CN104277103A

CN104277103A - 包含聚合物和生物活性分子的缀合物及其用于减肥的用途

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Publication number: CN104277103A
Application number: CN201310284560.XA
Authority: CN
Inventors: 徐敏; 周向军; 黄国锋; 张映辉; 吕玮; 罗小苏; 侯银菊
Original assignee: PEGBIO (HANGZHOU) CO Ltd
Current assignee: PEGBIO (HANGZHOU) CO Ltd; Pegbio Co Ltd
Priority date: 2013-07-08
Filing date: 2013-07-08
Publication date: 2015-01-14

Abstract

本发明涉及包含聚合物和生物活性分子（例如GLP-1受体激动剂）的缀合物及其用于减肥的用途，更特别地包含二价或更多价聚合物和两个或更多个生物活性分子的缀合物。

Description

包含聚合物和生物活性分子的缀合物及其用于减肥的用途

技术领域

本发明涉及药物领域。特别地，本发明涉及包含聚合物和生物活性分子(例如GLP-1受体激动剂)的缀合物，更特别地包含二价或更多价聚合物和两个或更多个生物活性分子的缀合物。本发明还涉及所述缀合物用于治疗减肥的用途。

背景技术

自然界中广泛存在通过形成二聚体的方式来加强配体和受体之间的作用强度的例子(ChemBio-Chem 6，358-364，2005；Angew.Chem.Int.Ed.37，2754-2794，1998)，研究人员也尝试采用药物的二聚体来增加药物和受体之间的结合强度和疗效。2个Exendin-4分子通过一个小分子连接在一起的产物，比单独1个Exendin-4与受体的结合强度强3.5倍(Bioconjugate Chem.22，625-632，2011)。但是，这样的二聚体存在种种缺陷，例如药物活性分子彼此之间由于空间位阻彼此影响，使得药效难以获得预期的提高。

除了小分子可以用来作连接基团，双官能团聚乙二醇因为具备和两个相同或不同的基团进行反应的能力，也被研究者用作连接基团。如脂肪族环酯在催化剂的作用下，和双羟基聚乙二醇进行开环聚合，从而制备脂肪族聚酯-聚乙二醇-脂肪族聚酯三嵌段共聚物，再在缩合剂的作用下，和紫杉醇进行酯化反应，从而得到紫杉醇键合物(CNl961962)。

双官能团的聚乙二醇还被用来连接相同或者不同的具有生物活性的分子，如叶酸类化合物，从而制备叶酸类化合物介导的主动靶向载体(CNl733309)。

徐明波等公布了聚乙二醇修饰双价生长激素和降钙素(CNl02190719，CNl02190721)，其中聚乙二醇双端活化(优选醛或者酮)，然后和多肽或蛋白药物的游离氨基共价结合从而形成双价的柔性分子。Thompson Robert也在EP057554581，WO92016221AlPEGYLATION OF POLYPEPTIDES中公布了聚合物(如聚乙二醇)双端共价连接相同或者不同的多肽(如肿瘤坏死因子(TNF)，白介素-1，白介素-2等多肽)的方法。

1985年发现了一种肠激素胰高血糖素样肽-1(Glucagon-likepeptide-1，GLP-1)，其是进食后由胰高血糖素原基因表达，主要在肠道黏膜L-细胞分泌的一种产物，它能刺激胰岛β-细胞分泌胰岛素(JMed Chem，47，4128-4134，2004)，对稳定血糖水平有重要作用。外源给予GLP-1能使II型糖尿病患者的血糖水平正常化(Diabetes Care，15，270-276，1992；Lancet，359，824-830，2002；Endoer.Rev，16，390-410，1996；Diabetologia，28，565-573，1985)。但GLP-1在体内很容易被二肽基肽酶(DPPIV)降解，半衰期不足2分钟，几乎不能成为有效的抗糖尿病药物。因此，研究人员开发了GLP-1受体激动剂，以模拟GLP-1的糖代谢调节作用。例如，Exendin-4是在毒蜥(美国亚利桑那州和北墨西哥州内陆爬行动物)的唾液分泌物中发现的多肽(J.Biol.Chem，265，20259-20262，1990；J.Biol.Chem，267，7402-7405，1992)，与胰高血糖素样肽-1(GLP-1(7-36))具有高度同源性(53％)。研究表明，Exendin-4同样可以与GLP-1受体结合，并在药理上表现出与GLP-1相类似的激动作用。

为了进一步改进GLP-1受体激动剂的效果，科研人员对GLP-1受体激动剂的聚合物修饰也进行了一系列研究。杨和普里克特(CN1372570A)的研究证明了Exendin-4主要是通过肾清除来代谢，因此他们利用分子量范围在500至20,000道尔顿(Dalton，Da)的聚乙二醇对Exendin-4进行修饰。包文超、徐宏景、余刚、左亚军(CN101125207A)则利用分子量范围在20kDa至50kDa的聚乙二醇对Exendin-4进行了氨基修饰。

WO2010/121559公开了一种新型Exendin变体，其中具体公开了Exendin变体与聚乙二醇的缀合物及其用于治疗II型糖尿病的用途，其通过引用以整体并入本文。

但是，现在已有的GLP-1受体激动剂以及各种修饰形式仍有一些缺点，包括效果仍然不够理想，在体内使用时给药频率较高，给患者身体、心理和经济带来较大的负担，限制了患者用药依从性，无法广泛应用。另外，有一些GLP-1受体激动剂的修饰形式虽然也可达到一定的效果，但是具有延迟效应，也就是说在施用后需要经过一段时间才能起效，这使得对象血糖水平出现较大波动，不能非常平稳的控制血糖水平。因此，仍然需要有新的GLP-1受体激动剂及其聚合物修饰形式。

