CN108697768B - 长效glp-1r激动剂作为神经系统病状和神经退行性病状的治疗方法 - Google Patents

长效glp-1r激动剂作为神经系统病状和神经退行性病状的治疗方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用GLP‑1r激动剂治疗神经退行性病状的组合物和方法。在某些实施例中，长效GLP‑1r激动剂对中枢神经系统具有神经保护和疾病改善作用。

Description

长效GLP-1R激动剂作为神经系统病状和神经退行性病状的治 疗方法
相关申请
本申请要求2015年12月23日提交的美国临时申请第62/387,319号的根据35U.S.C.§119(e)的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院(NIH)授予的R21 CA 198243和P50 CA103175的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
神经退行性疾病包括由神经元的结构或功能的逐步缺失(包括神经元的死亡)诱发的一系列病状。由于神经退行性过程，出现了多种神经退行性疾病，包括帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和亨廷顿舞蹈病(HD)。
帕金森病(PD)是一种迟发型进行性神经退行性病症，影响约一百万美国人和全世界700万至一千万人。尽管多巴胺替代减轻了症状性运动功能障碍，但随着疾病的进展，其有效性降低，导致不可接受的副作用，例如严重的运动波动和运动障碍。此外，这种姑息治疗方法没有解决该疾病的潜在机制。
阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经退行性疾病之一，占全世界80％以上的痴呆病例。它导致精神、行为、功能衰退和学习能力的逐步缺失。当前批准的治疗，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂，仅提供症状改善，但不改变疾病过程。包括基于淀粉样蛋白和基于tau蛋白的疗法的多种新策略处于临床开发状态，然而，在本文所述的发明之前，没有药物在人类中证明具有明显的疗效。
随着人们的寿命延长，越来越多的人患有这些常见的、使人衰弱的神经系统病症。在本文所述的发明之前，尚未标识出可以治疗疾病或阻止该疾病在人类中进展的经证实的神经保护疗法。因此，对治疗这种无情的进行性慢性病症的治疗策略存在实质性的未满足的需求。
发明内容
本发明至少部分基于长效GLP-1r(胰高血糖素样肽1受体)激动剂的开发，其对中枢神经系统具有神经保护和疾病改善作用。开发了皮下给药的长效艾塞那肽，其尽管具有大分子量，但在脑中具有高生物活性并且在中枢神经系统病症(例如，神经退行性疾病)的小鼠模型中具有显著的神经保护和疾病改善作用。与大分子量半衰期延长载体(例如，免疫球蛋白Fc、白蛋白或PEG)融合的工程肽药物不易穿过血脑屏障(BBB)(Pardridge,W.M.2005《神经治疗方案(NeuroRx)》2(1)：3-14)，除非将分子重新改造成靶BBB受体，如转铁蛋白受体(Yu Y.J.等人，2014.《科学转化医学(Sci.Transl.Med.)》6(261)：261ra154)。本文描述的是PEG化艾塞那肽(exenatide)(NLY001)，与
Figure BDA0001769265350000021
艾塞那肽(具有2小时半衰期的毒蜥外泌肽-4(exendin-4))和利拉鲁肽(具有13小时半衰期)相比，PEG化艾塞那肽在非人灵长类动物中具有显著改善的半衰期和平均停留时间。通过位点特异性连接聚乙二醇(PEG)分子至艾塞那肽，PEG化艾塞那肽保持其生物活性(WO2013002580，通过引用并入本文)。由于其更长的半衰期和效力，该化合物适用于每周一次、每两月一次或每月一次的临床给药频率。该给药频率是对当前每日两次治疗(艾塞那肽，
Figure BDA0001769265350000022
)或每日一次治疗(利拉鲁肽，
Figure BDA0001769265350000023
)的改善。然而，就像与大分子量载体融合的肽药物一样，并未预期这种PEG化艾塞那肽在全身注射后对神经退行性疾病(例如，帕金森病(PD)或阿尔茨海默病(AD))显示出疗效。如本文所述，一个意外的发现是皮下给予长效GLP-1r激动剂(PEG化艾塞那肽)，其通过有效靶向大脑中的激活的小胶质细胞和反应性星形胶质细胞在临床相关的转基因PD和AD动物模型中显示出明显的抗帕金森病和抗阿尔茨海默病的作用。本文描述了利用长效GLP-1r激动剂治疗PD和AD以及其它神经退行性病状，例如亨廷顿舞蹈病和肌萎缩侧索硬化症(ALS)(发病机制以小胶质细胞激活为中心的疾病)。
已经标识了用于选择性阻断或逆转小胶质细胞激活和反应性星形胶质细胞以阻止触发神经毒性途径的级联的组合物和方法，该小胶质细胞及反应性星形胶质细胞是参与神经退行性疾病的建立和/或进展的关键细胞。该方法包括向受试者给予长效GLP-1r激动剂。
在一个实施例中，用于治疗或预防哺乳动物受试者中的神经退行性疾病的方法包括给予长效GLP-1r激动剂，其具有穿透BBB并在PD大脑中以连续方式激活GLP-1r而没有“关闭时间”且没有“脱靶”毒性的能力。例如，长效GLP-1r激动剂NLY001在PD和AD模型的大脑中有效累积，并且重要的是，与短效GLP-1r激动剂相比，显示出缓慢的GLP-1r内化。大脑中的组成型GLP-1r激活有助于最大化GLP-1r激动剂的协同抗炎和神经保护特性。
在一个实施例中，保护神经元细胞的方法通过阻断胶质细胞增生(小胶质细胞和星形胶质细胞的激活)并通过在激活的小胶质细胞中靶向上调的GLP-1r来阻断毒性分子从激活的小胶质细胞和反应性星形胶质细胞释放而起作用。
因此，本文提供了治疗神经退行性疾病或病症的方法，其包括向患有神经退行性疾病或病症或有患神经退行性疾病或病症风险的受试者给予药学有效量的包含长效GLP-1r激动剂的组合物以减轻神经退行性疾病或病症的一种或多种症状。合适的长效GLP-1r激动剂包括PEG化GLP-1r类似物、Fc融合GLP-1类似物、白蛋白融合GLP-1类似物或其衍生物。在一个示例性方面，长效GLP-1r激动剂包含PEG化艾塞那肽类似物。在一些情况下，神经退行性疾病或病症选自由以下构成的群组：帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化症、脊髓小脑性共济失调1型(SCA1)和朊病毒病症。任选地，神经退行性病症是帕金森病和阿尔茨海默病。在一个示例性实施例中，方法进一步包括标识患有神经退行性疾病或病症或有患神经退行性疾病或病症风险的患者，神经退行性疾病或病症例如帕金森病或阿尔茨海默病。
优选地，长效GLP-1r激动剂阻断常驻型固有免疫细胞的激活。例如，固有免疫细胞包括小胶质细胞和/或星形胶质细胞。在一些情况下，通过GLP-1r的上调抑制异常聚集蛋白质激活免疫细胞。例如，异常聚集蛋白质包括α-突触核蛋白、β-淀粉样蛋白或tau蛋白。长效GLP-1r激动剂的量有效地抑制了激活的固有免疫细胞分泌的炎性和/或神经毒性介质的分泌。
在一些情况下，与适当的对照相比，GLP-1r激动剂以有效减少炎性或神经毒性介质的量给予，该介质选自由以下构成的群组：TNF-α、IL-1α、IL-1β、IFN-γ、IL-6和C1q。在一个方面，GLP-1r激动剂以有效减少激活的小胶质细胞和反应性星形胶质细胞的细胞群体的量给予。
在一个实施例中，与适当的对照相比，大脑中的TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6或C1q和/或激活的小胶质细胞和反应性星形胶质细胞的水平降低、维持或恢复至受试者中的正常水平。
在一个实施例中，与适当的对照相比，脑蛋白(例如，α-突触核蛋白(α-syn)(路易体)以及淀粉样蛋白斑和tau蛋白)的异常沉积物的水平降低、维持或恢复至受试者中的正常水平。
在一个实施例中，与适当的对照相比，治疗减轻或恢复运动缺陷、改善记忆功能和/或增加受试者的寿命。
合适的给药方式包括口服给药、静脉内给药、局部给药、肠胃外给药、腹腔内给药、肌内给药、鞘内给药、病灶内给药、颅内给药、鼻内给药、眼内给药、心内给药、玻璃体内给药、骨内给药、脑内给药、动脉内给药、关节内给药、皮内给药、透皮给药、透粘膜给药、舌下给药、肠内给药、唇下给药、吹入给药、栓剂给药、吸入给药和皮下给药。示例性给药方式包括皮下给药。
在一些情况下，组合物以某一形式给予，该形式选自包括以下的群组：丸剂、胶囊、片剂、颗粒、粉末、盐、晶体、液体、浆液、糖浆、混悬液、凝胶、乳膏、糊剂、薄膜、贴剂和蒸气。
在一个方面，本文所述的组合物，例如PEG化艾塞那肽，每月给予约1至4次。例如，组合物大约每周两次一次或每周两次给予。或者，组合物大约每两周给予一次。在其它情况下，组合物每月给予一次。在其它情况下，组合物每两个月给予一次。在其它方面，组合物每6个月给予约1至3次。或者，本发明的组合物每年给予约1至12次，例如，每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次、每10个月一次、每11个月一次、或每12个月一次。
优选地，本文所述的组合物，例如PEG化艾塞那肽，在体内具有增加的半衰期，例如至少2小时至200小时。例如，PEG化艾塞那肽在体内的半衰期为2小时、6小时、12小时、20小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、88小时、100小时、112小时、124小时、150小时、175小时或200小时。在一个示例性实施例中，本发明的组合物在非人灵长类动物体内的半衰期为88小时。
本文所述的组合物以0.001mg/kg至100mg/kg的剂量给予，例如0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg或100mg/kg。例如，组合物在啮齿类动物模型中以0.2mg/kg至20mg/kg的剂量给予。在人类中，组合物可以以0.001mg/kg至10mg/kg的剂量给予。
在一个方面，将本文所述的组合物给予于受试者1至20年，例如1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年或20年。任选地，本文所述的组合物给予10年。在一个方面，治疗效果持续至少1年。
优选地，本文所述的组合物保护免受与α-突触核蛋白相关的多巴胺能神经元缺失的影响。在一个方面，本文所述的组合物保护免受阿尔茨海默病神经元中的淀粉样蛋白-β和/或tau蛋白毒性的影响。例如，本文所述的组合物保护免受与淀粉样蛋白斑和tau蛋白相关的神经元缺失的影响。在一个方面，本文所述的组合物相对于对照改善受试者的运动和认知以及记忆技能。在另一方面，本文所述的组合物相对于对照，在受试者中保护突触和/或突触功能，增强神经形成，减少细胞凋亡，保护神经元免受氧化应激的影响，减少斑块形成并预防慢性炎性反应。
本文还提供了包含长效胰高血糖素样肽1受体(GLP-1r)激动剂和一种或多种聚乙二醇(PEG)部分或其衍生物的组合物。在一些情况下，长效GLP-1r激动剂包含PEG化GLP-1类似物或其衍生物。在一些情况下，长效GLP-1r激动剂包含Fc融合GLP-1类似物或白蛋白融合GLP-1类似物或其衍生物。在一些情况下，GLP-1r激动剂是毒蜥外泌肽-4类似物和/或其衍生物。在一些情况下，毒蜥外泌肽-4类似物是肽。例如，肽包含序列：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID NO:1)。
在一个方面，PEG部分或衍生物选自由以下构成的群组：直链PEG、支链PEG、星形PEG、梳形PEG、树枝状PEG、PEG琥珀酰亚胺基丙酸酯、PEG N-羟基琥珀酰亚胺、PEG丙醛、PEG马来酰亚胺、直链甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)、支链mPEG、星形mPEG、梳形mPEG、树枝状mPEG、mPEG琥珀酰亚胺基丙酸酯、mPEG N-羟基琥珀酰亚胺、mPEG丙醛和mPEG马来酰亚胺。在一些情况下，支链PEG部分或衍生物包含单体、二聚和/或三聚PEG部分或其衍生物。在一些情况下，PEG部分或衍生物是三聚甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺。
在另一方面，PEG部分包含至少1,000道尔顿的PEG部分。在一些情况下，PEG部分包含1,000至1,000,000道尔顿范围内的PEG部分。在其它实例中，PEG部分包含10,000至500,000道尔顿范围内的PEG部分。在其它情况下，PEG部分包含20,000至250,000道尔顿范围内的PEG部分。在其它方面，PEG部分包含30,000至100,000道尔顿范围内的PEG部分。或者，PEG部分包含40,000至80,000道尔顿范围内的PEG部分。在一个示例性实施例中，本文所述的PEG化艾塞那肽是NLY001，即，用50,000道尔顿的PEG部分PEG化的艾塞那肽。
定义
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文使用，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。“约”可以理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之内。除非上下文另有说明，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。
“药剂”是指任何小化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。
