， 3 , 4， 5， 6， 8， 10小时）， PB-106组（给药后 0.08， 0.25 , 0.5, 1， 2， 4， 8， 12， 24， 36, 48， 60， 72 , 84， 96小时）， PB-107组（给药后 0.08， 0.25, 0.5 , 1， 2， 4， 8， 12， 24， 36 , 48， 60 , 72 , 84， 96 , 108， 120， 132 , 144小时）， PB-108和 PB-109 组（给药后 0.08， 0.25 , 0.5 , 1， 2， 4， 8， 12， 24， 36 , 48， 60， 72 , 84， 96， 108， 120， 132 , 144， 156， 168小时）。血样置 Eppendorf 管离心制备血浆 ( 5000 rpm , 5 min )， -20。C备用。 各组血浆样品 制备齐全后采用 Exenatide EIA Kit ( Phoenix Pharmaceuticals, Inc. USA )检测样品中药物浓度。 结果以血药浓度值为纵坐标， 时间为横坐标， 建立聚乙二醇化缀合物药-时曲线， 结果表明 PB-105 及其聚乙二醇化缀合物显示快速分布和慢速消除（见图 43 )。
运用 Kinetica 5.0( Thermo Fisher Scientific Inc., USA )软件， 进行非房室模型 ( Non-compartmental method )参数统计， 计算 出 PB-105 及其聚乙二醇化缀合物的药代动力学参数 （ Cmax， AUCo-t, AUCo-oo, t1/2, MRT, CL和 Vss等），结果见表 5。其中， PB-105 的血浆半衰期为 2.9±0.1 hrs, 其聚乙二醇化缀合物的血浆半衰期 随聚乙二醇分子量的增加而延长； PB-105 药-时曲线下面积为 18.2±1.9 ng*hr/ml, 其聚乙二醇化缀合物的药 -时曲线下面积随聚 乙二醇分子量的增加而增加。图 44A和图 44B分别显示聚乙二醇 化缀合物中聚乙二醇分子量与血浆半衰期和药-时曲线下面积之 间的关系。 表 5 PB-105及其聚乙二醇化缀合物的药代动力学参数 （每 组 3只大鼠） C x (ng/ml) AUCo-t (ng*hr/ml) AUCo-∞ (ng*hr/ml)
PB-105 23.0±2.8 18.2±1.9 24.5±2.2
PB-110 76.1±14.5 101.0±25.8 165.5±45.3
PB-106 149.2±5.7 942.5±84.6 1146.0±65.2
PB-107 128.2±15.5 1485.2±123.0 1879.3±82.1
PB-108 148.1±24.5 1780.7±279.9 2202.5±318.8
PB-109 240.1±20.9 5478.8±654.3 7033.4±861.6
T1/2 (hr) MRT (hr) CL (ml/hr*kg) Vss (ml/kg)
PB-105 2.9±0.1 4.1±0.2 207.8±20.9 846.3±79.0
PB-110 6.1±0.8 9.6±1.0 37.5±13.5 340.1±92.9
PB-106 42.6±8.1 47.3±11.6 4.4±0.3 209.0±57.3
PB-107 70.5±2.6 75.3±9.5 2.7±0.1 201.6±27.3
PB-108 74.8±4.5 90.2±10.2 2.3±0.3 193.6±50.0
PB-109 103.6±2.4 102.0±6.8 0.7±0.1 74.8±10.4
本发明的 Exendin变体具有改善的药动学性质， 能显著降低 血糖， 具有与 Exendin相当或更优的生物学活性。 通过半胱氨酸 巯基定点偶联聚合物的 Exendin变体缀合物显著延长了 Exendin 变体的半衰期， 保持了高的生物活性。
本发明已通过各个具体实施例作了举例说明。 但是， 本领域 普通技术人员能够理解， 本发明并不限于各个具体实施方式， 普 通技术人员在本发明的范围内可以作出各种改动或变型， 而仍不 背离本发明的精神和范围。 这样的改动和变型均在本发明的范围 之内。

Claims (39)

  1. 权 利 要 求 书
    1. 一种具有 GLP-1受体激动剂活性的 Exendin变体， 其具 有与野生型 Exendin序列相比有一个或多个氨基酸残基被半胱氨 酸置换的氨基酸序列，优选地所述野生型 Exendin序列选自
    Exendin-4序列
    His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met- Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn- Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO: 1)、 Exendin-3序列
    His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met- Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn- Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO: 2) 及其衍生序列。
    2. 权利要求 1的 Exendin变体，其至少在所述 Exendin变体 的 C端具有半胱氨酸置换。
    3. 权利要求 1的 Exendin变体， 其至少在选自下述的一个或 多个位置具有半胱氨酸置换： 与 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 2 中第 20位 Arg (精氨酸）、 25位 Trp (色氨酸）、 35位 Ala (丙氨 酸)、 39位 Ser (丝氨酸）相对应的位置。
    4. 权利要求 1 - 3中任一项的 Exendin变体， 其还包含一个 或更多个进一步的氨基酸缺失、 添加和 /或替换。
    5. 权利要求 1的 Exendin变体， 其具有选自下述的氨基酸序 列：
    His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met- Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn- Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys ( SEQ ID NO: 3 )；