此外，在世界范围内肥胖发病率逐年增加，WHO已将其定位为一种重要的疾病，它已成为世界范围内重要的公共卫生问题。国内调查显示，2002年我国成年人超重和肥胖发生率分别为22.8％和7.1％，超重和肥胖已经影响到2亿7千万人口，肥胖症及其相关疾病治疗的总费用高达100亿人民币/年，这在大中城市尤其明显。在美国，64.5％的人群处于超重、肥胖状态，防治肥胖症及其相关并发症的费用迅速增加，2003年花费达750亿美元，2006年花费则增至907亿美元，2009年报道每年花费高达1470亿美元。因此，一直存在对减肥药物的需求。

奥利司他，是目前全球唯一的OTC减肥药，全球超过40,000,000人服用并成功减重，是目前最畅销的减肥产品。但是，奥利司他具有种种缺点，例如，其减肥效果对某些人群不显著，而且其需要每天随餐或者餐后服用，患者依从性较差。而且，其也存在安全性风险。美国食品药品监督管理局(FDA)于2010年5月警告其存在可能引起严重肝损害的风险。因此，需要开发其他机制的新的减肥药物。

发明内容

本发明人在研究中出人意料地发现，两个或更多个GLP-1受体激动剂与二价或更多价聚合物相缀合形成的缀合物能够在对象中特别有效地减轻体重。

相比于市场上目前唯一的OTC减肥药奥利司他，本发明的缀合物至少表现出以下优点：减肥效果更好，持续作用时间更长(也就是说，用药频率更低)，剂量更小从而更加安全。另外，由于优先减少腹部皮下脂肪，本发明的缀合物更是满足了塑形、美体等方面的需求，获得了出人意料的技术效果。

在一个方面，本发明涉及包含聚合物和生物活性分子的缀合物，其中所述聚合物为与两个或更多个生物活性分子相缀合的二价或更多价聚合物。特别地，所述生物活性分子各自独立地选自GLP-1受体激动剂。

在另一个方面，本发明涉及具有通式Y-(Z_i-X_i)_n的缀合物，其中各个X_i表示相同或不同的生物活性分子，各个Z_i表示相同或不同的连接基，Y表示聚合物，n是大于1的整数，i是1至n的整数。特别地，所述生物活性分子各自独立地选自GLP-1受体激动剂。

在又一个方面，本发明涉及制备本发明缀合物的方法，其包括使所述生物活性分子与经活化的聚合物相接触。

在又一个方面，本发明还涉及药物组合物，其包含有效量的本发明缀合物，以及任选地药学上可接受的载体。

在又一个方面，本发明还涉及试剂盒，其包含根据本发明的缀合物和/或根据本发明的药物组合物，以及使用说明书。

本发明人还出人意料地发现，本发明的缀合物大大降低了维持所需效果需要的给药频率。在某些实施方案中，本发明的缀合物每至少30天、每至少25天、每至少20天、每至少15天、每至少10天、每至少9天、每至少8天、每至少7天、每至少6天、每至少5天、每至少4天、每至少3天、每至少2天、每至少1天一次向所述对象施用。在某些实施方案中，本发明的缀合物每至多30天、每至多25天、每至多20天、每至多15天、每至多10天、每至多9天、每至多8天、每至多7天、每至多6天、每至多5天、每至多4天、每至多3天、每至多2天、每至多1天一次向所述对象施用。

在又一个方面，本发明提供了在有此需要的对象中降低血糖的方法，其包括向所述对象施用本发明的缀合物和/或本发明的药物组合物。优选地，所述方法包括每至少30天、每至少25天、每至少20天、每至少15天、每至少10天、每至少9天、每至少8天、每至少7天、每至少6天、每至少5天、每至少4天、每至少3天、每至少2天、每至少1天一次向所述对象施用本发明的缀合物和/或本发明的药物组合物。在某些实施方案中，所述方法包括每至多30天、每至多25天、每至多20天、每至多15天、每至多10天、每至多9天、每至多8天、每至多7天、每至多6天、每至多5天、每至多4天、每至多3天、每至多2天、每至多1天一次向所述对象施用本发明的缀合物和/或本发明的药物组合物。

在又一个方面，本发明提供了在有此需要的对象中治疗糖尿病(特别是II型糖尿病)的方法，其包括向所述对象施用本发明的缀合物和/或本发明的药物组合物。优选地，所述方法包括每至少30天、每至少25天、每至少20天、每至少15天、每至少10天、每至少9天、每至少8天、每至少7天、最少6天、每至少5天、每至少4天、每至少3天、每至少2天、每至少1天一次向所述对象施用本发明的缀合物和/或本发明的药物组合物。在某些实施方案中，所述方法包括每至多30天、每至多25天、每至多20天、每至多15天、每至多10天、每至多9天、每至多8天、每至多7天、每至多6天、每至多5天、每至多4天、每至多3天、每至多2天、每至多1天一次向所述对象施用本发明的缀合物和/或本发明的药物组合物。

