CN104994912A - 肽治疗剂及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了治疗和/或预防疾病或疾患的方法和组合物，所述方法包括单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合施用GLP-1和/或GLP-1自然或人为发生的变体或类似物，或其药学上可接受的盐。

Description

肽治疗剂及其使用方法
相关申请案的交叉引用
本申请要求2012年12月6日提交的美国临时申请第61/734,293号的权益，其全部内容特此以引用的方式并入。
技术领域
本文公开了与利用GLP-1和/或GLP-1自然或人为发生的变体或类似物，或其药学上可接受的盐治疗和/或改善疾病和疾患相关的方法和组合物。在一些实施方案中，所述疾病或疾患特征在于线粒体功能障碍。本文还提供了包含GLP-1和/或GLP-1自然或人为发生的变体或类似物或其药学上可接受的盐的治疗性和药物组合物。本文还提供了与利用GLP-1和一种或多种芳香族阳离子肽治疗和/或改善疾病和疾患相关的方法和组合物。
背景技术
在肠内分泌细胞内，响应于营养摄入，通过将高血糖素原分化加工成两种主要分子形式，GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)，合成胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。在二十世纪80年代早期在克隆高血糖素原之后首次鉴定出所述肽。
GLP-1生物活性的初步研究利用全长N末端延伸形式的GLP-1(1-37和1-36酰胺)。通常发现这些较大的GLP-1分子无生物活性。1987年，3个独立研究小组证明去除前6个氨基酸产生生物活性大幅增强的GLP-1形式。
发现大多数循环的生物活性GLP-1呈GLP-1(7-36)酰胺形式。GLP-1(7-36)的生物效应包括刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌和生物合成，抑制胰高血糖素分泌和胃排空，及抑制食物摄取。GLP-1降低糖尿病患者体内的血糖的发现，连同GLP-1可恢复对外源性促分泌素的细胞敏感性的暗示一起，表明增强GLP-1信号是治疗糖尿病患者的有用策略。越来越多的证据强烈地表明GLP-1信号调节胰岛增殖和胰岛新生。另外，GLP-1已经牵连于提高心肌功能，减轻体重和降低血压。
GLP-1受酶二肽基肽酶IV(DPP IV)迅速灭活成其降解产物GLP-1(9-36)。DPP IV介导的灭活是调节啮齿动物和人体内GLP-1的生物活性的关键控制机制。几项研究也已经使中性肽链内切酶24.11的作用牵连于GLP-1的内切蛋白酶解。
当前正在研究DPP IV抑制剂和GLP-1(7-36)降解更慢的类似物用于治疗目的。预计抗DPP IV裂解的GLP-1类似物在体内更有效。自然发生的DPP IV抗性GLP-1类似物的实例为蜥蜴艾塞那肽-4(exendin-4)。
需要减少或消除高血糖诱导的活性氧，以便减少糖尿病并发症和其它疾病或疾患的新疗法。本发明解决了这两种需要。
发明内容
一方面，本公开提供了一种组合物，其包含单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或章节II或表1中公开的一种或多种芳香族阳离子肽组合的GLP-1。
在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种附加活性剂，例如环孢霉素、强心药、抗炎药、降压药、抗体、眼药、抗氧化剂、金属络合物和抗组胺药。
一方面，本公开提供了一种在对象中治疗或预防线粒体功能障碍的方法，包括向所述对象施用治疗有效量的根据权利要求1所述的组合物。
一方面，本公开提供了一种治疗特征在于线粒体功能障碍的疾病或疾患的方法，包括施用治疗有效量的根据权利要求1所述的组合物。
在一些实施方案中，所述疾病或疾患包括神经或神经退行性疾病或疾患，缺血，再灌注，缺氧，动脉粥样硬化，输尿管梗阻，糖尿病，糖尿病并发症，关节炎，肝损伤，胰岛素抗性，糖尿病性肾病，急性肾损伤，慢性肾损伤，由于暴露于肾毒性剂和/或放射性造影剂引起的急性或慢性肾损伤，高血压，代谢综合征，眼科疾病或疾患例如干眼病、糖尿病性视网膜病、白内障、色素性视网膜炎、青光眼、黄斑变性、脉络膜新生血管、视网膜变性、氧诱导的视网膜病变，心肌病，缺血性心脏病，心力衰竭，高血压性心肌病，血管阻塞，血管阻塞损伤，心肌梗塞，冠心病，氧化性损伤。
在一些实施方案中，所述线粒体功能障碍包括线粒体通透性转换。
在一些实施方案中，所述神经或神经退行性疾病或疾患包括阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病(Parkinson’sdisease)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease)或多发性硬化。
在一些实施方案中，所述对象患有缺血或者在心血管组织、骨骼肌组织、脑组织和肾组织中的一个或多个中具有无复流解剖区。
一方面，本公开提供了一种在有需要的对象中减少CD36表达的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。
一方面，本公开提供了一种在有需要的对象中治疗或预防特征在于CD36升高的疾病或疾患的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。
在一些实施方案中，所述对象诊断为患有、疑似患有或有风险患上动脉粥样硬化、炎症、血管生成异常、脂类代谢异常、凋亡细胞清除异常、缺血例如脑缺血和心肌缺血、缺血-再灌注、输尿管梗阻、中风、阿尔茨海默氏病、糖尿病、糖尿病性肾病或肥胖症。
一方面，本公开提供了一种减少移除器官或组织中的氧化性损伤的方法，包括向所述移除器官或组织施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。
在一些实施方案中，所述移除器官包括心脏、肺、胰腺、肾脏、肝脏或皮肤。
一方面，本公开提供了一种在有需要的对象中预防产多巴胺型神经元损失的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。
在一些实施方案中，所述对象诊断为患有、疑似患有或有风险患上帕金森氏病或ALS。
一方面，本公开提供了一种在有需要的对象中减少与神经退行性疾病相关的氧化性损伤的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。
在一些实施方案中，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或ALS。
一方面，本公开提供了一种在有需要的对象中预防或治疗灼伤的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。
一方面，本公开提供了一种在有需要的对象中治疗或预防机械通气引起的隔肌功能障碍的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。
一方面，本公开提供了一种在有需要的对象中治疗或预防缺血-再灌注损伤后无复流的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。
一方面，本公开提供了一种在需要镇痛的哺乳动物中预防去甲肾上腺素摄取的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。
一方面，本公开提供了一种在有需要的对象中治疗或预防药物引起的周围神经病或痛觉过敏的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。
一方面，本公开提供了一种在有需要的对象中止痛或镇痛的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。
一方面，本公开提供了一种在有需要的对象中治疗动脉粥样硬化性肾血管病(ARVD)的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。
在一些实施方案中，所述组合物包含含有修饰的Glp-1类似物，所述修饰选自包含一种或多种D-氨基酸、包含一个或多个N-甲基化位点和包含一个或多个还原酰胺键(Ψ[CH2-NH])。
在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种药学上可接受的降pH剂以及对促进所述活性剂的生物利用度有效的至少一种吸收促进剂中的一种或多种，和一个或多个层压层。
在一些实施方案中，所述降pH剂选自柠檬酸、酒石酸和氨基酸的酸式盐。
具体实施方式
I.GLP-1
如本文所使用，术语“GLP-1”意在包括自然发生的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)多肽和/或GLP-1自然发生或人造的变体或类似物，包括但不限于GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)。下面提供了此类GLP-1多肽的示例、非限制性实例。同样见以引用的方式整体并入本文的美国专利公布第2008/0015144号和美国专利公布第2011/0274747号。
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Asp Ile Leu Trp G1u Val(SEQ ID NO:26)
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II.芳香族阳离子肽
本技术的芳香族阳离子肽为水溶性、高极性，并且可容易地穿透细胞膜。
本技术的芳香族阳离子肽包括通过肽键共价连接的最少3个氨基酸。
本发明芳香族阳离子肽中存在的最大数量的氨基酸为通过肽键共价连接的约20个氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸的最大数量为约12个。在一些实施方案中，氨基酸的最大数量为约9个。在一些实施方案中，氨基酸的最大数量为约6个。在一些实施方案中，氨基酸的最大数量为约4个。
本技术的芳香族阳离子肽的氨基酸可为任何氨基酸。如本文所使用，术语“氨基酸”用于指含有至少一个氨基和至少一个羧基的任何有机分子。在一些实施方案中，至少一个氨基在相对于羧基的α位置。
氨基酸可以是自然发生的。自然发生的氨基酸包括，例如通常在哺乳动物蛋白质中发现的20种最常见的左旋(L)氨基酸，即丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Glu)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ileu)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸、(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。
其它自然发生的氨基酸包括，例如在与蛋白质合成不相关的代谢过程中合成的氨基酸。例如，在尿素生成期间在哺乳动物代谢中合成氨基酸鸟氨酸和瓜氨酸。
用于本发明的肽可含有一种或多种非自然发生的氨基酸。非自然发生的氨基酸可为L-、右旋(D)或其混合物。在一些实施方案中，所述肽没有自然发生的氨基酸。
非自然发生的氨基酸是通常并非在活体内在正常代谢过程中合成的那些氨基酸，并且在蛋白质中并非自然发生。另外，用于本发明的非自然发生的氨基酸也不被常见蛋白酶识别。
非自然发生的氨基酸可存在于肽内的任何位置。例如，非自然发生的氨基酸可在N端、C端或介于N端和C端之间的任何位置。
非天然氨基酸可以，例如，包含烷基、芳基或烷基芳基。烷基氨基酸的一些实例包括a-氨基丁酸、(氨基丁酸、y-氨基丁酸、6-氨基戊酸和E-氨基己酸)。芳基氨基酸的一些实例包括邻-、间-和对-氨基苯甲酸。烷基芳基氨基酸的一些实例包括邻-、间-和对-氨基苯乙酸和y-苯基-R-氨基丁酸。
非自然发生的氨基酸还包括自然发生的氨基酸的衍生物。自然发生的氨基酸的衍生物可包括，例如向自然发生的氨基酸添加一个或多个化学基团。
例如，可向苯丙氨酸或酪氨酸的芳香环的2ˊ、3ˊ、4ˊ、5ˊ或6ˊ位置，或色氨酸残基的苯环的4ˊ、5ˊ、6ˊ或7ˊ位置中的一处或多处添加一个或多个化学基团。所述基团可以是可添加到芳香环上的任何化学基团。此类基团的一些实例包括支化或未支化的C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4烷基氧基(即烷氧基)、氨基、C1-C4烷基氨基和C1-C4二烷基氨基(例如，甲基氨基、二甲基氨基)、硝基、羟基、卤代基(即，氟、氯、溴或碘)。自然发生的氨基酸的非自然发生衍生物的一些特定实例包括正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)和羟基脯氨酸(Hyp)。
用于本方法中的肽内的氨基酸修饰的另一个实例为肽的天冬氨酸或谷氨酸残基的羧基衍生。衍生的一个实例是经氨或经伯胺或仲胺，例如甲胺、乙胺、二甲胺或二乙胺酰胺化。衍生的另一个实例包括与(例如)甲醇或乙醇酯化。
另一种此类修饰包括赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基的氨基衍生。例如，此类氨基可酰化。一些适合的酰基包括，例如苯甲酰基或包含以上提到的任何C1-C4烷基的烷酰基，例如乙酰基或丙酰基。
非自然发生的氨基酸在一些实施方案中对常见蛋白酶有抗性，并且在一些实施方案中对常见蛋白酶不敏感。对蛋白酶有抗性或不敏感的非自然发生的氨基酸的实例包括以上提到的任何自然发生的L-氨基酸的左旋(D-)形式，以及L-和/或D非自然发生的氨基酸。虽然在通过不同于细胞的正常核糖体蛋白合成机制的方式合成的某些肽类抗生素中发现，但是D-氨基酸通常不在蛋白质中出现，如本文所使用，D-氨基酸被视为非自然发生的氨基酸。
为了将蛋白酶敏感性减到最低，不管氨基酸是自然还是非自然发生的，用于本发明方法中的肽应具有少于5个、少于4个、少于3个或少于2个被常见蛋白酶识别的连续L-氨基酸。在一些实施方案中，肽仅有D-氨基酸，而没有L-氨基酸。
如果肽含有氨基酸的蛋白酶敏感序列，则氨基酸中的至少一个优选为非自然发生的v-氨基酸，从而赋予蛋白酶抗性。蛋白酶敏感序列的实例包括易于为常见蛋白酶，例如肽链内切酶和胰蛋白酶裂解的两个或更多个连续碱性氨基酸。碱性氨基酸的实例包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
重要的是与肽中氨基酸残基的总数量相比，芳香族阳离子肽在生理pH下具有最小数量的净正电荷。下面将生理pH下净正电荷的最小数量称为(pm)。下面将肽中氨基酸残基的总数量称为(r)。
下面讨论的最小数量的净正电荷全部是在生理pH下。如本文所使用的术语“生理pH”指哺乳动物身体的组织和器官的细胞内的正常pH。例如，人的生理pH一般为约7.4，但是哺乳动物中正常的生理pH可为约7.0至约7.8的任何pH。
本文所使用的“净电荷”指肽中存在的氨基酸携带的正电荷数量和负电荷数量的差额。在本说明书中，应理解在生理pH下测量净电荷。在生理pH下带正电的自然发生的氨基酸包括L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸。在生理pH下带负电的自然发生的氨基酸包括L-天冬氨酸和L-谷氨酸。
通常，肽具有带正电的N端氨基和带负电的C端羧基。在生理pH电荷相互抵消。作为计算净电荷的实例，肽Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg具有一个带负电的氨基酸(即，Glu)和四个带正电的氨基酸(即，两个Arg残基、一个Lys和一个His)。因此，上述肽具有3个净正电荷。
在本发明的一个实施方案中，芳香族阳离子肽在生理pH下净正电荷的最小数量(pm)与氨基酸残基的总数量(r)之间有关系，其中3pm是小于或等于r+1的最大数量。在该实施方案中，净正电荷的最小数量(pm)与氨基酸残基的总数量(r)之间的关系如下：
(r) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
(pm) 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7
在另一个实施方案中，芳香族阳离子肽在净正电荷的最小数量(pm)与氨基酸残基的总数量(r)之间有关系，其中2pm是小于或等于r+1的最大数量。在该实施方案中，净正电荷的最小数量(pm)与氨基酸残基的总数量(r)之间的关系如下：
(r) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
(pm) 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10
在一个实施方案中，净正电荷的最小数量(pm)和氨基酸残基的总数量(r)相等。在另一个实施方案中，所述肽具有三个或四个氨基酸残基和最少一个净正电荷、最少两个净正电荷或最少三个净正电荷。
同样重要的是与净正电荷的总数量(pt)相比，芳香族阳离子肽具有最小数量的芳族基。下面将芳族基的最小数量称为(a)。
具有芳族基的自然发生的氨基酸包括氨基酸组氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。例如，六肽Lys-Gln-Tyr-Arg-Phe-Trp具有两个净正电荷(由赖氨酸和精氨酸残基贡献)和三个芳族基(由酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基贡献)。
在本发明的一个实施方案中，用于本技术的方法中的芳香族阳离子肽在芳族基的最小数量(a)与生理pH下净正电荷的总数量(pt)之间有关系，其中3a是小于或等于pt+1的最大数量，除当pt为1时，a也可为1。在该实施方案中，芳族基的最小数量(a)与净正电荷的总数量(pt)之间的关系如下：
(pt) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
(a) 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7
在另一个实施方案中，芳香族阳离子肽在芳族基的最小数量(a)与净正电荷的总数量(pt)之间有关系，其中2a是小于或等于pt+1的最大数量。在该实施方案中，芳香族氨基酸残基的最小数量(a)与净正电荷的总数量(pt)之间的关系如下：
(pt) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
(a) 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10
在另一个实施方案中，芳族基的数量(a)和净正电荷的总数量(pt)相等。
羧基，特别是C端氨基酸的末端羧基，优选经氨酰胺化形成C端酰胺。可选地，C端氨基酸的末端羧基可经任何伯胺或仲胺酰胺化。伯胺或仲胺可为，例如烷基，特别是支化或未支化的C1-C4烷基，或芳香胺。因此，肽C端的氨基酸可转化为酰胺基、N-甲基酰胺基、N-乙基酰胺基、N,N-二甲基酰胺基、N,N-二乙基酰胺基、N-甲基-N-乙基酰胺基、N-苯基酰胺基或N-苯基-N-乙基酰胺基。
未出现在本发明的芳香族阳离子肽C端的天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的游离羧酸根基团无论其出现在肽内的任何位置也可酰胺化。在这些内部位置的酰胺化可用本文所述的氨或任何伯胺或仲胺。
在一个实施方案中，用于本发明方法中的芳香族阳离子肽是具有两个净正电荷和至少一个芳香族氨基酸的三肽。在一个特定实施方案中，用于本发明方法中的芳香族阳离子肽是具有两个净正电荷和两个芳香族氨基酸的三肽。
于本发明方法中的芳香族阳离子肽包括但不限于下列肽实例：
表1
在一些实施方案中，芳香族阳离子肽是具有以下的肽：
至少一个净正电荷；
最少4个氨基酸；
最多约20个氨基酸；
净正电荷的最小数量(pm)与氨基酸残基的总数量(r)之间的关系，其中3pm是小于或等于r+1的最大数量；和芳族基的最小数量(a)与净正电荷的总数量(pt)之间有关系，其中2a是小于或等于pt+1的最大数量，除当a为1时，pt也可为1。
在一个实施方案中，2pm是小于或等于r+1的最大数量，并且a可与pt相等。芳香族阳离子肽可为具有最少两个或最少三个正电荷的水溶性肽。
在一个实施方案中，所述肽包含一个或多个非自然发生的氨基酸，例如一个或多个D-氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸在C末端的C端羧基酰胺化。在某些实施方案中，所述肽具有最少4个氨基酸。所述肽具有最大约6个，最多约9个或最多约12个氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽具有阿片受体激动剂活性。在其它实施方案中，所述肽没有阿片受体激动剂活性。
在一个实施方案中，所述肽包含在N-末端的酪氨酸或2′,6′-二甲基酪氨酸(Dmt)残基。例如，所述肽可具有式Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2或2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2。在另一个实施方案中，所述肽包含在N-末端的苯丙氨酸或2′,6′-二甲基苯丙氨酸残基。例如，所述肽可具有式Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2或2′,6′-Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NH2。在一个特定实施方案中，芳香族阳离子肽具有式D-Arg-2′6′Dmt-Lys-Phe-NH2。
在一个实施方案中，所述肽用式I定义：
其中R1和R2各自独立地选自
(i)氢；
(ii)直链或支链C1-C6烷基；
(iii)其中m＝1-3；
(iv)
(v)
R3和R4各自独立地选自
(i)氢；
(ii)直链或支链C1-C6烷基；
(iii)C1-C6烷氧基；
(iv)氨基；
(v)C1-C4烷基氨基；
(vi)C1-C4二烷基氨基；
(vii)硝基；
(viii)羟基；
(ix)卤素，其中“卤素”涵盖氟、氯、溴和碘；
R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自
(i)氢；
(ii)直链或支链C1-C6烷基；
(iii)C1-C6烷氧基；
(iv)氨基；
(v)C1-C4烷基氨基；
(vi)C1-C4二烷基氨基；
(vii)硝基；
(viii)羟基；
(ix)卤素，其中“卤素”涵盖氟、氯、溴和碘；并且n为1至5的整数。
在一个特定实施方案中，R1和R2为氢；R3和R4为甲基；R5、R6、R7、R8和R9全部为氢；并且n为4。
如本文所使用，“神经病”或“周围神经病”通常指对周围神经系统神经的损伤。所述术语涵盖各种病因的神经病，包括但不限于由遗传性障碍、代谢/内分泌并发症、炎症、维生素缺乏、恶性病和毒性(例如酒精、有机金属、重金属、辐射和药物毒性)引起、产生或与之相关的神经病。如本文所使用，所述术语涵盖运动、感觉、混合性感觉运动、慢性和急性神经病。如本文所使用，所述术语涵盖单神经病、多发性单神经病和多神经病。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防周围神经病或周围神经病的症状的组合物。在一些实施方案中，所述周围神经病是药物引起的周围神经病。在一些实施方案中，所述周围神经病由化学治疗剂引起。在一些实施方案中，所述化学治疗剂为长春花生物碱。在一些实施方案中，所述长春花生物碱为长春新碱。在一些实施方案中，周围神经病的症状包括痛觉过敏。
如本文所使用，“痛觉过敏”指对疼痛的敏感性增加，这可由对伤害感受器或外周神经的损伤(即，神经病)引起。所述术语指暂时和永久性痛觉过敏，并且涵盖原发性痛觉过敏(即直接在受损组织中发生的痛觉敏感)和继发性痛觉过敏(即在受损组织周围的未受损组织中发生的痛觉敏感)。所述术语涵盖但不限于由遗传性障碍、代谢/内分泌并发症、炎症、维生素缺乏、恶性病和毒性(例如酒精、有机金属、重金属、辐射和药物毒性)引起、产生或与之相关的神经病引起的痛觉过敏。在一些实施方案中，痛觉过敏由药物引起的周围神经病引起。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防痛觉过敏的组合物。在一些实施方案中，痛觉过敏由药物引起。在一些实施方案中，痛觉过敏由化学治疗剂引起。在一些实施方案中，所述化学治疗剂为长春花生物碱。在一些实施方案中，所述长春花生物碱为长春新碱。
本文所述的Glp-1肽在治疗或预防神经病或痛觉过敏中有用。在一些实施方案中，可在神经病或痛觉过敏发作之后向对象施用所述肽。因此，术语“治疗”在其最广义上用于本文并且指使用Glp-1肽部分或完全治愈神经病或痛觉过敏。
在其它实施方案中，可在神经病或痛觉过敏发作之前向对象施用本技术的Glp-1肽以便防御神经病或痛觉过敏或提供对神经病或痛觉过敏的预防。因此，术语“预防”在其最广义上用于本文并且指完全或部分预防神经病或痛觉过敏的预防性用途。还考虑到可向有风险发展神经病或痛觉过敏的对象施用Glp-1化合物。
III.GLP-1用途
本文公开了通过施用治疗有效量的GLP-1，或连同一种或多种附加活性剂一起施用治疗有效量的GLP-1治疗和/或改善疾病和疾患的方法。在一些实施方案中，所述一种或多种附加活性剂包括芳香族阳离子肽，例如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2或其药学上可接受的盐例如醋酸盐或三氟醋酸盐。
下面提供了GLP-1功能的示例、非限制性实例，例如关于治疗疾病、病状或疾患的功能。在一些实施方案中，所述疾病、病状或疾患与线粒体功能障碍(例如，线粒体通透性转换)相关。在一些实施方案中，GLP-1单独地或与一种或多种附加活性剂(例如，芳香族阳离子肽)组合施用用于预防、治疗或改善疾病、疾患或病征及疾病或疾患的症状。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会减少oxLDL诱导的CD36mRNA和蛋白质水平，和小鼠腹腔巨噬细胞内的泡沫细胞形成。
预计单独的或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会减少患有急性脑缺血的对象的梗死体积和半球脑肿胀。
预计单独的或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会减少有需要的对象中缺血后脑部内还原型谷胱甘肽(GSH)的降低。
预计单独的或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会减少有需要的对象中缺血后脑部内的CD36表达。
预计单独的或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会减少有需要的对象中单侧输尿管梗阻(UUO)之后肾小管细胞内的CD36表达。
预计单独的或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会减少UUO之后肾脏内的脂质过氧化。
预计单独的或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会减少UUO之后阻塞肾脏内的肾小管细胞凋亡。
预计单独的或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会减少阻塞肾脏内由UUO诱导的巨嗜细胞浸润。
预计单独的或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会减少UUO之后阻塞肾脏内的间质性纤维化。
预计离体心脏与单独的或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)一起冷藏会减少CD36表达的上调。
预计单独的或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会减少在长时间冷缺血之后经受温血再灌注的心脏组织(例如，心脏)内的脂质过氧化。
预计单独的或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会消除在长时间冷缺血之后经受温血再灌注的心脏组织(例如，心脏)内的内皮细胞凋亡。
预计单独的或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会保持在长时间冷缺血之后经受温血再灌注的心脏组织(例如，心脏)内的冠脉血流量。
预计单独的或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会预防糖尿病对象中对近端肾小管的损伤。
预计单独的或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会预防糖尿病对象中的肾小管上皮细胞凋亡。
需要减少CD36表达的方法的哺乳动物包括，例如CD36表达升高的哺乳动物。CD36表达升高与单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合施用GLP-1、其类似物、变体或药学上可接受的盐有治疗性的各种疾病和疾患相关。特征在于CD36表达升高的疾病和疾患的实例包括但不限于动脉粥样硬化、炎症、血管生成异常、脂类代谢异常、凋亡细胞清除异常、缺血(例如脑缺血和心肌缺血)、缺血-再灌注、输尿管梗阻、中风、阿尔茨海默氏病、糖尿病、糖尿病性肾病和肥胖症。
需要减少CD36表达的方法的哺乳动物还包括患有糖尿病并发症的哺乳动物。单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合施用GLP-1、其类似物、变体或药学上可接受的盐对此类患者群体有治疗性。糖尿病并发症包括但不限于肾病、神经病、视网膜病、冠心病和周围性血管疾病。
在一些实施方案中，本文公开的方法是通过单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合施用GLP-1、其类似物、变体或药学上可接受的盐，减少移除器官和组织中的CD36表达的方法。所述方法包括使移除器官或组织与有效量的本文所述的肽接触。可(例如)从供者中取出器官或组织用于自体或异种移植。服从本技术的方法的器官和组织的实例包括但不限于心脏、肺、胰腺、肾脏、肝脏、皮肤等。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将转移到并积聚于线粒体内。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)防御由Ca2+过载和3-硝基丙酸(3NP)诱导的线粒体通透性转换(MPT)。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)抑制线粒体肿胀和细胞色素c释放。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)在心脏组织内在缺血-再灌注期间保护心肌收缩力。
预计向心脏停搏液中添加单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将明显增强长期缺血之后离体灌注心脏组织(例如，心脏)内的收缩功能。
本文所述的肽(例如，单独或与一种或多种芳香族阳离子肽组合的GLP-1)在治疗与MPT相关的任何疾病或疾患中有用。此类疾病和疾患包括但不限于组织或器官的缺血和/或再灌注、缺氧和许多神经退行性疾病中的任一种。需要治疗或预防MPT的哺乳动物是患有这些疾病或疾患的那些哺乳动物。
本公开的方法和组合物也用于治疗或预防与MPT相关的神经退行性疾病。与MPT相关的神经退行性疾病包括，例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)。本文公开的方法和组合物可用于延迟这些和其它与MPT相关的神经退行性疾病发作或减缓其进展。本文公开的方法和组合物在治疗患有与MPT相关的早期神经退行性疾病的人类和易患这些疾病的人类中特别有用。
本文公开的肽(例如，单独或与诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽组合的GLP-1)可用于在移植之前保护哺乳动物的器官。移除器官由于缺乏血流而对MPT敏感。因此，包括使器官与本技术的肽接触的方法可用于预防移除器官中的MPT。
可将移除器官置于标准缓冲溶液，例如本领域中常用的标准缓冲溶液中。例如，可将切除的心脏置于含有本文所述的肽的心脏停搏液中。本领域中的技术人员可容易地测定标准缓冲溶液中肽的浓度。例如，此类浓度可介于约0.1nM至约10μM之间。
也可向服用药物以治疗疾患或疾病的哺乳动物施用所述肽(例如，单独或与诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽组合的GLP-1)。如果药物的副作用包括MPT，则服用此类药物的哺乳动物极大地受益于施用本文公开的肽。
通过实现MPT诱导细胞毒性的药物的实例为化疗药物亚德里亚霉素(Adriamycin)。预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合施用GLP-1会改善、减少或防止此类药物的副作用。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将剂量依赖性地清除H2O2。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将剂量依赖性地抑制ABAP诱导的亚油酸过氧化并降低ABAP诱导的亚油酸过氧化的速率。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将剂量依赖性地抑制10mM CuSO4诱导的LDL氧化并降低LDL氧化的速率。
在基础条件下并且在受抗霉素(antimycin)刺激之后通过鲁米诺化学发光测量，预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将抑制线粒体生成过氧化氢。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将减少在某些应激或病状下线粒体的过氧化氢自发生成。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将抑制线粒体内过氧化氢的自发生成和受抗霉素刺激的过氧化氢生成。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将减少有需要的对象，例如患有特征在于线粒体功能障碍的疾病或疾患的对象的细胞内ROS(活性氧)并增加在细胞内的存活率。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将防止患有特征在于线粒体功能障碍的疾病或疾患的对象中细胞活力的丧失。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将降低在有需要的对象，例如患有特征在于线粒体功能障碍的疾病或疾患的对象中显示半胱天冬酶(caspase)活性增加的细胞的百分比。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将降低在有需要的对象，例如患有特征在于线粒体功能障碍的疾病或疾患的对象中ROS积聚的速率。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将抑制有需要的对象，例如患有特征在于线粒体功能障碍的疾病或疾患的对象中的脂质过氧化。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将防止有需要的对象，例如患有特征在于线粒体功能障碍的疾病或疾患的对象中的线粒体去极化和ROS积聚。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将防止有需要的对象，例如患有特征在于线粒体功能障碍的疾病或疾患的对象中的细胞凋亡。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将明显提高在长期(例如，18小时)冷缺血之后经受温血再灌注的心脏组织(例如，心脏)内的冠脉血流量。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将防止在长期(例如，18小时)冷缺血之后经受温血再灌注的心脏组织(例如，心脏)内的内皮细胞和肌细胞内的细胞凋亡。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将提高有需要的对象中胰腺细胞的存活率。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将减少有需要的对象中胰岛细胞中的细胞凋亡并增加活力。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将减少有需要的对象中胰岛细胞中的氧化性损伤。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将保护有需要的对象的多巴胺能细胞免于MPP+毒性。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将防止有需要的对象中多巴胺能神经元损失。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将提高有需要的对象中的纹状体多巴胺、DOPAC(3,4-二羟基苯乙酸)和HVA(高香草酸)水平。
本文所述的肽(例如，单独或与诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽组合的GLP-1)在减少有需要的哺乳动物的氧化性损伤中有用。需要减少氧化性损伤的哺乳动物是遭受与氧化性损伤相关的疾病、疾患或治疗相关的那些哺乳动物。通常，氧化性损伤由自由基，例如活性氧(ROS)和/或活性氮(RNS)引起。ROS和RNS的实例包括羟基自由基(HO.)、超氧阴离子自由基(O2 .-)、一氧化氮(NO.)、过氧化氢(H2O2)、次氯酸(HOCI)和过氧亚硝基阴离子(ONOO-)。
在一些实施方案中，有需要的哺乳动物可以是接受与氧化性损伤相关的治疗的哺乳动物。例如，哺乳动物可正在接受再灌注。“再灌注”指恢复流向其中血流减少或受阻的任何器官或组织的血流。再灌注期间血流的恢复导致突发性呼吸和自由基形成。
在一些实施方案中，有需要的哺乳动物是患有与氧化性损伤相关的疾病或疾患的哺乳动物。氧化性损伤可在哺乳动物的任何细胞、组织或器官中发生。受氧化性损伤影响的细胞、组织或器官的实例包括但不限于内皮细胞、上皮细胞、神经系统细胞、皮肤、心脏、肺部、肾脏和肝脏。例如，对于疾病或疾患而言脂质过氧化和炎症过程与氧化性损伤相关。
“脂质过氧化”指脂质的氧化修饰。脂质可存在于细胞膜内。膜脂质的这种修饰通常导致细胞膜功能的变化和/或损伤。另外，脂质过氧化也可在细胞外源的脂质或脂蛋白中发生。例如，低密度脂蛋白对脂质过氧化敏感。与脂质过氧化相关的疾患的实例为动脉粥样硬化。因为在例如心脏病发作和冠心病中牵涉动脉粥样硬化，所以减少与动脉粥样硬化相关的氧化性损伤很重要。
“炎症过程”指免疫系统的激活。通常，免疫系统受抗原物质激活。抗原物质可为免疫系统识别的任何物质，并且包括自身来源和外源的物质。由对自身来源的物质的炎症反应引起的疾病或疾患的实例包括关节炎和多发性硬化。外源物质的实例包括病毒和细菌。
所述病毒可为激活炎症过程并且与氧化性损伤相关的任何病毒。病毒的实例包括A、B或C型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒和牛腹泻病毒。例如，肝炎病毒可引起炎症过程和自由基形成，从而损伤肝脏。
所述细菌可为任何细菌，并且包括革兰氏阴性(gram-negative)和革兰氏阳性(gram-positive)细菌。革兰氏阴性细菌在细菌壁内含有脂多糖。革兰氏阴性细菌的实例包括大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、变形菌属(Proteus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙雷氏菌(Serratia)和拟杆菌(Bacteroides)。
本文公开的方法和组合物也可用于减少与任何神经退行性疾病或疾患相关的氧化性损伤。神经退行性疾病可影响中枢和周围神经系统的任何细胞、组织或器官。此类细胞、组织和器官的实例包括脑部、脊髓、神经元、神经节、施旺细胞(Schwann cell)、星形细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。
神经退行性疾患可为急性疾患，例如中风或创伤性脑损伤或脊髓损伤。在一个实施方案中，神经退行性疾病或疾患为慢性神经退行性疾患。在慢性神经退行性疾患中，例如自由基可引起对蛋白质的损伤。此类蛋白质的实例为p-淀粉样蛋白。与受自由基损伤相关的慢性神经退行性疾病的实例包括帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)。