“改变”是指通过本文所述的标准技术已知方法检测的基因或多肽的表达水平或活性的变化(提升或降低)。如本文使用，改变包括表达水平的至少1％的变化，例如，表达水平的至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的变化。例如，改变包括表达水平的至少5％至10％的变化，优选25％的变化，更优选40％的变化，最优选表达水平的50％或更大的变化。
“改善”是指减少、抑制、削弱、减弱、阻止或稳定疾病的发展或进展。
“结合至”分子是指对该分子具有物理化学亲和力。
与“包括”、“含有”或“其特征在于”同义的过渡术语“包含”是包含性的或开放式的，并且不排除其它未列举的元素或方法步骤。相反，过渡短语“由……组成”排除了权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。过渡短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤以及要求保护的发明的“对基本和新颖特征没有实质影响的那些”。
“对照”或“参考”是指比较标准。如本文使用，“与对照相比变化的”样品或受试者被理解为具有与来自正常、未治疗或对照样品的样品在统计学上不同的水平。对照样品包括例如培养中的细胞、一个或多个实验室测试动物或一个或多个人类受试者。选择和测试对照样品的方法在本领域技术人员的能力范围内。分析物可以是由细胞或有机体特征性表达或产生的天然存在的物质(例如，抗体、蛋白质)或由报道基因构建体产生的物质(例如，β-半乳糖苷酶或荧光素酶)。根据用于检测的方法，变化的量和测量值可以不同。统计显著性的确定在本领域技术人员的能力范围内，例如，与相当于是阳性结果的平均值的标准偏差的数量。
“检测”是指标识待检测分析物的存在、不存在或量。
如本文使用，术语“诊断”是指对病理或症状进行分类，确定病理的严重性(例如，等级或阶段)，监测病理进展，预测病理结果和/或确定恢复前景。
术语“有效量”和“治疗有效量”的制剂或制剂组分是指提供所需的效果的足够量的单独或组合的制剂或组分。例如，“有效量”是指相对于未治疗的患者，改善疾病(例如，前列腺癌)的症状所需的单独或组合的化合物的量。用于实施本发明以治疗疾病的活性化合物的有效量根据受试者的给药方式、年龄、体重和一般健康状况而不同。最终，主治医师或兽医将决定适当的量和剂量方案。该量称为“有效”量。
“片段”是指多肽或核酸分子的一部分。该部分优选含有参考核酸分子或多肽的全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可以含有10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个核苷酸或氨基酸。
术语“分离的(isolated)”、“纯化的”或“生物纯的”是指以不同程度不含组分的材料(该等组分通常伴随于天然状态下的该材料)。“分离(isolate)”表示与原始来源或环境的分离程度。“纯化”表示高于分离(isolation)的分离程度。
“长效GLP-1r激动剂”是指GLP-1r激动剂，其有效至少一小时、至少六小时、至少十二小时、至少一天、至少两天、至少一周、至少两周、至少一个月或至少两个月。
“标记”是指具有与疾病或病症相关的表达水平或活性改变的任何蛋白质或多核苷酸。
“调节”是指改变(增加或减少)。这种改变通过诸如本文所述的标准技术已知方法检测。
“神经退行性疾病或病症”是指神经元结构或功能逐步缺失(包括神经元的死亡)的一般术语。许多神经退行性疾病包括由于神经退行性过程而引起的肌萎缩侧索硬化症、帕金森氏症、阿尔茨海默病和亨廷顿舞蹈病。这些疾病是无法治愈的，从而导致神经元细胞的进行性变性和/或死亡。
术语“正常量”是指已知未被诊断患有疾病或病症的个体中的复合物的正常量。可以利用诸如参考限制、鉴别限制或风险定义阈值来定义截止点和异常值(例如，针对前列腺癌)在测试样品中测量分子的量并与“正常对照水平”进行比较。“正常对照水平”是指通常在已知未患前列腺癌的受试者中发现的一种或多种蛋白质(或核酸)或组合蛋白质指数(或组合核酸指数)的水平。这种正常对照水平和截止点可以基于分子是单独使用还是在将其它蛋白质组合成指数的公式中使用而不同。或者，正常对照水平可以是来自先前测试的受试者的蛋白质模式的数据库，该等受试者在临床相关时间范围内未转化为疾病或病症。
确定的水平可以与控制水平或截止水平或阈值水平相同，或者可以相对于控制水平或截止水平或阈值水平提升或降低。在一些方面，对照受试者是相同物种、性别、种族\年龄组\吸烟状态、身体质量指数(BMI)、当前治疗方案状态、病史或其组合的匹配对照，但不同于被诊断为对照没有患有所述疾病或没有患该疾病的风险的受试者。
相对于对照水平，确定的水平可以是提升的水平。如本文使用，术语相对于水平(例如，表达水平、生物活性水平等)的“提升”是指高于对照水平的任何％的提升。相对于对照水平，提升的水平可以是至少或大约1％的提升、至少或大约5％的提升、至少或大约10％的提升、至少或大约15％的提升、至少或大约20％的提升、至少或大约25％的提升、至少或大约30％的提升、至少或大约35％的提升、至少或大约40％的提升、至少或大约45％的提升、至少或大约50％的提升、至少或大约55％的提升、至少或大约60％的提升、至少或大约65％的提升、至少或大约70％的提升、至少或大约75％的提升、至少或大约80％的提升、至少或大约85％的提升、至少或大约90％的提升或至少或大约95％的提升。
相对于对照水平，确定的水平可以是降低的水平。如本文使用，术语相对于水平(例如，表达水平、生物活性水平等)的“降低”是指低于对照水平的任何％的降低。相对于对照水平，降低的水平可以是至少或大约1％的降低、至少或大约5％的降低、至少或大约10％的降低、至少或大约15％的降低、至少或大约20％的降低、至少或大约25％的降低、至少或大约30％的降低、至少或大约35％的降低、至少或大约40％的降低、至少或大约45％的降低、至少或大约50％的降低、至少或大约55％的降低、至少或大约60％的降低、至少或大约65％的降低、至少或大约70％的降低、至少或大约75％的降低、至少或大约80％的降低、至少或大约85％的降低、至少或大约90％的降低或至少或大约95％的降低。
短语“药学上可接受的载体”是本领域公认的并且包括适于将本发明的化合物给予哺乳动物的药学上可接受的材料、组合物或载剂。载体包括液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其涉及将主体药剂从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一个器官或身体的另一部分。在与制剂的其它成分相容并且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二元醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和药物制剂中使用的其它无毒相容物质。
“蛋白质”或“多肽”或“肽”是指任何多于两个天然或非天然氨基酸的链，无论是否翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)，相当于如本文所述的天然存在的或非天然存在的多肽或肽的全部或部分。
“纯化的”或“生物纯的”核酸或蛋白质充分地不含其它材料，使得任何杂质不会实质上影响蛋白质的生物学特性或造成其它不利后果。也就是说，如果本发明的核酸或肽在通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或在化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质，则本发明的核酸或肽是纯化的。纯度和均匀性通常使用分析化学技术确定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。对于可以进行修饰(例如，磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离蛋白质，其可以单独纯化。
“基本上纯的”是指已经与天然伴随的组分分离的核苷酸或多肽。通常，核苷酸和多肽在其为至少60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％(按重量计)时是基本上纯的，不含蛋白质和天然地与其相关的天然存在的有机分子。
本文提供的范围被理解为该范围内的所有值的简写。例如，1至50的范围应理解为包括选自群组的任意数字、数字组合或子范围，该群组由以下构成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50以及上述整数之间的所有中间小数值，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，特别考虑从该范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。例如，1至50的示例性范围的嵌套子范围可以包括一个方向上的1至10、1至20、1至30和1至40，或者另一个方向上的50至40、50至30、50至20和50至10。
“减少”是指至少1％的负向变化，例如，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
“参考”是指标准或对照条件。
“参考序列”是用作序列比较或基因表达比较的基础的定义序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，一段全长cDNA或基因序列，或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度通常为至少约16个氨基酸，优选至少约20个氨基酸，更优选至少约25个氨基酸，甚至更优选约35个氨基酸、约50个氨基酸或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度通常为至少约40个核苷酸，优选至少约60个核苷酸，更优选至少约75个核苷酸，甚至更优选约100个核苷酸或约300或约500个核苷酸或在其上下或其之间的任何整数。
如本文使用，如“获得药剂”中的“获得”包括合成、购买或以其它方式获取药剂。
“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、犬科动物、绵羊属动物或猫科动物。受试者优选是需要治疗的哺乳动物，例如已被诊断患有疾病或具有该疾病易感性的受试者。哺乳动物是任何哺乳动物，例如人、灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马以及为食物消费而饲养的牲畜或动物，例如牛、绵羊、猪、鸡和山羊。在一个优选的实施例中，哺乳动物是人。
“基本上相同的”是指表现出与参考氨基酸序列(例如，本文所述的氨基酸序列中的任何一种)或核酸序列(例如，本文所述的核酸序列中的任何一种)至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，这种序列与用于比较的序列相比在氨基酸水平或核酸上有至少60％、更优选80％或85％、更优选90％、95％或甚至99％的同一性。
如本文使用的术语“样品”是指为了体外评价而获得的生物样品。关于本文公开的方法，样品或患者样品优选地可以包含任何体液或组织。在一些实施例中，体液包括但不限于从受试者获得的血液、血浆、血清、淋巴液、母乳、唾液、粘液、精液、阴道分泌物、细胞提取物、炎性积液、脑脊髓液、粪便、玻璃体液或尿液。在一些方面，样品是血液样品、血浆样品、血清样品和尿液样品中的至少两种的复合板。在示例性方面，样品包含血液或其部分(例如，血浆、血清、经由白细胞去除术获得的部分)。优选的样品是全血、血清、血浆或尿液。样品也可以是组织或体液的部分纯化的部分。
参考样品可以是来自没有疾病或病状液的供体或来自患有疾病或病状的受试者的正常组织的“正常”样品。参考样品也可以来自未治疗的供体或未用活性剂治疗的细胞培养物(例如，不治疗或仅给予载剂)。参考样品也可以在使细胞或受试者与待测试的药剂或治疗干预物接触之前或在前瞻性研究开始时在“零时间点”抽取。
“特异性结合”是指识别和结合本发明的多肽但基本上不识别和结合样品(例如，天然包含本发明的多肽的生物样品)中其它分子的化合物或抗体。
如本文使用的术语“受试者”包括易患所指示病症的动物界中的所有成员。在一些方面，受试者是哺乳动物，并且在一些方面，受试者是人。该方法也适用于伴侣动物，例如狗和猫以及牲畜，例如牛、马、绵羊、山羊、猪和其它家养和野生动物。
“患有或疑似患有”特定疾病、病状或综合征的受试者具有足够数量的风险因素或具有足够数量的疾病、病状或综合征的体征或症状或其组合，使得有能力的个体会诊断或怀疑受试者患有疾病，病状或综合症。用于标识患有或疑似患有与心脏病、神经退行性病症等相关的病症的受试者的方法在本领域技术人员的能力范围内。患有和疑似患有特定疾病、病状或综合征的受试者不一定是两个不同的群体。
如本文使用，“易于患有”或“易患”或“易感于”特定疾病或病状或“有患特定疾病或病状的风险”是指基于遗传、环境、健康和/或其它风险因素而比一般人群更容易患上疾病或病状的个体。患上疾病的可能性的增加可以是约10％、20％、50％、100％、150％、200％或更多的增加。
“基本上相同的”是指表现出与参考氨基酸序列(例如，本文所述的氨基酸序列中的任何一种)或核酸序列(例如，本文所述的核酸序列中的任何一种)至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，这种序列与用于比较的序列相比在氨基酸水平或核酸上有至少60％、更优选80％或85％、更优选90％、95％或甚至99％的同一性。
本文使用的术语“治疗(treat/treating/treatment)”等是指将药剂或制剂给予患有不良病状、病症或疾病的有临床症状的个体，以便实现症状的严重性和/或频率的降低，消除症状和/或其根本原因，和/或促进损伤的改善或补救。应当理解，尽管不排除，但治疗病症或病状不需要完全消除与其相关的病症、病状或症状。
术语“PEG化”是指聚乙二醇(PEG)聚合物链与分子和宏观结构(例如，药物、治疗性蛋白质或囊泡)的共价和非共价连接或融合的过程。
