JP5839597B2 - グルコース調節ポリペプチド並びにその作成及び使用方法 - Google Patents

グルコース調節ポリペプチド並びにその作成及び使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP5839597B2
JP5839597B2 JP2012515082A JP2012515082A JP5839597B2 JP 5839597 B2 JP5839597 B2 JP 5839597B2 JP 2012515082 A JP2012515082 A JP 2012515082A JP 2012515082 A JP2012515082 A JP 2012515082A JP 5839597 B2 JP5839597 B2 JP 5839597B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
xten
fusion protein
sequence
gpxten
subject
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2012515082A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2012529297A5 (ja
JP2012529297A (ja
Inventor
フォルカー シェレンバーガー，
フォルカー シェレンバーガー，
ジョシュア シルバーマン，
ジョシュア シルバーマン，
ウィレム ピー． ステマー，
ウィレム ピー． ステマー，
チア−ウェイ ワン，
チア−ウェイ ワン，
ネイサン ギーティング，
ネイサン ギーティング，
ジェフリー エル． クリーランド，
ジェフリー エル． クリーランド，
ベンジャミン スピンク，
ベンジャミン スピンク，
Original Assignee
アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド
アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US12/699,761 external-priority patent/US8673860B2/en
Application filed by アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド, アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド filed Critical アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド
Publication of JP2012529297A publication Critical patent/JP2012529297A/ja
Publication of JP2012529297A5 publication Critical patent/JP2012529297A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5839597B2 publication Critical patent/JP5839597B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57563—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/328—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having effect on glycaemic control and diabetes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Description

（連邦政府後援研究に関する説明）
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）からのＳＢＩＲ助成２Ｒ４４ＧＭ０７９８７３−０２のもと、米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
（関連出願）
本出願は、全てが係属中である、２００９年６月８日に出願の米国仮特許出願第６１／２６８，１９３号、２００９年８月２５日に出願の同６１／２３６，８３６号、及び２００９年１１月１０日に出願の同６１／２８０，９５５号、並びにその両方が２０１０年２月３日に出願された米国特許出願第１２／６９９，７６１号、及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／２３１０６号の優先権を主張するものであり、これらの全文は参照することにより本明細書に組み入れられる。
グルコース調節ペプチドは、人間の代謝の重要な調整成分である。様々なペプチドが、血清グルコースレベルの増加又は減少という結果となるという生物学的な結果で、説明されている。これらのペプチドは、それらがお互いに反対の生物学的機能を有している場合であっても、お互いに相同性が高い傾向がある。治療薬として使用されているものを含む、多くのグルコース調節ペプチドは、一般的に有効保存期間の短い不安定な分子であり、水溶液中で製剤化されている場合は、特にそうである。更に、多くのグルコース調節ペプチドは、限られた溶解性を有し、又は、組み換え生成中に凝集し、複雑な可溶化及びリフォールディングの手順を必要とする。それらの特性を変化させるために、様々な化学ポリマーをそのようなペプチドやタンパク質へ付着することができる。特に興味深いのは、柔軟な立体配座を有し、水溶液中で十分な水和型である親水性ポリマーである。頻繁に使用されるポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。これらのポリマーは、その分子量に対して大きな流体力学的半径を有する傾向があり（非特許文献１）、強化された薬物動態学的特性をもたらし得る。しかしながら、タンパク質へのポリマーの化学的結合は、複雑なマ複数ステップのプロセスが必要である、典型的に、化学的共役のステップの前にタンパク質成分を生成及び精製する必要があり、共役ステップは、単離する必要がある異種生成物の混合物を形成する可能性があり、著しい生成物の損失に繋がる。また、このような混合物は、最終的な医薬品として使用できるが、標準化することは困難であり得る。いくつかの例は、現在、混合物として使用されるペグ化されたインターフェロン−α生成物として販売されている（非特許文献２；非特許文献３）。そのような混合物は、治療活性の低い、又は全く無い異性体を含んでいるので、再現性よく製造し、特徴付けることが困難である。
Ｆｃ領域のようなアルブミン及び免疫グロブリンフラグメントは、他の生物学的に活性なタンパク質を共役するために使用されており、半減期又は免疫原性の増加に関して、予測不可能な結果となっている。残念ながら、Ｆｃドメインは組換え発現において正しく折りたたまれず、封入体として知られる不溶性沈殿物を形成する傾向にある。これらの封入体は可溶化しなければならず、機能性タンパク質を復元しなければならない。これは、追加の製造工程としばしば複雑な精製工程を必要とする、時間のかかる非効率的な、高価なプロセスである。
従って、グルコース調節ペプチドの生物学的、薬理、安全性、及び／又は薬学的特性を改善する組成物及び方法について、大きな必要性が未だ存在する。
Ｋｕｂｅｔｚｋｏ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６８：１４３９−５４ Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｓｕｂｍｉｃｒｏｓｃ Ｃｙｔｏｌ Ｐａｔｈｏｌ，３０：５０３−９ Ｄｈａｌｌｕｉｎ， Ｃ．，ｅｔ ａｌ． （２００５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１６：５０４−１７
本開示は、グルコース調節ペプチドを投与することにより改善される、回復する、又は阻害される、任意の疾患、障害、又は状態の治療に有用である可能性のある組成物及び方法を対象とする。具体的には、本発明は、グルコース調節ペプチド（ＧＰ）に結合した、非反復配列及び／又は非構造性コンホメーションを有する伸張（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を１つ以上含む、融合タンパク質の組成物を提供する。部分的には本開示は、グルコース調節ペプチド関連疾患、障害又は状態を治療するための、融合タンパク質を含む医薬組成物、及びその使用を対象とする。
一実施形態において本発明は、表１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％同一のグルコース調節ペプチドを含む、単離した融合タンパク質を提供し、ここで前記グルコース調節ペプチドは少なくとも約１００、又は少なくとも約２００、又は少なくとも約４００、又は少なくとも約８００、又は少なくとも約９００、又は少なくとも約１０００、又は少なくとも約２０００、から約３０００アミノ酸残基までの伸張組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に結合されており、ここでＸＴＥＮは（ａ）ＸＴＥＮが表５に示された配列から選択された、同等の長さのアミノ酸配列と少なくとも約９０％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％の同一性を示す少なくとも約２００の連続したアミノ酸を含むこと；（ｂ）ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムを用いて解析した場合、ＸＴＥＮ配列が予測されるＴ−細胞エピトープを含まず、ＸＴＥＮ配列中のエピトープのＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズム予測は、−５、又は−６、又は−７、又は−８、又は−９以上のスコアに基づくこと；（ｃ）ＸＴＥＮが１０未満、又は９未満、又は８未満、又は７未満、又は６未満、又は５未満、又はさらにそれより低い部分列スコアを有すること；及び（ｄ）グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の総和がＸＴＥＮの全アミノ酸残基の約９０％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％以上を構成すること、を特徴とする。一実施形態において、単離した融合タンパク質のグルコース調節ペプチドはヒトグルコース調節ペプチドである。別の実施形態において、単離した融合タンパク質は少なくとも第二のＸＴＥＮを含み、ここでこの融合タンパク質は表５に示す多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）ＸＴＥＮ配置又はその変異構造をとる。
別の実施形態においてＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定した場合に９０％を超えるランダムコイル構造又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％のランダムコイル構造を有すること；及びＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定した場合、ＸＴＥＮ配列は２％未満のアルファ−ヘリックス及び２％のベータシートを有すること、を特徴とする。
別の実施形態において、本発明はＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、ここでＸＴＥＮは、アスパラギン及びグルタミン残基の総和がＸＴＥＮの全アミノ酸配列の１０％未満であり、メチオニン及びトリプトファン残基の総和がＸＴＥＮの全アミノ酸配列の２％未満であり、ＸＴＥＮ配列が有する正電荷アミノ酸残基が５％未満であり、ＧＯＲアルゴリズムを用いて決定した場合にＸＴＥＮ配列は９０％を超えるランダムコイル構造、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％のランダムコイル構造を有し；及びＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムを用いて決定した場合にＸＴＥＮ配列は２％未満のアルファ−ヘリックス及び２％のベータシートを有する、ことを特徴とする。
別の実施形態において本発明はＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、ここでＸＴＥＮは、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％がオーバーラップしていない配列モチーフから構成されることを特徴とし、ここで各配列モチーフは約９〜約１４アミノ酸残基であり、配列中の任意の２つの連続したアミノ酸残基は各配列モチーフ中に２回より多くは存在せず、配列モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態においては、ＧＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ配列の３０％より多くを１種類のアミノ酸が構成することはない。他の実施形態においてＸＴＥＮは、セリン以外には同一のアミノ酸が３つ連続したアミノ酸配列を含まず、この場合には３つより多くの連続したアミノ酸がセリン残基になることはない。その上さらに他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％、又は１００％がオーバーラップしていない配列モチーフから構成され、ここで各配列モチーフは１２アミノ酸残基である。一実施形態において、ＸＴＥＮ配列はオーバーラップしていない配列モチーフから成り、ここで配列モチーフは表２の１つ以上の配列からのものである。
いくつかの実施形態においてＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮと結合していないＧＰと比較して向上した薬物動態学的特性を示す。向上した特性には、より長い終末相半減期、濃度曲線下面積の増大、治療ウィンドウ中での血中濃度が維持される時間の延長、連続投与の時間間隔の増大、及び全期間中でのモル用量の減少、が含まれるがこれらには限定されない。いくつかの実施形態において、対象に投与されるＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質の終末相半減期は、ＸＴＥＮと結合していなく、かつ、同等の用量において対象に投与されるＧＰと比較して少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約４０倍、又は少なくとも約６０倍、又は少なくとも約１００倍にも長くなる。他の実施形態において向上した薬物動態学的特性は、指定された期間、治療ウィンドウ中で維持されるＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質の血中濃度が、ＸＴＥＮと結合していなく、かつ、同等の用量において対象に投与されるＧＰと比較して少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍長く、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約４０倍、又は少なくとも約６０倍、又は少なくとも約１００倍、又はそれ以上であることを反映する。半減期及び治療ウィンドウ中で費やされる時間がより長いことは、ＸＴＥＮに結合していない対応するＧＰと比較して、より低頻度で投与すること及び対象に投与する融合タンパク質の量（モル等量）を低減させることを可能にする。一実施形態において治療上効果的な投与計画は、融合タンパク質結合していなく、かつ、同等の用量において対象に投与される対応するＧＰと比較して、融合タンパク質の少なくとも２つの連続したＣｍａｘのピーク及び／又はＣｍｉｎの谷の間の時間を少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも４倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも６倍、又は少なくとも８倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約４０倍、又は少なくとも約６０倍、又は少なくとも約１００倍、長くする。
いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮは生物学的に活性なタンパク質と結合させることで、その生物学的に活性なタンパク質の熱安定性を高める。熱安定性は、生物学的に活性なタンパク質を約３７℃に少なくとも約７日間曝露した後に生理活性の保持を測定し、ＸＴＥＮに結合した生物学的に活性なタンパク質と比較することによって確かめられる。前述のうちの一実施形態において生理活性は、ＸＴＥＮを含むがＸＴＥＮと結合していないＧＰと比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、又は約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、又は約５００％より長く保持される。
いくつかの実施形態においては、少なくとも第一のＸＴＥＮを含む単離した融合タンパク質はＧＰを含み、ここでこのＧＰはヒトグルコース調節ペプチドである。いくつかの実施形態においては、単離した融合タンパク質は第二のＸＴＥＮをさらに含み、ここで第二のＸＴＥＮは第一のＸＴＥＮと同一であっても又は異なるものであってもよく、そしてこの融合タンパク質は表７に示される多重ＸＴＥＮ配置をとる。前述のうちの一実施形態において、第一及び第二のＸＴＥＮはそれぞれ表５から選択される配列であり得、又は表５から選択される配列と少なくとも少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％又は１００％の配列同一性を示すものであり得る。別の実施形態において第二のＸＴＥＮ配列を含む単離した融合タンパク質は、表７に示した多重ＸＴＥＮ配置をとる。
一実施形態において単離した融合タンパク質は、ＸＴＥＮと結合していないＧＰと比較して免疫原性が低い。免疫原性は、例えば、同等の用量において対象に投与した後に、生物学的に活性なタンパク質に選択的に結合するＩｇＧ抗体の生産を測定することにより確かめられる。
いくつかの実施形態においては、グルコース調節ペプチドと、融合タンパク質のＸＴＥＮはスペーサーを介して結合し、ここでスペーサー配列は約１個〜約５０個の範囲のアミノ酸残基から成り、任意に開裂配列を含む。一実施形態において開裂配列はプロテアーゼによる開裂に感受性である。そのようなプロテアーゼの非限定的な例としては、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、トロンビン、エラスターゼ−２、グランザイムＢ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７又はＭＭＰ−２０、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、及びソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）Ａが挙げられる。
いくつかの実施形態において単離した融合タンパク質は、融合タンパク質に結合していない対応するＧＰと比較して、対応するＧＰの標的受容体に対する結合親和性が低くなるように構成される。一実施形態においては、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質がＧＰの標的受容体に対して示す結合親和性は、ＸＴＥＮをもたない対応するＧＰの約０．０１％〜３０％、又は約０．１％〜約２０％、又は約１％〜約１５％、又は約２％〜約１０％の範囲である。別の実施形態においてＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＧＰの標的受容体に対して、ＸＴＥＮに結合していないＧＰと比較して少なくとも約３倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約７倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約１２倍、又は少なくとも約１５倍、又は少なくとも約１７倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約３０倍、又は少なくとも約５０倍、又は少なくとも約１００倍低い結合親和性を示す。関連する実施形態において、より低い親和性を有する融合タンパク質は、融合タンパク質に結合していない対応するＧＰと比較して、より低い受容体介在性クリアランス及びそれに対応する、少なくとも約３倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約７倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約１２倍、又は少なくとも約１５倍、又は少なくとも約１７倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約３０倍、又は少なくとも約５０倍、又は少なくとも約１００倍長い半減期を有し得る。
一実施形態において本発明は、表３５、表３６、及び表３７から選択される配列と、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離したＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態においては、本発明はＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、ここでＧＰＸＴＥＮは、融合タンパク質に結合していないＧＰと比較して、生理学的条件において少なくとも３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約７倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約１５倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも６０倍高い溶解度を示す。
いくつかの実施形態においてＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーで決定した場合に、実際の分子量よりも大きい見かけの分子量（Ａｐｐａｒｅｎｔｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ）を示す。ここでこの見かけの分子量は、少なくとも約１００ｋＤ、又は少なくとも約１５０ｋＤ、又は少なくとも約２００ｋＤ、又は少なくとも約３００ｋＤ、又は少なくとも約４００ｋＤ、又は少なくとも約５００ｋＤ、又は少なくとも約６００ｋＤ、又は少なくとも約７００ｋＤであるが、融合タンパク質の各ＧＰ構成要素の実際の分子量は約２５ｋＤ未満である。従って、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質の実際の分子量よりも約４倍大きい、又は約５倍大きい、又は約６倍大きい、又は約７倍大きい、又は約８倍大きい見かけの分子量を有する場合がある。場合により、前述の実施形態の単離したＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は生理学的条件下において、約４、又は約５、又は約６、又は約７、又は約８より大きい見かけの分子量因子を示す。
本発明は、表１から選択されるＧＰ（又は断片若しくはその配列変異体）、表５から選択されるＸＴＥＮ（又はその配列変異体）を含み、表５から選択される構造をとるＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を企図するが、組成物の配列及び構造はこれらには限定されない。概して、生じるＧＰＸＴＥＮは、ＸＴＥＮと結合していない対応するＧＰの生理活性を少なくとも部分的に保持する。その他の例においてＧＰ構成要素は、ＧＰＸＴＥＮ中にスペーサー配列と共に組み入れられた任意の開裂配列による開裂よってＸＴＥＮから放出される際に、生物学的に活性なもの又は活性が増したもののいずれかとなる。
ＧＰＸＴＥＮ組成物の一実施形態において本発明は、式Ｉの融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）ｘ−ＧＰ−（ＸＴＥＮ）ｙ：Ｉ
式中、ＧＰは、各出現に対して、独立してグルコース調節ペプチドであり；ｘは０又は１のいずれかであり、及びｙは０又は１であり、ここでｘ＋ｙ≧１であり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
いくつかの実施形態においては、ＸＴＥＮはグルコース調節ペプチドのＮ−又はＣ−末端でグルコース調節ペプチドに融合される。いくつかの実施形態において単離した融合タンパク質は、ヒトグルコース調節ペプチド並びにＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＥ１４４、及びＡＥ２８８から選択される第一及び第二のＸＴＥＮを含む。
ＧＰＸＴＥＮ組成物の別の実施形態では、本発明は、式ＩＩの融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）ｘ−（ＧＰ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｙ：ＩＩ
式中、ＧＰは、各出現に対して、独立して、グルコース調節ペプチドであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり及びｙは０又は１のいずれかであり、ここでｘ＋ｙ≧１であり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
別の実施形態では本発明は、融合タンパク質が式ＩＩＩの融合タンパク質である、単離した融合タンパク質を提供し、
（ＧＰ）−（Ｓ）ｘ−（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｙ−（ＧＰ）−（Ｓ）ｚ−（ＸＴＥＮ）ｚ：ＩＩＩ
式中、ＧＰは、各出現について、独立して、グルコース調節ペプチドであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；ｚは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
別の実施形態において本発明は、融合タンパク質が式ＩＶの融合タンパク質である単離した融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）ｙ−（ＧＰ）−（Ｓ）ｚ−（ＸＴＥＮ）−（ＧＰ）：ＩＶ
式中、ＧＰは、各出現について、独立して、グルコース調節ペプチドであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；ｚは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
別の実施形態において本発明は、融合タンパク質が式Ｖの融合タンパク質である、単離した融合グルコース調節ペプチドを提供し、
（ＧＰ）ｘ−（Ｓ）ｘ−（ＧＰ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）：Ｖ
式中、ＧＰは、各出現について、独立して、グルコース調節ペプチドであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
別の実施形態において本発明は、融合タンパク質が式ＶＩの融合タンパク質である単離した融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｘ−（ＧＰ）−（Ｓ）ｙ−（ＧＰ）：ＶＩ
式中、ＧＰは、各出現について、独立して、グルコース調節ペプチドであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
別の実施形態において本発明は、融合タンパク質が式ＶＩＩの融合タンパク質である単離した融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｘ−（ＧＰ）−（Ｓ）ｙ−（ＧＰ）−（ＸＴＥＮ）：ＶＩＩ
式中、ＧＰは、各出現について、独立して、グルコース調節ペプチドであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
別の実施形態において本発明は、融合タンパク質が式ＶＩＩＩの融合タンパク質である単離した融合タンパク質を提供し、
（（Ｓ）ｍ−（ＧＰ）ｘ−（Ｓ）ｎ−（ＸＴＥＮ）ｙ−（Ｓ）ｏ）ｔ：ＶＩＩＩ
式中、ｔは０より大きい整数であり（１、２、３、など）；ｍ、ｎ、ｏ、ｘ、及びｙはそれぞれ独立して整数であり（０、１、２、３、など）、ＧＰはグルコース調節ペプチドであり；Ｓは任意に開裂部位を含むスペーサーであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドであるが、但し（１）ｘ＋ｙ＞１、（２）ｔ＝１の場合、ｘ＞０及びｙ＞０であり、（３）１つより多いＧＰ、Ｓ、又はＸＴＥＮが存在する場合、ＧＰ、ＸＴＥＮ、又はＳのそれぞれは同じか又はそれぞれ独立して異なり；及び（４）ｔ＞１の場合、各サブユニット中のｍ、ｎ、ｏ、ｘ、又はｙはそれぞれ同じか又はそれぞれ独立して異なる、ことを条件とする。
いくつかの実施形態においては、治療上有効量の式Ｉ〜ＶＩＩＩの実施形態の融合タンパク質を、それを必要とする対象へ投与すると、ＸＴＥＮと結合していない対応するＧＰであって、かつ、同等の用量において対象に投与されるＧＰと比較して、融合タンパク質が治療ウィンドウ中で費やされる時間が少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも４倍、又は少なくとも５倍以上に延長される。他の例においては、治療上有効量の式Ｉ〜ＶＩＩＩの実施形態の融合タンパク質を、それを必要とする対象へ投与すると、ＸＴＥＮに結合していないＧＰであって、かつ、同等の用量において投与されるＧＰの連続投与の間隔と比較して、治療上効果的な投与計画を維持するために必要な連続投与の間隔を少なくとも４８時間、又は少なくとも７２時間、又は少なくとも約９６時間、又は少なくとも約１２０時間、又は少なくとも約７日間、又は少なくとも約１４日間、又は少なくとも約２１日間延長することができる。
ＧＰ、ＸＴＥＮ、及び任意のスペーサー配列のＮ末端からＣ末端にかけての配置が異なるように、融合タンパク質を設計することができる。これら配置の例にはＸＴＥＮ−ＧＰ、ＧＰ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−Ｓ−ＧＰ、ＧＰ−Ｓ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−ＧＰ−ＸＴＥＮ、ＧＰ−ＧＰ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−ＧＰ−ＧＰ、ＧＰ−Ｓ−ＧＰ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−ＧＰ−Ｓ−ＧＰ、及びその多量体又は表７に示されている構造が挙げられるが、これらには限定されない。本明細書に開示したように、配置の選択により、特定の薬物動態学的、物理化学的、又は薬理学的特性を付与することができる。
いくつかの実施形態において単離した融合タンパク質は、（ｉ）ＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと比較してより長い半減期を有する；（ｉｉ）他の点では同等の投与計画において、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドよりも少ないモル量の融合タンパク質を対象に投与した場合に、融合タンパク質はＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を達成する；（ｉｉｉ）他の点では同等の投与計画において、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドよりも少ないモル量の融合タンパク質を対象に投与した場合に、融合タンパク質はＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等の治療効果を達成する；（ｉｖ）他の点では同等のモル量で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドよりも低頻度で融合タンパク質を対象に投与した場合に、融合タンパク質はＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を達成する；（ｖ）他の点では同等のモル量で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドよりも低頻度で融合タンパク質を対象に投与した場合に、融合タンパク質はＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等の治療効果を達成する；（ｖｉ）他の点では同等の投与期間、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドよりも累積して少ないモル量の融合タンパク質を対象に投与した場合に、融合タンパク質はＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を達成する；又は（ｖｉｉ）他の点では同等の投与期間、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドよりも累積して少ないモル量の融合タンパク質を対象に投与した場合に、融合タンパク質はＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等の治療効果を達成する；ことを特徴とする。
一実施形態において、上述の式Ｉ〜ＶＩＩＩのＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質に結合していないＧＰの生理活性と比較して、少なくとも約０．１％、又は少なくとも約１％、又は少なくとも約２％、又は少なくとも約３％、又は少なくとも約４％、又は少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の生理活性を示す。別の実施形態において式Ｉ〜ＶＩＩＩのＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質に共有結合していない対応するＧＰと同じ受容体に結合する。
本発明は、（ａ）融合タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞を準備すること、（ｂ）融合タンパク質の発現を可能にする条件下において宿主細胞を培養すること；及び（ｃ）融合タンパク質を回収すること、を含む、グルコース調節ペプチドを１つ以上の伸張組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に融合させた融合タンパク質の生産方法を提供する。本方法の一実施形態において、融合タンパク質のグルコース調節ペプチドは、ヒトグルコース調節ペプチド又は表１から選択された配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。本方法の別の実施形態において、発現させた融合タンパク質中の１つ以上のＸＴＥＮは、表５から選択された配列と、少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％から約１００％の配列同一性を有する。本方法の別の実施形態において、ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞中での前記融合タンパク質の発現を高めるためにコドン最適化したものである。本方法の別の実施形態においては、宿主細胞は原核細胞である。本方法の別の実施形態において宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。本方法の別の実施形態において単離した融合タンパク質は、宿主細胞の細胞質から、実質的に可溶な形態で回収される。