可按照公开的方法和组合物治疗的其它疾患包括子痫前期、糖尿病及衰老症状和与衰老相关的疾患，例如黄斑变性和皱纹。
在一些实施方案中，本文公开的肽(例如，单独或与诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽组合的GLP-1)用于在移植之前减少哺乳动物器官内的氧化性损伤。例如，移除器官，在移植后经受再灌注时，可对氧化性损伤敏感。因此，所述肽可用于减少来自于移植器官再灌注的氧化性损伤。
移除器官可为适合移植的任何器官。此类器官的实例包括心脏、肝脏、肾脏、肺部和胰岛。将移除器官置于适合介质中，例如本领域中常用的标准缓冲溶液中。
例如，可将切除心脏置于含有本文所述的肽(例如，单独或与诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽组合的GLP-1)的心脏停搏液中。本领域中的技术人员可容易地测定标准缓冲溶液中肽的浓度。例如，此类浓度可介于约0.01μM至约10μM之间，介于约0.1nM至约10μM之间，介于约1μM至约5μM之间，介于约1nM至约100nM之间。
在一些实施方案中，本技术涵盖减少有需要的细胞内的氧化性损伤的方法和组合物。在一些实施方案中，所述方法包括单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合施用治疗有效量的GLP-1(或其变体、类似物或其药学上可接受的盐)。需要减少氧化性损伤的细胞通常是其中细胞膜或DNA已经受自由基，例如ROS和/或RNS损伤的那些细胞。能够承受氧化性损伤的细胞的实例包括但不限于胰岛细胞、肌细胞、内皮细胞、神经元细胞、干细胞和本文讨论的其它细胞类型。
所述细胞可为组织培养细胞。可选地，所述细胞可从哺乳动物获得。在一种情况下，所述细胞可受由于细胞损伤引起的氧化性损伤损害。细胞损伤包括例如疾病或疾患(例如，糖尿病等)或紫外线辐射(例如，阳光等)。例如，可从哺乳动物获得受由于糖尿病引起的氧化性损伤损害的胰岛细胞。
可通过本领域中技术人员已知的任何方法向细胞施用本文所述的肽(例如，单独或与诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽组合的GLP-1)。例如，可在适合条件下将肽与细胞一起培养。此类条件可由本领域中的技术人员容易地确定。
由于氧化性损伤减少，受治细胞可能能够再生。此类再生细胞可作为对疾病或疾患的治疗性治疗重新引入其来源的哺乳动物体内。如上所述，一种此类疾患为糖尿病。
如果在施用有效量的本文所述的肽之后，哺乳动物、移除器官或细胞内氧化性损伤的量减少，则认为氧化性损伤“减少”。通常，如果氧化性损伤减少至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％，则认为氧化性损伤减少。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将对肌肉组织的氧化态有影响。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将对偏瘦和肥胖人类对象的肌肉组织的氧化态有影响。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将对肌肉组织内的胰岛素抗性有影响。
在一些实施方案中，肥胖症或高脂饮食诱导的胰岛素抗性影响线粒体生物能。不希望受理论约束，人们认为代谢底物供给过多引起线粒体呼吸系统的功能降低，及ROS生成增多和总体氧化还原环境向更高氧化态转变。如果持续下去，这导致胰岛素抗性发展。将线粒体生物能与胰岛素抗性的病因联系起来有许多临床意义。例如，已知人类中胰岛素抗性(NIDDM)常常导致增重并且，在所选个体中，导致血糖可变性增加，引起代谢和临床后果。本文所示实例证明用线粒体靶向抗氧化剂(例如，GLP-1肽)治疗线粒体缺陷提供了治疗或预防胰岛素抗性的新的惊人方法，没有增加胰岛素的代谢副作用。
预计本方法和组合物通过单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合施用GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)降低胰岛素抗性。
如本文公开的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1肽对预防或治疗疾病有用。具体地，所述肽对治疗有病症风险(或敏感)的对象，或患有与胰岛素抗性相关的病症的对象的预防和治疗方法有用。胰岛素抗性通常与II型糖尿病、冠心病、肾功能障碍、动脉粥样硬化、肥胖症、高脂血症和原发性高血压相关。胰岛素抗性也与脂肪肝相关，脂肪肝可进展为慢性炎症(NASH；“非酒精性脂肪肝炎”)、纤维化和肝硬变。累积地，胰岛素抗性综合征，包括但不限于糖尿病，是40岁以上的人发病和死亡的许多主要原因的基础。因此，本发明提供了在有需要的对象中预防和/或治疗胰岛素抗性和相关综合征的方法，所述方法包括向对象单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合施用有效量的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。例如，可向对象施用包含单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的组合物，以提高哺乳动物骨骼肌组织对胰岛素的敏感性。在一个实施方案中，使用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)预防药物引起的肥胖症、胰岛素抗性和/或糖尿病，其中所述肽与表现出引起这些疾患中的一种或多种的副作用的药物(例如，奥氮平(olanzapine)、)一起施用。
在各实施方案中，进行适合的体外或体内测定法以确定特定GLP-1肽基治疗剂的作用及是否指示其施用用于治疗对象的患病组织。在各实施方案中，用对象病症所涉类型的代表性细胞进行体外测定法，以确定指定GLP-1肽基治疗剂是否对所述细胞类型发挥了所需作用。在人类对象中试验之前，可在适合动物模型系统，包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等中试验用于治疗的化合物。类似地，对于体内试验而言，在向人类对象施用之前，可使用本领域中已知的任何动物模型系统。可通过量化体重、空腹血糖/胰岛素/游离脂肪酸、口服葡萄糖耐量(OGTT)、体外肌肉胰岛素敏感性、胰岛素信号的标志(例如，Akt-P、IRS-P)、线粒体功能(例如，呼吸或H2O2生成)、细胞内氧化应激的标志(例如，脂质过氧化、GSH/GSSG比或顺乌头酸酶活性)或线粒体酶活性，容易地检测胰岛素抗性或敏感性升高或降低。
一方面，本文公开的方法是在对象中预防骨骼肌组织内与胰岛素抗性相关的疾病或疾患的方法，所述方法通过向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，以调节胰岛素抗性的一个或多个病征或标志，例如体重、空腹血糖/胰岛素/游离脂肪酸、口服葡萄糖耐量(OGTT)、体外肌肉胰岛素敏感性、胰岛素信号的标志(例如，Akt-P、IRS-P)、线粒体功能(例如，呼吸或H2O2生成)、细胞内氧化应激的标志(例如，脂质过氧化、GSH/GSSG比或顺乌头酸酶活性)或线粒体酶活性。
通过例如本文所述的诊断或预后测定法中的任一种或组合，可鉴定有由线粒体功能异常或胰岛素抗性引起或促成的疾病的风险的对象。在预防性应用中，按足以消除或降低疾病，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在疾病发展期间呈现的中间病理表现型的风险，减轻严重程度或延迟发作的量，向对疾病或疾患敏感或另外有疾病或病理风险的对象施用包括单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1肽的药物组合物或药剂。施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的预防性GLP-1肽可在异常症状特征表现之前进行，以便预防，或可选地，在其进展中延迟疾病或病症。根据异常类型，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1肽将起增强或提高线粒体功能的作用，并且可用于治疗对象。可根据本文所述的筛选测定法确定适当的化合物。
本文公开的另一方面包括为了治疗目的调节对象的胰岛素抗性或敏感性的方法。在一些实施方案中，向遭受胰岛素抗性或敏感性的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。在治疗性应用中，按足以治愈或部分阻止疾病症状(生物化学、组织学和/或行为)，包括其并发症和在疾病发展中的中间病理表现型的量，向疑似或已经患有此类疾病的对象施用组合物或药剂。将足以实现治疗或预防性治疗的量定义为治疗或预防有效剂量。这些调节方法可在体外(例如，通过与GLP-1肽一起培养细胞)或可选地，在体内(例如，通过向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1肽)进行。同样，本发明提供了治疗患有胰岛素抗性相关疾病或病症的个体的方法。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将提高由缺血和再灌注引起的组织病理学评分。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将增加缺血后肾组织内，再灌注之后ATP生成的速率。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将改善缺血后的肾线粒体呼吸。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将减少单侧输尿管梗阻(UUO)中的髓质纤维化。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将减少UUO中的间质性纤维化。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将减少UUO中的肾小管细胞凋亡。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将减少UUO中的巨嗜细胞浸润。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将增加UUO中的肾小管细胞增殖。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将减少UUO中的氧化性损伤。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将减轻由放射性造影剂引起的肾功能障碍。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将保护肾小管免于放射性造影剂损伤。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将防止由放射性造影剂引起的肾小管细胞凋亡。
单独或与本文所述一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1肽在保护对象肾脏免于肾损伤中有用。急性肾损伤(ARI)指肾功能降低和来自患者血液的废物滤过。通常将ARI表征为包括肾小球滤过率(GFR)降低到如此缓慢以致很少或没有尿液形成的水平。因此，肾脏通常所消除的物质留在体内。
ARI的原因可由分为三类的各种因素引起：(1)肾前性ARI，其中例如由于和在休克/心搏停止中一样，或在出血后体循环血压降低，肾脏无法得到充足供血；(2)固有ARI，其中例如由于药物引起的毒性，在肾脏内出现故障；和(3)肾后性ARI，和由于肾结石或膀胱/前列腺癌引起的输尿管梗阻一样，由流出肾脏的尿流减少引起。ARI可与这些类别中的任一种或组合相关。
肾脏无法得到向肾脏的充足供血的疾患的实例为缺血。缺血是ARI的主要原因。一个或两个肾的缺血是主动脉手术、肾移植期间，或心脏血管麻醉期间经历的常见问题。涉及夹紧主动脉和/或肾动脉的外科手术，包括肾上腺和近肾腹主动脉瘤的手术和肾移植，也特别易于引起肾缺血，导致明显的术后并发症和早期同种异体移植排斥。在进行这些手术的高危患者中，已经报道了肾功能障碍的发病率高达50％。
因为严重腹泻或灼伤、休克和与移植之前供肾的储存相关的缺血，可由失血、来自身体的液体损失引起肾缺血。在这些情况下，流向肾脏的血流可减少至危险的低水平，时间完全足以引起对肾小管上皮细胞的缺血性损伤，上皮细胞剥落进入小管腔内，导致肾小球滤过作用丧失和急性肾损伤的小管流梗阻。
对象也可在接受麻醉、手术或α-肾上腺素能激动剂后，由于相关的全身性或肾血管收缩，变得易受ARI影响。另外，由过敏反应和降压药、脓毒症或药物过量引起的全身性血管舒张也可引起ARI，这是因为身体的天然防御将要关闭，即非必要器官例如肾脏的血管收缩。
因此，在一些实施方案中，有ARI风险的对象可为经历向肾脏的供血或血压中断或减少的对象。可在此类供血中断或减少之前或同时，向这些对象施用本技术的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1肽。同样，可在治疗缺血的治疗剂之后施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1肽。
ARI的另一个原因包括药物引起的毒性。例如，肾毒素可引起对肾小管上皮细胞的直接毒性。肾毒素包括但不限于治疗药物，例如顺铂(cisplatin)、庆大霉素(gentamicin)、先锋霉素(cephaloridine)、环孢菌素(cyclosporin)、两性霉素(amphotericin)，放射性造影剂(下面更详细地描述)、杀虫剂(例如，百草枯(paraquat))、环境污染物(例如，三氯乙烯和二氯代乙炔)。其它实例包括氨基核苷嘌呤霉素(PAN)；氨基糖苷，例如庆大霉素；头孢菌素(cephalosporin)，例如先锋霉素；钙调磷酸酶(caleineurin)抑制剂，例如他克莫司(tacrolimus)或西罗莫司(sirolimus)。药物引起的肾毒性也可由非甾体类抗炎药、抗逆转录病毒药物、抗细胞因子、免疫抑制剂、肿瘤药物或血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂引起。药物引起的肾毒性可进一步由止痛剂滥用、环丙沙星(ciprofloxacin)、氯吡格雷(clopidogrel)、可卡因(cocaine)、cox-2抑制剂、利尿剂、膦甲酸(foscamet)、金、异环磷酰胺(ifosfamide)、免疫球蛋白、中草药、干扰素、锂、甘露糖醇、美沙拉嗪(mesalamine)、丝裂霉素(mitomycin)、亚硝基脲、青霉胺(penicillamine)、青霉素(penicillin)、戊烷脒(pentamidine)、奎宁(quinine)、利福平(rifampin)、链脲霉素(streptozocin)、磺胺、噻氯匹定(ticlopidine)、氨苯蝶啶(triamterene)、丙戊酸、阿霉素(doxorubicin)、甘油、西多福韦(cidofovir)、托普霉素(tobramycin)、硫酸新霉素(neomycin sulfate)、甲磺酸粘菌素(colistimethate)、万古霉素(vancomycin)、阿米卡星(amikacin)、头孢噻肟(cefotaxime)、顺铂、阿昔洛韦(acyclovir)、锂、白细胞间素-2、环孢菌素(cyclosporin)或茚地那韦(indinavir)引起。
除对肾小管上皮细胞的直接毒性外，一些肾毒素还减少肾灌注，对已知具有有限氧利用率的区域(内髓区)造成损伤。此类肾毒素包括两性霉素和放射性造影剂。与缺血、容量减少、梗阻或感染相结合时，甚至可由临床相关剂量的这些药物引起肾衰竭。实例为在肾功能受损的患者中使用放射性造影剂。造影剂诱导的肾病(CIN)的发病率在普通患者中为3-8％，但是对于糖尿病患者而言增加到25％。大多数ARI情况在有诱因性共病的患者中发生(McCombs,P.R.& Roberts,B.,Surg Gynecol.Obstet.,148:175-178(1979))。
因此，在一个实施方案中，有ARI风险的对象接受一种或多种具有肾毒性效应的治疗药物。在此类治疗剂之前或同时，向对象施用本技术的GLP-1肽。同样，可在治疗肾毒性的治疗剂之后施用GLP-1肽。
在一个实施方案中，向有CIN风险的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1肽，以便预防所述疾患。CIN是急性肾衰竭的一个重要原因。将CIN定义为在暴露于血管内放射显影物质48小时内发生的急性肾衰竭，并且仍然是放射性造影术的常见并发症。
CIN在对象暴露于放射性造影剂时，例如在冠状动脉、心脏或神经血管造影手术期间出现。造影剂对许多诊断和介入性手术而言必不可少，因为造影剂使得医生能够目测阻塞的身体组织。肌酐试验可用于监测CIN的发作、疾患的治疗和本发明的GLP-1肽在治疗或预防CIN中的功效。
在一些实施方案中，在施用造影剂之前或同时向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1肽以便提供对CIN的防护。例如，对象可在接受造影剂约1至2小时，约1至6小时，约1至12小时，约1至24小时或约1至48小时前，接受所述肽。同样，可在与造影剂大致相同的时间向对象施用所述肽。而且，可在施用造影剂之后继续向对象施用所述肽。在一些实施方案中，对象在施用造影剂之后间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、12、24和48小时，继续接受所述肽，以便提供对CIN的防护或预防作用。
在一些实施方案中，在施用造影剂之后向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1肽以便治疗CIN。例如，对象在接受造影剂约1至2小时，约1至6小时，约1至12小时，约1至24小时、约1至48小时或约1至72小时后，接受所述肽。例如，对象可在接受本发明的肽之前表现出CIN的一种或多种病征或症状，例如血清肌酐水平升高和/或尿量减少。与未施用所述肽的对照对象相比，施用本发明的肽改善了所述对象中这些肾功能指标中的一种或多种。
在一个实施方案中，有需要的对象可以是尿流减少的对象。可在尿道的任何地方发生尿流梗阻并且有许多可能原因，包括但不限于肾结石或膀胱/前列腺癌。单侧输尿管梗阻(UUO)是与尿流梗阻相关的常见临床病症。还与肾小管细胞凋亡、巨噬细胞浸润和间质性纤维化相关。尽管经手术矫正，但是间质性纤维化产生缺氧环境并且有助于肾功能逐渐下降。因此，可向患有UUO或有UUO风险的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以预防或治疗ARI。
在本发明的再一方面，提供了在有需要的哺乳动物中保护肾脏免于肾纤维化的方法。所述方法包括向哺乳动物施用如本文所述的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。如本文所述，可通过本领域中技术人员已知的任何方法向有需要的哺乳动物施用本文所述的肽。
在本发明的另一方面，通过了在有需要的哺乳动物中治疗急性肾损伤的方法。所述方法包括向哺乳动物施用如本文所述的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。如本文所述，可通过本领域中技术人员已知的任何方法向有需要的哺乳动物施用本文所述的肽。
本发明的方法在有可至少部分归因于药物或化学药品的肾毒性的肾机能不全、肾衰竭或晚期肾病的患者中可特别有用。其它指征可包括肌酐清除率水平低于97(男性)和88(女性)mL/min，或血尿素水平为20-25mg/dl或更高。此外，所述治疗在有微量白蛋白尿、大量白蛋白尿，和/或蛋白尿水平每24小时超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10g或更多，和/或血清肌酐水平为约1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4.0、4.5、5、5.5、6、7、8、9、10mg/dl或更高的患者中有用。
相对于对照对象，本发明的方法可用于使肾功能低于正常的患者中的肾病进展减缓或逆转25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，相对于对照对象，本发明的方法使肾功能丧失减缓至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。在其它实施方案中，相对于对照对象，本发明的方法使患者的血清肌酐水平、蛋白尿和/或尿白蛋白排泄率提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。本文和例如，WO 01/66140中描述了评估肾功能的非限制说明性方法。
在一个实施方案中，本文公开的肽，例如单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)也可用于在移植之前保护对象的肾脏免于急性肾损伤。例如，可将切除的肾脏置于含有本文所述的肽的溶液中。本领域中的技术人员可容易地测定标准缓冲溶液中肽的浓度。例如，此类浓度可介于约0.01nM至约10μM，约0.1nM至约10μM，约1μM至约5μM，或介于约1nM至约100nM之间。
单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)在预防或治疗ARI中有用并且也可适用于除肾脏外的其它系统中的组织损伤和器官衰竭。例如，预测单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会将线粒体功能障碍、细胞死亡、炎症和纤维化减到最少。在一些实施方案中，本发明提供了治疗有组织损伤，例如诸如胰腺炎、缺血、多处创伤、失血性休克和免疫介导的器官损伤的非传染性病理状况的对象的方法。
组织损伤可与(例如)主动脉瘤修复、多处创伤、周围性血管疾病、肾血管疾病、心肌梗塞、中风、脓毒症和多器官衰竭相关。一方面，本发明涉及治疗有来自于心脏、脑部、脉管系统、肠、肝脏、肾脏和眼的组织经受损伤和/或缺血事件的对象的方法。所述方法包括向对象单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合施用治疗有效量的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以提供治疗或预防作用。本发明的另一个实施方案提供施用本发明的肽以改善选自以下的一个或多个器官的功能：肾脏、肺部、心脏、肝脏、脑部、胰腺等。在一个特定实施方案中，肺部功能的改善选自水肿水平更低、组织学损伤评分提高和炎症水平更低。
在一些实施方案中，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)用于预防和/或治疗由缺血、药物(例如，醋胺酚、酒精)、病毒、肥胖症(例如，非酒精性脂肪肝炎)和梗阻(例如，胆道梗阻、肿瘤)引起的急性肝损伤。在一些实施方案中，向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以预防或治疗急性肝衰竭(ALF)。ALF是由对干细胞的严重广泛损伤引起的导致肝脏不能正常作用的临床疾患。ALF由导致肝性脑病和肝功能重度损伤的肝细胞大量坏死引起。其具有各种原因，例如病毒性肝炎(A、B、C型)、药物毒性、频繁的酒精中毒和自身免疫性肝炎。ALF是具有高死亡率的非常严重的临床疾患。在美国，药物相关的肝毒性是ALF的主要原因。
在一些实施方案中，在施用已知或怀疑诱导肝毒性的药物或试剂，例如醋胺酚之前或同时，向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，以便提供对ALF的防护。例如，对象可在接受所述药物或试剂约1至2小时，约1至6小时，约1至12小时，约1至24小时或约1至48小时前，接受所述肽。同样，可在与所述药物或试剂大致相同的时间向对象施用所述肽以提供对由所述药物或试剂引起的ALF的预防作用。而且，可在施用所述药物或试剂之后继续向对象施用所述肽。在一些实施方案中，对象可在施用所述药物或试剂之后间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、12、24和48小时，继续接受所述肽，以便提供防护或预防作用。
在一些实施方案中，向表现出ALF的一种或多种病征或症状，包括但不限于肝酶(转氨酶、碱性磷酸酶)水平升高、血清胆红素、氨、葡萄糖、乳酸盐或肌酐升高的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。与未施用所述肽的对照对象相比，施用本技术的肽改善了所述对象中这些肝功能指标中的一种或多种。对象可在ALF的第一病征或症状之后约1至2小时，约1至6小时，约1至12小时，约1至24小时、约1至48小时或约1至72小时，接受所述肽。
在一个实施方案中，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)用于治疗或改善灼伤的局部和远处病理生理学效应，包括但不限于代谢亢进和器官损伤。应意识到本文在不同详细级别上描述了本发明的某些方面、模式、实施方案、变化和特征，以便提供对本发明的实质性理解。
如本文所述的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)在治疗或预防灼伤和与灼伤相关的全身性疾患中有用。在一些实施方案中，在灼伤后和在全身损伤的可检测症状发作后向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。因此，术语“治疗”在其最广义上用于本文并且指使用Glp-1肽部分或完全治愈灼伤和/或继发性并发症，例如器官功能障碍和代谢亢进。
在其它实施方案中，在灼伤后，但是在全身损伤的可检测症状发作之前向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，以便防御或提供对全身损伤，例如器官损伤或代谢亢进的预防。因此术语“预防”在其最广义上用于本文并且指完全或部分预防对皮肤的局部损伤或全身损伤，例如灼伤后的器官功能障碍或代谢亢进的预防性用途。还考虑到可向有受到灼伤风险的对象施用所述化合物。
灼伤通常根据其严重程度和范围分类。一度灼伤最轻并且通常仅影响表皮。灼伤部位呈红色，并且疼痛、干燥、无水泡，并且可能由于液体渗漏而略湿。轻度晒伤是典型的一度灼伤。在二度灼伤中，表皮和真皮均受影响。通常在皮肤上出现水泡，对神经和皮脂腺有损伤。三度灼伤最严重，对所有皮层均有影响，包括皮下组织。通常没有水泡，灼伤表面由于炭化呈白色或黑色，或由于伤口底部的血液呈鲜红色。在大多数情况下，灼伤穿透浅筋膜，蔓延到动脉和静脉受影响的肌肉层。由于神经损伤，可能不痛。
考虑到单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合施用GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)对治疗任何原因的灼伤，包括干热灼伤或冷灼烧、烫伤、晒伤、电灼伤，化学剂例如酸和碱，包括氢氟酸、甲酸、无水氨、粘固粉和苯酚，或辐射灼伤。由于暴露于高温或低温引起的灼伤均在本发明的范围内。灼伤的严重程度和范围可能不痛，但是在灼伤非常广泛或非常严重(二度或三度灼伤)时，通常将出现继发性器官损伤或代谢亢进。继发性器官功能障碍或衰竭的发展取决于灼伤的范围、患者免疫系统的反应和其它因素，例如感染和脓毒症。
在一些实施方案中，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)用于预防或治疗灼伤继发性器官功能障碍。灼伤后导致器官功能障碍的一连串生理过程很复杂。在严重灼伤的对象中，儿茶酚胺、后叶加压素和血管紧张素的释放引起可危害损伤远处器官的灌注的外周和内脏床血管收缩。心肌收缩力也可因TNF-α的释放而降低。在灼伤后的数小时内，活化中性粒细胞隔绝在真皮和远处器官，例如肺部中，导致有毒活性氧和蛋白酶释放并产生血管内皮细胞损伤。当肺毛细血管和肺泡上皮细胞的完整性受损时，血浆和血压渗入间质肺泡内空间，导致肺水肿。在重度灼伤患者中，由于体液因子例如组胺、血清素和凝血噁烷A2引起的支气管收缩，可出现肺功能降低。
遭受灼伤的对象还有骨骼肌功能障碍的风险。虽然不希望受理论限制，但是认为灼伤诱导的骨骼肌线粒体功能障碍是由经由刺激线粒体生成活性氧(ROS)的氧化磷酸化(OXPHOS)的缺陷和对线粒体DNA(mtDNA)所产生的损伤引起。在一些实施方案中，预计GLP-1肽将经由线粒体氧化还原状态的恢复或经由早在灼伤6小时后下调的过氧化物酶体增殖物激活型受体-γ共激活因子-1诱导ATP合成。因此，预计灼伤引起的线粒体功能障碍将随着单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合施用GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)而恢复。
一方面，本方法涉及通过向对象施用有效量的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)治疗由灼伤产生的伤口。可全身性或局部性地向伤口施用所述肽。灼伤伤口通常在深度和严重程度上不一致。通常在凝固组织周围存在损伤可逆并且可防止由炎症和免疫细胞对皮肤微脉管系统介导的损伤的重要区域。在一个实施方案中，施用所述肽将减缓或改善伤口收缩的影响。伤口收缩是缩小全层开放性伤口，特别是全层灼伤的尺寸的过程。挛缩和皮下纤维组织形成期间发展的张力可导致变形，并且特别是对伤口涉及关节上方区域的关节固定弯曲或固定延伸。此类并发症尤其是在伤口愈合中有关。在没有对组织的损伤时不会发生伤口收缩，并且在灼伤为全层并在伤口中没有活体组织时将发生最大收缩。在一个实施方案中，预计施用所述肽将防止灼伤从二度灼伤进展到三度灼伤。
还预计治疗灼伤的方法对减少灼伤部位结疤或伴随愈合过程的疤痕组织形成也有效。结疤是在正常组织已经破坏的部位形成纤维组织。因此本公开还包括减少二度或三度灼伤后结疤的方法。这种方法包括用有效量的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)治疗有二度或三度灼伤的动物。
在一个特定实施方案中，向遭受灼伤的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以便治疗或预防对远侧器官或组织的损伤。具体而言，在皮肤或身体其它部位的灼伤之后，肺部、肝脏、肾脏和/或肠的功能障碍或衰竭对发病率和死亡率有显著影响。虽然不希望受理论限制，但是人们认为灼伤后在对象中出现全身性炎症反应，并且是导致表现为远离损伤部位的器官功能障碍和衰竭的远侧组织损伤的这种弥漫性炎症。全身损伤，包括器官功能障碍和代谢亢进，通常与二度和三度灼伤相关。全身损伤，即器官功能障碍或代谢亢进的特征在于引起后续损伤或疾患的灼伤并不直接影响问题器官，即所述损伤是灼伤继发性的。
在一个实施方案中，施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以治疗或预防对肝脏组织的灼伤继发性损伤。评估肝功能的方法在本领域中众所周知并且包括但不限于使用对血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平、碱性磷酸酶(AP)或胆红素水平的验血。评估肝脏结构退化的方法也众所周知。此类方法包括肝脏显像(例如，MRT、超声)或肝活检的组织学评价。
在一个实施方案中，施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以治疗或预防对肝脏组织的灼伤继发性损伤。评估肝功能的方法在本领域中众所周知并且包括但不限于使用对血清肌酐或肾小球滤过率的验血。评估肝脏结构退化的方法也众所周知。此类方法包括肝脏显像(例如，MRT、超声)或肝活检的组织学评价。
在一个实施方案中，施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以预防或治疗灼伤相关的代谢亢进。代谢亢进状态可能与高血糖症、蛋白质流失和瘦体重明显减轻相关。可通过施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)并且通过施用特定营养素、生长因子或其它试剂操纵对象的生理和生物化学环境实现代谢亢进反应的逆转。正如实例所证明，可向遭受灼伤的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以治疗或预防代谢亢进。
一方面，本公开提供了通过向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，在对象中预防灼伤或与灼伤相关的疾患的方法。可向有受到灼伤风险的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。在预防性应用中，向易受灼伤或另外有灼伤风险的对象施用GLP-1肽的药物组合物或药剂以消除或降低灼伤及其并发症的风险，减轻严重程度或延迟其发作。
本公开的另一方面包括为了治疗目的在对象中治疗灼伤和相关并发症的方法。在治疗性应用中，按足以治愈或部分阻止损伤症状，包括其并发症和在疾病发展中的中间病理表现型的量，向已经遭受灼伤的对象施用组合物或药剂。可在灼伤之后，但是在发展全身损伤的可检测症状，例如器官功能障碍或衰竭之前向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，因此术语“治疗”在其最广义上用于本文并且指完全或部分预防灼伤后的全身损伤，例如器官功能障碍或衰竭或代谢亢进的预防性用途。同样，本公开提供了治疗受灼伤折磨的个体的方法。
单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可在哺乳动物对象中预防或治疗代谢综合征。在一些情况下，代谢综合征可能是由于高脂饮食，或更通常地，是由于营养过剩和缺乏运动。单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可减少代谢综合征的一种或多种病征或症状，包括但不限于血脂异常、向心性肥胖、血脂异常和胰岛素抗性。
不希望受理论约束，人们认为线粒体完整性和胰岛素敏感性的丧失出于常见的代谢紊乱，即氧化应激。特别是由于高脂饮食的营养过剩可增加线粒体活性氧(ROS)生成和整体氧化应激，导致急性和慢性线粒体功能障碍及代谢综合征发展。单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)减轻了这些效应，从而改善了不同身体组织内的线粒体功能，并且改善了与代谢综合征相关的一种或多种风险因素。
本技术还涉及通过施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)减少代谢综合征的症状。
单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)用于预防或治疗疾病。具体地，本公开提供了治疗有代谢综合征风险(或易患代谢综合征)的对象的预防和治疗方法。代谢综合征通常与II型糖尿病、冠心病、肾功能障碍、动脉粥样硬化、肥胖症、血脂异常和原发性高血压相关。因此，本方法提供了通过向有需要的对象施用有效量的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，对对象中代谢综合征或相关疾患的预防和/或治疗。例如，可向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以改善促成代谢综合征的一个或多个因素。
一方面，所述技术可提供通过施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)在哺乳动物中治疗或预防与代谢综合征相关的特定病症，例如肥胖症、糖尿病、高血压和高脂血症的方法。在某些实施方案中，所述特定病症可为肥胖症。在某些实施方案中，所述特定病症可为血脂异常(即，高脂血症)。
在一个实施方案中，预计向表现出与代谢综合征相关的一种或多种疾患的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会引起那些疾患中的一种或多种的改善。例如，与接受GLP-1肽组合物之前的对象相比，对象可表现出体重减轻至少约5％、至少约10％、至少约20％或至少约50％。在一个实施方案中，与接受GLP-1肽组合物之前的对象相比，对象可表现出HDL胆固醇减少至少约5％、至少约10％、至少约20％或至少约50％和/或LDL胆固醇减少至少约5％、至少约10％、至少约20％或至少约50％。在一个实施方案中，对象可表现出一些甘油三酯减少至少约5％、至少约10％、至少约20％或至少约50％。在一个实施方案中，对象可表现出口服葡萄糖耐量(OGTT)提高至少约约5％、至少约10％、至少约20％或至少约50％。在一些实施方案中，对象在与代谢综合征相关的一种以上疾患中可显示出可观察到的改善。
一方面，本发明可提供通过向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，在对象中预防骨骼肌组织中与代谢综合征相关的疾病或疾患的方法，GLP-1调节代谢综合征的一种或多种病征或标志，例如体重、血清甘油三酯或胆固醇、空腹血糖/胰岛素/游离脂肪酸、口服葡萄糖耐量(OGTT)、体外肌肉胰岛素敏感性、胰岛素信号的标志(例如，Akt-P、IRS-P)、线粒体功能(例如，呼吸或H2O2生成)、细胞内氧化应激的标志(例如，脂质过氧化、GSH/GSSG比或顺乌头酸酶活性)或线粒体酶活性。可使用本领域众所周知的临床实验室技术测量空腹血糖/胰岛素/游离脂肪酸、口服葡萄糖耐量(OGTT)、胆固醇和甘油三酯水平等。
通过例如本文所述的诊断或预后测定法中的任一种或组合，可鉴定有代谢综合征风险的对象。在预防性应用中，按足以消除或降低疾病，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在疾病发展期间呈现的中间病理表现型的风险，减轻严重程度或延迟发作的量，向对疾病或疾患敏感或另外有疾病或病理风险的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的药物组合物或药剂。施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的预防性GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可在异常症状特征表现之前进行，以便预防，或可选地，在其进展中延迟疾病或病症。根据异常类型，起增强或提高线粒体功能的作用的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可用于治疗对象。可根据本文所述的筛选测定法确定适当的化合物。
所述技术的另一方面包括为了治疗目的在对象中减少与代谢综合征相关的症状的方法。在治疗性应用中，按足以治愈或部分阻止疾病症状，包括其并发症和在疾病发展中的中间病理表现型的量，向疑似患有或已经患有灼伤的对象施用组合物或药剂。同样，本发明提供了患有代谢综合征或代谢综合征相关疾病或病症的个体的方法。
本公开考虑到单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)与用于治疗血压、血甘油三酯水平或高胆固醇的一种或多种试剂的联合疗法。对代谢综合征、肥胖症、胰岛素抗性、高血压、血脂异常等的治疗也可包括各种其它方法，包括减重和运动，及饮食变化。这些饮食变化包括：维持将碳水化合物限制为总卡路里的50％或更少的饮食；食用定义为复合碳水化合物的食物，例如全麦面包(而不是白面包)、糙米(而不是白米)、未提炼的糖，通过食用豆类(例如，菜豆)、全谷类、水果和蔬菜增加纤维消耗，减少红肉和家禽的摄取，“健康”脂肪，例如橄榄油、亚麻油和坚果中的脂肪的消耗，限制饮酒等。另外，可通过各种可用药物(例如，胆固醇调节药物)控制对血压和血甘油三酯水平的治疗，凝血功能紊乱也可以(例如，经由阿司匹林(aspirin)治疗)并且一般而言，为血栓前或促炎状态。如果代谢综合征导致糖尿病，当然对这种疾病而言有许多疗法可用。
本技术涉及通过施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)治疗或预防眼科疾患。不希望受理论限制，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可通过减轻眼部中氧化性损伤的严重程度或减少其发生治疗或预防眼科疾病或疾患。在一个实施方案中，眼科疾患选自：干眼病、糖尿病性视网膜病、白内障、色素性视网膜炎、青光眼、黄斑变性、脉络膜新生血管、视网膜变性和氧诱导的视网膜病变。
预计用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)治疗将减少人视网膜上皮细胞(HREC)内的细胞内活性氧(ROS)。