术语“预防(prevent/preventing/prevention)”、“预防性治疗”等是指将药剂或组合物给予无临床症状的个体(该个体有患特定不利的病状、病症或疾病的风险，易于患有或易感于特定不利的病状、病症或疾病)，并且因此涉及预防症状和/或其根本原因的发生。
在一些情况下，口服或全身给予本发明的组合物。其它给药方式包括直肠途径、局部途径、眼内途径、口腔途径、阴道内途径、脑池内途径、脑室内途径、气管内途径、鼻腔途径、透皮途径、植入物内/植入物上途径或肠胃外途径。术语“肠胃外”包括皮下、鞘内，静脉内、肌内、腹腔内或输注。静脉内或肌内途径不特别适合于长期治疗和预防。但是，在紧急情况下，它们可能是优选的。可以将包含本发明的组合物的组合物加入到生理流体，例如血液中。由于对患者的方便性以及给药方案，口服给药对于预防性治疗可以是优选的。肠胃外方式(皮下或静脉内)可能对于更急性的疾病或对于由于胃肠不耐受、肠梗阻或其它危重疾病而不能耐受肠内给药的患者的治疗而言是优选的。吸入治疗可能最适合肺血管疾病(例如，肺动脉高压)。
药物组合物可以组装成试剂盒或药物系统，用于阻滞快速分裂细胞(例如，癌细胞)中的细胞周期。根据本发明该方面的试剂盒或药物系统包括载体装置，例如盒子、纸盒、管，其中具有紧密限制的一个或多个容器装置，例如小瓶、管、安瓿瓶、瓶子、注射器或袋。本发明的试剂盒或药物系统还可以包含使用该试剂盒的相关说明书。
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文使用，术语“或”应理解为包括性的。除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文使用，术语“一个(a/an)”和“该(the)”应理解为单数或复数。
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文使用，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之内。除非上下文另有说明，否则本文提供的所有数值均由术语约修饰。
本文中对变量的任何定义中的化学基团列表的叙述包括将该变量的定义包括为任何单个基团或所列基团的组合。本文中对变量或方面的实施例的叙述将该实施例包括为任何单个实施例或与任何其它实施例或其部分组合。
“治疗有效量”是足以产生有益或所需结果(包括临床结果)的量。有效量可以在一次或多次给药中给予。
本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的任何其它组合物和方法中的一种或多种组合。
本发明的其它特征和优点将从以下对其优选实施例的描述和权利要求中变得显而易见。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请均通过引用并入本文。由本文引用的入藏号表示的Genbank和NCBI提交内容通过引用并入本文。本文引用的所有其它公开的参考文献、文件、手稿和科学文献通过引用并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的而不是限制性的。
附图说明
图1描绘了NLY001(PEG化艾塞那肽)的药代动力学(PK)曲线。图1示出了在食蟹猴中皮下给予的艾塞那肽和NLY001的PK曲线(n＝2)。t1/2：半衰期，MRT：平均停留时间。艾塞那肽和Olaedin的半衰期分别为2.7±0.9小时和88.0±10.9小时。艾塞那肽和Olaedin的平均停留时间分别为2.5±0.3小时和114.0±17.5小时。
图2是一系列条形图，示出了(图2A)α-突触核蛋白PFF激活的原代小胶质细胞(n＝4)以及来自健康者与患有(图2B)帕金森病(n＝10)和(图2C)阿尔茨海默病(n＝6)的患者的人死后脑组织中的mRNA GLP-1r表达谱。*P<0.05，***P<0.001。
图3是示出了激活的小胶质细胞-神经元共培养实验的示意图。在有或没有NLY001的情况下通过α-突触核蛋白激活原代小胶质细胞，并且将小胶质细胞与原代神经元共培养72小时，然后进行神经元死亡测定。
图4A和图4B是示出了时间线的图，该时间线描绘了互补PD小鼠模型(图4A)α-突触核蛋白PFF诱发的PD模型和(图4B)A53Tα-突触核蛋白转基因PD模型)中的实验策略。
图5是一系列显微照片，示出了在α-突触核蛋白PFF诱发的PD小鼠中的NLY001治疗显著地抑制了大脑中的α-突触核蛋白累积。图5示出了对于脑组织的α-突触核蛋白LB(棕色，箭头)具有选择性的抗体的免疫染色。
图6示出了使用PBS或NLY001的hA53Tα-突触核蛋白转基因(Tg)PD小鼠的卡普兰-梅尔存活曲线分析。在6月龄时用载剂(PBS)或NLY001治疗小鼠。
图7示出了时间线，该时间线描绘了AD小鼠模型中的实验策略。
图8是示出了NLY001治疗3xTg-AD小鼠的Morris水迷宫(MWM)测试结果的图。±S.E.M，每组n＝7只小鼠。###P<0.001相对于WT+PBS组。**P<0.01，**P<0.001相对于3xTg AD+PBS。
图9是一系列图像，示出了用载剂(PBS)或NLY001治疗的野生型(WT)和3xTg-AD小鼠的代表性视频跟踪。
具体实施方式
神经退行性疾病包括由神经元的结构或功能的逐步缺失(包括神经元的死亡)诱发的一系列病状。由于神经退行性过程，出现了多种神经退行性疾病，包括帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和亨廷顿舞蹈病(HD)。
帕金森病(PD)是一种迟发型进行性神经退行性病症，影响约一百万美国人和全世界700万至一千万人。尽管多巴胺替代减轻了症状性运动功能障碍，但随着疾病的进展，其有效性降低，导致不可接受的副作用，例如严重的运动波动和运动障碍。此外，这种姑息治疗方法没有解决该疾病的潜在机制(Nagatsua,T.和M.Sawadab，《帕金森病及其相关病症(Parkinsonism Relat Disord)》，2009.15附刊1：p.S3-8)。
阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经退行性疾病之一，占全世界80％以上的痴呆病例。它导致精神、行为、功能衰退和学习能力的逐步缺失(Anand R等人，《神经药理学(Neuropharmacology)》，2014.76 Pt A：27-50)。当前批准的治疗，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂，仅提供症状改善，但不改变疾病过程。包括基于淀粉样蛋白和基于tau蛋白的疗法的多种新策略处于临床开发状态，然而，还没有药物在人类中证明具有明显的疗效。
随着人们的寿命延长，越来越多的人患有这些常见的、使人衰弱的神经系统病症。在本文所述的发明之前，尚未标识出可以治疗疾病或阻止该疾病在人类中进展的经证实的神经保护疗法。因此，对治疗这种无情的进行性慢性病症的治疗策略存在实质性的未满足的需求。
在本文描述的发明之前，神经退行性病症的致病机制是复杂的并且在很大程度上是未知的。在与神经退行性病症病理学相关的许多因素中，小胶质细胞和神经炎症被认为是该病症的重要起因之一(Sanchez-Guajardo等人，《神经科学(Neuroscience)》，2015.302：47-58)。在PD和AD的背景下，已经讨论了激活的小胶质细胞的主要有害作用。在大脑疾病进展期间，静息小胶质细胞经历激活并直接或通过释放包括促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-6或C1q)的毒性分子经由星形胶质细胞激活而引起神经炎症和神经元损伤(Hirsch EC等人《柳叶刀神经病学杂志(LancetNeurol)》，2009.8：382-397；Saijo K等人《细胞(Cell)》，2009.137：47-59；Farber K等人，《神经科学研究杂志(J Neurosci Res)》，200.87(3)：644-652)。本质上，激活的小胶质细胞和反应性星形胶质细胞是神经退行性疾病的主要上游靶标。因此，设计能够阻断小胶质细胞激活并关闭毒性分子的释放而没有脱靶毒性的高选择性药剂可以在神经退行性疾病中产生显著的治疗效果。然而，缺少选择性地靶向激活的小胶质细胞而没有大脑副作用的有效方法阻碍了该策略。
在本文描述的发明之前，需要预防、停止和/或改善神经退行性疾病的疗法。因此，本发明的一个目的是提供用于治疗和预防神经退行性疾病而没有脱靶毒性的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供用于阻断或减少神经退行性疾病中的小胶质细胞激活同时使正常细胞不受伤害的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供用于阻断或减少神经退行性疾病中的反应性星形胶质细胞同时使正常细胞不受伤害的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供用于在神经退行性疾病中保护神经元免受激活的小胶质细胞和/或反应性星形胶质细胞的影响同时使正常细胞不受伤害的组合物和方法。
因此，本发明至少部分地基于使用在大脑中具有高生物活性的长效GLP-1r(胰高血糖素样肽1受体)激动剂治疗帕金森病(PD)和阿尔茨海默病(AD)的组合物和方法的开发。特别地，如本文所述，与现有治疗相比，PEG化形式的GLP-1类似物(例如，艾塞那肽)表现出具有更长半衰期的疾病改善作用。这允许在治疗患有PD和/或AD或有患PD和/或AD的风险的受试者方面较不频繁的给药和更好的患者依从性。
在存在或不存在一种或多种其它非神经病状的情况下，受试者可能患有PD或AD或有患PD或AD的风险。非神经病状包括1型糖尿病、2型糖尿病、增殖性疾病(例如，癌症)、自身免疫疾病和其它局部或全身性疾病(例如，炎症和感染)。
如本文所述，本发明包括一种在PD和AD中具有疾病改善作用的可注射的(例如，每周一次或每月一次)基于肽的药物。艾塞那肽是FDA批准的肽
Figure BDA0001769265350000151
和胰高血糖素样肽1受体(GLP-1r)激动剂，最近在一些PD患者中进行了研究，结果显示运动和认知症状得到改善，表明潜在的PD治疗(Aviles-Olmos,I.等人，《临床研究杂志(J Clin Invest)》，2013.123(6)：p.2730-6；Simuni,T.和P.Brundin，《帕金森病杂志(J Parkinsons Dis)》，2014.4(3)：p.345-7)。如下文详细描述，应用该胰高血糖素样肽1受体(GLP-1r)激动剂的基本原理基于证明GLP-1r激动剂介导的神经保护作用的实验研究，该神经保护作用在神经变性动物模型中促进功能上有益的神经可塑性。艾塞那肽的临床结果甚至在给药后一年也显示运动和认知症状得到改善(Aviles-Olmos,I.等人，《临床研究杂志(J Clin Invest)》，2013.123(6)：p.2730-6；Simuni,T.和P.Brundin，《帕金森病杂志(J Parkinsons Dis)》，2014.4(3)：p.345-7)。在2期临床试验中正在研究艾塞那肽治疗PD的能力。然而，艾塞那肽具有短半衰期(人t1/2为2小时或更短)并且需要每日两次皮下(s.c.)注射，这对PD患者来说是不方便和困难的，特别是在晚期阶段。本文所述的组合物提供与PD中艾塞那肽相似的药理学益处，并且给药频率降低，例如每月一次给药。
艾塞那肽(毒蜥外泌肽-4)是GLP-1r的肽激动剂，促进2型糖尿病(T2D)中的胰岛素释放，目前作为针对T2D的
Figure BDA0001769265350000152
在市场上出售(Meier,J.J.，《自然评论内分泌学(NatRev Endocrinol)》，2012.8(12)：p.728-42)。该肽以葡萄糖依赖性方式管理胰岛素释放，因此对于非糖尿病患者是安全的。艾塞那肽还减少了一系列神经退行性过程(Holscher,C.，《内分泌学杂志(J Endocrinol)》，2014.221(1)：p.T31-41)。在临床前模型中，艾塞那肽穿过血脑屏障(BBB)，保护AD中的记忆形成或PD中的运动活动，保护突触和突触功能，增强神经形成，减少细胞凋亡，保护神经元免受氧化应激的影响，以及减少斑块形成和AD和PD小鼠模型大脑的慢性炎症反应。在最近的临床试验中，用艾塞那肽治疗12个月的中度晚期PD患者表现出改善的运动和认知症状，并且在治疗结束后长达12个月仍然存在效果(Aviles-Olmos,I.等人，《临床研究杂志(J Clin Invest)》，2013.123(6)：p.2730-6；Simuni,T.和P.Brundin，《帕金森病杂志(J Parkinsons Dis)》，2014.4(3)：p.345-7)。
短效GLP-1r激动剂(艾塞那肽和利拉鲁肽)在PD和AD的基于毒素的急性动物模型中表现出神经保护作用(Holscher,C.，《内分泌学杂志(J Endocrinol)》，2014.221(1)：p.T31-41)。应该注意的是，没有一种GLP-1r激动剂在临床相关的遗传性α-突触核蛋白相关的PD动物模型中显示出抗PD疗效。在AD中，短效GLP-1r激动剂在基于毒素的AD模型中显示出神经保护特性，但其在遗传性AD转基因(Tg)小鼠中的抗AD效果是有争议的。例如，在长期治疗后，利拉鲁肽在基于毒素的模型中显示出抗PD疗效，但未能在遗传性AD Tg小鼠模型中显示出类似的效果(Hansen HH等人，《公共科学图书馆综合(PLoS One)》.2016,11(7)：e0158205)。通常，仅在毒素诱发的神经退行性疾病模型中证实有效的化合物在临床试验中经常失败。最近，据报道，在长期治疗后，利拉鲁肽未能改变AD患者的认知评分。总之，这意味着需要在与PD(α-突触核蛋白PD表型)或AD(淀粉样蛋白和tau蛋白表型)病理生物学相关的临床相关模型中具有强治疗功效的替代GLP-1r激动剂，以保证在患者中成功进行临床试验。本文所述的组合物在α-突触核蛋白相关的PD模型和3xTg-AD模型中提供长效GLP-1r激动剂的强抗PD和抗AD治疗功效，该α-突触核蛋白相关的PD模型和3xTg-AD模型被认为分别代表PD和AD的神经退行性过程的近似模型。