    His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met- Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn- Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Cys-Pro-Pro-Pro-Ser ( SEQ ID NO: 4 )； His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met- Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn- Gly-Cys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser ( SEQ ID NO: 5 )；
    His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met- Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Cys-Leu-Lys-Asn- Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser ( SEQ ID NO: 6 )；
    His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met- Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn- Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys-Tyr( SEQ ID NO: 7 ); 或
    His-dAla-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met- Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn- Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys ( SEQ ID NO: 8 )„
    6. 一种 Exendin变体缀合物， 其中一个或多个聚合物基团缀 合至权利要求 1 - 5中任一项的 Exendin变体，优选地所述一个或 多个聚合物基团缀合在所述 Exendin变体的半胱氨酸残基上， 更 优选地以硫醚键缀合在所述 Exendin变体的半胱氨酸残基上。
    7. 权利要求 6的缀合物， 其中所述一个或多个聚合物基团各 自独立地选自多糖、聚亚烷基二醇及其衍生物，如聚丙二醇和聚乙 二醇， 优选聚乙二醇。
    8. 权利要求 6或 7的缀合物， 其中所述一个或多个聚合物基 团的分子量为 2 kDa至 50 kDa, 优选 3 kDa至 40 kDa, 更优选 4 kDa至 35 kDa， 还优选 5 kDa至 30 kDa, 例如 5 kDa、 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa和 40 kDa以及上述各分子量值之间的 任意值。
    9. 权利要求 6至 8中任一项的缀合物， 其中所述一个或多个 聚合物基团的分子量为 20 kDa至 30 kDa，优选 21 kDa至 29 kDa, 更优选 23 kDa至 27 kDa,例如 20 kDa, 21 kDa, 22 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 27 kDa, 28 kDa, 29 kDa、 30 kDa以 及上述各分子量值之间的任意值。
    10. 权利要求 6至 9中任一项的缀合物， 其具有如下式（I ) 的结构：
    RPEG— X— CH— Z— Exendin
    Y ( 1 )， 其中， Exendin代表权利要求 1 - 5中任一项所定义的 Exendin 变体， Y为！！或1^1^ - X—，并且每个 X和 Z各自独立为连接基， PEG表示 (OCH2CH2)n-， 其中 n为正整数， R表示 PEG的末端 基团， 优选地每个 R各自独立地选自氢、 烷基、 环烷基、 环烷基 烷基、 烯基、 芳基或芳烷基。
    11. 权利要求 10的缀合物，其中每个" RPEG_"各自独立地具 有选自如下的结构：
    CH3(CH2)k— (OCH2CH2)n ~ (CH3)2CH— (OCH2CH2)n ~
    其中： k 为 0、 1、 2、 3、 4、 5和 6中任一整数， 每 个 n各自独立地选自 40 - 1200的整数， 例如 46、 47、 48 等。
    12. 权利要求 10的缀合物，其中每个" RPEG_ "各自独立地具 有选自如下的结构：
    CH3(CH2)k— (OCH2CH2)n ~ (CH3)2CH— (OCH2CH2)n ~ 其中： k为 0、 1、 2和 3中任意整数； 每个 n各自独立 地选自 40— 1200的整数， 例如 46、 47、 48等。
    13. 权利要求 10的缀合物， 其中每个连接基"一 X一"各自独 立地具有选自如下的结构： 或 一 0— (CH2)n
    其中： 每个 p和 m各自独立地为 0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11或 12中任意整数。
    14. 权利要求 13的缀合物， 其中每个连接基"一 X一"各自独 立地具有选自如下的结构：
    0
    — 0— (CH2)P— C— NH— (CH2)E — O— (CH2)n
    其中： 每个 p各自独立地为 0、 1、 2、 3、 4或 5中任 意整数； 每个 m各自独立地为 0、 1、 2、 3或 4中的整数。
    15. 权利要求 10的缀合物，其中所述的" _Z—Exendin，，具有如 下结构：
    0 0
    — CH20— (CH2)厂 N — CONH— (CH2)W— N
    Exendin Exendin
    O O o
    — CH20― (CH2)~ NHCO— (CH2)q- N
    Exendin
    O
    O
    — CONH— (CH2)W— NHCO— (CH2)q—N