本発明は、（ａ）前述の実施形態のいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補鎖、から選択されたポリヌクレオチド配列を含む、単離した核酸を提供する。一実施形態において本発明は、（ａ）表３５、表３６、及び表３７から選択された、同等の長さのポリヌクレオチド配列；又は（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補鎖と、少なくとも８０％の配列同一性、又は約８５％、又は少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％から約１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、単離した核酸を提供する。本発明は、この段落で上述した実施形態のうちのいずれかの核酸を含む、発現ベクターを提供する。一実施形態において前述の発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結した組換え制御配列をさらに含む。別の実施形態において前述の発現ベクターのポリヌクレオチド配列は、分泌シグナル配列をコードするポリヌクレオチドにインフレームで融合させたものであり、このシグナル配列は原核性のシグナル配列であり得る。一実施形態において、分泌シグナル配列は、ＯｍｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＰｈｏＡシグナル配列から選択される。
本発明は宿主細胞を提供し、この宿主細胞は前述の段落で開示した発現ベクターを含むことができる。一実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は大腸菌である。別の実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。
一実施形態において本発明は、前述のいずれかの実施形態の融合タンパク質及び薬学上許容可能な担体を含む、医薬組成物を提供する。別の実施形態において本発明は、包装材及び前述の実施形態の医薬組成物を含む少なくとも第一の容器、並びに医薬組成物及び保管及び操作条件を指示するラベル、並びに再構成及び／又は対象への医薬組成物の投与についての説明を記載したシートを含むキットを提供する。
本発明は、治療上有効量の、前述のいずれかの実施形態の融合タンパク質を対象に投与することを含む、対象におけるグルコース調節ペプチド関連疾患の治療方法を提供する。本方法の一実施形態においては、グルコース調節ペプチド関連疾患は、若年性糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満、急性低血糖症、急性高血糖、夜間低血糖症、慢性の高血糖、グルカゴノーマ、気道の分泌障害、関節炎、骨粗しょう症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、うっ血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺浮腫、高血圧、及び食物摂取の減少が望まれている障害、脳卒中、過敏性腸症候群、心筋梗塞（例えば、それに関連する罹患率及び／又は死亡率の削減）、脳卒中、急性冠症候群（例えば、Ｑ−波の欠如による特徴づけられる）、心筋梗塞、手術後の異化変化、冬眠心筋や糖尿病性心筋症、不十分な尿中ナトリウム排泄量、過度の尿中カリウム濃度、有毒な循環血液量過多に伴う状態又は障害（例えば、腎不全、うっ血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、冬眠心筋梗塞、外科手術後の異化変化、及び高血圧）、多嚢胞性卵巣症候群、呼吸困難、腎症、左室収縮機能障害（例えば、異常な左室駆出率を有する）、下痢などの胃腸障害、術後のダンピング症候群や過敏性腸症候群（すなわち、幽門洞−十二指腸（ａｎｔｒｏ−ｄｕｏｄｅｎａｌ）運動性の阻害を介する）、重大な病気の多発神経障害（ＣＩＰＮ）、高脂血症、虚血後の血流の再灌流によって引き起こされる臓器組織損傷、及び冠状動脈性心臓病の危険因子（ＣＨＤＲＦ）症候群、未修飾のグルコース調節ペプチド（例えばエキセンジン４、ＧＬＰ −１又はグルカゴン）が利用できる任意の他の兆候、ＧＰを利用することができる（ただし対象のペプチドのレベルを調節する内因性のグルコースが必ずしも不足ないもののために）他の任意の兆候、から選択されるが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態においては組成物を、皮下に、筋内に、又は静脈内に投与することができる。一実施形態においては、組成物を治療上有効量で投与する。一実施形態において治療上有効量とは、融合タンパク質のＧＰに対応するが融合タンパク質に結合していないＧＰであって、かつ、同等の用量において対象に投与されるＧＰと比較して、融合タンパク質が治療ウィンドウ中で費やされる期間の延長をもたらす。治療ウィンドウ中で費やされる時間の延長は、融合タンパク質に結合していない対応するＧＰよりも少なくとも３倍長くなる場合があり、あるいは、融合タンパク質に結合していない対応するＧＰよりも少なくとも４倍、又は５倍、又は６倍、又は７倍、又は８倍、又は９倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも約３０倍、又は少なくとも約５０倍、又は少なくとも約１００倍、長くなる可能性がある。本治療方法のいくつかの実施形態においては、（ｉ）他の点では同等の投与計画において、ＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと比較して、より少ないモル量（例えば約１／２未満、又は約１／３倍未満、又は約１／４未満、又は約１／５未満、又は約１／６未満、又は約１／８未満、又は約１／１００未満又はそれより少ない量）の融合タンパク質を投与した場合に、融合タンパク質は、ＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等の濃度曲線下面積及び／又は同等の治療効果を達成する；（ｉｉ）融合タンパク質を、ＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドより低頻度で（例えば、隔日、約７日おきに、約１４日おきに、約２１日おきに、又は約１ヶ月おきに）、かつ、他の点では同じ用量で投与した場合、融合タンパク質は、ＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等の濃度曲線下面積及び／又は同等の治療効果を達成する；又は（ｉｉｉ）ＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと比較して、より少ない累積モル量（例えば約５％、又は約１０％、又は約２０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％未満）の融合タンパク質を、他の点では同じ投与計画で投与した場合、融合タンパク質は、ＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等の濃度曲線下面積及び／又は同等の治療効果を達成する。より少ない累積モル量は、少なくとも約１週間、又は約１４日、又は約２１日、又は約１ヶ月の期間の測定量である。本方法のいくつかの実施形態においては、治療効果は、ＨｂＡ１ｃ濃度、インスリン濃度、刺激Ｃペプチド、空腹時血糖値（ＦＰＧ）、血清サイトカイン濃度、ＣＲＰ値、インスリン分泌、及び、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）から得られるインスリン感受性指数、、体重、食事摂取量から選択される、測定指標である。
別の実施形態において本発明は、治療上効果的な投与計画に則って、前述の医薬組成物を対象に複数回連続して投与することを含む、疾患、障害又は状態の治療方法を提供する。前述の一実施形態において、治療上効果的な投与計画は、対応する融合タンパク質のＧＰではあるが融合タンパク質と結合していないＧＰであって、かつ、同等の用量において対象に投与されるＧＰと比較して、融合タンパク質の少なくとも２つの連続した血中レベルのＣｍａｘのピーク及び／又はＣｍｉｎの谷の間の時間を少なくとも３倍、あるいは少なくとも４倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも６倍、又は７倍、又は少なくとも８倍、又は９倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約３０倍、又は少なくとも約４０倍、又は少なくとも約５０倍、又は少なくとも約６０倍、又は少なくとも約１００倍、長くするものである。前述の別の実施形態においては、融合タンパク質に結合していない対応する生物学的に活性なタンパク質構成要素であって、かつ、治療上効果的な投与計画に則って対象に投与されるタンパク質構成要素と比較して、融合タンパク質のより低頻度での投与又は医薬組成物中の融合タンパク質のモル量においてより少ない総量の投与で、グルコース調節ペプチド関連疾患の少なくとも１つの測定指標の改善をもたらす。
本発明は、疾患、障害又は状態の治療用薬物として調製された、前述のいずれかの実施形態の融合タンパク質を含む組成物の、それを必要とする対象における使用をさらに提供する。前述の一実施形態において、疾患、障害又は状態は、若年性糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満、急性低血糖症、急性高血糖、夜間低血糖症、慢性の高血糖、グルカゴノーマ、気道の分泌障害、関節炎、骨粗しょう症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、うっ血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺浮腫、高血圧、及び食物摂取の減少が望まれている障害、脳卒中、過敏性腸症候群、心筋梗塞（例えば、それに関連する罹患率及び／又は死亡率の削減）、脳卒中、急性冠症候群（例えば、Ｑ−波の欠如による特徴づけられる）、心筋梗塞、手術後の異化変化、冬眠心筋や糖尿病性心筋症、不十分な尿中ナトリウム排泄量、過度の尿中カリウム濃度、有毒な循環血液量過多に関連付けられている状態又は障害（例えば、腎不全、うっ血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、冬眠心筋梗塞、外科手術後の異化変化、及び高血圧）、多嚢胞性卵巣症候群、呼吸困難、腎症、左室収縮機能障害（例えば、異常な左室駆出率を有する）、下痢などの胃腸障害、術後のダンピング症候群や過敏性腸症候群（すなわち、幽門洞−十二指腸（ａｎｔｒｏ−ｄｕｏｄｅｎａｌ）運動性の阻害を介する）、重篤な病気の多発神経障害（ＣＩＰＮ）、高脂血症、虚血後の血流の再灌流によって引き起こされる臓器組織損傷、及び冠状動脈性心臓病の危険因子（ＣＨＤＲＦ）症候群、未修飾のグルコース調節ペプチド（例えばエキセンジン４、ＧＬＰ−１又はグルカゴン）が利用できる任意の他の兆候、ＧＰを利用することができる（ただし対象のペプチドのレベルを調節する内因性のグルコースが必ずしも不足ないもののために）他の任意の兆候、から成る群より選択されるが、それらに限定されない。目的の適応に応じて、開示した任意の実施形態を、単独で又は併用で実施することができる。
（参照による組み入れ）
本明細書において言及した全ての出版物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の出版物、特許、又は特許出願を、参照により組み入れられることを特定的にかつ個別に示シたのと同様の程度で、参照することにより本明細書に組み入れられる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
表１から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるグルコース調節ペプチド（ＧＰ）を含む単離した融合タンパク質であって、前記グルコース調節ペプチドは少なくとも約２００アミノ酸残基の伸張組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に結合しており、そして該ＸＴＥＮが、
（ａ）該ＸＴＥＮ配列が、表３から選択された同等の長さのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を示す、少なくとも約２００の連続したアミノ酸を含み；
（ｂ）−９又はそれを超えるスコアに基づくＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによってＸＴＥＮ配列中にあるエピトープの予測を行った場合に、該ＸＴＥＮ配列は予測されるＴ細胞エピトープを含まず；
（ｃ）１０未満の部分列スコアを有し；及び
（ｄ）グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の総和が、ＸＴＥＮの全アミノ酸残基の約９０％より多くを構成することを特徴とする、
単離した融合タンパク質。
（項目２）
該グルコース調節ペプチドがヒトグルコース調節ペプチドである、項目１に記載の単離した融合タンパク質。
（項目３）
第二のＸＴＥＮ配列をさらに含む単離した融合タンパク質であって、かつ、該融合タンパク質が表７に示した多重ＸＴＥＮ配置をとる、項目１又は２に記載の単離した融合タンパク質。
（項目４）
該グルコース調節ペプチドペプチド及び該ＸＴＥＮがスペーサーを介して結合しており、ここで該スペーサー配列が１〜約５０までのアミノ酸残基を含み、そして該スペーサーが開裂配列を任意に含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の単離した融合タンパク質。
（項目５）
該融合タンパク質が、ＸＴＥＮをもたない対応する天然のグルコース調節ペプチドと同じ標的受容体に結合し、かつ、前記融合タンパク質が、ＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドの結合親和性の少なくとも約０．１％〜約３０％またはそれを超える値を保持する、項目１〜４のいずれかに記載の単離した融合タンパク質。
（項目６）
表３６、表３７、及び表３８から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１〜５のいずれかに記載の単離した融合タンパク質。
（項目７）
項目１〜６のいずれかに記載の単離した融合タンパク質及び薬学上許容可能な担体を含む医薬組成物。
（項目８）
式Ｉに従って配置される、項目１のいずれかに記載の単離したタンパク質であって、（ＸＴＥＮ） ｘ −ＧＰ−（ＸＴＥＮ） ｙ （Ｉ）
式中、各出現について独立して：
（ａ）ｘは０又は１のいずれかであり；及び
（ｂ）ｙは０又は１のいずれかであり、
ここでｘ＋ｙ≧１である、
単離したタンパク質。
（項目９）
該ＸＴＥＮを、該グルコース調節ペプチドのＮ末端又はＣ末端を介してグルコース調節ペプチドに融合させた、項目１〜６のいずれかに記載の単離した融合タンパク質。
（項目１０）
ヒトグルコース調節ペプチド、並びに表５から選択され、それぞれ１つ以上のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性がある、第一の及び第二のＸＴＥＮを含む、項目１〜６及び８〜９のいずれかに記載の単離した融合タンパク質。
（項目１１）
項目１〜６及び８〜１０のいずれかに記載の単離した融合タンパク質であって、
（ｉ）対象に投与した場合のＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと比較して、同等のモル用量で対象に投与した場合に、該融合タンパク質がより長い終末相半減期を有する；
（ｉｉ）他の点では同等な投与計画で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドよりも、少ないモル量の該融合タンパク質を投与した場合に、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を達成する；
（ｉｉｉ）他の点では同等な投与計画で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドよりも、少ないモル量の該融合タンパク質を投与した場合に、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等の治療効果を達成する；
（ｉｖ）他の点では同等なモル量で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドよりも、該融合タンパク質を低頻度で投与した場合に、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を達成する；
（ｖ）他の点では同等なモル量で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドよりも、該融合タンパク質を低頻度で投与した場合に、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等の治療効果を達成する；（ｖｉ）他の点では同等な投与期間、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドよりも、より少ない累積モル量の該融合タンパク質を投与した場合に、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を達成する；又は
（ｖｉｉ）他の点では同等な投与期間、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドよりも、より少ない累積モル量の該融合タンパク質を投与した場合に、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等の治療効果を達成する、ことを特徴とする、
単離した融合タンパク質。
（項目１２）
１つ以上の伸張組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に融合させたグルコース調節ペプチドを含む融合タンパク質の生産方法であって、
（ａ）項目１又は６に記載の融合タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞を準備すること；
（ｂ）該融合タンパク質が発現できる条件下において該宿主細胞を培養すること；及び
（ｃ）該融合タンパク質を回収することを含む、生産方法。
（項目１３）
該融合タンパク質の該グルコース調節ペプチドが、
（ａ）ヒトグルコース調節ペプチド；又は
（ｂ）表１から選択された配列
と、少なくとも９０％の配列同一性を有する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
発現した融合タンパク質中の１つ以上のＸＴＥＮが、表５から選択された配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、項目１２又は１３に記載の方法。
（項目１５）
該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子が、表３５、表３６、及び表３７から選択された核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を示す核酸配列を含む、項目１２〜１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記融合タンパク質の該宿主細胞中での発現を高めるために、該ポリヌクレオチドのコドンを最適化する、項目１２〜１５のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
該宿主細胞が原核細胞である、項目１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
該宿主細胞の細胞質から、該単離した融合タンパク質を実質的に可溶性の形態で回収する、項目１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
項目１の融合タンパク質またはその相補体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離した核酸。
（項目２０）
項目１９に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（項目２１）
項目１９に記載の核酸を含み、かつ、原核宿主細胞である、単離した宿主細胞。
（項目２２）
治療上有効量の、項目１の融合タンパク質を対象に投与する工程を含む、対象におけるグルコース調節ペプチド（ＧＰ）に関連した状態の治療方法。
（項目２３）
グルコース調節ぺプチドに関連する疾患が、若年性糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満、急性低血糖、急性高血糖、夜間の低血糖、慢性高血糖、グルカゴン産生腫瘍、気道の分泌性疾患、関節炎、骨粗鬆症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、うっ血性心不全、ネプローゼ症候群、硬変、肺水腫、高血圧、脳卒中、過敏性腸症候群、心筋梗塞、急性冠症候群、術後の異化の変化、冬眠心筋、糖尿病性心筋症、尿のナトリウム排泄が不十分であること、尿のカリウム濃度の過剰、多嚢胞性卵巣症候群、呼吸促迫、腎症、左心室収縮不全、下痢、術後のダンピング症候群、重症疾患多発ニューロパチー（ＣＩＰＮ）、脂質代謝異常、虚血による血流の再灌流から生じる器官組織障害、及び冠動脈性心疾患危険因子（ＣＨＤＲＦ）症候群から選択される項目２２に記載の方法。
（項目２４）
治療有効量が、同等の量で投与された自然のＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと比較して、少なくとも３倍の長さの融合タンパク質の治療ウィンドウ内で融合タンパク質の濃度を維持することをもたらす、項目２２又は２３に記載の方法。
（項目２５）
治療上効果的な用量計画に則って該融合タンパク質を対象に２回以上連続して投与すると、該融合タンパク質の血中レベルの連続したＣ ｍａｘ のピーク及び／又はＣ ｍｉｎ の谷の間の時間が、ＧＰの確立された治療上の投与計画に則って投与される該融合タンパク質に結合していない対応するグルコース調節ペプチドと比較して長くなる、項目２２〜２４のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
項目２２〜２５のいずれかに記載の方法であって、
（ｉ）他の点では同等の投与計画で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドよりも少ないモル量の該融合タンパク質を対象に投与すると、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等な治療効果を達成する；
（ｉｉ）他の点では同等のモル量で、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドよりも該融合タンパク質を低頻度で投与すると、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等な治療効果を達成する；又は
（ｉｉｉ）他の点では同等の投与期間、対象に投与されるＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと比較して、より少ない累積モル量の該融合タンパク質を投与すると、該融合タンパク質がＸＴＥＮをもたない対応するグルコース調節ペプチドと同等な治療効果を達成する、方法。
（項目２７）
該治療効果が、ＨｂＡ１ｃ濃度、インスリン濃度、刺激Ｃペプチド、空腹時血糖値（ＦＰＧ）、血清サイトカインレベル、ＣＲＰレベル、インスリン分泌、及び経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）、体重、摂取量によに由来するインスリン感受性指標から選択される測定指標である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
項目７に記載の医薬組成物、該医薬組成物を特定するラベル、および該医薬組成物の保存、再構成、および／または対象への投与についての説明書を含むキット。
本発明の新規特徴を、特に添付の請求項により記載する。本発明の原理が使用される、例示説明のための実施形態を記載する本発明の詳細な説明、及び以下の添付する図面を参照することにより、本発明の特徴及び利益についてのより良い理解が得られる。
図１は、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質（図１Ａ〜Ｈ）の例を示す模式図であり、全てはＮ末端からＣ末端への方向で図示されている。図１Ａは、それぞれが単一のＧＰ及びＸＴＥＮを含むＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１００）の２つの異なる構成を示し、第一の構成はＧＰ（１０３）のＣ末端に結合するＸＴＥＮ分子（１０２）を有し、第二の構成はＧＰ（１０３）のＮ末端に結合するＸＴＥＮ分子を有する。図１Ｂはそれぞれが単一のＧＰ、スペーサー配列及びＸＴＥＮを含むＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１００）の２つの異なる構成を示し、第一の構成はスペーサー配列のＣ末端に結合するＸＴＥＮ分子（１０２）およびＧＰ（１０３）のＣ末端に結合するスペーサー配列を有し、第二の構成はスペーサー配列（１０４）のＮ末端に結合するＸＴＥＮ分子およびＧＰ（１０３）のＮ末端に結合するスペーサー配列を有する。図１Ｃは、それぞれが単一のＧＰの２つの分子及び１つのＸＴＥＮ分子を含むＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）の２つの異なる構成を示し、第一の構成は第一のＧＰのＣ末端に結合したＸＴＥＮを有して、そのＧＰは第二のＧＰのＣ末端に結合し、第二の構成はＸＴＥＮが第一のＧＰのＮ末端に結合し、そのＧＰが第二のＧＰのＮ末端に結合する、反対向きの配置をとる。図１Ｄは、それぞれが単一のＧＰの２つの分子、スペーサー配列及び１つのＸＴＥＮ分子を含む、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）の２つの異なる構成を示し、第一の構成は第一はスペーサー配列のＣ末端に結合するＸＴＥＮを有し、スペーサー配列は第一のＧＰのＣ末端に結合し、第一のＧＰは第二のＧＰのＣ末端に結合しており、第二の構成は、ＸＴＥＮがスペーサー配列のＮ末端に結合し、スペーサー配列が第一のＧＰのＮ末端に結合し、第一のＧＰが第二のＧＰのＮ末端に結合している、反対向きの配置をとる。図１Ｅは、それぞれが単一のＧＰの２つの分子、スペーサー配列及び１つのＸＴＥＮ分子を含む、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）の２つの異なる構成を示し、第一の構成は第一のＧＰのＣ末端に結合したＸＴＥＮを有し、第一のＧＰはスペーサー配列のＣ末端に結合し、このスペーサー配列は第二のＧＰ分子のＣ末端に結合しており、第二の構成は、ＸＴＥＮが第一のＧＰのＮ末端に結合し、第一のＧＰがスペーサー配列のＮ末端に結合し、次いでスペーサー配列が第二のＧＰ分子のＮ末端に結合する、反対向きの配置をとる。図１Ｆは、それぞれが１つのＧＰ分子及びＧＰのＮ末端及びＣ末端に結合した２つのＸＴＥＮ分子を含むＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０５）の構成を示す。図１Ｇは、単一のＧＰが２つのＸＴＥＮに結合し、第二のＸＴＥＮがスペーサー配列によりＧＰから離されている融合タンパク質の構成（１０６）を示す。図１Ｈは、２つのＧＰが２つのＸＴＥＮに結合し、第二のＸＴＥＮが第一のＧＰのＣ末端および第二のＧＰのＮ末端に結合しており、第二のＧＰはＧＰＸＴＥＮのＣ末端に位置する構成（１０６）である。 図２は、図１の対応するＧＰＸＴＥＮポリペプチドをコードするＧＰＸＴＥＮ遺伝子のポリヌクレオチド構築物（図２Ａ−Ｈ）の例を示す模式図であり、全ては５’から３’の方向に図示されている。これらの具体例となる遺伝子は、１つのＧＰ及びＸＴＥＮ（２００）；又は１つのＧＰ、１つのスペーサー配列及び１つのＸＴＥＮ（２００）；２つのＧＰ及び１つのＸＴＥＮ（２０１）；又は２つのＧＰ、スペーサー配列及び１つのＸＴＥＮ（２０１）；１つのＧＰ及び２つのＸＴＥＮ（２０５）；又は２つのＧＰ及び２つのＸＴＥＮ（２０６）を有するＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする。これらの図において、ポリヌクレオチドは以下の要素をコードし、全ての配列はインフレームで結合される：ＸＴＥＮ（２０２）、ＧＰ（２０３）、及び開裂配列を含む場合のあるスペーサーアミノ酸（２０４）。 図３は、２つの単量体ＧＰＸＴＥＮの例、及びその単量体融合タンパク質の、細胞表面にある標的受容体に結合する能力（その後細胞シグナル伝達を誘導する）を模式的に示す図である。図３Ａは、ＧＰ（１０３）及びＸＴＥＮ（１０２）からなるＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１００）、及び２つのＸＴＥＮ（１０５）に結合しているＧＰからなる第二のＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０５）を示す。図３Ｂは、Ｃ末端にＧＰを有するＧＰＸＴＥＮ（１００）及びＣ末端にＸＴＥＮを有するＧＰＸＴＥＮ（１０５）と、細胞表面（１０７）上の標的受容体（１０８）との間の相互作用を示す。この例において、ＧＰが何も結合していない（フリーの）Ｃ末端を有する場合には受容体と高い親和性での結合を示すが、Ｃ末端にＸＴＥＮを有するＧＰＸＴＥＮは受容体としっかりと結合せず、図３Ｃに見られるように解離する。図３Ｄは、高い親和性で結合したＧＰＸＴＥＮ（１００）は受容体（１０６）との結合を維持し、細胞中のエンドソーム（１１０）内に取り込まれていることを示し、これは結合したＧＰの受容体介在性クリアランス及び細胞シグナル伝達の誘発（１０９）（細胞質を点描で色つけすることによって示した）を説明するものである。 図４は、ＸＴＥＮの組み立て、生産及び評価の、代表的な工程を示す模式的なフローチャートである。 図５は、融合タンパク質をコードするＧＰＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の組み立てについての、代表的な工程を示す模式的なフローチャートである。個々のオリゴヌクレオチド５０１を１２アミノ酸（「１２−ｍｅｒ」）のモチーフのような配列モチーフ５０２にアニーリングさせ、これを次にＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ制限酵素部位を有するオリゴ５０３とライゲーションする。所望の長さのＸＴＥＮ遺伝子５０４が得られるまで、ライブラリー由来の配列モチーフを１２−ｍｅｒにさらにアニーリングさせる。ＸＴＥＮ遺伝子をｓｔｕｆｆｅｒベクター中にクローニングする。ベクターは、Ｆｌａｇ配列５０６と、それに続くＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ部位を含むストッパー配列５０７、及びエキセンジン（ｅｘｅｎｄｉｎ）−４（Ｅｘ４）遺伝子５０８をコードし、その結果ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子５００が得られる。 図６は、生物学的に活性なタンパク質（ＧＰ）及びＸＴＥＮを含む融合タンパク質をコードする遺伝子の組み立て、その発現及び融合タンパク質としての回収、並びに候補ＧＰＸＴＥＮ産物としての評価における、代表的な工程を示す模式的なフローチャートである。 図７は、異なる処理方法を用いた、Ｅｘ４ＸＴＥＮ発現ベクターの設計を示す模式図である。図７Ａは、生物学的に活性なタンパク質Ｅｘ４をコードする配列とその３’末端に融合させたＸＴＥＮをコードする発現ベクターの例を示す。ここで留意すべき点は、このベクターにはさらなるリーダー配列を必要としないことである。図７Ｂは、ＣＢＤリーダー配列及びＴＥＶプロテアーゼ部位を有し、Ｅｘ４をコードする配列の５’末端に融合させたＸＴＥＮをコードする発現ベクターを図示している。図７ＣはＣＢＤ及びＴＥＶプロセッシング部位を最適化したＮ末端リーダー配列（ＮＴＳ）に置き換えた以外は図７Ｂと同様の発現ベクターを図示する。図７Ｄは、ＮＴＳ配列、ＸＴＥＮ、Ｅｘ４をコードする配列、及びさらに第二のＸＴＥＮをコードする配列をコードする発現ベクターを図示している。 図８は、実施例１８に記載した、Ｎ末端ＸＴＥＮをコードする配列、それに結合したエキセジン−４（Ｅｘ４）をコードする配列に、及びその下流、ＸＴＥＮのＣ末端に１４４又は２８８ＸＴＥＮのいずれかをコードする配列を結合させたＧＰＸＴＥＮ遺伝子の、工程毎の構築を示す模式図である。 図９は、図の横軸に示した、ＧＦＰ及びＸＴＥＮ配列を含む構築物の発現アッセイの結果を示す。存在するＧＦＰレポーターの量を決定するために、発現培養を蛍光プレートリーダーを用いて（励起３９５ｎｍ、放射５１０ｎｍ）アッセイした。箱髭図でグラフ化したように、結果は、発現レベルの中央値は、「基準」であるＣＢＤＮ末端ヘルパードメインの発現と比較しておよそ半分の発現レベルであるが、ライブラリー由来の最も良いクローンの発現レベルは基準にかなりより近いことを示し、このことはそれらの配列周辺のさらなる最適化の根拠となる。結果はまた、ＭＡアミノ酸から始まるライブラリーはＭＥから始まるものよりもよい発現レベルを有したことを示す（実施例１４を参照のこと）。 図１０は、実施例１５に記載するように、ＬＣＷ５４６、ＬＣＷ５４７及びＬＣＷ５５２由来のクローンのＮ末端の３番目及び４番目のコドンのために用いた、３種類のランダム化ライブラリーを示す。図に示したようにこのライブラリーは、３番目及び４番目の残基について、それらの位置でＸＴＥＮコドンの全ての可能な組み合わせをとるように、これら残基を変更することにより設計された。各ライブラリーについて全ての可能なＸＴＥＮコドンを含めるために、３番目及び４番目の残基がそれぞれ異なるコドンを有する１２アミノ酸をコードする９対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングさせ、そしてＮｄｅＩ／ＢｓａＩ制限酵素部位で切断したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０５５１（Ｓｔｕｆｆｅｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）にライゲーションし、及び大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換して、３種類のライブラリーであるＬＣＷ０５６９、ＬＣＷ０５７０、及びＬＣＷ０５７１からのコロニーを得た。 図１１は、実施例１５に記載した、最適化工程を行った後に再試験した上位７５クローンの、基準であるＣＢＤ＿ＡＭ８７５構築物に対するＧＦＰ蛍光シグナルについての結果を示すヒストグラムである。結果は、最適化後、いくつかのクローンが基準よりも優れていたことを示す。 図１２は、実施例１６に記載した、Ｎ末端４８アミノ酸の２つの領域の好ましいコドン最適化の組み合わせを見いだすために用いた、コンビナトリアル手法の模式図である。この手法により、ＸＴＥＮがＧＰのＮ末端にあるＸＴＥＮタンパク質の発現についての解決策となり得るリーダー配列をもたらした発現の最適化の評価のためにＸＴＥＮタンパク質のＮ末端において新規の４８ｍｅｒを作出した。 図１３は、ＸＴＥＮのＮ末端のコドンを最適化した実験により得られた好ましいクローンの発現を、構築物配列のＮ末端にＣＢＤリーダー配列を含む基準となるＸＴＥＮクローンと比較して確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルを示す。 図１４は、ＧＦＰのＮ末端にＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を融合させた融合タンパク質の安定性試験からの、試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す（実施例２４を参照のこと）。ＧＦＰ−ＸＴＥＮを、カニクイザルの血漿及びラット腎臓溶解物中で、３７℃で最長７日までインキュベートした。さらに、ＧＦＰ−ＸＴＥＮをカニクイザルに投与した場合についてもまた評価した。試料を０、１及び７日目に採取し、そしてＳＤＳ ＰＡＧＥにより解析し、その後ウェスタン解析及びＧＦＰに対する抗体を用いた検出により検出した。 