预计用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)治疗将防止用高葡萄糖处理的HREC的线粒体电位损失。将在JC-l荧光探针染色后通过流式细胞术测量HREC的ΔΨm。预计高葡萄糖(30mM)处理将导致培养的HREC的线粒体膜电位迅速损失。相反，预计流式细胞术分析将显示与单独高葡萄糖组相比，用GLP-1组合物与30mM葡萄糖共同处理将使ΔΨm增加。
预计经高葡萄糖(HG)处理的HREC中半胱天冬酶-3的表达增加将受单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)处理减少。半胱天冬酶-3表达将标准化为β-肌动蛋白的表达。预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将增加经高葡萄糖处理的HREC中的Trx2表达。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)对主要人类视网膜色素上皮(RPE)细胞的活力无不良影响。
预计如本文所述的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将对预防或治疗疾病有用。具体地，本公开提供了治疗有(易患)眼科疾病或疾患风险的对象的预防和治疗方法。因此，本方法通过向有需要的对象施用有效量的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，在对象中提供了对眼科疾患的预防和/或治疗。例如，可向对象施用包含单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的组合物以改善促成眼科疾病或疾患的一个或多个因素。
本技术的一方面包括为了治疗目的在对象中减轻眼科疾患的方法。在治疗性应用中，按足以治愈或部分阻止/减轻疾病症状，包括并发症和在疾病发展中的中间病理表现型的量，向已知患有疑似患有疾病的对象施用组合物或药剂。同样，本公开提供了治疗患有眼科疾患的个体的方法。在一些实施方案中，本技术提供了在哺乳动物中通过施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，治疗或预防特定眼科病症，例如糖尿病性视网膜病、白内障、色素性视网膜炎、青光眼、脉络膜新生血管、视网膜变性和氧诱导的视网膜病变的方法。
在一个实施方案中，向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以治疗或预防糖尿病性视网膜病。糖尿病性视网膜病特征在于毛细血管微动脉瘤和点出血。之后，微血管阻塞引起在视网膜上形成棉絮斑。而且，在有糖尿病性视网膜病的个体中由于血管通透性增高可能形成视网膜水肿和/或硬性渗出物。随后，出现新血管形成并且由玻璃体内生长的结缔组织的牵引引起视网膜脱离。也可发生虹膜红变新生血管性青光眼，这又可导致失明。糖尿病性视网膜病的症状包括但不限于阅读困难，视力模糊，一只眼睛突然失明，看到光环，看到黑点和/或看到闪光。
在一个实施方案中，向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以治疗或预防白内障。白内障是特征在于天然晶状体透明度降低的先天性或获得性疾病。有白内障的个体可表现出一种或多种症状，包括但不限于晶状体表面混浊、晶状体内部混浊和/或晶状体肿胀。先天性白内障相关疾病的典型实例为假性白内障、膜白内障、冠状白内障、层状白内障、点状白内障和丝状白内障。获得性白内障相关疾病的典型实例为老年白内障、继发性白内障、褐变白内障、并发性白内障、糖尿病性白内障和外伤性白内障。获得性白内障也可由电击、辐射、超声波、药物、全身性疾病和营养失调诱发。获得性白内障还包括术后白内障。
在一个实施方案中，向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以治疗或预防色素性视网膜炎。色素性视网膜炎是特征在于视杆细胞和/或视锥细胞损伤的病症。视网膜内黑线的存在在患有色素性视网膜炎的个体中很典型。有色素性视网膜炎的个体还呈现出各种症状，包括但不限于头痛、四肢麻木或刺痛、闪光和/或视力变化。见，例如，Heckenlively等，Am.J.Ophthalmol.105(5):504-511(1988)。
在一个实施方案中，向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以治疗或预防青光眼。青光眼是特征在于眼内压增加，导致视力下降的遗传性疾病。青光眼可源于个体中已经存在的各种眼科疾患，例如伤口、手术和其它结构畸形。虽然青光眼可在任何年龄出现，但是常常在老年个体中发展并导致失明。青光眼患者通常具有超过21mm Hg的眼内压。然而，在不存在此类更高眼内压，即高于21mm Hg时可出现正常眼压性青光眼，其中在视野和视神经乳头上发现青光眼性改变。青光眼的症状包括但不限于视力模糊、严重的眼痛、头痛、看到光晕、恶心和/或呕吐。
在一个实施方案中，向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以治疗或预防黄斑变性。黄斑变性通常是一种年龄相关疾病。黄斑变性的一般类别包括干性、湿性和非年龄相关黄斑变性。占全部情况的约80-90％的干性黄斑变性也称为萎缩性、非渗出性或玻璃疣黄斑变性。随着干性黄斑变性，玻璃疣通常在视网膜色素上皮组织下积聚。随后在玻璃疣干扰黄斑内的光感受器功能时发生视力丧失。干性黄斑生成的症状包括但不限于斜视、中心视觉畸变、光或暗畸变和/或色彩感觉变化。干性黄斑变性可导致视力逐渐丧失。
在一个实施方案中，向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以治疗或预防脉络膜新生血管。脉络膜新生血管(CNV)是特征在于在眼睛的脉络膜层中形成新血管的疾病。新形成的血管在脉络膜中生长，穿过布鲁赫膜(Bruch membrane)，并且侵入视网膜下腔。CNV可导致视力受损或视力完全丧失。CNV的症状包括但不限于在患病的一只眼或双眼中看到摇曳、闪烁的光，视力模糊、失真和/或视力丧失。
在一个实施方案中，向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以治疗或预防视网膜变性。视网膜变性是涉及视网膜破裂的遗传性疾病。视网膜组产儿视网膜病和/或晶状体后纤维增生。视网膜变性通常包括视网膜劈裂症、格子样变性，并且与进行性黄斑变性有关。视网膜变性的症状包括但不限于视力受损、视力丧失、夜盲、视野狭隘、周边视力丧失、视网膜脱离和/或光敏性。
在一个实施方案中，向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)以治疗或预防氧诱导的视网膜病变。氧诱导的视网膜病变(OIR)是特征在于微血管变性的疾病。OIR是建立的用于研究早产儿视网膜病的模型。OIR与达到异常新血管形成的顶峰的血管细胞损伤相关。微血管变性导致缺血，缺血促成与OIR相关的物理变化。氧化应激也在OIR的发展中起重要作用，其中内皮细胞易受过氧化损伤。然而，周细胞、平滑肌细胞血管周星形细胞通常耐过氧化损伤。见，例如，Beauchamp等，J.Appl.Physiol.90:2279-2288(2001)。OIR，包括早产儿视网膜病，通常无症状。然而，异常眼运动、内斜视、严重近视和/或白瞳症，可以是OIR或早产儿视网膜病的病征。
一方面，预计本技术通过向对象施用调节眼科疾患的一种或多种病征或标志的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，提供了在对象中预防眼科疾患的方法。通过例如本文所述的诊断或预后测定法中的任一种或组合，可鉴定有眼科疾患风险的对象。在预防性应用中，按足以消除或降低疾病，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在疾病发展期间呈现的中间病理表现型的风险，减轻严重程度或延迟发作的量，向对疾病或疾患敏感或另外有疾病或病理风险的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的药物组合物或药剂。施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的预防性GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可在异常症状特征表现之前进行，以便预防，或可选地，在其进展中延迟疾病或病症。根据异常类型，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)起增强或提高线粒体功能或减少氧化性损伤的作用，并且可用于治疗对象。可根据本文所述的筛选测定法确定适当的化合物。
本文所述的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)对预防或治疗疾病有用。具体地，本公开提供了治疗患有或有(易患)心力衰竭风险的对象的预防和治疗方法。因此，本方法通过向有需要的对象施用有效量的GLP-1要在对象中提供了对心力衰竭的预防和/或治疗。见Tsutsui等，Antiox.Redox Sig.8(9):1737-1744(2006)。在特定实施方案中，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)用于通过增强心脏组织内的线粒体功能治疗或预防心力衰竭。
所述技术的一方面包括为了治疗目的在对象中治疗心力衰竭的方法。在治疗应用中，在治疗性应用中，按足以治愈或部分阻止疾病症状，包括其并发症和在疾病发展中的中间病理表现型的量，向疑似或已经患有此类疾病的对象施用组合物或药剂。同样，本发明提供了治疗患有心力衰竭的个体的方法。
可通过本领域已知的诊断或预后测定法中的任一种或组合鉴定患有心力衰竭的对象。例如，心力衰竭的典型症状包括呼吸急促(呼吸困难)、疲劳、虚弱、平躺时呼吸困难及腿部、脚踝或腹部肿胀(水肿)。对象也可患有其它病症，包括冠心病、系统性高血压、心肌病或心肌炎、先天性心脏病、心脏瓣膜异常或瓣膜性心脏病、严重肺病、糖尿病、严重贫血性甲状腺机能亢进、心律不齐或节律障碍和心肌梗塞。充血性心力衰竭的主要病征为：心肥大(心脏扩大)、呼吸急促(呼吸促迫；在左侧衰竭的情况下发生)和肝肿大(肝脏扩大；在右侧衰竭的情况下发生)。由于冠状动脉阻塞的急性心肌梗塞(“AMI”)是最终可导致心力衰竭的常见始发事件。然而，有AMI的对象不一定会发展心力衰竭。同样，患有心力衰竭的对象不一定会患有AMI。
一方面，本技术提供了通过向有需要的对象施用有效量的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)治疗高血压性心肌病的方法。当高血压性心肌病恶化时，可导致充血性心力衰竭。可通过本领域已知的诊断或预后测定法中的任一种或组合鉴定患有高血压性心肌病的对象。例如，高血压性心肌病的典型症状包括高血压(血压过高)、咳嗽、虚弱和疲劳。高血压性心肌病的附加症状包括腿部肿胀、增重、平躺时呼吸困难、活动时呼吸短促增加及半夜醒来呼吸短促。
一方面，本技术提供了通过向对象施用预防梗塞发生或进展的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，在对象中预防心力衰竭的方法。例如可通过如本文所述的诊断或预后测定法中的任一种或组合鉴定有心力衰竭风险的对象。在预防性应用中，按足以消除或降低疾病，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在疾病发展期间呈现的中间病理表现型的风险，减轻严重程度或延迟发作的量，向对疾病或疾患敏感或另外有疾病或病理风险的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的药物组合物或药剂。预计施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的预防性GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可在异常症状特征表现之前进行，以便预防，或可选地，在其进展中延迟疾病或病症。可根据本文所述的筛选测定法确定适当的化合物。
在各实施方案中，进行适合的体外或体内测定法以确定单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的特定GLP-1肽基治疗剂(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的作用及是否指示其施用用于治疗。在各实施方案中，用代表性动物模型进行体外测定法，以确定单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的指定GLP-1肽基治疗剂(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)是否在预防或治疗心力衰竭中发挥了所需作用。在人类对象中试验之前，可在适合动物模型系统，包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等中试验用于治疗的化合物。类似地，对于体内试验而言，在向人类对象施用之前，可使用本领域中已知的任何动物模型系统。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可在NAOPH氧化酶下游作用并响应于Ang II减少p38MAPK的活化和细胞凋亡。
预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将明显改善Gαq小鼠中心肌工作指数(MPI)的恶化。预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将大体上防止Gαq小鼠中标准化心脏重量的增加，并且标准化肺部重量增加将表现为来自于单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)治疗的作用。
预计本文所述的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将对预防或治疗疾病有用。具体地，本公开提供了治疗有(或易受)血管阻塞损伤、缺血-再灌注损伤或心脏缺血-再灌注损伤风险的对象的预防和治疗方法。因此，本方法通过向有需要的对象或做冠状动脉旁路移植(CABG)手术的对象施用有效量的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，在对象中提供了对血管阻塞损伤、缺血-再灌注损伤或心脏缺血-再灌注损伤的预防和/或治疗。
一方面，本技术提供了通过向对象施用预防疾患发生或进展的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，在对象中预防血管阻塞损伤的方法。例如可通过如本文所述的诊断或预后测定法中的任一种或组合鉴定有血管阻塞损伤风险的对象。在预防性应用中，按足以消除或降低疾病，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在疾病发展期间呈现的中间病理表现型的风险，减轻严重程度或延迟发作的量，向对疾病或疾患敏感或另外有疾病或病理风险的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的药物组合物或药剂。施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的预防性GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可在异常症状特征表现之前进行，以便预防，或可选地，在其进展中延迟疾病或病症。可根据本文所述的筛选测定法确定适当的化合物。在一些实施方案中，按足以预防来自CABG的肾或脑部并发症的量施用所述肽。
本技术的另一方面包括在对象中治疗血管阻塞损伤或缺血-再灌注损伤的方法。在治疗性应用中，按足以治愈或部分阻止疾病症状，包括其并发症和在疾病发展中的中间病理表现型的量，向疑似或已经患有此类疾病的对象施用组合物或药剂。同样，所述技术提供了通过施用有效量的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)并进行CABG手术，治疗患有缺血-再灌注损伤的个体或治疗患有心脏缺血-再灌注损伤的个体的方法。
本技术还可能涉及在哺乳动物中治疗或预防与急性心肌梗塞和器官移植相关的缺血-再灌注损伤的方法。一般而言，所述方法和组合物包括单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或其药学上可接受的盐组合的一种或多种GLP-1肽(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。
在一些方面，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)用于在哺乳动物中治疗急性心肌梗塞损伤的方法中。
在一些方面，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)用于治疗缺血和/或再灌注损伤哺乳动物的方法中。
在一些方面，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)用于治疗、预防或改善环孢霉素诱导的肾毒性损伤哺乳动物的方法中。
在一些方面，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)用于在哺乳动物中进行血运重建术的方法中。
在一个实施方案中，血运重建术选自：经皮冠状动脉介入术；球囊血管成形术；旁路移植插入术；支架插入术；和定向旋切术。在一些实施方案中，血运重建术包括去除阻塞。在一些实施方案中，血运重建术包括施用一种或多种血栓溶解剂。在一些实施方案中，所述一种或多种血栓溶解剂选自：组织纤溶酶原激活物；尿激酶；尿激酶原；链激酶；纤溶酶原的酰化形式；纤溶酶的酰化形式；和酰化链激酶-纤溶酶原复合物。
另一方面，本公开提供了冠状动脉血运重建的方法，包括：(a)同时、分开或依次施用有效量的(i)单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或其药学上可接受的盐组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)和(ii)附加活性剂；及(b)对对象进行冠状动脉旁路移植手术。在一些实施方案中，附加活性剂包含环孢霉素或环孢霉素衍生物或类似物。
另一方面，本公开提供了冠状动脉血运重建的方法，包括：(a)向哺乳动物对象施用治疗有效量的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或其药学上可接受的盐组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)；(b)向对象施用治疗有效量的孢霉素或环孢霉素衍生物或类似物；及(c)对对象进行冠状动脉旁路移植手术。
一方面，本发明提供了通过向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)和预防所述疾患发生或进展的环孢霉素，在对象中预防急性心肌梗塞损伤的方法。在预防性应用中，按足以消除或降低疾病，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在疾病发展期间呈现的中间病理表现型的风险，减轻严重程度或延迟发作的量，向对疾病或疾患敏感或另外有疾病或病理风险的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的药物组合物或药剂。施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的预防性GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可在异常症状特征表现之前进行，以便预防，或可选地，在其进展中延迟疾病或病症。
预计用本文公开的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，例如GLP-1或其药学上可解释的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)会保护肾脏免于急性肾损伤(ARI)。所述技术的另一方面包括治疗任何器官或组织中的缺血的方法。例如，所述方法涉及治疗肾脏(或其它器官)无法得到充足供血(缺血)的疾患。缺血是急性肾损伤(ARI)的主要原因。一个或两个肾的缺血是主动脉手术、肾移植期间，或心脏血管麻醉期间经历的常见问题。涉及夹紧主动脉和/或肾动脉的外科手术，例如肾上腺和近肾腹主动脉瘤的手术和肾移植，也特别易于引起肾缺血，导致明显的术后并发症和早期同种异体移植排斥。在进行这些手术的高危患者中，已经报道了肾功能障碍的发病率高达50％。技术人员将理解上述缺血的原因不限于肾脏，但是在外科手术期间可在其它器官中发生。因此，在一些实施方案中，可通过施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)和活性剂(例如环孢霉素或其衍生物或类似物)，治疗、预防、改善此类缺血(例如降低缺血的严重程度)。
本技术的另一方面包括预防或改善环孢霉素诱导的肾毒性的方法。例如，在一些实施方案中，向呈现出环孢霉素诱导的肾毒性或有环孢霉素诱导的肾毒性风险的对象施用包含单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的药物组合物或药剂。例如，在一些实施方案中，也向器官或组织移植后接受例如作为免疫抑制剂的环孢霉素的对象施用治疗有效量的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。在一些实施方案中，在器官或组织移植之前，在器官或组织移植期间和/或在器官或组织移植之后向对象施用所述肽。在一些实施方案中，对象将在器官或组织移植之前、期间和/或之后接受单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)与环孢霉素的组合。将按足以治愈或部分阻止肾毒性症状，包括其并发症和中间病理表现型的量施用包括单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)和任选地环孢霉素的组合物或药剂。例如，在一些实施方案中，按足以消除肾毒性，包括所述疾患的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和中间病理表现型的风险，降低风险，减轻严重程度或延迟发作的量，施用所述组合物或药剂。施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的预防性GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)和环孢霉素可在异常症状特征表现之前进行，以便预防，或可选地，在其进展中延迟所述疾患。通常，与未接受所述肽的对象相比，接受所述肽的对象将具有更健康的移植器官或组织，和/或能够维持更高和/或更一致的环孢霉素剂量或方案更长时间。在一些实施方案中，接受单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)连同环孢霉素的患者能够耐受更长和/或更一致的环孢霉素治疗方案，和/或更高剂量的环孢霉素。在一些实施方案中，接受单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)连同环孢霉素的患者与未接受所述肽的患者相比，将对环孢霉素具有更高的耐受性。
用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)治疗在减少胰岛细胞凋亡中有用并且增强移植后胰岛细胞的活力。
本文所述的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可在减少有需要的哺乳动物的氧化性损伤中有用。需要减少氧化性损伤的哺乳动物是遭受与氧化性损伤相关的疾病、疾患或治疗相关的那些哺乳动物。通常，氧化性损伤由自由基，例如活性氧(ROS)和/或活性氮(RNS)引起。ROS和RNS的实例包括羟基自由基、超氧阴离子自由基、一氧化氮、氢、次氯酸(HOCI)和过氧亚硝基阴离子。如果在施用有效量的本文所述的GLP-1肽之后，哺乳动物、移除器官或细胞内氧化性损伤的量减少，则认为氧化性损伤“减少”。
在一些实施方案中，待治疗的哺乳动物可以是有与氧化性损伤相关的疾病或疾患的哺乳动物。氧化性损伤可在哺乳动物的任何细胞、组织或器官中发生。在人类中，在许多疾病中涉及氧化应激。实例包括动脉粥样硬化、帕金森氏病、心力衰竭、心肌梗塞、阿尔茨海默氏病、精神分裂症、双相性精神障碍、脆性X染色体综合征和慢性疲劳综合征。
在一个实施方案中，哺乳动物可接受与氧化性损伤相关的治疗。例如，哺乳动物可接受再灌注。再灌注指恢复流向其中血流减少或受阻的任何器官或组织的血流。再灌注期间血流的恢复导致突发性呼吸和自由基形成。
在一个实施方案中，由于缺氧或缺血哺乳动物可具有减少或受阻的血流。缺氧或缺血期间供血损失或严重减少可能，例如，是由于栓塞性中风、冠状动脉粥样硬化或周围性血管疾病。许多器官和组织易受缺血或缺氧。此类器官的实例包括脑部、心脏、肾脏、肠和前列腺。受到影响的组织通常为肌肉，例如心肌、骨骼肌或平滑肌。例如，心肌缺血或缺氧通常由动脉粥样硬化或血栓堵塞引起，动脉粥样硬化或血栓堵塞导致通过心脏动脉和毛细血管供血向心脏组织的氧输送减少或损失。此类心脏缺血或缺氧可引起受影响的心肌疼痛和坏死，并且最终可导致心力衰竭。
所述方法也可用于减少与任何神经退行性疾病或疾患相关的氧化性损伤。神经退行性疾病可影响中枢和周围神经系统的任何细胞、组织或器官。此类细胞、组织和器官的实例包括脑部、脊髓、神经元、神经节、施旺细胞、星形细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。神经退行性疾患可为急性疾患，例如中风或创伤性脑损伤或脊髓损伤。在另一个实施方案中，神经退行性疾病或疾患为慢性神经退行性疾患。在慢性神经退行性疾患中，例如自由基可引起对蛋白质的损伤。此类蛋白质的实例为p-淀粉样蛋白。与受自由基损伤相关的慢性神经退行性疾病的实例包括帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)。
可治疗的其它疾患包括子痫前期、糖尿病及衰老症状和与衰老相关的疾患，例如黄斑变性和皱纹。
本文所述的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)在治疗与线粒体通透性转换(MPT)相关的任何疾病或疾患中有用。此类疾病和疾患包括但不限于组织或器官缺血和/或再灌注、缺氧及许多神经退行性疾病中的任一种。需要抑制或预防MPT的哺乳动物是患有这些疾病或疾患的那些哺乳动物。
因此，本公开描述了能够在长期MV期间减少隔膜内线粒体ROS生成，或在肢体固定或通常在肌肉废用期间减少其它骨骼肌，例如比目鱼肌或跖肌内的线粒体ROS生成的方法和包括线粒体靶向抗氧化剂、GLP-1肽的组合物。
一方面，本公开提供了线粒体靶向抗氧化剂、单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。例如，在一些实施方案中，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)在患有或有风险患上由线粒体源性ROS引起的肌肉虚弱例如肌无力、萎缩、功能障碍等的对象中用作治疗剂和/或预防剂。在一些实施方案中，预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)会减少肌肉中的线粒体ROS生成。另外或可选地，在一些实施方案中预计单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)将选择性地在骨骼肌线粒体内浓缩并且提供H2O2、OH-和ONOO-的自由基清除，并且在一些实施方案中，在剂量依赖性基础上发生自由基清除。
在一些实施方案中，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)用于治疗肌肉虚弱(例如肌无力、萎缩、功能障碍等)的方法中。在此类治疗性应用中，可按足以预防、减少、减轻或部分阻止肌肉虚弱，包括其并发症和在肌肉虚弱发展中的中间病理表现型的量，向疑似或已经患有肌肉虚弱的对象施用包括单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的组合物或药剂。同样，本发明提供了治疗患有或疑似患有本文所述肌肉虚弱的个体的方法。在一个实施方案中，施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。
另一方面，本公开提供了如本文所述，通过向对象施用预防或减少虚弱发生或进展的可能性的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，预防或减少肌肉虚弱可能性的方法。可容易地鉴定有发展肌肉虚弱风险的对象，例如准备或即将接受医学专业人员可设想到的MV或相关膈肌废用或任何其它骨骼肌废用(例如，为肢体铸型)的对象。
在预防性应用中，按足以消除或降低肌肉虚弱，包括虚弱的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在虚弱发展期间呈现的中间病理表现型的风险，减轻严重程度或延迟发作的量，向易患肌肉虚弱或另外有肌肉虚弱风险的对象施用包含单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的药物组合物或药剂。施用单独或与本文公开的一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的一种或多种GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可在异常症状特征表现之前进行，以便预防，或可选地，在其进展中延迟所述病症。可根据本文所述或本领域众所周知的筛选测定法确定适当的化合物。在一个实施方案中，药物组合物包括单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。
在一些实施方案中，需要防御或治疗肌肉虚弱的对象还包括遭受与氧化性损伤相关的疾病、疾患或治疗的对象。通常，通常，氧化性损伤由自由基，例如活性氧(ROS)和/或活性氮(RNS)引起。ROS和RNS的实例包括羟基自由基(HO.)、超氧阴离子自由基(O2 .-)、一氧化氮(NO.)、过氧化氢(H2O2)、次氯酸(HOCI)和过氧亚硝基阴离子(ONOO-)。
可在固定或废用之前、期间或之后的任何时间施用包含本文公开的治疗或预防与例如由于铸型或其它废用引起的肌肉固定相关的肌肉虚弱的GLP-1肽的组合物。例如，在一些实施方案中，可在肌肉固定或废用之前，在肌肉固定或废用之后立即，在肌肉固定或废用过程中，和/或在肌肉固定或废用之后(例如，在石膏去除之后)，施用一个或多个剂量的包含单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的组合物。举例而言，而非限制，在一些实施方案中，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可在固定或废用持续期间每天施用一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天六次或更多。在其它实施方案中，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可在固定或废用持续期间每天、隔天施用，每周两次、三次或四次，或每月一次、两次、三次、四次、五次或六次
在一些实施方案中，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可用于治疗或预防由肌肉废用或废用性萎缩引起，与肌肉质量和强度损失相关的肌肉虚弱的方法中。萎缩是与组织，例如纤维肌肉组织再吸收和变性有关的生理过程，其涉及细胞水平的凋亡。当由于营养支持丧失或其它疾病而发生萎缩时，称为病理性萎缩。此类萎缩或病理性萎缩可由肢体固定、长期肢体固定、石膏肢体固定、机械通气(MV)、长期MV、长期卧床休息恶病质、充血性心力衰竭、肝病、肌少症、消瘦、营养不良、血液循环不良、荷尔蒙失调、神经功能丧失等引起，或与之有关。因此，本方法涉及对象中包括骨骼肌萎缩在内的肌肉虚弱的预防和/或治疗，包括向有需要的对象施用有效量的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。
可通过施用本文公开的组合物和制剂治疗、预防或改善的肌肉虚弱另外的实例包括但不限于年龄相关性肌肉虚弱、与长期卧床休息相关的肌肉虚弱，与在太空飞行中一样，诸如与微重力相关的虚弱和萎缩的肌肉虚弱，与某些药物(例如，他汀类、抗逆转录病毒药和噻唑烷二酮(TZD))的作用相关的肌肉虚弱，和诸如恶病质，例如由癌症或其它疾病引起的恶病质的肌肉虚弱。
一方面，本技术涉及通过向有需要的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，对无复流解剖区的治疗或预防。在一个实施方案中，向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)在无复流解剖区形成之前进行。在另一个实施方案中，向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)在无复流解剖区形成之后进行。在一个实施方案中，所述方法连同血运重建术一起进行。还提供了治疗或预防心脏缺血-再灌注损伤的方法。还提供了在对象中治疗心肌梗塞以预防再灌注后对心脏的损伤的方法。一方面，本技术涉及一种冠状动脉血运重建方法，包括向哺乳动物对象施用治疗有效量的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)并且对对象进行冠状动脉旁路移植(CABG)手术。
一方面，本技术提供了通过向对象施用预防疾患发生或进展的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，在对象中预防无复流解剖区的方法。例如可通过如本文所述的诊断或预后测定法中的任一种或组合鉴定有无复流解剖区风险的对象。在预防性应用中，按足以消除或降低疾病或疾患，包括疾病或疾患的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在疾病或疾患发展期间呈现的中间病理表现型的风险，减轻严重程度或延迟发作的量，向对疾病或疾患敏感或另外有疾病或病理风险的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的药物组合物或药剂。施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的预防性GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可在异常症状特征表现之前进行，以便预防，或可选地，在其进展中延迟疾病或病症。
本技术的另一方面包括为了治疗目的在对象中治疗血管阻塞损伤、无复流解剖区或心脏缺血-再灌注损伤的方法。在治疗性应用中，按足以治愈或部分阻止疾病或疾患的症状，包括其并发症和在疾病或疾患发展中的中间病理表现型的量，向疑似或已经患有此类疾病或疾患的对象施用组合物或药剂。同样，本发明提供了治疗受无复流解剖区折磨的个体的方法。
IV.肽合成和GLP-1肽
用于本公开的方法中的肽(例如，GLP-1、其变体、类似物或药学上可接受的盐和诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)可通过本领域中已知的方法合成。化学合成蛋白质的示例、非限制性方法包括Stuart和Young在“Solid Phase Peptide Synthesis”，第二版，Pierce Chemical Company(1984)和在“Solid Phase Peptide Synthesis,”Methods Enzymol.289,Academic Press,Inc,NewYork(1997)中描述的方法。
本公开涉及GLP-1的一种或多种衍生物，包括GLP-1(7-36)酰胺，GLP-1的“生物活性”形式的用途。另外或可选地，可使用GLP-1的其它形式。替代形式包括：GLP-1(1-37)、GLP-1(1-36)、GLP-1(1-36)酰胺、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-37)、GLP-1(9-36)、GLP-1(9-37)和GLP-1(28-36)。另外或可选地，也证实具有生物活性的GLP-1的C端肽可用于本文公开的方法和组合物中。
V.剂量
在治疗或预防性应用的情况下，向对象施用的组合物的量将取决于疾病的类型和严重程度及个体的特征，例如总体健康状况、年龄、性别、体重和耐药性。还将取决于疾病的程度、严重程度和类型。技术人员将能够根据这些和其它因素确定适当剂量。所述组合物也可与一种或多种附加治疗化合物组合施用。
VI.施用模式
本领域中技术人员已知的使细胞、器官或组织与肽(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或其药学上可接受的盐接触的任何方法均可采用。适合的方法包括体外、离体或体内方法。
体外方法通常包括培养的样品。例如，可将细胞置于贮器(例如，组织培养板)内，并且在适合获得所需结果的适当条件下用肽培养。适合的培养条件可由本领域中的技术人员容易地测定。
离体方法通常包括取自哺乳动物，例如人的细胞、器官或组织。例如，可在适当条件下用所述肽培养细胞、器官或组织。通常将接触过的细胞、器官或组织返回到供体，置于受体体内或储存供将来使用。因此，所述肽通常在药学上可接受的载体中。
体内方法通常包括向哺乳动物例如人施用肽，例如本文所述的肽。按获得所需结果或治疗哺乳动物有效的量向哺乳动物施用用于本方法中的肽。在临床前试验和临床试验期间通过内科医生和临床医生熟悉的方法测定有效量。
可通过许多众所周知的施用药物组合物的方法中的任一种向有需要的哺乳动物施用有效量的用于本方法中，例如用于药物组合物中的肽。可全是或局部施用所述肽。
在一个实施方案中，静脉内施用所述肽。例如，可经由快速静脉团注施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。在一些实施方案中，如同恒速静脉输注那样施用所述肽。
所述肽也可经口服、局部、鼻内、肌肉内、皮下或经皮施用。在一个实施方案中，经皮施用是通过离子电渗疗法，其中带电的肽通过电流穿过皮肤输送。
其它施用途径包括脑室内或鞘内。脑室内指向脑部的脑室系统施用。鞘内指向脊髓蛛网膜下的间隙施用。因此对于影响中枢神经系统的器官或组织的那些疾病和疾患而言可优选脑室内或鞘内施用。
正如本领域中已知，用于本发明方法中的肽也可通过缓释向哺乳动物施用。缓释施用是在特定时间段内达到某一药物水平的药物递送方法。通常通过血清或血浆浓度测量所述水平。在通过引用整体并入本文的国际PCT申请第WO02/083106号中可找到对通过控释递送化合物的方法的描述。
制药领域中已知的任何制剂均适合施用用于本方法中的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。对于口服施用而言，可使用液体或固体制剂。制剂的实例包括片剂、明胶胶囊、丸剂、锭剂、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂、口香糖等。正如本领域中从业者所理解的那样，所述肽可与适合的药物载体(媒介物)或赋形剂混合。载体和赋形剂的实例包括淀粉、牛奶、糖、某些类型的粘土、明胶、乳酸、硬脂酸或其盐(包括硬脂酸镁或钙)、滑石、植物脂肪或油、树胶和乙二醇。
对于全身、脑室内、鞘内、局部、鼻内、皮下或经皮施用而言，用于本方法中的肽的制剂可利用传统稀释剂、载体或赋形剂等，例如本领域中已知递送所述肽的稀释剂、载体或赋形剂等。例如，所述制剂可包含以下的一种或多种：稳定剂、表面活性剂，优选非离子型表面活性剂，和任选盐和/或缓冲剂。所述肽可呈水溶液形式，或呈冻干形式递送。
稳定剂可包含(例如)氨基酸，例如甘氨酸；寡糖，例如蔗糖、海藻糖、乳糖或葡聚糖。可选地，稳定剂可包含糖醇，例如甘露糖醇。在一些实施方案中，稳定剂或稳定剂的组合占肽重量的约0.1％至约10％重量。
在一些实施方案中，表面活性剂为非离子型表面活性剂，例如聚山梨醇酯。适合表面活性剂的实例包括吐温20(Tween 20)、吐温80(Tween 80)；聚乙二醇或聚氧乙烯聚氧丙烯二醇，例如约0.001％(w/v)至约10％(w/v)的普朗尼克F-68(Pluronic F-68)。
盐或缓冲剂可为任何盐或缓冲剂，分别例如氯化钠或磷酸钠/钾。在一些实施方案中，缓冲剂将药物组合物的pH维持在约5.5至约7.5的范围内。盐和/或缓冲剂对将渗透压维持在适合向人或动物施用的水平也有用。在一些实施方案中，盐或缓冲剂以约150mM至约300mM的大致等渗浓度存在。
用于本方法中的肽的制剂可另外含有一种或多种传统添加剂。此类添加剂的实例包括增溶剂，例如甘油；抗氧化剂例如杀藻胺(季铵化合物的混合物，称为“quats”)、苯甲醇、氯惹酮或氯代丁醇；麻醉剂例如吗啡衍生物；和等渗剂，例如本文所述。作为抗氧化或其它损坏的进一步预防措施，药物组合物可储存在经不透水瓶塞密封的小瓶内的氮气下。