与其它肽类药物一样，艾塞那肽在血流中固有地短暂且不稳定，因此需要频繁注射。尽管PEG化是延长蛋白质药物半衰期的黄金标准方法(Harris,J.M.和R.B.Chess，《自然评论药物发现(Nat Rev Drug Discov)》，2003.2(3)：p.214-21)，但它通常不适用于较小的肽类药物，因为与大PEG分子的缀合通常会降低肽的生物活性(例如，相对于天然肽，降低至低于1％生物活性)。如本文详细描述，为了允许有效和长效肽，开发了独特的PEG化技术，其延长了短效肽的循环半衰期，同时保留了艾塞那肽的治疗活性(专利公开WO2013002580和US20130217622，通过引用并入本文)。NLY001是一种使用这种PEG化技术的长效形式的艾塞那肽，正在作为每周一次、每两个月一次或每月一次的T2D治疗进行研究(图1)，其与在市场上出售的其它GLP-1r激动剂相比具有令人满意的效果。
NLY001作为长效PEG化形式的艾塞那肽，具有延长的半衰期(在灵长类动物中88小时)。NLY001的长效特征是通过独特的半衰期延伸技术设计的，该技术仍然允许组合物遵循与艾塞那肽相同的靶标和作用机制。除了通过刺激GLP-1r促进T2D患者中的胰岛素释放之外，GLP-1r的肽激动剂艾塞那肽延迟了许多神经退行性过程(Holscher,C.，《内分泌学杂志(J Endocrinol)》，2014.221(1)：p.T31-41)。该肽以葡萄糖依赖性方式管理胰岛素释放，因此对于非糖尿病患者是安全的。
作为一种基于长效艾塞那肽的治疗方法，与艾塞那肽相比，NLY001提供了改进的药物递送方法，同时保持了其药理作用。例如，如下文详细描述，类似于艾塞那肽，NLY001改善了PD中的运动和认知症状。与本文所述的发明之前标识的艾塞那肽疗法不同，NLY001通过单次注射或每两个月一次的注射递送给患者，从而避免了每日多次注射并改善了对治疗的依从性。
因为NLY001具有与小的艾塞那肽(～4,000Da)缀合的大分子量聚(乙二醇)聚合物(PEG，50,000Da)，所以与PD和AD中的艾塞那肽类似的药理学功效完全出乎意料，因为可能无法穿过血脑屏障(BBB)(Pardridge,W.M.，《神经治疗方案(NeuroRx)》，2005.2(1)：p.3-14)。如下文详细描述，意外地发现皮下给予的NLY001在PD和AD动物模型的大脑中显著更高地累积，并且在许多新建立的PD动物模型(也参见Luk,K.C.等人，《科学(Science)》，2012.338(6109)：p.949-53)和AD动物模型中显示出明显的有益效果。如下文详细描述，结果表明NLY001的给予保护免受α-突触核蛋白预先形成的原纤维(PFF)诱发的多巴胺能神经元缺失的影响，减少PFF诱发的路易体样病理，抑制PFF诱发的纹状体多巴胺终端密度的降低，恢复PFF诱发的行为缺陷，并延长Tg PD模型的寿命。重要的是，NLY001显著阻断了小胶质细胞激活并减少了大脑中反应性星形胶质细胞的形成。总之，下面详细描述的研究结果清楚地表明NLY001对α-突触核蛋白PFF诱发的行为缺陷具有有益的神经保护/疾病改善作用。同样，在Tg AD模型中，NLY001治疗改善了记忆障碍，减少了淀粉样蛋白聚集和tau蛋白形成(这是AD的标志)。与PD研究一致，NLY001显示出显著抑制的小胶质细胞激活和AD大脑中反应性星形胶质细胞的群体。
长效GLP-1r激动剂(如携带大分子量半衰期延长载体的GLP-1肽类似物)的抗PD疗效以前是未知的。本文所述的研究结果证明了长效GLP-1r激动剂在许多互补动物模型(在原纤维诱发的α-突触核蛋白病PD小鼠模型，A53Tα-突触核蛋白Tg小鼠模型和3xTg AD小鼠模型上预先形成的)中的抗PD和抗AD效果并阐明作用机制。长效艾塞那肽使PD和AD治疗发生革命性变化，同时大大提高了患者的依从性——每周一次或每月一次的治疗选择。引入注射频率低得多的基于艾塞那肽的治疗是患病患者和家属的有效治疗选择。
PD的发病机制归因于：1)由激活的小胶质细胞和反应性星形胶质细胞诱发的神经炎症和神经毒性，2)线粒体功能障碍，3)突触功能障碍，和4)较低水平的神经营养因子。尽管艾塞那肽的神经保护作用机制尚不确定，但越来越多的证据表明它调节/延迟了有助于PD的神经退行性过程的这些过程中的一些或全部。因此，如下文详细描述，NLY001也在这些途径中实现了有益的神经保护作用。如下所述，新建立的α-突触核蛋白PD小鼠模型和A53TTg PD小鼠模型的预先形成的原纤维(PFF)表现出异常水平的活性氧(ROS)(其导致氧化应激的增加和随后的线粒体功能障碍)，并通过细胞间传播途径重现PD样路易体(LB)病理学。所有这些过程都有助于PD的疾病过程。如本文详细描述，由于将NLY001给予于两个互补PD小鼠模型中保护免受与α-突触核蛋白相关的PD病理学的影响，因此NLY001也参与并控制这些途径。
包括PD和AD在内的神经退行性疾病的病因现在已经很明确。有证据表明神经退行性疾病的免疫激活增加。大多数研究集中于小胶质细胞和星形胶质细胞(大脑的常驻型固有免疫细胞)对PD和AD病理学的作用(Sanchez-Guajardo V等人《神经科学(Neuroscience)》.2015.302：47-58，Perry VH等人，《自然评论神经病学(Nat RevNeurol)》.2014.10：217-224)。响应于神经变性和异常聚集蛋白质(如α-突触核蛋白和β-淀粉样蛋白)的累积，静息小胶质细胞变为激活状态并释放各种细胞因子和神经毒性分子，包括驱动其增殖并激活星形胶质细胞(A1星形胶质细胞)的TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6和C1q。因此，由激活的小胶质细胞诱发的激活的小胶质细胞或反应性星形胶质细胞释放的这种炎性介质引起神经元损伤并促成神经退行性疾病的进展。因此，激活的小胶质细胞可被描述为神经退行性疾病的主要上游有害物质。在没有脱靶毒性的情况下抑制小胶质细胞激活是预防、停止和/或逆转神经变性过程的合理策略。然而，在本文描述的发明之前，缺乏特异性靶向小胶质细胞激活的翻译方法阻碍了该策略。例如，各种抗炎剂(包括NSAID(de Jong D等人《公共科学图书馆综合(PLoS One)》.2008.23：e1475)、罗格列酮(Gold M等人《痴呆及老年认知障碍(Dement Geriatr Cogn Disord)》.2010.30：131-146)、他汀类药物(FeldmanHH等人《神经病学(Neurology)》.2010.74：956-964)和泼尼松(Aisen PS等人《神经病学(Neurology)》.2000.54：588-593))的临床试验未能减缓AD的进展。令人失望的临床试验结果可能是由于有限的BBB通透性和/或对关键促炎和神经毒性细胞因子的抑制不足。
这些研究描述了一种独特的策略，可选择性地靶向和阻断小胶质细胞和星形胶质细胞激活以及炎性和神经毒性分子从激活的常驻型固有免疫细胞中的释放；从而预防、停止和/或改善神经退行性疾病的进展。出乎意料的是，发现由异常聚集蛋白质激活的小胶质细胞上调了GLP-1r，与激活小胶质细胞结合的长效GLP-1r激动剂显著抑制毒性分子(包括TNF-α、IL-1α，IL-1β、IL-6和C1q)的释放并保护神经元。令人惊讶的是，通过GLP-1r内化测定，发现长效GLP-1r激动剂表现出GLP-1r的缓慢内化，与短效GLP-1r激动剂(艾塞那肽和利拉鲁肽)相比降低了GLP-1r再循环的速率，因此可以连续激活GLP-1r并在大脑中诱发GLP-1r信号传导。用短效GLP-1r激动剂治疗的患者将经历“关闭时间”，这将在长期治疗期间损害治疗效果。相比之下，NLY001具有穿透BBB并在大脑中以连续方式激活GLP-1r而没有“关闭时间”且没有“脱靶”毒性的能力。长效GLP-1r激动剂的这种独特的特性对于最大化GLP-1r激动剂在神经退行性疾病中的协同抗炎和神经保护特性是至关重要的。
帕金森病
帕金森病(PD，也称为特发性或原发性帕金森病、运动功能减退强直综合征(HRS)或震颤性麻痹)是中枢神经系统的退行性病症，主要影响运动系统。帕金森病的运动症状是由于黑质(中脑区域)中多巴胺生成细胞的死亡所致。对这种细胞死亡的原因知之甚少。在疾病早期，最明显的症状是与运动有关；这些包括颤抖、强直、运动缓慢以及步行和步态困难。之后，可能会出现思维和行为问题，在疾病的晚期阶段通常会发生痴呆，并且抑郁症是最常见的精神症状。其它症状包括感觉、睡眠和情绪问题。帕金森病在老年人中更常见，大多数病例发生在50岁以后；当见于年轻人时，其被称为青少年型PD(YOPD)。
主要运动症状统称为“帕金森病”或“帕金森综合症”。该疾病可以是原发性或继发性的。原发性帕金森病被称为特发性帕金森病(没有已知原因)，尽管一些非典型病例具有遗传起因，而继发性帕金森病则由于已知原因(如毒素)。该疾病的病理学特征在于蛋白质在神经元中的路易体中的累积，以及在中脑的某些部分中多巴胺的形成和活性不足。路易体所在的位置通常与个体症状的表达和程度有关。典型病例的诊断主要基于症状，使用测试(如神经成像)进行确认。
帕金森病的诊断涉及医生记录病史并进行神经系统检查。没有实验室测试可以清楚地标识疾病，但脑部扫描有时用于排除可能引起类似症状的病症。人们可能会被给予左旋多巴，所引起的运动障碍的缓解往往可以确认诊断。尸检时中脑中路易体的研究结果通常被认为是患有帕金森病的证据。随着时间的推移，疾病的进展可能表明它不是帕金森病，有些当局建议定期审查诊断。可以继发地产生帕金森综合征的其它原因是阿尔茨海默病、多发性脑梗塞和药物诱发的帕金森病。必须排除帕金森叠加综合征，如进行性核上性麻痹和多系统萎缩。抗帕金森病的药物通常不能太有效地控制帕金森叠加综合征的症状。更快的进展率、早期认知功能障碍或姿势不稳定、发作时的最小震颤或对称性可能表明帕金森叠加疾病而不是PD本身。遗传形式通常被归类为PD，尽管术语家族性帕金森病(familialParkinson's disease/familial parkinsonism)用于具有常染色体显性遗传或隐性遗传模式的疾病实体。
PD学会大脑库标准要求运动缓慢(运动迟缓)加上强直、静止性震颤或姿势不稳定。在诊断PD之前，需要排除这些症状的其它可能原因。最后，在发病或进展期间需要三个或更多个以下特征：单侧发作、静止时震颤、时间进展、运动症状不对称、至少五年的对左旋多巴的反应、至少十年的临床过程和由摄入过量左旋多巴诱发的运动障碍的表现。在尸检时评估的诊断标准的准确性为75-90％，专家(如神经科医生)的准确率最高。PD患者的计算机断层扫描(CT)和常规磁共振成像(MRI)脑扫描通常表现正常。然而，这些技术可用于排除可能是帕金森病的继发性原因的其它疾病，例如基底神经节肿瘤、血管病变和脑积水。据报道，MRI、扩散MRI的特定技术可用于区分典型和非典型帕金森病，尽管其确切的诊断价值仍在研究中。可以用不同的PET和SPECT放射性示踪剂测量基底神经节中的多巴胺能功能。实例是用于SPECT或氟脱氧葡萄糖(18F)的碘氟潘(123I)(商品名DaTSCAN)和碘苯托烷(Dopascan)和用于PET的DTBZ。基底神经节中多巴胺能活性降低的模式可以帮助诊断PD。
治疗，通常是药物L-DOPA和多巴胺激动剂，改善疾病的早期症状。随着疾病的进展和多巴胺能神经元继续缺失，这些药物最终在治疗症状方面变得无效，同时产生以无意识的扭动运动为特征的并发症。在药物无效的严重病例中，手术和深部脑刺激已被用于减少运动症状作为最后的手段。尽管多巴胺替代减轻了症状性运动功能障碍，但随着疾病的进展，其有效性降低，导致不可接受的副作用，例如严重的运动波动和运动障碍。此外，没有可以阻止疾病的进展的疗法(Lang,A.E.和A.M.Lozano，《新英格兰医学期刊(N Engl JMed)》，1998.339(15)：p.1044-53；Lang,A.E.和A.M.Lozano，《新英格兰医学期刊(N Engl JMed)》，1998.339(16)：p.1130-43)。此外，这种姑息治疗方法没有解决该疾病的潜在机制(Nagatsua,T.和M.Sawadab，《帕金森病及其相关病症(Parkinsonism Relat Disord)》，2009.15附刊1：p.S3-8)。
术语帕金森病用于运动综合征，其主要症状是静止时震颤、僵硬、运动缓慢和姿势不稳定。帕金森综合征可以根据其起因分为四种亚型：原发性或特发性帕金森病、继发性或后天性帕金森病、遗传性帕金森病、以及帕金森叠加综合征或多系统变性。通常被归类为运动障碍，PD也会引起一些非运动类型的症状，如感觉缺陷、认知困难或睡眠问题。帕金森叠加疾病是表现出其它特征的原发性帕金森病。它们包括多系统萎缩、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性和路易体痴呆。
在病理生理学方面，PD被认为是由于路易体形式的大脑中α-突触核蛋白的异常累积而导致的突触核蛋白病，这与其它疾病(例如，阿尔茨海默病，其中大脑以神经原纤维缠结形式累积tau蛋白)相反。然而，在tau蛋白病和突触核蛋白病之间存在临床和病理学重叠。阿尔茨海默病最典型的症状是痴呆，发生在PD的晚期，而在受PD影响的大脑中常见的是神经原纤维缠结。路易体痴呆(DLB)是另一种与PD有相似性(尤其与患有痴呆的PD病例的亚组有相似性)的突触核蛋白病。然而，PD和DLB之间的关系很复杂，仍有待澄清。它们可能表示连续病症的一部分，也可能是不同的疾病。
已经最终证明特定基因的突变导致PD。这些基因编码α-突触核蛋白(SNCA)、帕金蛋白(PRKN)、富亮氨酸重复激酶2(LRRK2或震颤素)、PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)、DJ-1和ATP13A2。在大多数情况下，具有这些突变的人会患上PD。然而，除LRRK2外，它们仅占PD病例的一少部分。最广泛研究的PD相关基因是SNCA和LRRK2。已经发现包括SNCA、LRRK2和葡糖脑苷脂酶(GBA)的基因突变是散发性PD的风险因素。已知GBA中的突变会引起戈谢病。在散发病例中寻找具有低外显率的突变等位基因的全基因组关联研究现已获得许多正面成果。