図１５は、分子量標準と比較して、さまざまな長さのＸＴＥＮ、即ち、Ｙ２８８、Ｙ１４４、Ｙ７２及びＹ３６に融合したグルカゴンの発現を確認するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。 図１６は、実施例２２に記載したように、既知の分子量を有するタンパク質を用いて測定した、グルカゴン−ＸＴＥＮ構築物試料のサイズ排除クロマトグラフィー解析の結果を示す。グラフは吸収対保持容量として表した。グルカゴン−ＸＴＥＮ構築物は、１）グルカゴン−Ｙ２８８；２）グルカゴンＹ−１４４；３）グルカゴン−Ｙ７２；及び４）グルカゴン−Ｙ３６である。結果は、ＸＴＥＮ部分の長さが長くなるほど、見かけの分子量も増えることを示す。 図１７は、カニクイザルに皮下及び静脈内経路によって投与した（実験の詳細については実施例２７を参照）、ＧＰＸＴＥＮ ＥＸ４−ＡＥ８６４の薬物動態学的結果を示す。 図１８は、Ｅｘ４−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４へのヒトの反応を、実施例２８に記載の、４種類の動物、すなわちマウス、ラット、カニクイザル、及びイヌにおける測定結果に基づいて予測した、異種間物差し法（ａｌｌｏｍｅｔｒｉｃ ｓｃａｌｉｎｇ）の結果を示す。図１８Ａは、測定した終末相半減期対体重を示し、ヒトでのＴ１／２は１３９時間と予測された。図１８Ｂは、測定した薬剤クリアランス対体重を示し、ヒトでのクリアランス率は３０ｍｌ／時間と予測された。図１８Ｃは、測定した体積分布対体重を示し、ヒトでの値は５，９７０ｍｌと予測された。 図１９は、Ｇｃｇ−ＸＴＥＮの生物物理学的特徴及び安定性の試験結果を示す（実験の詳細については実施例２１を参照）。図１９Ａは、精製したタンパク質生成物（レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。分子量マーカーは、左側にラベルされた該当するサイズマーカーと共に、レーン１に示されている。分子の真の分子量は１６，３０５ダルトンであることに注意されたい（質量分析法により確認、図示せず）。球状タンパク質スタンダードに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるゆっくりの移行は、一次アミノ酸組成の違いによるＸＴＥＮ融合タンパク質の典型的なものである。図１９Ｂは、非修飾グルカゴンとＧｃｇ−ＸＴＥＮの有効性を比較した、グルカゴン受容体（ＧｃｇＲ）Ｃａ２＋フラックス分析の結果を示す。各曲線当てはめについてのＥＣ５０の算出値を示す。図１９Ｃは、逆相Ｃ１８ ＨＰＬＣ分析の結果を示す。図１９Ｄは、精製されたＧｓｇ−ＸＴＥＮ構造の生成時におけるサイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ分析の結果を示す。図１９Ｅは、逆相Ｃ１８ ＨＰＬＣ分析の結果を示す。図１９Ｆは、８０℃、２〜８℃又は２５℃のいずれかでの６ヶ月の貯蔵後の、Ｇｃｇ−ＸＴＥＮのサイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ分析の結果を示し、３つの曲線すべては実質的に重畳している。 図２０は、グルカゴン又はＧｃｇ−ＸＴＥＮを投与した犬における薬理学研究の結果を示す（実験の詳細については、実施例２９を参照）。グルカゴン（図２０Ａ）又はＧｃｇ−ＸＴＥＮ（図２０Ｂ）は、空腹時のビーグル犬（各群ｎ＝４）に。それぞれ１４又は１２ｎｍ／ｋｇ投与し、図２０Ｃに示したように、血糖値は、プラセボの注射と比較して監視した。プラセボ、Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ、又はグルカゴン（Ｇｄｇ）注入後の最初の1時間についての、注入前のベースラインに対する曲線下の血糖面積の差を示す（各群ｎ＝４〜８動物個体）。各群の投与量レベルを示す。 図２１は、Ｇｃｇ−ＸＴＥＮが、イヌにおけるインスリン誘発低血糖に時間的に制御された抵抗性を付与するかどうかをテストするために、グルカゴン又はＧｃｇ−ＸＴＥＮを投与し、インスリンについて抗原投与したイヌにおける薬力学試験の結果を示す（実験の詳細については実施例３０を参照）。ビーグル犬には、実験開始３時間前にエサを与え、その後は絶食とした。時間＝０において、動物は、０．６ｎｍｏｌ／ｋｇのＧｃｇ−ＸＴＥＮ又はプラセボ（開いている矢印）のいずれかを投与した。動物（各群ｎ＝４）に、６時間のいずれかで（図２１Ａ）（実線の矢印で示す）、又は最初の投与から１２時間で（図２１Ｂ）（実線の矢印で示す）低血糖を誘発するために、０．０５Ｕ／ｋｇのインスリンを抗原投与した。図２１Ｃには、投与量の管理と実験の実験計画に対応することを目的とした、ヒトへ投与するための、食餌、睡眠、覚醒のサイクルについての仮想的なタイムラインを示す。 図２２は、カニクイザルにおける空腹時の終了後に血糖値の上昇を抑制するための、化合物の能力を試験するためにグルカゴン又はGｃｇ−XTEN_Y288（構造１）を投薬した、薬力学的実験の結果を示す（実験の詳細については、実施例３１を参照）。図２２Ａ〜Ｃは、３匹の各カニクイザルについてのプラセボ又はＧｃｇ−ＸＴＥＮ２８８投与後の、血糖プロファイルのオーバーレイプロットを示す。実線の矢印は、食物が動物に戻された時間を指し示す（T=６時間）。 図２３は、マウスの食餌誘導性肥満モデルにおいて、２つのＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質の組み合わせ、即ち、Ｙ２８８に結合したグルカゴン（Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ）及びＡＥ８６４に結合したエキセンジン４（Ｅｘ４−ＸＴＥＮ）を使用した、その組み合わせを有効性について評価するための、薬力学的及び代謝研究からの体重の結果を示す（実験の詳細は実施例２６を参照）。グラフは、28日間連続薬剤投与の経過にわたる、食餌誘導性肥満マウスの体重の変化を示す。示された値は、群ごとの１０動物個体について、平均＋／−標準誤差である（プラセボ群において、２０動物個体）。 図２４は、マウスの食餌誘導性肥満モデルにおける、２つのＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質、即ち、Ｙ２８８に結合したグルカゴン（Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ）及びＡＥ８６４に結合したエキセンジン４（Ｅｘ４−ＸＴＥＮ）を単一で及び組み合わせて使用する、薬力学的及び代謝研究から空腹時血糖値の変化を示す（実験の詳細は実施例２６を参照）。群は、以下の通り；群１ トリスビヒクル、群２ Ｅｘ４−ＡＥ５７６，１０ｍｇ／ｋｇ、群３ Ｅｘ４−ＡＥ５７６，２０ｍｇ／ｋｇ、群４ ビヒクル，５０％ＤＭＳＯ、群５ エクセナチド ３０μｇ／ｋｇ／日、群６ エクセナチド ３０μｇ／ｋｇ／日＋Ｇｃｇ−Ｙ２８８ ２０μｇ／ｋｇ、群７ Ｇｃｇ−Ｙ２８８ ２０μｇ／ｋｇ、群８ Ｇｃｇ−Ｙ２８８ ４０μｇ／ｋｇ、群９ Ｅｘ４−ＡＥ５７６ １０ｍｇ／ｋｇ＋Ｇｃｇ−Ｙ２８８ ２０μｇ／ｋｇ、群１０ Ｇｃｇ−Ｙ２８８ ４０μｇ／ｋｇ＋Ｅｘ４−ＡＥ５７６ ２０ｍｇ／ｋｇ。グラフは、マウスの食餌誘導性肥満モデルにおける、28日間連続薬剤投与の経過にわたる、空腹時血糖値の変化を示す。示された値は、群ごとの１０動物個体について、平均＋／−標準誤差である（プラセボ群において、２０動物個体）。 図２５は、マウスの食餌誘導性肥満モデルにおける、8日間連続のＧｓｇ−ＸＴＥＮ及びエキセンジン４の薬剤の単独又は組み合わせのいずれかの投与の経過にわたる、トリグリセリドとコレステロールの値を示す（実験の詳細は実施例２６を参照）。示された値は、群ごとの１０動物個体について、平均＋／−標準誤差である。 図２６は、実施例２３で説明したように、皮下又は静脈内に投与した、ＸＴＥＮに結合したＧＦＰの異なった組成を有するＸＴＥＮの長さの効果を試験する、カニクイザルにおける薬物動態試験の結果を示す。組成は、ＧＦＰ−Ｌ２８８、ＧＦＰ−Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＡＦ５７６、ＧＦＰ−Ｙ５７６及びＡＤ８３６−ＧＦＰである。結果は、投与後の血漿中濃度対時間（時間）として表示する。 図２７は、実施例３４において記載されているように実施された、ＥＸ４−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の近紫外円二色性スペクトルを示す。 図２８は、実施例３２に記載されているように、カニクイザルに投与されたグルカゴンＸＴＥＮの融合タンパク質の経時的血中濃度の結果を示す。投与されたＧＰＸＴＥＮは、グルカゴン−Ｙ２８８、グルカゴン−Ｙ１４４、及びグルカゴン−Ｙ７２であった。グルカゴン−Ｙ１４４投与からの結果は、０〜６時間に渡る、血中濃度の３倍未満の変動を示し、１０〜１２時間で、Ｃｍａｘからの１０倍の閾値未満に血中濃度が減少した。 図２９は、陰性対照として未処理の細胞（閉じた菱形）を用いて（実験の詳細は、実施例３５を参照）、２つの市販のソースからのエキセンジン４（閉じた三角形）と、Ｙ２８８に結合したエキセンジン４（閉じた四角形）とを比較した、ＧＬＰ−１活性のｉｎ ｖｉｖｏでの細胞アッセイの結果を示す。
（発明の詳細）
本発明の実施形態を記載する前に、それらの実施形態は例示のためだけに提供されたものであり、本発明の実施においては、本明細書に記載した本発明の実施形態に様々な変更を加えたものを用いることができることを理解されたい。本発明から逸脱することなく、当業者はここで数多くの変異、変更及び置換を生じるだろう。
別段の指定のない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験においては、本明細書に記載したものと同様又は等価な方法及び材料を使用することができるが、以下に好適な方法及び材料を記載する。矛盾が生じる場合には、定義を含め、本特許明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び実施例は例示のためだけのものであり、本発明を限定することを意図しない。本発明から逸脱することなく、当業者はここで数多くの変異、変更及び置換を生じるだろう。
（定義）
本明細書で使用する場合、以下の用語は、特段の指定のない限り、それらに割り当てられた意味を有する。
本明細書及び請求項で使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明かでない限り、複数の形態を含む。例えば、用語「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」は、その混合物を含む、複数の細胞を含む。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は本明細書においては同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。ポリマーは直鎖であっても分岐していてもよく、修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、そして非アミノ酸により中断されていてもよい。この用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化により、又は任意のその他の操作（標識要素の結合のような）により、修飾を受けたアミノ酸ポリマーをもまた包含する。
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、グリシン及び、Ｄ又はＬ両方の光学異性体、及びアミノ酸アナログ及びペプチド模倣薬を含むがこれらには限定されない、天然の及び／又は非天然の又は合成のアミノ酸を指す。アミノ酸を表すために、標準的な１文字又は３文字コードが使用される。
用語「天然のＬ−アミノ酸」は、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、及びトレオニン（Ｔ）のＬ型の光学異性体を意味する。
配列に関し、かつ、本明細書で使用する場合、用語「天然に生じない」は、哺乳類で見られる野生型又は天然に生じる配列に対応するものをもたない、相補的でない、又は高い相同性をもたない、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、天然に生じないポリペプチドは、適切にアライメントした場合に、天然の配列と比較して、９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％又はそれ未満のアミノ酸配列同一性しか有し得ない。
用語「親水性」及び「疎水性」は、ある物質が水に対して有する、親和性の度合いを指す。親水性の物質は水に高い親和性を有し、水に溶解しやすく、混合されやすく、又は湿水しやすいが、疎水性の物質は水への親和性を実質的に欠き、水をはじきやすく、及び水を吸収しにくく、及び水に溶解、混合又は湿水しない傾向にある。アミノ酸を、その疎水性にもとづいて特徴付けることができる。数多くの尺度が開発されている。尺度の一例には、Ｌｅｖｉｔｔ， Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （１９７６） １０４：５９により開発されたものがあり、これは、Ｈｏｐｐ， ＴＰ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ （１９８１） ７８：３８２４に挙げられている。「親水性アミノ酸」の例には、アルギニン、リジン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられる。特に目的となる親水性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びセリン、及びグリシンである。「疎水性アミノ酸」の例としては、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、及びバリンが挙げられる。
「断片」は、治療用及び／又は生理活性を少なくとも部分的に保持する天然の生物学的に活性なタンパク質の切断型形態である。「変異型」は、生物学的に活性なタンパク質の、治療用及び／又は生理活性を少なくとも部分的に保持する、天然の生物学的に活性なタンパク質との配列同一性を有するタンパク質である。例えば、変異型タンパク質は、基準となる生物学的に活性なタンパク質と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する可能性がある。本明細書で使用する場合、用語「生物学的に活性なタンパク質部分」は、例えば部位特異的突然変異生成、若しくは挿入により故意に、又は突然変異生成を介して偶然に修飾されたタンパク質を含む。
「宿主細胞」は、目的のベクターの提供源となり得る、又は提供源である個々の細胞又は細胞培養を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の後代を含む。後代は、天然の、偶然の、又は故意の変異生成により、元の親細胞とは（形態学的に又は相補的な総ＤＮＡのゲノムに関して）完全に同一でなくてもよい。宿主細胞には、本発明のベクターを用いてｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクションした細胞が含まれる。
本明細書において開示した様々なポリペプチドを記載するために使用される「単離した」は、その天然の環境の構成要素から、同定され、かつ、単離され、及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その天然の環境から混入する物質（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）は通常、そのポリペプチドの診断的又は治療用の使用を干渉し得る物質であり、酵素、ホルモン、及びその他のタンパク様及び非タンパク様溶質を含む場合がある。当業者には明らかなように、天然に生じないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はその断片は、その天然に生じる対応物から区別するための「単離」を必要としない。加えて、「濃縮した」、「単離した」又は「希釈した」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はその断片は、その体積当たりの濃度又は分子数が通常、天然に生じる対応物のものよりも高いことから、その天然に生じる対応物からの区別が可能である。一般的には、組換え技術によって作出され、宿主細胞中で発現させたポリペプチドを「単離した」と見なす。
「単離した」ポリヌクレオチド又はポリペプチドをコードする核酸又はその他のポリペプチドをコードする核酸は、同定され、そしてそのポリペプチドをコードする核酸の天然の環境で通常付随している少なくとも１つの混入核酸分子から単離された、核酸分子である。単離したポリペプチドをコードする核酸分子は、天然において見られる形態又は状態ではないものである。単離したポリペプチドをコードする核酸分子はそのため、天然の細胞中に存在している特定のポリペプチドをコードする核酸分子から区別することができる。しかしながら、単離したポリペプチドをコードする核酸分子は、例えば天然の細胞のものとは異なり、核酸分子が染色体又は染色体外に局在する場合、通常はポリペプチドを発現している細胞中に含まれるポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
「キメラ」タンパク質は、その配列中に、天然に生じる場合とは異なる位置に領域を含む、少なくとも１つの融合ポリペプチドを含む。この領域は、通常は別のタンパク質中に存在し得るものであり、融合ポリペプチド中で１つにまとめられたものであるか、又はそれらは通常同じタンパク質中に存在し得るものであるが、融合ポリペプチド中で新しい位置に配置されたものである。キメラタンパク質は、例えば、化学的な合成、又は、所望される関係においてペプチド領域をコードしたポリヌクレオチドの作出及び翻訳、により作出され得る。
本明細書においては、「共役した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」、「結合した（ｌｉｎｋｅｄ）」、「融合した」、及び「融合」は、同じ意味で用いられる。これらの用語は、２つ以上の化学的要素又は構成要素を、化学的結合又は組換え技術を含む何らかの手段によって、接続することを指す。例えば、その配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーター又はエンハンサーはコード配列に操作可能に結合される。一般に、「操作可能に結合した」は、結合したＤＮＡ配列が連続していること、及び転写段階にあること、又はインフレームで結合していることを意味する。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正しい読み枠を維持する方法で、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を連続したより長いＯＲＦになるように接続することを指す。従って、得られる組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによりコードされるポリペプチドに相当する、２つ以上のセグメント（このセグメントは通常天然では接続されない）を含む、１つのタンパク質である。
ポリペプチドに関連した「直線（ｌｉｎｅａｒ）配列」又は「配列」は、配列中の互いに隣接した残基が連続しているポリペプチドの一次構造における、ポリペプチド中のアミノ酸の、アミノ末端からカルボキシ末端方向への順番である。「部分配列」は、１又は両方向にさらに残基を含んでいることが分かっているポリペプチドの、部分的な直線配列である。
「異種」は、比較される他の実体に由来し、その実体とは遺伝子型で区別できるものを意味する。例えば、グリシン富有配列をその天然のコード配列から除去し、そして天然の配列以外のコード配列に操作可能に結合したものが、異種グリシン富有配列である。ポリヌクレオチド又はポリペプチドに用いられる用語「異種」は、比較される他の実体に由来し、遺伝子型で区別できる、実体からのポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は同じ意味で用いられる。それらは、任意の長さの多量体型ヌクレオチド、又はデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はそのアナログを指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造をとっていてもよく、既知又は未知のいずれの機能を有していても良い。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子又は遺伝子断片のコード又は非コード領域、連鎖解析から定義された遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離したＤＮＡ、任意の配列の単離したＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログのような、修飾を受けたヌクレオチドを含んでいてもよい。修飾がある場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの構成の前又は後に付与され得る。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチドの構成要素により、分断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、標識用構成要素の結合のように、重合の後にさらに修飾を受ける場合もある。
「ポリヌクレオチドの相補体」という用語は、参照配列と比較して、相補配列と逆方向性を有し、完全な忠実度で参照配列とハイブリダイズし得る、ポリヌクレオチド分子を意味する。
ポリヌクレオチドに用いられる「組換え」は、そのポリヌクレオチドが、宿主細胞中で発現することが可能な構築物を生じる、インビトロクローニング、制限酵素消化及び／又はライゲーション工程、及びその他の過程の、様々な組み合わせによる産物であることを意味する。
本明細書において、「遺伝子」又は「遺伝子断片」という用語は同じ意味で用いられる。それらは、転写され翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることができる、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子又は遺伝子断片はそのポリヌクレオチドが少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む限り、ゲノムであっても又はｃＤＮＡであってもよく、コード領域全体を含むものであっても又はそのセグメントを含むものであってもよい。「融合遺伝子」は、１つにまとめて結合された少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子である。
「相同性」又は「相同」は、配列の類似性又は２つ以上のポリヌクレオチド配列又は２つ以上のポリペプチド配列間での互換可能性を指す。２つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性、類似性又は相同性を決定するために、ＢｅｓｔＦｉｔのようなプログラムを用いる場合には、予め決められた設定を用いることができ、又は同一性、類似性又は相同性スコアを最適化するために、ｂｌｏｓｕｍ４５又はｂｌｏｓｕｍ８０のような適切な採点マトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）を選択することができる。好ましくは、本明細書において相同なポリヌクレオチドとは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと定義され、それらの配列と少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は９５％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
「ライゲーション」は、２つの核酸断片又は遺伝子間で、それらを結合するホスホジエステル結合を形成させる工程を指す。ＤＮＡ断片又は遺伝子を１つにライゲーションさせるためには、ＤＮＡの末端は互いに適合（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）していなくてはならない。場合によっては、エンドヌクレアーゼによる消化の後、末端はそのままでも適合するだろう。しかしながら、通常エンドヌクレアーゼによる消化の後には突出末端が形成されるため、最初に、ライゲーションに適合する平滑末端にするための変換が必要となる場合がある。
用語「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ポリヌクレオチドが、検出可能な程度にその他の配列よりも強く（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍より強く）その標的配列にハイブリダイズするであろう条件への言及を含む。一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、部分的には、洗浄工程が行われる温度及び塩濃度で表される。典型的には、ストリンジェント条件は、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満、一般的にはｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン（又はその他の塩）濃度であり、かつ、短いポリヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については温度が少なくとも約３０℃、長いポリヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については温度が少なくとも約６０℃の条件であり、例えば、「ストリンジェント条件」は５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ／１％ ＳＤＳ、６０℃〜６５℃での３回の洗浄、各回につき１５分、を含むことができる。あるいは、約６５℃、６０℃、５５℃、又は４２℃の温度を用いることもできる。ＳＤＳの濃度が約０．１％である場合、ＳＳＣの濃度は約０．１〜２×ＳＳＣまでと多様である。そのような洗浄温度は通常、決められたイオン強度及びｐＨでの特定の配列の熱融点（ｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）よりも約５℃〜２０℃低い温度に設定される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に一致したプローブとハイブリダイズする温度（決められたイオン強度及びｐＨ条件下で）である。Ｔｍ及び核酸ハイブリダイゼーション条件を計算するための式は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ， ２ｎｄ ｅｄ．， ｖｏｌ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ Ｎ．Ｙ．；に見ることができる（特に第２巻の９章を参照のこと）。典型的に、ブロッキング試薬が非特異的なハイブリダイゼーションを阻害するために用いられる。そのようなブロッキング試薬は例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの、断片化し、変性させたサケ精子ＤＮＡを含む。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションのような特定の状況では、約３５〜５０％ｖ／ｖ濃度のホルムアミドのような有機溶媒もまた使用される場合がある。当業者は、これら洗浄条件の有用な変異型を容易に理解できるであろう。
ポリヌクレオチド配列に用いられる、「同一性パーセント」及び「同一性％」という用語は標準的なアルゴリズムを用いてアライメントした少なくとも２つのポリヌクレオチド配列間の、一致する残基のパーセンテージを指す。そのようなアルゴリズムは、２つの配列間のアライメントを最適化するために、標準的な及び再現できる方法により、比較する配列中にギャップを挿入する場合があり、その結果２つの配列間でのより有意義な比較が達成される。同一性パーセントは、例えば、特定の配列ＩＤ番号によって定義されるように、定義したポリヌクレオチド配列の全長について測定することができ、又は、より短い長さ（例えばより長い、定義されたポリヌクレオチド配列から得られた断片について、例えば少なくとも４５、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２１０又は少なくとも４５０個の連続した残基の断片）について測定することができる。これらの長さは例示のためだけのものであり、本明細書、表、図、又は配列表により支持されるいずれの長さの断片も、その同一性パーセントを測定する場合の長さを記載するために用いられ得ると見なされる。
本明細書において同定したポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントした後に（最大のパーセント配列同一性を達成するために、必要な場合にはギャップを挿入し、かつ、いずれの保守的置換は配列同一性の一部としては考慮しない）、第二の、基準となるポリペプチド配列又はその一部のアミノ酸残基と同一な、クエリー配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを目的としたアライメントは、当該分野における様々な技術、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような、公的に使用可能なコンピューターソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較する完全長配列について最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメント測定のための適切なパラメータを決定することができる。同一性パーセントを、例えば、特定の配列ＩＤ番号によって定義されるように、定義したポリペプチド配列全長について測定してもよく、又は、より短い長さ（例えばより長い、定義されたポリヌクレオチド配列から得られた断片の長さについて、例えば少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０又は少なくとも１５０個の連続した残基の断片）について測定することができる。これらの長さは例示のためだけのものであり、本明細書、表、図、又は配列表により支持されるいずれの長さの断片も、その同一性パーセントを測定する場合の長さを記載するために用いられ得ると見なされる。
本明細書で使用する場合、ポリペプチドに関する「非反復性」という用語は、ペプチド又はポリペプチド配列において内部相同性が無いこと又はそれが限られていることを指す。「実質的に非反復性」という用語は、例えば、その配列中に、同一のアミノ酸型が４つ連続したアミノ酸の例がほとんど若しくは全くない、又はポリペプチドが１０以下の部分列スコア（以下で定義する）を有すること、又はＮからＣ末端の向きで、ポリペプチド配列を構成する配列モチーフのパターンがないこと、を意味し得る。本明細書で使用する場合、ポリペプチドに関する「反復性」という用語は、ペプチド又はポリペプチド配列における内部相同性の度合いを指す。対照的に、「反復性」配列は、短いアミノ酸配列の複数の同一コピーを含み得る。例えば、目的のポリペプチド配列はｎ−ｍｅｒの配列に分断してもよく、それにより同一配列の数を測定することができる。高度に反復性の配列は、配列が同一な部分が大きいが、非反復配列はほとんど同一の配列を含まない。ポリペプチドに関して配列は、決められた若しくは様々な長さのより短い配列のコピー、又は、モチーフそれ自体が非反復性配列を有し、完全長ポリペプチドを実質的に非反復性にする、モチーフを含む場合がある。非反復性が測定されるポリペプチドの長さは、３アミノ酸〜約２００アミノ酸、約６〜約５０アミノ酸、又は約９〜約１４アミノ酸と多様になり得る。ポリヌクレオチド配列に関して用いられる「反復性」は、配列における内部相同性の度合い、例えば指定された長さの同一のヌクレオチド配列の頻度を指す。反復性は、例えば、同一配列の頻度を解析することにより測定することができる。
「ベクター」は核酸分子であり、挿入された核酸分子を宿主細胞中に及び／又は宿主細胞間で移送する適切な宿主中において、好ましくは自己複製するものである。この用語は、主にＤＮＡ又はＲＮＡを細胞中に挿入することにおいて機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製に主に機能するベクターの複製、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳に機能する発現ベクターを含む。上述の機能のうちの１つ以上を提供するベクターもまた含まれる。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入した場合に、ポリペプチド内で転写及び翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」は一般に、目的の発現産物を得るために機能させることができる、発現ベクターを含む好適な宿主細胞を意味する。
ポリペプチドに関する「血清分解抵抗性」は、通常血清又は血漿中にプロテアーゼを含む、血液及びその成分による分解に、ポリペプチドが耐える能力を指す。血清分解抵抗性は、そのタンパク質をヒト（又は必要に応じてマウス、ラット、サル）の血清又は血漿と、通常ある範囲の期間（例えば０．２５、０．５、１、２、４、８、１６日間）、通常約３７℃で混合することにより、測定することができる。これらの時点での試料をウェスタンブロット解析により解析することができ、抗体を用いてタンパク質を検出する。抗体はタンパク質中にタグを含むものであってもよい。ウェスタンブロット解析において、タンパク質が注入したタンパク質と同じサイズの単一のバンドを示す場合、タンパク質の分解は起きなかったこととなる。この例となる方法では、ウェスタンブロット解析又は同等の技術によって判断して、タンパク質の５０％が分解した時点が血清分解半減期又はそのタンパク質の「血清半減期」である。
本明細書で使用する場合、「ｔ１／２」という用語は、ｌｎ（２）／Ｋｅｌとして計算される、終末相半減期を意味する。Ｋｅｌは、ログ濃度対時間曲線の終末相の線形部分の線形回帰により計算される、終末相の消失速度定数である。半減期は通常、生物中に蓄積された、投与された物質の半分量が代謝される、又は正常な生物学的プロセスによって排出されるために必要な時間を指す。本明細書において、「ｔ１／２」、「終末相半減期」、「排出半減期」及び「血中半減期」という用語は、同じ意味で用いられる。
「見かけの分子量係数」又は「見かけの分子量」は、特定のアミノ酸配列が示す見かけの分子量の相対的な増加又は減少の測定に関する、関連した用語である。見かけの分子量は、基準となる球状タンパク質との比較を行うサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び類似の方法により決定され、「見かけのｋＤ」単位で表される。見かけの分子量係数は、見かけの分子量と実際の分子量との間の率の因子であり、実際の分子量はアミノ酸組成物に基づいて、組成物中の各アミノ酸型について算出した分子量を総和することにより予測される。
「流体力学半径」又は「ストークス半径」は、溶液中の分子の、それが溶液中を移動している物体であり、溶液の粘性によって妨害されると仮定することにより測定される有効半径（Ｒｈ、ｎｍ単位）である。本発明の実施形態において、ＸＴＥＮ融合タンパク質の流体力学半径の測定は、より直観的測定である「見かけの分子量係数」と相関がある。タンパク質の「流体力学半径」は、その水溶液中での拡散率、並びに高分子でできたゲル中を移動するその能力に影響を及ぼす。タンパク質の流体力学半径は、その分子量、並びに形状及び稠密度を含むその構造により決定される。米国特許第６，４０６，６３２号及び同第７，２９４，５１３号に記載されるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用のような、流体力学半径の決定方法は当該分野において周知である。大部分のタンパク質は、最もコンパクトなタンパク質の三次元構造であり、最も小さい流体力学半径をとることができる、球状構造を有する。いくつかのタンパク質は、ランダムでかつ開かれた、非構造性の、又は線形構造をとり、その結果、一般的な同様の分子量をもつ球状タンパク質に比べて大きな流体力学半径を有する。