根据本发明治疗的哺乳动物可为任何哺乳动物，包括例如家畜，如羊、猪、牛和马；宠物，例如狗和猫；和实验动物，例如大鼠、小鼠和兔。在一个实施方案中，所述哺乳动物为人。
在一些实施方案中，按减少线粒体遭受次数，或预防MPT有效的量，向哺乳动物施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或其药学上可接受的盐组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。在临床前试验和临床试验期间通过内科医生和临床医生熟悉的方法测定有效量。
所述肽可全身或局部施用。在一个实施方案中，静脉内施用所述肽。例如，可经由快速静脉团注施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。在一个实施方案中，如同恒速静脉输注那样施用所述肽。
例如，可在血管成形术或冠状动脉旁路手术期间将所述肽直接注入冠状动脉，或涂到冠状动脉支架上。
剂量和给药方案将取决于疾病的严重程度、所用的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的特定GLP-1肽(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的特征(例如其治疗指数)、对象的特征及对象的病史。
本文所述的肽(例如，单独或与诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽组合的GLP-1)可掺入药物组合物中，单独或组合地施用给对象用于治疗或预防本文所述的病症。此类组合物通常包括活性剂和药学上可接受的载体。如本文所使用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相适的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂，等等。也可向组合物中掺入补充活性化合物。
通常将药物组合物配制成与预期施用途径相适。施用途径包括，例如肠胃外(例如，静脉、皮内、腹膜内或皮下)、口服、呼吸(例如，吸入)、经皮(局部)和经粘膜施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或混悬液可包括以下组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张性的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠调节pH。可将制剂装入由玻璃或塑料制成的安瓿一次性注射器或多剂量小瓶内。为了方便患者或主治医师，可在装有一个疗程(例如，治疗7天)的所有必要设备(例如，药瓶、稀释剂瓶、注射器和针头)的试剂盒内提供剂量配方。
适合注射使用的药物组合物可包括无菌水溶液(溶于水时)或分散体和供临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。对于静脉施用而言，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor(BASF,Parsippany,N.J.,USA)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，供肠胃外施用的组合物必须无菌并应配制为易于注射。所述组合物应在生产和储存条件下稳定，并且必须防护受诸如细菌和真菌等微生物的污染。
GLP-1肽组合物可包括载体，所述载体可为含有，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)或其适合混合物的溶剂或分散介质。例如，可通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂，维持适当的流动性。可通过各种抗菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现微生物作用的预防。在组合物中可包括谷胱甘肽和其它抗氧化剂以防氧化。在许多情况下，期望包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可通过使组合物中包括延缓吸收的试剂，例如单硬脂酸铝或明胶，实现注射组合物的长期吸收。
可通过在有以上所列成分中的一种或其组合的适当溶剂中掺入所需量的活性化合物，根据需要，接着过滤灭菌，制备无菌注射液。通常，通过向含有基本分散介质和来自以上所列的所需其它成分的无菌媒介物中掺入活性化合物制备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，典型的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，可得到活性成分加上来自于其先前经无菌过滤的溶液的任何附加所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。为了口服治疗施用的目的，活性化合物可与赋形剂一起并入并且呈片剂、锭剂或胶囊，例如明胶胶囊形式使用。口服组合物也可使用用作嗽口水的流体载体制备。可包括药学上相容的粘合剂，作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有以下任何成分或相似性质的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖；崩解剂例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂例如胶态二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或橙香精。
为了通过吸入施用，可从装有适合推进剂，例如诸如二氧化碳的气体的压力容器或分配器，或喷雾器呈气溶胶喷雾的形式递送所述化合物。此类方法包括美国专利第6,468,798号中描述的方法。
也可通过经粘膜或经皮方式全身施用如本文所述的治疗性化合物。对于经粘膜或经皮施用，在所述制剂中使用适于待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常在本领域中已知，并且例如对于经粘膜施用而言，包括洗涤剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻喷入法实现。对于经皮施用，如本领域中通常所知，将活性化合物配制成软膏剂、药膏、凝胶或霜剂。在一个实施方案中，经皮施用可通过离子电渗疗法进行。
治疗性蛋白质或肽可配制于载体体系中。载体可为胶体体系。胶体体系可为脂质体、双层磷脂媒介物。在一个实施方案中，在维持蛋白质完整性的同时将治疗性蛋白质封装在脂质体内。如本领域中的技术人员将认识到那样，存在各种制备脂质体的方法。(见Lichtenberg等，Methods Biochem.Anal.33:337-462(1988)；Anselem等，Liposome Technology,CRC Press(1993))。脂质体制剂可延迟清除并增加细胞摄取(见Reddy,Ann.Pharmacother.34(78):915-923(2000))。
所述载体也可为聚合物，例如生物可降解、生物相容的聚合物基体。在一个实施方案中，在维持蛋白质完整性的同时可将治疗性蛋白嵌入聚合物基体中。所述聚合物可以是天然的，例如多肽、蛋白质或多糖，或合成的，例如聚-羟基酸。实例包括由例如胶原、纤连蛋白、弹性蛋白、醋酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶及其组合构成的载体。在一个实施方案中，所述聚合物为聚-乳酸(PLA)或共聚乳酸/乙醇酸(PGLA)。聚合基体可呈各种形式和尺寸制备和分离，包括微球和纳米球。聚合物配方可引起疗效持续时间延长。(见Reddy,Ann.Pharmacother.34:915-923(2000))。人生长激素(hGH)的聚合物配方已经用于临床试验。(见Kozarich和Rich，Chemical Biology 2:548-552(1998))。
在PCT公布WO 99/15154(Tracy等)、美国专利第5,674,534和5,716,644号(均属于Zale等)、PCT公布WO96/40073(Zale等)和PCT公布WO 00/38651(Shah等)中描述了聚合物微球缓释配方的实例。美国专利第5,674,534和5,716,644号及PCT公布WO 96/40073描述了含有对与盐的聚集稳定的促红细胞生成素颗粒的聚合基体。
在一些实施方案中，用会保护治疗性化合物免于从体内快速消除的载体，例如控释制剂，包括移植物和微胶囊化递送体系，制备所述治疗性化合物。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类制剂可使用已知技术制备。例如，也可从AlzaCorporation(Mountain View,CA,USA)和Nova Pharmaceuticals,Inc.(Sydney,AU)购买获得所述材料。脂质体混悬液(包括靶向具有细胞特异性抗原的单克隆抗体的特定细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域中技术人员已知的方法制备，例如美国专利第4,522,811号中所述。
也可配制治疗性化合物以增强细胞内递送。例如，脂质体递送体系在本领域中已知。见，例如，Chonn和Cullis,Curr.Opin.in Biotech.6:698-708(1995)；Weiner,Immunometh.4(3):201-9(1994)；Gregoriadis,Trends Biotechnol.13(12):527-37(1995)。Mizguchi等，Cancer Lett.100:63-69(1996)描述了融合脂质体将蛋白质递送到体内和体外细胞的用途。
可通过标准制药过程在细胞培养物或实验动物中测定治疗剂的剂量、毒性和疗效，例如测定LD50(群体50％致死剂量)和ED50(群体50％治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比为治疗指数并且可表示为LD50/ED50。优选表现出高治疗指数的化合物。虽然可使用表现出毒副作用的化合物，但是应小心设计将此类化合物靶向患病组织部位的递送体系以将对未感染细胞的潜在损伤减到最小，从而减少副作用。
由细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的一系列剂量。此类化合物的剂量优选在包括ED50，有很少或无毒性的循环浓度范围内。剂量可根据采用的剂型和利用的施用途径在该范围内变化。对于本发明方法中使用的任何化合物而言，最初可由细胞培养测定估计治疗有效量。可在动物模型中配制一剂量以达到包括在细胞培养中测定的IC50(即，实现症状最大半数抑制的试验化合物浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更精确地测定在人类中的有用剂量。例如，可通过高效液相色谱法测量在血浆中的水平。
通常，本文公开的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)足以实现治疗或预防效果的有效量，范围从每日每千克体重约0.000001mg至每日每千克体重约10,000mg。在一些实施方案中，剂量范围将从每日每千克体重约0.0001mg至每日每千克体重约100mg。例如剂量可为每日1mg/kg体重或10mg/kg体重。例如剂量可为每日、每两日或每三日1mg/kg体重或10mg/kg体重或在每周、每两周或每三周1-10mg/kg的范围内。在一个实施方案中，肽的单剂量范围为0.1-10,000μg/kg体重。在一个实施方案中，载体中的GLP-1肽浓度范围为每递送1毫升0.2-2000μg。示例性治疗方案需要每日或每周施用一次。通过测量对象中葡萄糖或胰岛素的血液水平并相应地调节剂量或施用表明，间隔也可无规律。在一些方法中，调节剂量以达到所需空腹血糖或空腹胰岛素浓度。在治疗性应用中，有时需要间隔相对较短的相对高剂量直至疾病的发展减少或终止，或直至对象显示疾病症状部分或完全改善。之后，可向患者施预防性方案。
在一些实施方案中，将单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的治疗有效量定义为靶组织处10-11至10-6摩尔，例如约10-7摩尔的肽浓度。该浓度可按0.01-100mg/kg的全身剂量或相等剂量，通过体表区域递送。优化剂量时间表以维持靶组织处的治疗浓度，例如通过每日或每周单次施用，但是也包括持续施用(例如，胃肠外输注或经皮敷用)。
技术人员将认识到某些因素可影响有效治疗对象所需的剂量和定时，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前治疗、对象的总体健康状况和/或年龄，及其它疾病的存在。而且，用有效量的本文所述的治疗性组合物治疗对象可包括单一治疗或一系列治疗。
在一些实施方案中，按足以保护对象免于急性肾损伤(ARI)或急性肝衰竭(ALF)的量向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。同样，也可按治疗ARI或ALF有效的量向对象施用用于本方法中的肽。
如本文所使用，术语组合物的“有效量”或“药学有效量”或“治疗有效量”，是足以实现所需治疗和/预防效果的量，例如引起对ARI或ALF的预防或相关症状减少的量。向对象施用的本发明组合物的量将取决于疾病的类型和严重程度及个体的特征，例如总体健康状况、年龄、性别、体重和耐药性。也将取决于疾病的程度、严重程度和类型。技术人员将能够根据这些和其它因素确定适当剂量。本发明的组合物也可与一种或多种附加治疗化合物组合施用。在本方法中，可向具有由疾病或疾患引起的一种或多种ARI病征的对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。施用有效量的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可改善对象中ARI的至少一种病征或症状，例如代谢性酸中毒(血液酸化)、高钾血症(钾水平升高)、尿少或无尿(尿液生成减少或停止)、体液平衡变化和对其它器官系统的影响。例如，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的“治疗有效量”指将急性肾衰竭的生理效应保持在最低限度的水平。通常与未施用所述肽的一个对象或一类对象比较，测量生物学效应的功效。
本领域中技术人员已知的使细胞、器官或组织与肽接触的任何方法均可采用。适合的方法包括体外、离体或体内方法。体内方法通常包括向哺乳动物，例如人施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。当在体内用于治疗时，按有效量(即，具有所需疗效的量)向对象施用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。肽通常将经肠胃外、局部或口服施用。剂量和给药方案将取决与疾病或损伤的类型和严重程度、所用特定GLP-1肽和诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的任何芳香族阳离子肽的特征(例如其治疗指数)、对象的特征和对象的病史。
所述肽可配制成药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”指由碱或酸制备的可接受用于向患者，例如哺乳动物施用的盐(例如，对于指定给药方案具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。然而，应理解所述盐无需为药学上可接受的盐，例如并非意欲向患者施用的中间化合物的盐。药学上可接受的盐可由药学上可接受的无机或有机碱和药学上可接受的无机或有机酸得到。另外，当肽含有碱性部分，例如胺、吡啶或咪唑，和酸性部分例如羧酸或四唑时，可形成两性离子并且包括在如本文所使用的术语“盐”中。由药学上可接受的无机碱得到的盐包括铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰、亚锰、钾、钠和锌盐等。由药学上可接受的有机碱得到的盐包括伯胺、仲胺和叔胺，包括经取代的胺、环胺、自然存在的胺等，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N'-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、葡糖胺、组氨酸、哈胺(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因(procaine)、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、缓血酸胺等的盐。由药学上可接受的无机酸得到的盐包括硼酸、碳酸、氢卤酸(氢溴酸、盐酸、氢氟酸或氢碘酸)、硝酸、磷酸、氨基磺酸和硫酸的盐。由药学上可接受的有机酸得到的盐包括脂肪族羟基酸(例如，柠檬酸、葡糖酸、乙醇酸、乳酸、乳糖酸、苹果酸和酒石酸)、脂肪族一元羧酸(例如，醋酸、丁酸、甲酸、丙酸和三氟醋酸)、氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、芳香族羧酸(例如，苯甲酸、对氯苯甲酸、二苯基乙酸、龙胆酸、马尿酸和三苯基乙酸)、芳香族羟基酸(例如，邻羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、1-羟基萘-2-羧酸和3-羟基萘-2-羧酸)、抗坏血酸、二羧酸(例如，富马酸、马来酸、草酸和琥珀酸)、葡萄糖醛酸、扁桃酸、粘酸、烟酸、乳清酸、帕莫酸、泛酸、磺酸(例如苯磺酸、樟脑磺酸、乙二磺酸、乙磺酸、羟乙磺酸、甲磺酸、萘磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2,6-二磺酸和对甲苯磺酸)、昔萘酸(xinafoic acid)的盐、醋酸盐、三氟醋酸盐等。
在一些实施方案中，按“低”、“中”或“高”剂量水平提供单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。在一些实施方案中，低剂量为约0.001至约0.5mg/kg/h，或约0.01至约0.1mg/kg/h。在一些实施方案中，中等剂量为约0.1至约1.0mg/kg/h，或约0.1至约0.5mg/kg/h。在一些实施方案中，高剂量为约0.5至约10mg/kg/h，或约0.5至约2mg/kg/h。
在一些实施方案中，单独或与本文所述一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)(或药学上可接受的盐、酯、酰胺、前药或溶剂化物)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)与另一种治疗剂组合施用。举例而言，可向经历炎症，接受单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的患者联合施用抗炎剂。举例而言，可通过联合施用佐剂增强本文所述化合物的疗效。举例而言，可通过与已知或怀疑有助于预防或治疗特定疾患的另一种治疗剂组合施用本文所述的组合物，增强对患者的治疗效益。
联合疗法的非限制性实例包括连同一氧化氮(NO)诱导剂、他汀、带负电的磷脂、抗氧化剂、矿物、抗炎剂、抗血管生成剂、基质金属蛋白酶抑制剂或类胡萝卜素一起使用单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的一种或多种GLP-1肽(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。在一些实施方案中，与本文所述组合物组合使用的试剂可属于多个类别(例如，黄体素为抗氧化剂和类胡萝卜素)。此外，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可与可向患者提供效益，仅举例而言包括环孢菌素A在内的附加试剂一起施用。
另外，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)也可与可向患者提供附加或协同效益的手术，例如离体流变疗法(膜差示过滤)、植入式微型望远镜、疣激光凝固术和微刺激疗法组合使用。
已经证实使用抗氧化剂有益于患黄斑变性和营养不良的患者。见，例如，Arch.Ophthalmol.119:1417-36(2001)；Sparrow等，J.Biol.Chem.278:18207-13(2003)。适合与至少一种GLP-1肽组合使用的抗氧化剂的非限制性实例包括维生素C、维生素E、β-胡萝卜素和其它类胡罗卜素、辅酶Q、4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶N-氧基(Tempol)、黄体素、丁羟甲苯、白藜芦醇、trolox类似物(PNU-83836-E)和越桔提取物。
还已证实使用某些矿物有益于患黄斑变性和营养不良的患者。见，例如，Arch.Ophthalmol.119:1417-36(2001)。与单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的至少一种GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)组合使用的矿物的非限制性实例包括含铜矿物(例如，氧化铜)、含锌矿物(例如，氧化锌)和含硒化合物。
还已证实使用某些带负电的磷脂有益于患黄斑变性和营养不良的患者。见，例如，Shaban和Richter，Biol.,Chem.383:537-45(2002)；Shaban等，Exp.Eye Res.75:99-108(2002)。适合与至少一种GLP-1肽组合使用的带负电的磷脂的非限制性实例包括心磷脂和磷脂酰甘油。带正电和/或中性磷脂当与GLP-1肽组合使用时也可为患黄斑变性和营养不良的患者提供效益。
已经将某些类胡罗卜素的使用与维持光感受器细胞内必需的光保护作用联系起来。类胡罗卜素是可在植物、藻类、细菌和某些动物例如鸟类和贝类中找到的自然存在的萜类黄色至红色色素。类胡罗卜素是其中可鉴定出超过600种自然存在的种类的一大类分子。类胡罗卜素包括烃(胡罗卜素)及其氧化、醇类衍生物(叶黄素)。其包括海葵赤素、虾青素、角黄素、辣椒红素、辣椒玉红素、p-8'-阿朴胡萝卜素醛(阿朴-胡萝卜醛)、p-12'-阿朴-胡萝卜醛、a-胡罗卜素、p-胡罗卜素、胡罗卜素(a-和p-胡罗卜素的混合物)、y-胡罗卜素、p-隐黄素、黄体素、番茄红素、violerythrin、玉米黄质及含羟基或羧基的成员的酯。许多类胡罗卜素在自然界中呈顺式和反式异构体形式存在，而合成化合物常常作为外消旋混合物存在。
在人类中，视网膜选择性积聚两大类类胡罗卜素：玉米黄质和黄体素。认为这两类类胡罗卜素有助于保护视网膜，因为它们是有力的抗氧化剂并且吸收蓝光。对鹌鹑的研究已经确定用缺乏类胡罗卜素的饮食饲养的动物发育出具有低玉米黄质浓度的视网膜并且正如非常大量的凋亡光感受器细胞证实，遭受严重的光损伤。相反，用高类胡罗卜素饮食饲养的动物发育出具有高玉米黄质浓度，经得住最小光损伤的视网膜。适合与单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的至少一种GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)组合使用的类胡罗卜素的非限制性实例包括黄体素和玉米黄质，以及前述任何类胡罗卜素。
一氧化氮诱导剂包括刺激内源NO或升高体内内源内皮源性舒张因子(EDRF)的水平，或是一氧化氮合成酶的底物的化合物。此类化合物包括，例如L-精氨酸、L-高精氨酸和N-羟基-L-精氨酸，包括其亚硝基化和亚硝酰基化类似物(例如，亚硝基化L-精氨酸、亚硝酰基化L-精氨酸、亚硝基化N-羟基-L-精氨酸、亚硝酰基化N-羟基-L-精氨酸、亚硝基化L-高精氨酸和亚硝酰基化L-高精氨酸)、L-精氨酸的前体及其生理上可接受的盐，包括例如，瓜氨酸、鸟氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、包含这些氨基酸中的至少一种的多肽、酶精氨酸酶的抑制剂(例如，N-羟基-L-精氨酸和2(S)-氨基-6-硼己酸)和一氧化氮合成酶的底物、细胞因子、腺苷、缓激肽、钙网蛋白、比沙可啶(bisacodyl)和酚酞。EDRF是内皮分泌的血管松弛因子，并且已经鉴定为一氧化氮或其紧密相关的衍生物(Palmer等，Nature 327:524-526(1987)；Ignarro等，Proc.Natl.Acad.Sci.84:9265-9269(1987))。
他汀用作降脂剂和/或适合的一氧化氮诱导剂。另外，已经证明了使用他汀与延迟黄斑变性发作或发展之间的关系。G.McGwin等，Br.J.Ophthalmol.87:1121-25(2003)。因此当与单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)组合施用时，他汀可向患有眼科疾患(例如黄斑变性和营养不良，及视网膜营养不良)的患者提供效益。仅举例而言，适合的他汀包括瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、匹伐他汀(pitivastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、美伐他汀(mevastatin)、维乐他汀(velostatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、康帕丁(compactin)、洛伐他汀(lovastatin)、达伐他汀(dalvastatin)、氟因多他汀(fluindostatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、阿托伐他汀钙(为阿托伐他汀的半钙盐)和二羟基康帕丁。
仅举例而言，适合与单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)组合使用的抗炎剂包括阿司匹林(aspirin)和其它水杨酸盐、色甘酸(cromolyn)、奈多罗米(nedocromil)、茶碱(theophylline)、齐留通(zileuton)、扎鲁司特(zafirlukast)、孟鲁司特(montelukast)、普仑司特(pranlukast)、消炎痛(indomethacin)、脂肪氧合酶抑制剂、非甾体抗炎药(NSAID)(例如，布洛芬(ibuprofen)和萘普生(naproxin))、强的松(prednisone)、地塞米松(dexamethasone)、环加氧酶抑制剂(即，COX-1和/或COX-2抑制剂例如NaproxenTM和CelebrexTM)、他汀(例如瑞舒伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、维乐他汀、氟伐他汀、康帕丁、洛伐他汀、达伐他汀、氟因多他汀、阿托伐他汀、阿托伐他汀钙(为阿托伐他汀的半钙盐)和二羟基康帕丁)和无关联的类固醇。
基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂也可与本文所述用于治疗眼科疾患或与黄斑变性或视网膜变性相关的症状的组合物组合施用。已知MMP水解细胞外基质的大部分组分。这些蛋白酶在许多生物过程例如正常组织重构、胚胎发生、伤口愈合和血管发生中起中心作用。然而，高水平的MMP与许多病状，包括黄斑变性相关。已经鉴定了许多MMP，其中大部分为多结构域锌肽链内切酶。已知许多金属蛋白酶抑制剂(见，例如，Whittaker等，Chem.Rev.99(9):2735-2776(1999))。MMP抑制剂的代表性实例包括金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)(例如，TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4)、-2-巨球蛋白、四环素(例如，四环素、米诺环素、强力霉素)、异羟肟酸盐(例如，BATIMASTATTM、MARIMISTATTM和TROCADETM)、螯合剂(例如，EDTA、半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、D-青霉胺、金盐)、合成MMP片段、琥珀酰巯基嘌呤、磷酰胺和异羟肟酸。适合与本文所述的组合物组合使用的MMP抑制剂的非限制性实例包括前述任何抑制剂。
还已证实使用抗血管生成药或抗VEGF药对患黄斑变性和营养不良的患者提供效益。适合与至少一种GLP-1肽组合使用的抗血管生成药或抗VEGF药的实例包括rhufab V2(LuccntisTM)、色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)、eye001(抗VEGF聚乙二醇化适配子)、角鲨胺(squalamine)、RetaaneTM(贮库型混悬剂用乙酸阿奈可他)、康普瑞汀A4(combretastatin A4)前药(CA4P)、MacugenTM、MifeprexTM(米非司酮(mifepristone)-ru486)、眼筋膜囊内曲安奈德(triamcinolone acetonide)、玻璃体内晶体曲安奈德、普马司他(prinomastat)(AG3340)、醋酸氟轻松(包括氟轻松眼内植入物)、VEGFR抑制剂和VEGF-Trap。
已经用于缓解视觉缺陷的其它药物疗法可与至少一种GLP-1肽组合使用。此类治疗包括但不限于以下试剂，例如借助于非热能激光的VisudyncTM、PKC412、恩多维隆(endovion)、神经营养因子(例如，胶质源性神经营养因子、睫状神经营养因子)、diatazem、多佐胺(dorzolamide)、phototrop、9-顺-视黄醛、眼药(包括回声疗法)(包括碘磷灵或依可酯或碳酸酐酶抑制剂)、AE-941、Sima-027、哌加他尼(pegaptanib)、神经营养蛋白(neurotrophin)(例如，NT-4/5)、cand5、雷珠单抗(ranibizumab)、INS-37217、整合素拮抗剂、EG-3306、BDM-E、沙立度胺(thalidomide)、心肌营养素-1、2-甲氧雌甾二醇、DL8234、NTC-200、四硫钼酸盐、LYN-002、微藻类化合物、D-9120、ATX-S10、TGF-β2、酪氨酸激酶抑制剂、NX-278-L、Opt-24、枧网膜细胞神经节神经保护剂、N-硝基吡唑衍生物、KP-I02和环孢菌素A。
可按任何顺序或同时施用多种治疗剂。如果同时，则所述试剂可呈单一、统一形式，或呈多种形式(即，作为单一溶液或作为两种单独的溶液)提供。其中一种治疗剂可分多个剂量给予，或二者均可作为多个剂量给予。如果不同时，则多个剂量之间的定时可从零周至小于约4周、小于约6周、小于约2个月、小于约4个月、小于约6个月或小于约1年变化。另外，联合方法、组合物和制剂不限于仅使用两种试剂。举例而言，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可与至少一种抗氧化剂和至少一种带负电的磷脂一起提供。举例而言，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可与至少一种抗氧化剂和至少一种一氧化氮生成诱导剂一起提供。举例而言，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可与至少一种一氧化氮生成诱导剂和至少一种带负电的磷脂一起提供。
另外，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)可与可向患者提供附加或协同效益的手术组合使用。例如，已知、推荐或认为缓解视觉缺陷的手术包括但不限于“局限性视网膜转位术”、光动力疗法(例如，受体靶向PDT、与PDT一起使用的卟吩姆钠(porfimersodium)注射剂、维替泊芬(verteporfin)、与PDT一起使用的罗他泊芬(rostaporfin)、与PDT一起使用的他拉泊芬钠(talaporfin sodium)、莫特沙芬镥(motexafinlutetium))、反义寡核苷酸(例如，Novagali Pharma SA的产品，ISIS-13650)、激光凝固术、疣激光作用、黄斑裂孔手术、黄斑转位术、植入式微型望远镜、-运动血管造影术(微激光疗法和滋养血管治疗)、质子束疗法、微刺激疗法、视网膜脱离和玻璃体手术、巩膜扣压术、黄斑下手术、经瞳孔温热疗法、光系统I疗法、使用RNA干扰(RNAi)、离体流变疗法(膜差示过滤和血液净化疗法)、微芯片植入、干细胞疗法、基因替代疗法、核酶基因疗法(包括缺氧反应元件的基因疗法、LENTIPACTM、PDEF基因疗法)、光感受器/视网膜细胞移植(包括可移植视网膜上皮细胞、视网膜细胞移植物)和针刺疗法。
可用于使个体受益的另外的组合包括使用基因检测确定个体是否是已知与某些眼科疾患相关联的突变基因的携带者。仅举例而言，认为人ABCA4基因中的缺陷与5种不同的视网膜表现型相关，包括斯特格氏病(Stargardt disease)、视锥-视杆细胞营养不良、年龄相关性黄斑变性和色素性视网膜炎。见例如，Allikmets等，Science 277:1805-07(1997)；Lewis等，Am.J.Hum.Genet.64:422-34(1999)；Stone等，Nature Genetics 20:328-29(1998)；Allikmets,Am.J Hum.Gen.67:793-799(2000)；Klevering等，Ophthalmology 111:546-553(2004)。另外，斯特格氏病的常染色体显性形式由ELOV4基因的突变引起。见Karan等，Proc.Natl.Acad.Sci.(2005)。预计具有这些突变中的任一种的患者会受益于本文所述的治疗和/或预防方法。
在一些实施方案中，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)与一种或多种附加试剂组合用于预防或治疗心力衰竭。心力衰竭的药物治疗通常涉及利尿剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、地高辛(洋地黄)、钙通道阻断剂和β-阻断剂。在轻微的情况下，噻嗪类利尿剂，例如25-50mg/日的双氢氯噻嗪或250-500mg/日的氯噻嗪有用。然而，因为慢性利尿引起低血钾性碱中毒，所以可能需要补充氯化钾。而且，噻嗪类利尿剂通常在有心力衰竭晚期症状的患者中无效。ACE抑制剂的典型剂量包括2550mg/日的卡托普利(captopril)和10mg/日的喹那普利(quinapril)。
在一个实施方案中，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)与肾上腺素能β-2激动剂组合。“肾上腺素能β-2激动剂”指肾上腺素能β-2激动剂及其类似物和衍生物，包括例如具有肾上腺素能β-2激动剂生物活性的天然或合成功能变体，以及肾上腺素能β-2激动剂的具有肾上腺素能β-2激动剂生物活性的片段。术语“肾上腺素能β-2激动剂生物活性”指模拟对象体内的肾上腺素和去甲肾上腺素的效应并且提高有心力衰竭的患者中的心肌收缩力的活性。通常所知的肾上腺素能β-2激动剂包括但不限于克仑特罗(clenbuterol)、舒喘灵(albuterol)、福莫特罗(formeoterol)、左旋沙丁胺醇(levalbuterol)、奥西那林(metaproterenol)、吡布特罗(pirbuterol)、沙美特罗(salmeterol)和特布他林(terbutaline)。
在一个实施方案中，单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)与肾上腺素能β-1拮抗剂组合。肾上腺素能β-1拮抗剂和肾上腺素能β-1阻断剂指肾上腺素能β-1拮抗剂及其类似物和衍生物，包括例如具有肾上腺素能β-1拮抗剂生物活性的天然或合成功能变体，以及肾上腺素能β-1拮抗剂的具有肾上腺素能β-1拮抗剂生物活性的片段。肾上腺素能β-1拮抗剂生物活性指阻断肾上腺素对β受体的作用的活性。通常所知的肾上腺素能β-1拮抗剂包括但不限于醋丁洛尔(acebutolol)、阿替洛尔(atenolol)、倍他索洛尔(betaxolol)、比索洛尔(bisoprolol)、艾司洛尔(esmolol)和美托洛尔(metoprolol)。
克仑特罗，例如，以许多商标名称可用，包括Spiropent、 Cesbron和Clenbuter。类似地，制备肾上腺素能β-1拮抗剂例如美托洛尔及其类似物和衍生物的方法在本领域中众所周知。美托洛尔尤其以Novartis Pharmaceuticals Corporation(East Hanover,N.J.,USA)生产的商标名称(酒石酸美托洛尔)在市场上销售。的仿制形式也可从MylanLaboratories Inc.(Canonsburg,PA,USA)和Watson Pharmaceuticals,Inc.(Morristown,N.J.,USA)得到。美托洛尔也可以Astra Zeneca,LP(London,G.B.)生产的商标名称Toprol在市场上销售。
在一个实施方案中，附加治疗剂与单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)组合施用给对象，以致产生协同疗效。“协同疗效”指通过两种治疗剂的组合产生的，并且超过另外将由单独施用任一种单独治疗剂产生的疗效的超累加性疗效。因此，在治疗特定疾患中可使用较低剂量的一种或两种治疗剂，导致疗效增加并且副作用减少。
在一个实施方案中，在缺血之前向对象施用本文所述的组合物。在一个实施方案中，在缺血组织再灌注之前向对象施用所述组合物。在一个实施方案中，在缺血组织再灌注时向对象施用所述组合物。在一个实施方案中，在缺血组织再灌注之后向对象施用所述组合物。
在一个实施方案中，在CABG或血运重建术之前向对象施用本文所述的组合物。在另一个实施方案中，在CABG或血运重建术之后向对象施用所述组合物。在另一个实施方案中，在CABG或血运重建术期间和之后向对象施用所述组合物。在另一个实施方案中，在CABG或血运重建术之前、期间和之后向对象施用所述组合物。
在一个实施方案中，在CABG或血运重建，即缺血组织再灌注前至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少3小时、至少5小时、至少8小时、至少12小时或至少24小时开始向对象施用本文所述的组合物。在一个实施方案中，从CABG或血运重建术前约5-30分钟、约10-60分钟、约10-90分钟或约10-120分钟，向对象施用所述肽。在一个实施方案中，向对象施用所述肽直至CABG或血运重建术之后约5-30分钟、约10-60分钟、约10-90分钟、约10-120分钟或约10-180分钟。
在一个实施方案中，在CABG手术或血运重建术，即缺血组织再灌注之后至少30分钟、至少1小时、至少3小时、至少5小时、至少8小时、至少12小时或至少24小时向对象施用所述组合物。在一个实施方案中，施用所述组合物直至CABG手术或血运重建术，即缺血组织再灌注之后约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约8小时、约12小时或约24小时。
在一个实施方案中，在再灌注前约1分钟至30分钟(即在再灌注前约5分钟、约10分钟、约20分钟或约30分钟)开始作为IV输注向对象施用所述肽并且在再灌注后约1小时至约24小时(即在再灌注候约1小时、约2小时、约3小时、约4小时等)继续。在一个实施方案中，在再灌注期后对象继续长期地接受所述组合物，即在再灌注期后约1-7天，约1-14天或约1-30天。在此期间，可通过任何途径，例如皮下或静脉施用所述组合物。
在一个实施方案中，通过在麻醉诱导前约5-60分钟、约10-45分钟或约30分钟开始通过全身静脉输注施用所述肽组合物。在一个实施方案中，所述肽组合物连同心脏停搏液一起施用。在一个实施方案中，心肺分流术期间所述肽作为心肺机中预充液的一部分施用。
在不同实施方案中，对象患有心肌梗塞、中风，或需要血管成形术。在一个实施方案中，血运重建术选自球囊血管成形术、支架插入术、经皮冠状动脉介入术(PCI)、经皮冠状动脉腔内血管成形术或定向旋切术。在一个实施方案中，血运重建术包括去除阻塞。在一个实施方案中，血运重建术包括施用一种或多种血栓溶解剂。在一个实施方案中，所述一种或多种血栓溶解剂选自：组织纤溶酶原激活物、尿激酶、尿激酶原、链激酶、纤溶酶原的酰化形式、纤溶酶的酰化形式和酰化链激酶-纤溶酶原复合物。
在一个实施方案中，血管阻塞包括心脏血管阻塞。在另一个实施方案中，血管阻塞为颅内血管阻塞。再一个实施方案中，血管阻塞选自：深静脉血栓形成、外周血栓形成、栓塞性血栓形成、肝静脉血栓形成、静脉窦血栓形成、静脉血栓形成、阻塞动静脉分流和阻塞导管装置。
一方面，本技术涉及动脉粥样硬化性血管疾病(ARVD)的治疗，包括向有需要的对象施用治疗有效量的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。在一些实施方案中，所述治疗为施用超过1周的慢性治疗。