在又一个方面，本发明提供了在有此需要的对象中减轻体重的方法，其包括向所述对象施用本发明的缀合物和/或本发明的药物组合物。优选地，所述方法包括每至少30天、每至少25天、每至少20天、每至少15天、每至少10天、每至少9天、每至少8天、每至少7天、最少6天、每至少5天、每至少4天、每至少3天、每至少2天、每至少1天一次向所述对象施用本发明的缀合物和/或本发明的药物组合物。在某些实施方案中，所述方法包括每至多30天、每至多25天、每至多20天、每至多15天、每至多10天、每至多9天、每至多8天、每至多7天、每至多6天、每至多5天、每至多4天、每至多3天、每至多2天、每至多1天一次向所述对象施用本发明的缀合物和/或本发明的药物组合物。在一些实施方案中，体重的减轻是通过减少脂肪实现的，更优选选择性减少腹部皮下脂肪。在另一些实施方案中，体重的减轻是通过抑制食欲实现的。

在又一个方面，本发明提供了在有此需要的对象中减少脂肪(例如腹部皮下脂肪和/或腹腔内脂肪)的方法，其包括向所述对象施用本发明的缀合物和/或本发明的药物组合物。

在又一个方面，本发明提供了本发明的缀合物和/或本发明的药物组合物在制备用于在有此需要的对象中降低血糖的药物中的用途。

在又一个方面，本发明提供了本发明的缀合物和/或本发明的药物组合物在制备用于治疗糖尿病(特别是II型糖尿病)的药物中的用途。

在又一个方面，本发明提供了本发明的缀合物和/或本发明的药物组合物在制备用于在有此需要的对象中减轻体重的药物中的用途。在一些实施方案中，体重的减轻是通过减少脂肪实现的，更优选选择性减少腹部皮下脂肪。在另一些实施方案中，体重的减轻是通过抑制食欲实现的。

在又一个方面，本发明提供了本发明的缀合物和/或本发明的药物组合物在制备用于在有此需要的对象中减少脂肪(例如腹部皮下脂肪和/或腹腔内脂肪)的药物中的用途。

在又一个方面，本发明提供了缀合物和/或药物组合物，其用于在有此需要的对象中降低血糖。

在又一个方面，本发明提供了缀合物和/或药物组合物，其用于治疗糖尿病(特别是II型糖尿病)。

在又一个方面，本发明提供了缀合物和/或药物组合物，其用于在有此需要的对象中减轻体重。在一些实施方案中，体重的减轻是通过减少脂肪实现的，更优选选择性减少腹部皮下脂肪。在另一些实施方案中，体重的减轻是通过抑制食欲实现的。

在又一个方面，本发明提供了缀合物和/或药物组合物，其用于在有此需要的对象中减少脂肪(例如腹部皮下脂肪和/或腹腔内脂肪)。

本发明的缀合物大大降低了给药频率，增加了对象的顺从性。另外，本发明的缀合物在施用后，立即或者很快起效，没有延迟，减少了对象中血糖水平的波动。本发明的缀合物还能够在对象中显著抑制食欲，显著减少脂肪(特别是腹部皮下脂肪)，从而实现减轻体重的作用。

附图说明

图1为双Exendin-4变体聚乙二醇缀合物PEG40K-(Exendin-4-Cys39)₂的分离纯化图。

图2为PEG40K-(Exendin-4-Cys39)2HPLC分析图。

图3比较了Exendin-4和PB105样品的体外生物活性检测。

图4显示PB-108和PB-193在恒河猴中的药时曲线。

图5显示PB-193给药后对肥胖恒河猴动物摄食量的影响。

图6显示PB-193给药对肥胖恒河猴体重随时间变化的影响。

图7显示PB-193给药结束后肥胖恒河猴的体重降低。

图8显示PB-193给药后对肥胖恒河猴腹部皮下脂肪体积的影响。

图9显示PB-193给药后对肥胖恒河猴腹内脂肪体积的影响。

图10显示PB-193单次给药后对肥胖恒河猴空腹血糖的影响。

图11显示PB-193单次给药后肥胖恒河猴空腹血糖下降率。

具体实施方式

本发明涉及包含聚合物和生物活性分子的缀合物，其中所述聚合物为与两个或更多个生物活性分子相缀合的二价或更多价聚合物。优选地，所述生物活性分子各自独立地选自GLP-1受体激动剂。

在一些实施方案中，本发明涉及包含二价聚合物和两个生物活性分子的缀合物。优选地，所述两个生物活性分子各自独立地选自GLP-1受体激动剂。

在一些实施方案中，所述GLP-1受体激动剂选自：GLP-1生物活性形式及其功能性变体(例如GLP-1-(7-37)和GLP-1-(7-36)酰胺)、exendin-4及其功能性变体、exendin-3及其功能性变体、albiglutide及其功能性变体、liraglutide及其功能性变体和taspoglutide及其功能性变体。

在一些优选实施方案中，所述GLP-1受体激动剂选自exendin-4功能性变体和exendin-3功能性变体，所述功能性变体相比于其野生型序列(例如，exendin-4和exendin-3的野生型序列分别如SEQ ID NO：1和2所示，参见表1)具有包含一个或更多个半胱氨酸替换的氨基酸序列。特别地，所述半胱氨酸替换中至少一个位于氨基酸序列的C末端，优选地位于C末端的10个氨基酸、9个氨基酸、8个氨基酸、7个氨基酸、6个氨基酸、5个氨基酸、4个氨基酸、3个氨基酸、2个氨基酸或者1个氨基酸中，最优选位于C末端最后一个氨基酸。

表1

在本发明的一些实施方案中，所述聚合物选自：多糖、多肽、聚亚烷基二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚恶唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、马来酸丙烯酸共聚物、聚酯、聚缩醛、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚亚氨碳酸酯、聚酰胺、乙烯基醚马来酸酐共聚物、苯乙烯马来酸酐共聚物以及以上聚合物的共聚物，优选地所述聚合物选自聚亚烷基二醇，更优选地所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。