「生理学的な条件」は、温度、塩濃度、ｐＨを含む、生物対象の条件に類似した生物宿主中の一連の条件、並びに、インビトロでの条件を指す。インビトロアッセイで使用するための多数の生理学的に適切な条件が確立されている。一般に、生理学的な緩衝液は、生理学的な濃度の塩を含み、約６．５〜約７．８の範囲の中性のｐＨ、好ましくは約７．０〜約７．５、に調整される。様々な生理学的な緩衝液がＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）中に挙げられている。生理的な温度の範囲は約２５℃〜約３８℃、好ましくは約３５℃〜約３７℃である。
「反応基」は、第二の反応基に結合することができる化学構造である。反応基の例としては、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アジド基が挙げられる。いくつかの反応基は、第二の反応基との結合が促進するように活性化させることができる。活性化の例としては、カルボキシル基とカルボジイミドとの反応、カルボキシル基の活性化エステルへの変換、又はカルボキシル基のアジド官能基への変換が挙げられる。
「制御放出型製剤」、「遅延放出型製剤」、「デポ製剤」又は「徐放放出型製剤」は同じ意味で用いられ、その薬剤なしにポリペプチドを投与した場合の放出期間と比較して、本発明のポリペプチドの放出期間を延長することができる薬剤を指す。本発明の様々な実施形態は、様々な放出率を有し得、その結果、様々な治療量がもたらされる。
本明細書において、「抗原」、「標的抗原」又は「免疫原」という用語は同じ意味で用いられ、抗体断片又は抗体断片ベースの治療が結合する又はそれに対して特異性を有する、構造又は結合決定因子を指す。
本明細書で使用する場合、用語「ペイロード」は、低分子薬理作用団の対応物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）である、生物学的な又は治療用活性を有するタンパク質又はペプチド配列を指す。ペイロードの例には、サイトカイン、酵素、ホルモン及び血液及び成長因子が含まれるがこれらには限定されない。ペイロードは、化学治療薬、抗ウイルス性化合物、毒素、又は造影剤のような、遺伝子的に融合させた又は化学的に結合させた部分をさらに含んでもよい。これらの結合部分は、開裂可能又は開裂不可能な可能性のあるリンカーを介してポリペプチドの他の部分に結合させることができる。
本明細書で使用する場合、用語「アンタゴニスト」は、本明細書において開示した天然のポリペプチドの生理活性を、部分的に又は完全に、遮断する、阻害する、又は中和する任意の分子を含む。ポリペプチドのアンタゴニストを特定する方法は、天然のポリペプチドと候補アンタゴニスト分子とを接触させること、及び、通常天然のポリペプチドに関連する、１つ以上の生理活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。本発明に関する説明において、アンタゴニストは、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体又は生物学的に活性なタンパク質の効果を低減させる任意のその他分子を含み得る。
用語「アゴニスト」は、その最も広い意味で用いられ、そして本明細書において開示した天然のポリペプチドの生理活性を模倣する、任意の分子を含む。好適なアゴニスト分子は特に、アゴニスト抗体又は抗体断片、天然のポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子などを含む。天然のポリペプチドのアゴニストを特定する方法は、天然のポリペプチドと候補アゴニスト分子とを接触させること、及び、通常天然のポリペプチドに関連する、１つ以上の生理活性の検出可能な変化を検出することを含む場合がある。
本明細書において目的とする「活性」は、生物学的に活性な対応する天然のタンパク質の作用又は効果と一致する、融合タンパク質の構成要素の作用又は効果を指し、ここで「生理活性」とは、受容体結合、アンタゴニスト活性、アゴニスト活性、又は細胞での若しくは生理学的な反応を含むがこれらには限定されない、インビトロ又はｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的な機能又は効果を指す。
本明細書で使用する場合、「治療（ｔｒｅａｔｅｍｅｎｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「緩和すること（ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）」、または「改善すること（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」は、ここで同義に使用される。これらの用語は、治療利益および／または予防利益を含むが、それらに限定されない、有益な、あるいは望まれる結果を得るための手段を指す。治療利益は、治療している、その原因となる障害の除去あるいは改善を意味する。また、治療利益は、その原因となる障害に伴う生理的症状の１つ以上を除去あるいは改善して、対象が原因となる障害に依然として罹患している可能性があるにもかかわらず、改善が対象において観察されるようにすることにより、達成される。予防利益のためには、特定の疾患の診断が成されていないかもしれないが、その疾患を発症する危険性のある対象、あるいは、ある疾患の診断が成されていないかもしれないが、その疾患の１つ以上の症状を報告している対象に組成物を投与することができる。
本明細書で使用する場合、「治療効果」は、本発明の融合ポリペプチドの能力（生物学的に活性なタンパク質が保有する抗原性エピトープに対する抗体生産を誘導する能力以外の）によって引き起こされる、ヒト若しくはその他の動物における疾患の治癒、軽減、改善、又は予防、そうでなければヒト又は動物の身体的又は精神的な満足度を向上させる生理的な効果を含むがこれらには限定されない効果を指す。治療上有効量の決定は、特に本明細書において提供される詳細な開示を考慮すると、当業者の能力の範囲内である。
本明細書で使用する場合、「治療上有効量」及び「治療上効果的な用量」という用語は、単回又は複数回投与で対象に投与した場合に、単独で又は融合タンパク質組成物の一部分としてのいずれかにおいて、疾患の段階又は状態の任意の症状、態様、測定指標又は特徴に、任意の検出可能な、有益な効果をもたらすことができる、生物学的に活性なタンパク質の量を指す。そのような効果は、有益であるために、絶対的である必要はない。
本明細書で使用する場合、用語「治療上効果的な投与計画」は、単独で又は融合タンパク質組成物の一部分としてのいずれかにおいて投与される、生物学的に活性なタンパク質の連続的な投与用量のスケジュールを指し、ここで用量は、疾患の段階又は状態の任意の症状、態様、測定指標又は特徴に持続的に有益な効果をもたらす治療上の有効量で与えられる。
１）一般的な技術
本発明の実施においては、別段の指定のない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、遺伝学及び組換えＤＮＡの、当該分野において標準的な技術が用いられる。その内容の全体が参照することにより本明細書に組み入れられる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，」３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００１；「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」， Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．，１９８７； ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ．；「ＰＣＲ ２： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」， Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９５； 「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ． 及び Ｌａｎｅ， Ｄ． ｅｄｓ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；「Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，」１１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， ２００５； 及び Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．，「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｓｏｍｅｒｓｅｔ， ＮＪ， ２０００、を参照のこと。
ＩＩ）グルコース調節ペプチド
本発明は部分的には、グルコース調整ペプチド（ＧＰ）を含む、融合タンパク質組成物に関する。このような組成物は、特定の疾患、障害又はグルコースの恒常性に関連する状態、肥満、インスリン耐性、脂質異常症、高血圧、等の治療又は予防に有用性を有し得る。
内分泌及び肥満関連疾患又は障害は、ほとんどの先進国での大流行に達しており、ほとんどの先進国における実質的かつ増大する医療の負担を表し、これは臓器、組織、及び身体の循環系に影響を与える多種多様な条件を含む。特に懸念されるのは、内分泌及び肥満関連疾患や障害である。これらの中で、最も深刻なのは糖尿病であり、米国での死亡の主要な原因の一つである。糖尿病は主要な二つのサブクラスに分かれており、Ｉ型は、若年性糖尿病又はインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）として知られており、ＩＩ型は、成人発症の糖尿病、又は非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）として知られている。Ｉ型糖尿病は、完全に又は部分的にそのような対象におけるインスリンを産生する膵臓の細胞を破壊し、彼らの一生涯外因性インスリンの使用を必要とする自己免疫疾患の形態である。適切に管理された対象であっても、突発性の発作が起こり得、そのうちのいくつかは、生命を脅かす可能性がある。
ＩＩ型糖尿病では、食後血糖値の上昇が適切に膵臓によるインスリン産生を刺激しない。さらに、末梢組織では一般的にインスリンの効果に耐性であり、そしてそのような対象は、多くの場合、身体が、そのインスリン耐性を克服することを試みて、通常の血漿インスリンレベル（高インスリン血症）よりも高くなっている。進行した疾患状態において、インスリン分泌も損なわれる。
インスリン耐性及び高インスリン血症はまた、かなりの健康上のリスクをもたらす二つの代謝性疾患である、耐糖能不全及び代謝性肥満に関連している。耐糖能異常は、食べる前に、通常の血糖値であり、食後に血糖値が上昇（高血糖）する傾向によって特徴付けられる。これらの人々は、糖尿病や冠動脈疾患のリスクが高いと考えられている。肥満はまた、インスリン耐性症候群又は「シンドロームＸ」と呼ばれる状態の群についての危険因子であり、高血圧、冠動脈疾患（動脈硬化）、及び乳酸アシドーシス、ならびに関連する疾患状態も同様である。肥満の病因は多因子性であると考えられているが、しかし、根本的な問題は、肥満者において、過剰な脂肪組織が存在するまで、栄養素利用性とエネルギー消費とのバランスが取れていないことである。他の関連する疾患又は障害は、妊娠糖尿病、若年性糖尿病、肥満、過度の食欲、不十分な満腹感、代謝性疾患、グルカゴノーマ、網膜神経変性プロセス、及びI型糖尿病の「蜜月期間」を含むがこれらに限定されない。
脂質異常症は、糖尿病患者の間で頻繁に発生し、典型的に、血液中の上昇した血漿トリグリセリド、低ＨＤＬ（高比重リポタンパク質）コレステロール、正常〜上昇したＬＤＬの上昇（低密度リポタンパク質）コレステロール、小さな高密度のＬＤＬ粒子レベルの上昇に特徴づけられる。脂質異常症は、冠動脈事象と糖尿病患者の死亡の発生率の増加の主な要因である。
グルコースの恒常性における代謝過程及びインスリン反応のほとんどは、複数のペプチドやホルモンによって調節され、そして多くのそのようなペプチドやホルモン、ならびにその類似体は、代謝性疾患及び障害の治療に有用性を見出されている。これらのペプチドの多くは、それらが反対の生物学的機能を有している場合でも、お互いに非常に相同である傾向がある。グルコース増加ペプチドの一例は、ペプチドホルモンのグルカゴンであるが、その一方グルコース降下ペプチドは、エキセンジン４、グルカゴン様ペプチド−１、及びアミリンを含む。しかしながら、治療ペプチド及び／又はホルモンの使用は、小さな分子の薬の使用によって強化した場合であっても、このような疾患、障害及び状態の管理に限定された成功しか収めていない。特に治療ウィンドウの狭い患者についての代謝疾患の治療において、投与量の最適化は、医薬品と生物製剤のために重要である。ホルモン全般、及びグルコースの恒常性において含まれるペプチドは、一般に狭い治療ウィンドウを有する。狭い治療ウィンドウは、このようなホルモンやペプチドは、通常、短い半減期を有し、臨床効果を達成するために頻回の投与が必要であるという事実と相まって、このような患者の管理の難しさという結果になる。ペグ化など治療用タンパク質の化学修飾は、ｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスの速度とその後の血清半減期でそれを変更することができるが、追加の製造工程が必要であり、最終的な生成物が不均質となる。更に、慢性投与による容認できない副作用が報告されている。また、Ｆｃドメインと治療タンパク質又はペプチドとの融合による遺伝子改変は、治療タンパク質のサイズを大きくし、腎臓を介したクリアランス速度を減少させ、ＦｃＲｎ受容体によるリソソームからのリサイクルを促進する。残念ながら、Ｆｃドメインは、組換え発現時に効率的に折り畳まれず、不溶性の封入体と呼ばれる沈殿物を形成する傾向がある。これらの封入体を可溶化する必要があり、機能性タンパク質は再生されなければならず、これは時間のかかる非効率的な、そして高価なプロセスである。
従って、本発明の一態様は、グルコース、インスリン、肥満症、疾患、及び関連した状態（「ペプチド関連疾患、障害又は状態を調節するグルコース」と総称する）の治療に使用することができる組成物を作成するための、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質における、グルコースの恒常性、インスリン耐性及び肥満に関与するペプチド（総称して「グルコース調節ペプチド」）の取り込みである。グルコース調節ペプチドは、グルコースの恒常性の疾患、障害、又は状態、又はインスリン耐性や肥満を予防、治療、調節、又は改善するのに有用な、あらゆる、生物学的、治療上の、又は予防上の利益間又は機能を有するタンパク質を含む。ＸＴＥＮに結合させてＧＰＸＴＥＮを作製することのできる適切なグルコース調節ペプチドは、膵臓のβ細胞によるインスリンのグルコース依存性の分泌を増加させる、又はインスリンの作用を増強させる、又はグルコース恒常性において役割を果たす、すべての生理活性ポリペプチドを含む。グルコース調節ペプチドは、また、膵臓β-細胞におけるプロインスリン遺伝子の転写を刺激するすべての生理活性ポリペプチドを含む。更に、グルコース調節ペプチドはまた、胃排出時間を遅くし、食事量を減らす、すべての生理活性ポリペプチドを含む。グルコース調節ペプチドはまた、ランゲルハンスのα細胞からのグルカゴンの放出を阻害するすべての生理活性ポリペプチドを含む。表１は、本発明のＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質により包含されるグルコース調節ペプチドの配列の非限定的リストを提供する。発明のＧＰＸＴＥＮ組成物のグルコース調節ペプチドは、表１から選択されたタンパク質配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、又は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、１００％の配列同一性を示すペプチドであり得る。
Figure 0005839597
Figure 0005839597
「アミリン」は、米国特許第５，２３４，９０６号公報に記載されているような、アミリン、プラムリンチド呼ばれる、ヒトペプチドホルモン及びその別の種による変形を意味し、少なくとも自然のアミリンの生物活性の一部を有する。アミリンは、栄養素の摂取に反応して膵β細胞によってインスリンと共分泌される３７アミノ酸ポリペプチドホルモンであり（Ｋｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３３９：１１７９−１１８０．１９９２）、グリコーゲンへのグルコースの取り込みを含む炭水化物代謝のいくつかの重要な経路を、調節することが報告されている。本発明のアミリンを含む融合タンパク質は、糖尿病と肥満において、胃排出を調節すること、グルカゴン分泌及び食物摂取量を抑制ｓること、そしてこれにより、循環中のブドウ糖の出現率に影響を与えることにおいて特定の用途を見出し得る。このように、融合タンパク質は、循環からグルコースの消失速度及び末梢組織によるその摂取を調節する、インスリンの作用を補完し得る。アミリン模倣体は、米国特許出願代５，６８６，４１１号、及び第７，２７１，２３５号公報に記載されているように、クローニングされている。アミリンの模倣体は、生物学的活性を保持しているものを作成することができる。例えば、プラムリンチドは、ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＮＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＰＩＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹの配列を有し、そこではラットのアミリンからの配列がヒトアミリン配列中のアミノ酸の代わりに置き換えられている。一実施形態では、本発明は以下の配列を有するアミリンの模倣体を含む融合たんぱく質を企図し、
ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＸ１ＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＸ２ＩＬＸ２Ｘ２ＴＮＶＧＳＮＴＹ
式中、Ｘ１は独立して、Ｎ又はＯであり、Ｘ２は独立して、Ｓ、Ｐ、又はＧである。一実施形態において、ＧＰＸＴＥＮに組み込まれた模倣アミリンは、以下の配列を有する：
ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＮＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＧＩＬＧＧＴＮＶＧＳＮＴＹ。
模倣アミリンがＧＰＸＴＥＮのＣ末端で使用される別の実施形態において、その模倣体は以下の模倣配列を有する：
ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＮＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＧＩＬＧＧＴＮＶＧＳＮＴＹ（ＮＨ２）
「エキセンジン３」は、メキシコドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ ｈｏｒｒｉｄｕｍ）から単離されたグルコース調節ペプチド及び少なくとも、自然のエキセンジン３の生物学的活性部分を有する、その配列変形を意味する。エキセンジン３アミドは、膵臓のｃＡＭＰの増加、及びインスリン及びアミラーゼの放出を媒介する、特定のエキセンジン受容体拮抗因子である。本発明のエキセンジン３含有融合タンパク質は、糖尿病とインスリン耐性障害の治療における特定の用途を見出し得る。そのアッセイのための、配列及び方法は、米国特許第５，４２４，２８６号に記載されている。
「エキセンジン４」は、ヒラモンスターアメリカドクトカゲの唾液に見られる、グルコース調節ペプチド、ならびにその別種および配列変異体を意味し、３９アミノ酸の配列、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ及び相同配列及びペプチド模倣体、及びその変異体、少なくとも自然のエキセンジン４の生物学的活性の一部を有する非天然の霊長類からのような、天然配列を意味する。エキセンジン４は、血糖値を低下させ、インスリン分泌を促進し、胃排出を遅らせ、満腹感を向上させ、食後高血糖の顕著な改善を提供する、インクレチンペプチドホルモンである。エキセンジンは、グルカゴン様ペプチドファミリーの成員に対してある配列類似性を有し、ＧＬＰ−１に対して高い同一性を有する（Ｇｏｋｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６８：１９６５０−５５（１９９３））。様々な相同配列が、自然のエキセンジン４及びＧＬＰ−１に対して機能的に同等であり得る。異なる種からのＧＬＰ−１配列の保存は、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２００１ ９８ ｐ．１−１２．に記載されている。表２は、多様な種からの配列を示し、表３は合成ＧＬＰ−１アナログのリストを示し、それらの全ては、本明細書に記載のＧＰＸＴＥＮにおけるグルコース調製ペプチドの使用のために意図されている。エキセンジン４は、インスリン分泌βＴＣ１条のＧＬＰ−１受容体に結合し、また、ソマトスタチンの放出を刺激し、単離された胃のガストリンの遊離を阻害する（Ｇｏｋｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５０−５５，１９９３）。ＧＬＰ−１の模倣体として、エキセンジン４は、同様な広範囲の生物学的活性を示し、更にＧＬＰ−１よりも長い半減期を有し、２．４時間という平均の末端半減期を有する。エクセナチドは、バイエッタとして販売されている、エキセンジン4の合成版である。しかしながら、その短い半減期のために、エクセナチドは、現在、１日２回投与されており、その有用性を制限する。エキセンジン４を含む本発明の融合タンパク質は、糖尿病とインスリン耐性障害の治療における特定の用途を見出し得る。
「グルカゴン」は、ヒトグルカゴングルコース調節ペプチド、又はそれらの別種および配列変異体を意味し、２９アミノ酸配列及び相同配列、霊長類からのような天然配列、少なくとも自然のエキセンジン４の生物学的活性部分を有する非天然の配列を意味する。本明細書において使用される際、「グルカゴン」という用語はまた、グルカゴンのペプチド模倣体を含む。自然のグルカゴンは膵臓によって生成され、血糖値が下がりすぎ始めると放出され、肝臓が貯蔵されたグリコーゲンをグルコースに変換し、血流へ放出するように促す。グルカゴンの作用は、体内の細胞が血液からグルコースを取り込むように通知を行うインスリンのそれと反対であるが、グルカゴンはまた、インスリンの放出を刺激し、血流中に新たに利用可能なグルコースが取り込まれ、インスリン依存性組織で使用することができる。グルカゴンを含む本発明の融合タンパク質は、現存の肝グリコーゲン貯蔵を有する個々人の血糖値上昇、およびし、グルコース恒常性の維持における特別な使用を見出し得る。グルカゴンは、米国特許第４，８２６，７６３号に開示されているように、クローンされている。
「ＧＬＰ−１」は、ヒトグルカゴン様ペプチド−１及び、自然のＧＬＰ−１の生物学的活性の少なくとも一部を有するその配列の変形を意味する。「ＧＬＰ−１」という用語は、ヒトＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３７）、及びＧＬＰ−１（７−３６）アミドを含む。ＧＬＰ−１は、インスリン分泌を刺激するが、高血糖の期間のみである。インスリンと比較したＧＬＰ−１の安全性は、この特性及び、分泌されたインスリンの量が、高血糖の程度に比例するという観察によって高められる。ＧＬＰ−１（７−１０）ＯＨの生物学的半減期は、わずか３〜５分である（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１１８，６６６）。ＧＬＰ−１を含む本発明の融合タンパク質は、グルコース調節のための糖尿病とインスリン耐性疾患の治療に特定の用途を見出し得る。ＧＬＰ−１は、米国特許第５，１１８，６６６号に記載のように、クローニングされ、誘導体が調製されている。多様な種からのＧＬＰ−１配列の非限定的な例を表２に示し、表３は多数の合成ＧＬＰ−１類似体の配列を示し、それらの全ては、本明細書に記載のＧＰＸＴＥＮ組成物におけるグルコース調節ペプチドとして使用するために企図される。
Figure 0005839597
Figure 0005839597
ＧＬＰの自然配列は、いくつかの配列モチーフによって記載され得、以下に記す。カッコ内の文字は、各配列部分での許容可能なアミノ酸を表す。［ＨＶＹ］［ＡＧＩＳＴＶ］［ＤＥＨＱ］［ＡＧ］［ＩＬＭＰＳＴＶ］［ＦＬＹ］［ＤＩＮＳＴ］［ＡＤＥＫＮＳＴ］［ＡＤＥＮＳＴＶ］［ＬＭＶＹ］［ＡＮＲＳＴＹ］［ＥＨＩＫＮＱＲＳＴ］［ＡＨＩＬＭＱＶＹ］［ＬＭＲＴ］［ＡＤＥＧＫＱＳ］［ＡＤＥＧＫＮＱＳＹ］［ＡＥＩＫＬＭＱＲ］［ＡＫＱＲＳＶＹ］［ＡＩＬＭＱＳＴＶ］［ＧＫＱＲ］［ＤＥＫＬＱＲ］［ＦＨＬＶＷＹ］［ＩＬＶ］［ＡＤＥＧＰＩＫＮＱＲＳＴ］［ＡＤＥＧＮＲＳＴＷ］［ＧＩＬＶＷ］［ＡＩＫＬＭＱＳＶ］［ＡＤＧＩＫＮＱＲＳＴ］［ＧＫＲＳＹ］。更に、ＧＬＰ−１及びプラムリンチドの合成類似体は、グルコース関連疾患の治療において生物学的活性が有用であるＧＰＸＴＥＮを生成するためのＸＴＥＮとの融合パートナーとして有用であり得る。ＧＬＰ−１の合成及びプラムリンチドの配列の非限定的例を、表３に見出すことができる。更に、ＧＬＰ−１、プラムリンチド、ならびにエキセンジン４、アミリン、又はグルカゴンに対して相同の更なる配列は、標準的な相同性検索技術によって見つけることができる。
表３：ＧＬＰ−１及びプラムリンチド合成類似体
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
「ＧＬＰ−２」は、ヒトのグルカゴン様ペプチド−２及び、自然のＧＬＰ−２の生物学的活性の少なくとも一部を有するその配列変異体を意味する。より具体的には、ＧＬＰ−２は、小腸及び大腸の腸内分泌細胞からＧＬＰ−１と一緒に分泌される、３３アミノペプチドである。
ＩＩＩ）グルコース調節ペプチド融合タンパク質組成物
本発明は部分的には、グルコース調節ペプチド（ＧＰ）を具備する融合タンパク質組成物に関する。一態様において本発明は、伸張組換えポリペプチド（「ＸＴＥＮ」）に共有結合した、ＧＰの完全長配列又は配列変異体を含む、ＧＰの単離した単量体融合タンパク質を提供する。以下により詳細に記載するように、融合タンパク質は、プロテアーゼを作用させた場合にＸＴＥＮ配列からＧＰを単離し、融合タンパク質からＧＰを放出するための開裂配列をさらに含むスペーサー配列を任意に含む。
いくつかの態様において本発明は、１つ以上の伸張組換えポリペプチド（「ＸＴＥＮ」）に共有結合した少なくとも第一の生物学的に活性なグルコース調節ペプチドを含み、グルコース調節ペプチド−ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物（以下「ＧＰＸＴＥＮ」）を生じる、単離した融合タンパク質を提供する。他の場合、より活性な形でプロテアーゼによって作用を受ける場合に、任意に、さらに融合タンパク質からＧＰを解放するために切断配列を含むことができるスペーサー配列を含んでよく、１つ以上のＸＴＥＮに結合したグルコース調節ペプチドは、不活性又は活性が減少している。
本明細書で使用する場合、「ＧＰＸＴＥＮ」という用語は、各々が、グルコース調節ペプチドが関連する１つ以上の生物学的又は治療用活性を仲介する生物学的に活性なＧＰを含む、１つ以上のペイロード領域、及び担体として機能する少なくとも第一のＸＴＥＮポリペプチドを含む、少なくとももう一つの他の領域を含む融合ポリペプチドを包含することを意図する。
対象組成物のＧＰ、特に表１で開示したＧＰ、とそれらに対応する核酸及びアミノ酸配列は、当該分野において周知であり、また、その説明及び配列は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅｓ（例えば、ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）のような公共のデータベース、及びＧｅｎＳｅｑ（例えば、Ｄｅｒｗｅｎｔ）のような遺伝子特許データベースから入手可能である。ポリヌクレオチド配列は所与のＧＰ（例えば、完全長又は成熟したもののいずれか）をコードする野生型ポリヌクレオチド配列であってもよく、又は幾つかの場合では、例えば配列は、ポリヌクレオチドのＤＮＡ配列が、例えば特定の種での発現のために最適化された；又は部位特異的突然変異体又は対立遺伝子変異体のような野生型タンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドなどの、野生型ポリヌクレオチド（例えば、生物学的に活性な野生型タンパク質をコードするポリヌクレオチド）配列の変異体であってもよい。当該分野において既知の方法、及び／又は本明細書で提供され、また実施例においてより詳細に記述する指針及び方法に関連した方法を用い、本発明で検討されるＧＰＸＴＥＮ構築物を作出するための、ＧＰの野生型又は保存されたｃＤＮＡ配列又はコドン最適化された変異体の使用について当業者は十分な能力を有する。
本発明のＧＰＸＴＥＮに組み入れられるＧＰは、生物学的、治療上、予防上、若しくは診断上の利益又は機能を有し、あるいはグルコース調節ペプチドの欠如又は対象による１つ以上のＧＰに対する感受性の欠如に関わる疾患、障害若しくは状態の緩和又は予防又は改善に有用な任意のグルコース調節ペプチド若しくは配列変異体を含む。特に興味がもたれるのは、相当する天然のＧＰと比較して、高い薬物動態学的指標、高い溶解度、高い安定性、又は複数のその他の強められた医薬特性が求められるＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物、又は終末相半減期を増加させることが効力、安全性を改善し、又は低頻度での投薬をもたらし、及び／又は患者のコンプライアンスを改善する可能性があるＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物である。従ってＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける曝露を増加させること、又は、対象に投与した場合に、ＸＴＥＮに結合していないＧＰよりも治療ウィンドウ中に保持される期間を長くすることによって、生物学的に活性なＧＰの治療効力を改善させることを含む、様々な目的において調製される。
一実施形態において、対象組成物に組み込まれるＧＰは、天然に見られる対応するタンパク質の配列を有する組換えポリペプチドであってもよい。別の実施形態においてＧＰは、天然のＧＰの生理活性を少なくとも部分的に保持する、配列変異体、断片、ホモログ、及び天然の配列を模倣した配列である。いくつかの場合、本発明のＧＰＸＴＥＮに組み込むためのＧＰは、表１、表２及び表３の配列から選択されるタンパク質配列と、少なくとも約８０％の配列同一性、又はあるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を示す配列である。一実施形態においてＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮに結合した単一のＧＰ分子を含む（以下により詳細に記載するように）。別の実施形態においてＧＰＸＴＥＮは、第一のＧＰ及びそれと同じＧＰの第二の分子を含み、１つ以上のＸＴＥＮ（例えば、ＧＬＰ−１の２つの分子）に結合した２つのＧＰを含む融合タンパク質を生じる。別の実施形態においてＧＰＸＹＥＮ融合タンパク質は、Ｎ末端側からＣ末端への配置がＸＴＥＮ−ＧＰ−ＸＴＥＮである、第一の及び第二のＸＴＥＮに結合した単一のＧＰ分子を含み、ここでＧＰは、表１、表２、及び表３の配列から選択される配列と少なくとも約８０％の配列同一性、又はあるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を示す配列であり、そして第一の及び／又は第二のＸＴＥＮは、表５の配列から選択される配列と少なくとも約８０％の配列同一性、又はあるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を示す配列であり得る。
通常、ＧＰＸＴＥＮのＧＰ融合パートナー構成要素は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて使用した場合、又はインビトロアッセイに用いた場合に、特定の標的に対する結合特異性又は別の所望される生物学的特徴を示すであろう。例えば、ＧＰＸＴＥＮは、グルコース調節ペプチドの細胞受容体に結合する能力を有するアゴニストである。一実施形態においてＧＰＸＴＥＮのその受容体への結合は、ＸＴＥＮに結合していない対応する天然のグルコース調節ペプチドと比較して、細胞内シグナル伝達経路の少なくとも部分的な活性化を引き起こし得る。一実施形態において、グルコース調節ペプチドの細胞受容体に結合したＧＰＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに結合していない天然のグルコース調節ペプチドと比較して、細胞内シグナル伝達経路を少なくとも約１％、又は約５％、又は約１０％、又は約１５％、又は約２０％、又は約２５％、又は約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は少なくとも約９５％活性化するだろう。
本発明の対象ＧＰＸＴＥＮは、１つ以上の薬物動態学的指標の向上を示し、これらは任意にスペーサー配列の開裂によって融合タンパク質がＧＰから放出されることにより、生物学的効果について向上され得る。向上した薬物動態学的指標を有するＧＰＸＴＥＮは、より低頻度での投薬を可能にし、又は最小有効量若しくは血中濃度（Ｃｍｉｎ）と最大耐量若しくは血中濃度（Ｃｍａｘ）との間となる、治療ウィンドウ中での生物学的に活性なＧＰＸＴＥＮの維持のような（しかしこれには限定されない）、高められた薬理学的効果を可能にし得る。このような例においては、選択されたＸＴＥＮ配列を含む融合タンパク質へのＧＰの結合は、これらの特性の改善をもたらす可能性があり、ＸＴＥＮに結合していないＧＰと比較して、それらをより有用な治療用又は予防用薬剤にし得る。
ＩＶ）伸張（ＸＴＥＮＤＥＤ）組換えポリペプチド
一態様において本発明は、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を生じる、ＧＰが結合するのに有用な融合タンパク質パートナーとしてのＸＴＥＮポリペプチド組成物を提供する。ＸＴＥＮは通常、主に小さい親水性アミノ酸からなる、天然に生じない、実質的に非反復的な配列の、伸張した長さのポリペプチドであり、生理的な条件下において二次構造又は三次構造の程度が低い、又はそれら構造をとらないものである。
ＸＴＥＮは、融合タンパク質を作出するためにＧＰタンパク質に結合させた場合に、特定の所望される薬物動態学的、物理化学的及び医薬特性を付与し得る「担体」となるパートナーである、融合タンパク質パートナーとしての有用性を有し得る。そのような所望される特性には、向上した薬物動態学的指標及び組成物の溶解特性、などの以下において記載したその他の特性が含まれるがこれらには限定されない。そのような融合タンパク質組成物は、本明細書において記載した、特定のグルコース調節ペプチド関連疾患、障害又は状態の治療への有用性を有する。本明細書で使用する場合、「ＸＴＥＮ」は特に、一本鎖抗体又は軽鎖若しくは重鎖のＦｃ断片のような、抗体若しくは抗体断片を除外する。
いくつかの実施形態においては、ＸＴＥＮは、単一の融合タンパク質中に、担体として又は累積的に、１つ以上のＸＴＥＮ単位を用いる場合、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さの、好ましくは４００より長く約３０００残基までの長さの、長いポリペプチドである。他の場合において、融合タンパク質の構成要素間のリンカーとして用いる場合又は融合タンパク質の半減期の延長は必要とされないが、ＧＰ融合パートナー構成要素の溶解度の向上若しくはその他の物理化学的特性が望まれる場合のＸＴＥＮ配列は１００アミノ酸残基より短く、例えば約９６、又は約８４、又は約７２、又は約６０、又は約４８、又は約３６アミノ酸残基であり、これらをその特性に効果を及ぼすように、ＧＰを含む融合タンパク質組成物中に組み込まれ得る。