另一方面，本技术涉及在无组织再灌注时对缺血性损伤的治疗或预防。例如，可向一个或多种组织或器官经历急性缺血，例如并非血运重建术的适合候选者或对其而言血运重建术并非容易使用的患者施用肽。另外或可选地，向一个或多个组织中有慢性缺血的患者施用所述肽以防需要血运重建术。在无组织再灌注时施用肽以治疗或预防缺血性损伤的患者可在血运重建术之前、期间和之后根据本文所述的方法另外施用肽。
在一个实施方案中，肾再灌注损伤的治疗包括与未施用所述肽的类似对象相比，增加对象组织灌注的量或面积。在一个实施方案中，肾再灌注损伤的预防包括与未施用所述肽的类似对象相比，减小对象因再灌注引起的微血管损伤的量或面积。在一些实施方案中，肾再灌注损伤的治疗或预防包括与未施用所述肽的类似对象相比，减少对象中再灌注后对受影响的血管的损伤，减少受血细胞堵塞的影响，和/或减少内皮细胞肿胀。可通过本领域中已知的任何技术，包括但不限于测量肾体积、肾动脉压、肾血流量(RBF)和肾小球滤过率(GFR)，以及通过本领域中已知的成像技术，包括但不限于CT和显微CT测量预防或治疗的程度。可通过将用这些成像技术中的任一种观察到的对象肾再灌注损伤的程度与未施用所述肽的对照对象或对照对象群体作比较，确定预防或治疗成功。
在一个实施方案中，向对象施用所述肽是在肾再灌注损伤发生之前。例如，在一些实施方案中，施用所述肽以抑制、预防或治疗有需要的对象中的缺血性损伤，和/或防止再灌注治疗和/或减轻或改善再灌注损伤。另外或可选地，在一些实施方案中，向对象施用所述肽是在肾再灌注损伤发生之后。在一个实施方案中，所述方法连同血运重建术一起进行。在一个实施方案中，血运重建术为经皮腔内肾血管成形术(PTRA)。一方面，本技术涉及肾动脉重建的方法，其包括向哺乳动物对象施用治疗有效量的芳香族阳离子肽并且对对象进行PTRA。
在一个实施方案中，在血运重建术之前，向对象施用诸如D-Arg-2′,6′-Dmt-Lys-Phe-NH2的肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐。在另一个实施方案中，在血运重建术之后向对象施用所述肽。在另一个实施方案中，在血运重建术期间和之后向对象施用所述肽。再一个实施方案中，在血运重建术之前、期间和之后不断地向对象施用所述肽。在另一个实施方案中，在肾动脉狭窄和/或肾动脉重建术之后定期(即，长期)向对象施用所述肽。
在一些实施方案中，在血运重建术之后向对象施用所述肽。在一个实施方案中，在血运重建术之后向对象施用所述肽至少3小时、至少5小时、至少8小时、至少12小时或至少24小时。在一些实施方案中，在血运重建术之前向对象施用所述肽。在一个实施方案中，在血运重建术前至少8小时、至少4小时、至少2小时、至少1小时或至少10分钟开始向对象施用所述肽。在一个实施方案中，在血运重建术之后向对象施用所述肽至少一周、至少一个月或至少一年。在一些实施方案中，在血运重建术之前和之后向对象施用所述肽。在一些实施方案中，在指定时间段内作为输注向对象施用所述肽。在一些实施方案中，所述肽作为推注向对象施用。
在一些实施方案中，本方法包括连同一种或多种血栓溶解剂一起施用肽。在一些实施方案中，所述一种或多种血栓溶解剂选自：组织纤溶酶原激活物、尿激酶、尿激酶原、链激酶、纤溶酶原的酰化形式、纤溶酶的酰化形式和酰化链激酶-纤溶酶原复合物。
Glp-1类似物
在一些方面，本公开提供了已经修饰以提高稳定性的单独或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。
使肽对酶促降解稳定的一种方式是在经历裂解的肽键处用D-氨基酸置换L-氨基酸。制备除已经存在的D-Arg残基外，还含有一个或多个D-氨基酸残基的Glp-1肽类似物。防止酶促降解的另一种方式是在所述肽的一个或多个氨基酸残基处的α-氨基N-甲基化。这将防止肽键受任何肽酶裂解。实例包括：H-D-Arg-Dmt-Lys(NαMe)-Phe-NH2；H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe(NMe)-NH2；H-D-Arg-Dmt-Lys(NαMe)-Phe(NMe)-NH2；和H-D-Arg(NαMe)-Dmt(NMe)-Lys(NαMe)-Phe(NMe)-NH2。Nα-甲基化类似物具有较低的氢键结合能力并且可预计具有更高的肠道通透性。在一些实施方案中，通过所述肽的一个或多个氨基酸残基处的α-氨基N-甲基化修饰Glp-1。
使肽酰胺键(-CO-NH-)对酶促降解稳定的替代方式是其用还原酰胺键(Ψ[CH2-NH])置换。这可在固相肽合成中用Boc-氨基酸-醛与增长肽链的N-端氨基酸残基的氨基之间的还原烷基化反应实现。预计由于氢键结合能力减小，还原型肽键将导致细胞通透性提高。实例包括：H-D-Arg-Ψ[CH2-NH]Dmt-Lys-Phe-NH2、H-D-Arg-Dmt-Ψ[CH2-NH]Lys-Phe-NH2、H-D-Arg-Dmt-LysΨ[CH2-NH]Phe-NH2、H-D-Arg-Dmt-Ψ[CH2-NH]Lys-Ψ[CH2-NH]Phe-NH2等。在一些实施方案中，Glp-1经修饰为包括还原酰胺键(Ψ[CH2-NH])。
可在血浆、人工胃液(SGF)和人工肠液(SIF)中对稳定Glp-1类似物进行稳定性筛选。将一定量的肽添加到10ml有胃蛋白酶的SGF(Cole-Palmer)或有胰酶的SIF(Cole-Palmer)中，混合并温育0、30、60、90和120分钟。在固相萃取后通过HPLC分析样品。然后评估在SGF和SIF中均稳定的新类似物在Caco-2单层上的分布。然后经测定表观渗透系数>10-6cm/s(可预测肠道吸收良好)的类似物将具有在细胞培养物中测定的降低线粒体氧化应激的活性。使用超氧化物MitoSox和HyPer-mito(靶向线粒体感测H2O2的基因编码荧光指示剂)通过FACS量化线粒体ROS。线粒体氧化应激物可包括叔丁基过氧化氢、抗霉素和血管紧张素。满足所有这些标准的Glp-1类似物则可进行大规模合成。
预计提出的策略将产生具有口服生物利用度的Glp-1类似物。Caco-2模型被制药行业视为肠道吸收的优良预报因子。
VII.制剂
在一些方面，本公开提供了用于递送与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的药物制剂。
一方面，本技术涉及适于口服递送GLP-1的药物成品，所述产品包括：(a)治疗有效量的活性肽；(b)至少一种药学上可接受的降pH剂；及(c)对促进所述活性剂的生物利用度有效的至少一种吸收促进剂，其中所述降pH剂按如果将产品添加到10毫升的0.1M重碳酸盐水溶液中，将足以将溶液的pH降低到不高于5.5的量存在于药物成品中，并且其中产品的外表面大体上无耐酸防护媒介物。
在一些实施方案中，所述降pH剂按如果将产品添加到10毫升的0.1M重碳酸盐水溶液中，将足以将溶液的pH降低到不高于3.5的量存在。在一些实施方案中，吸收促进剂是可吸收或生物可降解的表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂选自酰基肉碱、磷脂、胆汁酸和蔗糖酯。在一些实施方案中，吸收促进剂是选自以下的表面活性剂：(a)为胆固醇衍生物的阴离子剂，(b)负电荷中和剂和阳离子表面活性剂的混合物，(c)非离子表面活性剂，和(d)阴离子表面活性剂。
在一些实施方案中，药物成品还包含一定量的第二肽，其为增强Glp-1肽生物利用度有效的生理活性肽。在一些实施方案中，药物成品包含在室温下于水中的溶解度为每100毫升水至少30克的至少一种降pH剂。在一些实施方案中，药物成品包含含有药物粘合剂并且均匀分散于粘合剂中的颗粒、降pH剂、吸收促进剂和Glp-1肽。
在一些实施方案中，药物成品包含分层，其具有包含至少一种药学上可接受的降pH剂的第一层和包含治疗有效量的活性肽的第二层；所述产品还包含促进活性剂生物利用度有效的至少一种吸收促进剂，其中所述第一层和第二层相互联合，但是所述至少一种降pH剂和所述肽在所述分层中大体上分开，使得少于约0.1％的肽接触降pH剂以防止第一层材料和第二层材料之间大量混合并因此而避免分层中所述降pH剂和所述肽之间的相互作用。
在一些实施方案中，药物成品包含选自柠檬酸、酒石酸和氨基酸的酸式盐的降pH剂。在一些实施方案中，降pH剂选自二羧酸和三羧酸。在一些实施方案中，降pH剂按不小于300毫克的量存在。
VIII.疼痛管理/分析
一方面，本公开提供了在有需要的对象中刺激μ-阿片受体的方法。所述方法包括向哺乳动物全身施用有效量的与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。在一个实施方案中，所述方法包括抑制哺乳动物中的去甲肾上腺素。
术语“周围神经病”泛指对周围神经系统的神经的损伤。术语涵盖各种病因的神经病，包括但不限于获得性神经病、遗传性神经病和特发性神经病。说明性获得性神经病包括但不限于由外伤、代谢/内分泌紊乱(例如，糖尿病)、炎症、传染病、维生素缺乏、恶性病和毒性(例如酒精、有机金属、重金属、辐射和药物毒性)引起、产生或与之相关的神经病。如本文所使用，“周围神经病”涵盖运动、感觉、混合性感觉运动、慢性和急性神经病。如本文所使用，所述术语涵盖单神经病、多发性单神经病和多神经病。
药物毒性引起多种形式的周围神经病，最常见的是轴索变性。明显例外的是哌克昔林(perhexiline)，可引起节段性脱髓鞘，一些神经周围的隔绝层局部变性的预防性抗心绞痛药的药物毒性。
周围神经病最初通常呈现出感觉症状，并且常常进展成运动障碍。大多数药物引起的周围神经病是纯感觉或混合性感觉运动缺陷。这里明显例外的是Dapzone，其几乎专门引起运动神经病。
药物引起的周围神经病，包括例如化疗引起的周围神经病，可引起各种剂量限制性神经性疾患，包括1)肌痛、2)疼痛灼性感觉异常、3)手套和长袜式感觉神经病和4)痛觉过敏和异常性疼痛。痛觉过敏指由刺激引起的一般仅轻微疼痛或刺激的超敏反应和疼痛。异常性疼痛指由刺激引起的一般不疼痛或不刺激的超敏反应和疼痛。
术语“痛觉过敏”指对疼痛的敏感性增加，这可由对伤害感受器或外围神经的损伤(即神经病)引起。所述术语指暂时和永久性痛觉过敏，并且涵盖原发性痛觉过敏(即直接在受损组织中发生的痛觉敏感)和继发性痛觉过敏(即在受损组织周围的未受损组织中发生的痛觉敏感)。所述术语涵盖由周围神经病引起的痛觉过敏，包括但不限于由遗传性障碍、代谢/内分泌并发症、炎症、维生素缺乏、恶性病和毒性(例如酒精、有机金属、重金属、辐射和药物毒性)引起、产生或与之相关的神经病。在一些实施方案中，痛觉过敏由药物引起的周围神经病引起。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防痛觉过敏的组合物。在一些实施方案中，痛觉过敏由药物引起。在一些实施方案中，痛觉过敏由化学治疗剂引起。在一些实施方案中，所述化学治疗剂为长春花生物碱。在一些实施方案中，所述长春花生物碱为长春新碱。
已知有各种药品引起药物引起的神经病，包括但不限于抗微生物剂、抗肿瘤剂、心血管药、安眠药和精神药物、抗风湿药和抗惊厥药。
已知会引起神经病的说明性抗微生物剂包括但不限于异烟肼(isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)、乙硫异烟胺(ethionamide)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、甲硝哒唑(metronidazole)、环丙沙星、氯霉素(chloramphenicol)、甲砜氯霉素(thiamphenicol)、二胺、粘菌素(colistin)、链霉素(streptomycin)、萘啶酸(nalidixicacid)、氯碘羟喹(clioquinol)、磺胺、两性霉素、青霉素。
已知会引起神经病的说明性抗肿瘤剂包括但不限于甲基苄肼(procarbazine)、硝基糠腙(nitrofurazone)、鬼臼(podophyllum)、氮芥(mustine)、依托格鲁(ethoglucid)、顺铂、苏拉明(suramin)、紫杉醇(paclitaxel)、瘤可宁(chlorambucil)、六甲蜜胺(altretamine)、卡铂(carboplatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、多西他赛(docetaxel)、氮烯唑胺(dacarbazine)、依托泊苷(etoposide)、异环磷酰胺与美司(mesna)、氟达拉滨(fludarabine)、它莫西芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)和硫鸟嘌呤(thioguanine)。已知长春花生物碱，例如长春新碱尤其具神经毒性。
已知会引起神经病的说明性心血管药包括但不限于心得安(propranolol)、哌克昔林、肼苯达嗪(hydrallazine)、胺碘酮(amiodarone)、双异丙吡胺(disopyramide)和安妥明(clofibrate)。
已知会引起神经病的说明性安眠药和精神药物包括但不限于苯乙肼(phenelzine)、沙立度胺、安眠酮(methaqualone)、导眠能(glutethimide)、阿米替林(amitriptyline)和丙咪嗪(imipramine)。
已知会引起神经病的说明性抗风湿药包括但不限于金、消炎痛、秋水仙碱(colchicine)、氯喹(chloroquine)和苯基丁氮酮。
已知会引起神经病的说明性抗惊厥药包括但不限于苯妥英(phenytoin)。
已知会引起神经病的其它药物包括但不限于氰氨化钙、硫福宋(sulfoxone)、麦角胺(ergotamine)、丙基硫尿嘧啶(propylthiouracil)、硫噻嗪(sulthaime)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、二甲麦角新碱(methysergide)、苯妥英、戒酒硫(disulfiram)、氨磺丁脲(carbutamide)、甲糖宁(tolbutamide)、甲硫咪唑(methimazole)、氨苯砜(dapsone)和抗凝剂。
本公开考虑到了包括施用与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)与一种或多种附加治疗方案的联合疗法。在一些实施方案中，附加治疗方案用于治疗或预防神经病或痛觉过敏或与神经病或痛觉过敏相关的症状。在一些实施方案中，附加治疗方案用于治疗或预防与神经病或痛觉过敏无关的疾病或疾患。在一些实施方案中，除与神经病或痛觉过敏或与神经病或痛觉过敏相关的症状无关的疾病、疾患或症状外，附加治疗方案还用于治疗或预防神经病或痛觉过敏或与神经病或痛觉过敏相关的症状。在一些实施方案中，附加治疗方案包括施用一种或多种药物，包括但不限于抗微生物剂、抗肿瘤剂、心血管药、安眠药和精神药物、抗风湿药和抗惊厥药。在实施方案中，附加治疗方案包括非药物疗法，包括但不限于饮食和生活方式管理。
一方面，本公开提供了一种在有需要的对象中止痛或镇痛的方法，包括向对象施用有效量的与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)。在一些实施方案中，Glp-1肽通过结合并抑制μ-阿片受体镇痛。
X.实施例
以下实施例证明了本文所述的选择性实施方案。应理解，包括与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的组合物也可根据实施例用于获得相同或相似的结果。
实施例1：GLP-1介导的对小鼠腹腔巨噬细胞内氧化型低密度脂蛋白(oxLDL) 诱导的CD36表达和泡沫细胞形成的抑制
认为动脉粥样硬化是由于血管壁巨噬细胞摄取脂质，导致泡沫细胞发育及细胞因子和趋化因子精化，导致平滑肌细胞增殖而发展。CD36是介导向巨噬细胞的oxLDL摄取和后续泡沫细胞发育的清道夫受体。CD36敲除小鼠显示oxLDL摄取减少并且动脉粥样硬化减少。CD36表达在转录水平上受各种刺激，包括葡萄糖和oxLDL调节。
从在oxLDL(50μg/ml)缺乏或存在时过夜培养48小时的小鼠腹腔收获巨噬细胞。预计用oxLDL培养会显著增加CD36mRNA。预计培养基中包含GLP-1(例如，10nM或1μM)会消除CD36的上调。
通过蛋白质印迹测定，还预计当与媒介物对照(V)比较时，CD36蛋白质的表达会在用25μg/ml的oxLDL(oxLDL)培养48小时候显著增加。其它对照将包括来自于从CD36敲除小鼠(KO)获得的小鼠心脏(H)和巨噬细胞的CD36表达。CD36蛋白质的量将标准化为β-肌动蛋白。预计用GLP-1(例如，1μM)培养与暴露于媒介物对照(V)的巨噬细胞相比，将显著降低CD36蛋白质水平。预计用GLP-1(1μM)同时培养也会显著抑制暴露于25μg/ml oxLDL 48小时的巨噬细胞中的CD36蛋白质水平上调。
还预计用oxLDL培养巨噬细胞48小时会增加泡沫细胞形成。将用使脂质小滴染红的油红O使泡沫细胞可见。预计包含GLP-1(1μM)会防止oxLDL诱导的泡沫细胞形成。
预计用oxLDL培养巨噬细胞会使凋亡细胞从6.7％增加到32.8％。预计用GLP-1(1nM)同时培养会显著减少oxLDL诱导的凋亡细胞百分比至20.8％。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在治疗或预防哺乳动物对象中的动脉粥样硬化的方法中有用。
实施例2：GLP-1介导的对急性脑缺血效应的防护
脑缺血引起许多导致脑部损伤的细胞和分子事件。这样的一个事件是缺血后炎症。使用小鼠脑缺血-再灌注模型(大脑中动脉20分钟阻塞)，已经发现在缺血后脑部的小胶质细胞和巨噬细胞中CD36随着活性氧生成增多上调。CD36敲除小鼠在缺血后活性氧明显减少并且与野生型小鼠相比神经功能改善。
右侧大脑中动脉阻塞30分钟将引起脑缺血。将在缺血0、6、24和48小时后给予野生型(WT)小鼠盐水媒介物(Veh)(腹膜内，n＝9)或GLP-1(2mg/kg或5mg/kg，腹膜内，n＝6)。在缺血3天后处死小鼠。脑部将冷冻、切片并用尼氏染剂(Nissl stain)染色。将使用图像分析仪测定梗死体积和半球肿胀。将通过单因素ANOVA与事后分析对数据进行分析。
预计在大脑中动脉30分钟阻塞后0、6、24和48小时用GLP-1(2mg/kg或5mg/kg，腹膜内，n＝6)处理野生型小鼠将引起与盐水对照相比，梗死体积和半球肿胀显著减少。先前已经证实在WT小鼠中30分钟脑缺血导致与经媒介物处理的动物中的对侧相比，同侧皮质和纹状体体内的还原型谷胱甘肽(GSH)大量损耗。预计同侧皮质内GSH的损耗在用GLP-1(2mg/kg，腹膜内，在0、6、24和48小时)处理小鼠时会显著减少。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在治疗或预防哺乳动物对象中急性脑缺血的方法中有用。
实施例3：GLP-1防止CD36介导的急性脑缺血
如实施例2中所述，CD36敲除(CD36KO)小鼠将遭受急性脑缺血。在30分钟缺血期后，在0、6、24和48小时给予CD36KO小鼠盐水媒介物(Veh)(腹膜内，n＝5)或GLP-1(2mg/kg，腹膜内，n＝5)。预计CD36KO小鼠的梗死体积和半球肿胀与接受盐水和GLP-1的对象相似。预计用GLP-1(2mg/kg，腹膜内，n＝5)处理CD36KO小鼠将不能进一步防止同侧皮质中因缺血引起的GSH损耗。数据将显示急性脑缺血中GLP-1的保护作用是抑制CD36上调的函数。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在治疗或预防哺乳动物对象中CD36介导的急性脑缺血效应的方法中有用。
实施例4：GLP-1介导的对缺血后脑部内CD36表达的抑制
已经证实大脑中动脉的短暂性阻塞使缺血后脑部内小胶质细胞和巨噬细胞中的CD36mRNA表达显著增加。在30分钟缺血期后，在0和6小时给予野生型小鼠盐水媒介物(Veh，腹膜内，n＝6)或GLP-1(5mg/kg，腹膜内，n＝6)。将使用实时PCR测定缺血后脑部内CD36mRNA的水平。预计与接受盐水的小鼠的对侧脑部相比，在同侧脑部中CD36表达将上调高达6倍，在接受GLP-1的小鼠的同侧脑部中CD36mRNA显著减少。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在抑制哺乳动物对象的缺血后脑部内CD36表达的方法中有用。
实施例5：GLP-1介导的对单侧输尿管梗阻后肾小管细胞内CD36上调的抑 制
侧输尿管梗阻(UUO)是与肾小管细胞凋亡、巨噬细胞浸润和间质性纤维化相关的常见临床病症。尽管手术矫正，间质性纤维化仍导致缺氧环境并有助于肾功能逐渐下降。已经证实CD36在肾小管细胞内表达。
将在Sprague-Dawley大鼠中诱导UUO。将在诱导UUO前一天和在UUO诱导后的14天每天一次用盐水(腹膜内，n＝6)或GLP-1(1mg/kg腹膜内，n＝6)处理大鼠。将处死大鼠并取出肾脏，石蜡包埋并切片。在室温下用抗CD36多克隆IgG(Santa Cruz,sc-9154；用封闭血清稀释1:100)处理切片1.5小时。然后在室温下用与生物素偶联的第二抗体(抗兔IgG-B1；ABC试剂盒，PK-6101)培养载玻片30分钟。然后用抗生物素蛋白(avidin)处理载玻片，用DAB显色并用10％苏木精复染。对侧未受阻的肾脏将用作每只动物的对照。
预计UUO将导致肾小管扩张和经盐水处理的小鼠的肾小管细胞中CD36的表达显著增加。在经GLP-1处理的大鼠中也预计到肾小管扩张，但是预计CD36表达将显著减少。
为了证明GLP-1减少UUO之后肾脏内的脂质过氧化，将在诱导UUO前一天和在UUO后的14天每天一次用盐水(n＝6)或GLP-1(1mg/kg腹膜内，n＝6)处理大鼠。然后将处死大鼠，取出肾脏，石蜡包埋并切片。将用HNE兔IgG培养载玻片并且生物素标记的抗兔IgG将用作二抗。将用DAB使载玻片显色。预计因UUO增加的脂质过氧化会因GLP-1处理减少。预计与对侧对照相比，在受阻肾脏中的肾小管细胞内HNE染色(褐色)将显著增加。预计来自于经GLP-l处理的大鼠的受阻肾脏与经盐水处理的大鼠相比，将显示出明显更少的HNE染色。
为证明GLP-1减少UUO之后受阻肾脏内的肾小管细胞凋亡，将在诱导UUO前一天和在UUO后的14天每天一次用盐水(n＝6)或GLP-1(1mg/kg腹膜内，n＝6)处理大鼠。然后将处死大鼠，取出肾脏，石蜡包埋并切片。为量化有片段化DNA的细胞核，将用原位TUNEL试剂盒进行TUNEL测定。将用DAB使载玻片显色并用10％苏木精复染。预计经盐水处理的对照中与肾小管细胞凋亡相关的CD36上调将通过GLP-1处理显著抑制。预计当与对侧未受阻的对照相比时，在来自于经盐水处理的动物的受阻肾脏中观察到凋亡细胞显著增加。预计在来自于经GLP-1处理的动物的受阻肾脏中，凋亡细胞的数量将显著减少。
预计通过GLP-1处理将防止巨噬细胞浸润和间质性纤维化。将在诱导UUO前一天和在UUO后的14天每天一次用盐水(n＝6)或GLP-1(1mg/kg腹膜内，n＝6)处理大鼠。然后将处死大鼠，取出肾脏，石蜡包埋并切片。将用单克隆抗体处理载玻片的ED1巨噬细胞(1:75；Serotec)。辣根过氧物酶联兔抗小鼠二抗(Dako)将用于巨噬细胞检测。然后将用10％苏木精使载玻片复染。预计与对侧未受阻的对照相比，在来自于经盐水处理的大鼠的受阻肾脏中巨噬细胞的数量将显著增加。预计在经GLP-1处理的大鼠中巨噬细胞浸润将显著减少。
将在诱导UUO前一天和在UUO后的14天每天一次用盐水(11＝6)或GLP-1(1mg/kg腹膜内，n＝6)处理大鼠。然后将处死大鼠，取出肾脏，石蜡包埋并切片。将用苏木精和伊红及Masson三色对载玻片的间质性纤维化进行染色(蓝变)。预计与对侧未受阻的对照相比，来自于经盐水处理的大鼠的受阻肾脏将显示出纤维化增加，而来自于经GLP-1处理的大鼠的受阻肾脏将显示出明显更少的纤维化。
这些结果将表明GLP-1抑制肾小管细胞内由UUO诱导的CD36上调。这些结果将进一步证实本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在抑制哺乳动物对象中由UUO诱导的肾小管细胞内CD36上调的方法中有用。
实施例6：GLP-1介导的对长时间冷缺血储存后离体心脏再灌注后CD36上 调的抑制
器官移植需要低温储存离体器官以转移给受者。目前，心脏移植受冠状动脉血流量严重受损之前可耐受的冷缺血储存时间短(<4小时)限制。在受到长时间冷缺血储存和温血再灌注的离体心脏中，冠脉内皮和心肌内的CD36表达上调。
为豚鼠离体心脏灌注单独的St.Thomas液或含1-100nM GLP-1的St.Thomas液3分钟，然后储存在4℃的相同溶液中18小时。缺血性储存后，将为心脏再灌注34℃Krebs-Henseleit溶液90分钟。新从豚鼠分离的心脏将用作对照。
心脏将固定于石蜡中并切片，用抗CD36兔多克隆抗体免疫染色。预计来自于在4℃下储存在St.Thomas液中18小时的代表性心脏的切片与对照相比将显示CD36染色增加。预计CD36染色在储存在含1-100nM GLP-1的St.Thomas液中18小时的心脏中显著减少。
还预计经GLP-1处理的心脏内的脂质过氧化将减少。将为豚鼠心脏灌注单独的心脏停搏液(St.Thomas液)或含1-100nM GLP-1的St.Thomas液3分钟，然后经受18小时的冷缺血(4℃)。然后将为心脏再灌注34℃Krebs Henseleit缓冲液90分钟。将通过用抗HNE抗体(Santa Cruz)和荧光二抗培养，进行来自于组织薄片的石蜡切片中经4-羟基壬烯醛(HNE)修饰的蛋白质的免疫组织化学分析。预计与非缺血心脏相比，在于St.Thomas液中经历18小时冷藏的心脏中，HNE染色显著增加。预计与对照相比，在储存于GLP-1中的心脏中HNE染色会减少。
进一步地，预计GLP-1将明显减少内皮细胞凋亡。将为豚鼠心脏灌注单独的St.Thomas液或含1-100nM GLP-1的St.Thomas液3分钟，然后经受18小时的冷缺血(4℃)。然后将为心脏再灌注34℃Krebs-Henseleit缓冲液90分钟。去石蜡后，将用脱氧核苷酸转移酶(Tdt)与地高辛-dNTP培养切片1小时。将用终止缓冲液终止反应。然后将涂上荧光抗地高辛抗体。
预计于St.Thomas液中经历18小时冷藏的心脏将显示显著的内皮细胞凋亡，而在非缺血对照心脏中不会观察到内皮细胞凋亡。预计在储存于GLP-1中的心脏中不会观察到凋亡细胞。预计当心脏保存于GLP-1中时，在长时间冷缺血储存和温血再灌注之后将发生冠脉血流量显著提高。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在抑制长时间冷缺血储存后经再灌注后离体器官内的CD36上调的方法中有用。
实施例7：GLP-1介导的对糖尿病小鼠肾损伤的预防
在糖尿病小鼠的各种组织，包括单核细胞、心脏、肾脏和血液中，CD36表达上调。已知高葡萄糖通过提高CD36mRNA的翻译效率上调CD36的表达。糖尿病性肾病是1型和2型糖尿病的常见并发症，并且与肾小管上皮细胞变性和间质性纤维化相关。已经将CD36鉴定为糖尿病性肾病中肾小管上皮细胞凋亡的介体。高葡萄糖刺激近端肾小管上皮细胞内的CD36表达和细胞凋亡。
链脲霉素(STZ)将用于在小鼠中诱导糖尿病。将研究三组CD-1小鼠：I组-无STZ处理；II组-将给予STZ(50mg/kg，腹膜内)5天，每天一次；III组-将给予STZ(50mg/kg，腹膜内)5天，每天一次，并且将给予GLP-1(3mg/kg，腹膜内)16天，每天一次。预计STZ处理将导致血糖逐渐增加。将在3周后处死动物并保存肾组织用于组织病理分析。将通过肾小管刷状缘的希夫氏高碘酸(PAS)染色检查肾切片。
预计STZ处理将引起肾皮质近端小管内的刷状缘急剧损失，肾小管上皮细胞显示出小的凝结核。预计每天用GLP-1(3mg/kg，腹膜内)处理将防止经STZ处理的小鼠体内的刷状缘损失，并且肾小管上皮细胞核将呈现正常。
预计STZ处理将诱导小管上皮细胞内明显的细胞凋亡。将如上所述使用TUNEL测定检查肾切片的细胞凋亡。预计来自于经STZ处理的小鼠的肾切片与未经处理的对照相比，将在近端小管内显示大量的凋亡核。预计用GLP-1处理将显著地减少近端小管上皮细胞内近端小管CD36表达中的凋亡细胞。预计通过减少CD36表达，GLP-1将抑制经STZ处理的小鼠体内的肾小管细胞凋亡和刷状缘损失，不影响血糖水平。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在治疗或预防糖尿病哺乳动物中的肾损伤的方法中有用。
实施例8：GLP-1穿透细胞膜
将使用Caco-2细胞(人肠上皮细胞)研究[3H]GLP-1的细胞摄取，并使用SH-SY5Y(人神经母细胞瘤)、HEK293(人胚肾)和CRFK(肾上皮)细胞确认。将在涂有胶原的12孔板(5×105个细胞/孔)内培养单层细胞3天。在第4天，将用预热HBSS洗涤细胞两次，并且在37℃或4℃下用0.2ml含有250nM[3H]GLP-1的HBSS培养长达1小时的不同时间。
预计在细胞裂解物中将观察到[3H]GLP-1并且将在1小时内达到稳态水平。预计与37℃相比，在4℃下[3H]GLP-1摄取的速率将更慢，但是到45分钟时将达到76.5％饱和并且到1小时时将达到86.3％饱和。预计[3H]GLP-1的内化将不限于Caco-2细胞，并且用SH-SY5Y、HEK293和CRFK将得到类似结果。预计GLP-1的细胞内浓度在培养1小时后比细胞外浓度高约50倍。
在单独实验中，将在37℃下用一系列的GLP-1浓度(1μM-3mM)培养细胞。在培养期结束时，将用HBSS洗涤细胞4次，并且将向每个孔添加0.2ml含1％SDS的0.1N NaOH。然后将细胞裂解物转移到闪烁管内并计算放射性。为区分内化放射性和表面相关放射性，将包括酸洗步骤。在细胞裂解之前，将于冰上用0.2ml的0.2M醋酸/0.05M NaCl培养细胞5分钟。
将使用GLP-1的荧光类似物通过共聚焦激光扫描显微术(CLSM)确认向Caco-2细胞内的GLP-1摄取。将如上所述培养细胞并将接种在(35mm)玻璃皿(MatTek Corp.,Ashland,MA)上2天。然后去除培养基并且在37℃下用1ml含0.1μM至1.0μM荧光肽类似物的HBSS培养细胞1小时。用冰冷HBSS洗涤细胞三次并用200μL的PBS覆盖。将于10分钟内在室温下使用带C-Apochromat63x/l.2W corr物镜的Nikon共聚焦激光扫描显微镜进行显微镜检查。将在340nm下借助于UV激光进行激发，并且将在520nm下测量发射。对于z向的光学切片，将收集2.0μz-步长的5-10帧。
将使用CLSM确认在37℃下用0.1μM荧光GLP-1培养1小时后荧光GLP-1摄取进入Caco-2细胞。预计在37℃和4℃下荧光肽的摄取将类似。预计荧光似乎将在整个细胞质扩散，但是从核内完全排除。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在包括GLP-1进行细胞的方法中有用。
实施例9：GLP-1靶向体内线粒体
将制备GLP-1的荧光类似物。将如上所述培养细胞并将接种在(35mm)玻璃皿(MatTek Corp.,Ashland,MA)上2天。然后去除培养基并且在37℃下用1ml含0.1μM荧光GLP-1的HBSS培养细胞15分钟至1小时。
还将在37℃下用四甲基若丹明甲酯(TMRM，25nM)，一种为线粒体染色的染料，培养细胞15分钟。将用冰冷HBSS洗涤细胞三次并用200μL的PBS覆盖。将于10分钟内在室温下使用带C-Apochromat 63x/l.2W corr物镜的Nikon共聚焦激光扫描显微镜进行显微镜检查。
对于荧光GLP-1而言，将在350nm下使用UV激光进行激发，并且将在520nm下测量发射。对于TMRM，将在536nm下进行激发，并且将在560nm下测量发射。
预计在37℃下仅仅培养15分钟后CLSM将显示荧光GLP-1摄取至Caco-2细胞内，并且将从核内排除染色。将通过荧光GLP-1和TMRM的重叠证明荧光GLP-1的线粒体定位。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在包括使所述肽靶向体内线粒体的方法中有用。
实施例10：GLP-1靶向离体线粒体
为从小鼠肝脏中分离出线粒体，将通过断头术处死小鼠。将取出肝脏并迅速放入冷冻肝脏匀化介质中。将使用剪刀将肝脏切碎，然后用玻璃匀浆器手动匀化。
在4℃下1000×g离心匀浆10分钟。抽吸上清液并转移到聚碳酸酯管内并且再在4℃下3000×g离心10分钟。将去除所得上清液，并将去除管一侧壁上的脂肪脂质。
将使团块重新悬浮于肝脏匀浆介质中并重复匀化两次。最终纯化的线粒体团块将重新悬浮于介质中。将通过Bradford方法测定线粒体制剂中的蛋白质浓度。
将在37℃下用[3H]GLP-1培养约1.5mg于400μl缓冲液中的线粒体5-30分钟。然后将离心线粒体并且将测定线粒体部分和缓冲液部分中放射性的量。假定0.7μl/mg蛋白质的线粒体基质体积(Lim等，J.Physiol.545:961-974(2002))，预计线粒体中[3H]GLP-1的浓度将比缓冲液中高，表明GLP-1在线粒体内浓缩。
为证明GLP-1选择性地分布到线粒体，我们将检查荧光GLP-1和[3H]GLP-1向小鼠离体肝脏线粒体的摄取。预计荧光GLP-1迅速摄取。预计用碳酰氰对-(三氟甲氧基)-苯腙(FCCP)，一种导致线粒体立即去极化的解偶联剂，预处理线粒体会减少荧光GLP-1的摄取，证明摄取具膜电位依赖性。
为证明线粒体靶向不是荧光团的人为现象，我们还将检查[3H]GLP-1的线粒体摄取。将用[3H]GLP-1培养离体线粒体并且测定线粒体团块和上清液中的放射性。预计团块中放射性的量从2分钟到8分钟不会变，并且用FCCP处理线粒体将减少与线粒体团块缔合的[3H]GLP-1的量。
FCCP对GLP-1线粒体摄取最低限度的影响将证实[3H]GLP-1很可能与线粒体膜缔合或在膜间间隙内，而不是在线粒体基质内。我们还将使用丙甲菌素(alamethicin)诱导线粒体外膜肿胀和破裂，证明线粒体肿胀对荧光GLP-1的线粒体定位的影响。预计通过线粒体肿胀将仅部分逆转荧光GLP-1的摄取。该结果将确认GLP-1与线粒体膜缔合。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在包括使所述肽靶向离体线粒体的方法中有用。
实施例11：GLP-1不改变线粒体呼吸或膜电位
该实施例将证明，通过耗氧量和线粒体膜电位测量，GLP-1不改变线粒体功能。
将用100pM GLP-1培养小鼠离体肝脏线粒体，并测量耗氧量。预计GLP-1不会改变状态3或状态4期间的耗氧量，或呼吸比(状态3/状态4)(6.2与6.0)。将使用TMRM测量线粒体膜电位。预计添加线粒体将导致TMRM信号立即猝灭，这将易于通过添加FCCP可逆，表明线粒体去极化。预计添加Ca2+(150μM)将导致线粒体立即去极化，接着是表明MPT的猝灭逐渐降低。预计单独添加即使是200μM的GLP-1，也不会引起线粒体去极化或MPT。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在包括使所述肽靶向线粒体的方法中有用。
实施例12：GLP-1介导的对Ca 2+ 和3NP诱导的MPT的防护
该实施例将证明GLP-1防止Ca2+过载和3-硝基丙酸(3NP)诱导的MPT。
预计在添加Ca2+之前用GLP-1(10μM)预处理离体线粒体2分钟将仅导致一过性去极化并且将防止MPT发作。还预计GLP-1将剂量依赖性地增强线粒体对累积Ca2+激发的耐受性。
3-硝基丙酸(3NP)是电子传递链的复合物II中琥珀酸脱氢酶的不可逆性抑制剂。预计向离体线粒体中添加3NP(1mM)将引起线粒体膜电位损伤和MPT发作。还预计用GLP-1预处理线粒体将剂量依赖性地延迟3NP诱导的MPT发作。
将在GLP-1(0.1μM)缺乏或存在时用3NP(10mM)处理Caco-2细胞4小时，然后用TMRM培养并通过LSCM检查。预计经3NP处理的细胞与对照细胞相比将显示出更少的荧光，这表明线粒体去极化。相反，预计用GLP-1同时处理将防止3NP引起的线粒体去极化。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在保护体外或体内线粒体免于MPT的方法中有用。
实施例13：GLP-1防止线粒体肿胀和细胞色素c释放
MPT孔隙打开导致线粒体肿胀。我们将通过测量540nm下的吸光度的减少量(A540)证明GLP-1对线粒体肿胀的影响。将离心线粒体悬浮液并且将使用市场上可买到的ELISA试剂盒测定团块和上清液中细胞色素c的量。预计用GLP-1预处理离体线粒体将抑制Ca2+过载诱导的肿胀和细胞色素c释放。还预计除防止Ca2+过载诱导的MPT外，GLP-1还将防止1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)，一种线粒体电子传递链的复合物I的抑制剂诱导的线粒体肿胀。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在保护体外或体内线粒体免于线粒体肿胀和细胞色素c释放的方法中有用。
实施例14：GLP-1防止缺血-再灌注诱导的线粒体心肌顿抑
将迅速分离豚鼠心脏，并且将为主动脉原位插管并在恒定压力(40cm H20)下以逆行方式灌注氧合Krebs-Henseleit。将用插入左心室顶点的小钩和连接到压力移动传感器的结扎丝线测量收缩力。将通过定时收集肺动脉流出物测量冠脉血流量。
经为心脏灌注GLP-1(1-100nM)30分钟，然后经受30分钟的全心缺血。不会使用缺乏GLP-1的灌注缓冲液进行再灌注。
预计双因素ANOVA将证明经GLP-1处理的心脏与对照相比，在收缩力、心率和冠脉血流量上的显著差异。在对照心脏中，预计与缺血前期相比，再灌注期间收缩力将显著较低。在经GLP-1处理的心脏中，预计再灌注期间的收缩力与对照相比将提高。预计GLP-1将提供对心脏顿抑的完全抑制。另外，预计冠脉血流量将在整个再灌注期间很好地维持并且在经GLP-1处理的心脏中心率不会降低。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在治疗或预防缺血-再灌注诱导的心肌顿抑的影响的方法中有用。
实施例15：GLP-1加强器官保存
对于移植而言，供体心脏在运输期间保存在心脏停搏液中。保存液含有有效地阻止心脏跳动并保存能量的高钾。然而，离体心脏的存活时间十分有限。
该实施例将证明GLP-1延长了储存用于移植的器官的存活期。将在34℃下以逆行方式为豚鼠离体心脏灌注氧合Krebs-Henseleit液。稳定30分钟后，将为心脏灌注有或无100nM GLP-1的心脏停搏液(CPS；St.Thomas)3分钟。然后通过完全阻断冠脉血流量诱导全心缺血并维持90分钟。将用氧合Krebs-Henseleit液进行再灌注60分钟。将整个过程中不断地监测收缩力、心率和冠脉血流量。
预计向心脏停搏液中添加GLP-1将显著增强长时间缺血后的收缩功能。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在加强器官保存的方法中有用。
实施例16：GLP-1清除过氧化氢
将通过鲁米诺(luminol)诱导的化学发光测量GLP-1对H2O2的影响。将向H2O2(4.4nmol)和GLP-1肽的溶液中添加鲁米诺(25μM)和辣根过氧化物酶(0.7IU)，并且将在37℃下用Chronolog 560型凝集计(Havertown,PA)监测化学发光20分钟。
预计GLP-1将剂量依赖性地抑制鲁米诺反应，证明GLP-1可清除H2O2。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在用于H2O2清除的方法中有用。
实施例17：GLP-1抑制脂质过氧化
将使用水溶性引发剂2,2'偶氮双(2-脒基丙烷)(ABAP)诱导亚油酸过氧化，并且通过形成共轭二烯检测脂质过氧化，在236nm用分光光度法监测(E.Longoni、W.A.Pryor、P.Marchiafava，Biochem.Biophys.Res.Commun.233,778-780(1997))。
将在2.4ml亚油酸悬浮液中温育5ml的0.5M ABAP和不同浓度的GLP-1，直至自动氧化速率变得恒定。预计GLP-1将剂量依赖性地抑制亚油酸的过氧化。
将在100μM的浓度下，单独地或连同GLP-1一起测试本文所述的各种肽。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在抑制脂质过氧化的方法中有用。
实施例18：GLP-1抑制LDL氧化
将由储存的血浆新制备人低密度脂蛋白(LDL)。将通过添加10mM Cu8O4催化诱导LDL氧化，并且将在37℃下在234nm下检测共轭二烯的形成5小时(B.Moosmann和C.Behl，Mol.Pharmacol.61:260-268(2002)。
预计GLP-1将剂量依赖性地抑制LDL氧化的速率。
将在100μM的浓度下，单独地或连同GLP-1一起测试本文所述的各种肽。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在抑制LDL氧化的方法中有用。
实施例19：GLP-1抑制小鼠离体肝脏线粒体生成过氧化氢
该实施例将证明GLP-1对离体线粒体中H2O2形成的影响。将从小鼠收获肝脏，于冰冷缓冲液中匀化，并且在13800×g下离心10分钟。将洗涤团块一次，重新悬浮在0.3ml洗涤缓冲液中，并置于冰上直至使用。将使用如先前所述的鲁米诺化学发光测量H2O2(Li等，Biochim.Biophys.Acta 1428:1-12(1999)。在GLP-1肽(100μM)缺乏或存在时，向0.5m1磷酸钾缓冲液(100mM，pH 8.0)添加0.1mg线粒体蛋白。将添加25mM鲁米诺和0.7IU辣根过氧化物酶，并且将在37℃下用Chronolog 560型凝集计(Havertown,PA)监测化学发光20分钟。将20分钟生成的H2O2的量量化为曲线下面积(AUC)，并且将数据标准化为线粒体单独产生的AUC。