SNCA基因在PD中有很重要的作用，因为α-突触核蛋白是路易体的主要成分。黑质和其它几个大脑区域的组织病理学(显微解剖学)显示出许多剩余神经细胞中的神经元缺失和路易体。神经元缺失伴随着星形胶质细胞(星状胶质细胞)的死亡和小胶质细胞(另一种胶质细胞)的激活。路易体是PD的关键病理特征。
阿尔茨海默病
阿尔茨海默病(AD)占痴呆病例的60％至70％。它是一种慢性神经退行性疾病，通常开始缓慢，但随着时间的推移逐渐恶化。最常见的早期症状是短期记忆缺失。随着疾病的进展，症状包括语言问题、情绪波动、动力缺失、定向障碍、行为问题以及自理能力管理不善。渐渐地，身体功能缺失，最终导致死亡。尽管进展速度可能不同，但诊断后的平均预期寿命为3至9年。对阿尔茨海默病的病因知之甚少。大约70％的风险被认为是许多基因相关的遗传风险。其它风险因素包括头部受伤、高血压或抑郁症的病史。疾病过程与大脑中的斑块和缠结有关。
阿尔茨海默病的特征在于大脑皮层和某些皮层下区域的神经元和突触的缺失。这种缺失导致受影响区域的严重萎缩，包括颞叶和顶叶、以及额叶皮层和扣带回的部分的变性。阿尔茨海默病被假设为蛋白质错误折叠疾病(蛋白质构象病)，由大脑中异常折叠的A-β和tau蛋白的累积引起。斑块由长度为39至43个氨基酸的小肽组成，称为β-淀粉样蛋白(也称为A-β或Aβ)。β-淀粉样蛋白是来自较大蛋白质的片段，该较大蛋白质被称为淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)，是一种穿透神经元膜的跨膜蛋白质。APP对神经元生长、存活和损伤后修复至关重要。在阿尔茨海默病中，一种未知的过程导致APP通过蛋白水解被酶分成较小的片段。这些片段中的一个产生β-淀粉样蛋白的原纤维，其形成团块，其沉积在称为老年斑的致密形成物中的神经元外部。
可能的诊断基于疾病的历史和通过医学成像和血液测试的认知测试来排除其它可能的原因。最初的症状经常被误认为正常衰老。需要对脑组织进行检查以确定诊断。阿尔茨海默病通过完整的医学评估来诊断。没有一项临床测试可以确定人是否患有阿尔茨海默病。通常进行几项测试以排除痴呆的任何其它原因。唯一确定的诊断方法是对活检或尸检中获得的脑组织进行检查。测试(如血液测试和脑成像)用于排除痴呆类似症状的其它原因。实验室测试和筛查包括：全血细胞计数；电解质检查；筛选代谢检查；甲状腺功能测试；维生素B-12叶酸水平；梅毒测试、和人类免疫缺陷抗体测试(根据病史)；尿液分析；心电图(ECG)；胸部X光；计算机断层扫描(CT)头部扫描；和脑电图(EEG)。腰椎穿刺也可以在整体诊断中提供信息。
没有降低风险的药物或补品。没有治疗可以阻止或逆转其进展，但有些可能会暂时改善症状。
GLP-1激动剂(例如，艾塞那肽)
艾塞那肽(市售为
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Bydureon)是胰高血糖素样肽-1激动剂(GLP-1激动剂)药物，属于肠促胰岛素模拟物组，于2005年4月批准用于2型糖尿病的治疗。在一天中的第一餐和最后一餐之前的60分钟内的任何时间，将
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形式的艾塞那肽作为腹部、大腿或手臂的皮下注射剂(在皮肤下)给予。于2012年1月27日批准了一种每周一次的注射剂，其商标为Bydureon。它由Amylin Pharmaceuticals制造并由Astrazeneca商业化。
艾塞那肽是毒蜥外泌肽-4的合成版本，毒蜥外泌肽-4是一种在吉拉毒蜥的唾液中发现的激素。它显示出类似于人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的生物学特性，GLP-1是葡萄糖代谢和胰岛素分泌的调节因子。根据包装说明书，艾塞那肽通过胰腺β细胞增强葡萄糖依赖性胰岛素分泌，抑制不当升高的胰高血糖素分泌并减缓胃排空，但作用机制仍在研究中。
艾塞那肽是一种由39个氨基酸形成的肽，是一种胰岛素促分泌素，具有葡萄糖调节作用。艾塞那肽的肽序列为：H(His)G(Gly)E(Glu)G(Gly)T(Thr)F(Phe)T(Thr)S(Ser)D(Asp)L(Leu)S(Ser)K(Lys)Q(Gln)M(Met)E(Glu)E(Glu)E(Glu)A(Ala)V(Val)R(Arg)L(Leu)F(Phe)I(Ile)E(Glu)W(Trp)L(Leu)K(Lys)N(Asn)G(Gly)G(Gly)P(Pro)S(Ser)S(Ser)G(Gly)A(Ala)P(Pro)P(Pro)P(Pro)S(Ser)(SEQ ID NO:1)。FDA于2005年4月28日将艾塞那肽批准用于其糖尿病不能通过其它口服药物得到很好控制的患者。使用填充式笔状装置每天两次皮下注射该药物。
肠促胰岛素激素GLP-1和葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(GIP)在摄入食物后由肠的L和K内分泌细胞产生。GLP-1和GIP刺激胰腺中胰岛的β细胞分泌胰岛素。只有GLP-1引起糖尿病状态的胰岛素分泌；然而，GLP-1本身作为糖尿病的临床治疗无效，因为它在体内具有非常短的半衰期。艾塞那肽与GLP-1具有50％的氨基酸同源性，并且其在体内具有更长的半衰期。因此，测试了其刺激哺乳动物的胰岛素分泌和降低血糖的能力，并且发现其在糖尿病状态下是有效的。在对啮齿动物的研究中，它也被证明可以增加胰腺中β细胞的数量。
在商业上，艾塞那肽通过直接化学合成产生。在历史上，艾塞那肽被发现为毒蜥外泌肽-4，一种在吉拉毒蜥的唾液中天然分泌的并在其尾部集中的蛋白质。毒蜥外泌肽-4与哺乳动物GLP-1具有广泛的同源性和功能，但在抗DPP-IV(其在哺乳动物中分解GLP-1)降解方面具有治疗优势，因此允许更长的药理学半衰期。毒蜥外泌肽-4的生化特征促成了将艾塞那肽视为并开发为糖尿病治疗策略。随后的临床测试发现了同样所需的胰高血糖素和食欲抑制作用。
以每日两次的
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形式，艾塞那肽迅速提高胰岛素水平(在给药后约十分钟内)，胰岛素水平在接下来的一两个小时内大幅度下降。餐后采用的剂量对血糖的影响远小于事先采用的剂量。六至八小时后对血糖的影响减弱。以
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形式，该药物有两种剂量：5mcg.和10mcg.。治疗通常以5mcg.剂量开始，如果不良反应不显著，则增加剂量。其每周一次的Bydureon形式不受注射和就餐之间的时间的影响。Bydureon的优势在于可以提供覆盖24小时的血糖降低，而
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的优势在于可以对餐后立即发生的血糖飙升进行更好的控制。根据Bydureon的FDA标签，Bydureon平均降低HbA1c血糖1.6％，而
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平均降低0.9％。
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和Bydureon都有类似的减肥效果。根据FDA批准的Bydureon标签，Bydureon患者的恶心水平低于
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患者。
在一些实施例中，本发明基于使用其它(非艾塞那肽)类型的长效GLP-1激动剂来治疗PD和AD。在一些情况下，长效GLP-1激动剂包含Fc-融合GLP-1(例如，度拉糖肽、艾本那肽(efpeglenatide))或其衍生物。在一些情况下，长效GLP-1激动剂包含白蛋白-融合GLP-1(例如，阿必鲁肽)或其衍生物。用于治疗PD或AD的Fc-融合GLP-1组合物的实例是度拉糖肽。度拉糖肽是一种可每周使用一次的胰高血糖素样肽1受体激动剂(GLP-1激动剂)，用于治疗2型糖尿病。度拉糖肽由与人IgG4的Fc片段共价连接的GLP-1(7-37)组成，从而保护GLP-1部分免受由二肽基肽酶4失活带来的影响。GLP-1是参与血液中葡萄糖水平(血糖过多)正常化的激素。GLP-1通常由胃肠粘膜的L细胞响应餐食而分泌。度拉糖肽与胰高血糖素样肽1受体结合，从而减缓胃排空并增强胰腺β细胞的胰岛素分泌。同时，该化合物通过抑制胰腺的α细胞来降低升高的胰高血糖素分泌(其被认为在糖尿病患者中是不当的)。用于治疗PD或AD的白蛋白-融合的GLP-1组合物的实例是阿必鲁肽。阿必鲁肽是一种胰高血糖素样肽-1激动剂(GLP-1激动剂)药物，用于治疗2型糖尿病。它是与人白蛋白融合的二肽基肽酶-4抗性胰高血糖素样肽-1二聚物。阿必鲁肽的半衰期为四至七天。
聚乙二醇(PEG)
聚乙二醇(PEG)是一种聚醚化合物，具有从工业制造到医学的许多用途。PEG的结构是(注意括号中的重复元素)：H-(O-CH2-CH2)n-OH PEG也称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)，这取决于其分子量。PEG、PEO或POE是指环氧乙烷的低聚物或聚合物。这三个名称在化学上是同义词，但在历史上，PEG在生物医学领域是优选的，而PEO在聚合物化学领域更为普遍。由于不同的用途需要不同的聚合物链长，PEG倾向于指分子质量低于20,000g/mol的低聚物和聚合物，PEO指分子质量高于20,000g/mol的聚合物，POE指任何分子质量的聚合物。PEG和PEO是液体或低熔点固体，取决于它们的分子量。PEG通过环氧乙烷的聚合制备，并且其可市售的分子量范围广泛(300g/mol至10,000,000g/mol)。虽然具有不同分子量的PEG和PEO可用于不同的用途并且由于链长效应而具有不同的物理特性(例如，粘度)，但它们的化学特性几乎相同。取决于用于聚合过程的引发剂，也可获得不同形式的PEG——最常见的引发剂是单官能甲基醚PEG或甲氧基聚(乙二醇)，缩写为mPEG。较低分子量的PEG也可以作为较纯的低聚物使用，称为单分散、均匀或离散PEG。最近已经证明非常高纯度的PEG是结晶的，从而允许通过X射线衍射来确定晶体结构。由于纯低聚物难于纯化和分离，因此该质量类型的价格通常是多分散PEG的10至1000倍。
PEG也可具有不同的几何形状。支链PEG具有从中心核心基团散发出的三至十个PEG链。星形PEG具有从中心核心基团散发出的10至100个PEG链。梳状PEG具有通常接枝到聚合物主链上的多个PEG链。通常包含在PEG名称中的数字表示它们的平均分子量(例如，具有n＝9的PEG将具有约400道尔顿的平均分子量，并且将被标记为PEG400。大多数PEG包括具有的分子量分布的分子(即它们是多分散的)。尺寸分布可以通过其重均分子量(Mw)和其数均分子量(Mn)在统计学上表征，其比率称为多分散指数(Mw/Mn)。MW和Mn可通过质谱法测量。
PEG化是将PEG结构与另一种较大分子共价偶联的行为，该较大分子例如治疗性蛋白质，其在共价偶联后被称为PEG化蛋白质。PEG化干扰素α-2a或-2b是丙型肝炎感染的常用可注射治疗。PEG可溶于水、甲醇、乙醇、乙腈、苯和二氯甲烷，并且不溶于乙醚和己烷。它与疏水性分子偶联以产生非离子表面活性剂。PEG含有潜在的毒性杂质，例如环氧乙烷和1,4-二恶烷。如果应用于受损皮肤，乙二醇及其醚是对肾脏有害处的。
当在生物医学应用中使用时，聚乙二醇(PEG)和相关聚合物(PEG磷脂构建体)通常用超声波降解。然而，PEG对超声波降解非常敏感，并且PEG降解产物可能对哺乳动物细胞有毒。因此，必须评估潜在的PEG降解，以确保最终材料不含有可能将伪影引入实验结果的无记载污染物。
PEG和甲氧基聚乙二醇的稠度在液体与固体之间变化，这取决于分子量，如名称后面的数字所表示。它们可以在许多商业上的应用中使用，包括用作表面活性剂、用于食品、用于化妆品、用于药剂学、用于生物医学、用作分散剂、用作溶剂、用于软膏、用于栓剂基质、用作片剂赋形剂以及用作轻泻剂。一些特定的组是聚桂醇、壬苯聚醇、辛苯聚醇和泊洛沙姆。
聚乙二醇通过环氧乙烷与水、乙二醇或乙二醇低聚物的相互作用产生。该反应由酸性或碱性催化剂催化。优选乙二醇及其低聚物作为起始材料而不是水，因为其允许产生具有低多分散性(窄分子量分布)的聚合物。聚合物链长取决于反应物的比率。
HOCH2CH2OH+n(CH2CH2O)→HO(CH2CH2O)n+1H
取决于催化剂类型，聚合机理可以是阳离子聚合或阴离子聚合。环氧乙烷的聚合是放热过程。
聚环氧乙烷或高分子量聚乙二醇通过悬浮聚合来合成。在缩聚过程中必须将增长的聚合物链保持在溶液中。该反应由镁-、铝-或钙-有机元素化合物催化。为了防止聚合物链从溶液中凝结，使用螯合添加剂(如二甲基乙二肟)。使用碱催化剂，如氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)或碳酸钠(Na2CO3)，来制备低分子量聚乙二醇。
PEG在许多药物产品中用作赋形剂。较低分子量的变体用作口服液体和软胶囊中的溶剂，而固体变体用作软膏基质、片剂粘合剂、薄膜包衣和润滑剂。PEG还用于润滑滴眼液。
聚乙二醇具有低毒性并且用于各种产品中。该聚合物用作水性和非水性环境中各种表面的润滑涂层。由于PEG是一种柔韧的水溶性聚合物，它可以用于产生非常高的渗透压(大约几十个大气压)。它还不太可能与生物化学品发生特定的相互作用。这些特性使PEG成为在生物化学和生物膜实验中施加渗透压的最有用的分子之一，特别是当使用渗透胁迫技术时。