本発明の融合タンパク質組成物を作出するために用いられる、生物学的に活性なタンパク質に結合させるＸＴＥＮの選択基準は通常、その後、融合タンパク質組成物に向上した医薬及び薬物動態学的特性を付与するために用いられる、ＸＴＥＮの物理的／化学的特性及び立体構造の特徴に関する。本発明のＸＴＥＮは、それら融合タンパク質のパートナーとして特に有用なものである、以下の有利な特性の内の１つ以上を示す：配座柔軟性、向上した水溶性、プロテアーゼへの高い抵抗性、低い免疫原性、弱い哺乳類の受容体への結合、及び長い流体力学的（又はストローク）半径。ＸＴＥＮにより向上し得る、ＧＰを含む融合タンパク質の特性の非限定的な例としては、全体的な溶解度及び／又は代謝安定性の向上、タンパク質分解に対する感受性の低下、免疫原性の低下、皮下又は筋内に投与した場合の吸収速度の低下、及び、より長い終末相半減期のような向上した薬物動態学的特性、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）の増加、Ｃｍａｘがより低くなるような皮下又は筋内注入後の吸収の遅延（類似した経路により投与されるＸＴＥＮに結合していないＧＰと比較して）、が挙げられ、これにより、増加した半減期及び/又はＡＵＣとともに、ＧＰの有害事象（治療用活性を保持するＧＰＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質を、長期間にわたって対象に投与したことによって累積的に生じる）の低減をもたらす可能性がある。
本発明のＸＴＥＮを含む組成物のような、タンパク質の物理的／化学的特性を決定するための様々な方法及びアッセイが当該分野において既知であり、特性としては、溶解度、二次又は三次構造、溶解度、タンパク質凝集、融解特性、異物の混入及び水分含量が挙げられる。そのような方法には、分析用遠心法、ＥＰＲ、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、光散乱解析、キャピラリー電気泳動、円二色性分析、示差走査熱量測定、蛍光、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折率測定、及びＵＶ／可視分光法が含まれる。さらに別の方法が、Ａｒｎａｕ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆ （２００６） ４８， １−１３において開示されている。本発明へのこれら方法の適用は、当業者の理解の範囲内であろう。
ＸＴＥＮが伸張した長さのポリマーであるにもかかわらず、典型的にＸＴＥＮは、生理学的条件下において変性したペプチド配列のような挙動を示すように設計される。変性した、とはペプチド主鎖の大部分が構造的な制限をもたないことによって特徴付けられる、ペプチドの溶液中での状態を指す。大半のペプチド及びタンパク質は、高濃度の変性剤の存在下において、又は高温下において変性構造をとる。変性構造のペプチドは、例えば、特徴的な円二色性（ＣＤ）スペクトルを有し、そしてＮＭＲで決定される長距離相互作用を欠くことによって特徴付けられる。本明細書においては、「変性構造」及び「非構造性構造（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は同じ意味で用いられる。いくつかの場合において本発明は、生理的な条件下において、大部分が二次構造をもたない、変性した配列に類似し得るＸＴＥＮ配列を提供する。他の例においてＸＴＥＮ配列は、生理的な条件下で、実質的に二次構造をもたない可能性がある。本明細書中において使用される場合、「大部分がもたない（ｌａｒｇｅｌｙ ｄｅｖｏｉｄｅｄ）」とは、本明細書において記載した手段によって測定又は決定した場合に、ＸＴＥＮ配列中の５０％未満のＸＴＥＮアミノ酸残基が二次構造に寄与することを意味する。本明細書中において使用される場合、「実質的にもたない」とは、本明細書において記載した手段によって測定又は決定した場合に、ＸＴＥＮ配列中の少なくとも約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％、又は少なくとも約９９％のＸＴＥＮアミノ酸残基が二次構造に寄与しないことを意味する。
特定のポリペプチド中での二次及び三次構造の有無を識別するための様々な方法が当該分野において確立されている。具体的には、二次構造は、例えば、「遠ＵＶ」スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）での円二色性分光法を用いた分光光度法により測定することができる。アルファ−ヘリックス及びベータシートのような二次構造要素はそれぞれ、特徴的な形状及び強さのＣＤスペクトルを生じる。二次構造はまた、米国特許出願第２００３０２２８３０９Ａ１号に記載され、よく知られているＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ， Ｐ． Ｙ．， ｅｔ ａｌ． （１９７４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １３： ２２２−４５）及びＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎ（「ＧＯＲ」）アルゴリズム（Ｇａｒｎｉｅｒ Ｊ， Ｇｉｂｒａｔ ＪＦ， Ｒｏｂｓｏｎ Ｂ． （１９９６）， ＧＯＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６６：５４０−５５３）のような、特定のコンピュータープログラム又はアルゴリズムを介してポリペプチド配列から予測することができる。指定された配列について、アルゴリズムは、例えばアルファ−ヘリックス若しくはベータシートを形成する配列の、全残基及び／又は残基のパーセンテージとして、又はランダムコイル形成（二次構造を欠如している）を生じると予測される配列の残基のパーセンテージとして表される二次構造が、いくらかでも存在するか又は完全に二次構造がないかどうかを予測することができる。
いくつかの場合において、本発明の融合タンパク質組成物中に用いられるＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムを用いて決定した場合に０％〜約５％未満となる範囲のパーセンテージのアルファ−ヘリックスを有し得る。他の例において、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムを用いて決定した場合に０％〜約５％未満となる範囲のパーセンテージのベータシートを有し得る。いくつかの場合において、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムを用いて決定した場合に、０％〜約５％未満となる範囲のパーセンテージのアルファ−ヘリックス及び０％〜約５％未満となる範囲のパーセンテージのベータシートを有し得る。好ましい実施形態において、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、約２％未満のパーセンテージのアルファ−ヘリックス及び約２％未満のパーセンテージのベータシートを有するであろう。他の例において、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムで決定した場合に、高いパーセンテージとなるランダムコイルを有し得る。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムで決定した場合に、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、及び最も好ましくは少なくとも約９９％となる、ランダムコイルを有し得る。
１．非反復配列
対象組成物のＸＴＥＮ配列は実質的に非反復性であり得る。一般に、反復性アミノ酸配列は、コラーゲン及びロイシンジッパーのような天然の反復性配列に代表されるように、凝集する又は高次構造を形成する傾向に、又は結晶若しくは疑似結晶構造を生じるように接触する傾向にある。それに比して、非反復性配列が凝集しにくい傾向にあることは、もしも配列が反復性ならば凝集しやすくなるであろう、相対的に少ない数の荷電したアミノ酸頻度を有する、長い配列のＸＴＥＮを設計することを可能にする。通常ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、約１００よりも長く約３０００アミノ酸残基までの長さ、好ましくは４００より長く約３０００までの長さのＸＴＥＮ配列を含み、それらの配列は実質的に非反復配列である。一実施形態においてＸＴＥＮ配列は、セリン以外の同一のアミノ酸型が配列中で３つ連続することがなく、それが起こる場合、３つ多くの連続するアミノ酸がセリンとなることはない、約１００より長く約３０００までの長さのアミノ酸残基を有する。前述の実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、実質的に非反復性となるであろう。
ポリペプチド又は遺伝子の反復性の度合いは、当該分野において知られている、コンピュータープログラム又はアルゴリズム又はその他の方法によって測定され得る。ポリペプチド配列中の反復性は、指定された長さのより短い配列が、そのポリペプチド中にある回数を決定することにより評価することができる。例えば、２００アミノ酸残基のポリペプチドは、１９２個のオーバーラップした９アミノ酸配列（又は９−ｍｅｒ「フレーム」）及び１９８個の３−ｍｅｒフレームを含むが、個別の９−ｍｅｒ又は３−ｍｅｒ配列の個数は、その配列中の反復性の量に依存する。ポリペプチド配列全体における部分列の反復性の度合いを反映するスコア（以下「部分列スコア」）を生成することができる。本発明に関して、「部分列スコア」は、ポリペプチドの２００連続したアミノ酸配列中に存在する、各個別の３−ｍｅｒフレームの頻度の総和を、２００アミノ酸配列中における個別の３−ｍｅｒ配列の絶対数で除算したものを意味する。反復性の第一の２００アミノ酸、及び非反復ポリペプチドから算出される各部分配列の例を実施例４０に示す。いくつかの実施形態において本発明は、各ＧＰＸＴＥＮが、２００の連続したアミノ酸残基のセグメントから派生した場合、１２未満、より好ましくは１０未満、より好ましくは９未満、より好ましくは８未満、より好ましくは７未満、より好ましくは６未満、及び最も好ましくは５未満の部分列スコアを有し得る１つ以上のＸＴＥＮを含む、ＧＰＸＴＥＮを提供する。この段落で上述した実施形態において、約１０未満（すなわち９、８、７など）の部分列スコアを有するＸＴＥＮは、「実質的に非反復性」となる。
ＸＴＥＮの非反復特性は、ＧＰを有する融合タンパク質に、反復配列を有するポリペプチドと比較して、より高い溶解度およびより低い凝集傾向を付与する。これらの特性は、ある場合では１００ｍｇ／ｍｌを超える非常に高い薬剤濃度を含有する、ＸＴＥＮを含む医薬組成物の製剤を容易にする。
さらに、実施形態のＸＴＥＮポリペプチド配列は、哺乳類に投与した場合の免疫原性を低減させるために又は免疫原性を実質的に除去するために、配列内部の反復性の度合いが低くなるように設計される。大部分が、グリシン、セリン及びグルタミン酸のような３種類のアミノ酸に限定される、短い、繰り返しモチーフに含まれるポリペプチド配列は、これらの配列中に予測されるＴ細胞エピトープがないにも関わらず、哺乳類に投与した場合に、相対的に高い抗体力価を生じ得る。これは、タンパク質凝集、交差免疫原性及び反復性炭水化物を含む反復性エピトープが高度免疫原性であり、そして例えば、Ｂ細胞活性化を誘導するＢ細胞受容体の架橋を生じることから示されてきたように、ポリペプチドの反復性の性質によって引き起こされる可能性がある。（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｖａｃｃｉｎｅ， ２５：１６７６−８２； Ｙａｎｋａｉ， Ｚ．， ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ３４５：１３６５−７１； Ｈｓｕ， Ｃ． Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ６０：３７０１−５）； Ｂａｃｈｍａｎｎ ＭＦ， ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９５） ２５（１２）：３４４５−３４５１）。
２．配列モチーフの例
本発明は、アミノ酸配列が非反復性であるより短い配列又はモチーフの単位を複数含み得る、ＸＴＥＮを包含する。ＸＴＥＮ配列の設計において、ＸＴＥＮ配列を作出するために多量体化した配列モチーフのライブラリーを用いた「ビルディングブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）」法の使用にもかかわらず、非反復性の基準を満たしうることを発見した。従って、ＸＴＥＮ配列がわずか４つの異なる型の配列モチーフを、複数単位含む場合でも、モチーフ自体が通常非反復性アミノ酸配列からなることから、ＸＴＥＮ配列全体は実質的に非反復性となる。
一実施形態においてＸＴＥＮは、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％、又は約１００％がオーバーラップしていない配列モチーフからなり、各モチーフが約９〜３６アミノ酸残基である、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さの、又は４００より長く約３０００残基までの長さの、非反復配列を有することができる。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％、又は約１００％は、オーバーラップしていない配列モチーフからなり、各モチーフは９〜１４アミノ酸残基である。その上さらに他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列構成要素の少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％、又は約１００％は、オーバーラップしていない配列モチーフからなり、各モチーフは１２アミノ酸残基である。これらの実施形態において、配列全体が非構造性、及び柔軟性特徴を有するように、配列が主に小さい親水性アミノ酸からなることが好ましい。ＸＴＥＮに含まれ得るアミノ酸の例には、例えば、アルギニン、リジン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、及びグリシンがある。コドン最適化、配列モチーフをコードするポリヌクレオチドの組み立て（ａｓｓｅｍｂｌｙ）、タンパク質の発現、発現タンパク質の荷電分布及び溶解度、並びに二次及び三次構造のような変数を試験した結果、その配列が実質的に非反復性になるように設計した場合、向上した特徴をもつＸＴＥＮ組成物は主に、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基を含むことを見いだした。好ましい実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）又はプロリン（Ｐ）から選択される４つ〜６つの型のアミノ酸を主に含み、この配列は実質的に非反復配列として配置され、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さ、又は４００より長く約３０００残基までの長さのものである。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮは、配列の少なくとも約８０％がオーバーラップしていない配列モチーフからなる、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さの、又は４００より長く約３０００残基までの長さ配列を有し得、ここで各モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択される４〜６つの型のアミノ酸からなる９〜３６アミノ酸残基のモチーフであり、そして完全長ＸＴＥＮ配列中のいずれの１種類のアミノ酸型の含量も３０％を超えない配列を有する。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％はオーバーラップしていない配列モチーフからなり、ここで各モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択される４〜６つの型のアミノ酸からなる９〜３６アミノ酸残基のモチーフであり、そして完全長ＸＴＥＮ中のいずれの１種類のアミノ酸型の含量も３０％を超えない。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％はオーバーラップしていない配列モチーフからなり、ここで各モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択される４〜６つの型のアミノ酸を含む１２アミノ酸残基のモチーフであり、そして完全長ＸＴＥＮ中のいずれの１種類のアミノ酸型の含量も３０％を超えない。一層さらに他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％、から約１００％は、オーバーラップしていない配列モチーフを含みここで各モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択される４〜６つの型のアミノ酸を含む１２アミノ酸残基のモチーフであり、そして完全長ＸＴＥＮ中のいずれの１種類のアミノ酸型の含量も３０％を超えないものである。
その上さらにその他の実施形態においてＸＴＥＮは、配列の少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％がオーバーラップしていない配列モチーフを含む、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さの、又は４００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さの非反復性配列を含み、ここでモチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択される４〜６つの型のアミノ酸を含む９〜１４アミノ酸残基のモチーフであり、そしていずれのモチーフ中のいずれの２つの連続したアミノ酸残基の配列も、その配列モチーフ中に３回以上反復されないものである。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％は、オーバーラップしていない１２アミノ酸残基の配列モチーフを含み、ここでモチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択される４〜６つの型のアミノ酸から成り、そしていずれのモチーフ中のいずれの２つの連続したアミノ酸残基の配列も、その配列モチーフ中に３回以上反復されないものである。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％はオーバーラップしていない１２アミノ酸残基の配列モチーフを含み、ここでモチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から成り、そしていずれのモチーフ中のいずれの２つの連続したアミノ酸残基の配列も、その配列モチーフ中に３回以上反復されないものである。一層さらに他の実施形態において、ＸＴＥＮは１２アミノ酸の配列モチーフから成り、ここでアミノ酸はグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択され、そして、いずれのモチーフ中のいずれの２つの連続したアミノ酸残基の配列も、その配列モチーフ中に３回以上反復されず、及び完全長ＸＴＥＮ配列中のいずれの１種類のアミノ酸型の含量も３０％を超えないものである。この段落の前述の実施形態においてＸＴＥＮ配列は、実質的に非反復性となるであろう。
いくつかの場合において本発明は、配列の少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％〜約１００％が、表４のアミノ酸配列から選択される２つ以上のオーバーラップしていない配列モチーフの、複数単位から成る、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの、又は累積して４００より長く約３０００残基までの長さの非反復性ＸＴＥＮ配列を含む組成物を提供する。いくつかの場合においてＸＴＥＮは、配列の約８０％、又は少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％〜約１００％が、表４の単一のモチーフファミリーから選択される２つ以上のオーバーラップしていない配列モチーフから成り、その結果、配列全体が実質的な非反復性を保持する「ファミリー」配列となる。従って、これらの実施形態においてＸＴＥＮ配列は、表４のＡＤモチーフファミリー、又はＡＥモチーフファミリー、又はＡＦモチーフファミリー、又はＡＧモチーフファミリー、又はＡＭモチーフファミリー、又はＡＱモチーフファミリー、又はＢＣファミリー、又はＢＤファミリーの配列の、オーバーラップしていない配列モチーフの複数単位から成る。その他の場合においてＸＴＥＮは、表４の２つ以上のモチーフファミリーからのモチーフ配列を含む。
Figure 0005839597
Figure 0005839597

＊: 様々な並びの順序で用いられた際、「ファミリー配列」を生じる個々のモチーフ配列を示す。
他の場合においてＧＰＸＴＥＮ組成物は、配列の少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％〜約１００％が、表１０〜１３の１つ以上のポリペプチド配列から選択されたオーバーラップしていない３６アミノ酸配列のモチーフを含む、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの、又は累積的に４００より長く約３０００残基までの長さの一つ以上の非反復性ＸＴＥＮ配列を含み得る。
ＧＰＸＴＥＮ融合タンパクのＸＴＥＮ構成要素の１００％未満のアミノ酸がグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択された４〜６種のアミノ酸を含む、又は配列の１００％未満が表４の配列モチーフを含む、又は表５のＸＴＥＮと１００％未満の配列同一性を有する実施形態において、その他のアミノ酸残基は、任意のその他１４種の天然のアミノ酸から選択されるが、ＸＴＥＮ配列が少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％親水性アミノ酸を含むように、親水性アミノ酸から優先的に選択され得る。グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）ではないＸＴＥＮアミノ酸は、ＸＴＥＮ配列全体にわたって散在し、配列モチーフ中若しくは配列モチーフ間に局在し、又はＸＴＥＮ配列中の１つ以上の短い配列中に集中して存在する。ＧＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ構成要素がグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）ではないアミノ酸を含む例においては、それらのアミノ酸が疎水性残基ではないことが好ましく、かつ、ＸＴＥＮ構成要素の二次構造を実質的に与えないものであるべきである。ＸＴＥＮの構築において好ましくない疎水性残基には、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、及びメチオニンが含まれる。加えて、ＸＴＥＮ配列が、システイン（ジスルフィド形成及び酸化を避けるため）、メチオニン（酸化を避けるため）、アスパラギン及びグルタミン（脱アミド化を避けるため）をほとんど含まない（例えば５％未満）又は全く含まないようにＸＴＥＮ配列を設計することができる。従って前述の好ましい実施形態において、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）に加えてその他のアミノ酸を含む、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素において、アルファ−ヘリックス及びベータシートに寄与する配列が、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムで測定した場合に、５％未満となり得、ランダムコイルの形成が、ＧＯＲアルゴリズムで測定した場合に、少なくとも９０％、又は少なくとも約９５％又はそれ以上となるだろう。
３．配列の長さ
本発明の別の態様において、本発明は、伸張した長さの配列を有するＸＴＥＮポリペプチドの担体を含むＧＰＸＴＥＮ組成物を包含する。本発明は、非反復性の、非構造性ポリペプチドの長さの増大がＸＴＥＮの非構造性の特性を向上させ、その結果、ＸＴＥＮ担体を含む融合タンパク質の生物学的及び薬物動態学的特性を向上させるという発見を活用する。実施例においてより詳細に記載するように、ＸＴＥＮの長さを比例的に増大させると、それが単一ファミリーの配列モチーフ（例えば、表４の４種類のＡＥモチーフ）を固定した順番で繰り返すことによって作出したものであっても、ＧＯＲアルゴリズムにより決定されるランダムコイル形成のパーセンテージが、より短い長さのＸＴＥＮと比較した場合よりも高くなり得る。実施例において記載するように、一般に、非構造性ポリペプチド融合パートナーの長さを増大させると、より短い長さの配列の非構造性ポリペプチドパートナーを有する融合タンパク質に比べて、融合タンパク質の終末相半減期は長さの増大に比例するより過大に増大する。
本発明のＧＰＸＴＥＮ中に含めることが検討されるＸＴＥＮの非限定的な例を表５に示す。一実施形態において本発明は、融合タンパク質のＸＴＥＮ配列の長さが、約１００より長く約３０００アミノ酸残基までであり、いくつかの例においては４００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さであり、ここでＸＴＥＮが、ＸＴＥＮに結合していないＧＰと比較して向上した薬物動態学的特性をＧＰＸＴＥＮに付与する、ＧＰＸＴＥＮ組成物を提供する。いくつかの場合において、本発明のＧＰＸＴＥＮ組成物のＸＴＥＮ配列は、約１００、又は約１４４、又は約２８８、又は約４０１、又は約５００、又は約６００、又は約７００、又は約８００、又は約９００、又は約１０００、又は約１５００、又は約２０００、又は約２５００又は約３０００までの長さのアミノ酸残基であり得る。他の例においてＸＴＥＮ配列は、約１００〜１５０、約１５０〜２５０、約２５０〜４００、４０１〜約５００、約５００〜９００、約９００〜１５００、約１５００〜２０００、又は約２０００〜約３０００の長さのアミノ酸残基であり得る。一実施形態においてＧＰＸＴＥＮは、表５から選択されたＸＴＥＮと、少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を示すＸＴＥＮ配列を含み得る。いくつかの場合においてＸＴＥＮ配列は、最適化したＮ末端リーダー配列（ＮＴＳ）をコードするヌクレオチドを、融合タンパク質をコードする遺伝子のＸＴＥＮ部分に挿入することにより、ＸＴＥＮ配列の発現がＧＰＸＴＥＮのＮ末端構成要素として最適になるように設計される。前述の一実施形態において発現したＧＰＸＴＥＮのＮ末端ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４８又はＡＭ４８、ＡＥ６２４、又はＡＥ９１２又はＡＭ９２３の配列と、少なくとも９０％の配列同一性を有する。前述の別の実施形態においてＸＴＥＮは、実施例１４〜１７に記載したＮ末端残基を有する。
他の場合においてＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮ配列中の残基の累計が約４００から約３０００アミノ酸残基である、第一の及び第二のＸＴＥＮ配列を含む。前述の実施形態においてＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、各配列が、表５から選択された少なくとも第一のＸＴＥＮと又は加えて第二のＸＴＥＮと、少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を示す、第一の及び第二のＸＴＥＮ配列を含み得る。
以下により詳細に記載するように、本発明は対象に投与する融合タンパク質に標的半減期を付与する長さのＸＴＥＮを選択することによってＧＰＸＴＥＮを設計する方法を提供する。概して、累積した長さが約４００残基の、より長いＸＴＥＮをＧＰＸＴＥＮ組成物中に組み込むと、累積した長さがより短い（例えば約２８０残基より短い）ＸＴＥＮと比較して、半減期がより長くなる。しかしながら別の実施形態においてはさらに、対象に皮下又は筋内投与した後の体内吸収率をよりゆるやかにするために、より長い配列長のＸＴＥＮを含むように、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を設計し得る。そのような場合においては、同等な用量のＸＴＥＮに結合していないＧＰと比較して、Ｃｍａｘが低下し、このことは、治療ウィンドウにおいて組成物がＧＰＸＴＥＮを維持する能力に寄与する。従ってＸＴＥＮは、本明細書において記載したその他の物理的／化学的特性を付加することで、投与されるＧＰＸＴＥＮに持続性の特性を付与する。
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
４．ＸＴＥＮセグメント
一実施形態において本発明は、ＸＴＥＮ構成要素の累積した長さが約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さであり、ＸＴＥＮ構成要素が表５、１０、１１、１２及び１３から選択された少なくとも１種類のポリペプチド配列セグメントを含み、ＸＴＥＮ配列のその他の部分が全体にわたって少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％又はそれ以上の親水性アミノ酸を含み、そしてＸＴＥＮ配列の残りの部分が約２％未満の疎水性又は芳香族、又はシステインを概して含む、単離したＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。前述の実施形態においてＸＴＥＮは、同一の又は異なる複数のセグメントを含み得る。別の実施形態において本発明は、ＸＴＥＮ構成要素の累積した長さが約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さであり、ＸＴＥＮ構成要素が少なくとも約１００〜約９２３、又は少なくとも約１００〜約８７５、又は少なくとも約１００〜約５７６、又は少なくとも約１００〜約２８８、又は少なくとも約１００〜約１４４までのアミノ酸残基の少なくとも１種類の配列セグメントを含み、ここで配列セグメントは少なくとも３種類の異なる型のアミノ酸を含み、かつ、配列セグメント中のグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の総和が配列セグメントの全アミノ酸配列の少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％を構成し、そしてＸＴＥＮ配列の残りの部分の及び少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％が親水性アミノ酸を含み、ＸＴＥＮ配列の残りの部分の未満約２％が疎水性芳香族アミノ酸、又はシステインを含む、単離したＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。別の実施形態において本発明は、ＸＴＥＮ構成要素の累積した長さが約１００より長く約３０００アミノ酸残基までの長さであり、かつ、ＸＴＥＮ構成要素が少なくとも約２００〜約９２３、又は少なくとも約２００〜約８７５、又は少なくとも約２００〜約５７６、又は少なくとも約２００〜約２８８アミノ酸残基の少なくとも１種類の配列セグメントを含み、ここで配列セグメント中のグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の総和は配列セグメントの全アミノ酸配列の少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％を構成し、そしてセグメントの部分列スコアが１２未満、より好ましくは１０未満、より好ましくは９未満、より好ましくは８未満、より好ましくは７未満、より好ましくは６未満、及び最も好ましくは５未満であり、ＸＴＥＮ配列の残りの部分の少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％が親水性アミノ酸を含み、かつ、ＸＴＥＮ配列の残りの部分の未満約２％が疎水性、芳香族又はシステインアミノ酸を含む、単離したＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。
５．Ｎ末端ＸＴＥＮの発現を高める配列
いくつかの実施形態において本発明は、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＮ末端として短い長さのＸＴＥＮ配列を提供する。結合融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに組み込まれた、最適化されたＮ末端リーダーポリヌクレオチド配列（Ｎ末端ＸＴＥＮをコードする）を含む好適な発現ベクターで形質転換した宿主細胞における、融合タンパク質の発現が高められる。実施例１４〜１７に記載したように、結合融合タンパク質中に最適化されたＮ末端リーダー配列（ＮＴＳ）を含む、そのような発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞における融合タンパク質の発現が、ＮＴＳを含まないポリヌクレオチドの対応する融合タンパク質の発現と比較して、非常に高くなること、及び発現を高めるために用いられる、非ＸＴＥＮリーダー配列を組み込む必要がなくなることが見いだされた。一実施形態において本発明は、ＮＴＳを含むＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質であって、結合融合タンパク質をコードする遺伝子の宿主細胞中での発現が、Ｎ末端ＸＴＥＮ配列を含まないＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質（コードする遺伝子がＮＴＳを欠損する）の発現と比較して、約５０％、又は約７５％、又は約１００％、又は約１５０％、又は約２００％、又は約４００％高められたＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。
一実施形態において、ＧＰＸＴＥＮのＮ末端ＸＴＥＮポリペプチドは、ＡＥ４８又はＡＭ４８のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示す配列を含む。ＡＥ４８又はＡＭ４８の配列は以下に示す通りである。
ＡＥ４８：ＭＡＥＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳ
ＡＭ４８：ＭＡＥＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳ
別の実施形態において、短い長さのＮ末端ＸＴＥＮを、長い長さのＸＴＥＮに結合させてＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＮ末端領域を形成することができる。この場合、短い長さのＮ末端ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチド配列は、宿主細胞中での発現を高める特性に寄与し、上述のように、長い長さの発現したＸＴＥＮは、融合タンパク質中でのＸＴＥＮ担体としての特性の向上に寄与する。前述の融合タンパク質において短い長さのＸＴＥＮは、本明細書において開示した任意のＸＴＥＮ（例えば、表５のＸＴＥＮ）と結合し得、生じたＸＴＥＮは、次いで本明細書において開示した任意のＧＰ（例えば、表１〜３のＧＰ）のＮ末端に融合タンパク質の構成要素として結合する。あるいは、短い長さのＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチド（又はその相補鎖）は、本明細書において開示した任意のＸＴＥＮ（又はその相補鎖）をコードするポリヌクレオチドに結合し、生じたＮ末端ＸＴＥＮをコードする遺伝子を生じは、次いで本明細書において開示した任意のＧＰをコードするポリヌクレオチドの５’末端に（又はその相補鎖の３’末端に）結合する。いくつかの実施形態において、長い長さを有するＮ末端ＸＴＥＮポリペプチドは、配列ＡＥ６２４、ＡＥ９１２、及びＡＭ９２３からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示す。