预计H2O2生成的量在10μM GLP-1的存在下将显著减少。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在抑制线粒体内H2O2生成的方法中有用。
实施例20：GLP-1抑制抗霉素诱导的小鼠离体肝脏线粒体生成过氧化氢
将从小鼠收获肝脏，于冰冷缓冲液中匀化，并且在13800×g下离心10分钟。将洗涤团块一次，重新悬浮在0.3ml洗涤缓冲液中，并置于冰上直至使用。将使用如先前所述的鲁米诺化学发光测量H2O2(Li等，Biochim.Biophys.Acta1428:1-12(1999)。在GLP-1缺乏或存在时，向0.5m1磷酸钾缓冲液(100mM，pH8.0)添加0.1mg线粒体蛋白。将添加25mM鲁米诺和0.7IU辣根过氧化物酶，并且将在37℃下用Chronolog 560型凝集计(Havertown,PA)监测化学发光20分钟。将20分钟生成的H2O2的量量化为曲线下面积(AUC)，并且将数据标准化为线粒体单独产生的AUC。
预计GLP-1将剂量依赖性地减少离体线粒体自发生成H2O2。
预计GLP-1将剂量依赖性地减少离体线粒体内抗霉素诱导的H2O2生成。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在抑制线粒体内抗霉素诱导的H2O2生成的方法中有用。
实施例21：GLP-1减少细胞内活性氧(ROS)并增加细胞存活率
为证明本文所述的肽在涂到全细胞上时有效，将按1×104个/孔的密度在96孔板内接种神经元N2A细胞并且在用tBHP(0.5或1mM)处理40分钟之前，使其生长2天。将洗涤细胞两次并且在单独的培养基或含不同浓度的GLP-1的培养基中培养4小时。将使用羧基H2DCFDA(Molecular Probes,Portland,OR,U.S.A.)测量细胞内ROS。将使用MTS细胞增殖测定法(Promega,Madison,WI)测量细胞死亡。
预计用tBHP培养将导致细胞内ROS剂量依赖性增加和细胞活力降低。预计用GLP-1培养将剂量依赖性地减少细胞内ROS并增加细胞存活率，EC50在nM范围内。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在包括降低细胞内ROS水平/生成并增加细胞存活率的方法中有用。
实施例22：GLP-1防止细胞活力丧失
将按1×104个/孔的密度在96孔板内接种神经元N2A和SH-SY5Y细胞并且在用有或无GLP-1的叔丁基过氧化氢(tBHP)(0.05-0.1mM)处理24小时之前，使其生长2天。将使用MTS细胞增殖测定法(Promega,Madison,WI)评估细胞死亡。
预计用低剂量的t-BHP(0.05-0.1mM)处理N2A和SH-SY5Y细胞将导致细胞活力降低。预计用GLP-1同时处理细胞将导致t-BHP-诱导的细胞毒性剂量依赖性降低。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在减少细胞活力丧失的方法中有用。
实施例23：GLP-1降低半胱天冬酶活性
将在96孔板上培养N2A细胞，在37℃下在GLP-1缺乏或存在时用t-BHP(0.05mM)处理12-24小时。所有处理均将进行四次。将在37℃下用有或无GLP-1的t-BHP(50mM)培养N2A细胞12小时。将用细胞脱离液(Accutase,Innovative Cell Technologies,Inc.,San Diego,CA,U.S.A.)使细胞从板上轻轻地提起并将于PBS中洗涤两次。将使用FLICA试剂盒(Immunochemistry TechnologiesLLC,Bloomington,MN)测定半胱天冬酶活性。根据生产商的建议，将细胞重新悬浮(约5×106个细胞/ml)在PBS中并且在避光的同时在37℃、5％CO2下用泛-半胱天冬酶抑制剂FAM-VAD-FMK标记1小时。然后将冲洗细胞以去除未结合的试剂并固定。将通过激光扫描细胞仪(Beckman-Coulter XL,Beckman Coulter,Inc.,Fullerton,CA,U.S.A.)，使用标准绿光发射滤光片(FLl)测量细胞内的荧光强度。每一轮，将收集10,000个独立事件并储存在列表模式文件中做离线分析。
半胱天冬酶活化是凋亡级联的启动触发，并且预计在用50mM t-BHP培养SH-SY5Y细胞12小时后半胱天冬酶活性将显著增加，这将受GLP-1剂量依赖性地抑制。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在降低半胱天冬酶活性的方法中有用。
实施例24：GLP-1抑制暴露于氧化性损伤的细胞内的脂质过氧化
预计GLP-1将抑制经t-BHP处理的N2A细胞内的脂质过氧化。将通过测量4-HNE迈克尔加成物(Michael adduct)估计脂质过氧化。4-HNE是膜多不饱和脂肪酸过氧化的主要产物之一。在GLP-1(10-8至10-10M)缺乏或存在时t-BHP处理(1mM，3小时，37°℃、5％CO2)前1天将N2A细胞将接种在玻璃皿上。将用PBS洗涤细胞两次，在室温下用4％于PBS中的多聚甲醛固定30分钟，并再用PBS洗涤3次。然后使细胞透性化并用兔抗HNE抗体处理，接着用二抗(与生物素偶联的山羊抗兔IgG)处理。将细胞固定在Vectashield中并使用Zeiss荧光显微镜，使用460±20nm的激发波长和505nm发射长通滤光片成像。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在抑制暴露于氧化性损伤的细胞内的脂质过氧化的方法中有用。
实施例25：GLP-1抑制暴露于氧化性损伤的细胞内线粒体膜电位的损失
在GLP-1(0.1μM)缺乏或存在时用tBHP(1mM)处理Caco-2细胞4小时，然后用TMRM培养并且在LSCM下检查。在经tBHP处理的细胞中，预计TMRM荧光与对照相比将减少很多，表明普遍的线粒体去极化。相反，预计用GLP-1同时处理将防止由t-BHP引起的线粒体去极化。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在抑制暴露于过氧化氢的细胞内线粒体膜电位的损失的方法中有用。
实施例26：GLP-1防止在暴露于t-BHP的N2A细胞中线粒体膜电位损失和 更多的ROS积聚
将用单独的0.1mM t-BHP或与1nM GLP-1组合处理在玻璃皿内培养的N2A细胞6小时。然后在37℃、5％CO2下为细胞装载10μM二氯荧光素(激发/发射波长＝485/530)30分钟。将用HBSS洗涤细胞3次，在37℃用20nM的Mitotracker TMRM(激发/发射波长＝550/575nm)染色15分钟，并通过共聚焦激光扫描显微术检查。
预计用t-BHP处理N2A细胞将导致TMRM荧光损失，表明线粒体去极化，并且导致DCF荧光相伴增加，表明细胞内ROS增多。还预计用1nM GLP-1同时处理将防止线粒体去极化和ROS积聚减少。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在抑制暴露于t-BHP的细胞中线粒体膜电位损失和ROS积聚增加的方法中有用。
实施例27：GLP-1防止氧化应激诱导的细胞凋亡
将在96孔板上培养SH-SY5Y细胞并且在37℃下，在GLP-1缺乏或存在时用t-BHP(0.025mM)处理24小时。所有处理均将进行四次。然后将用2mg/mlHoechst 33342为细胞染色20分钟，用4％多聚甲醛固定，并且使用装备有ZeissAcroplan×20物镜的Zeiss荧光显微镜(Axiovert 200M)成像。将使用350±100m的激发波长和400nm发射长通滤光片估计核形态。将使用MetaMorph软件(Universal Imaging Corp.,West Chester,PA,U.S.A.)处理和分析所有图像。染色均匀的核将被记为健康的活神经元。核凝结或破碎的细胞将被记为凋亡。预计GLP-1将防止0.025mM t-BHP诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在防止氧化应激引起的细胞凋亡的方法中有用。
实施例28：GLP-1防止经受缺血和再灌注的心脏中的脂质过氧化
将在Langendorff装置中以逆行方式灌注豚鼠离体心脏并经受不同间隔的缺血-再灌注。将立即固定心脏，石蜡包埋并切片。将使用抗HNE抗体进行4-羟基-2-壬烯醇(HNE)修饰蛋白的免疫组织化学分析。
预计与未经处理的对照相比，用GLP-1处理将防止经受短暂间隔的缺血和再灌注的心脏内脂质过氧化。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在防止经受缺血和再灌注的器官内脂质过氧化的方法中有用。
实施例29：GLP-1提高离体胰岛细胞的活力
将根据标准程序从小鼠胰腺中分离出胰岛细胞。将向整个分离程序中使用的分离缓冲液添加GLP-1或对照媒介物。将使用TMRM(红色)测量线粒体膜电位并通过共聚焦显微镜术可视化，并且将使用膜联蛋白V(Annexin V)通过流式细胞术测量凋亡并通过碘化丙啶测量坏死。
预计通过线粒体膜电位测量，GLP-1将减少凋亡并增加胰岛细胞活力。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在提高离体胰岛细胞的活力的方法中有用。
实施例30：GLP-1防止胰岛细胞内的氧化性损伤
将用无或有GLP-1的25μM tBHP处理小鼠离体胰岛细胞。将通过TMRM(红色)测量线粒体膜电位并使用共聚焦显微镜术通过DCF(绿色)测量活性氧。预计GLP-1将防止离体胰岛细胞内的氧化性损伤。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在防止胰岛细胞内的氧化性损伤的方法中有用。
实施例31：GLP-1防止帕金森氏病
MPTP是选择性破坏纹状体多巴胺能神经元的神经毒素并且是公认的帕金森氏病动物模型。MPP+，MPTP的代谢产物，靶向线粒体，抑制电子传递链的复合物I，并增加ROS生成。因为细胞不能将MPTP代谢为活性代谢产物，所以将MPP+用于体外研究，而MPTP用于体内(即，动物)研究。
将用缓冲液、50μM MPP+或50μM MPP+和1nM GLP-1处理SN-4741细胞48小时。将通过荧光显微镜术用Hoechst 33342测量凋亡。预计在对照细胞中通过MPP+处理将显著增加凝结、破碎核的数量，并且用GLP-1同时处理将减少凋亡细胞的数量。
还预计GLP-1将剂量依赖性地防止经MPTP处理的小鼠体内多巴胺能神经元的损失。将间隔2小时给予小鼠(n＝12)3个剂量的MPTP(10mg/kg)。将在每次注射MPTP 30分钟前，和在最后一次注射MPTP 1小时和12小时后，施用GLP-1。一周后将处死动物并将对脑纹状体区免疫染色以分析酪氨酸羟化酶活性。将通过高压液相色谱法量化多巴胺水平、DOPAC和HVA水平。
预计GLP-1将剂量依赖性地提高经MPTP处理的小鼠体内的纹状体多巴胺、DOPAC(3,4二羟基苯乙酸)和HVA(高香草酸)水平。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在治疗或预防哺乳动物对象的帕金森氏病的方法中有用。
实施例32：GLP-1减少饲喂高脂饮食的大鼠的线粒体功能障碍
为确定饮食诱导的肥胖症对骨骼肌中细胞氧化还原平衡的潜在影响，将研发一种测量透性化骨骼肌纤维束中线粒体H2O2生成速率的新方法。见Anderson等，J.Clin.Invest.(doi:10.1172/J C137048)。受NADH联复合物I底物支持的基础(状态4)呼吸期间，超氧化物形成速率低，占总O2利用的0.1-0.5％(Anderson和Neufer，Am.J.Physiol.Cell Physiol.290:C844-851(2006)；St-Pierre等，J.Biol.Chem.277:44784-44790(2002))。然而，专门受FADH联复合物I底物琥珀酸盐支持的呼吸通过产生流回复合物I的反向电子流促进高速率的超氧化物生成(Anderson和Neufer，Am J Physiol Cell Physiol 290:C844-851(2006)；St-Pierre等，J.Biol.Chem.277:44784-44790(2002)；Liu等，J.Neurochem.80:780-787(2002)；Turrens等，Biochem.J.191:421-427(1980))。该实施例描述了测量透性化肌肉组织中的线粒体功能的方法并检查了高脂饮食对线粒体功能的影响。
动物和试剂。将从查尔斯河实验室(Charles River Laboratory)(Wilmington,MA)获得30只雄性Sprague-Dawley大鼠并且放在温度(22℃)和光纤受控室内，自由接触食物和水。20只动物将维持高(60％)脂饮食(Research Dyets,Bethlehem,PA)。将从麻醉动物(100mg/kg腹膜内，克他命-甲苯噻嗪(ketamine-xylazine))获得骨骼肌。手术后，将在麻醉的同时通过颈脱位法处死动物。将从Molecular Probes(Eugene,OR)获得Amplex Red Ultra试剂。将从Fluka Biochemika(Buchs,Switzerland)获得标桩菌素(stigmatellin)和辣根过氧化物酶(HRP)。所有其它化学药品将从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)购得。所有动物研究将通过东卡罗莱纳大学实验动物管理和使用委员会(East Carolina University Institutional Animal Careand Use Committee)批准。
透性化肌肉纤维束的制备。简言之，将解剖一小部分(25mg)的比目鱼肌、红色腓肠肌(RG)和白色腓肠肌(WG)并置于含有60mM K-MES、35mM KC1、7.23mM K2EGTA、2.77mM CaK2EGTA、20mM咪唑、0.5mM DTT、20mM牛磺酸、5.7mM ATP、15mM PCr和6.56mM MgCl2 .6H2O(pH 7.1，295mosmol/kg H2O)的冰冷缓冲液X中。将为肌肉修整结缔组织并切短成纤维束(2×7mm，4-8mg湿重)。在解剖显微镜下使用针尖镊子，轻轻地将纤维相互分开以最大化纤维束的表面积，仅留下小的接触区域。为透性化肌纤维，将每个纤维束置于含有50μg/ml皂苷的冰冷缓冲液X中并且在4℃下于旋转器上培养30分钟。将于含有110mMK-MES、35mM KC1、1mM EGTA、10mM K2HP04、3mM MgCl2 .6H2O、5mg/mlBSA、0.1mM谷氨酸盐和0.05mM苹果酸盐(pH 7.4，295mOsm)的冰冷缓冲液Z中洗涤透性化纤维束(PmFB)，并且在4℃下于缓冲液Z中在旋转器上培养直至分析(<2小时)。
线粒体呼吸和H2O2生成测量。将在30℃下于缓冲液Z中使用Oroboros O2K氧描记器(Innsbruck,Austria)获得高分辨率呼吸测量。将在30℃下于状态4呼吸期间在缓冲液Z(10μg/ml寡霉素)中，通过在温度控制和>1000rpm磁力搅拌下，使用Spex Fluoromax 3(Jobin Yvon,Ltd.)荧光分光光度计不断监测Amplex Red的氧化测量线粒体H2O2生成。Amplex Red试剂与H2O2按1:1化学计量受HRP催化反应产生荧光化合物试卤灵(resorufin)和摩尔当量的O2。试卤灵的激发/发射特征为563nm/587nm并且一旦形成就极其稳定。建立基线荧光(仅反应物)后，将通过在37℃下向300μl含5μM Amplex Red和0.5U/ml HRP与琥珀酸盐的缓冲液Z中添加透性化纤维束引发反应。对于琥珀酸盐实验，将于无底物的缓冲液Z中简单地洗涤纤维束以消除残留的丙酮酸盐和苹果酸盐。指出时，将在反应缓冲液中包括10μg/ml寡霉素以阻断ATP合成酶并确保状态4呼吸。每次实验结束时，将于双蒸馏(dd)H2O中洗涤PmFB以去除盐，并于冻干器(LabConco)中冷冻干燥。呼吸速率将表示为pmol/秒/mg干重，并且线粒体H2O2生成表示为pmol/分钟/mg干重。
统计分析。数据将作为平均值±SE呈现。将使用单因素ANOVA，用分析组间显著性的学生-纽曼-柯尔斯法(Student-Newman-Keuls method)进行统计分析。显著水平将设为p<0.05。
预计使动物维持60％脂肪饮食3周将引起线粒体H2O2生成的最大速率增加。预计在琥珀酸盐滴定结束时添加鱼藤酮(rotenone)将消除H2O2生成，确认复合物I为对照动物和饲喂高脂饮食的动物中超氧化物生成的来源。还将通过在抗霉素(复合物III抑制剂)的存在下滴定丙酮酸盐/苹果酸盐测量线粒体H2O2生成，预期饲喂高脂饮食的动物将具有比对照动物更高的H2O2生成最大速率。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在减少暴露于高脂饮食的哺乳动物对象的线粒体功能障碍的方法中有用。
实施例33：GLP-1减少饲喂高脂饮食的大鼠的ROS生成
超氧化物生成在受脂肪酸支持的基础呼吸期间比碳水化合物代谢更高，提高了高脂饮食引起的线粒体H2O2生成增加可能是细胞H2O2水平升高的结果(例如，通过ROS诱导的ROS释放机制生成的ROS)。为检验这个假设，将检查GLP-1肽对高脂饮食大鼠的线粒体功能的影响。已经证实GLP-1肽抗氧化剂有效减少了经受心肌顿抑的心脏、移植后的胰岛细胞及帕金森氏病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症动物模型中的ROS(Zhao等，J.Biol.Chem.279:34682-34690(2004)；Thomas等，J.Am.Soc.Nephr.16,TH-FC067(2005)；Petri等，J.Neurochem.98,1141-1148(2006)；Szeto等，AAPS J.8:E521-531(2006))。
维持高脂饮食的10只大鼠将接受每天腹膜内注射溶于磷酸盐缓冲液盐水中的GLP-1(1.5mg/kg)。将建立体外和体内GLP-1的剂量反应曲线。将根据实施例1中描述的方法测量线粒体功能。预计两条剂量反应曲线都将反映琥珀酸盐支持的呼吸期间线粒体H2O2生成减少。
接下来，将使大鼠处于高脂饮食(60％)6周，每天施用或不施用GLP-1。预计对透性化纤维进行的琥珀酸盐滴定实验将显示高脂肪饲喂大鼠中H2O2生成的最大速率增加。还预计来自于高脂肪饲喂大鼠的透性化纤维将在受棕榈酰肉碱支持的基础呼吸期间显示出更高的H2O2生成速率。预计在经GLP-1处理的高脂肪饲喂大鼠中，琥珀酸盐和棕榈酰肉碱支持的呼吸期间线粒体H2O2生成的增量将减少。还预计在来自于高脂肪饲喂大鼠的纤维中受丙酮酸盐/苹果酸盐支持的基础呼吸将略微增加，表明一定程度的解偶联。然而，还预计在高脂肪饲喂大鼠中，丙酮酸盐/苹果酸盐或棕榈酰肉碱支持的呼吸的基础速率将不受GLP-1处理影响，表明GLP-1处理对H2O2生成的标准化不受质子泄漏增加介导。还预计GLP-1处理不会影响高脂肪饲喂大鼠的体重增加。
总的来说，这些发现将证明施用线粒体靶向抗氧化剂，例如本技术的GLP-1肽，防止或补偿高脂饮食诱导的线粒体H2O2生成的增加。同样地，本技术的GLP-1肽在预防或治疗哺乳动物对象中由线粒体功能障碍引起的胰岛素抗性的方法中有用。
人们越来越认识到许多蛋白质(例如，受体、激酶/磷酸酶、转录因子等)的细胞内化和活性受含巯基(-SH)的残基的氧化态控制，表明细胞内氧化还原环境的转变可影响各种细胞功能(Schafer和Buetner，Free Radic BioI Med 30,1191-1212(2001)。谷胱甘肽(GSH)，细胞内最丰富的氧化还原缓冲液，在H2O2的存在下被谷胱甘肽过氧化物酶可逆地氧化为GSSG，并且被谷胱甘肽还原酶用NADPH所供电子还原为GSH。GSH/GSSG之比通常很动态，并且反映了细胞的总体氧化还原环境。
将通过在pH 7.2的含有10mM Tris、1mM EDTA、1mM EGTA、2mM原钒酸钠、2mM焦磷酸钠、5mM NaF和蛋白酶抑制剂混合物(完全)的缓冲液中匀化100mg冷冻肌肉制备蛋白质匀浆。匀化后，将向蛋白质悬浮液中添加1％TritonX-100，将涡旋并于冰上培养5分钟。将在10,000rpm下离心样品10分钟以团块化不溶性碎片。对于GSSG测量，将于含有20mM甲基-2-乙烯基吡啶三氟甲烷磺酸酯的溶液中匀化组织以清除样品中所有还原硫醇。将使用市场上可买到的GSH/GSSG测定法(Oxis Research Products,Percipio Biosciences,Foster City,CA,U.S.A)测量总GSH和GSSG。
预计高脂肪饲喂将引起细胞谷胱甘肽总含量(GSHt)降低，与GLP-1处理无关，证明高脂肪摄入损害骨骼肌内GSH介导的氧化还原缓冲能力。为建立由高脂饮食引起的线粒体H2O2生成增加及其对骨骼肌总体氧化还原环境的影响之间的联系，将在1)禁食10小时后，和2)施用标准糖负荷1小时后(口腔喂食，禁食10小时)，在来自于标准食物饲喂和高脂肪饲喂的大鼠的骨骼肌中测量GSH和GSSG。在标准食物饲喂的对照中，预计葡萄糖摄食将引起GSH/GSSG比率减小(标准化为GSHt)，可能反映响应于胰岛素刺激的葡萄糖代谢增加，向更高氧化态转变。在高脂肪饲喂的大鼠中，GSH/GSSG比率相对于标准食物饲喂的对照将在10小时禁食状态中减小并且将响应于葡萄糖摄食进一步降低。预计即使在葡萄糖摄食之后，GLP-1处理也将保持GSH/GSSG比率接近对照水平。
这些发现将证明与对照相比，高脂饮食使骨骼肌内的细胞内氧化还原环境转变为更高的氧化态。预计用GLP-1处理可能将通过清除主要氧化剂保持骨骼肌内的细胞内氧化还原状态，从而补偿高脂饮食诱导的总GSH介导的氧化还原缓冲能力的降低。因此，预计施用线粒体靶向抗氧化剂，例如本技术的GPL-1肽将防止或补偿在饲喂高脂饮食的大鼠中发展的代谢功能障碍。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在减少暴露于高脂饮食的哺乳动物对象中ROS生成的方法中有用。
实施例34：GLP-1预防饲喂高脂饮食的大鼠的胰岛素抗性
为证明线粒体驱动的细胞内氧化还原环境的变化可能与高脂饮食诱导的胰岛素抗性的病因有关，将在6周高脂饮食后在大鼠中进行口服葡萄糖耐量试验。在试验当天，将在经由口腔喂食施用2g/kg葡萄糖溶液10小时前拿走食物。将对全血样品(Lifescan,Milpitas,CA,U.S.A.)测定葡萄糖水平。将使用大鼠/小鼠ELISA试剂盒(Linco Research,St.Charles,MO,U.S.A.)测定血清胰岛素水平。禁食数据将用于测定稳态模型评估(HOMA)计算的空腹胰岛素(mU/ml)×空腹葡萄糖(mM)/22.5。
预计在高脂肪饲喂的大鼠中与标准食物饲喂的大鼠相比，对口服葡萄糖激发的血糖和胰岛素反应将更高且更持久。预计用GLP-1处理高脂肪饲喂的大鼠会标准化对口服葡萄糖激发的血糖和胰岛素反应。
预计稳态模型评估(HOMA)将确认高脂肪饲喂的大鼠胰岛素抗性的发展，并且用GLP-1处理高脂肪饲喂的大鼠将抑制胰岛素抗性的发展。
为进一步评估胰岛素敏感性，将在1)禁食10小时后，和2)接受口服葡萄糖负荷1小时后，测量骨骼肌内胰岛素信号蛋白Akt的磷酸化状态。预计响应于葡萄糖摄食，在标准食物饲喂的对照的骨骼肌内Akt磷酸化将增加，但是在高脂肪饲喂的大鼠中将基本上保持不变，在胰岛素信号水平上确认了胰岛素抗性的存在。还预计用GLP-1处理高脂肪饲喂的大鼠将抑制响应于葡萄糖摄食的Akt磷酸化，这表示胰岛素敏感性。
这些结果将表明施用线粒体靶向抗氧化剂，例如本技术的GLP-1肽，预防在饲喂高脂饮食的大鼠中发展胰岛素抗性。同样地，本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在预防或治疗哺乳动物对象的胰岛素抗性的方法中有用。
实施例35：GLP-1预防人类对象中的线粒体功能障碍
该实施例将说明人类对象中线粒体驱动的细胞内氧化还原环境的变化与胰岛素抗性之间的联系。
将测量来自于偏瘦、胰岛素敏感(BMI＝21.6±1.2kg·m-2，HOMA＝1.2±0.4)和肥胖/抗胰岛素的(BMI＝43.0±4.lkg·m-2，HOMA＝2.5±0.7)男性对象的透性化骨骼肌纤维束中的线粒体H2O2生成和呼吸。在实验当天，对象将在禁食过夜(约12小时)后报告实验室。将获得空腹血样以测定葡萄糖和胰岛素。将记录身高和体重并且将在局部皮下麻醉(1％利多卡因(lidocaine))下通过经皮穿刺活检技术从股外侧肌外侧获得骨骼肌活检。一部分活检样品将速冻于液体N2中用于蛋白质分析，而另一部分将用于制备透性化纤维束。
预计在肥胖对象中响应于琥珀酸盐滴定，线粒体H2O2生成比在偏瘦对象中更高，并且在受脂肪酸支持的基础呼吸期间更高。预计基础O2利用率在偏瘦和肥胖对象中相似，在肥胖对象中在谷氨酸盐/苹果酸盐/琥珀酸盐和棕榈酰肉碱支持的基础呼吸期间线粒体自由基泄露的速率更高。最后，预计GSH总含量和GSH/GSSG比率在肥胖对象的骨骼肌中较低，表明总体氧化还原缓冲能力较低并且细胞内氧化还原环境氧化态更高。
这些结果将表明线粒体ROS生成和引起的向更高氧化态的骨骼肌氧化还原环境转变是高脂饮食诱导的胰岛素抗性的根本原因。预计线粒体H2O2生成的预期增量是有助于细胞总体氧化还原环境转变的主要因素。因此，施用线粒体靶向抗氧化剂，例如本技术的GLP-1肽，将防止或补偿高脂饮食引起的代谢功能障碍。同样地，本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，，在预防或治疗人类对象的胰岛素抗性的方法中有用。
实施例36：GLP-1用于预防和治疗胰岛素抗性
为证明对胰岛素抗性的预防和治疗，将向为公认的饮食诱导胰岛素抗性模型的肥胖(fa/fa)Zucker大鼠施用本技术的GLP-1肽。与高脂肪饲喂的Sprague-Dawley大鼠(如实施例1-3中所使用)相比，预计肥胖Zucker大鼠会在相似条件下发展更高程度的肥胖症和胰岛素抗性。如实施例1-3中一样，预计在来自于Zucker大鼠的透性化纤维中线粒体功能障碍(例如，H2O2生成增加)将显而易见。
为证明GLP-1肽对胰岛素抗性预防的影响，将为青年Zucker大鼠(～3-4周龄)施用GLP-1约6周。因为这些青年大鼠尚未表现出胰岛素抗性的病征或症状，所以其提供了评估预防胰岛素抗性的方法的功效的有用模型。将经腹膜内(i.p.)或口服(饮水或口服喂食)向大鼠施用GLP-1(1.0-5.0mg/kg体重)。
预计施用GLP-1将减弱或预防通常在肥胖Zucker大鼠中发展的全身和肌肉胰岛素抗性的发展。测量的生理参数包括体重、空腹葡萄糖/胰岛素/游离脂肪酸、口服葡萄糖耐量(OGTT)、体外肌肉胰岛素敏感性(体外培养)、胰岛素信号的生物标志(Akt-P、IRS-P)、对透性化纤维的线粒体功能研究(呼吸、H2O2生成)、细胞内氧化应激的生物标志(脂质过氧化、GSH/GSSG比率、顺乌头酸酶活性)和线粒体酶活性。对照动物将包括未施用GLP-1的野生型和肥胖大鼠。与上面提到的胰岛素抗性或线粒体功能障相关的一个或多个标志减少将表明本技术的GLP-1肽成功预防胰岛素抗性。
为证明GLP-1肽对胰岛素抗性治疗的影响，将为Zucker大鼠(～12周龄)施用GLP-1约6周。因为这些大鼠显示出肥胖症和胰岛素抗性的病征，所以其将提供评估治疗胰岛素抗性的方法的功效的有用模型。将经腹膜内(i.p.)或口服(饮水或口服喂食)向大鼠施用GLP-1(1.0-5.0mg/kg体重)。
预计施用GLP-1将减轻通常在肥胖Zucker大鼠中发展的全身和肌肉胰岛素抗性。测量的参数包括体重、空腹葡萄糖/胰岛素/游离脂肪酸、口服葡萄糖耐量(OGTT)、体外肌肉胰岛素敏感性(体外培养)、胰岛素信号的生物标志(Akt-P、IRS-P)、对透性化纤维的线粒体功能研究(呼吸、H2O2生成)、细胞内氧化应激的生物标志(脂质过氧化、GSH/GSSG比率、顺乌头酸酶活性)和线粒体酶活性。对照将包括未施用GLP-1的野生型和肥胖大鼠。与上面提到的胰岛素抗性或线粒体功能障相关的一个或多个标志减少将表明本技术的GLP-1肽成功治疗胰岛素抗性。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在治疗或预防哺乳动物对象的胰岛素抗性的方法中有用。
实施例37：GLP-1防止缺血-再灌注引起的肾前性ARI
该实施例将证明本技术的GLP-1肽在保护对象免于缺血-再灌注(I/R)引起的急性肾损伤(ARI)中的作用。
向三组之一分配8只Sprague Dawley大鼠(250～300g)：(1)假手术(无I/R)；(2)I/R+盐水媒介物；和(3)I/R+GLP-1。将在缺血前30分钟和再灌注后立即施用GLP-1(3mg/kg于盐水中)。将按照相同时间表给予对照动物单独的盐水。
将用克他命(90mg/kg，腹膜内)和甲苯噻嗪(4mg/kg，腹膜内)的混合物麻醉大鼠。将使用微型夹钳封闭左肾血管蒂30-45分钟。在缺血期结束时，将通过移除夹钳建立再灌注。此时，将切除对侧肾。再灌注24小时后，将处死动物并通过心脏穿刺获得血样。将通过测量血尿素氮(BUN)和血清肌酐的水平(BioAssaySystems DIUR-500and DICT-500)测定肾功能。
肾形态学检查：肾将于10％中性缓冲福尔马林(formalin)中固定并且石蜡包埋以切片。将用苏木精-伊红(H&E)和希夫氏高碘酸(PAS)为3微米切片染色，并通过光学显微术分析。将根据1)单个细胞的有丝分裂和坏死，2)周围小管存活的相邻近曲小管内所有细胞的坏死，3)限于有一群坏死延伸过内皮质的近曲小管远侧三分之一的坏死，和4)影响近曲小管的全部三个区段的坏死，为损害评分。
TUNEL凋亡测定：将为肾组织切片脱蜡并用二甲苯、梯度醇系列和去离子H2O再水合，并且在室温下在20μg/ml蛋白酶K中培养20分钟。将根据生产商的说明使用原位细胞死亡检测POD试剂盒(Roche,IN,USA)。简言之，将通过用0.3％于甲醇中的H2O2培养10分钟阻断肾切片中的内源性过氧化物酶活性。然后将在37℃下在黑暗中于加湿箱内用TUNEL反应混合物培养切片30分钟。洗涤后，将在室温下于加湿箱内用50-100μl Converter-POD培养载玻片30分钟。将在DAB溶液中培养载玻片(1-3分钟)，用苏木精复染，通过一系列梯度醇脱水，并且固定于Permount内进行显微镜检查。
免疫组织化学分析：将从石蜡块上切取肾切片并固定在载玻片上。用二甲苯去除石蜡后，将使用梯度醇系列和去离子H2O使载玻片再水合。将于柠檬酸盐缓冲液(10mM柠檬酸，0.05％吐温20，pH 6.0)中加热载玻片进行抗原修复。将用0.3％于甲醇中的过氧化氢阻断内源性过氧化物酶。然后将使用按1:200稀释的血红素加氧酶-I(HO-1)的一抗(大鼠抗HO-1/HMOX1/HSP32单克隆抗体(R&D Systems,MN,USA)和二抗(HRP偶联山羊抗大鼠IgG，VECTASTAIN ABC(VECTOR Lab Inc.MI,USA))进行免疫组织化学分析。将使用底物试剂3-氨基-9-乙基咔唑(AEC,Sigma,MO,USA)使载玻片显色，用苏木精复染。
蛋白质印迹：将于冰上将肾组织匀化于2ml的RIPA裂解缓冲液(Santa Cruz,CA,USA)中并且在500×g下离心30分钟以去除细胞碎片。上清液等分试样将储存于-80℃下。包含30μg来自每种样品的蛋白质的等分试样将悬浮于上样缓冲液中，煮沸5分钟，并经受10％SDS-PAGE凝胶电泳。蛋白质将转移到PVDF膜上，于含1％牛血清白蛋白的5％脱脂奶粉中阻断1小时，并用1:2000稀释的抗HO1/HMOXl/HSP32或1:1000稀释的抗AMPKα-1单克隆抗体(R&D Systems,MN,USA)培养。将使用辣根过氧化物酶偶联二抗检测特异性结合，将使用增强型化学发光检测系统(Cell Signaling,MA,USA)显色。
ATP含量测定：在收获后立即，将肾组织置于10ml含10mM DTT、2mMEDTA的5％三氯乙酸中，于冰上匀化，于冰上培养10分钟，在2000×g下离心10分钟，并用pH 7.6的10N KOH中和。在2000×g下离心10分钟后，所得上清液的等分试样将储存于-80℃下。将使用市场上可买到的试剂盒(ATPbioluminescent kit,Sigma,MO,USA)通过生物发光测量ATP。
线粒体功能：将分离肾线粒体并根据本文所述的程序测量氧耗量。
预计GLP-1处理将提高缺血和再灌注后大鼠体内的BUN和血清肌酐值，并且将预防缺血和再灌注后肾小管细胞凋亡。还预计GLP-1将预防缺血和再灌注后肾小管细胞损伤。这些结果将表明本技术的GLP-1肽在减少缺血-再灌注引起的ARI的发病率上有效。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在保护对象免于缺血引起的ARI的方法中有用。
实施例38：GLP-1防止输尿管梗阻引起的肾后性ARI
将在单侧输尿管梗阻(UUO)的动物模型中证明本发明的GLP-1肽在保护对象免于输尿管梗阻引起的ARI中的作用。
Sprague-Dawley将经历在无菌条件下通过腹部中线切口用4-0丝线进行单侧输尿管结扎。将通过就在输尿管膀胱连接部上方结扎左侧输尿管下端实现输尿管梗阻。在UUO前一天经腹膜内施用GLP-1(1mg/kg或3mg/kg；n＝8)或对照媒介物(n＝16)并且在UUO 14天后继续施用。
肾组织学：将由委员会认证的病理学家(SVS，肾病理学专家)检查石蜡包埋样本的三色切片，并且按0-+++的尺度评分。
免疫组织化学分析：将使用先前所述的ED-1的单克隆抗体对巨噬细胞进行免疫组织化学染色。将在10倍高倍视野下(×400)，由两名独立的研究员以盲目形式为巨噬细胞计数。将通过如实施例1中所述的TUNEL测定测量凋亡。将使用如实施例1中所述的免疫组织化学法，使用DAKO#S100-A4抗体(1:100稀释)检查成纤维细胞的存在。将通过用蛋白酶K培养细胞20分钟修复抗原。将根据常规程序进行剩余的免疫过氧化物酶方法。
预计在梭状间质细胞和圆形炎性细胞中将存在S100-A4染色。将仅量化梭状细胞。将使用用于抗原修复的蛋白酶K和日本老化制御研究所(Japan InstituteControl of Aging)提供的抗体按1:200-1:500稀释进行8-0H dG染色。
聚合酶链式反应分析：将根据以下通过RT-PCR测量肾血红素加氧酶-1(HO-1)的表达：将收获大鼠肾脏并储存在-80℃下直至使用。将使用Trizol(R)-氯仿提取程序提取总RNA，并且将使用Oligotex mRNA提取试剂盒(Qiagen,Valencia,California,U.S.A.)根据生产商的说明纯化mRNA。将通过测量260nm下的吸光度测定mRNA浓度和纯度。将使用Qiagen一步PCR试剂盒(Qiagen,Valencia,California,U.S.A.)和自动热循环仪(ThermoHybrid,PX2)进行RT-PCR。热循环将按如下进行：在95℃下的初始活化步骤15分钟，接着是在94℃下变性45秒，在60℃下退火30秒，在72℃下延伸60秒循环35次。将通过2％琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，通过溴化乙锭染色可视化，并使用Image J光密度分析软件量化。GAPDH将用作内部对照。
预计未受阻的对侧肾将在肾小管、肾小球或肾间质中显示出极少(若有)炎症或纤维化，并且对照动物的受阻肾脏将显示中等(12+)髓质三色染色和病灶性肾盂1+染色的区域。预计皮质将显示出比髓质更少的纤维化。还预计对照受阻肾脏将显示中度炎症，通常在皮质中评分为1+并且在髓质中评分为2+。预计经GLP-1处理的受阻肾脏会显示出明显更少的三色染色，在皮质中评分为0-微量并且在髓质中评分为微量-1+。因此，预计GLP-1处理将减少UUO模型中的髓质纤维化。
将通过免疫过氧化物酶使成纤维细胞的成纤维细胞特异性蛋白(FSP-1；akaS100-A4)可视化。预计在受阻肾脏中将发现FSP-1表达增加。还预计GLP-1(1mg/kg)将显著减少受阻肾脏中成纤维细胞浸润的量。因此，预计GLP-1将减少UUO模型中的成纤维细胞表达。
预计在未经处理的肾脏中，2周UUO将导致与对侧肾相比，肾小管凋亡细胞显著增加。还预计GLP-1(1mg/kg)将显著减少受阻肾脏中的肾小管细胞凋亡。因此，预计GLP-1将减少UUO模型中的肾小管细胞凋亡。
预计2周UUO后与对侧肾相比，巨噬细胞向受阻肾脏的浸润将显著增加。还预计用1mg/kg或3mg/kg的GLP-1处理将显著减少受阻肾脏内的巨噬细胞浸润。因此，预计GLP-1将减少UUO模型中的巨噬细胞浸润。
预计正如通过免疫过氧化物酶可视化PCNA那样，受阻肾脏将与肾小管细胞的增殖增加相关。预计GLP-1将引起受阻肾脏内肾小管细胞增殖显著减少。预计在1mg/kg剂量下肾小管细胞增殖将减少，并且在3mg/kg剂量下将减少多达3.5倍。因此，预计GLP-1将抑制UUO模型中的肾小管细胞增殖。
预计正如通过血红素加氧酶-1(HO-1)和8-OH dG的表达增加所测量那样，受阻肾脏与对侧肾相比将显示出更高的氧化性损伤。预计用GLP-1处理将减少受阻肾脏内的HO-1表达。预计在受阻肾脏的肾小管和间质性腔隙内均会将检测到8-OH dG染色，受阻肾脏内8-OH dG阳性细胞的数量与对侧肾相比将显著增加，并且通过GLP-1处理将显著减少8-OH dG阳性细胞的数量。因此，预计GLP-1将减少UUO模型中的氧化性损伤。
这些结果将表明GLP-1在UUO引起的ARI动物模型中，在减少间质性纤维化、肾小管细胞凋亡、巨噬细胞浸润和肾小管细胞增殖上有效。同样地，本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在保护对象免于输尿管梗阻引起的ARI的方法中有用。
实施例39：GLP-1用于预防和治疗造影剂诱导的肾病
该实施例将证明本技术的GLP-1在ARI动物模型中预防和治疗造影剂诱导的肾病(CIN)的用途。
动物模型：将使用Agmon等，J.Clin.Invest.94:1069-1075(1994)描述的放射性造影剂诱导的肾衰竭的大鼠模型。与在人类中一样，放射性造影剂在施用给具有正常肾功能的动物时，通常是无毒的。然而，放射性造影剂可在肾功能受损的动物中诱导ARI。在该模型中，通过施用消炎痛(10mg/kg)和L-NAME(10mg/kg)诱导肾功能受损。动物将分配给三组之一：
1.对照(n＝8)
2.间隔15分钟施用消炎痛和L-NAME，接着施用碘酞酸盐(6ml/kg)(n＝7)
3.组2中在施用消炎痛/L-NAME/碘酞酸盐前15分钟施用GLP-1(3mg/kg，腹膜内)；在药物暴露后立即施用第二剂量的GLP-1(3mg/kg)。
肾功能：将通过在基线和染料施用24小时后测定GFR评估肾功能。将通过在染料施用之前和之后24小时间期估计的肌酐清除率测定GFR。将通过测量血浆和尿肌酐水平(Bioassay Systems；DICT-500)和尿量分析肌酐清除率。
肾组织学：肾脏将于10％中性缓冲福尔马林中固定并且石蜡包埋以切片。将用苏木精-伊红(H&E)和希夫氏高碘酸(PAS)为3微米切片染色并由委员会认证的病理学家通过光学显微术分析。将通过TUNEL标记可视化凋亡。
预计对照动物在第一个24小时(约235.0±30.5μl/min/g)和第二个24小时(约223.7±44.0μl/min/g)之间不会显示出GFR的显著差异。预计当向经消炎痛和L-NAME预处理的动物施用造影剂时，GFR将在24小时内下降，并且在染料施用之前和之后用GLP-1处理将减少肾功能的下降。
预计PAS染色将说明对照肾脏中的正常形态，及暴露于造影剂的肾脏中肾刷状缘损失和空泡形成。还预计通过GLP-1处理将减弱这些效应。因此。预计GLP-1将预防暴露于放射性造影剂的对象的肾损伤。
预计对照肾脏将显示很少的凋亡细胞，而暴露于造影剂的肾脏将具有许多凋亡细胞。还预计用GLP-1处理将减少暴露于造影剂的肾脏中的凋亡细胞数量。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽在减少由放射性造影剂暴露诱导的肾损伤上有效。同样地，本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在治疗或预防由造影剂暴露引起的急性肾损伤的方法中有用。
实施例40：GLP-1用于预防和治疗糖尿病对象的CIN
该实施例将证明本技术的GLP-1肽在预防和治疗造影剂诱导的肾病(CIN)中的用途。
动物模型：糖尿病引起的肾功能受损是造影剂诱导的肾病的主要诱发因素之一(McCullough等，J.Am.Coll.Cardio.,2008,51,1419-1428)。在该实验中，将饲喂总共57只Sprague-Dawley大鼠高脂饮食6周，接着施用低剂量链脲霉素(streptozotocin)(30mg/kg)9周。将测量血糖、血清肌酐和胱抑蛋白C。满足以下标准的动物(n＝20)将推进CIN研究：Scr>250μM，胱抑蛋白C>750ng/ml和血糖>＝16.7μM。
将为动物施用碘海醇(iohexol)和GLP-1或碘海醇和盐水对照媒介物。