PEG化(通常也称为peg化)是聚乙二醇(PEG)聚合物链与分子和宏观结构(例如，药物、治疗性蛋白质或囊泡)的共价和非共价连接或融合的过程，该药物、治疗性蛋白质或囊泡在此过程后被描述是PEG化的(peg化的)。通常通过将PEG的反应性衍生物与靶分子一起温育来实现PEG化。PEG与药物或治疗性蛋白质的共价连接可以“掩盖”药剂免受主体的免疫系统(降低的免疫原性和抗原性)的影响，并通过降低肾清除率来增加延长其循环时间的药剂的水动力学尺寸(溶液中的尺寸)。PEG化还可以为疏水性药物和蛋白质提供水溶性。
PEG化是将聚合物PEG的链连接到分子上的过程，该分子最通常是肽、蛋白质和抗体片段，其可以提高许多治疗的安全性和效率。它产生物理化学特性的改变，包括构象、静电结合、疏水性等的变化。这些物理和化学变化增加了治疗剂的全身保留。而且，它可以影响治疗部分与细胞受体的结合亲和力，并且可以改变吸收和分布模式。
PEG是特别有吸引力的缀合聚合物。与药物应用相关的PEG部分的具体特征是：水溶性、溶液中的高迁移率、无毒性和低免疫原性、易于从体内清除、以及体内分布的改变。
PEG化过程
PEG化第一步是PEG聚合物在一个或两个末端的合适官能化。在每个末端用相同的反应性部分激活的PEG被称为“同双官能”PEG，而如果存在的官能团不同，则PEG衍生物被称为“异双官能”或“异官能”PEG。制备PEG聚合物的化学活性或激活的衍生物以将PEG连接到所需分子上。
蛋白质缀合的总PEG化过程可大致分为两种类型，即溶液相分批过程和柱上补料分批过程。简单且通常采用的分批方法包括在合适的缓冲溶液中将试剂混合在一起，优选在介于4℃和6℃之间的温度下，然后基于其物理化学特性使用合适的技术分离和纯化所需产物，包括尺寸排阻色谱(SEC)、离子交换色谱(IEX)、疏水相互作用色谱(HIC)以及膜或水两相体系。
PEG衍生物的合适官能团的选择基于将与PEG偶联的分子上的可用反应基团的类型。对于蛋白质，典型的反应性氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。N-末端氨基基团和C-末端羧酸也可以通过与醛官能聚合物缀合而用作位点特异性位点。用于形成第一代PEG衍生物的技术通常使PEG聚合物与可与羟基基团反应的基团反应，所述基团通常是酸酐、氯化酰基、氯甲酸根和碳酸根。在第二代PEG化化学中，更有效的官能团(如醛、酯、酰胺等)可用于缀合。
随着PEG化应用变得越来越先进和复杂，对于缀合用异双官能PEG的需求也已增加。这些异双官能PEG在连接两个实体方面非常有用，其中需要亲水性、柔性和生物相容性间隔物。异双官能PEG的优选端部基团是马来酰亚胺、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、胺、羧酸和NHS酯。对于第三代peg化药剂，聚合物的形状已经分化，存在表现出粘度降低以及无器官累积的Y形或梳形聚合物。PEG化化合物清除时间的不可预测性可能导致肝脏中大分子量化合物的累积，导致无已知毒理学后果的包涵体。此外，链长的改变可能导致意外的体内清除时间。
GLP-1r激动剂(NLY001、PB-119、LY2428757)的PEG化
如下所述，可以经由选择性PEG化增加毒蜥外泌肽-4类似物(例如，艾塞那肽)或GLP-1类似物的产率，并且可以增加药物的治疗效果。这种技术增加了分子量、代谢位点的防御和免疫原性位点的抑制，从而增加了体内半衰期和稳定性并降低了免疫原性。此外，由于PEG增加了肽和蛋白质的分子量，与PEG结合的肽和蛋白质的肾脏排泄减少，因此PEG化具有在药代动力学和药效学上均增加效果的优点。
此外，根据本发明的聚乙二醇或其衍生物是直链型或支链型，并且对于支链型，优选可以使用二聚物型或三聚物型，更优选可以使用三聚物型。具体地，聚乙二醇衍生物例如是甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯、甲氧基聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺、甲氧基聚乙二醇丙醛、甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺或这些衍生物的多支链型。优选地，聚乙二醇衍生物是直链甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺、支链型甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺或三聚甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺，更优选三聚甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺。
如本文所述，在将毒蜥外泌肽-4类似物(例如，艾塞那肽)用聚乙二醇PEG化或制备其衍生物后，可以通过质谱仪、液相色谱、X射线衍射分析、旋光测定以及构成PEG化艾塞那肽的代表性元素的计算值与测量值之间的比较来确认类似物的分子结构。
当本发明的组合物用作药物时，含有用聚乙二醇PEG化的毒蜥外泌肽-4类似物(例如，艾塞那肽)或其衍生物的药物组合物可以在配制成各种口服或非口服给药形式后，在临床给药的情况下按如下给药，但不限于此。
例如，对于口服给药的制剂，有片剂、丸剂、硬/软胶囊、液体、混悬液、乳化剂、糖浆、颗粒、酏剂、锭剂等；除活性成分外，这些制剂包括稀释剂(实例：乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸)、滑爽改性剂(实例：硅石、滑石、硬脂酸盐及其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇)。片剂还可包括粘合剂，例如硅酸铝镁、淀粉糊、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷，并且可包括崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或沸腾混合物和/或吸收剂、着色剂、调味剂和甜味剂(如果需要)。
含有用聚乙二醇PEG化的毒蜥外泌肽-4类似物或其衍生物的药物组合物可以非口服给药，并且通过皮下注射、静脉内注射、肌内注射、胸腔内注射或局部给药进行给药。
用聚乙二醇PEG化的毒蜥外泌肽-4类似物(例如，艾塞那肽)或其衍生物可以通过将其与稳定剂或缓冲剂在水中混合以将其配制成非口服给药目的制剂而制备成液体或混悬液，并且这可以准备安瓿瓶或小瓶单位给药形式。该组合物是已灭菌的和/或可以包括佐剂，例如防腐剂、稳定剂、水合剂或乳化刺激剂、渗透压控制目的盐和/或缓冲剂、以及其它有益于治疗的物质，并且可以根据传统的混合、造粒或包衣方法配制。
根据本发明的含有用聚乙二醇PEG化的毒蜥外泌肽-4类似物(例如，艾塞那肽)或其衍生物的药物组合物的人体剂量可以根据患者的年龄、体重、性别、给药形式、健康状况和疾病水平而不同，并且可以在医生或药剂师的决定后经由口服或非口服途径给药，优选剂量为0.01至200mg/kg/天。
血脑屏障(BBB)
血脑屏障(BBB)是一种高选择性通透性屏障，可将循环血液与中枢神经系统(CNS)中的脑细胞外液(BECF)分开。血脑屏障由脑内皮细胞形成，其通过具有极高电阻率的紧密连接而连接。星形胶质细胞是产生血脑屏障所必需的。血脑屏障通过被动扩散以及对神经功能至关重要的分子(例如，氨基酸和葡萄糖)的选择性转运允许脂溶性分子、水和一些气体通过。血脑屏障沿着所有大脑毛细血管发生，并且由毛细血管周围的紧密连接组成，这些紧密连接不存在于正常循环中。内皮细胞限制微观体(例如，细菌)和大分子或亲水性分子扩散到脑脊髓液(CSF)中，同时允许小疏水性分子(例如，O2、CO2、激素)的扩散。屏障的细胞用特定蛋白质主动地将代谢产物(例如，葡萄糖)转运穿过屏障。
这种“屏障”是由CNS血管中内皮细胞之间紧密连接的选择性引起的，这限制了溶质的通过。在血液和大脑之间的界面处，内皮细胞通过这些紧密连接缝合在一起，这些连接由较小的亚基组成，通常是生物化学二聚物，作为跨膜蛋白质，例如闭合蛋白、紧密连接蛋白、连接粘附分子(JAM)或ESAM。这些跨膜蛋白质中的每一种都被另一种蛋白质复合物锚定在内皮细胞中，该蛋白质复合物包括zo-1和相关蛋白质。
血脑屏障由大脑毛细血管内皮形成，并且从大脑中排除～100％的大分子神经治疗和超过98％的所有小分子药物。克服将治疗剂递送到大脑的特定区域的困难对大多数大脑症状的治疗提出了主要挑战。在其神经保护作用中，血脑屏障起到阻碍许多潜在重要的诊断和治疗剂向大脑递送的作用。可能以其它方式在诊断和治疗中有效的治疗性分子和抗体不会以足够的量穿过BBB。大脑中的药物靶向机制涉及“通过”或“穿透(goingbehind)”BBB。通过BBB的药物递送/给予形式的程式需要通过渗透方式；生物化学上使用血管活性物质(如缓激肽)；或甚至通过局部暴露于高强度聚焦超声(HIFU)来破坏。用于通过BBB的其它方法可能需要使用内源转运系统，包括载体介导的转运体，如葡萄糖和氨基酸载体；受体介导的胰岛素或转铁蛋白转胞吞作用；和活性外排转运体(如p-糖蛋白)的阻断。然而，已经发现靶向BBB转运体的载体(例如，转铁蛋白受体)仍然被捕获在毛细血管的脑内皮细胞中，而不是通过BBB运送到脑实质中。BBB后面的药物递送方法包括脑内植入(例如，使用针)和对流增强分布。另外，甘露醇可用于绕过BBB。
众所周知，没有靶向血脑屏障受体(例如，转铁蛋白受体)的能力的肽或蛋白质生物药物不会穿过BBB。由于PEG化艾塞那肽类似物或GLP-1类似物的高分子量以及靶向血脑屏障受体的配体的缺少，出乎意料的是，本文所述的组合物将穿过血脑屏障并治疗PD和AD。
通过以下实例进一步说明本发明，这些实例不应解释为是限制性的。本申请中引用的所有参考文献、专利和公开专利申请的内容以及附图均通过引用并入本文。
实例
实例1：激活的小胶质细胞上调GLP-1r和GLP-1r激动剂选择性地阻断小胶质细胞 激活并抑制多种神经毒性分子的释放。
激活的小胶质细胞是神经退行性疾病的起因之一。小胶质细胞激活导致促炎和神经毒性介质(如TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6和C1q)的产量增加。结果，这些炎性介质直接或经由星形胶质细胞激活诱发神经炎症和神经元损伤。例如，TNF-α在包括神经元在内的各种脑细胞中以非常低的水平表达，但当小胶质细胞和星形胶质细胞被病原体或损伤激活时，表达并释放高水平的TNF-α。据报道，由激活的小胶质细胞产生的TNF-α对于触发神经元细胞的凋亡是必要且充分的(Guadagno J等人《细胞死亡及疾病(Cell Death and Disease)》.2013.4：e538)，并且有证据表明TNF-α有助于各种大脑病症，如PD、AD、多发性硬化和其它神经退行性疾病。在本文描述的发明之前，没有临床测试的稳健方法表现出选择性地靶向和影响人中的小胶质细胞和星形胶质细胞激活。
结果
NLY001，一种长效GLP-1r激动剂，被标识为具有从静息小胶质细胞转化的靶向激活小胶质细胞，同时抑制神经退行性疾病中的多种炎性和神经毒性介质。当原代小胶质细胞被异常聚集蛋白质(例如，α-突触核蛋白预先形成的原纤维(PFF))激活时，激活的小胶质细胞上调GLP-1r的mRNA水平(图2A、图2B和图2C)。与健康脑组织相比，来自患有PD和AD的患者的脑组织表现出上调的GLP-1r(图2A、图2B和图2C)。重要的是，当小胶质细胞用α-突触核蛋白PFF(1μg/ml)和NLY001(1μM)治疗6小时时，NLY001阻断小胶质细胞激活并显著减少多种炎性介质(包括TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6)的释放。在体内，发现皮下给予的NLY001同时抑制TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6和C1q的水平(表1)。该结果表明，长效GLP-1r激动剂能够通过上调的GLP-1r选择性地靶向激活的小胶质细胞，并同时关闭可以诱发神经退行性疾病中的神经元损伤的多种炎性和毒性介质的释放。
Figure BDA0001769265350000301
表1.用或不用NLY001治疗的正常和α-突触核蛋白PFF激活的小鼠原代小胶质细胞中TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6的mRNA水平(相对倍数)。±S.E.M，每组n＝3。使用双向ANOVA进行统计分析，然后进行事后邦弗朗尼(Bonferroni)检验以进行多组比较。***P<0.001相对于对照组(PBS)，P<0.001相对于PFF+PBS组。
实例2：NLY001保护神经元免受激活的小胶质细胞介导的神经元细胞死亡的影响。
材料和方法
为了确定NLY001对α-突触核蛋白PFF诱发的小胶质细胞神经毒性的影响，测试NLY001是否保护原代神经元免受α-突触核蛋白PFF激活的小胶质细胞介导的神经元细胞死亡的影响。为解决此问题，在用或不用NLY001(1μM)的情况下，将小胶质细胞用α-突触核蛋白PFF(1μg/ml)激活6小时，然后洗去培养基。此后，如图3所述，将原代神经元与激活的小胶质细胞共培养72小时。通过PI染色评估神经元毒性。
结果
如表2所总结，与α-突触核蛋白PFF激活的小胶质细胞共培养的神经元表现出细胞死亡的增加。相反，当神经元与用PFF治疗的小胶质细胞共培养时，NLY001表明神经细胞死亡的显著减少。该结果意味着NLY001可以在神经退行性疾病的进展期间保护神经元细胞免受由异常聚集蛋白质激活的转化小胶质细胞或星形胶质细胞的影响。
表2.原代小胶质细胞-原代皮质神经元共培养的神经元细胞死亡测定。±S.E.M，每组n＝4。使用双向ANOVA进行统计分析，然后进行事后邦弗朗尼检验以进行多组比较。***P<0.001相对于对照组(PBS)，###P<0.001相对于PFF+PBS组。
Figure BDA0001769265350000311
实例3：与短效GLP-1r激动剂相比，长效GLP-1r激动剂NLY001通过延迟的GLP-1r内 化组成性地激活GLP-1r。