    Exendin
    O
    其中： 每个 i各自独立地为 0或 1的整数； 每个 j各自 独立地为 1、 2、 3、 4、 5或 6中的整数； 每个 q各自独立 地为 1、 2、 3、 4、 5或 6中的整数； 以及每个 w各自独立 地为 1、 2、 3、 4、 5或 6中的整数。
    16. 权利要求 10的缀合物， 其中所述 Exendin变体具有选自 下述的氨基酸序列：
    His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met- Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly -Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys ( SEQ ID NO: 3 )或
    His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met- Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly -Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Cys-Pro-Pro-Pro-Ser ( SEQ ID NO: 4 )。
    17. 一种制备权利要求 6至 16中任一项所述缀合物的方法， 其中包括使权利要求 1至 5中任一项所述的 Exendin变体与所述 聚合物相接触， 优选地其中所述聚合物带有活化基团或者在接触 时进行活化。
    18. 权利要求 17的方法， 其中所述聚合物是聚乙二醇， 优选 其分子量范围为 2 kDa至 50 kDa, 更优选为 3 kDa至 40 kDa, 再优选 5 kDa至 30 kDa， 还优选 20 kDa至 30 kDa， 进一步优选 23 kDa至 27 kDa。
    19. 权利要求 18的方法， 其中在以下条件下进行接触： pH 值 5.0-7.0， 聚乙二醇与肽的摩尔比值为 1-10， 反应时间为 0.5-12 小时， 反应温度为 0-50°C， 优选 2-40。C， 还优选 4-37° ( 。
    20. 权利要求 18的方法， 其中所述聚乙二醇缀合在该
    Exendin-4变体氨基酸序列中的半胱氨酸残基上， 优选地所述聚 乙二醇以硫醚键缀合在所述半胱氨酸残基上。
    21. 权利要求 18的方法， 其中所述聚乙二醇被马来酰亚胺所 活化。
    22. 一种药物组合物， 其包含有效量的权利要求 1 - 5中任一 项所述的 Exendin变体和 /或权利要求 6 - 16中任一项所述的缀合 物， 以及任选地药学上可接受的载体。
    23. 权利要求 22的药物组合物， 其用于降低血糖， 优选地用 于治疗糖尿病， 更优选地用于治疗 I型糖尿病和 /或 II型糖尿病， 尤其优选地用于治疗 II型糖尿病。
    24. 权利要求 22的药物组合物， 其中所述药学上可接受的载 体包含緩冲体系，优选地所述緩冲体系为 pH约 3.0至约 6.0的醋 酸盐緩冲溶液， 或者 pH约 5.0至约 9.0的磷酸盐緩冲溶液。
    25. 权利要求 22的药物组合物， 其包含 0.02 mg/ml至 50 mg/ml Exendin变体和 /或包含 0.4 mg/ml至 400 mg/ml Exendin 变体缀合物， 优选地 0.20 mg/ml至 5 mg/ml Exendin变体和 /或 4mg/ml至 40 mg/ml Exendin变体缀合物， 更优选地 0.5 mg/ml 至 2 mg/ml Exendin变体和 /或 10mg/ml至 20 mg/ml Exendin变体 缀合物。
    26. 权利要求 22的药物组合物， 其中所述药学可接受载体包 括等渗调节剂和 /或防腐剂， 优选地所述等渗调节剂为蔗糖、 甘露 醇、 氯化钠和丙三醇中的一种或多种， 优选地所述防腐剂选自间 甲酚、 苄醇、 对羟基苯甲酸甲酯、 对羟基苯甲酸乙酯、 对羟基苯 甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯中的一种或多种。
    27. 权利要求 22的药物组合物， 其中所述 Exendin变体缀合 物为与亲水性聚合物相缀合的 Exendin变体缀合物， 优选地所述 亲水性聚合物为聚乙二醇， 更优选地所述聚乙二醇的分子量为 2 kDa至 50 kDa。
    28. 权利要求 22至 27中任一项的药物组合物， 其为液体制 剂形式。
    29. 权利要求 22至 27中任一项的药物组合物， 其为冻干制 剂形式。
    30. 权利要求 29的药物组合物， 其中所述冻干制剂含有冻干 保护剂， 优选地所述冻干保护剂选自糖类如蔗糖、 乳糖、甘露醇、 海藻糖等的一种或多种。
    31. 权利要求 1 - 5中任一项的 Exendin变体或者权利要求 6 - 16中任一项的缀合物在制备用于降低血糖的药物中的用途。
    32. 权利要求 31的用途， 其中所述药物用于治疗糖尿病， 包 括 I型糖尿病和 II型糖尿病， 尤其是 II型糖尿病。
    33. 一种降低血糖的方法， 其包括对有此需要的对象施用权 利要求 1-5中任一项的 Exendin变体或者权利要求 6 - 16中任一 项的缀合物。
    34. 权利要求 33的方法， 其用于治疗糖尿病， 包括 I型糖尿 病和 II型糖尿病， 尤其是 II型糖尿病。
    35. 一种试剂盒， 其包含权利要求 1 - 5中任一项的
    Exendin变体和 /或权利要求 6 - 16中任一项的缀合物，以及使 用说明书。
    36. 一种降低体重的方法， 其包括向有此需要的对象施用 缀合有一个或多个聚合物基团的 Exendin或其变体，其中所述 一个或多个聚合物基团优选地是聚乙二醇基团。
    37. 权利要求 36的方法， 其中所述 Exendin或其变体的 缀合物是权利要求 6至 16中任一项的缀合物。
    38. 缀合有一个或多个聚合物基团的 Exendin或其变体在 制备用于降低体重的药物中的用途， 其中所述一个或多个聚合 物基团优选地是聚乙二醇基团。
    39. 权利要求 38的用途， 其中所述 Exendin或其变体的 缀合物是权利要求 6至 16中任一项的缀合物。
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