在第1天，将收集血清样品并且将使用Bradford测定法测量尿总蛋白。在第2和3天，将在注射造影剂(6mL/kg尾静脉注射)30分钟前，经皮下(s.c.)施用3mg/kg GLP-1或对照媒介物。将在染料施用后第2和24小时重复施用GLP-1或媒介物。将在第4和5天收集血清和尿样。将在第5天使动物安乐死，并收获生命器官。将通过学生t检验分析样品并且在p<0.05时将差异视为显著。
肾功能：将通过在基线、染料施用后48小时和72小时测定血清和尿肌酐评估肾功能。将根据血清和尿肌酐及尿量计算肌酐清除率。将通过Bradford蛋白测定试剂盒(Sigma,St.Louis,MO,U.S.A.)测定尿蛋白浓度，并且将使用Westang大鼠胱抑蛋白C试剂盒(Shanghai,P.R.C.)测量胱抑蛋白C。
预计对照动物将在造影剂暴露之后显示血清胱抑蛋白C(AKI生物标志)水平升高和肌酐清除率降低，并且用GLP-1处理将减弱这些效应。因此，预计本技术的GLP-1肽减轻糖尿病动物模型中由放射性造影剂引起的肾功能障碍。同样地，本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在保护糖尿病对象免于造影剂引起的急性肾损伤的方法中有用。
实施例41：GLP-1用于预防和治疗甘油诱导的横纹肌溶解动物模型中的CIN
该实施例证明了本技术的GLP-1肽在预防和治疗甘油诱导的横纹肌溶解动物模型中的CIN的用途。
动物模型：该实施例将利用如先前所述，经受甘油诱导的横纹肌溶解的动物。Parvez等，Invest.Radiol.,24:698-702(1989)；Duan等，Acta Radiologica,41:503-507(2000)。将在按10ml/kg的剂量肌肉(i.m.)注射25％甘油溶液(v/v)后，使体重为300-400g的Sprague-Dawley大鼠脱水24小时。24小时后，将根据以下为动物施用造影剂与GLP-1或对照媒介物：1)25％甘油+盐水+PBS(n＝6)，2)25％甘油+泛影酸盐+PBS(n＝7)，3)25％甘油+泛影酸盐+GLP-1(n＝7)。将通过比较来自每一组的动物的肾功能证明GLP-1对ARI的影响。将通过学生t检验分析样品并且在p<0.05时将差异视为显著。
肾功能：将通过在基线、脱水24小时后和施用造影剂48小时后测定血清和尿肌酐评估肾功能。将根据血清和尿肌酐水平及尿量计算肌酐清除率。将使用竞争ELISA测定法测定尿白蛋白浓度。
预计当向患有甘油诱导的横纹肌溶解的对象施用造影剂时肌酐清除率将降低。还预计用GLP-1处理将减弱或防止肌酐清除率降低。
蛋白尿是肾小球膜渗透性增加的指示剂，并且可由暴露于造影剂产生。预计当向患有甘油诱导的横纹肌溶解的对象施用造影剂时蛋白尿将增加。还预计用GLP-1处理将减少或预防此类对象中的蛋白尿，表明GLP-1对该模型中肾小球基底膜的渗透性具有保护作用。
预计PAS染色将说明在向患有甘油诱导的横纹肌溶解的对象施用造影剂后近端小管刷状缘损失，以及肾小球肿胀和肾小管蛋白管型沉积。还预计用GLP-1处理将减弱或防止此类对象中的这些效应。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在预防和治疗患有横纹肌溶解的对象的CIN的方法中有用。
实施例42：GLP-1用于预防和治疗肾毒性CC1 4 慢性肾损伤
该实施例证明了本技术的GLP-1肽用于预防和治疗四氯化碳(CC14)诱导的慢性肾毒性的用途。
动物模型：活性自由基的生成已经牵涉于四氯化碳诱导的肾毒性，其中特征在于脂质过氧化和功能异常性蛋白积聚。Ozturk等，Urology,62:353-356(2003)。该实施例描述了施用GLP-1肽预防四氯化碳(CC14)诱导的慢性肾毒性的作用。
研究设计和实验方案：将为体重为250g的Sprague-Dawley大鼠饲喂0.35g/L苯巴比妥溶液(鲁米那水)两周，并分配到以下分组之一：1)鲁米那水+橄榄油，胃肠道内(i.g.)，1ml/kg，每周两次；PBS皮下(s.c.)，每周5天；2)鲁米那水+50％CC14.i.g.，2ml/kg，每周两次；和PBS s.c每周5天；3)鲁米那水+50％CC14.i.g.，2ml/kg，每周两次；GLP-1(10mg/kg)s.c.每周5天。试验将总共进行7周。
在第5周结束时，将处死每一组的4个对象进行组织病理学切片和纤维化检查。在第7周结束时，将处死所有剩余对象，并且收获肾脏和肝脏进行组织病理学检查。
肾组织学：肾脏将于10％中性缓冲福尔马林中固定并且石蜡包埋以切片。将用苏木精-伊红(H&E)为3微米切片染色并由认证的病理学家通过光学显微术分析。
预计GLP-1将保护肾小管免受CCl4肾毒性。预计H&E染色会说明CCl4暴露导致肾小管上皮细胞变性和坏死，并且经GLP-1处理的动物与对照动物相比未显示显著的组织病理学变化。因此，本技术的GLP-1肽在预防或治疗CCl4肾毒性的方法中有用。
实施例43：GLP-1用于预防顺铂诱导的ARI
该实施例将证明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐在预防顺铂诱导的ARI中的用途。
实验方案：将在第1天经腹膜内(i.p.)给予Sprague-Dawley大鼠(350-400g)单剂量的顺铂(7mg/kg)。就在施用顺铂之前，对象将经皮下接受GLP-1(3mg/kg)(n＝8)或盐水媒介物(n＝8)，并且再施用3天，每天一次。在试验最后24小时对象将置于代谢笼内以收集尿液。在试验结束时，将从尾静脉抽取血样并收获肾脏。
肾功能：将通过测量血尿素氮(BUN)、血清肌酐、尿肌酐和尿蛋白评估肾功能。将从由血清和尿肌酐及尿量测定的肌酐清除率估计GFR。
肾组织学：肾脏将于10％中性缓冲福尔马林中固定并且石蜡包埋以切片。将用希夫氏高碘酸(PAS)为3微米切片染色并通过光学显微术分析。
预计媒介物对照对象与施用顺铂之前的体重相比，将在施用顺铂之后显示体重明显减轻，并且GLP-1处理将减弱或预防这种效应。还预计血清肌酐在媒介物对照对象中将大幅增加，并且GLP-1处理将减弱或预防这种效应。
预计媒介物对照对象在顺铂处理之后将显示BUN明显增加，并且GLP-1处理将减弱或预防这种效应。
这些结果将表明GLP-1保护肾脏免于顺铂诱导的肾病。同样地，本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在保护对象免于顺铂或类似肾毒性剂引起的急性肾损伤的方法中有用。
实施例44：GLP-1预防和治疗急性肝衰竭(ALF)
该实施例证明了本技术的GLP-1肽在预防和治疗急性肝衰竭(ALF)中的用途。
适合的ALF动物模型利用外科手术、中毒性肝损伤或其组合。见Belanger和Butterworth，Metabolic Brain Disease,20:409-423(2005)。在中毒或手术伤害之前或同时施用GLP-1或对照媒介物。将通过测量血清肝脏酶(转氨酶、碱性磷酸酶)、血清胆红素、血氨、血清葡萄糖、血清乳酸或血清肌酐评估肝功能。将通过与对照对象相比，以上标志指示的ALF的发病率或严重程度降低指示本发明的GLP-1肽在预防ALF中的功效。
预计中毒或手术性肝伤害将引起肝功能降低，并且用GLP-1处理将减弱或预防这种效应。这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在预防或治疗ALF的方法中有用。
实施例45：GLP-1用于预防和治疗灼伤后的代谢亢进
代谢亢进(HYPM)是灼伤后代谢紊乱标志特征。能量消费增加，随着脂质氧化对能量生产总量的贡献增加，与底物氧化加速和燃料利用率变化相关。线粒体功能障碍与HYPM的发展密切相关。该实施例将证明本技术的GLP-1肽在预防和治疗HYPM中的用途。
Sprague Dawley大鼠将随机分为三组：假灼伤(SB)，经盐水处理的灼伤(B)和经肽处理的灼伤(BP)。将通过手术将导管置于颈静脉和颈动脉内。BP组动物将通过将背侧浸入100℃水中12秒受到30％全身表面积三度灼伤，之后立即液体复苏。BP动物将接受IV注射GLP-1(2mg/kg，每12小时)三天。将在TSE间接量热系统(TSE Co.,Germany)中监测动物的EE。
预计B组的动物与SB组的动物相比将显示EE显著增加，并且用GLP-1处理将减弱或预防这种效应。这些结果将表明用GLP-1处理预防或减弱了灼伤诱导的HYPM。同样地，本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在治疗有需要的对象灼伤和继发性并发症的方法中有用。
实施例46：GLP-1防止灼伤诱导的肝细胞凋亡
全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官衰竭(MOF)是重度灼伤患者中发病率和死亡率的主要原因。该实施例证明了GLP-1在预防这些效应中的用途。
6至8周龄的雄性C57BL小鼠将经受30％全身表面(TBSA)灼伤并且随后每天注射盐水媒介物或GLP-1肽(5mg/kg体重)。重量和时间匹配的暴露于)微温液体(～37℃)的假灼伤组将用作对照。在灼伤处理1、3和7天后收集肝脏组织并分析细胞凋亡(TUNEL)、活化半胱天冬酶水平(蛋白质印迹)和半胱天冬酶活性(酶学测定)。
预计在检查的所有日期，灼伤将增加对照对象肝脏内的细胞凋亡速率，预计在灼伤后第7天出现最明显的增加。还预计用GLP-1肽处理将减弱或预防这种效应。
预计蛋白质印迹分析将揭示与假对照组相比，灼伤后活化半胱天冬酶-3逐渐增加。还预计在灼伤后第3天和第7天用GLP-1处理将减弱或抑制半胱天冬酶-3活化，产生与假对照动物相似的活化半胱天冬酶-3水平。预计半胱天冬酶活性将在灼伤后第7天显著增加，并且用GLP-1肽处理将使半胱天冬酶活性降低到与假对照组在统计上无差异的水平。还预计与对照对象相比，在经GLP-1肽处理的小鼠中，在灼伤后蛋白质氧化将减少。
这些结果将表明GLP-1防止灼伤诱导的凋亡细胞途径的活化及后续肝细胞凋亡。同样地，本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在预防或治疗灼伤继发性全身器官损伤，例如肝损伤的方法中有用。
实施例47：GLP-1用于预防灼伤后伤口收缩
该实施例将证明本技术的GLP-1肽用于预防伤口收缩的用途。
灼伤伤口通常在深度和严重程度上不均，在损伤可能可逆的凝固组织周围面积很大，并且可预防炎症性组织损伤。伤口收缩是缩小三度开放性伤口并且尤其是三度灼伤的尺寸的过程。收缩和皮下纤维组织形成期间发展的张力可导致组织畸形、弯曲固定、关节伸展固定(伤口涉及关节上的区域时)。此类并发症在灼伤愈合中特别相关。当对组织无损伤时，不会发生伤口收缩；并且当灼伤为三度，在伤口中未剩余活体组织时，将发生最大的收缩。
将在灼伤(65℃水，25秒，下背部)1小时前腹膜内施用1mg GLP-1(约3mg/kg)预处理Sprague-Dawley大鼠(雄性，300-350g)，接着想伤口局部涂覆GLP-1(1mg)，并且每12小时腹膜内施用1mgGLP-1肽72小时。将在灼伤后长达3周观察到伤口。
预计伤口将呈硬痂外观，这将量化为伤口尺寸的量度。预计与对照对象相比在GLP-1处理组中将观察到较缓慢的伤口收缩速率，以致与对照相比在这些对象中灼伤将不那么严重。这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在治疗与灼伤相关的伤口的方法中有用。
实施例48：GLP-1减轻灼伤后的骨骼肌功能障碍
该实施例将证明GLP-1用于预防和治疗灼伤后并发症的用途。
人们认为灼伤中骨骼肌线粒体功能障碍的主要原因是经由刺激线粒体生成活性氧(ROS)进行氧化磷酸化(OXPHOS)的缺陷和对线粒体DNA(mtDNA)的氧化性损伤的结果。这种假设受指示响应于灼伤，骨骼肌中ATP合成速率显著降低和ROS生成增加的数据支持。这种进展成为灼伤病理生理学的原因，包括骨骼肌损耗和恶病质。
临床相关的鼠灼伤模型将用于证明GLP-1对灼伤诱导的线粒体功能障碍和内质网(ER)应激的影响。将通过硝基氧EPR估计就在局部皮肤灼伤(90℃，3秒)下的腓肠肌的氧化还原状态。预计肌肉内的氧化还原状态将受灼伤损害，在灼伤6小时后效应最显著。
将在灼伤30分钟前和在灼伤后立即经腹膜内施用GLP-1(3mg/kg)肽。预计在6小时时间点，肽处理将显著增加硝基氧还原速率，证明GLP-1处理减少了灼伤下肌肉内的氧化应激。这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在预防或治疗灼伤继发性并发症，例如骨骼肌功能障碍的方法中有用。
实施例49：GLP-1减弱灼伤后组织损伤的进展
该实施例将证明GLP-1肽用于预防灼伤后组织损伤进展的用途。结果将表明GLP-1
提高二度烧伤伤口内的伤口愈合(即，加速愈合或导致更少瘢疤形成)。
Sprague Dawley大鼠将随机分为三组：假灼伤(SB)，经盐水处理的灼伤(B)和经肽处理的灼伤(BP)。BP组动物将通过将背侧身体浸入100℃水中12秒受到30％全身表面积三度灼伤，之后立即液体复苏。BP动物将接受IV注射GLP-1(2mg/kg，每12小时)三天。将在21天内经由总体形态学和在组织学上评估伤口表皮细胞再生、收缩和深度。为此，在受伤后立即向动物皮肤的伤口边缘以及离边缘1cm处涂上黑色标记。将在21天内为伤口数码拍照，并且将使用图像分析软件测量伤口的面积(定义为痂)。标记离伤口部位的距离将用于评估伤口收缩。
在所选时间点，将从动物收获伤口。因为预计二度到三度伤口的行列主要在灼伤48后前48小时内发生，所以将在12、24和48小时收获样品。为监测对伤口愈合过程的长期影响，将在第2、7、14和21天收获样品。将固定并包埋组织，并且从收集的伤口的中央切片，进行H&E和三色染色。
将使用TUNEL标记和使用在灼伤后0和48小时期间获得的皮肤样品进行的活化半胱天冬酶-3免疫染色测量皮肤毛囊的细胞凋亡。将在高放大倍数下数字化获取图像进行TUNEL和半胱天冬酶-3染色的量化。将测定每个高倍视野阳性细胞的数量，并且在组间比较。
将使用多普勒(Doppler)成像进行发光映射以评估伤口血流量。灼伤2小时后，将在扫描激光多普勒装置上为动物的背部成像以量化灼伤区域内外皮肤的浅表血流分布。为了发光映射，将使用100只雄性Sprague-Dawley大鼠。80只动物将在背部接受大面积(占全身表面积的30％)三度灼伤。这是已确立的模型。其将分为2组，一组用GLP-1处理而另一组用安慰剂(盐水)处理。每一组将进一步分为由将处死动物进行进一步分析的4个时间点组成的4个小组。处死之前，将进行发光成像，接着安乐死并为皮肤组织取样用于后续组织学分析。其余20只动物将接受“假灼伤”并且将用GLP-1或盐水处理。将对相应的4个时间点的每个小组中的两只动物进行安乐死。平均来说，每只动物将在单独的笼中居住10天(包括灼伤前在动物庄园的天数)。
预计在该模型中施用GLP-1将加速伤口愈合并减弱灼伤进展。还预计GLP-1处理将减少灼伤诱导的细胞凋亡和血流量。这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在减弱灼伤后组织损伤的进展，正如二度灼伤到三度灼伤的进展一样的方法中有用。
实施例50：GLP-1防止晒伤并减弱晒伤后组织损伤的进展
该实施例将证明GLP-1肽防止晒伤和减弱鼠类模型中晒伤后组织损伤的进展的用途。
将使皮肤特征与人类相似的无毛小鼠暴露于过度UV辐射一周。对象将随机分为3组：1)灼伤；盐水媒介物；2)灼伤，GLP-1(每日4mg/kg，低剂量组)；3)灼伤，GLP-1(每日40mg/kg，高剂量组)。将静脉内施用肽7天，每天两次。测量的参数将包括伤口收缩、表皮细胞再生距离、细胞构成和胶原机体形成。将评估Ki67增殖抗原，以及TUNEL和半胱天冬酶-3活化。将通过发光映射测量血流量。
预测施用GLP-1将加速伤口愈合并减弱该模型中晒伤的进展。这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在防止晒伤和减弱晒伤后组织损伤进展的方法中有用。
实施例51：GLP-1通过下调褐色脂肪组织内的UCP-1表达减弱灼伤诱导的 代谢亢进
代谢亢进是灼伤后代谢紊乱的标志特征。灼伤后发生线粒体功能障碍，并且与代谢亢进(和底物氧化改变)密切相关。解偶联蛋白1(UCP-1)在褐色脂肪组织内表达，并且在产生热量中起关键作用。该实施例将证实本技术的GLP-1肽下调灼伤后的UCP-1表达。
方法。Sprague Dawley大鼠将随机分为5组：虚假组(S)、经盐水媒介物处理的虚假组(SSal)、经GLP-1处理的虚假组(SPep)、经盐水媒介物处理的灼伤组(BSal)和经GLP-1处理的灼伤组(BPep)。灼伤对象的背面将浸入100℃水中12秒以在全身麻醉下产生三度30％TBSA灼伤。将通过浸入温水中产生虚假灼伤。对象将在损伤后接受40ml/kg盐水腹膜内注射以复苏。将在虚假或灼伤后通过手术将静脉导管置于右颈静脉内。见使用渗透泵(Durect,CA)输注GLP-1(2mg/kg)或盐水媒介物7天(4mg/kg/天)。将在灼伤6天后，于TSE间接量热系统(TSE Co.,Germany)中进行间接量热24小时，并且将每6分钟记录VO2、VCO2和能量消耗。将在间接量热之后收集肩胛间褐色脂肪组织，并且将通过蛋白质印迹估计褐色脂肪组织内的UCP-1表达。
预计与SSal组相比，在BSal组内VO2、VCO2和能量消耗将显著增加，并且用GLP-1处理将显著减弱这种效应。还预计BSal组内的UCP-1表达将高于SSal组，BPep组内的UCP-1水平低于BSal组。
这些结果将表明GLP-1通过下调褐色脂肪组织内的UCP-1表达减弱了灼伤诱导的代谢亢进。同样地，本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在治疗遭受灼伤的对象的方法中有用。
实施例52：GLP-1诱导灼伤后的ATP合成
该实施例将证明GLP-1肽增加了体内使用31P NMR和电子电子顺磁共振(EPR)灼伤后ATP合成的速率。
人们认为灼伤中骨骼肌线粒体功能障碍的主要原因是经由刺激线粒体生成活性氧(ROS)进行氧化磷酸化(OXPHOS)的缺陷和对线粒体DNA(mtDNA)的氧化性损伤的结果。这种假设受指示响应于灼伤，骨骼肌中ATP合成速率显著降低和ROS生成增加的数据支持。这种进展成为灼伤病理生理学的原因，包括骨骼肌损耗和恶病质。
材料和方法。将通过腹膜内(i.p.)注射40mg/kg戊巴比妥钠(pentobarbitalsodium)麻醉重20-25g的6周龄雄性小鼠。将剃光所有组的左后肢。将通过将左后肢浸入90℃水中3秒使灼伤对象遭受全身表面积(TBSA)3-5％的非致死性烫伤。
在Padfield等，Proc.Natl.Acad.Sci.,102:5368-5373(2005)中详细描述了NMR分光术。简言之，小鼠将随机分为1)灼伤+对照媒介物，2)灼伤+GLP-1肽，3)未灼伤+对照媒介物，和4)未灼伤+GLP-1肽组。将在灼伤前30分钟和在灼伤之后立即经腹膜内注射GLP-1肽(3mg/kg)。将在水平孔磁铁上(质子频率400MHz，直径21cm，Magnex Scientific)，使用Bruker Avanee控制台进行NMR实验。将优化90°脉冲以检测磷光谱(重复时间2s，400个平均数，4K数据点)。将使用后面是破碎梯度的饱和90°选择性脉冲序列(持续时间36.534ms，带宽75Hz)使γ-ATP峰饱和。还将在无机磷酸盐(Pi)共振的低磁场，与γ-ATP共振对称地施加相同的饱和脉冲序列。将在γ-ATP饱和的存在下使用反转恢复脉冲序列测量Pi和磷酸肌酸(PCr)的松弛时间。将使用绝热脉冲(扫描400次，以10KHz扫描，4K数据)反转Pi和PCr，反转时间介于152ms和7651ms之间。
在Khan等，Mol.Med.Rep.1:813-819(2008)中详细描述了EPR分光术。简言之，小鼠将随机分为1)灼伤+对照媒介物，2)灼伤+GLP-1肽，3)未灼伤+对照媒介物，和4)未灼伤+GLP-1肽组。将在灼伤0、3、6、24和48小时后经腹膜内注射GLP-1肽(3mg/kg)。将用装备有设计用于体内实验的微波桥和内部环状谐振器的I.2-GHz EPR分光计进行EPR实验。最佳分光计参数将为：入射微波功率，10mW；磁场中心，400高斯；调制频率，27kHz。将在不同时间点测量静脉注射的硝基氧(150mg/kg)的衰减动力学，以评估肌肉的线粒体氧化还原状态。
预计对照对象将在灼伤后展示出氧化还原状态显著升高，并且ATP合成速率显著降低。还预计与对照相比，GLP-1处理将诱导灼伤小鼠的ATP合成速率显著提高。
这些结果将表明GLP-1可能经由恢复线粒体氧化还原状态或经由过氧化物酶体增生物激活受体γ辅激活因子-1β(PGC-1β)诱导ATP合成速率。因此，预计通过施用GLP-1肽减弱了灼伤引起的线粒体功能障碍。
还预测即使在健康对照小鼠中，施用GLP-1肽也会大幅提高ATP合成速率。这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在预防或治疗灼伤继发性并发症，例如骨骼肌功能障碍的方法中有用。
实施例53：GLP-1降低线粒体顺乌头酸酶活性
线粒体顺乌头酸酶是TCA循环的一部分并且其活性已经与TCA流量直接相关。而且，其活性受ROS抑制，以致将其视为氧化应激的指标。该实施例将证明本技术的GLP-1肽对线粒体顺乌头酸酶活性的影响。
如上所述，鼠对象将经受灼伤或虚假灼伤并施用GLP-1或对照媒介物。将从灼伤和对照组织分离线粒体并且使用市场上可买到的试剂盒评估线粒体顺乌头酸酶活性。
预计在灼伤腿部(局部灼伤效应)和灼伤腿部的对侧(全身灼伤效应)，很可能由于灼伤诱导的代谢亢进，线粒体顺乌头酸酶活性将增加。因此，已知在灼伤中发生的可抑制线粒体顺乌头酸酶活性的ROS生成增加，很可能不会克服关于线粒体顺乌头酸酶活性和TCA流量的代谢亢进效应。虽然在这种情形下也观察到ROS增加，但是在完整人类骨骼肌和离体小鼠骨骼肌中，在运动/重复收缩的情况下也显示出类似结果。
因此，还预计在受到灼伤的对象中，GLP-1处理将使线粒体顺乌头酸酶活性降至对照水平。这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在降低灼伤后的线粒体顺乌头酸酶活性的方法中有用。
实施例54：GLP-1用于预防或治疗代谢综合征
该实施例将证明GLP-1肽用于预防和治疗代谢综合征的用途。
将饲喂Sprague Dawley大鼠高脂饮食(HFD)6周，然后施用单剂量的STZ(30mg/kg)。大鼠将维持HFD直至STZ施用14周后。将为饲喂正常鼠食(NRC)6周的对照对象施用无STZ的柠檬酸盐缓冲液。5个月后，将用GLP-1(10mg/kg、3mg/kg或1mg/kg s.c.q.d.(皮下，每日一次)或对照媒介物(盐水)处理糖尿病对象10周，每周5天。研究组将如下：
组A：HFD/STZ+GLP-110mg/kg s.c.q.d.(周一至周五)，n＝12；
组B：HFD/STZ+GLP-13mg/kg s.c.q.d.(周一至周五)，n＝12；
组C：HFD/STZ+GLP-11mg/kg s.c.q.d.(周一至周五)，n＝10；
组D：HFD/STZ+对照媒介物s.c.q.d.(周一至周五)，n＝10；
组E：NRC+对照媒介物s.c.q.d.(周一至周五)，n＝10。
预计HFD饲喂6周将引起明显的体重增加，并且施用STZ将增加血糖和高脂血症，表示这些对象中的代谢综合征样病症。因此，所述方案将会在这些对象中诱导代谢综合征。
10周肽处理期间，预计在接受GLP-1的对象中体重或血糖水平无明显变化。预计NRC组的血糖会在正常范围内，而预计STZ处理组的血糖在整个10周试验期内会保持更高。
预计HFD/STZ大鼠的血甘油三酯水平将比肽处理之前的NRC大鼠高得多，并且将在GLP-1施用10周之后降到正常水平，证明GLP-1对脂质代谢具有有益影响。这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在预防或治疗代谢综合征的方法中有用。
实施例55：GLP-1预防高葡萄糖诱导的对人视网膜上皮细胞的损伤
该实施例将证明GLP-1肽用于预防高葡萄糖诱导的对人视网膜上皮细胞(HREC)的损伤的用途。
用于本发明研究的HREC培养方法已知。通常见，Li等，Clin.Ophthal.Res.23:20-2(2005)；Premanand等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.47:2179-84(2006)。简言之，将在三种条件之一下培养HREC细胞：1)正常对照；2)30mM葡萄糖；3)30mM葡萄糖+GLP-1。将使用膜联蛋白V通过流式细胞术测量用不同浓度的GLP-1(10nM、100nM、1μM、10μM)共同处理的HREC在高葡萄糖中的存活率。通常见，Koopman等，Blood 84:1415(1994)；Homburg等，Blood X5:532(1995)；Vermes等，J.Immunol.Meth.184:39(1995)；Fadok等，J.Immunol.148:2207(1992)。
将在24小时和48小时测试用GLP-1共同处理的HREC在高葡萄糖中的存活率。预计与对照相比，经施用GLP-1将显著提高HREC的存活率，凋亡和坏死细胞减少。还预计用GLP-1处理会减少ROS生成。
为证明线粒体介导的途径将在GLP-1对高葡萄糖诱导的细胞死亡的防御中很重要，将使用TMRM通过流式细胞术测量线粒体膜电位。预计在用无GLP-1的高葡萄糖处理HREC 24或48小时之后，将检测到线粒体膜电位迅速损失，并且用100nM GLP-1处理将防止或减弱这种效应。这些结果将表明GLP-1肽防止了由暴露于高葡萄糖环境引起的线粒体膜电位损失。
预计葡萄糖(30mmol/L)将诱导从HREC的线粒体释放细胞色素c。将用细胞色素c抗体和线粒体特异性蛋白抗体(HSP60)免疫标记固定的HREC。预计共聚焦显微镜分析将显示正常培养和GLP-1中经葡萄糖共同处理的HREC具有重叠的细胞色素c染色和线粒体染色，表明细胞色素c和线粒体共区域化。预计用30mmol/L葡萄糖处理24或48小时后，将在HREC的细胞质中观察到细胞色素c，表明葡萄糖诱导细胞色素c从HREC的线粒体释放到细胞质，并且用GLP-1处理防止或减弱了这种效应。
这些结果将表明GLP-1促进了HREC细胞在高葡萄糖环境中的存活。同样地，本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在预防糖尿病性视网膜病的方法中有用。
实施例56：GLP-1预防饲喂高脂饮食的大鼠的糖尿病性视网膜病
该实施例将证明GLP-1用于预防饲喂高脂饮食(HFD)的大鼠的糖尿病性视网膜病的用途。
将在Sprague-Dawley大鼠中，通过6周HFD和1)低剂量STZ(30mg/kg)注射，或2)单次高剂量STZ(65mg/kg)的组合建立糖尿病大鼠模型。通常见，Srinivasan等，Pharm.Res.52(4):313-320(2005)。对照将维持正常鼠食(NRC)。处理组将如下：
组A：12HFD/STZ GLP-110mg/kg s.c
组B：12HFD/STZ GLP-13mg/kg s.c.
组C：12HFD/STZ GLP-11mg/kg s.c.
组D：10HFD/STZ对照媒介物s.c.
组E：10NRC对照媒介物s.c.
将收获眼睛并且使用本领域中已知的方法评估对象的白内障形成、上皮变化、血-视网膜屏障的完整性、视网膜微血管结构和视网膜紧密连接结构。
预计施用GLP-1将引起对糖尿病大鼠晶状体内白内障形成的预防或逆转。还预计施用GLP-1将减少STZ大鼠模型和HFD/STZ大鼠模型内的上皮细胞变化，并引起与对照对象相比，内部血-视网膜屏障改善。
预计施用GLP-1将减少在STZ或HFD/STZ大鼠中观察到的视网膜微血管变化。还预计正如通过claudin-5定位可视化的紧密连接，在对照对象中将沿着视网膜血管均匀分布，而在HFD/STZ对象中不均匀。还预计用GLP-1(10mg/kg)处理将防止、逆转或减弱这种效应。
这些结果将共同确定GLP-1肽预防或补偿了糖尿病在眼部的负面影响，例如白内障和微脉管系统损害。同样地，本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在预防或治疗人类对象与糖尿病相关的眼科疾患的方法中有用。
实施例57：GLP-1用于预防和治疗心力衰竭
该实施例将证明GLP-1用于预防和治疗高血压性心肌病和心力衰竭的用途。该实施例将进一步证明NADPH和线粒体在血管紧张素II(Ang II)诱导的心肌病中和在过表达异源三聚体Gq蛋白(Gαq)的α亚基的心肌病小鼠中的作用。
将解剖来自小于72小时的乳鼠的心室，切碎并用Blendzyme 4(45mg/ml，Roche)酶促消化。酶促消化之后，将使用差示预平皿接种富集心肌细胞2小时，并接种于纤连蛋白涂层培养皿上含20％胎牛血清(Sigma)和25μM阿糖胞苷(Sigma)的DMEM(Gibco)中24小时。心肌细胞将于含0.5％胰岛素转铁蛋白-硒(Sigma)、2mM谷氨酰胺和1mg/ml BSA的无血清DMEM中受血管紧张素II(1μM)刺激3小时。将同时用以下的任一种处理心肌细胞：GLP-1(1nM)、N-乙酰半胱氨酸(NAC：0.5mM)或PBS对照。为测量线粒体超氧化物浓度，将在37℃下培养Mitosox(5pM)30分钟以负载心肌细胞，接着用汉克斯平衡盐溶液(HanksBalanced Salt Solution)洗涤2次。将使用488/625nm的激发/发射波长通过流式细胞术分析样品。将使用FCS Express(De Novo Software,Los Angeles,CA,U.S.A.)分析流量数据，并且作为Mitosox荧光强度的直方图分布呈现。
小鼠实验、药物递送、超声心动描记术和血压测量。每个实验组(盐水、AngII、Ang II+GLP-1、WT、Gαq、Gαq+GLP-1)将包括6至10只小鼠。将使用皮下Alzet 1004渗透压微泵，连续施用增压剂量的Ang II(1.1mg/kg/d)4周，用或不用GLP-1(3mg/kg/d)。将在基线和泵植入4周后，使用装备有13MHz探针的SiemensAcuson CV-70进行超声心动描记术。将在0.5％异氟烷下以减少搅动，拍摄标准M模式、传统和组织多普勒图像，并且将根据美国超声心动图学会(AmericanSociety of Echocardiography)指南进行功能计算。将计算MTI作为等容收缩和松弛时间之和与LV射血时间之比。MPI增大是花费更大一部分的心缩期处理等容期间的压力变化的指示。作为GLP-1肽在经Ang II处理的小鼠中影响的参考，将包括Rosa-26诱导型mCAT的遗传小鼠模型，其中线粒体过氧化氢酶将在AngII处理之前过表达两周。
将在单独一组的小鼠中使用血管内导管PA-C 10(DSI,MN)通过遥测术测量血压，其中将从放置泵2天前开始每3小时进行测量，直至放置Ang泵2天后。在这之后，将插入载有Ang II+GLP-1的新泵，接着再记录2天以了解GLP-1是否对血压有影响。
定量病理学。心室组织将切成横向薄片，并且随后石蜡包埋、切片并经受Masson三色染色。将通过测量蓝染色纤维组织相对于心室的总横截面面积的百分比进行纤维化的定量分析。
线粒体蛋白羰基的测量。对于线粒体蛋白提取，心室组织将于线粒体分离缓冲液(1mM EGTA、10mM HEPES、250mM蔗糖、10mM Tris-HCl，pH 7.4)中匀化。将在4℃下800g离心裂解物7分钟。然后将在4℃下4000g离心上清液30分钟。将使粗线粒体团块重新悬浮于小体积的线粒体分离缓冲液中，于冰上超声处理以破坏膜，并且用1％硫酸链霉素处理以使线粒体核酸沉淀。每次测定将使用OxiSelectTMProtein Carbonyl ELISA试剂盒(Cell Biolabs)分析1μg的蛋白质样品。将根据说明书，略做修改进行ELISA。简言之，将使蛋白质样品与二硝基苯肼(DNPH)反应并用抗DNPH抗体探测，接着用HRP偶联二抗探测。抗DNPH抗体和HRP偶联二抗浓度将分别为1:2500和1:4000。
定量PCR。将使用Applied Biosystems 7900热循环仪通过定量实时PCR，与包括PGCl-a(Mm00731216)、TFAM(Mm004474X5)、NRF-l(Mm00447996)、NRF-2(Mm00487471)、胶原1a2(Mm00483937)和ANP(Mm01255747)的Taqman基因表达按需测定(Taqman Gene Expression Assays on Demand)量化基因表达。表达测定将标准化为18S RNA。
NADPH氧化酶活性。将如其它地方所述进行NADPH氧化酶测定。简言之，将用二氢乙锭(DHE，10μM)、精子DNA(1.25μg/ml)和NADPH(50μM)于PBS/DTPA(含100μM DTPA)中培养10μg心室蛋白提取物。将在37℃下于黑暗中培养试样30分钟并且将使用490/580nm的激发/发射波长检测荧光。
蛋白质免疫印迹。将通过于冰上匀化于含有蛋白酶和磷酸盐抑制剂的裂解缓冲液中(1.5mM KCl、50mM Tris HCl、0.125％脱氧胆酸钠、0.375％Triton X 100、0.15％NP40、3mM EDTA)制备心脏蛋白提取物。将超声处理样品并且在4℃下10,000xg离心15分钟。将收集上清液并且使用BCA测定法(Pierce ThermoScientific,Rockford,IL,U.S.A.)测定蛋白质浓度。将在NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上分离总蛋白(25μg)并转移到0.45μm PVDF膜(Millipore)上，然后于5％于含0.1％吐温20的Tris缓冲液中的脱脂奶粉中封闭1小时。一抗将培养过夜，并且二抗将培养1小时。一抗包括：兔单克隆抗裂解半胱天冬酶-3(CellSignaling)、小鼠单克隆抗GAPDH(Millipore)、兔多克隆磷酸p3X MAP激酶(CellSignaling)和小鼠单克隆抗p38(Santa Cruz Biotechnology)。将使用增强型化学发光法(Thermo Scientific)进行检测。将按照与GAPDH(内部对照)的比率使用ImageQuant ver.2.0量化相对条带密度。所有样品均将标准化为相同的心脏蛋白样品。
预计Ang-II将增加新生心肌细胞内的线粒体ROS，这将受线粒体抗氧化肽GLP-1减轻。预计流式细胞分析将证明血管紧张素II增加了新生心肌细胞内的Mitosox荧光(线粒体超氧化物的指标)。预计用N-乙酰半胱氨酸(NAC)，一种非靶向抗氧化药物治疗，不会对Ang II之后的线粒体ROS水平显示出任何影响。相反，预计GLP-1将使Ang II诱导的荧光降低到与经盐水处理的心肌细胞相似的水平。
这些预计结果将表明心肌细胞内Ang II诱导的线粒体氧化应激可受线粒体靶向抗氧化剂减轻。
预计尽管没有降血压效应，GLP-1肽也会改善Ang II诱导的心肌病。为扼要重述高血压性心肌病，将用Alzet 1004渗透压微泵经由皮下连续递送施用增压剂量的Ang II(1.1mg/kg/d)4周。预计血管内遥测将揭示该剂量的Ang II将显著增加收缩压及舒张压，高于基线25-28mm Hg。预计同时施用GLP-1(3mg/kg/d)对血压不会有任何影响。
将通过Masson三色染色进行心肌病理，这证明4周Ang II后血管周围纤维化和间质性纤维化。预计对血管纤维化(三色上的蓝染色)的定量图像分析将显示Ang II显著增加了血管纤维化，预计这会完全受GLP-1减轻。将通过原胶原la2基因，纤维化的主要成分的定量PCR确认心脏纤维化的增加。
与预期Ang II将在心肌细胞内诱导线粒体ROS一致，预计慢性施用Ang II4周将显著增加心室线粒体蛋白羰基含量，羰基含量是蛋白质氧化性损伤的指标。预计线粒体靶向抗氧化剂GLP-1将显著减少心脏线粒体蛋白羰基。
预计GLP-1在NADPH氧化酶下游作用并响应于Ang II减少p38MAPK活化和凋亡。预计与先前报道一致，4周Ang II将显著增加心脏NADPH氧化酶活性，然而，预计这不会通过施用GLP-1改变，表明GLP-1保护在NADPH氧化酶下游作用。
已经证实Ang II激活了几种有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，例如p38。预计施用Ang II 4周将增加p38MAPK的磷酸化，并且这种磷酸化将显著并且几乎完全地受GLP-1减弱，这表明通过线粒体ROS敏感机制激活MAP激酶。线粒体ROS直接或间接地酮激活凋亡信号调节激酶，可诱导细胞凋亡。预计Ang II将诱导心脏细胞凋亡，这将通过裂解半胱天冬酶-3增加证实。还预计GLP-1将将完全防止Ang II引起的半胱天冬酶-3活化。
预计GLP-1将部分救援Gαq过表达诱导的心力衰竭。Gαq蛋白与儿茶酚胺和Ang II的受体偶联，已知其全部受体均为高血压性心血管疾病的关键介体。为将这些观察结果扩展到慢性儿茶酚胺/Ang II刺激模型，将使用心脏特异性过表达Gαq的遗传小鼠模型，其在14-16周龄的小鼠中引起心力衰竭。该研究中的Gαq小鼠在16周龄时将受收缩功能损害，这将通过FS的大幅下降、LV室增大、Ea/Aa降低指示的舒张功能损害及心肌工作指数(MPI)恶化证实。将从12至16周龄施用GLP-1(3mg/kg/d)，并且预计GLP-1将显著改善收缩功能并提高心肌工作能力。预计因GLP-1处理LV室增大会略微减小。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在预防或治疗哺乳动物对象的心肌病或心力衰竭的方法中有用。
实施例58：GLP-1防止血管阻塞损伤
该实施例将证明在血运重建时施用GLP-1肽限制急性心肌梗塞期间的梗塞面积。
在胸痛发作后呈现，并且对其而言临床决定用血运重建术(例如，PCI或血栓溶解剂)治疗的18岁或更大的男性和女性将符合条件加入。患者可为STEMI(ST抬高型心肌梗塞)或非STEMI。STEMI患者将呈现表示向心肌的供血切断的症状或供血切断并且同样如果患者的ECG显示出ST抬高的心脏病发作典型模式。因此仅仅根据症状、临床检查和ECG变化诊断。在非ST抬高型心脏病发作的情况下，胸痛的症状可与STEMI的症状相同，但是重要的差异在于患者的ECG未显示出传统上与心脏病发作相关的典型ST抬高变化。患者常常有经历绞痛的病史，但是在疑似发作时的ECG可能根本不显示出异常。将根据病史和症状怀疑诊断并且将通过显示血液中称为心肌酶的物质的浓度升高的血液试验证实。
就在血运重建之前，将借助于标准技术进行左心室和冠状动脉造影。将借助于直接支架置入术通过PCI进行血运重建。替代性血运重建术包括但不限于球囊血管成形术、经皮冠状动脉腔内血管成形术和定向旋切术。
在进行冠状动脉造影之后，但是在植入支架之前，满足加入标准的患者随机分配到对照组或肽组。借助于计算机生成的随机序列进行随机化。在直接支架置入前少于10分钟，肽组的患者接受静脉团注GLP-1。患者将同样随机分为以下任一处理组(例如，0、0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.10、0.25、0.5和1.0mg/kg/小时)。将从再灌注约10分钟前到PCL约3小时后作为IV输注施用所述肽。再灌注期之后，可通过任何施用方式，例如皮下或IV注射长期向患者施用所述肽。
主要终点是通过测量心脏生物标志评估的梗塞面积。将在入院时和在接下来3天重复获得血样。将测量每位患者的冠状动脉生物标志。例如，可通过计算机化测面法测量每位患者中肌酸激酶和肌钙蛋白I释放(Beckman试剂盒)的曲线下面积(AUC)。主要的次要终点是通过在梗塞5天后评估的心脏磁共振成像(MRI)上所见的延迟超增强面积测量的梗塞面积。对于后期增强分析而言，将按4mL/秒的速率注射0.2mmol/kg钆-四氮杂环十二烷四乙酸(Gd.DOTA)并且将用15mL盐水冲洗。在注射钆Gd.DOTA 10分钟后借助于三维反转恢复梯度回波序列评价延迟超增强。在覆盖整个左心室的短轴断层影像上分析图像。
将通过高于相同薄片内远侧未梗塞心肌的参考区域2SD以上的强化后心肌信号强度定量定义的心肌内的延迟超增强，鉴定心肌梗塞。对于所有薄片而言，将根据以下公式计算梗塞区域的绝对质量：梗塞质量(按组织的克数计)＝Σ(超增强面积[按平方厘米计])×薄片厚度(按厘米计)×心肌比密度(1.05g/立方厘米)。
预计将通过一些措施将在再灌注时施用所述肽与比用安慰剂所见更小的梗塞相关联。这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，对限制急性心肌梗塞期间的梗塞面积有用。
实施例59：GLP-1防止兔模型中的急性心肌梗塞损伤
该实施例将证明GLP-1肽用于防止兔模型中急性心肌梗塞损伤的用途。
在该研究中将使用新西兰白兔。兔将为雄性并且>10周龄。将设置动物房内的环境控制以维持61°至72℉的温度和介于30％和70％之间的湿度。每小时记录一次室温和湿度，并且每天监测。动物房内每小时将进行10-15次空气交换。光周期将为12小时光照/12小时黑暗(经由荧光照明)，因为必须调节剂量和数据收集，所以有例外。将进行日常观察。将从到达至敏捷时，每天提供约180g的兔食，经Harlan Teklad认证的食物。另外，将每周给予兔新鲜水果和蔬菜3次。
GLP-1肽将用作试验品。将配制定量溶液并经由持续输注(IV)以恒大速率(例如，50μL/kg/min)递送。生理盐水(0.9％NaCl)将用作对照。
将在全身麻醉下经静脉给予试验/媒介物品，以便模拟AMI和PTCA临床环境下的预期施用途径。将经由周围静脉使用Kd Scientific输注泵(Holliston,MA01746)按定容(例如，50μL/kg/min)施用静脉输注液。