短效GLP-1r激动剂在临床相关的神经退行性疾病转基因小鼠模型中的疗效尚不清楚。例如，利拉鲁肽(每日一次注射)在长期治疗后对2xTg AD模型中的β-淀粉样蛋白斑块负荷没有影响(Hansen HH等人《公共科学图书馆综合(PLoS One)》.2016.11(7)：e0158205)。在PD中，没有一种GLP-1r激动剂(短效或长效)在临床相关的Tg或突变PD模型中显示出疗效。总体而言，短效GLP-1r激动剂在急性、基于毒素的PD和AD模型中证实了疗效，但在慢性转基因模型中未证实疗效。短效GLP-1r激动剂可能在慢性PD或AD模型中显示出降低的疗效或不显示疗效。在历史上，该等仅在基于毒素的神经退行性模型中证实了疗效的化合物在临床试验中大多失败。相反，如实例中所述，NLY001在多个互补慢性PD和AD模型中清楚地证明了强抗PD和抗AD疗效。
与短效GLP-1r激动剂不同，NLY001是一种长效GLP-1r激动剂，出乎意料地穿透BBB并在神经退行性疾病的大脑中显示高累积(表X)。假设短效GLP-1r激动剂由于没有连续激活大脑中GLP-1r的能力而在患有神经退行性疾病的慢性Tg模型中无效。除了可以连续向大脑提供活性GLP-1配体的NLY001的延长的血浆半衰期，据标识，NLY001在分子水平上显著延迟GLP-1r内化，因此与短效GLP-1r激动剂相比，能够扩增GLP-1信号传导(表3)。因此，与短效GLP-1r激动剂相比，NLY001结合长血浆半衰期和穿透BBB的能力，可以连续激活GLP-1r并在大脑的靶细胞中诱发GLP-1信号传导而没有“关闭时间”。
通过使用PathHunter eXpress GLP1RA激活的GRPC内化测定试剂盒(DisoverRX，CA)研究短效和长效GLP-1r的GLP-1r内化特性。简言之，该试剂盒使用制造商手册中所述的酶片段互补来检测用激活受体阻止的相互作用。将PathHunter eXpress激活的GPCR内化细胞接种于96孔板(每孔105个细胞)中，并用两种短效GLP-1r激动剂(艾塞那肽和利拉鲁肽)和一种长效GLP-1r激动剂(NLY001)刺激，浓度为10-12至10-6M。刺激后，根据制造商推荐的方案检测信号。如表3中所总结，与短效GLP-1r激动剂(艾塞那肽和利拉鲁肽)相比，NLY001在激动剂刺激的EC50(nM)方面表现出GLP-1r内化延迟10至20倍。
表3.通过短效和长效GLP-1r激动剂对人GLP-1r的内化。±S.E.M，每组n＝4。使用双向ANOVA进行统计分析，然后进行事后邦弗朗尼检验以进行多组比较。###P<0.001相对于短效GLP-1r激动剂。
Figure BDA0001769265350000321
实例4：NLY001减少α-突触核蛋白相关的胶质细胞增生(小胶质细胞和星形胶质细 胞激活)，抑制α-突触核蛋白聚集并改善LB/LN病理学并减轻α-突触核蛋白PFF诱发的PD小 鼠的运动缺陷。
材料和方法
动物
所有实验程序遵循美国国立卫生研究院动物护理和使用指南的实验动物手册的指南，该指南由约翰霍普金斯医学研究所动物护理和使用委员会批准。制备α-突触核蛋白PFF诱发的PD小鼠(Luk,K.C.等人，《科学(Science)》，2012.338(6109)：p.949-53)。对于α-突触核蛋白PFF的立体定位注射，用甲苯噻嗪和氯胺酮麻醉12周龄雄性小鼠。将注射套管(26.5规格)立体定位地应用于纹状体(前后位，距前囟3.0mm；中侧位，0.2mm；后前位，2.6mm)单侧(应用到右半球)。以0.2μl/min的速率进行输注，并将2μlα-突触核蛋白PFF(PBS中5ug/ml)或相同体积的PBS注射到小鼠中。通过缝合和伤口愈合闭合头部皮肤，并在手术后监测恢复。对于体视学分析，在用纹状体α-突触核蛋白PFF注射6个月后，在心脏内用冰冷的PBS灌注并固定动物，然后用4％多聚甲醛灌注并固定。取出大脑并进行免疫组织化学或免疫荧光处理。在单侧纹状体α-突触核蛋白PFF注射6个月后，进行行为测试。如图4A所示，在单侧纹状体α-突触核蛋白PFF注射1个月(每周2次)后，完成NLY001(3mg/kg)的治疗。
NLY001对α-突触核蛋白PFF诱发的行为缺陷的有益神经保护作用
在α-突触核蛋白PFF注射6个月后，在载剂(PBS)或NLY001治疗小鼠中进行四种不同的行为测试。
爬杆测试：让动物在行为实验室中适应环境30分钟。杆由2.5英尺直径9毫米的金属棒构成，并用绷带纱布包裹。简言之，将小鼠头朝上放置在杆的顶部(距离杆的顶部3英寸)。记录到杆的底部所用的总时间。在实际测试之前，连续两天训练小鼠，每个训练时间段由三个测试试验组成。在测试当天，在三个时间段中评价小鼠并记录总时间。停止测试和记录的最大截止时间为30秒。结果以总时间(以秒为单位)表示。α-突触核蛋白PFF注射导致达到杆的底部的时间显著增加，而NLY001的治疗减少α-突触核蛋白PFF诱发的行为缺陷，类似于健康小鼠(表4)。
转棒测试：对于转棒测试，将小鼠置于加速转棒圆筒上，并测量动物保持在转棒上的时间。速度在5分钟内从4rpm缓慢增加到40rpm。如果动物从横档上掉落或抓住装置并连续旋转两圈而不试图走上横档，则试验结束。在测试前，训练动物3天。运动测试数据表示为与对照相比在转棒上的平均持续时间(3次试验)的百分比。与PBS治疗PFF诱发的PD模型相比，NLY001的治疗显著改善转棒性能(表4)。
圆筒测试：通过将动物放置在小透明圆筒(高度，15.5cm；直径，12.7cm)中来测量自发运动。自发活动记录5分钟。测量前爪碰触、背部碰触和绝望(glooming)的次数。由实验者无视小鼠类型和NLY001治疗以慢动作观察和评价记录文件。α-突触核蛋白PFF诱发的PD小鼠表现出在圆筒任务中前肢使用的缺陷，而NLY001治疗PD小鼠通过平衡使用两个前爪来减轻运动缺陷(表4)。
苯丙胺诱发的刻板旋转：将5mg/kg苯丙胺(Sigma-Aldrich)腹腔内给予于小鼠。将小鼠置于直径为20cm的白纸圆筒中并监测30分钟。在给予苯丙胺后20至30分钟之间以三个一分钟的间隔拍摄小鼠的行为。根据视频记录对每只小鼠在一分钟时间段期间的全身同侧旋转(顺时针)进行计数。α-突触核蛋白注射使苯丙胺诱发的旋转行为增加7倍，表明多巴胺神经元的缺失。相反，NLY001防止苯丙胺诱发的旋转，表明多巴胺神经元仍起作用(表4)。
表4.健康和α-突触核蛋白PFF诱发的PD模型(PFF)中的行为测试。±S.E.M，每组n＝10只小鼠。使用双向ANOVA进行统计分析，然后进行事后邦弗朗尼检验以进行多组比较。***P<0.001相对于对照组(PBS)，##P<0.01，###P<0.001相对于PFF注射组。
Figure BDA0001769265350000341
NLY001拯救多巴胺能(DA)神经元并改善α-突触核蛋白PFF诱发的PD小鼠的LB病理 学。
病理性α-突触核蛋白的累积与DA神经元的变性有关。如本文所述，检查全身给予的NLY001保护免受α-突触核蛋白PFF接种诱发的DA神经元缺失的影响的能力。处死小鼠并通过使用无偏性体视学对SNpc中酪氨酸羟化酶(TH)阳性和Nissl阳性神经元的数量进行计数来测量DA神经元的缺失。另外，通过光密度测量分析纹状体(STR)中的相对TH阳性纤维密度。与PBS治疗对照相比，SNpc和STR切片的免疫染色和TH阳性染色的DA神经元和纤维密度的定量显示出注射PFF的小鼠中多巴胺能神经元的显著缺失。相反，NLY001的给予显著地保护免受PFF诱发的TH-神经元缺失的影响(表5)。
表5.NNY001拯救α-突触核蛋白PFF诱发的PD小鼠中的DA神经元。±S.E.M，每组n＝10只小鼠。使用双向ANOVA进行统计分析，然后进行事后邦弗朗尼检验以进行多组比较。***P<0.001相对于对照组(PBS)，##P<0.01相对于PFF注射组。
Figure BDA0001769265350000351
接下来，研究NLY001改善由α-突触核蛋白PFF接种诱发的LB/路易神经突(LN)样病理的扩散的能力。在如上所述的治疗后，使用p-SynSer129抗体在注射部位(STR)和黑质(SN)处观察到过度磷酸化的α-突触核蛋白(人LB/LN的标志物)的沉积物。与PBS治疗对照相比，p-SynSer129阳性神经元显示出在注射PFF的小鼠的纹状体和SN中LB/LN样病理学的显著增加。如图5所示，NLY001减少PD脑中的LB/LN病理。
NLY001通过减少α-突触核蛋白相关的小胶质细胞和星形胶质细胞激活来抑制PD 大脑中的胶质细胞增生。
来自SNpc区域的小胶质细胞和星形胶质细胞用抗Iba-1(1:1000，Wako)或抗GFAP(1:2000，Dako)抗体染色，然后与生物素缀合的抗兔抗体和ABC试剂一起温育。然后使用SigmaFast DAB过氧化物酶底物(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)开发切片。用ImageJ软件测量SNpc区域中小胶质细胞的数量和星形胶质细胞的密度。在PD模型中，Iba-1阳性(激活的小胶质细胞)和GFAP阳性(反应性星形胶质细胞)的细胞群体高度增加。NLY001治疗显著阻断小胶质细胞激活并减少PFF诱发的PD模型中反应性星形胶质细胞的形成(表6)。
表6.NLY001阻断α-突触核蛋白PFF诱发的PD小鼠中的α-突触核蛋白相关的小胶质细胞和星形胶质细胞激活。±S.E.M，每组n＝10只小鼠。使用双向ANOVA进行统计分析，然后进行事后邦弗朗尼检验以进行多组比较。***P<0.001相对于对照组(PBS)，###P<0.001相对于PFF注射组。
Figure BDA0001769265350000352
实例5：NLY001减少α-突触核蛋白相关的胶质细胞增生(小胶质细胞和星形胶质细 胞激活)，抑制α-突触核蛋白聚集并改善LB/LN病理学并增加A53TTgPD小鼠的寿命。
动物
A53Tα-突触核蛋白转基因小鼠(A53T)获自Jackson Lab(B6；Prnp-SNCA*A53T，PMID：12084935)。将小鼠与C57BL/6小鼠(Jackson Lab)交配，并产生用于本研究。如图4B所示，在6月龄后直至10月龄和死亡日期，在野生型(WT)对照小鼠和A53TPD小鼠中进行NLY001和PBS皮下治疗(3mg/kg，每周两次)。
与WT小鼠大脑相比，NLY001在PD大脑中显著更高地累积。
在10月龄时处死小鼠，并通过如上所述的免疫测定法测量大脑(小脑和半球)中NLY001的浓度。使用C-18SEP-Column(Phoenix Pharmaceuticals,Inc.)从脑组织中提取NLY001，并通过毒蜥外泌肽-4EIA试剂盒(Phoenix Pharmaceuticals,Inc.)进行分析。令人惊讶的是，与健康WT小鼠大脑相比，皮下给予的NLY001穿透BBB并且在PD大脑(A53T)中显著更高地累积(10至30倍)(表7)。
表7.NLY001的大脑累积。±S.E.M，每组n＝6至8只小鼠。使用双向ANOVA进行统计分析，然后进行事后邦弗朗尼检验以进行多组比较。***P<0.001相对于对照WT+NLY001组。
Figure BDA0001769265350000361
NLY001治疗增加PD模型的体重。
晚期PD的小鼠模型通常显示出体重减轻。在临床上，PD的体重减轻是一个关键问题。并发有体重减轻的PD过程导致整体治疗效果较差和生活质量下降。已知批准的用于糖尿病/肥胖症患者的GLP-1r激动剂在长期治疗期间有效地降低体重。利拉鲁肽尤其显示出对2型糖尿病的长期体重减轻有效，并且最近批准了高剂量的利拉鲁肽作为抗肥胖药物(Sexenda)。与其它GLP-1r激动剂不同，NLY001不会降低神经退行性疾病模型的体重，而会增加体重，同时改善疾病进展(表8)。
表8.用PBS或NLY001治疗的12月龄的WT和A53T PD小鼠模型的体重。±S.E.M，每组n＝20只小鼠。***P<0.001相对于对照WT组，###P<0.001相对于A53T+PBS组。
Figure BDA0001769265350000362
NLY001增加A53Tα-突触核蛋白Tg小鼠的寿命。
A53Tα-突触核蛋白Tg小鼠表现出由于脑干和脊髓神经元的变性(导致肢体麻痹、自身功能障碍和过早死亡)而造成的寿命缩短(Lee MK等人《美国国家科学院学报(ProcNatl Acad Sci USA)》.2002.99(13)：8969-8973)。在大多数患病动物中，疾病迅速发展至死亡，可能是因为无法进食和脱水。在该研究中，A53T小鼠表现出11至14月龄的过早致死率。相反，NLY001治疗显著增加A53T的寿命(图6和表9)。
表9.通过GraphPad Prism 6计算中位存活期。±S.E.M，每组n＝20只小鼠。###P<0.001相对于A53T+PBS组。
Figure BDA0001769265350000371
NLY001抑制PD大脑中的胶质细胞增生并减少A53Tα-突触核蛋白TgPD小鼠中的α- 突触核蛋白聚集。
如上所述分析小胶质细胞和星形胶质细胞激活。用ImageJ软件测量大脑中小胶质细胞的数量和星形胶质细胞的密度。在A53T Tg PD模型中，Iba-1阳性(激活的小胶质细胞)和GFAP阳性(反应性星形胶质细胞)的细胞群体高度增加。NLY001治疗显著阻断小胶质细胞激活并减少A53T Tg PD模型中反应性星形胶质细胞的形成(表10)。重要的是，通过利用PBS或NLY001在来自10月龄A53T Tg小鼠和年龄匹配的同窝对照的脑干洗涤剂不溶性部中进行免疫印迹来分析α-突触核蛋白p-ser129、α-突触核蛋白聚集和β-肌动蛋白的相对蛋白质表达。此外，通过p-α-突触核蛋白免疫组织化学图像分析A53T Tg小鼠脑干中泛素阳性包涵体的形成。如在PFF诱发的PD小鼠中所见，NLY001显著阻断A53T Tg PD小鼠中的α-突触核蛋白聚集。结果总结在表11中。
表10.NLY001阻断A53Tα-突触核蛋白Tg PD小鼠中的α-突触核蛋白相关的小胶质细胞和星形胶质细胞激活。±S.E.M，每组n＝7只小鼠。使用双向ANOVA进行统计分析，然后进行事后邦弗朗尼检验以进行多组比较。***P<0.001相对于对照组(PBS)，##P<0.01，###P<0.001相对于A53T+PBS组。