在本发明的一些实施方案中，所述聚合物(例如，PEG)的分子量为约2kDa至约50kDa，优选约3kDa至约40kDa，更优选约4kDa至约35kDa，还优选约5kDa至约30kDa，例如约5kDa、约10kDa、约15kDa、约20kDa、约25kDa、约30kDa、约35kDa、约40kDa和约45kDa以及上述各分子量值之间的任意值。

在本发明的另一些实施方案中，所述聚合物是是被活化的从而与所述生物活性分子相缀合，优选地所述聚合物为经修饰的带有活化基团的聚合物，使得所述聚合物通过所述活化基团与生物活性分子相缀合，更优选地所述活化基团选自：马来酰亚胺、卤素、乙烯基砜、二硫键、巯基、醛基、羰基、O-取代羟氨、活性酯、烯基、炔基、叠氮基以及其他具有高化学反应活性的基团，最优选地，所述活化基团选自：马来酰亚胺、卤素、乙烯基砜和二硫键。

在本发明的又一些实施方案中，所述聚合物缀合在所述生物活性分子的赖氨酸侧链氨基或半胱氨酸侧链巯基上。

在另一方面，本发明还涉及具有通式Y-(Z_i-X_i)_n的缀合物，其中各个X_i表示相同或不同的生物活性分子，各个Z_i表示相同或不同的连接基，Y表示聚合物，n是大于1的整数(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大)，i是1至n的整数。例如，当n为2时，所述缀合物为(Z₂-X₂)-Y-(Z₁-X₁)，当n为3时，所述缀合物为：

当n为4时，所述缀合物为：

特别地，所述生物活性分子各自独立地选自GLP-1受体激动剂。在一些实施方案中，所述连接基为活化基团，例如马来酰亚胺、卤素、乙烯基砜、二硫键、巯基、醛基、羰基、O-取代羟氨、活性酯、烯基、炔基、叠氮基或其他具有高化学反应活性的基团，更优选地，所述活化基团选自：马来酰亚胺、卤素、乙烯基砜和二硫键。

定义

本文中所述的“生物活性分子”表示具有生物学功能的分子，包括药物、药物前体、靶向分子、其他具有生物活性的分子以及它们的各种变体，例如小分子药物、多肽、寡肽等。

本文中所述的“变体”和“功能性变体”可互换使用，其是指经过修饰或改变的生物学分子，优选地所述变体仍保持其生物学活性。例如，多肽的“变体”是指通过一个或多个取代、缺失、插入、融合、截短或其任意组合在氨基酸序列上有所不同的多肽。变体多肽可以是完全功能性的或者可缺乏一种或多种活性的功能。完全功能性变体可含有例如仅仅保守性改变或非关键残基或非关键区域的改变。功能性变体还可包含相似氨基酸的替换，其导致功能未改变或不显著的改变。

本文中所述的“二价或多价聚合物”表示具有两个或多个官能团(或者活化基团)的聚合物，所述官能团能够与其他分子(例如生物活性分子)键合从而使得所述聚合物与两个或更多个其他分子相缀合。

本文中所述的“聚乙二醇”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，既包括聚乙二醇(含不同结构的如线性、支链、星型等分叉结构)本身，也包括其末端修饰的衍生物，除非另有明确说明。

本文中所述“缀合物”，是指具有生物活性分子与聚乙二醇分子以共价或者非共价连接后形成的产物。

此外，对于聚合物如聚乙二醇来说，有多种方法测定其分子量。由于聚合物是由一定分布范围内的不同聚合度的分子构成，一般用平均分子量表示聚合物的分子量。具体来说可以是数均分子量，或重均分子量。尽管在聚合物的聚合度差异较大时，数均分子量和重均分子量可能有一些偏差，但是对于分布范围较窄的聚合物来说，二者趋于相等。对于本文提及的聚合物如聚乙二醇，在提及其分子量时，既可以是重均分子量，也可以是数均分子量。

本文所述的“GLP-1”是指胰高血糖素样肽-1(Glucagon-likepeptide-1)，其由胰高血糖素原分子经肠道蛋白酶水解酶裂解产生，在体内具有促进胰岛素分泌的作用。例如GLP-1为具有SEQ ID NO：4(HisAspGluPheGluArgHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgGly)所示序列的多肽。

本文所述的“GLP-1生物活性形式”是指具有生物活性的GLP-1片段，其由胰高血糖素原分子经肠道蛋白酶水解酶裂解产生，例如GLP-1-(7-37)和GLP-1-(7-36)酰胺。

本文所述的“GLP-1受体激动剂”是指具有GLP-1受体激动作用的物质，例如GLP-1及其变体(例如GLP-1-(7-37)和GLP-1-(7-36)酰胺)、exendin-4及其变体、exendin-3及其变体、albiglutide及其变体、liraglutide及其变体和taspoglutide及其变体。

本文所述的“连接基”表示在本发明的缀合物中将聚合物和生物活性分子相连接的基团、片段、化学键或者任何起到连接作用的实体(entity)。在一些实施方案中，所述连接基为活化基团，例如马来酰亚胺、卤素、乙烯基砜、二硫键、巯基、醛基、羰基、O-取代羟氨、活性酯、烯基、炔基、叠氮基或其他具有高化学反应活性的基团，更优选地，所述活化基团选自：马来酰亚胺、卤素、乙烯基砜和二硫键。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

本文使用的术语“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分(例如根据本发明的缀合物)可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。

根据本发明的药物组合物可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。

本文使用的“治疗有效量”或“有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。

本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如野生动物(如苍鹭、鹳、鹤等)，家畜(如鸭、鹅等)或实验动物(如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、土拨鼠、地松鼠等)。

尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数涵盖近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。

另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。

提供了以下实施例以证明并进一步解释本发明的一些优选的实施方式和方面，不应被解释为限制其范围。

实施例

实施例1.双Exendin-4变体聚乙二醇缀合物的制备、纯化和质量分析：PEG10K-(Exendin-4-Cys39)₂(双PB-105-二价聚乙二醇10K)

称取10mg Exendin-4变体(即Exendin-4-Cys39，其序列如SEQ IDNO：3所示)样品(购自成都凯捷生物医药科技发展公司)，用5.0ml0.2MpH6.5的磷酸缓冲液溶解，并称取7.93mg分子量为10KD的聚乙二醇马来酰亚胺修饰剂(PEG-ppMAL2-10KD，其获得自派格生物医药(苏州)有限公司)，其中Exendin-4-Cys39与PEG-ppMAL2-10KD摩尔比为3∶1，加入上述多肽缓冲液中混合均匀，室温25℃放置，缓慢搅拌反应1到2小时，-20℃冷冻保存等待分离纯化用。

用平衡液Buffer A(0.02M pH值4.0的醋酸钠缓冲液)平衡离子交换柱(Macrocap SP填料，GE XK/16柱，柱体积10ml)5个柱体积，用Buffer A(0.02M pH值4.0的醋酸钠缓冲液)5倍稀释反应混合物，用120cm/h流速上样，上样后再用Buffer A(0.02M pH值4.0的醋酸钠缓冲液)平衡5个柱体积，然后线性梯度洗脱20个柱体积到100％Buffer B(0.02M pH值4.0的醋酸钠缓冲液加1M NaCl)，收集各洗脱峰，并做HPLC检测分析。

HPLC分析方法，使用C18反相柱(Jupiter C185um300A4.6＊250mm)，先用65％流动相A(10mM辛烷磺酸钠+2mM NaH2PO4pH2.5)平衡2分钟，然后线性梯度洗脱30分钟到50％流动相B(100％乙腈)，流速为1ml/min，柱温35℃，检测波长220nm。

实施例2.双Exendin-4变体聚乙二醇缀合物的制备、纯化和质量分析：PEG20K-(Exendin-4-Cys39)₂(双PB-105-二价聚乙二醇20K)

称取10mg Exendin-4-Cys39样品，用5.0ml0.2M pH6.5的磷酸缓冲液溶解，并称取15.86mg分子量为20KD(PEG-ppMAL2-20KD，其获得自派格生物医药(苏州)有限公司)的聚乙二醇马来酰亚胺修饰剂(Exendin-4-Cys39与PEG-ppMAL2-20KD摩尔比为3∶1)，加入上述多肽缓冲液中混合均匀，室温25℃放置，缓慢搅拌反应1到2小时，-20℃冷冻保存等待分离纯化用。

实施例3.双Exendin-4变体聚乙二醇缀合物的制备、纯化和质量分析：PEG30K-(Exendin-4-Cys39)₂(双PB-105-二价聚乙二醇30K)

称取10mg Exendin-4-Cys39样品，用5.0ml0.2M pH6.5的磷酸缓冲液溶解，并称取23.79mg分子量为30KD(PEG-ppMAL2-30KD，其获得自派格生物医药(苏州)有限公司)的聚乙二醇马来酰亚胺修饰剂(Exendin-4-Cys39与PEG-ppMAL2-30KD摩尔比为3∶1)，加入上述多肽缓冲液中混合均匀，室温25℃放置，缓慢搅拌反应1到2小时，-20℃冷冻保存等待分离纯化用。

实施例4：.双Exendin-4变体聚乙二醇缀合物的制备、纯化和质量分析：PEG40K-(Exendin-4-Cys39)₂(双PB-105-二价聚乙二醇40K)

称取10mg Exendin-4-Cys39样品，用5.0ml0.2M pH6.5的磷酸缓冲液溶解，并称取31.72mg分子量为40KD(PEG-ppMAL2-40KD，其获得自派格生物医药(苏州)有限公司)的聚乙二醇马来酰亚胺修饰剂(Exendin-4-Cys39与PEG-ppMAL2-40KD摩尔比为3∶1)，加入上述多肽缓冲液中混合均匀，室温25℃放置，缓慢搅拌反应1到2小时，-20℃冷冻保存等待分离纯化用。

用平衡液Buffer A(0.02M pH值4.0的醋酸钠缓冲液)平衡离子交换柱(Macrocap SP填料，GE XK/16柱，柱体积10ml)5个柱体积，用Buffer A(0.02M pH值4.0的醋酸钠缓冲液)5倍稀释反应混合物，用120cm/h流速上样，上样后再用Buffer A(0.02M pH值4.0的醋酸钠缓冲液)平衡5个柱体积，然后线性梯度洗脱20个柱体积到100％Buffer B(0.02M pH值4.0的醋酸钠缓冲液加1M NaCl)，收集各洗脱峰。分离纯化的过程参见图1。接下来，对纯化的双Exendin-4变体聚乙二醇缀合物进行HPLC检测分析。

HPLC分析方法，使用C18反相柱(Jupiter C185um300A4.6＊250mm)，先用65％流动相A(10mM辛烷磺酸钠+2mM NaH2PO4pH2.5)平衡2分钟，然后线性梯度洗脱30分钟到50％流动相B(100％乙腈)，流速为1ml/min，柱温35℃，检测波长220nm。HPLC分析的结果参见图2。