上で述べた、前述のＮ末端ＸＴＥＮ実施形態のいずれにおいても、Ｎ末端ＸＴＥＮは、Ｎ末端ＸＴＥＮをコードするヌクレオチドを融合タンパク質の標的部分をコードする遺伝子に連結するために、制限エンドヌクレアーゼの制限酵素部位を用いることができるように、好ましくはＧＥＳＴＰＡから選択された、約１つ〜約６つのアミノ酸残基をさらに有していてもよい。Ｎ末端配列の生成方法及び本発明の融合タンパク質への組み込みについては、実施例においてより詳細に記載されている。
６．実効電荷
その他の実施形態において、ＸＴＥＮポリペプチドは、実効電荷を有するアミノ酸を組み込んだこと、及び／又はＸＴＥＮ配列中の疎水性アミノ酸の割合を低下させたことにより付与された、非構造性の特徴を有する。全実効電荷及び実効電荷密度は、ＸＴＥＮ配列における荷電したアミノ酸の含量を変えることにより制御される。いくつかの実施形態において、組成物のＸＴＥＮの実効電荷密度は、１残基当たり、＋０．１より高い又は−０．１未満の電荷であり得る。他の実施形態において、ＸＴＥＮの実効電荷は、約０％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、又は約２０％又はそれ以上になり得る。
ヒト又は動物の大部分の組織及び表面が実効負電荷を有することから、いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮを含む組成物と、血管、健康な組織のような様々な表面、若しくは様々な受容体との間の非特異的相互作用を最小にするために、実効負電荷を有するように設計される。特定の理論に拘束されないが、ＸＴＥＮは、それぞれが実効負電荷を有し、ＸＴＥＮポリペプチドの配列全体に分布しているＸＴＥＮポリペプチド中の個々のアミノ酸の間の静電反発力により、オープン構造をとることができる。ＸＴＥＮの伸張した長さの配列における実効負電荷のそのような分布は非構造性構造を引き起こすことができ、このことは次いで、流体力学半径の有意な増大を生じ得る。好ましい実施形態において負電荷は、グルタミン酸残基を組み込むことによって付加される。従って、一実施形態において本発明は、約８、１０、１５、２０、２５、又は約３０％ものグルタミン酸を含むＸＴＥＮ配列を有する、ＸＴＥＮを提供する。一般に、グルタミン酸残基は、ＸＴＥＮ配列中で一定の間隔で配置されるだろう。いくつかの例において、ＸＴＥＮには、ＸＴＥＮ ２０ｋＤ当たり、約１０〜８０、又は約１５〜６０、又は約２０〜５０個のグルタミン酸残基を含めることができ、これにより、非常に似たｐＫａを有する荷電した残基を含むＸＴＥＮを生じさせることができる。これらグルタミン酸残基の添加により、産物の電荷均一性を向上させ、等電点をはっきりさせ、得られるＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質の物理化学的特性、例えば精製工程の単純化、を向上させることができる。
本発明の組成物のＸＴＥＮは一般に、正電荷をもつアミノ酸を全く又はほとんど含まない。いくつかの実施形態においてＸＴＥＮは、正電荷のアミノ酸残基を約１０％未満有し得、又は正電荷のアミノ酸残基を約７％未満、又は約５％未満、又は約２％未満、又は約１％未満有し得る。しかしながら本発明は、リジンのイプシロンアミンと、ペプチド上の反応基、リンカーブリッジ（ｌｉｎｋｅｒ ｂｒｉｄｇｅ）若しくは薬剤上の反応基、又はＸＴＥＮ主鎖に結合する小分子、との結合を可能にするために、限られた数の、リジンのような正電荷アミノ酸をＸＴＥＮに組み込んだ構築物についても企図する。前述の一実施形態においてＸＴＥＮは、約１〜約１００のリジン残基、又は約１〜約７０のリジン残基、又は約１〜約５０のリジン残基、又は約１〜約３０のリジン残基、又は約１〜約２０のリジン残基、又は約１〜約１０のリジン残基、又は約１〜約５の範囲のリジン残基、又は１つのみのリジン残基を有する。前述のリジンを含むＸＴＥＮを用いることにより、ＸＴＥＮ、グルコース調節ペプチド、及びグルコースに関連する疾患又は障害の治療に有用な化学療法薬、を含む融合タンパク質を構築する。この場合、ＸＴＥＮ構成要素に組み込まれる薬剤の最大分子数は、ＸＴＥＮに組み込まれるリジン又は反応性側鎖を有する他のアミノ酸（例えば、システイン）の数よって決定される。
いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、よりよい発現又は精製挙動を生じるように、セリン又はグリシンのようなその他の残基によって離された、荷電した残基を含む。実効電荷に基づき、いくつかのＸＴＥＮは、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、又は６．５もの等電点（ｐＩ）を有する。好ましい実施形態においてＸＴＥＮは、１．５から４．５までの等電点を有するだろう。これらの実施形態において、本発明のＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物中に組み込まれたＸＴＥＮは、非構造性構造並びに哺乳類のタンパク質及び組織へのＸＴＥＮ構成要素の結合を低下させることに寄与する実効負電荷を、生理的な条件下で有する。
疎水性アミノ酸がポリペプチドの構造に関わることから、本発明は、ＸＴＥＮ中の疎水性アミノ酸含量が通常、５％未満、又は２％未満、又は１％未満であるＸＴＥＮを提供する。一実施形態において、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素中におけるメチオニン及びトリプトファンのアミノ酸含量は通常、５％未満、又は２％未満、及び最も好ましくは１％未満である。別の実施形態においてＸＴＥＮは、１０％未満の正電荷アミノ酸残基を含み、又は約７％未満、又は約５％未満、又は約２％未満の正電荷アミノ酸残基を含み、メチオニン及びトリプトファン残基の総和が２％未満となり、及びアスパラギン及びグルタミン残基の総和が全ＸＴＥＮ配列の１０％未満となり、配列を有する。
７．低い免疫原性
別の態様において、本発明は、ＸＴＥＮ配列が低度の免疫原性しかもたない、又は実質的に非免疫原性である組成物を提供する。ＸＴＥＮの免疫原性には、例えば、非反復配列、非構造性構造、高度の溶解性、低度な自己凝集性又は自己凝集性の欠如、配列中のタンパク質分解部位が低頻度であるか又は無い、及びＸＴＥＮ配列中のエピトープが低頻度であるか又は無い、などの複数の因子が関与し得る。
立体構造エピトープは、タンパク質抗原における複数の不連続なアミノ酸配列を含む、タンパク質表面の領域から形成される。このタンパク質の正確な折り畳みが、宿主の体液性免疫系によって「異物」として認識されることができるようになる、明確な、安定した空間配置、又はエピトープをこれらの配列にもたらし、その結果このタンパク質に対する抗体の生産又は細胞介在性免疫反応の活性化が生じる。後者の例において、タンパク質に対する個々の免疫反応は、個々のＨＬＡ−ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性に関与する、Ｔ細胞エピトープの認識により大きく影響される。Ｔ細胞表面上の同種Ｔ細胞受容体によるＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体の認識は、ＣＤ４分子のような特定のその他のコレセプターの交差結合と共に、Ｔ細胞の活性化状態を誘導することができる。活性化により、サイトカインの放出が引き起こされ、さらに抗体を生産するＢ細胞のようなその他リンパ球が活性化され、又は完全な細胞免疫反応としてＴキラー細胞が活性化される。
ＡＰＣ（抗原提示細胞）の表面上で抗原を提示するための、ペプチドが特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力は、数多くの要因、とりわけその一次配列に依存する。一実施形態において、低度の免疫原性は、抗原提示細胞中での抗原プロセシングに抵抗性をもつＸＴＥＮ配列を設計すること及び／又はＭＨＣ受容体に強く結合しない配列を選択することにより達成される。本発明は、ＭＨＣ ＩＩ受容体への結合が低下するように、並びにＴ細胞受容体又は抗体結合に対するエピトープの形成を回避するように設計され、その結果低度の免疫現性を生じる、実質的に非反復性のＸＴＥＮポリペプチドを含むＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。免疫原性の回避は、部分的に、ＸＴＥＮ配列の配座柔軟性の、すなわちアミノ酸残基の選択及び順番が原因である二次構造の欠損の、直接的な結果である。例えば、特に興味深い配列は、水溶液中または立体構造エピトープを生じる可能性のある生理的条件下で、密に折りたたまれた構造をとる傾向が低い配列である。標準的な治療行為及び用量でのＸＴＥＮを含む融合タンパク質の投与は、一般に、ＸＴＥＮ配列に対する中和抗体の形成を引き起こさず、そしてＧＰＸＴＥＮ組成物中のＧＰ融合パートナーの免疫原性を低下させる。
一実施形態において対象融合タンパク質に用いられるＸＴＥＮ配列は、ヒトＴ細胞によって認識されるエピトープを実質的に含まないようにできる。タンパク質の免疫原性を低下させることを目的とした、そのようなエピトープの除去についてはこれまでに開示されてきた。例えば、参照することにより本明細書に組み入れられる、国際公開第９８／５２９７６号、同第０２／０７９２３２号、及び同第００／３３１７号を参照のこと。ヒト細胞エピトープのアッセイについても記載されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２８１： ９５−１０８）。特に興味がもたれるのは、Ｔ細胞エピトープ又は非ヒト配列のペプチド配列を生成することなくオリゴマー化することができるペプチド配列である。このペプチド配列は、Ｔ細胞エピトープの存在について、及び６〜１５−ｍｅｒ配列の頻度について、特に、非ヒト９−ｍｅｒ配列の頻度について、これら配列のダイレクトリピート（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ）を試験し、その後エピトープ配列を除去又は壊すようにＸＴＥＮ配列の設計を変更することにより達成される。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＭＨＣ受容体に結合すると予測されるＸＴＥＮのエピトープの数を制限することにより、実質的に非免疫原性となる。ＭＨＣ受容体に結合可能なエピトープの数を減少させることにより、同時に、Ｔ細胞活性化能並びにＴ細胞ヘルパー機能の低下、Ｂ細胞活性化又はアップレギュレーションの低下、及び抗体生産の減少が生じる。予測されるＴ細胞エピトープの低度は、実施例４５に示したエピトープ予測アルゴリズム、例えばＴＥＰＩＴＯＰＥ（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １７： ５５５−６１）など、により決定することができる。タンパク質中の所与のペプチドフレームのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：５５５、に開示されたように、そのペプチドフレームの複数の最も共通したヒトＭＨＣ対立遺伝子への結合のＫｄ（解離定数、親和性、オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ））の対数である。スコアの範囲は、少なくとも２０ｌｏｇ、約１０から約−１０（１０ｅ１０Ｋｄ〜１０ｅ−１０Ｋｄの結合定数に相当する）にわたり、そしてＭＨＣ上でのペプチド提示に際してアンカー残基として役立つ疎水性アミノ酸、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆなど、を回避することにより、スコアを低下させることができる。いくつかの実施形態において、ＧＰＸＴＥＮに組み込まれるＸＴＥＮ構成要素は、約−５以上、又は−６以上、又は−７以上、又は−８以上のＴＥＰＩＴＯＰＥスコア、又は−９以上のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアにおいて、予測されるＴ細胞エピトープを含まない。本明細書で使用する場合、「−９以上」のスコアは、１０から−９のスコアをまとめて包含し得るが、−１０のスコアは、−１０は−９未満であるとして包含しない。
別の実施形態において、対象ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込まれたものを含む本発明のＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮ配列における既知のタンパク質分解部位を制限し、ＸＴＥＮのＭＨＣＩＩ受容体に結合することができる低分子へのプロセシングを低減させることにより、実質的に非免疫原性とされる。別の実施形態においてＸＴＥＮ配列は、実質的に二次構造をとらず、多くのプロテアーゼへの抵抗性に寄与する高いエントロピーの構造を有する配列を使用することにより、実質的に非免疫原性とされる。従って、ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの低下及びＸＴＥＮからの既知のタンパク質分解部位の除去は、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物のＸＴＥＮを含むＸＴＥＮ組成物を、免疫系の受容体を含む哺乳類の受容体に実質的に結合できないようにする。一実施形態において、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮは、哺乳類の受容体に対して１００ｎＭ超の結合定数（Ｋｄ）、又は哺乳類の細胞表面若しくは血中ポリペプチド受容体に対して５００ｎＭより大きいＫｄまたは１μＭより大きいＫｄを有し得る。
加えて、ＸＴＥＮが非反復性配列であり、そのためにエピトープをもたないことは、Ｂ細胞がＸＴＥＮに結合する能力、又はＸＴＥＮがＢ細胞を活性化する能力を制限する。反復性配列は認識され、たとえＢ細胞わずかしか存在しなかったとしても多価接触を形成することができ、そして複数のＴ細胞非依存性受容体の交差結合の結果、Ｂ細胞の増殖及び抗体生産を刺激することができる。それとは異なり、ＸＴＥＮはその伸張配列全体にわたって多くの異なるＢ細胞との接触を形成するが、ＸＴＥＮ配列に反復性がないことにより、各個々のＢ細胞は、個々のＸＴＥＮとは１つ若しくは少数の接触を形成することしかできない。いずれの理論にも拘束されないが、ＸＴＥＮは、Ｂ細胞増殖とそれによる免疫反応を刺激する能力は、通常非常に低い。一実施形態において、ＧＰＸＴＥＮは、融合していない対応するＧＨと比較して、低い免疫原性を有し得る。一実施形態において、ＧＰＸＴＥＮを３回までの非経口用量において哺乳類に投与すると、１：１００に希釈した血清において検出可能な抗ＧＰＸＴＥＮ ＩｇＧを生じるが、１：１０００希釈においては検出できない。別の実施形態において、ＧＰＸＴＥＮを３回までの非経口用量において哺乳類に投与すると、１：１００に希釈した血清において検出可能な抗ＧＰ ＩｇＧを生じ得るが、１：１０００希釈においては検出できない。別の実施形態において、ＧＰＸＴＥＮを３回までの非経口用量において哺乳類に投与すると、１：１００に希釈した血清において検出可能な抗ＧＰ ＩｇＧを生じ得るが、１：１０００希釈においては検出できない。別の実施形態において、ＧＰＸＴＥＮを３回までの非経口用量において哺乳類に投与すると、１：１００に希釈した血清において検出可能な抗ＸＴＥＮ ＩｇＧを生じるが、１：１０００希釈においては検出できない。前述の実施形態において哺乳類は、マウス、ラット、ウサギ、又はカニクイザルであり得る。
高度な反復性を有する配列と比較した場合の、非反復性ＸＴＥＮ配列のさらなる特徴は、非反復性ＸＴＥＮが形成する抗体との接触はより弱いということである。抗体は多価分子である。例えば、ＩｇＧは、２つの同一の結合部位を有し、ＩｇＭは１０の同一の結合部位を含む。従って、反復性配列に対する抗体は、高い結合力でそのような反復性配列と多価接触を形成することができ、これらの接触がそれら反復性配列の能力及び／又は除去に影響を与える可能性がある。一方、非反復性ＸＴＥＮに対する抗体は一価相互作用を生じ得、結果として免疫クリアランスの可能性が低減し、ＧＰＸＴＥＮ組成物が血中で維持される期間を長くすることができる。
８．流体力学半径の増大
xxxxxxxxx
別の態様において本発明は、ＸＴＥＮポリペプチドが長い流体力学半径を有し、ＸＴＥＮを組み込んだＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質に見かけの分子量の相当する増加を付与する、ＸＴＥＮを提供する。実施例２２に詳述したように、ＸＴＥＮとＧＰ配列の結合は、ＸＴＥＮに結合していないＧＰと比較して、流体力学半径が長い、見かけの分子量が大きい、及び見かけの分子量因子が大きい可能性がある、ＧＰＸＴＥＮ組成物を生じ得る。例えば、延長された半減期が望まれる治療上の適用においては、長い流体力学半径のＸＴＥＮを１つ以上のＧＰを含む融合タンパク質に組み込むことにより、組成物の流体力学半径を効果的に、およそ３〜５ｎｍである糸球体細孔径を超えるものに増大させることができ（約７０ｋＤＡの見かけの分子量に相当する）（Ｃａｌｉｃｅｔｉ． ２００３． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ． Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５５：１２６１−１２７７）、その結果、血中タンパク質の腎クリアランスが低下する。タンパク質の流体力学半径は、その分子量と形状、又は緊密さを含むその構造によって決定される。特定の理論に拘束されず、ＸＴＥＮはペプチドの個々の電荷間の静電反発、又は二次構造を与える能力を欠いた、配列中の特定のアミノ酸による固有の柔軟性によって、オープン構造をとることができる。オープンな、伸張した、かつ、非構造性の構造をもつＸＴＥＮポリペプチドは、一般的な球状タンパク質のような二次及び／又は三次構造をもつ同等の配列長及び／又は分子量を有するポリペプチドと比較して、比例的により長い流体力学半径をもつことができる。米国特許第６，４０６，６３２号及び同第７，２９４，５１３号に記載されているように、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用などの流体力学半径の決定方法は当該分野において周知である。実施例２２に示す結果のように、長い長さのＸＴＥＮの付加は、流体力学半径、見かけの分子量、及び見かけの分子量因子などの指標の増大をもたらし、所望される特徴的な見かけの分子量又は流体力学半径のカットオフを有するようにＧＰＸＴＥＮを設計することを可能にする。従って、特定の実施形態においてＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質が少なくとも約５ｎｍ、又は少なくとも約８ｎｍ、又は少なくとも約１０ｎｍ、又は１２ｎｍ、又は少なくとも約１５ｎｍの流体力学半径を有することができるように、ＸＴＥＮを含めて構成することができる。前述の実施形態において、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質中のＸＴＥＮによって与えられる長い流体力学半径は、生じる融合タンパク質の腎クリアランスの低下を引き起こすことができ、その結果、相当する終末相半減期の増大、平均滞留時間の増加、及び／又は腎クリアランス率の低下を引き起こす。
別の実施形態においては、生理的な条件下において少なくとも約１５０ｋＤａ、又は少なくとも約３００ｋＤａ、又は少なくとも約４００ｋＤａ、又は少なくとも約５００ｋＤＡ、又は少なくとも約６００ｋＤａ、又は少なくとも約７００ｋＤＡ、又は少なくとも約８００ｋＤａ、又は少なくとも約９００ｋＤａ、又は少なくとも約１０００ｋＤａ、又は少なくとも約１２００ｋＤａ、又は少なくとも約１５００ｋＤａ、又は少なくとも約１８００ｋＤａ、又は少なくとも約２０００ｋＤａ、又は少なくとも約２３００ｋＤａ又はそれ以上の見かけの分子量をもつ融合タンパク質を作出するために、選択した長さ及び配列のＸＴＥＮを選択的にＧＰＸＴＥＮ中に組み込むことができる。別の実施形態においては、生理的な条件下において少なくとも３の、あるいは少なくとも４の、あるいは少なくとも５の、あるいは少なくとも６の、あるいは少なくとも８の、あるいは少なくとも１０の、あるいは少なくとも１５の見かけの分子量因子を、又は少なくとも２０若しくはそれ以上の見かけの分子量因子を有するＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を生じるように、選択した長さ及び配列のＸＴＥＮを選択的にＧＰに結合させることができる。別の実施形態においてＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は生理的な条件下で、融合タンパク質の実際の分子量に対して、約４〜約２０の、又は約６〜約１５の、又は約８〜約１２の、又は約９〜約１０の見かけの分子量因子を有する。
Ｖ）．ＧＰＸＴＥＮの構造配置及び特性
対象組成物のＧＰは、天然の、完全長ポリペプチドには限定されず、組み換えたもの、並びに生物学的及び／又は薬理学的に活性な変異体又はその断片をも含む。当然のことながら、ＧＰの生理活性又は薬理学的特性に関するＧＰ変異体を、本発明の精神から逸脱することなく作出するために、例えば、様々なアミノ酸の欠失、挿入及び置換を行うことができる。ポリペプチド配列中の保守的アミノ酸置換の例を表６に示した。しかしながら、ＧＰの配列同一性が、本明細書において開示した特定の配列と比較して１００％未満であるＧＰＸＴＥＮを用いた実施形態においては、本発明は、指定されたＧＰの指定されたアミノ酸残基を、任意のその他１９種類の天然のＬ−アミノ酸で置換することを検討する。ここで置換されるアミノ酸の位置は、隣接した残基を含む、ＧＰ配列中の任意の位置であってよい。任意の１置換が生理活性の望ましくない変化を生じる場合には、次に別のアミノ酸のうちの１つを使用して置換することができ、そして本明細書において記載した方法又は、例えば、その全文が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，３６４，９３４号に示された保守的及び非保守的突然変異についての指針を用いて、又は当該分野において一般的に知られている方法を用いて、構築物を評価することができる。加えて、変異体は例えば、ＧＰの完全長天然アミノ酸配列のＮ又はＣ末端に１つ以上のアミノ酸残基を付加したポリペプチド、又はＧＰの完全長天然アミノ酸配列のＮ又はＣ末端から１つ以上のアミノ酸残基を欠失したポリペプチドを含む得場合があり、このポリペプチドは天然のペプチドの生理活性を全てではなくても、いくらか保持する。
Figure 0005839597

（ａ）ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質の配置
本発明は、ＧＰ及びＸＴＥＮ構成要素をＮ末端側からＣ末端側への特定の配置で含む、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を提供する。いくつかの実施形態においては、ブロック共重合体を形成するように、１つ以上のＧＰが１つ以上のＸＴＥＮのＮ末端又はＣ末端のいずれかに、スペーサーと共に又はスペーサーを伴わずに結合し、その結果、生じるＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質中でのＧＰ及びＸＴＥＮの配置はブロック共重合体化学において既知の配置と同様になる。１つ以上のＧＰ、ＸＴＥＮ、又はスペーサーを含む場合、各ＧＰ、ＸＴＥＮ、又はスペーサーは同じ又は異なる配列を有し、ＧＰ及び／又はＸＴＥＮは連続して又は交互に（規則的に又は変則的に）結合する。従って、本明細書で提供する全ての式において、１つ以上のＧＰ、ＸＴＥＮ、又はスペーサーが含まれる場合、各ＧＰ、ＸＴＥＮ、及びスペーサーは同じか又は異なるものである。いくつかの実施形態においてＧＰＸＴＥＮは、１つのＸＴＥＮポリペプチドに結合したＧＰを含む、単量体融合タンパク質である。その他の場合においてＧＰＸＴＥＮは、２つ以上のＸＴＥＮポリペプチドに結合したＧＰを含む単量体融合タンパク質である。その上さらにその他の実施形態においてＧＰＸＴＥＮは、１つのＸＴＥＮポリペプチドに結合した２つ以上のＧＰを含む単量体融合タンパク質である。その上さらにその他の実施形態においてＧＰＸＴＥＮは、２つ以上のＸＴＥＮポリペプチドに結合した２つ以上のＧＰを含む単量体融合タンパク質である。表７に本発明のＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質に包含される配置の非限定的な例を示すが、本明細書において開示した又は当該分野において既知のスペーサー及び開裂配列の組み込みを含むその他の数多くの変異型が当業者には明かであろう。
Figure 0005839597
Figure 0005839597

＊単一とは１つの構成要素であり、複数が２つ以上の構成要素であることを特徴とする
＊＊グルコース調節ペプチド及びＸＴＥＮ構成要素のＮ末端側からＣ末端側への配置を反映する
本発明は、表１〜３の配列から選択されたＧＰ（又は断片若しくはその配列変異体）、及び表５から選択されたＸＴＥＮ（又はその配列変異体）を含み、表７に示した配置をとる、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を検討するが、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物はこれらには限定されない。通常、生じるＧＰＸＴＥＮは、対応するＸＴＥＮと結合していないＧＰの生理活性を少なくとも部分的には保持するであろう。その他の実施形態において、ＧＰＸＴＥＮ中のスペーサー配列に組み込まれた任意の開裂配列の開裂により、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物がＸＴＥＮから単離される際に生物学的に活性になる又は生理活性が増加するＧＰ構成要素のいずれについても以下でより詳細に記載する。
ＧＰＸＴＥＮ組成物の一実施形態において、本発明は式Ｉの融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）ｘ−ＧＯ−（ＸＴＥＮ）ｙ：Ｉ
式中、ＧＰは、各出現について、独立して、グルコース調節ペプチドであり；ｘは０又は１のいずれかであり及びｙは０又は１のいずれかであり、ここでｘ＋ｙ≧１であり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
ＧＰＸＴＥＮ組成物の別の実施形態において、本発明は式ＩＩの融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）ｘ−（ＧＰ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｙ：ＩＩ
式中、ＧＰは、各出現について、独立して、グルコース調節ペプチドであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり及びｙは０又は１のいずれかであり、ここでｘ＋ｙ≧１であり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
別の実施形態において、本発明は、融合タンパク質が式ＩＩＩの融合タンパク質である、単離した融合タンパク質を提供し、
（ＧＰ）−（Ｓ）ｘ−（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｙ−（ＧＰ）−（Ｓ）ｚ−（ＸＴＥＮ）ｚ：ＩＩＩ
式中、ＧＰは、各出現について、独立して、グルコース調節ペプチドであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；ｚは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
別の実施形態において、本発明は、融合タンパク質が式ＩＶの融合タンパク質である、単離した融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）ｙ−（ＧＰ）−（Ｓ）ｚ−（ＸＴＥＮ）−（ＧＰ）：ＩＶ
式中、ＧＰは、各出現について、独立して、グルコース調節ペプチドであり；Ｓは１〜約５０個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり；ｘは０又は１のいずれかであり；ｙは０又は１のいずれかであり；ｚは０又は１のいずれかであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
別の実施形態において本発明は、融合タンパク質が式ＶＩＩＩの融合タンパク質である、単離した融合タンパク質を提供し、
（（Ｓ）ｍ−（ＧＰ）ｘ−（Ｓ）ｎ−（ＸＴＥＮ）ｙ−（Ｓ）ｏ）ｔ：ＶＩＩＩ
式中、（１）ｘ＋ｙ＞１、（２）ｔ＝１、ｘ＞０及びｙ＞０である場合、（３）１つより多いＧＰ、Ｓ、又はＸＴＥＮが含まれ、ＧＰ、ＸＴＥＮ、又はＳがそれぞれ同じ又はそれぞれ独立して異なる場合；及び（４）ｔ＞１であり、各サブユニット中に含まれるｍ、ｎ、ｏ、ｘ、又はｙがそれぞれ同じ又はそれぞれ独立して異なる場合以外は、ｔは０より大きい整数であり（１、２、３、４など）；ｍ、ｎ、ｏ、ｘ、及びｙはそれぞれ独立して整数であり（０、１、２、３、４など）、ＧＰはグルコース調節ペプチドであり；Ｓは任意に開裂部位を含むスペーサーであり；及びＸＴＥＮは伸張組換えポリペプチドである。
いくつかの場合において、治療上有効量の式Ｉ〜ＶＩＩＩの実施形態の融合タンパク質を、それを必要とする対象へ投与すると、ＸＴＥＮと結合していない対応するＧＰであって、かつ、同等の用量において対象に投与されるＧＰと比較して、融合タンパク質が治療ウィンドウ中で推移する時間は少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも４倍、又は少なくとも５倍以上に延長され得る。その他の場合においては、治療上有効量の式Ｉ〜ＶＩＩＩの実施形態の融合タンパク質をそれを必要とする対象へ投与すると、ＸＴＥＮに結合していないＧＰであって、かつ、同等の用量において投与されるＧＰの連続投与の間隔と比較して、治療上効果的な投与計画を維持するために必要な連続投与の間隔を少なくとも４８時間、又は少なくとも７２時間、又は少なくとも約９６時間、又は少なくとも約１２０時間、又は少なくとも約７日間、又は少なくとも約１４日間、又は少なくとも約２１日間延長することができる。
本発明に包含される融合タンパク質のスペーサー配列群はいずれも任意である。スペーサーは、宿主細胞からの融合タンパク質の発現を高めるために、又はＧＰ構成要素が望ましい三次構造をとることができるように及び／又は標的受容体と適切に相互作用できるように、立体障害を低減させるために提供され得る。スペーサーについて及び望ましいスペーサーの同定方法については、例えば、参照することにより特に本明細書に組み入れられる、Ｇｅｏｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １５：８７１−８７９、を参照のこと。一実施形態においてスペーサーは、１〜５０までのアミノ酸残基の長さの又は約１〜２５残基、又は約１〜１０残基までの長さのペプチド配列を１つ以上含む。開裂部位を除いたスペーサー配列は、任意の２０種類の天然のＬアミノ酸を含むことができ、好ましくは立体障害のない親水性アミノ酸を含むことができ、これらアミノ酸にはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）が含まれるがこれらには限定されない。いくつかの例においてスペーサーは、ポリグリシン又はポリアラニンであってよく、又は主にグリシン及びアラニン残基の混合物である。開裂配列を除外したスペーサーポリペプチドはほとんど又は実質的に二次構造をとらない（例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及び／又はＧＯＲアルゴリズムで決定した場合、約１０％未満、又は約５％未満）。一実施形態において、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物に含まれる１つ又は両方のスペーサー配列は、同一又は異なり得る開裂配列をさらに含み得、この開裂配列は、融合タンパク質からＧＰを開裂させるためのプロテアーゼによる作用を受け得る。
いくつかの場合においては、ＸＴＥＮから単離されることによって活性化する又はより活性化するＧＰを単離することができるように、ＧＰＸＴＥＮへの開裂配列の組み込みを設計する。開裂後にＧＰに結合している残りの残基のいずれもがＧＰの活性（例えば、受容体への結合のような）を認識できるほど干渉せず、さらに開裂配列の開裂にプロテアーゼが効果的に作用できるようにするために、開裂配列はＧＰ配列に有意に隣接した位置に、通常ＧＰ配列末端から１８以内、又は１２以内、又は６以内、又は２アミノ酸以内に配置される。いくつかの実施形態において、開裂部位は、対象への投与後にＧＰＸＴＥＮが開裂され得るように、哺乳類対象の内生プロテアーゼにより開裂され得る配列である。そのような例においては、プロドラッグ又はＧＰに対する血中貯留物としてＧＰＸＴＥＮは役立つだろう。本発明で検討される開裂部位の例には、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ（トロンビン）、エラスターゼ−２、グランザイムＢ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７又はＭＭＰ−２０から選択される、哺乳類の内生プロテアーゼによって開裂され得るポリペプチド配列、又はＴＥＶ、エンテロキナーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ）、及びソルターゼＡのような哺乳類のものではないプロテアーゼによって開裂され得るポリペプチド配列が挙げられるが、これらの配列には限定されない。前述のプロテアーゼ及びその他により開裂される配列は当該分野において既知である。配列並びにその配列変異体中の開裂配列及び切断部位を表８に示す。例えば、ＬＴＰＲＳＬＬＶの配列に作用するトロンビン（活性化凝固第ＩＩ因子）（Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３６： Ｄ３２０）は、配列中の４番目の位置のアルギニンの後ろを切断するだろう。活性なＦＩＩａは、凝固経路における第ＩＸ因子の下流にあり、リン脂質及びカルシウム存在下でのＦＸａによるＦＩＩの開裂によって生産される。その凝固における天然の役割はフィブリノゲンの開裂であり、これが一旦活性化されると、次に凝固の形成が始まる。ＦＩＩａ活性はしっかりと制御されており、特定の止血に凝固が必要な場合にのみ生じる。しかしながら、凝固は哺乳類においては途切れない過程であるため、ＧＰＸＴＥＮのＧＰとＸＴＥＮの間にＬＴＰＲＳＬＬＶ配列を組み込むと、凝固が生理的に必要な場合には外因性又は内因性いずれかの凝固経路の活性化に伴ってＸＴＥＮドメインが隣接したＧＰとの接点から単離され、それによりＧＰがその間放出されるだろう。同様に、内生プロテアーゼが作用するその他の配列をＧＰＸＴＥＮ中に組み込むことにより、特定の場合においては、「プロドラッグ」形態のＧＰＸＴＥＮから高度に活性化されたＧＰを提供する、ＧＰの持続放出を提供することができるだろう。
いくつかの場合において、切断部位の両側に隣接した２つ又は３つのアミノ酸のみ（全部で４〜６アミノ酸）が開裂配列に組み込まれ得る。その他の場合において、既知の開裂配列は、１つ以上の欠失若しくは挿入を有し得、又はその既知配列の１つ若しくは２つ若しくは３ついずれかのアミノ酸の１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が置換されたものである。ここで欠失、挿入又は置換は、プロテアーゼへの感受性の低減又は増強を生じるがプロテアーゼへの感受性の喪失を生じず、ＸＴＥＮからのＧＰの放出速度を設計できる能力をもたらすものである。置換の例を表８に示す。
Figure 0005839597

↓は開裂部位を示す
ＮＡ：適用なし
＊スラッシュの前、間、又は後に記載されている複数のアミノ酸は、その位置で置換できる別のアミノ酸を示す
「−」は、いずれのアミノ酸も、中列に記載した、対応するアミノ酸で置換できることを示す