Figure BDA0001769265350000372
表11.NLY001降低A53Tα-突触核蛋白Tg PD小鼠中α-突触核蛋白和泛素的表达。±S.E.M，每组n＝3只小鼠。使用双向ANOVA进行统计分析，然后进行事后邦弗朗尼检验以进行多组比较。###P<0.001相对于A53T+PBS组。
Figure BDA0001769265350000381
实例5：NLY001改善3xTgAD小鼠中的阿尔茨海默病样病理学和记忆障碍。
材料和方法
动物：3xTg AD小鼠获自Jackson Lab。这些广泛使用的小鼠包括三种突变型，AAPSwedish、MAPT 3P01L和PSEN1 M126V，与家族性阿尔茨海默病相关。3xTg小鼠显示出斑块和唐氏病理学(tang pathology)。β-淀粉样蛋白沉积是进行性的，并且早在三或四月龄时出现在细胞内，并且细胞外沉积物在6个月时出现在额叶皮层中并且在12个月时变得更加广泛。在该研究中，使用6月龄雄性3xTg AD小鼠。如图7所示，在7月龄后的野生型(WT)对照小鼠和7×Tg AD小鼠中进行NLY001和PBS皮下治疗(1mg/kg和10mg/kg，每周两次)，持续5个月。
NLY001改善3xTgAD小鼠的记忆。在载剂(PBS)或NLY001治疗小鼠中进行两种不同 的行为测试(Webster SJ等人，《遗传学前沿(Front Genet)》.2014.5：88)。
Morris水迷宫测试(MWM)：Morris水迷宫是一个白色圆形水池(直径100cm，高35cm)，内部表面无特征。圆形水池中充满水和无毒水溶性白色染料。水池分为四个面积相等的象限。平台(直径8cm，高10cm)位于水池的一个象限的中心，并浸没在水面下1cm处，使其在水平面不可见。水池位于一个包含各种突出视觉线索的测试室内。由视频跟踪系统(ANY-maxe system,Wood Dale,IL,USA)监测从起始位置到平台的每只游泳小鼠的位置。实验的前一天专门用于在没有平台的情况下的游泳训练(60秒)。然后每天给小鼠进行三次试验，连续五天，试验间隔为15分钟，记录逃避潜伏期。该参数是对于每个试验时间段和每只小鼠的平均值。一旦小鼠找到平台，允许其在平台上保持10秒。如果小鼠在60秒内未找到平台，则将其在平台上放置10秒，然后由实验者从水池中取出。在第6天，探头测试涉及从水池中移除平台。该测试以60秒的截止时间进行。在试验1和试验2之间，小鼠进入水池中的进入点和用于逃避的平台的位置保持不变，但此后每天都改变。
如图8和图9中所述，与WT小鼠相比，用PBS治疗的3xTg AD小鼠显示出学习缺陷。在第4天和第5天，PBS治疗3xTg小鼠比WT同窝小鼠花费更多时间来找到隐藏的平台。相反，与PBS治疗3xTg小鼠相比，NLY001治疗3xTg AD小鼠显示出显著改善的性能，表明NLY001治疗减轻对3xTg小鼠空间学习的损害。为了评估空间学习的记忆强度，在第5天检查探头试验。与PBS治疗3xTg AD小鼠相比，NLY001治疗3xTg小鼠花费显著更多时间在目标象限中搜索平台(表12)。NLY001治疗对游泳速度和距离没有影响。
表12.NLY001治疗3xTg AD小鼠的探头测试和游泳测试。±S.E.M，每组n＝7只小鼠。*P<0.05相对于WT+PBS，#P<0.05，###P<0.001相对于3xTg AD+PBS组。
Figure BDA0001769265350000391
被动回避测试：通过逐步被动回避过程评估NLY001对学习/记忆的影响，动物在该过程中通过抑制其对黑暗环境的自然偏好来学习回避放电。测试开始于将小鼠放置在光室中的训练；当小鼠穿越至暗室时，它会受到一个轻微的(0.25mA/1s)足底电击。进入暗(电击)室的这种初始潜伏期用作基线量度。在探头试验期间，在训练24小时后，将小鼠再次置于光室中，并且测量返回暗室的潜伏期作为被动恐惧回避的指标。与PBS治疗3xTg AD小鼠相比，NLY001治疗显著改善了通过被动回避测试评估的3xTg AD小鼠的学习(表13)。
表13.通过用PBS或NLY001治疗的WT和3xTg AD小鼠中的被动回避测试评估的学习。误差条代表平均值±S.E.M，每组n＝7只小鼠。*P<0.05*相对于WT+PBS，#P<0.05相对于3xTg AD+PBS组。
Figure BDA0001769265350000392
与WT小鼠大脑相比，NLY001在AD大脑中显著更高地累积。
如PD模型中所述，在研究后处死小鼠，并通过如上所述的免疫测定法测量全脑中NLY001的浓度。使用C-18SEP-Column从脑组织中提取NLY001，并通过毒蜥外泌肽-4EIA试剂盒进行分析。如在PD模型中证实，皮下给予的NLY001穿透BBB并且在3xTgAD大脑中比在健康WT小鼠大脑中高2至5倍地累积。
NLY001通过减少小胶质细胞和星形胶质细胞激活来抑制AD大脑中的胶质细胞增 生。
将来自固定脑组织的小胶质细胞和星形胶质细胞用抗Iba-1或抗GFAP抗体染色，然后如上所述与生物素缀合的抗兔抗体和ABC试剂一起温育。在AD模型中，Iba-1阳性(激活的小胶质细胞)和GFAP阳性(反应性星形胶质细胞)的细胞群体高度增加。NLY001治疗显著阻断小胶质细胞激活并减少3xTg AD模型中反应性星形胶质细胞的形成。此外，还验证了GLP-1r在Iba-1阳性细胞(激活的小胶质细胞)上高度表达，但在MAP2阳性细胞(神经元)上不表达。该结果支持体外研究结果，长效GLP-1r激动剂阻断胶质细胞增生，并通过结合至在常驻型固有免疫细胞(包括大脑中的小胶质细胞)上表达的GLP-1r来关闭炎性和神经毒性分子的释放。
NLY001治疗降低3xTgAD小鼠大脑内的炎性和神经毒性分子的表达。
为了进一步证实NLY001在3xTg小鼠中的抗AD疗效是否是由于对从激活的小胶质细胞和反应性星形胶质细胞分泌的炎性和神经毒性分子的释放的抑制，脑组织匀浆通过实时PCR分析TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6和C1q。发现与WT小鼠相比，3xTg小鼠中炎性标志物的表达水平显著更高。与体外细胞的研究结果一致，NLY001治疗3xTg小鼠表现出显著降低的炎性和神经质标志物的表达，如表14中所总结。
表14.NLY001在3xTg AD小鼠中的作用。通过实时PCR分析大脑中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6和C1q的mRNA水平。±S.E.M，每组n＝5只小鼠。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001相对于WT+PBS，#P<0.05，##P<0.01相对于3xTg AD+PBS组。
Figure BDA0001769265350000401
等同
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文所述的发明的具体实施例的许多等同。这些等同旨在由以下权利要求涵盖。
其它实施例
虽然已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前面的描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
本文提及的专利和科学文献确定了本领域技术人员可用的知识。本文引用的所有美国专利以及公开或未公开的美国专利申请均通过引用并入本文中。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请均通过引用并入本文。由本文引用的入藏号表示的Genbank和NCBI提交内容均通过引用并入本文。本文引用的所有其它公开的参考文献、文件、手稿和科学文献均通过引用并入本文。
虽然已经参考本发明的优选实施例具体示出并描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，在不脱离由所附权利要求所包含的本发明的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。

Claims (33)

1.一种药学有效量的包含与包含20，000至250，000道尔顿范围内的支链PEG偶联的长效GLP-1r激动剂的组合物在制备用于治疗神经退行性疾病或病症的药物中的应用；
其中所述长效GLP-1r激动剂为PEG化GLP-1类似物；
其中将所述组合物给予至患有神经退行性疾病或病症或有患神经退行性疾病或病症风险的受试者以阻断或减少常驻型固有免疫细胞的激活，或抑制所述激活的固有免疫细胞分泌的炎性和/或神经毒性介质的分泌，从而减轻所述神经退行性疾病或病症的一种或多种症状；
其中所述常驻型固有免疫细胞选自由小胶质细胞和星形胶质细胞构成的群组。
2.根据权利要求1所述的应用，其中有效量的所述长效GLP-1r激动剂给予至有需要的受试者以阻断常驻型固有免疫细胞的激活。
3.根据权利要求2所述的应用，其中通过GLP-1r的上调抑制异常聚集蛋白质激活免疫细胞。
4.根据权利要求2所述的应用，其中长效GLP-1r激动剂的量有效地抑制了所述激活的固有免疫细胞分泌的炎性和/或神经毒性介质的分泌。
5.根据权利要求3所述的应用，其中所述异常聚集蛋白质是α-突触核蛋白、β-淀粉样蛋白或tau蛋白。
6.根据权利要求2所述的应用，其中与适当的对照相比，所述长效GLP-1r激动剂为有效减少炎性或神经毒性介质的量，所述介质选自由以下构成的群组：TNF-α、IL-1α、IL-1β、IFN-γ、IL-6和C1q。
7.根据权利要求1所述的应用，其中所述有效量的长效GLP-1r激动剂减少了激活的小胶质细胞和反应性星形胶质细胞的细胞群体。
8.根据权利要求1所述的应用，其中所述神经退行性疾病是帕金森病。
9.根据权利要求1所述的应用，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。
10.根据权利要求1所述的应用，其中所述神经退行性疾病是亨廷顿舞蹈病。
11.根据权利要求1所述的应用，其中所述神经退行性疾病是肌萎缩侧索硬化症。
12.根据权利要求1所述的应用，其中所述长效GLP-1r激动剂包含PEG化艾塞那肽类似物。
13.根据权利要求1所述的应用，其中所述长效GLP-1r激动剂包含PEG化艾塞那肽。
14.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物经由静脉内给药给予。
15.根据权利要求14所述的应用，其中所述组合物经由皮下给予。
16.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物以某一形式给予，所述形式选自包括以下的群组：丸剂、胶囊、片剂、颗粒、粉末、盐、晶体、液体、浆液、糖浆、混悬液、凝胶、乳膏、糊剂、薄膜、贴剂和蒸气。
17.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物每月给予1至4次。
18.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物每周给予一次。
19.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物每两周给予一次。
20.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物大约每月给予一次。
21.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物每两个月给予一次。
22.根据权利要求1所述的应用，其中给药包括每6个月给予1至3次。
23.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物在非人灵长类动物或人体内的体内半衰期为12小时至200小时。
24.根据权利要求1所述的应用，其中所述长效GLP-1r激动剂在非人灵长类动物或人体内的体内半衰期为至少200小时。
25.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物以介于0.001mg/kg和100mg/kg之间的剂量给予人。
26.根据权利要求25所述的应用，其中所述组合物以介于0.001mg/kg和10mg/kg之间的剂量给予人。
27.根据权利要求1所述的应用，其中将所述组合物给予于所述受试者，持续约10年。
28.根据权利要求1所述的应用，其中所述治疗效果持续至少一年。
29.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物保护免受α-突触核蛋白预先形成的原纤维诱发的多巴胺能神经元缺失的影响。
30.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物保护免受阿尔茨海默病神经元中的淀粉样蛋白-β和/或tau蛋白毒性的影响。
31.根据权利要求1所述的应用，其中相对于对照，所述受试者的运动、记忆和认知技能得到改善。
32.根据权利要求1所述的应用，其中相对于对照，在所述受试者中保护突触和/或突触功能，增强神经形成，减少细胞凋亡，保护神经元免受氧化应激的影响，减少斑块形成并预防慢性炎性反应。
33.根据权利要求1所述的应用，其中所述PEG是三聚PEG或其衍生物；所述PEG衍生物是甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯、甲氧基聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺、甲氧基聚乙二醇丙醛或甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺。
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