实施例5Exendin-4与其变体在体外作为GLP-1受体激动剂的活性EC50比较。

将稳定表达GLP-1受体的HEK293细胞(辉源生物科技(上海)有限公司)培养于添加了10％FBS(Hyclone)的DMEM(Hyclone)培养基中，放置于37摄氏度，10％CO₂的培养箱中培养。将细胞用胰酶(Hyclone)消化并按5X10⁴细胞/100ul密度接种于96孔板，培养16-24小时，弃去原培养基，更换为无血清DMEM培养基，继续培养5小时。加入受试的Exendin-4和C端第39位替换为半胱氨酸的Exendin-4变体Exendin-4-Cys39(下文称为PB-105)(终浓度10nmol/L、3nmol/L、1nmol/L、0.3nmol/L、0.1nmol/L、0.03nmol/L、0.01nmol/L、0.003nmol/L、0.001nmol/L)(购自成都凯捷生物医药科技发展公司)与细胞共同孵育20min，弃去孵药培养基，加入细胞裂解液(cAMP酶联免疫检测试剂盒中附带，R&D System)，置-80℃冰箱冻融两次以裂解细胞，低温离心收集上清液。按cAMP酶联免疫检测试剂盒(R&D System)说明进行操作，通过绘制标准曲线测定样品孔上清液中cAMP浓度。应用GraphpadPrism软件绘制Exendin-4与其变体的量效曲线图，并计算各样品曲线的EC50。

实验结果如图3所示，Exendin-4和PB-105在细胞水平上均能剂量依赖性地增加HEK293/GLP-1R细胞内的cAMP含量，其刺激细胞释放cAMP的EC50值，Exendin-4为2.3x10^-10M，PB-105为2.5x10^-10M。二者的EC50值非常接近，说明在Exendin-4的C端第39位引入半胱氨酸，不改变Exendin-4本身的生物活性。

实施例6PB-105及其聚乙二醇缀合物在体外作为GLP-1受体激动剂的活性EC50比较。

稳定表达GLP-1受体的HEK293细胞(辉源生物科技(上海)有限公司)培养于添加了10％FBS(Hyclone)的DMEM(Hyclone)培养基中，放置于37摄氏度，10％CO₂的培养箱中培养。将细胞用胰酶(Hyclone)消化并按5X10⁴细胞/100ul密度接种于96孔板，培养16-24小时，弃去原培养基，更换为无血清培养基，继续培养5小时。加入受试药物PB-105、PB-105聚乙二醇5K(PEG5000)缀合物(以下称为PB-110)、PB-105聚乙二醇20K(PEG20000)缀合物(以下称为PB-106)、PB-105聚乙二醇23K(PEG23000)缀合物(以下称为PB-119)、PB-105聚乙二醇27K(PEG27000)缀合物(以下称为PB-122)、PB-105聚乙二醇30K(PEG30000)缀合物(以下称为PB-107)、PB-105聚乙二醇40K(PEG40000)缀合物(以下称为PB-108)和PB-105聚乙二醇20Kx2(PEG20000X2，双臂)缀合物(以下称为PB-109)(终浓度10nmol/L、3nmol/L、1nmol/L、0.3nmol/L、0.1nmol/L、0.03nmol/L、0.01nmol/L、0.003nmol/L、0.001nmol/L)(以上缀合物获得自派格生物医药(苏州)有限公司，其制备方法可参见中国专利申请201080018053.6)与细胞共同孵育20min，弃去孵药培养基，加入细胞裂解液(R&D System)，置-80℃冰箱冻融两次以裂解细胞，低温离心收集上清液。按cAMP酶联免疫检测试剂盒说明进行操作，通过绘制标准曲线测定样品孔上清液中cAMP浓度。应用Graphpad Prism软件绘制供试品的量效曲线图，并计算各样品曲线的EC50。

实验结果表明，PB105及其聚乙二醇缀合物在细胞水平上均能剂量依赖性地增加HEK293/GLP-1R细胞内的cAMP含量，其刺激细胞释放cAMP的EC50值，PB-105、PB-110、PB106、PB-119、PB-122、PB-107、PB-108、PB-109分别为2.4x10^-10M、1.2x10^-10M、2.4x10^-10M、3.2x10^-10M、3.6x10^-10M、3.7x10^-10M、7.9x10^-10M和7.9x10^-10M。数据表明，聚乙二醇的存在影响PB-105的生物活性，随着偶联的聚乙二醇分子量的增加，PB-105的聚乙二醇缀合物活性下降，其激活GLP-1受体的EC50值呈上升趋势。而相同分子量(40KDa)的PEG，线性(PB-108)与分支(PB-109)的相比，二者活性没有明显差别，说明当分子量相同时，PEG的结构(分支和线性)对PEG化Exendin-4活性并无显著影响。

实施例7PB-105与双PB-105-二价聚乙二醇缀合物在体外作为GLP-1受体激动剂的活性EC50比较。

将稳定表达GLP-1受体的HEK293细胞消化并按5X10⁴细胞/100ul密度接种于96孔板，培养16-24小时，弃去原培养基，更换为无血清培养基，继续培养5小时。加入受试药物PB-105、双PB-105-二价聚乙二醇10K(PEG10000)缀合物(以下称为PB-190)、双PB-105-二价聚乙二醇20K(PEG20000)缀合物(以下称为PB-191)、双PB-105-二价聚乙二醇30K(PEG30000)缀合物(以下称为PB-192)和双PB-105-二价聚乙二醇40K(PEG40000)缀合物(以下称为PB-193)(终浓度10nmol/L、3nmol/L、1nmol/L、0.3nmol/L、0.1nmol/L、0.03nmol/L、0.01nmol/L、0.003nmol/L、0.001nmol/L)与细胞共同孵育20min，弃去孵药培养基，加入细胞裂解液，置-80℃冰箱冻融两次以裂解细胞，低温离心收集上清液。按cAMP酶联免疫检测试剂盒说明进行操作，通过绘制标准曲线测定样品孔上清液中cAMP浓度。应用Graphpad Prism软件绘制供试品的量效曲线图，并计算各样品曲线的EC50。