一実施形態において、ＧＰＺＴＥＮ融合タンパク質中に組み込まれたＧＰは、表１〜３の配列と少なくとも約８０％の配列同一性を、あるいは表１〜３の配列と比較して少なくとも約８１％、又は約８２％、又は約８３％、又は約８４％、又は約８５％、又は約８６％、又は約８７％、又は約８８％、又は約８９％、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％、又は約１００％の配列同一性を示す配列を有し得る。前述の実施形態のＧＰの活性を、アッセイを用いて、又は本明細書において記載した指標の測定若しくは決定によって評価することができ、そしてそれらの配列は、対象ＧＰＸＴＥＮに含めることが好適であろうと考えられる対応する天然のＧＰ配列の活性と比較して、少なくとも約４０％、又は約５０％、又は約５５％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％又はそれ以上の活性を保持する。好適なレベルの活性を保持することが認められたＧＰを、上に記載した１つ以上のＸＴＥＮポリペプチドに結合させることができる。一実施形態において、好適なレベルの活性を保持することが認められたＧＰを、表５の配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有する、あるいは表５の配列と比較して少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する１つ以上のＸＴＥＮポリペプチドに結合させることができ、その結果キメラ融合タンパク質が生じる。
単一のＸＴＥＮに結合させた単一のＧＰを含むＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質の非限定的な例を表３６に示し、２つのＸＲＥＮに結合した単一のＧＰを含むＧＰＸＴＥＮの配列を表３７に示す。一実施形態において、ＧＰＸＴＥＮ組成物は、表３６〜２７のＧＰＸＴＥＮと少なくとも約８０％の配列同一性を有する、あるいは表３６〜３７のＧＰＸＴＥＮと比較して少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むだろう。しかしながら、１つ以上のＧＰに結合した２つのＸＴＥＮ分子を含む融合タンパク質の配列の非限定的な例を表３６に示すが、本発明はまた、１つ以上のＸＴＥＮ（表５から選択される配列と少なくとも約９０％の配列同一性を示し、同じ若しくは異なる）に結合した、その他のＧＰ（表１〜３から選択される配列と少なくとも約９０％の配列同一性を示す配列を有する）を用いた置換についても検討する。この段落の上記に記載した、前述の融合タンパク質において、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質に、ＧＰとＸＴＥＮの間の位置又はＧＰに隣接した位置に、表８の開裂配列をさらに含めることができる（２つ以上のＧＰがそのＧＰＸＴＥＮに含まれている場合）。いくつかの例においては、開裂配列を含むＧＰＸＴＥＮは、プロテアーゼの接触を促進するために、ＧＰと開裂配列の間又はＸＴＥＮ又は開裂配列の間に１つ以上のスペーサー配列アミノ酸をもまた有するだろう。スペーサーアミノ酸は任意の天然のアミノ酸を含むが、好ましいアミノ酸はグリシン及びアラニンである。ＧＰＸＴＥＮ、開裂配列及びスペーサーアミノ酸を含むＧＰＸＴＥＮの非限定的な例を表３８に示す。しかしながら、本発明はまた、表３６〜３８のＧＰ配列を任意の表１〜３のＧＰ配列で置換すること、表３６〜３８のＸＴＥＮ配列を任意の表５のＸＴＥＮ配列で置換すること、及び表３８の開裂配列を任意の表８の開裂配列で置換することについても検討する。
（ｂ）ＧＰＸＴＥＮの薬物動態学的特性
本発明は、ＸＴＥＮに結合していないＧＰと比較して向上した薬物動態を有するＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質であって、本明細書に記載した方法を用いてこの組成物について決定した用量で使用した場合に、薬理学的効果をもたらす血中濃度ではあるが、同等の用量のＸＴＥＮに結合していないＧＰと比較して、組成物の生物学的な有効成分の安全域に長期間滞留することを達成することができる、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。このような例において、ＧＰＸＴＥＮは、融合タンパク質組成物の治療ウィンドウ中に長期間維持される。本明細書で使用する場合、「同等な用量」とは、等価なモル／ｋｇの、比較可能な方法で対象に投与される活性なＧＰ薬理作用団を含む用量を意味する。当該分野においては容易に理解されるように、「同等な用量の」ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を含む薬剤の重量はより重くなるだろうが、融合タンパク質用量中のＧＰのモル等価物は本質的には同じであり、及び／又はＧＰと比較してほぼ同じモル濃度を有するだろう。
ＧＰに特性のＸＴＥＮを結合させることにより向上させることができるＧＰの薬物動態学的特性には、終末相半減期、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）、Ｃｍａｘ容量の分布、及びグルコース調節ペプチド関連障害、疾患及び関連した症状の治療において向上した有用性をもたらすバイオアベイラビリティが含まれる。強化されたＰＫの性質を示すＧＰＸＴＥＮ組成物のＧＰは、表１〜３から選択されるタンパク質配列と少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を示す配列であって、表５から選択されるタンパク質配列と少なくとも約８０％の配列同一性、又はあるいは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を示す１つ以上のＸＴＥＮに結合した配列である可能性があり、表７の構造から選択した構造であり得る。
ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の薬物動態学的特徴に関する実施例でより詳細に記載したように、驚くことに、ＸＴＥＮ配列の長さを伸張することにより、ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の終末相半減期が不釣り合いなまでに増大し得ることが発見された。従って、本発明は、対象に投与するＧＰＸＴＥＮ組成物に標的半減期をもたらすように選択し得るＸＴＥＮを含む、ＸＴＥＮを含むＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象に投与されるＧＰＸＴＥＮの終末相半減期が、ＸＴＥＮと結合していなく、かつ、比較できる用量において対象に投与される、対応する融合タンパク質に結合していないＧＰと比較して少なくとも約２倍長く、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約７倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約１５倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約４０倍、又は少なくとも約８０倍、又は少なくとも約１００倍、又はそれ以上にも長くなるように選択したＸＴＥＮを含む、ＸＴＥＮを含む単量体融合タンパク質を提供する。実施例に記載したように、様々な動物種に実験的に投与した本明細書で開示した様々なＧＰＸＴＥＮ組成物の終末相半減期の値が数時間にもなったのに反して、外生の投与されたエキセンジン４の終末相半減期がヒトにおいては２．４時間であり、グルカゴンの半減期は２０分未満であることが報告されてきた。同様に、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＡＵＣは、対応する融合タンパク質に結合していないＧＰであって、かつ、同等の用量で対象に投与されるＧＰのＡＵＣと比較して、少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約１００％、又は少なくとも約１５０％、又は少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％、又は少なくとも約５００％、又は少なくとも約１０００％、又は少なくとも約２０００％増加する可能性がある。ＧＰＸＴＥＮの薬物動態学的指標は、投与する工程、時間間隔をおいて血液試料を採取する工程、及びＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、放射標識測定法、又はその他の当該分野において既知の方法若しくは本明細書に記載した方法を用いてタンパク質をアッセイする工程、並びに、その後、データを標準的な方法によって計算し、半減期及びその他のＰＫ指標を導く工程を含む標準的な方法によって決定することができる。
本発明はさらに、開裂配列をさらに含んでもよいスペーサー配列によって任意に離されている、又は第二のＸＴＥＮ配列によって離されている、第一の及び第二のＧＰ分子を含むＧＰＸＴＥＮを提供する。一実施形態において、ＧＰは、対応する融合タンパク質に結合していないＧＰと比較して、融合タンパク質に結合させた場合により低い活性を有する。そのような例において、図３８に示したように、ＧＰＸＴＥＮは、対象へ投与する際に、ＧＰ構成要素が開裂配列の開裂によって徐々に単離され、その結果ＧＰが活性又はその標的受容体若しくはリガンドに結合する能力を取り戻すように設計され得る。従って、前述のＧＰＸＴＥＮはプロドラッグ又は血中貯留物として役立ち、その結果融合タンパク質に結合していないＧＰと比較して長い終末相半減期をもたらす。
（ｃ）ＧＰＸＴＥＮの薬理及び医薬特性
本発明は、ＸＴＥＮに共有結合したＧＰを含み、ＸＴＥＮに結合していないＧＰと比較して向上した特性を有し得るＧＰＸＴＥＮ組成物、並びに組成物中の２つのＧＰ構成要素それぞれの治療用及び／又は生理活性を向上させるための方法を提供する。加えて本発明は、免疫グロブリンポリペプチドパートナー、より短いポリペプチド及び／又は反復性配列を有するポリペプチドパートナーを含む、当該分野において既知の融合タンパク質と比較して、向上した特性を有するＧＰＸＴＥＮ組成物を提供する。加えてＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、ペグ構築物のような化学結合体よりも、特に、研究及び開発の両方、並びに製品の製造の時点で時間及び費用を削減することができ、そして、ＧＰＸＴＥＮの製品及び代謝物の両面においてペグ結合体よりも低い毒性を有する、より均一で明確な製品を生じる細菌細胞発現系において組換えＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を作出できることから、大きな利益をもたらす。
治療用薬剤としてのＧＰＸＴＥＮは、ＸＴＥＮを含まない治療薬よりも、１つ以上の向上した特性を含む数多くの利点を有し得、これらの向上した特性の非限定的な例には、溶解度の向上、熱安定性の向上、免疫原性の低下、見かけの分子量の増加、腎クリアランスの低下、タンパク質分解の低下、代謝の低下、治療用効果の増大、より低い有効な治療用用量、バイオアベイラビリティの向上、治療ウィンドウ中でのＧＰの血中レベルを維持することができる投薬間隔の延長、「設計された」吸収速度、凍結乾燥に対する安定性の向上、血清／血漿安定性の向上、終末相半減期の延長、血流における溶解度の向上、中和抗体による結合の減少、受容体介在性クリアランスの低下、副作用の減少、受容体／リガンド親和性又は受容体／リガンド活性化の保持、分解に対する安定性、凍結融解に対する安定性、プロテアーゼに対する安定性、ユビキチン化に対する安定性、投与の簡便性、その他の薬剤的賦形剤又は担体との適合性、対象中での持続性、保存における安定性の向上（例えば、保持期限の増大）、生体中又は環境中での毒性の低下などが含まれる。向上した特性の実際の効果は、グルコース調節ペプチド関連疾患又は障害を有する対象に投与した場合に、ＧＰＸＴＥＮが治療用及び／又は生物学的効果の向上、又は患者のコンプライアンスの改善を生じ得るということである。
その他の場合、ＧＰの医薬的又は物理化学的特性（水溶性又は安定性の度合いのような）の向上が望まれる場合、ＧＰＸＴＥＮ組成物の全体的な医薬特性を向上するように、第一の及び第二の融合タンパク質における、第一の及び第二のＸＴＥＮ配列の長さ及び／又はモチーフファミリー組成物はそれぞれ、それぞれの融合タンパク質に異なる度合いの溶解性及び／又は安定性を付与するように選択され得る。ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を、本明細書において記載した方法を用いて構築し、物理化学的特性を確認するためにアッセイし、必要な場合には、望ましい特性を生じるようにＸＴＥＮを調製することができる。一実施形態においてＧＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ配列は、融合タンパク質が、融合タンパク質に結合していないＧＰと比較して少なくとも約２５％高い水溶性、又は対応する融合タンパク質に結合していないＧＰよりも少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約１００％、又は少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％、又は少なくとも約４００％、又は少なくとも約５００％、又は少なくとも約１０００％高い水溶性を有するように選択される。この段落に記載された本明細書の上述の実施形態において、融合タンパク質のＸＴＥＮは、表５から選択されたＸＴＥＮに対して、少なくとも約８０％の配列同一性、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％、約１００％までの配列同一性を有し得る。
一実施形態において本発明は、ＸＴＥＮに結合していないＧＰに対応する同等の投与量と比較してより長い期間の治療ウィンドウ内でのＧＰ組成物を維持できるＧＰＸＴＥＮ組成物を提供する。当業者は、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質の「同等の投与量」は、剤のより大きな質量を表し得るが、融合タンパク質の投与量において、ＧＰのおよそ等しいモル当量を有し得る、及び／又は、ＧＰに対しておよそ等しいモル濃度を有し得るということが、理解されるであろう。
本発明はまた、投与量の選択と一致する場合、ＧＰの循環濃度を維持することによって時間の拡張された期間のための治療のウィンドウ内で投与される組成物の効果増強を可能にする必要な薬物動態学的特性を提供するために接合するための適切なＸＴＥＮを選択する方法を提供する。本明細書で使用する場合、「治療ウィンドウ」とは、血中又は血漿濃度範囲として表される、許容できない毒性をもたず、疾患又は症状に効力又は所望の薬理学的効果を時間経過と共にもたらす薬剤又は生物学的製剤の量、すなわち、任意の正の治療効果を達成する最小量と（それ以上の用量又は濃度では）対象に対して毒性となる直前の反応を生じる最大量との間の、循環血液濃度である。加えて、治療ウィンドウは通常、時間の観点も包含する；所望の薬理学的を時間経過と共にもたらし、許容できない毒性又は有害事象を生じない最大及び最小濃度。対象の治療ウィンドウ中にある、投与された組成物は、「安全域」にあると言うこともできる。
機能的な特徴又は生物学的、及び薬理学的活性ならびにそれがもたらす指標を含む、本発明のＧＰＸＴＥＮ組成物の特徴は、望まれる特徴を測定するための、当該分野において既知の任意の好適なスクリーニングアッセイによって決定され得る。本発明は、所望される度合いの生物学的及び／又は治療用活性、並びに安全性プロファイルを有するＧＰＸＴＥＮを提供するために、異なる組成物又は配置のＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質をアッセイする方法を提供する。それぞれの配置のＧＰＸＴＥＮ及び／又はＧＰＸＴＥＮに組み込まれるＧＰ構成要素の活性を評価するために、特定のｉｎ ｖｉｖｏ及びエクスビボな生物学的アッセイを用いることができる。これらのアッセイには、実施例のアッセイ、表３５のアッセイ、並びにＧＰの特性及び効果をアッセイするための以下の又はその他当該分野において既知のアッセイが含まれるがこれらには限定されない。結合定数（Ｋｄ）、ＥＣ５０値、並びにそれらリガンド−受容体複合体の解離半減期（Ｔ１／２）を含む、ＧＰＸＴＥＮのＧＰ受容体への結合特性の決定を可能にするように、アッセイを実施することができる。結合親和性は、例えば、受容体又はリガンドに特異的に結合する能力の変化を検出する、競合型の結合アッセイ（例えば、実施例を参照のこと）により測定することができる。加えて、フローサイトメトリー又は表面プラズモン共鳴のような技術もまた、結合イベントを検出するために用いることができる。アッセイは可溶性の受容体分子を含む場合があり、又は細胞で発現した受容体への結合を決定する場合もある。そのようなアッセイには、カルシウムフラックス、シグナル伝達、及び細胞増殖についてのアッセイを含む、細胞を用いたアッセイが含まれる場合もある。使用可能なその他の、可溶性の受容体分子を含む場合のあるアッセイを用いては、発現したポリペプチドの受容体への結合を決定することができ、又は細胞に発現した受容体への結合を決定することができるだろう。対応するＧＰの標的受容体への、ＧＰＸＴＥＮの結合親和性は、チップに結合した受容体若しくは結合タンパク質を用いたＢｉａｃｏｒｅアッセイ又は米国特許第５，５３４，６１７号に記載されたようなＥＬＩＳＡアッセイ、本明細書の実施例に記載したアッセイ、放射性−受容体アッセイ、又はその他の当該分野において既知のアッセイのような、結合型又は競合型の結合アッセイによってアッセイすることができる。加えて、ＧＰ配列変異体（単一の構成要素として又はＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質としてアッセイされる）を、それらＧＰが天然のＧＰ、又はそのいくつかの画分と同様の結合特異性及び親和性及び親和性を有するかどうか、それらがＧＰＸＴＥＮへ組み込むのに好適かどうか、を決定するための競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイを用いて天然のＧＰと比較することができる。機能性アッセイには、ＧＰＸＴＥＮへの曝露の結果である、標的細胞中でのインスリン濃度及び／又は生成、及び／又は、結果として生じる、ベータ細胞、グルコースの取り込み及び/又は恒常性、ＨｂＡ１ｃ濃度、インスリン濃度は、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴから派生した血漿グルコース（ＦＰＧ）、血清サイトカイン濃度、ＣＲＰ値、インスリン分泌とインスリン感受性指数を空腹時、Ｃペプチドを刺激）だけでなく、体重、摂餌量、及び他の受け入れられる糖尿病のマーカーの効果を刺激する効果が含まれ、これら全てはＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込むためのＧＰの活性又は得られたＧＰＸＴＥＮを評価するための好適な指標である。
用量の最適化は全ての薬剤、特に治療ウィンドウが狭い薬剤にとって重要である。例えば、異なる症状又は異常な臨床指標を呈している全患者のために標準化された、単一用量のＧＰが常に有効というわけではない場合もある。許容できない毒性を生じる可能性がある、及び用量が安全域外になる場合がある、又は臨床的な改善を達成しない不十分な能力を生じる場合のある量に対して、治療上又は薬理学的有効量のＧＰＸＴＥＮの決定を目的とするこれら因子についての考慮は当業医師の権限の範囲内である。
多くの例において、異なる年齢又は疾患の度合いが異なる対象における、ＧＰの治療ウィンドウが確立されてきており、これは文献から入手可能であり、又はＧＰを含む認可された製品の薬剤ラベルに記載されている。その他の例において、新しい組成物の治療ウィンドウを確立することができる。特定の組成物の治療ウィンドウの確立方法は当業者に既知である（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， １１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ （２００５）を参照のこと）。例えば、標的疾患又は障害を有する対象において効力又は所望される薬理学的効果、有害事象の出現、及び循環血液レベルを決定するための用量漸増試験を行うことにより、特定の対象又は対対象集団に対する特定の薬剤若しくは生物製剤又は生物製剤と薬剤との併用についての治療ウィンドウを決定することができる。用量漸増試験は、当該分野において知られているように若しくは本明細書において記載したように、代謝性疾患又は障害に関連する１つ以上の指標である生理的若しくは生化学的な指標、又は特定の適応についての有益なアウトカムに関連した臨床指標を対象又は対照群においてモニターする代謝試験と、無影響量、有害事象、最大耐量などを決定するための観察及び／又は測定指標と、決定若しくは導き出した循環血液レベルを確立する薬物動態学的指標の測定を介して、ＧＰＸＴＥＮの活性を評価することができる。この結果を次に、先に決定した指標又は効果レベルと一致する治療薬の、投与した用量と血中濃度に関連づけることができる。これらの方法により、用量範囲及び血中濃度を、所望の効果がもたらされる最小有効用量及び最大用量を血中濃度と関連づけることができ、これより高い用量で毒性が生じた場合、投与した治療薬の治療ウィンドウを確立することができる。最大用量より高い血中濃度の融合タンパク質（又はＧＰ構成要素で測定される）は、治療ウィンドウ又は安全域の外にあると考えられるだろう。従って、前述の方法により、それより低量ではＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質が所望される薬理学的効果を示さないであろう血中レベルであるＣｍｉｎ、及び許容できない毒性又は有害事象を引き出すであろう濃度に達する前の最大の血中濃度を示すであろう血中レベルであるＣｍａｘを確立し、それらの量をＧＰＸＴＥＮの安全域の外にあるとするだろう。そのような確立された濃度を用い、融合タンパク質を治療ウィンドウ中に維持するための適切な用量及び投与頻度を提供するＣｍａｘ及びＣｍｉｎを測定することにより、投与頻度及び用量をさらに改良することができる。本明細書において開示した手段又はその他当該分野において既知の方法により、当業者はＧＰＸＴＥＮが治療ウィンドウに望ましい期間維持されているか、又は用量若しくはＸＴＥＮの配列長の調整が必要とされるかについて確認することができる。さらに、ＧＰＸＴＥＮを治療ウィンドウに維持するための適切な用量及び投与頻度の決定は、治療ウィンドウ範囲内にある連続したＣｍａｘのピーク及び／又はＣｍｉｎの谷を生じ、そして標的疾患、障害又は症状に関連する少なくとも１つの測定指標の改善をもたらすような、治療上効果的な用量の融合タンパク質をそれを必要とする対象に複数回の連続して投与するための投与スケジュールである、治療上効果的な投与計画を確立する。いくつかの例において、適切な用量で対象に投与されたＧＰＸＴＥＮは、対応するＸＴＥＮに結合していないＧＰであって、かつ、同等の濃度で投与されたＧＰと比較して、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質が治療ウィンドウ中に少なくとも約２倍長い期間維持される、あるいは少なくとも約３倍長い；あるいは少なくとも約４倍長い；あるいは少なくとも約５倍長い；あるいは少なくとも約６倍長い；あるいは少なくとも約７倍長い；あるいは少なくとも約８倍長い；あるいは少なくとも約９倍長い又は少なくとも約１０倍長い又はそれより長く治療ウィンドウ中に維持される、血中濃度を生じる。本明細書で使用する場合、「適切な用量」とは、対象に投与した場合に、所望される治療用又は薬理学的効果及び治療ウィンドウ範囲内の血中濃度を生じ得るであろう、薬剤又は生物製剤の用量を意味する。
一実施形態において、治療上効果的な投与計画で投与されたＧＰＸＴＥＮは、融合タンパク質に結合していない融合タンパク質に対応する生物学的に活性なタンパク質であって、かつ、同等な投与計画において対象に投与された融合タンパク質と比較して、融合タンパク質の血中レベルにおける少なくとも２つの連続したＣｍａｘのピーク及び／又はＣｍｉｎの谷との間隔の時間を、少なくとも約３倍長く；あるいは少なくとも約４倍長く；あるいは少なくとも約５倍長く；あるいは少なくとも約６倍長く；あるいは少なくとも約７倍長く；あるいは少なくとも約８倍長く；あるいは少なくとも約９倍長く又は少なくとも約１０倍長くする。別の実施形態においては、より低頻度で、又はモル換算してより少ない総用量の医薬組成物の融合タンパク質を治療上効果的な投与計画で投与した場合、ＧＰＸＴＥＮは、融合タンパク質に結合していない対応する生物学的に活性なタンパク質構成要素であって、かつ、ＧＰの治療上効果的な投与計画により対象に投与されたタンパク質構成要素と比較して、１つ、又は２つ、又は３つ又はそれ以上の測定指標の同等な改善を生じる。測定指標には、本明細書において開示した任意の臨床的、生化学的又は生理学的な指標、又はグルコース又はインスリン関連障害を有する対象を評価するための当該分野において既知のその他指標が含まれ得る。
本発明のＧＰＸＴＥＮ組成物の活性は、機能的な特性又は生物学的及び薬理学的活性ならびにその結果のパラメータを含み、所望の特徴を測定するために当該分野において公知である任意の適切なスクリーニングアッセイによって決定付けられ得る。ＧＰ成分を含むＧＰＸＴＥＮポリペプチドの活性及び構造は、本明細書に記載のパラメータを測定すること、表３５から選択される一つ又は複数のアッセイ（実施例のアッセイ）を使用することによって、又は溶解性、構造と生物活性の保持の程度を把握するために当該分野で公知の方法によって評価することができる。アッセイは、ＧＰの受容体又はリガンドＧＰＸＴＥＮの結合特性の測定を可能にすることができ、リガンド−受容体複合体の解離の半減期（Ｔ１／２）だけではなく、結合定数（Ｋｄ）、ＥＣ５０値を含む。結合親和性は、例えば、特に受容体又はリガンド（例えば、実施例を参照）に結合する能力の変化を検出する競争型の結合アッセイにより、測定することができる。更に、フローサイトメトリー又は表面プラズモン共鳴などの手法を、結合事象を検出するために使用することができる。アッセイは、可溶性受容体分子を含み得、又は細胞に発現した受容体への結合を決定し得る。そのようなアッセイは、増殖、細胞死、アポトーシスと細胞移動のためのアッセイを含む、細胞ベースのアッセイを含み得る。他の可能なアッセイは、発現されたポリペプチドの受容体結合を決定することができ、該アッセイは、可溶性受容体分子を含み得、又は細胞に発現した受容体への結合を決定し得る。標的受容体又は対応するＧＰのリガンドについてのＧＰＸＴＥＮの結合親和性は、米国特許第５，５３４，６１７号明細書に記載の、チップに結合した受容体や結合タンパク質を用いたビアコアアッセイもしくはＥＬＩＳＡアッセイなどの、結合や競合結合アッセイ、本明細書の実施例に記載のアッセイ、ラジオレセプターアッセイ、又は、当該分野において公知である他のアッセイを使用することによってアッセイできる。ＧＰ配列変異体（単一成分又は、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質としてアッセイされる）は、それらが自然のＧＰと同じ結合特異性及び親和性、又はＧＰＸＴＥＮに含めるのに適したいくつかのフラクションを有しているかどうかを判断するために、競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用してネイティブＧＰと比較することができる。
本発明は、ＧＰＸＴＥＮがＧＰ標的受容体若しくはリガンドに対して示す親和性が、ＸＴＥＮに結合していない天然のＧＰが標的受容体若しくはリガンドに対して示す親和性の、少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％又はそれ以上である可能性のある、単離したＧＰＸＴＥＮを提供する。いくつかの例において、対象ＧＰＸＴＥＮとＧＰＸＴＥＮ天然の受容体若しくはリガンドとの間の結合親和性であるＫｄは、少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、又は少なくとも約１０−７Ｍ、又は少なくとも約１０−８Ｍ、又はＧＰＸＴＥＮと天然の受容体若しくはリガンドとの間の親和性は少なくとも約１０−９Ｍである。
他の場合において、本発明は、特にＧＰの受容体への結合親和性が低下するように設計された、単離されたＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。一実施形態において、ＸＴＥＮを含むそのような融合タンパク質は、ＧＰ成分のＣ末端に融合していた。いくつかの場合において、ＧＰＸＴＥＮは、結合親和性が低下するように構成することができ、結合親和性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の受容体結合アッセイにより評価されることを特徴とし、結合が自然のＧＰに比べて約１０％、又は約２０％、又は約４０％、又は約６０％、又は約８０％、又は約９０％削減されることを特徴とする。他の場合において、ＧＰＸＴＥＮは、結合親和性が低下するように構成することができ、結合親和性は、シグナル伝達によって評価されることを特徴とし、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、ネイティブＧＰのリガンドにより誘発されるものと比較して、バインドされたＧＰＸＴＥＮを用いて、約８０％未満、又は約６０％未満、又は約４０％未満、又は約２０％未満、又は１０％未満、又は約５％未満の細胞のシグナル伝達経路の活性化を誘発する。前述の場合において、結合親和性は、「実質的な減少」である。減少した結合親和性を有するそのようなＧＰＸＴＥＮの特定の構造の非限定的な例は、ＡＥ９１２−ＧＰ−ＡＥ１４４、ＡＥ９１２−ＧＰ−ＡＦ１４４、ＡＥ９１２−ＧＰ−ＡＥ２８８、ＡＭ９２３−ＧＰ−ＡＥ１４４、ＡＭ９２３−ＧＰ−ＡＦ１４４、ＡＭ９２３−ＧＰ−ＡＥ２８８から選択されたＧＰ融合タンパク質に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、又は、少なくとも約８５％の配列同一性、又は、少なくとも約９０％の配列同一性、又は、少なくとも約９５％の配列同一性、又は、少なくとも約９７％の配列同一性、又は、少なくとも約９９％の配列同一性である、融合タンパク質を含む。
いくつかの場合において、本発明のＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、少なくとも約１０％、
又は約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の、公知のｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的活性、もしくはｉｎ ｖｉｖｏで薬理学的効果に関して、又は、代謝状態及び障害の治療及び予防におけるネイティブＧＰの使用に関連した、融合タンパク質に結合していない対応するＧＰの生物学的活性のパーセントを保持する。ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質の保持された活性を評価するためにアッセイ可能な活性又は薬理学的効果の非限定的な例は、受容体結合に応答したカルシウムフラックス及び／又はシグナル伝達、ＧＰＸＴＥＮへの曝露及び／又はβ細胞の結果として得られる刺激効果の結果としての標的細胞内のインスリン濃度及び／又は生成、グルコース取り込み及び／又は恒常性、ＨｂＡｌｃ濃度、インスリン濃度、刺激されたＣペプチド、空腹時血糖値（ＦＰＧ）、血清サイトカイン濃度、ＣＲＰ値、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）から派生したインスリン分泌及びインスリン感受性指数、だけでなく、体重、摂餌量、及び当該分野において公知の他の認められる糖尿病のマーカーを含み、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質又は結果として生じるＧＰＸＴＥＮに含まれるためのＧＰの活性を評価するための適切なパラメータになり得る。
前述の実施例のいくつかの場合において、ＧＰ構成要素の活性は、完全なＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質により明かであるが、その他の例においてＧＰ構成要素の活性は、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込まれた開裂配列にプロテアーゼが作用することによる、ＧＰの融合タンパク質からの開裂及び放出に際して、始めて明かになるであろう。前述の例においては、ＧＰ構成要素の受容体又はリガンドへの結合親和性がＸＴＥＮに結合した状態では低くなるように、上により詳細に記載したように、ＧＰＸＴＥＮ配列に組み込まれた、開裂配列の開裂を介してＸＴＥＮから放出された場合にはＧＰ構成要素の受容体又はリガンドへの結合親和性が増大するように、ＧＰＸＴＥＮを設計する。
その他の例においては、受容体介在性クリアランスを低下させることによって対象に投与したＧＰＸＴＥＮの終末相半減期を増大させるため、ＧＰ構成要素のＧＰ受容体への結合親和性が低くなるように、ＧＰＸＴＥＮを設計することができる。例えば、ＸＴＥＮを融合タンパク質のＧＰ構成要素のＣ末端に結合させる。その他の例においては、投与した組成物が原因である毒性又は副作用を低減させるため、ＧＰ構成要素のＧＰ受容体に対する結合親和性が低くなるようにＧＰＸＴＥＮを設計する。
従って本発明は、少なくとも第一のＧＰ、並びに第一の及び第二のＸＴＥＮを含み、Ｎ末端側からＣ末端側への構成要素の特定の配置を有する一本鎖融合タンパク質構築物を作出することによる、ＧＰＸＴＥＮの終末相半減期を延長する方法を提供し、ここで融合タンパク質中の第一のＮ末端からＣ末端への配置をとるＧＰ及びＸＴＥＮ構成要素は、第二のＮ末端からＣ末端への配置をとるＧＰＸＴＥＮと比較して、低い受容体介在性クリアランス（ＲＭＣ）とそれに対応する増大した終末相半減期を有する。前述の一実施形態において、ＧＰＸＴＥＮのＮ末端側からＣ末端側への配置はＸＴＥＮ−ＧＰＸＴＥＮであり、これはＮ末端側からＣ末端側への配置がＸＴＥＮ−ＧＰであるＧＰＸＴＥＮと比較して、低い受容体結合性を有する。前述の別の実施形態において、ＧＰＸＴＥＮの配置はＧＰ−ＸＴＥＮである。前述の実施形態において、２つのＸＴＥＮ分子は、その配列組成物又は長さが、同一であっても異なっていてもよい。単一のＧＰに結合した２つのＸＴＥＮを含む、前述の実施形態の非限定的な例としては、構築物ＡＥ９１２−ｈＧＰ−ＡＥ１４４、ＡＥ９１２−ｈＧＰ−ＡＥ２８８、ＡＥ８６４−ｈＧＰ−ＡＥ１４４、ＡＭ９２３−ｈＧＰ−ＡＥ１４４、及びＡＭ９２３−ｈＧＰ−ＡＥ２８８が挙げられる。本発明は、前述の例の相当する構成要素を表１〜３のＧＰ及び表５のＸＴＥＮで置換し、構築物が、相当する構成要素を別の位置に配置した場合と比較して低い受容体介在性クリアランスを有するように、例えば表７の配置で作出し得たようなその他の構築物についても検討する。いくつかの例において、終末相半減期を増大させる前述の方法は、受容体への結合が低下していない第二の配置をとるＧＰＸＴＥＮの半減期と比較して、終末相半減期を少なくとも約３０％、又は約５０％、又は約７５％、又は約１００％、又は約１５０％、又は約２００％、又は約３００％、又は約４００％又はそれ以上増大させる配置のＧＰＸＴＥＮを提供する。本発明は、オンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）の低下又はオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の増大のいずれかの結果、受容体への結合親和性が低下した特定のリガンドはＮ−又はＣ末端いずれかの障害による影響を受ける場合があること（図３に示すように）、及び末端を組成物の別のポリペプチド（ＧＰの別の分子、ＸＴＥＮ、若しくはスペーサー配列のいずれか）への結合に用いることにより結合親和性の低下が生じるという事実を利用する。ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質について特定の配置を選択することにより、受容体介在性クリアランス率の低下が達成され得るような、受容体への結合親和性の度合いの低下がもたらされ得る。ポリペプチドのその受容体への結合が活性化を起こさない場合、その結合はＲＭＣを誘導しないが、受容体の活性化はＲＭＣを誘導するように、通常、受容体の活性化はＲＭＣと関連する。しかしながら、いくつかの例、特にリガンドが高いオフレートを有する例において、リガンドはそれでもなお受容体介在性クリアランスを引き起こすことなく細胞シグナル伝達を開始するのに十分なほど結合することができ、この最終的な結果は、ＧＰＸＴＥＮのバイオアベイラビリティが維持されるということである。そのような例において、配置されたＧＰＸＴＥＮは、より高度にＲＭＣを誘導する配置をとるＧＰＸＴＥＮと比較して、長い半減期を有する。