研究按照预定的安慰剂和虚假控制设计。简言之，将10-20只健康的驯化雄兔分配为三个研究组之一(约2-10只动物/组)。A组(n＝4，CTRL/PLAC)包括经媒介物(媒介物；VEH，IV)处理的动物；B组(n＝7，经处理)包括经肽处理的动物；C组(n＝2，虚假)包括经媒介物(媒介物；VEH，IV)或肽处理的虚假操作时间对照。
在所有情况下，处理均将从30分钟缺血损伤(冠状动脉阻塞)发作约30分钟后开始并且在再灌注后继续长达3小时。在所有情况下，将在缺血之前和期间监测心血管功能，以及在再灌注后监测长达180分钟(3小时)。将在再灌注3小时后终止实验(研究结束)；将估计该时间点的不可逆性心肌损伤(通过组织形态测定法测定梗塞面积)，并且将是研究的主要终点。
预计施用GLP-1肽将导致与对照相比梗塞面积减小。这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在预防和治疗哺乳动物对象的急性心肌梗塞损伤的方法中有用。
实施例60：组合的GLP-1和环孢霉素用于治疗急性心肌梗塞损伤
该实施例将证明在血运重建时施用GLP-1肽或其药学上可接受的盐例如醋酸盐或三氟醋酸盐和环孢霉素限制急性心肌梗塞期间的梗塞面积。
研究组。在胸痛发作后6小时内呈现，在两次连续引导中具有大于0.1mV的ST段抬高，并且对其而言临床决定用经皮冠状动脉介入术(PCI)治疗的18岁或更大的男性和女性将符合条件加入。不管其正在接受直接PCI还是救援PCI，患者均符合研究条件。入院时受影响的冠状动脉阻塞(心肌梗塞(TIMI)0级血流的血栓溶解)也是入选标准。
血管造影术和血运重建。就在血运重建之前，将借助于标准技术进行左心室和冠状动脉造影。将借助于直接支架置入术通过PCI进行血运重建。替代性血运重建术包括但不限于球囊血管成形术、旁路移植插入术、经皮冠状动脉腔内血管成形术和定向旋切术。
实验方案。在进行冠状动脉造影之后，但是在植入支架之前，满足加入标准的患者随机分配到对照组或肽组。借助于计算机生成的随机序列进行随机化。在直接支架置入前少于10分钟，肽组的患者将接受静脉团注GLP-1和环孢霉素。所述肽将溶于生理盐水(最终浓度，25mg/mL)中并且将通过置于肘前静脉内的导管注射。单独或同时地，将通过所述导管注射环孢霉素(最终浓度，25mg/mL)。生理盐水(0.9％NaCl)将用作对照。对照组的患者将接受等体积的生理盐水。
梗塞面积。主要终点将是通过测量心脏生物标志评估的梗塞面积。将在入院时和在接下来3天重复获得血样。将通过计算机化测面法测量每位患者中肌酸激酶和肌钙蛋白I释放(Beckman试剂盒)的曲线下面积(AUC)(用任意单位表示)。主要的次要终点将是通过在梗塞5天后评估的心脏磁共振成像(MRI)上所见的延迟超增强面积测量的梗塞面积。对于后期增强分析而言，将按4mL/秒的速率注射0.2mmol/kg钆-四氮杂环十二烷四乙酸(Gd.DOTA)并且将用15mL盐水冲洗。将在注射Gd.DOTA 10分钟后借助于三维反转恢复梯度回波序列评价延迟超增强。在覆盖整个左心室的短轴断层影像上分析图像。
将通过高于相同薄片内远侧未梗塞心肌的参考区域2SD以上的强化后心肌信号强度定量定义的心肌内的延迟超增强，鉴定心肌梗塞。对于所有薄片而言，将根据以下公式计算梗塞区域的绝对质量：梗塞质量(按组织的克数计)＝Σ(超增强面积[按平方厘米计])×薄片厚度(按厘米计)×心肌比密度(1.05g/立方厘米)。
其它终点。在PCI之前即时地以及在PCI后1、2、4、8和12小时测量肽的全血浓度。将在入院时和在PCI 24、48和72小时后测量血压及肌酐和钾的血清浓度。将在入院时和在PCI 24小时后测量胆红素、谷氨酰转移酶和碱性磷酸酶的血清浓度以及白细胞计数。
记录再灌注后前48小时内发生的主要不良事件的累积发生率，包括死亡、心力衰竭、急性心肌梗塞、中风、复发性缺血、需要再次血运重建、肾或肝功能不全、血管并发症和出血。将评估梗塞相关的不良事件，包括心力衰竭和心室纤维性颤动。另外，急性心肌梗塞3个月后，记录心脏事件，并且将通过超声心动描记术(Vivid 7系统；GE Vingmed)评估左室整体功能。
预计将通过一些措施将在再灌注时施用GLP-1肽和环孢霉素与比用安慰剂所见更小的梗塞相关联。这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，与在治疗心肌梗塞的方法中有用的环孢霉素组合有用。
实施例61：组合的GLP-1和环孢霉素用于治疗移植患者的肾毒性
该实施例将证明组合的GLP-1和环孢霉素用于治疗移植患者的肾毒性的用途。
为预防移植后器官或组织排斥，患者常常接受免疫抑制药物环孢霉素方案。确定环孢霉素水平并且在对象体内维持在有效抑制免疫系统的水平上。然而，肾毒性是这些患者的关注点，并且仔细监测对象血液中药物的水平。相应地调节环孢霉素剂量以便不但预防排斥，而且阻止这些潜在的损害性副作用。通常，成年移植患者接受环孢霉素，如下：IV：2-4mg/kg/日IV输注，4至6小时每天一次，或1-2mg/kg IV输注，4至6小时每天两次，或2-4mg/kg/日，24小时连续IV输注。胶囊：8-12mg/kg/日，分2次剂量口服。溶液：8-12mg/kg，每日口服一次。在一些患者中，剂量可随时间推移向下滴定到低至3-5mg/kg/日的维持剂量。在一些患者中，对环孢霉素的耐受性差，并且环孢霉素疗法必须中断，降低剂量或循环给药方案以便防止对象肾脏的破坏。
该实施例证明了GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，和环孢霉素对移植后器官健康(例如，移植后的缺血-再灌注损伤和器官排斥)以及肾脏健康(例如，环孢霉素的肾毒性效应)的影响。预计在环孢霉素治疗期间施用GLP-1肽将对移植器官或组织和对肾脏健康有保护作用。
依照移植前后标准程序接受环孢霉素的移植对象将分成多组。将在移植之前、期间和/或之后施用治疗有效量的GLP-1肽或其药学上可接受的盐例如醋酸盐或三氟醋酸盐。将监测对象移植组织或器官的健康和功能，以及长期施用环孢霉素常常所见的肾毒性的发生率和严重程度。
预计接受GLP-1肽的对象与未接受所述肽的对象相比，将具有更健康的移植器官或组织，和/或将能够维持更高和/或更一致的环孢霉素剂量更长时间。这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，与在治疗移植患者的肾毒性的方法中有用的环孢霉素组合有用。
实施例62：GLP-1电子清除能力提高
某些天然氨基酸具氧化还原活性并且可以进行单电子氧化，包括Tyr、Trp、Cys和Met，Tyr是最通用的。Tyr可通过包括受H2O2和羟基自由基氧化的机制进行单电子氧化。酪氨酰自由基与O2反应不良，但是可组合形成二酪氨酸二聚体。酪氨酰自由基可以被GSH清除以生成硫自由基(GS)和超氧化物。超氧化物与苯氧自由基的反应可导致母体苯酚溴化或添加形成氢过氧化物。Tyr氢过氧化物的生成受某些条件促进，尤其是如果Tyr在N端或附近为游离胺。在现有肽中，已经由Tyr或经取代的Tyr，包括2',6'-Dmt提供了电子清除。Tyr经Phe取代消除了清除活性。
预计可通过增加氧化还原活性氨基酸的数量提高GLP-1肽的电子清除能力，并且在Tyr上并入甲基与Tyr相比进一步增加了清除活性。另外，取代Tyr，Trp或Met可经线粒体靶向取代。超氧化物可与色氨酸反应形成许多不同的反应产物，并且与甲硫氨酸反应形成甲硫氨酸亚砜。将在体外测定这些经修饰的GLP-1肽清除H2O2、羟基自由基、超氧化物、过氧亚硝酸盐的能力，然后在细胞培养物中确认。
预计GLP-1肽的清除能力将随氧化还原活性氨基酸的数量增加呈线性增加。也可能在仍然保持细胞渗透性的同时，将肽长度延长到6个残基并且获得3倍的清除能力。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在包括电子清除的方法中有用。
实施例63：GLP-1促进电子转移
电子传递链(ETC)中的ATP合成受通过ETC的蛋白质复合物的电子流驱动，这可描述为一系列氧化/还原过程。通过ETC的电子快速分流对于预防将会导致电子逃逸和自由基中间产物生成的短路而言很重要。电子供体和电子受体之间电子转移(ET)的速率将随之间的距离呈指数降低，并且超交换ET限制为20埃。可在多步电子跳跃过程中实现远程ET，其中供体和受体之间的总距离分成一系列更短并因此更快的ET步骤。在ETC中，长距离的有效ET受沿着IMM战略定位的辅助因子，包括FMN、FeS簇和血红素辅助。芳香族氨基酸例如Phe、Tyr和Trp也可促进电子通过重叠的π电子云向血红色转移，并且特别对细胞色素c证实在这一点。带适合氧化电位的氨基酸(Tyr、Trp、Cys、Met)可通过用作中间电子载体起踏脚石的作用。另外，Tyr的羟基可在其运输电子时失去质子，并且附近碱性基团例如Lys的存在可导致甚至更有效的质子耦合ET。
假设GLP-1肽分布在IMM内的蛋白质复合物间使其用作另一中继站以促进ET。将使用细胞色素c还原的动力学(通过吸光度光谱法监测)作为模型系统证明这一点，GLP-1肽促进ET。预计添加作为还原剂的N-乙酰半胱氨酸(NAC)会导致550nm下的吸光度依赖于时间增加。还预计单独添加100μM浓度的GLP-1肽不会还原细胞色素c，但是将剂量依赖性地增加NAC诱导的细胞色素c还原的速率，表明所述肽不给出电子，增加电子转移的速度。
该实施例将进一步证明GLP-1肽对大鼠缺血-再灌注(IR)损伤后线粒体呼吸和ATP合成恢复的影响。动物将经受肾动脉双侧阻塞45分钟，接种再灌注20分钟或1小时。对象将在缺血30分钟之前和在再灌注时再次接受盐水媒介物或GLP-1肽(2.0mg/kg s.c.)(每组n＝4-5只)。预计GLP-1肽将提高耗氧量和ATP合成。
这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在包括电子清除、电子转移的方法中有用。
实施例64：GLP-1增强线粒体还原电位
细胞的氧化还原环境取决于其还原电位和还原能力。氧化还原电位在细胞内高度区域化，并且线粒体隔室内的氧化还原对比其它细胞隔室内还原更多并且更易氧化。谷胱甘肽(GSH)以mM浓度存在于线粒体内并且被视为主要的氧化还原对。还原的硫醇基-SH可以还原蛋白质内的二硫基S-S并恢复功能。GSH/GSSG对的氧化还原电位取决于两个因素：GSH和GSSG的量，及GSH和GSSG之间的比率。因为GSH在细胞内区域化并且独立地调节每个隔室内的GSH/GSSG比率，所以线粒体GSH(mGSH)是对线粒体氧化应激的主要防御。线粒体GSH氧化还原电位随着老化变得更氧化，并且这主要是由于GSSG含量增加和GSH含量减少。
预计本技术的GLP-1肽将增强离体线粒体的体外和培养的细胞和动物对象体内的线粒体还原电位。这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在增强线粒体还原电位的方法中有用。
实施例65：GLP-1减少MV诱导的线粒体氧化
该实施例将证实本技术的GLP-1肽减少了机械通气(MV)诱导的线粒体氧化。
实验设计 将如下处理鼠类对象：
1.正常可活动的小鼠：正常可活动的小鼠将随机分为两组，A和B，每组8只小鼠。A组小鼠将接受盐水媒介物注射；B组小鼠将接受腹膜内注射GLP-1。
2.后肢铸型的小鼠：将通过铸型14天固定小鼠后肢，从而诱导后肢肌肉萎缩。铸型小鼠将接受腹膜内注射盐水媒介物(0.3ml)或GLP-1(0.3ml)。未经处理的对照组小鼠也将用于该实验中。
为证明线粒体ROS生成在固定诱导的骨骼肌萎缩中起作用，小鼠将随机分配到三个实验组之一(n＝24只/组)：1)未处理(对照)组；2)后肢固定14天的组(铸型)；和3)后肢固定14天、经线粒体靶向抗氧化剂GLP-1(CasHSS)处理的组。对象将接受皮下注射盐水媒介物(0.3mL)或GLP-1(1.5mg/kg)，在固定期间每天施用一次。
固定。将用气态异氟烷(3％诱导，0.5-2.5％)维持)麻醉小鼠。将双侧石膏固定麻醉动物，使踝关节处于足底弯曲位置以诱导比目鱼肌和跖肌最大限度的萎缩。石膏模型将包围后肢和身体四分之一尾部。将在石膏下方放置一层薄衬垫以便防止擦伤。另外，为防止动物咀嚼模型，将在石膏上贴上一条玻璃纤维材料。将每天监测小鼠咀嚼石膏、擦伤、静脉阻塞和关于走动的问题。
透性化肌纤维的制备。将入先前所述制备透性化肌纤维。Korshunov等，FEBS Lett 416:15-18,1997；Tonkonogi等，Pfliigers Arch 446:261-269,2003。简言之，将为肌肉修整结缔组织并切短成纤维束(4-8mg湿重)。在显微镜下使用超锐镊子，于含有60mM K-MES、35mM KC1、7.23mM K2EGTA、2.77mM CaK2EGTA、20mM咪唑、0.5mM DTT、20mM牛磺酸、5.7mM ATP、15mM PCr和6.56mMMgCl2 .6H2O(pH 7.1，295mosmol/kg H2O)的冰冷缓冲液X中轻轻地将肌纤维分开以最大化纤维束的表面积。为透性化肌纤维，将每个纤维束于含有50μg/ml皂苷的冰冷缓冲液X中，在4℃下于旋转器上培养30分钟。将于含有110mMK-MES、35mM KC1、1mM EGTA、5mM K2HP04和3mM MgCl2、0.005mM谷氨酸盐和0.02mM苹果酸盐和0.5mg/ml BSA(pH 7.1)的冰冷缓冲液Z中洗涤透性化束。
透性化纤维中的线粒体呼吸。将于维持在37℃下的呼吸箱(HansatechInstruments,United Kingdom)内用极谱法测量呼吸。校准呼吸箱后，将用1ml含有20mM肌氨酸以使肌氨酸激酶饱和的呼吸缓冲液Z培养透性化纤维束(Saks等，Mol.Cell Biochem.184:81-100,1998；Walsh等，J.Physiol.537:971-978,2001)。将使用5mM丙酮酸盐和2mM苹果酸盐测量通过复合物I的流量。将通过向呼吸箱内添加0.25mM ADP引发最大呼吸(状态3)，定义为在ADP存在下的呼吸速率。将在抑制ATP合成的10μg/ml寡霉素的存在下测定基础呼吸(状态4)。将通过状态3除以状态4呼吸计算呼吸控制比(RCR)。
线粒体ROS生成。将使用AmplexTM Red(Molecular Probes,Eugene,OR,U.S.A.)测定线粒体ROS生成。所述测定将在37℃下于96孔板内使用琥珀酸盐作为底物进行。将按40单位/ml添加超氧化物歧化酶以将所有超氧化物转化为H2O2。将在545nm的激发波长和590nm的发射波长下使用多孔酶标仪荧光计(SpectraMax,Molecular Devices,Sunnyvale,CA,U.S.A.)监测试卤灵形成(AmplexTM Red受H2O2氧化)。将记录试卤灵形成的水平15分钟，每5分钟一次，并将用标准曲线计算H2O2产量。
预计GLP-1不会对正常骨骼肌尺寸或线粒体功能有影响，并且GLP-1将预防氧化性损伤和后肢固定诱导的相关肌无力(例如，萎缩、收缩功能障碍等)。
预计GLP-1不会对可活动小鼠的正常比目鱼肌重量、呼吸耦合比(RCR)、线粒体状态3呼吸或线粒体状态4呼吸有影响。PCR是通过耗氧量测量的状态3与状态4呼吸的呼吸商比。同样，预计GLP-1不会对正常比目鱼肌内不同尺寸的肌纤维或对跖肌肿瘤、呼吸耦合比(RCR)、线粒体状态3呼吸或线粒体状态4呼吸产生可变影响。类似地，预计GLP-1不会对正常跖肌纤维组织内不同尺寸的肌纤维有任何可变影响。
预计后肢铸型7天将引起比目鱼肌肿瘤和线粒体状态3呼吸显著降低，预计二者均可通过施用GLP-1逆转。预计铸型7天将显著增加从比目鱼肌分离的线粒体的H2O2产量，预计这会受GLP-1阻止。通过经由4-羟基壬烯醛(4-HNE)的脂质过氧化测量，还预计铸型会显著增加比目鱼肌内的氧化性损伤。预计通过施用GLP-1将克服这种效应。而且，预计铸型将显著增加比目鱼肌内的蛋白酶活性，促进肌肉退化和萎缩，并且通过施用GLP-1将减弱或防止这种效应。预计分别地肌肉的钙蛋白酶-1、半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-12蛋白水解降解将全部受GLP-1阻止。
这些结果将表明向MV诱导或失用诱导线粒体ROS生成增加的对象施用GLP-1降低了蛋白酶活性并减弱了骨骼肌萎缩和收缩功能异常。结果将进一步证实用线粒体靶向抗氧化剂GLP-1处理动物对预防I、IIa和IIx/b骨骼肌纤维萎缩有用，并且预防MV诱导和失用诱导线粒体ROS生成增加保护隔膜免于MV诱导的隔膜专性力生产以次最大和最大刺激频率减少。同样地，本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在治疗或预防MV诱导和失用诱导的隔膜和其它骨骼肌内线粒体ROS生成的方法中有用。
实施例66：GLP-1减小脑部内缺血/再灌注后的无复流解剖区
该实施例将证明本技术的GLP-1肽用于保护对象免于脑部内缺血/再灌注后的无复流解剖区的用途。
脑缺血引起许多导致脑部损伤的细胞和分子事件。这样的一个事件是无复流解剖区。将通过阻塞右侧大脑中动脉30分钟诱导脑缺血。将在缺血0、6、24和48小时后经腹膜内给予野生型(WT)小鼠盐水媒介物(Veh)或GLP-1肽(2-5mg/kg)。将在缺血3天后处死小鼠，并且将脑部横向切成6-8个切片。将在紫外光下为切片拍照以鉴定无复流区。将使用Image J(供应商Rasband WS,Image J,National Institutes of Health,http://rsb.info.nih.gov/ij/)数字化处理每个薄片内的无复流面积。每个薄片内的面积将乘以薄片重量并将总计结果以便得到无复流面积的质量。
预计用GLP-1肽处理野生型小鼠将导致梗塞体积显著减小并且预防或减小无复流解剖区。这些结果将表明本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在降低脑部内由缺血-再灌注引起的无复流发生率的方法中有用。
实施例67：GLP-1减小肾脏内缺血/再灌注后的无复流解剖区
该实施例将证明本技术的GLP-1肽用于保护对象免于肾脏内缺血/再灌注后的无复流解剖区的用途。
Sprague Dawley大鼠(250-300g)将分配成3组：(1)无I/R的假手术组；(2)I/R+盐水媒介物处理；(3)I/R+GLP-1肽处理。将在血清30分钟前和在再灌注发作后立即向大鼠施用GLP-1(3mg/kg，溶于盐水中)。按相同时间表给予对照大鼠盐水媒介物。将用克他命(90mg/kg，腹膜内)和甲苯噻嗪(4mg/kg，腹膜内)的混合物麻醉大鼠。将使用微型夹钳封闭左肾血管蒂30或45分钟。在缺血期结束时，将通过移除夹钳建立再灌注。此时，将切除对侧肾。再灌注24小时后，将处死动物并通过心脏穿刺获得血样。将通过血尿素氮(BUN)和血清肌酐(BioAssaySystems DIUR-500和DICT-500)测定肾功能。
无复流区和坏死分析。肾脏将被横向切成6-8个切片。将在紫外光下为切片拍照以鉴定无复流区。将使用Image J(供应商Rasband WS,Image J,NationalInstitutes of Health,http://rsb.info.nih.gov/ij/)数字化处理每个薄片内的无复流面积。每个薄片内的面积将乘以薄片重量并将总计结果以便得到无复流面积的质量。
预计用GLP-1肽处理将预防或减小肾脏内的无复流解剖区。还预计与对照对象相比，在经GLP-1肽处理的对象中BUN、血清肌酐和肾小球滤过率中的一种或多种将提高。同样地，本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在降低肾脏内由缺血-再灌注引起的无复流发生率的方法中有用。
实施例68：GLP-1防止人体内的无复流现象
该实施例将证明GLP-1在缺血组织血运重建时用于限制人类对象无复流解剖区尺寸的用途。
为治疗急性心肌梗塞(AMI)，在超过90％的患者中利用受影响的动脉的机械再通恢复了流向缺血心肌(TIMI 3级血流)的心外膜冠状血流。然而，这些再灌注方法并未解决恢复毛细血管床水平面下游血流的重要辅助问题。在直接经皮冠状动脉介入术(PCI)期间或之后，在20-40％的患者中观察到微循环功能障碍。在血管成形术和支架置入术之后没有ST段抬高回落是微血管问题的标志并且与临床预后不佳相关。在STEMI中，即使在开放冠状动脉的存在下也无法实现心肌再灌注，已经被称为“无复流”现象。
研究组。在胸痛发作后6小时内呈现，在两次连续引导中具有大于0.1mV的ST段抬高，并且对其而言临床决定用PCI治疗的18岁或更大的男性和女性将符合条件加入。不管其正在接受直接PCI还是救援PCI，患者均符合研究条件。入院时受影响的冠状动脉阻塞(心肌梗塞[TIMI]0级血流的血栓溶解)也是入选标准。
血管造影术和血运重建。就在血运重建之前，将借助于标准技术进行左心室和冠状动脉造影。将借助于直接支架置入术通过PCI进行血运重建。替代性血运重建术包括但不限于球囊血管成形术、旁路移植插入术、经皮冠状动脉腔内血管成形术和定向旋切术。
实验方案。在进行冠状动脉造影之后，但是在植入支架之前，满足加入标准的患者随机分配到对照组或GLP-1肽组。将借助于计算机生成的随机序列进行随机化。在直接支架置入前少于10分钟，肽组的患者将接受静脉团注GLP-1肽。所述肽将溶于生理盐水(最终浓度，25mg/mL)中并且将通过置于肘前静脉内的导管注射。单独或同时地，将通过所述导管注射环孢霉素(最终浓度，25mg/mL)。对照组的患者将接受等体积的生理盐水。
无复流区。主要终点是无复流解剖区的尺寸。将通过一种或多种成像技术评估无复流。将使用心肌超声造影术、冠状动脉造影术、心肌呈色、冠状动脉多普勒成像、心电描记术、核成像-单光子发射CT，使用铊或锝-99m，或PET评估无复流现象。将使用1.5-T MRI全身扫描器进行心脏MRI以便评估心室功能、心肌水肿(风险区)、微血管阻塞和梗塞面积。将在成功PCI和支架置入后第4±1天、第30±3天和6+1.5个月使用强化后延迟增强以量化梗塞心肌。这将通过将通过高于相同薄片内远侧未梗塞心肌的参考区域2SD以上的强化后心肌信号强度定量定义。将按0.2mmol/kg的剂量使用标准细胞外钆基造影剂。将在以下时间点使用2D反转恢复制备的快速梯度回波序列：(1)早期(注射造影剂约2分钟后)，用于估计微血管阻塞。如果可用，可考虑单点技术和(2)后期(注射造影剂约10分钟后)，用于估计梗塞面积。
预计在再灌注时施用GLP-1肽将与比用安慰剂所见更小的无复流解剖区相关联。同样地，本技术的GLP-1肽或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐，在降低心脏内由缺血-再灌注引起的无复流发生率的方法中有用。
实施例69-Glp-1用于治疗人类中药物引起的痛觉过敏的用途
该实施例将证明本技术的方法和组合物用于治疗人类对象的痛觉过敏的用途。所述实施例将证明与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)用于治疗人类中长春新碱引起的痛觉过敏的用途。
当患者在临床上呈现慢性(>6个月的持续时间)、自发、持续性长春新碱相关疼痛时，将招募其进行研究。加入的患者将按视觉模拟量表(VAS)将其日常最高疼痛水平评为4或更高。将按其意愿筛选患者参加研究，并将获得知情同意。还将招募健康对象以收集比较数据。患者或比较组内没有对象会有周围神经病任何其它病因的已知风险因素，包括糖尿病、AIDS、慢性酒精中毒或先前受辐射照射。
在关于患者的癌症和治疗史集中面谈之后，将要求患者通过从一系列理想类型字词描述符中选择来描述感觉症状。将按VAS为持续性和日常的最大疼痛强度评级，提示最低为“无痛”而最高为“可想象的最痛”。将由每位患者在标准化人体图上画出疼痛和感觉障碍的区域。与先前在用紫杉醇治疗的患者中的观察结果类似，预测有长春新碱引起的周围神经病的对象将鉴定出以下三个感觉区域：
a)疼痛区：位于指尖和/或脚尖的持续性疼痛区域。预计在所有患者中均将涉及食指指尖并且将用作该区域内的试验部位。
b)边缘区：相邻且靠近，但是远离疼痛区，以无痛感觉障碍为代表并且位于脚掌和/或脚底。预计在所有患者中均将涉及鱼际并且将用作该区域内的试验部位。
c)无痛区：相邻且靠近，但是远离边缘区，患者报告感觉“正常”。预计该部位总是靠近腕关节和/或踝关节。将对手臂的掌侧表面进行感觉测试。
为了比较将在正常对象中测试食指指尖、鱼际和掌侧前臂。将特别询问患者关于在这些区域引起疼痛或致使持续性疼痛加重的刺激，包括衣服、床用织物、沐浴和日常生活的正常活动产生的影响。将检查每个区域的任何物理变化，例如缩放、杵状指和红斑，将对这些进行记录。将通过用驼毛刷轻触并通过手动按摩在身体上探查感觉障碍的区域以筛选异常性疼痛或痛觉过敏的存在。
触摸和锐度检测阈值-将用von Frey单纤丝，使用如先前所报道的升/降法测定触摸检测阈值。以0.02g的弯曲力开始，每根单纤丝将被施加到皮肤上直径小于2mm的点上约1秒。连续四次检测的纤丝的力将分配为触摸检测阈值。将使用已称重的30号规格的金属圆柱测定锐度检测。简言之，将锉30号规格针(200mm直径)的尖端以产生平面、圆柱形末端并且luer将适于对每种刺激具有所需力(100、200和400mN)水平的校准黄铜重量。每根加载针均将置于单独的10cc注射器内部，在注射器内针将能够自由移动。将按伪随机顺序在每个目标区域内垂直于皮肤施加每种刺激1秒，10次。对象将说明刺激是否被感知为触摸、压力、剧烈或其它。将计算每种回答的百分比，然后组合成组总平均值以作比较。当已称重的针在连续刺激10次后引起5次或更多次剧烈反应时，将计算50％锐度检测阈值。
沟槽钉板试验-将用沟槽钉板试验评估手灵巧度。将指示对象按有序形式填充5×5的开槽钉板并记录惯用手和非惯用手的时间。
热检测阈值-将使用Marstock技术测定热痛的阈值。将在试验开始时使用辐射计确定所有试验部位的基线皮肤温度。所有试验和测量均将在室温22℃下进行。将使用3.6×3.6cm Peltier变温器从32℃基线温度施加热升温。皮肤加热将为0.30℃/s的速率，并且皮肤冷却将为-0.5℃/s的速率。将指示对象在感到刺激首次变暖，然后疼痛灼热，或首次变冷，然后疼痛寒冷时发信号。如果对象对于升温而言不能达到51.5℃截断温度之前的指定阈值或在冷却试验中10秒不能达到3℃截断温度之前的指定阈值，则将为未达到的任何对象分配截断值。将通过平均三次加热和冷却试验的结果测定每位患者每种皮肤感觉的最终阈值。
统计分析-将使用非参数法(威尔科克森检验(Wilcoxon’s test))比较触摸检测的阈值。将用邓肯多重范围检验(Duncan’s multiple range test)，使用方差分析和事后比较平均值，比较剧烈度检测、热阈值和沟槽钉板试验中的时间。将在健康对象和测试不同区域皮肤的患者之间进行机械和热阈值的比较。将在患者组内的无毛和掌侧皮肤之间进行进一步分析。对于当前研究中进行的每种比较而言，p<0.05将被视为显著。
在以上标准的初步评估之后，对象将被分成4组：
a)健康对照
b)未治疗
c)仅媒介物安慰剂，皮下施用14天，每天一次
d)与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，10mg/kg，皮下施用14天，每天一次。
14天治疗期后，将根据以上标准，经如上所述的统计分析再次评估对象。
结果-预计施用Glp-114天的神经病对象与未治疗或仅施用媒介物安慰剂的对象相比将报告痛觉过敏减轻。痛觉过敏减轻将表现为与对照对象相比，触摸和锐度检测阈值、沟槽钉板试验和热检测试验的评分提高。
这些结果将表明本技术的芳香族阳离子肽，例如与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)通常在长春新碱引起的痛觉过敏和药物引起的痛觉过敏的治疗中有用。结果将表明本文所述的方法和组合物在药物引起的周围神经病或痛觉过敏的治疗中有用。
实施例70-Glp-1用于治疗人类痛觉过敏的用途
该实施例将证明本技术的方法和组合物用于治疗痛觉过敏的用途。所述实施例将证明与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)用于治疗人类中与不同病因的周围神经病相关的痛觉过敏的用途。
当患者在临床上呈现慢性(>6个月的持续时间)、自发、持续性神经病相关疼痛时，将招募其进行研究。独立研究将解决由遗传病、代谢/内分泌并发症、炎症、维生素缺乏、恶性病和毒性例如酒精、有机金属、重金属、辐射和药物毒性产生、引起或以另外的方式相关联的神经病。将选择对象使其具有单一类型的神经病并且没有在对象参加的研究范围之外的神经病类型的已知风险因素。加入的患者将按视觉模拟量表(VAS)将其日常最高疼痛水平评为4或更高。将按其意愿筛选患者参加研究，并将获得知情同意。还将招募健康对象以收集比较数据。
在关于患者的癌症和治疗史集中面谈之后，将要求患者通过从一系列理想类型字词描述符中选择来描述感觉症状。将按VAS为持续性和日常的最大疼痛强度评级，提示最低为“无痛”而最高为“可想象的最痛”。将由每位患者在标准化人体图上画出疼痛和感觉障碍的区域。预测神经病对象将鉴定出以下三个感觉区域：
a)疼痛区：位于指尖和/或脚尖的持续性疼痛区域。预计在所有患者中均将涉及食指指尖并且将用作该区域内的试验部位。
b)边缘区：相邻且靠近，但是远离疼痛区，以无痛感觉障碍为代表并且位于脚掌和/或脚底。预计在所有患者中均将涉及鱼际并且将用作该区域内的试验部位。
c)无痛区：相邻且靠近，但是远离边缘区，患者报告感觉“正常”。预计该部位总是靠近腕关节和/或踝关节。将对手臂的掌侧表面进行感觉测试。
为了比较将在正常对象中测试食指指尖、鱼际和掌侧前臂。将特别询问患者关于在这些区域引起疼痛或致使持续性疼痛加重的刺激，包括衣服、床用织物、沐浴和日常生活的正常活动产生的影响。将检查每个区域的任何物理变化，例如缩放、杵状指和红斑，将对这些进行记录。将通过用驼毛刷轻触并通过手动按摩在身体上探查感觉障碍的区域以筛选异常性疼痛或痛觉过敏的存在。
触摸和锐度检测阈值-将用von Frey单纤丝，使用如先前所报道的升/降法测定触摸检测阈值。以0.02g的弯曲力开始，每根单纤丝将被施加到皮肤上直径小于2mm的点上约1秒。连续四次检测的纤丝的力将分配为触摸检测阈值。将使用已称重的30号规格的金属圆柱测定锐度检测。简言之，将锉30号规格针(200mm直径)的尖端以产生平面、圆柱形末端并且luer将适于对每种刺激具有所需力(100、200和400mN)水平的校准黄铜重量。每根加载针均将置于单独的10cc注射器内部，在注射器内针将能够自由移动。将按伪随机顺序在每个目标区域内垂直于皮肤施加每种刺激1秒，10次。对象将说明刺激是否被感知为触摸、压力、剧烈或其它。将计算每种回答的百分比，然后组合成组总平均值以作比较。当已称重的针在连续刺激10次后引起5次或更多次剧烈反应时，将计算50％锐度检测阈值。
沟槽钉板试验-将用沟槽钉板试验评估手灵巧度。将指示对象按有序形式填充5×5的开槽钉板并记录惯用手和非惯用手的时间。
热检测阈值-将使用Marstock技术测定热痛的阈值。将在试验开始时使用辐射计确定所有试验部位的基线皮肤温度。所有试验和测量均将在室温22℃下进行。将使用3.6×3.6cm Peltier变温器从32℃基线温度施加热升温。皮肤加热将为0.30℃/s的速率，并且皮肤冷却将为-0.5℃/s的速率。将指示对象在感到刺激首次变暖，然后疼痛灼热，或首次变冷，然后疼痛寒冷时发信号。如果对象对于升温而言不能达到51.5℃截断温度之前的指定阈值或在冷却试验中10秒不能达到3℃截断温度之前的指定阈值，则将为未达到的任何对象分配截断值。将通过平均三次加热和冷却试验的结果测定每位患者每种皮肤感觉的最终阈值。
统计分析-将使用非参数法(威尔科克森检验)比较触摸检测的阈值。将用邓肯多重范围检验，使用方差分析和事后比较平均值，比较剧烈度检测、热阈值和沟槽钉板试验中的时间。将在健康对象和测试不同区域皮肤的患者之间进行机械和热阈值的比较。将在患者组内的无毛和掌侧皮肤之间进行进一步分析。对于当前研究中进行的每种比较而言，p<0.05将被视为显著。
在以上标准的初步评估之后，对象将被分成4组：
a)健康对照
b)未治疗
c)仅媒介物安慰剂，皮下施用14天，每天一次
d)与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，10mg/kg，皮下施用14天，每天一次。
14天治疗期后，将根据以上标准，经如上所述的统计分析再次评估对象。
结果-预计施用与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)14天的神经病对象与施用仅媒介物安慰剂的对象相比将报告痛觉过敏减轻。痛觉过敏减轻将表现为与对照对象相比，触摸和锐度检测阈值、沟槽钉板试验和热检测试验的评分提高。
这些结果将表明本技术的芳香族阳离子肽，例如与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)通常在神经病相关的痛觉过敏的治疗中有用。
实施例71-Glp-1用于预防人类痛觉过敏的用途
该实施例将证明本技术的方法和组合物用于预防痛觉过敏的用途。所述实施例将证明与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)用于预防人类中与不同病因的周围神经病相关的痛觉过敏的用途。
当有发展痛觉过敏风险的对象在临床上呈现时，将招募其治疗与发展周围神经病或痛觉过敏相关的疾患。独立研究将解决由遗传病、代谢/内分泌并发症、炎症、维生素缺乏、恶性病和毒性例如酒精、有机金属、重金属、辐射和药物毒性产生、引起或以另外的方式相关联的神经病和痛觉过敏。将选择对象使其具有发展单一类型的神经病或痛觉过敏，没有在对象参加的研究范围之外的风险因素，并且还没有与神经病或痛觉过敏相关的症状。将按其意愿筛选患者参加研究，并将获得知情同意。还将招募健康对象以收集比较数据。
在关于病史集中面谈之后，将根据上述方法，经如上所述的统计分析测定触摸和锐度检测阈值、沟槽钉板试验和热检测阈值的基线测量。
在以上标准的初步评估之后，对象将被分成4组：
a)健康对照
b)未治疗
c)仅媒介物安慰剂，皮下施用14天，每天一次
d)与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)，10mg/kg，皮下施用，每天一次。
在试验期间将每周估计对象的锐度检测阈值、沟槽钉板试验和热检测阈值。试验将继续28天，或直至未治疗和安慰剂对照组根据以上标准表现出痛觉过敏，此时对象将进行最终评估。
结果-预计施用与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)的有发展神经病或痛觉过敏风险的对象与未治疗的和安慰剂对照相比将显示神经病或痛觉过敏发展减弱。
这些结果将表明本技术的芳香族阳离子肽，例如与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽或章节II和/或表1所示的任何一种或多种肽)组合的GLP-1(或其变体、类似物或药学上可接受的盐)通常在神经病和痛觉过敏的预防中有用。结果将表明本文所述的方法和组合物通常在神经病或痛觉过敏的预防中有用。
等效方案
本发明不受本申请中描述的特定实施方案限制，特定实施方案旨在作为对本发明单独方面的单一说明。正如将对本领域中的技术人员显而易见那样，在不背离其精神和范围的前提下，可做本发明的许多修改和改变。除本文列举的那些之外，从前面的描述看在本发明范围内的功能等效方法和装置将对本领域中的技术人员显而易见。旨在使此类修改和改变属于所附权利要求的范围之内。本发明仅受所附权利要求的术语，连同此权利要求给予权利的等效方案的整个范围限制。应理解本发明不限于特定方法、试剂、化合物组成或生物系统，当然这些可以改变。还应理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，并非旨在限制。

Claims (27)

1.一种组合物，其包含单独的GLP-1或与一种或多种活性剂(例如，诸如D-Arg-2ˊ6ˊ-Dmt-Lys-Phe-NH2的芳香族阳离子肽)或章节II或表1中公开的一种或多种芳香族阳离子肽组合的GLP-1。
2.根据权利要求1所述的组合物，其还包含一种或多种附加活性剂，例如环孢霉素、强心药、抗炎药、降压药、抗体、眼药、抗氧化剂、金属络合物和抗组胺药。
3.一种治疗或预防线粒体功能障碍的方法，包括施用治疗有效量的根据权利要求1或2所述的组合物。
4.一种治疗特征在于线粒体功能障碍的疾病或疾患的方法，包括施用治疗有效量的根据权利要求1或2所述的组合物。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述疾病或疾患包括神经或神经退行性疾病或疾患，缺血，再灌注，缺氧，动脉粥样硬化，输尿管梗阻，糖尿病，糖尿病并发症，关节炎，肝损伤，胰岛素抗性，糖尿病性肾病，急性肾损伤，慢性肾损伤，暴露于肾毒性剂和/或放射性造影剂引起的急性或慢性肾损伤，高血压，代谢综合征，眼科疾病或疾患如干眼病、糖尿病性视网膜病、白内障、色素性视网膜炎、青光眼、黄斑变性、脉络膜新生血管、视网膜变性、氧诱导的视网膜病变，心肌病，缺血性心脏病，心力衰竭，高血压性心肌病，血管阻塞，血管阻塞损伤，心肌梗塞，冠心病，氧化性损伤。
6.根据权利要求3-5所述的方法，其中所述线粒体功能障碍包括线粒体通透性转换。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述神经或神经退行性疾病或疾患包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病、亨廷顿氏病或多发性硬化。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述对象患有缺血或者在心血管组织、骨骼肌组织、脑组织和肾组织中的一个或多个中具有无复流解剖区。
9.一种在有需要的对象中减少CD36表达的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1或2所述的组合物。
10.一种在有需要的对象中治疗或预防特征在于CD36升高的疾病或疾患的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1或2所述的组合物。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述对象被诊断为患有、疑似患有或有风险患上动脉粥样硬化、炎症、血管生成异常、脂类代谢异常、凋亡细胞清除异常、缺血例如脑缺血和心肌缺血、缺血-再灌注、输尿管梗阻、中风、阿尔茨海默氏病、糖尿病、糖尿病性肾病或肥胖症。
12.一种减少移除器官或组织中的氧化性损伤的方法，包括向所述移除器官或组织施用有效量的根据权利要求1或2所述的组合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述移除器官包括心脏、肺、胰腺、肾脏、肝脏或皮肤。
14.一种在有需要的对象中预防产多巴胺型神经元损失的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1或2所述的组合物。
15.根据权利要求15所述的方法，其中所述对象被诊断为患有、疑似患有或有风险患上帕金森氏病或ALS。
16.一种在有需要的对象中减少与神经退行性疾病相关的氧化性损伤的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1或2所述的组合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或ALS。
18.一种在有需要的对象中预防或治疗灼伤的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1或2所述的组合物。
19.一种在有需要的对象中治疗或预防机械通气引起的隔肌功能障碍的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1或2所述的组合物。
20.一种在有需要的对象中治疗或预防缺血-再灌注损伤后无复流的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。
21.一种在需要镇痛的哺乳动物中预防去甲肾上腺素摄取的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1或2所述的组合物。
22.一种在有需要的对象中治疗或预防药物引起的周围神经病或痛觉过敏的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1或2所述的组合物。
23.一种在有需要的对象中止痛或镇痛的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1或2所述的组合物。
24.一种在有需要的对象中治疗动脉粥样硬化性肾血管病(ARVD)的方法，包括向所述对象施用有效量的根据权利要求1或2所述的组合物。
25.根据权利要求1或2所述的组合物，其包含含有修饰的Glp-1类似物，所述修饰选自包含一种或多种D-氨基酸、包含一个或多个N-甲基化位点和包含一个或多个还原酰胺键(Ψ[CH2-NH])。
26.根据权利要求1或2所述的组合物，还包含至少一种药学上可接受的降pH剂以及对促进所述活性剂的生物利用度有效的至少一种吸收促进剂中的一种或多种，和一个或多个层压层。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述降pH剂选自柠檬酸、酒石酸和氨基酸的酸式盐。
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