实验结果表明，PB105以及所测试各个双PB105-二价聚乙二醇缀合物在细胞水平上均能剂量依赖性地增加HEK293/GLP-1R细胞内的cAMP含量，其刺激细胞释放cAMP的EC50值，PB-105、PB-190、PB191、PB-192和PB-193分别为4x10^-10M、3.5x10^-10M、5.2x10^-10M、6.2x10^-10M和7.8x10^-10M。数据表明，随着偶联的聚乙二醇的分子量的增加，双PB105-二价聚乙二醇缀合物的活性下降，其激活GLP-1受体的EC50值呈上升趋势。

实施例8PB-108和PB-193在恒河猴中的药代研究

恒河猴2只，分别皮下单次注射PB-108或PB-193(25ug/kg)。注射后0、30分钟、1、2、4、8、12、24、48h、3、5、7d采集血样。采用已验证的ELISA方法，由Origin5.0软件作图并用logistic方程进行拟合，获得方程参数后采用Excel2007回算标曲浓度点，计算质控样品和血清样品的药物浓度。药代动力学参数采用WinNonLin v5.2.1(Pharsight Inc.)软件的非房室模型计算；达峰时间后所有小于LLOQ的个体血清药物浓度值均不参与PK计算。剂量组各个体值的统计计算通过Excel2007(Microsoft Corporation)完成。恒河猴皮下注射25μg/kg的PB-108和PB-193后，药时曲线见图4，PK参数见表2。

表2.在恒河猴中PB-108和PB-193的药代动力学参数

PK参数显示，PB-108和PB-193在恒河猴体内的药代动力学性质类似，均显著优于对照(PB-119)。具体地，PB-108和PB-193的全身暴露水平(AUC)为PB-119相似(sc30μg/kg)剂量下的AUC的3.5倍左右，达峰浓度Cmax和PB-119的相当。PB-108和PB-193的半衰期约为PB-119半衰期的4倍左右，血浆清除率则为PB-119的1/6左右，PB-108和PB-193在恒河猴体内的平均滞留时间为PB-119的3倍左右。AUC、半衰期及血浆清除率三个参数均显示PB108和PB193在恒河猴体内的存留时间较PB119长。

以上数据表明，双PB-105-二价聚乙二醇缀合物(PB-193)与PB-108相比，在体内具有相似的半衰期，均大大优于Exendin-4以及未缀合PEG的PB-105，甚至大大优于缀合了PEG23KD的PB-119。此外，应注意，由于以上数据是针对相同浓度的肽含量，而PB-193是双PB-105的缀合物，因此在相同肽剂量下，PB-193中的PEG给药量是PB-108的一半，所以，PB-193在维持和PB-108相当的体内半衰期的同时，减少了PEG的给药量，减少了PEG可能带来的不良风险，获得了出人意料的技术效果。

实施例9PB-193对肥胖恒河猴减肥药效试验

肥胖恒河猴25只，根据体重、BMI、血糖和腹部脂肪体积分为5组，每组5只，分别为PB-193高剂量组(6μg/kg)、PB-193低剂量组(3μg/kg)、PB-108高剂量组(6μg/kg)、奥利司他对照组(6mg/kg)和模型对照组。PB-193高剂量组每5天一次，共6次；PB-108高剂量组和模型对照组注射生理盐水每5天一次，共6次；PB-193低剂量组前3次给药频率为每5天一次，后4次给药频率为每4天一次，共7次；奥利司他组每1天一次，共30次。试验期间测定动物体重、腹部脂肪体积、摄食量、血糖、血生化和血常规等指标。

摄食量结果如表3a和图5所示。PB-193对肥胖恒河猴的食欲具有抑制作用，而且这种作用呈现一定的剂量依赖性。

表3a.PB-193给药后对肥胖恒河猴动物摄食量的影响

注：“a”与模型对照比下降率；“*”与模型对照比p＜0.05

体重结果见图6和图7：在试验期间模型对照动物体重呈增加趋势，各给药组动物体重均有不同程度的降低。给药结束后，模型对照组动物体重与给药前比增加1.34％，3μg/kg和6μg/kg PB-193组动物体重与给药前比分别降低5.14％和5.68％，奥利司他组和6μg/kg PB-108组动物给药结束后体重下降率为2.18％和3.61％(如表3b所示)。数据表明，剂量远远低于奥利司他(3μg/kg vs6mg/kg)的PB-193却实现了更好的减肥效果，这一结果大大出乎人们的意料。相比于PB-108，PB-193也实现了更好的减肥效果，尽管它们对动物摄食量的影响相似，但是PB-193更显著地降低了动物的体重，这表明PB-193减轻体重的作用可能还通过减少摄食量之外的其他途径起作用。而且，PB-193的给药频率远远低于奥利司他(每5天一次vs每天一次)，这将使得接受药物施用的对象顺应性大大增加，这一效果也是出人意料的。

表3b.PB-193给药后对肥胖恒河猴动物体重的影响

注：“a”给药前与给药后比体重增加量；“＊”与模型对照比p＜0.05

腹部脂肪结果见图8和9及表4。与给药前比，各组动物腹部皮下脂肪和腹腔内脂肪体积均有所下降，PB-193与模型对照组相比统计学显著地减少了腹部皮下脂肪和腹腔内脂肪(p＜0.05)。特别地，相对于腹腔内脂肪，PB-193更加显著地减少腹部皮下脂肪。PB-193的这一特性是出人意料地，这对于美体、塑形等需求来说是十分理想的。

表4PB-193给药后对肥胖恒河猴腹部脂肪体积的影响

注：“a”负值表示下降，正值表示增加；“＊”与模型对照比p＜0.05

血糖结果见图10和11及表5。单次皮下注射3μg/kg或6μg/kg PB-193对肥胖恒河猴具有显著的降血糖作用，其药效至少可以维持4天。24小时后，低剂量(3μg/kg)PB-193导致空腹血糖(FPG，fasting plasmaglucose)降低17.84％，在96小时后仍然降低8.38％。从图11中可以清楚地看出，在24小时、48小时、72小时和96小时时，3μg/kg或6μg/kgPB-193都导致空腹血糖显著降低。这些数据表明，本发明的缀合物能够在对象中有效降低血糖，并且该作用能够持续至少4天。

表5.PB-193单次给药后对肥胖恒河猴空腹血糖的影响

血生化及血常规结果见表6及表7，给药前后对比，模型对照组、3μg/kg和6μg/kg PB-193组和奥利司他组动物，血生化和血常规各项指标均未有显著变化。

因此，PB-193长期连续给药对肥胖恒河猴具有显著的减肥作用，同时PB-193还具有降血糖作用。

以上描述地仅是优选实施方案，其只作为示例而不限制实施本发明所必需特征的组合。所提供的标题并不意指限制本发明的多种实施方案。术语例如“包含”、“含”和“包括”不意在限制。此外，除非另有说明，没有数词修饰时包括复数形式，以及“或”、“或者”意指“和/或”。除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的意思与本领域技术人员通常理解的相同。

本申请中提及的所有公开物和专利通过引用方式并入本文。不脱离本发明的范围和精神，本发明的所描述的方法和组合物的多种修饰和变体对于本领域技术人员是显而易见的。虽然通过具体的优选实施方式描述了本发明，但是应该理解所要求保护的本发明不应该被不适当地局限于这些具体实施方式。事实上，那些对于相关领域技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的多种变体意在包括在随附的权利要求的范围内。

Claims

1.包含聚合物和GLP-1受体激动剂的缀合物，其中所述聚合物为与两个或更多个GLP-1受体激动剂相缀合的二价或更多价聚合物。

2.具有通式Y-(Z_i-X_i)_n的缀合物，其中各个X_i表示相同或不同的GLP-1受体激动剂，各个Z_i表示相同或不同的连接基，Y表示聚合物，n是大于1的整数，i是1至n的整数。

3.根据权利要求1或2的缀合物，其中所述GLP-1受体激动剂选自：GLP-1生物活性形式及其功能性变体、exendin-4及其功能性变体和exendin-3及其功能性变体。

4.根据权利要求3的缀合物，其中所述GLP-1受体激动剂选自：exendin-3、exendin-4、exendin-3功能性变体和exendin-4功能性变体，

其中所述功能性变体相比于其野生型序列具有包含一个或更多个半胱氨酸替换的氨基酸序列。

5.根据权利要求4的缀合物，其中所述半胱氨酸替换中至少一个位于氨基酸序列的C末端，优选地位于C末端的10个氨基酸、9个氨基酸、8个氨基酸、7个氨基酸、6个氨基酸、5个氨基酸、4个氨基酸、3个氨基酸、2个氨基酸或者1个氨基酸中，最优选位于C末端最后一个氨基酸。

6.根据前述任一权利要求的缀合物，其中所述GLP-1受体激动剂为具有SEQ ID NO：3所示序列的exendin-4功能性变体。

7.根据前述任一权利要求的缀合物，其中所述聚合物选自：多糖、多肽、聚亚烷基二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚恶唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、马来酸丙烯酸共聚物、聚酯、聚缩醛、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚亚氨碳酸酯、聚酰胺、乙烯基醚马来酸酐共聚物、苯乙烯马来酸酐共聚物以及以上聚合物的共聚物，优选地所述聚合物选自聚亚烷基二醇，更优选地所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。

8.根据前述任一权利要求的缀合物，其中所述聚合物的分子量为2kDa至50kDa，优选3kDa至40kDa，更优选4kDa至35kDa，还优选5kDa至30kDa，例如5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa和45kDa以及上述各分子量值之间的任意值。

9.根据前述任一权利要求的缀合物，其中所述聚合物是被活化的从而与所述GLP-1受体激动剂相缀合，优选地所述聚合物为经修饰的带有活化基团的聚合物，使得所述聚合物通过所述活化基团与所述GLP-1受体激动剂相缀合，更优选地所述活化基团选自：马来酰亚胺、卤素、乙烯基砜、二硫键、巯基、醛基、羰基、O-取代羟氨、活性酯、烯基、炔基、叠氮基以及其他具有高化学反应活性的基团。

10.制备前述任一权利要求所述缀合物的方法，其包括使所述GLP-1受体激动剂与经活化的聚合物相接触。

11.药物组合物，其包含有效量的权利要求1-9中任一项的缀合物，以及任选地药学上可接受的载体。

12.试剂盒，其包含权利要求1-9中任一项的缀合物和/或权利要求11的组合物，以及使用说明书。

13.一种用于减肥的方法，其包括向有此需要的对象施用权利要求1-9中任一项的缀合物和/或权利要求11的组合物。