受容体介在性クリアランスを低下させるためのグルコース調節ペプチド受容体への結合親和性の低下が求められるが、少なくとも部分的な生理活性の保持が望まれる場合、望ましい受容体活性化を得るために十分な結合親和性を、例えばシグナル伝達の開始によって、やはり維持しなければならないことは明らかであろう。従って、一実施形態において本発明は、ＧＰＸＴＥＮの標的受容体への結合親和性が、結合親和性が低下しない配置をとる対応するＧＰＸＴＥＮＧＰＸＴＥＮの親和性の、約０．０１％〜４０％、又は約０．１％〜３０％、又は約１％〜２０％の範囲になるように配置したＧＰＸＴＥＮを提供する。従って、配置されたＢＸＴＥＮの結合親和性は、ＧＰ構成要素の標的受容体への結合親和性が低下しない配置をとる対応するＧＰＸＴＥＮ又は融合タンパク質に結合していないＧＰの結合親和性と比較して、同等の条件で決定した場合に、好ましくは少なくとも約６０％低下、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９９％低下する。異なる表現を用いて表すと、配置されたＧＰＸＴＥＮのＧＰ構成要素は、ＧＰ構成要素の結合親和性が低下しない配置をとるＧＰＸＴＥＮの対応するＧＰ構成要素の結合親和性の、約０．０１％、又は少なくとも約０．１％、又は少なくとも約１％、又は少なくとも約２％、又は少なくとも約３％、又は少なくとも約４％、又は少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも４０％と同程度の結合親和性を有する。本段落において明細書の上部で記載した前述の実施形態において、配置されたＧＰＸＴＥＮの標的受容体への結合親和性は、対応する天然のＧＰ又は対応するＧＰ構成要素の結合親和性が低下しない配置をとるＧＰＸＴＥＮと比較して「実質的に低下」するものであり得る。従って、本発明は、上記において例を挙げたように、ＧＰＸＴＥＮが十分な数の受容体に結合してそれらを活性化させ、所望されるｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的反応を得ることができるが、そのような反応を得るのに必要とされる以上の数の受容体を活性化させないように配置することによってＲＭＣを低下させた組成物及びこの組成物の作出方法を提供する。本段落において明細書の上部で記載した前述の実施形態において、増大した半減期は、ＸＴＥＮに結合していないＧＰと比較して又はＧＰ構成要素が、低頻度での投与にもかかわらず臨床的効力を有する組成物を生じる、十分な生物学的又は薬理学的活性を維持するように配置されたＧＰＸＴＥＮと比較して、より多い用量及び少ない投与頻度での投与を可能にすることができる。
ＶＩ）．本発明の組成物の使用
別の態様において本発明は、ＧＰが介在する疾患、障害又は状態に有益な効果をもたらす方法を提供する。本発明においては、最小の有効投与量及び最大の耐量との間の、相対的に短い終末相半減期及び／又は狭い治療ウィンドウを有するＧＰの欠点及び／又は限界を取り扱う。
グルコースの恒常性に関わる多くの過程は複数のペプチド及びホルモンによって制御され、そしてそのようなペプチド及びホルモン、並びにそのアナログがグルコース調節ペプチド関連疾患、障害及び状態の治療において有効であることが見いだされた。しかしながら、市販されているグルコース調節ペプチドの使用は、そのような疾患、障害及び状態に罹患した対象の管理において最適な効果をもたらさない。具体的には、グルコース調節ペプチド関連疾患及び障害の治療に用いられるペプチド及びホルモン生物製剤にとって重要なことは、用量の最適化及び投薬頻度である。グルコース調節ペプチドの半減期は短いため、臨床的有益性を達成するためには必然的に頻回投与となり、このことはそのような患者の管理を困難にする。
一実施形態において本発明は、治療上又は予防上有効量のＧＰＸＴＥＮを対象に投与する工程を含む、グルコース調節ペプチド関連疾患、障害又は状態を有する対象において有益な効果を達成するための方法を提供すし、ここで前記投与は、グルコース調節ペプチド関連疾患、障害又は状態に関連する１つ以上の生化学的又は生理学的な指標又は臨床エンドポイントの改善を生じる。有効量とは、グルコース調節ペプチド関連疾患、障害又は症状の治療の補助（例えば、治癒又は重篤度の低減）又は予防（例えば、発症の「見込み」又は重篤度の低下）において有益な効果を生じるものである。いくつかの例においては、有益な効果を達成するための方法には、若年性糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満、急性低血糖症、急性高血糖、夜間低血糖症、慢性の高血糖、グルカゴノーマ、気道の分泌障害、関節炎、骨粗しょう症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、うっ血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺浮腫、高血圧、及び食物摂取の減少が望まれている障害、脳卒中、過敏性腸症候群、心筋梗塞（例えば、それに関連する罹患率及び／又は死亡率の削減）、脳卒中、急性冠症候群（例えば、Ｑ−波の欠如による特徴づけられる）、心筋梗塞、手術後の異化変化、冬眠心筋や糖尿病性心筋症、不十分な尿中ナトリウム排泄量、過度の尿中カリウム濃度、有毒な循環血液量過多に関連付けられている状態又は障害（例えば、腎不全、うっ血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、冬眠心筋梗塞、外科手術後の異化変化、及び高血圧）、多嚢胞性卵巣症候群、呼吸困難、腎症、左室収縮機能障害（例えば、異常な左室駆出率を有する）、下痢などの胃腸障害、術後のダンピング症候群や過敏性腸症候群（すなわち、幽門洞−十二指腸（ａｎｔｒｏ−ｄｕｏｄｅｎａｌ）運動性の阻害を介する）、重大な病気の多発神経障害（ＣＩＰＮ）、高脂血症、虚血後の血流の再灌流によって引き起こされる臓器組織損傷、及び冠状動脈性心臓病の危険因子（ＣＨＤＲＦ）症候群、未修飾のグルコース調節ペプチド（例えばエキセンジン４、ＧＬＰ−１又はグルカゴン）が利用できる任意の他の兆候、ＧＰを利用することができる（ただし対象のペプチドのレベルを調節する内因性のグルコースが必ずしも不足ないもののために）他の任意の兆候を含むがこれらには限定されない、グルコース調節ペプチド関連疾患、障害又は症状を有する対象を治療するために、治療上有効量の融ＰＸＴＥＮ合タンパク質組成物を投与する工程を含む。
別の実施形態において、本発明は、ペプチド関連の疾患、障害又は欠陥を規制するグルコースを有する被験者におけるインスリン分泌を刺激する方法を提供する。この方法は、ＸＴＥＮに結合していないＧＰであって、かつ、同等の用量で投与されたＧＰを受けている対象と比較して、インスリンの血中レベルの上昇及び／又はインスリンの血中レベルが上昇している期間の増大をもたらす、治療上有効量のＧＰＸＴＥＮを対象に投与する工程を含む。いくつかの例において、ＸＴＥＮに結合していないＧＰ受容対象と比較、及び、匹敵する用量で投与して、インスリン分泌、及び／又は曲線下の増加は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約１００％、又は少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％である。
本明細書に記載したようにＧＰＸＴＥＮのＰＫ指標が向上した結果、グルコース調節ペプチド関連疾患、障害若しくは状態の症状、又は臨床的な異常を予防、治療、軽減、反転若しくは回復させるために、又は治療を受ける対象の生存を長くするために、ＧＰは、対応するＸＴＥＮに結合していないよりも長い投与間隔で投与され得る。
本発明の方法は、望まれる指標又は臨床効果を達成するために十分な期間、治療上有効量のＧＰＸＴＥＮを連続して投与すること、及び／又は望まれる指標又は臨床効果を維持するために治療上有効量のＧＰＸＴＥＮを連続して投与することを含み得、そしてそのような治療上有効量の連続投与をＧＰＸＴＥＮの治療上効果的な投与計画として、すなわち、本明細書に記載したがこれらには限定されない代謝性疾患の病期又は状態におけるいずれかの臨床徴候又は症状、態様、測定指標若しくは特徴に持続した有益な効果をもたらす、治療上有効量として示される用量の融合タンパク質組成物を連続して投与するための計画として、確立する。一実施形態においてこの方法は、ＸＴＥＮ配列に結合したＧＰと及び少なくとも１種の薬学上許容可能な担体とを含むＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を含む、治療上有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含み、この投与により、ＸＴＥＮに結合していないＧＰを含む医薬組成物であって、かつ、同等の用量で投与される医薬組成物の投与による介入の効果と比較して、少なくとも１つの指標、生理的な状態、又はＧＰ構成要素が介在する臨床転帰（この非限定的な例は上に記載した）の大きな改善がもたらされる。一実施形態において、医薬組成物は、治療上有効量の用量で投与される。別の実施形態において医薬組成物は、本明細書において定義したような治療上効果的な投与計画により、投与期間にわたり複数回連続して投与される。
治療上有効量のＧＰＸＴＥＮは、疾患病期、年齢、性別、及び対象の体重、並びに個々の対象における所望される反応を誘導する抗体又は抗体部分の能力、のような因子により多様になり得る。治療上有効量はまた、ＧＰＸＴＥＮの治療における有益な効果が、ＧＰＸＴＥＮのいずれかの毒性又は有害効果を上回る量である。予防上有効量とは、所望される予防的な結果を達成するために必要な期間にわたって要求されるＧＨＸＴＥＮの量を指す。
本発明の方法には、患者における回復を簡便にするように、投与間隔を長くするために、及び持続的な効果を達成するために必要な薬剤の量を減少させるために、長時間作用型のＧＰＸＴＥＮ組成物が好ましい。一実施形態において治療方法は、治療上有効量のＧＰＸＴＥＮをそれを必要とする対象に投与する工程を含み、この投与により、融合タンパク質に結合していない対応するＧＰ構成要素であって、かつ、同等の用量において対象に投与されるＧＨ構成要素と比較して、組成物中の融合タンパク質が確立された治療ウインドウ中で推移できる期間が長くなる。いくつかの例において、治療ウインドウ中に維持される期間は、融合タンパク質に結合していない対応するＧＰ構成要素であって、かつ、比較できる用量において対象に投与されるＧＰ構成要素の少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約４０倍長くなる。この方法はさらに、治療上効果的な用量計画を用いてそれを必要とする対象にＧＰＸＴＥＮを複数回連続投与した場合、融合タンパク質に結合していない対応するＧＨであって、かつ、ＧＰについて確立された投与計画で投与されるＧＰと比較して、融合タンパク質の血中レベルにおける連続したＣｍａｘのピーク及び／又はＣｍｉｎの谷との間の時間間隔の増大を生じ得る。前述の実施形態において、連続したＣｍａｘのピーク及び／又はＣｍｉｎの谷との間の時間間隔は、融合タンパク質に結合していない対応するＧＰ構成要素であって、かつ、ＧＰについて確立された投与計画で投与されるＧＰ構成要素の時間間隔の、少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約４０倍になり得る。この段落の上記で記載した実施形態において、融合タンパク質の投与は、融合タンパク質に結合していない対応するＧＰ構成要素であって、かつ、同等の単位用量又は投与計画において対象に投与されるＧＰ構成要素と比較して、モル換算してより低容量の単位用量の融合タンパク質を用いた場合にも、対象疾患、状態、または状態の評価に有用だとして本明細書に開示した指標のうちの少なくとも１つの改善をもたらすことができる。
この治療方法は、グルコース調節ペプチド疾患、障害又は状態に関連する１つ以上の指標の改善に効果を及ぼす、治療上効果的な用量計画を用いてＧＰＸＴＥＮを投与する工程を含む。いくつかの場合において、対象へのＧＰＸＴＥＮの投与は、１つ以上の生化学的な、生理的な、又は臨床指標の改善を生じることができ、この改善の度合いは、同じアッセイ又は測定される臨床指標に基づいて決定したＸＴＥＮに結合していない対応するＧＰ構成要素を投与した場合の度合いよりも大きいものである。その他の場合において、対象へのＧＰＸＴＥＮの投与は、１つ以上の生化学的な、生理的な、又は臨床指標の活性化を生じることができ、この活性化の度合いは、同じアッセイ又は測定される臨床指標に基づいて決定したＸＴＥＮに結合していない対応するＧＰ構成要素を投与した場合の活性化よりも長期間にわたる。前述の一実施形態において、対象へのＧＰＸＴＥＮの投与は、対象に投与されるＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して少なくとも約１０％、又は約２０％、又は約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又はそれ以上の、対象における血中ＧＰレベルのピーク濃度及び曲線下面積の改善を生じることができる。前述の別の実施形態において、対象へのＧＰＸＴＥＮの投与は、これらに制限されはしないが、ＨｂＡ１ｃ濃度、インスリン濃度、刺激Ｃペプチド、空腹時血糖値（ＦＰＧ）、血清サイトカインレベル、インスリン分泌、及び経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）、体重、摂取量に由来するインスリン感受性指標から選択される１つ以上の度合の改善を生じることができる。
本発明はさらに、本明細書に示した方法に従って使用するＧＰＸＴＥＮを、グルコース調節ペプチド関連疾患、障害、及び症状の治療に有用なその他の治療方法及び医薬組成物と併せて投与され得る、又はグルコース調節ペプチドが補助療法となる条件（例えば、インスリン耐性及び血糖コントロール不良）に投与することについて検討する。そのような組成物には、例えば、ＤＰＰ−ＩＶ阻害薬、インスリン、インスリンアナログ、ＰＰＡＲガンマアゴニスト、デュアルＰＰＡＲアゴニスト、ＧＬＰ−１アゴニスト又はアナログ、ＰＴＰ１Ｂ阻害薬、ＳＧＬＴ阻害薬、インスリン分泌促進薬、ＲＸＲアゴニスト、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３阻害薬、インスリン感作物質、免疫調節薬、ベータ−３アドレナリン受容体アゴニスト、Ｐａｎ−ＰＰＡＲアゴニスト、１１ベータ−ＨＳＤ１阻害薬、ビグアニド、アルファ−グルコシダーゼ阻害薬、メグリチニド、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素及びその他当該分野において既知の糖尿病治療薬、又は降圧剤、カルシウムチャネル遮断剤、及び関連製品が含まれ得る。いくつかの場合においては、ＧＰＸＴＥＮを投与することにより、対象における同等な臨床効果又は疾患、障害若しくは状態の測定指標を達成するために合わせて投与される医薬組成物の量を、より低用量にすることができ得る。
別の態様において本発明は、所望される薬理学的又は医薬特性を有するＧＰＸＴＥＮ組成物の設計方法を提供する。グルコース調節ペプチド関連疾患、障害、及び状態の治療における治療用効力の改善、ＧＰと比較した場合の融合タンパク質の薬物動態学的特徴の向上、薬理学的効果を達成するために必要な用量又は投与頻度の低減、医薬特性の向上、及びＧＨ構成要素が長期間治療ウインドウ中に維持される能力の向上、を含む様々な目的（融合タンパク質に結合していないＧＨと比較した）を考慮して、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を設計及び準備する。
通常、融合タンパク質及び図４〜６に示したような本発明の組成物の設計及び生産工程には、（１）特定の疾患、障害又は症状の治療に対するＧＰ（例えば、天然のタンパク質、アナログ又は活性をもつ誘導体）の選択；（２）生じるＧＰＸＴＥＮに所望のＰＫ及び物理化学的特徴（例えば、その組成物を対象に投与すると、ＸＴＥＮに結合していないＧＰに比較して、非常に長い期間融合タンパク質が治療ウインドウ中に維持されるようになる）を付与し得るＸＴＥＮを選択する工程；（３）所望される効力又はＰＫ指標を達成するための、ＧＰＸＴＥＮのＮ末端側からＣ末端側への配置を確立する工程；（４）配置されるＧＰＸＴＥＮをコードする発現ベクターの設計を確立する工程；（５）その発現ベクターで好適な宿主を形質転換する工程；及び（６）得られた融合タンパク質の発現及び回収、が含まれる。半減期が増大した（２４時間を上回る）又は治療ウインドウ中で維持される期間の延長が望まれるそれらのＧＰＸＴＥＮにおいて、組み込むために選択されるＸＴＥＮは通常、少なくとも約５００、又は約５７６、又は約８６４、又は約８７５、又は約９１２、又は約９２３のアミノ酸残基を有するであろう、この場合には単一のＸＴＥＮがＧＰＸＴＥＮに組み込まれる。別の実施形態においてＧＰＸＴＥＮは、前述の長さの第一のＸＴＥＮ、及び約１４４、又は約２８８、又は約５７６、又は約８６４、又は約８７５、又は約９１２、又は約９２３アミノ酸残基の第二のＸＴＥＮを含むことができる。
半減期の増大は必要とされないが、医薬特性（例えば、溶解度）の向上が求められるその他の場合においては、より短い長さのＸＴＥＮを含むＧＰＸＴＥＮを設計することができる。前述のいくつかの実施形態においてＧＰＸＴＥＮは、少なくとも約２４、又は約３６、又は約４８、又は約６０、又は約７２、又は約８４、又は約９６アミノ酸残基を有するＸＴＥＮに結合したＧＰを含むことができ、この場合、生理的な条件下における融合タンパク質の溶解度は、対応するＸＴＥＮに結合していないＧＨよりも、少なくとも３倍高く、あるいは、ＸＴＥＮに結合していないＧＰよりも少なくとも４倍、又は５倍、又は６倍、又は７倍、又は８倍、又は９倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍またはそれより高い。前述の一実施形態においてＧＰは、グルカゴンである。
別の態様において、本発明は、製造の簡便性を改善するためのＧＰＸＴＥＮ組成物の作出方法を提供し、その結果、天然のＧＰと比較して、安定性の向上、水溶性の向上、及び／又は処方の簡便性がもたらされる。一実施形態において本発明は、ＧＰの水溶性を向上させる方法を含み、この方法は融合していない状態のＧＰと比較して、生理的な条件下で、生じるＧＰＸＴＥＮが高濃度でも可溶性形態になることを達成できるように、１つ以上のＸＴＥＮにＧＰを結合させる工程を含む。融合タンパク質に組み込んだ場合にＧＰに水溶性の向上を付与するＸＴＥＮの特性に関わる因子には、ＸＴＥＮ融合パートナーの高い溶解度及び溶液中におけるＸＴＥＮ分子間の自己凝集の度合いが低いこと、が含まれる。いくつかの実施形態においてこの方法は、融合していないＧＰと比較して、その溶解度が、生理的な条件下において、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％高い、又は少なくとも約５０％高い、又は少なくとも約７５％高い、又は少なくとも約９０％高い、又は少なくとも約１００％高い、又は少なくとも約１５０％高い、又は少なくとも約２００％高い、又は少なくとも約４００％高い、又は少なくとも約６００％高い、又は少なくとも約８００％高い、又は少なくとも約１０００％高い、又は少なくとも約２０００％高い、又は少なくとも約４０００％高い、又は少なくとも約６０００％高い、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を生じる。
別の実施形態において、本発明は、ＧＰの品質保持期限を強化させる方法を含み、この方法は、得られるＧＰＸＴＥＮの品質保持期限が融合していない状態のＧＰよりも長くなるように選択した１つ以上のＸＴＥＮに、ＧＰを結合させる工程を含む。本明細書で使用する場合、品質保持期限とは、溶液中又はいくつかのその他の保存製剤中のＧＰ又はＧＰＸＴＥＮの機能活性が、過度な活性低下なしに、好適に維持される期間を指す。本明細書で使用する場合、「機能活性」とは、受容体又はリガンドへの結合能力、又は酵素活性、又は当該分野において知られているように、ＧＰと関連する既知の機能活性を１つ以上提示すること、のような薬理学的効果又は生理活性を指す。分解した又は凝集したＧＰは、溶液中に維持されるＧＰと比較して、通常、低い機能活性又は低いバイオアベイラビリティを有する。融合タンパク質に組み込んだ場合に、ＧＰの品質保持期限を延長させるためのこの方法の能力に関わる因子には、ＸＴＥＮ融合パートナーの、水溶性の向上、溶液中での自己凝集の低減、及び熱安定性の向上、が含まれる。具体的には、ＸＴＥＮが凝集する度合いが低いことは、ＧＰを高濃度で含む医薬調整物の調整方法を容易にし、そしてＸＴＥＮの熱安定性は、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質がより長い期間、可溶性及び機能的な活性を維持する特性に関係する。一実施形態においてこの方法は、同じ保管条件及び取扱い条件においた基準よりも高い活性を示し、「延長した」又は「長くなった」品質保持期限を有するＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を生じる。この基準は融合してないな完全長ＧＰであってもよい。一実施形態において方法は、単離したＧＰＸＴＥＮを、ＸＴＥＮがその非構造性構造を維持する能力を向上させ、ＧＰＸＴＥＮの製剤中での溶解度を、対応する融合していないＧＰよりも長期間維持する１種類以上の薬学上許容可能な賦形剤と共に処方する工程を含む。一実施形態において方法は、指定された時点で基準と比較した場合、並びに基準と同じ保管条件及び取扱い条件においた場合に、溶液中での機能活性を約１００％より高く、又は機能活性を約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％又は２００％より高く維持し、その結果、品質保持期限の強化を生じるＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を作出するために、ＧＰを１つ以上のＸＴＥＮに結合させる工程を含む。
品質保持期限は、保管を開始した時点での機能活性を用いて正規化した、保管後に維持される機能活性に関してもまた、評価することができる。機能活性の延長又は伸張によって表される、延長した又は伸張した品質保持期限を有する本発明のＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、同じ条件に同じ期間おかれたＸＴＥＮに結合していないＧＨの機能活性の、約５０％より高い、又は約６０％、７０％、８０％、又は９０％より高い活性と同等の活性を保持する。例えば、１つ以上のＸＴＥＮ配列に融合させたヒトエキセンジン１を含む本発明のＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、様々な温度条件下で、最大２週間、又は４週間、又は６週間又はそれ以上の期間、そのもともとの活性の約８０％又はそれ以上を保持し得る。いくつかの実施形態においてＧＰＸＴＥＮは、８０℃で１０分間加熱した場合に、溶液中におけるそのもともとの活性の少なくとも約５０％、又は約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、及びもっとも好ましくは少なくとも約９０％又はそれ以上を保持する。その他の実施形態においてＧＰＸＴＥＮは、３７℃で７日間加熱又は維持した場合に、液中におけるそのもともとの活性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又はあるいは少なくとも約９０％又はそれ以上を保持する。別の実施形態においてＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、約３０℃から約７０℃までの温度に、約１時間〜約１８時間の時間にわたって曝露した後に、その機能活性を少なくとも約８０％又はそれ以上を保持する。この段落で前述の実施形態において、特定の時点におけるＧＰＸＴＥＮの保持された活性は、対応する融合タンパク質に結合していないＧＰの少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍高いものであるだろう。
ＶＩＩ）．本発明の核酸配列
本発明は、ＧＰＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードする単離したポリ核酸及びＧＰＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードするポリ核酸分子に相補的な配列（その相同変異体を含む）を提供する。別の態様において本発明は、ＧＰＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードする単離したポリ核酸及び、ＧＰＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードするポリ核酸分子に相補的な配列（その相同変異体を含む）、の生産方法を包含する。通常、そして図４〜６に示したように、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の生産方法及び得られた遺伝子産物の発現方法には、ＧＰ及びＸＴＥＮをコードするヌクレオチドを組み合わせる工程、構成要素をインフレームで結合させる（ライゲーションする）工程、コード遺伝子を宿主細胞が推奨することができるものにとって適切な発現ベクター中に組み込む工程、発現ベクターを適切な宿主細胞に形質転換する工程、及び形質転換した宿主細胞中で融合タンパク質の発現を誘導する又はその発現を可能にする条件下で、宿主細胞を培養する工程、及びその結果、当該分野において既知の標準的なタンパク質の精製方法により、単離した融合タンパク質として回収されることができる、生物学的に活性なＧＰＸＴＥＮポリペプチドを生産する工程、が含まれる。本発明のポリヌクレオチド及び発現を作出するために、分子生物学における標準的な組換え技術を用いることができ、本明細書中に開示されるGPXTENをコードするポリヌクレオチド、遺伝子、及び発現ベクターを生む方法に適用することができる。
本発明では、適切な宿主細胞中でＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を直接発現させるための組換えＤＮＡ分子を生成するために、ＧＰＸＴＥＮをコードする核酸配列（又はその相補鎖）が用いられ得る。本発明の実施に好ましいことが想起される複数のクローニング方法があり、それら方法の多くを、本発明のＧＰＸＴＥＮ組成物融合タンパク質をコードする遺伝子又はその相補鎖を含む構築物を生成するために用いることができる。いくつかの場合においては、少なくとも第一のＧＰ及び少なくとも第一のＸＴＥＮポリペプチドを含む単量体ＧＰＸＴＥＮをコードする遺伝子又はその相補鎖を作出するために、クローニング方法が用いられるであろう。前述の一実施形態において遺伝子は、ＧＰ又は配列変異体をコードする配列を含むであろう。その他の場合においては、ＧＰＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質が宿主細胞中で発現させるための形質転換に用いられるであろう、少なくとも第一のＧＰ分子又はそのその補鎖並びに第一の及び少なくとも第二のＸＴＥＮ又はそれらの相補鎖をコードするヌクレオチドを含む、単量体ＧＰＸＴＥＮをコードする遺伝子を作出するために、クローニング方法が用いられる。この段落の前述の実施形態において遺伝子は、スペーサー配列をコードするヌクレオチドをさらに含む場合があり、このヌクレオチドは開裂配列をコードし得る場合もまたある。
所望されるＸＴＥＮ配列の設計において、ＸＴＥＮをコードする配列の作出に分子生物学的な「ビルディングブロック」法を使用するにもかかわらず、本発明の組成物のＸＴＥＮの非反復性の性質を達成することができることが発見された。このことは、上述したように、ペプチド配列モチーフをコードするポリヌクレオチドのライブラリーの使用によって達成された。このモチーフライブラリーは次にＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子を作出するためにライゲーション及び／又は多量体化される（図４及び５並びに実施例を参照のこと）。従って、発現した融合タンパク質のＸＴＥＮが、複数単位の４つの異なる配列モチーフしか含まなかったとしても、モチーフそれ自体が非反復性アミノ酸配列であるため、ＸＴＥＮ配列は全体として非反復性となる。従って、一実施形態において、ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで操作可能に連結した非反復配列、又はモチーフをコードする複数のポリヌクレオチドを含み、この場合、得られる発現ＸＴＥＮアミノ酸配列は非反復性である。
一方法においては、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質に対応するＤＮＡ配列を含む構築物をまず最初に準備する。標準的な方法により、ＧＰ ｍＲＮＡを保有し、そして検出可能なレベルでそれを発現していると考えられる組織又は単離した細胞を用いて調製したｃＡライブラリーから、組成物のＧＰをコードするＤＮＡを得うる。例えば約２０〜１００塩基の、目的のＧＰ遺伝子を同定するために設計されたプローブを用いて、標準的な分子生物学的技術を用い、ハイブリダイゼーションによって、ライブラリーをスクリーニングすることができる。プローブに対する最も良い候補は、得られたグルコース調節ペプチドへの高い相同性を有する配列を示し、十分な長さがあり、擬陽性を最小限にするために十分に明確なものであるが、１以上の位置においては配列が異なる可能性がある。必要に応じて、ｃＤＮＡに逆転写されない可能性がある前駆体及びプロセシング中間体のｍＲＮＡを検出するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．，前記，に記載されているような、標準的なプライマーエクステンション法を用いてコード配列を得ることができる。ＧＨ遺伝子を含むＧＰＸＴＥＮ構築物を準備するために十分な材料を得るために、その後、標的ＤＮＡ又はＲＮＡコード配列を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いることができる。ハイブリダイズする完全長遺伝子が所望のＧＰ遺伝子であることを確認するためのアッセイをその後行うことができる。これらの標準的な方法により，そのような提供源を用いて調製したｃＡライブラリーから、ＤＮＡを容易に得ることができる。ＧＰをコードする遺伝子はまた、ゲノムライブラリーから得ることもでき、又は公的に使用可能なデータベース、特許若しくは参考文献から得られたＤＮＡ配列を用いて、当該分野において既知の合成方法（例えば自動核酸合成、例えばＥｎｇｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｇｎｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．，２８：７１６−７３４，１９８９！））に記載されている方法の内の１つ）により、作出することができる。そのような方法は当該分野において周知であり、また、科学的及び特許文献に詳しく記載されている。例えば， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＣＡＳ）登録番号（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙにより発行されている）及び／又は ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（例えば，Ｌｏｃｕｓ ＩＤ，ＮＰ＿ＸＸＸＸＸ，及びＸＰ＿ＸＸＸＸＸ）から、配列を得ることができる。ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ又はＧｅｎＢａｎｋデータベース中の登録番号に対応し、目的のタンパク質のアミノ酸配列又はタンパク質の断片若しくは変異体を含む、モデルタンパク質識別名はワールドワードウェブ上のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブページ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能である。本明細書に示したそのような配列識別名、これらＣＡＳ及びＧｅｎＢａｎｋ及びＧｅｎＳｅｑアクセッション番号に関する要約のページ、並びに引用した雑誌出版物（例えばＰｕｂＭｅｄＩＤ番号（ＰＭＩＤ））はそれぞれ、その全体、特にそれらに記載されたアミノ酸配列に関して、参照することにより本明細書に組み入れられる。一実施形態において，ＧＰをコードする遺伝子は、表１〜３の任意のタンパク質のいずれか１つ、又はその断片若しくは変異体をコードする
発現融合タンパク質が単一のＧＰを含む場合、次に、対象ＧＰＸＴＥＮタンパク質のＧＰ部分をコードする遺伝子又はポリヌクレオチドを、生物系において高レベルのタンパク質を発現するために適切な転写及び翻訳配列の制御下にあるプラスミド又はその他のベクター構築物中にクローニングすることができる。その後の工程では、ＸＴＥＮをコードする二番目の遺伝子又はポリヌクレオチドを、構築物中のＧＰをコードする遺伝子に隣接して及びインフレームでクローニングすることにより、ＧＰ遺伝子のＮ及び／又はＣ末端をコードするヌクレオチドに遺伝的に融合させる。この第二の工程は、ライゲーション又は多量体化工程を通して行う。この段落の前述の実施形態においては、当然のことながら、作出された遺伝子構築物は、あるいは、それぞれの融合タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子の相補鎖であってもよい。
ＸＴＥＮをコードする遺伝子を１つ以上の工程において、実施例において詳細に記述した方法を含む完全に合成的な方法又は制限酵素を介したクローニングのような酵素処理、ＰＣＲ、オーバーラップエクステンションを組み合わせた合成方法のいずれかにより作出することができる。本明細書において開示した方法を、例えばＸＴＥＮをコードする短い配列のポリヌクレオチドを、所望される長さ及び配列のより長いＸＴＥＮ遺伝子にするためのライゲーションに、用いることができる。一実施形態においてこの方法は、ＸＴＥＮモチーフをコードするコドン最適化オリゴヌクレオチド又は約９〜１４アミノ酸、若しくは約１２〜２０アミノ酸、若しくは約１８〜３６アミノ酸、若しくは約４８〜約１４４アミノ酸、若しくは約１４４〜約２８８若しくはそれより長い長さの配列セグメント、又は前述の範囲の長さのモチーフ若しくはセグメントの組み合わせの２つ以上を結合させる。
あるいは、開示した方法を、ＸＴＥＮをコードする配列を、所望の長さのより長い配列にするための多量体化に用いることができる。例えば、ＸＴＥＮの３６アミノ酸をコードする遺伝子を７２アミノ酸をコードする遺伝子になるように二量体化、そして１４４アミノ酸、さらに２８８アミノ酸などになるように二量体化することができる。多量体化しても、使用した最も短い単位のモチーフにおいて選択されたコドンの設計を介して、ＸＴＥＮをコードする遺伝子の有する反復性が低い又は実質的に反復性を有さないようにＸＴＥＮポリペプチドを構築することができ、このことは形質転換した宿主中でのコード遺伝子の組換えを低減させ及び安定性を向上させることができる。非反復性配列の、ＸＴＥＮをコードする遺伝子を、遺伝子合成の標準的な技術を用いてオリゴヌクレオチドから組み合わせることができる。遺伝子の設計は、コドン使用頻度及びアミノ酸組成物を最適化するアルゴリズムを用いて行うことができる。本発明の一方法においては、図４及び５に示したように、相対的に短いＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチド構築物のライブラリーを作出し、次にこれを組み合わせる。このライブラリーは、ライブラリー中の各メンバーが同じアミノ酸配列を有するが、多くの異なるコード配列が可能になるような、一様なコドンのライブラリーとなる可能性がある。そのようなライブラリーを、部分的に無作為化したオリゴヌクレオチドから組み合わせることができ、そして配列モチーフを含むＸＴＥＮセグメントのライブラリーの構築のために用いることができる。各位置におけるアミノ酸の選択並びにコドン使用頻度を制御するために、無作為化法を最適にすることができる。前述の目的を達成するための方法の例を、実施例において開示する。
ａ、ポリヌクレオチドライブラリー
別の態様において本発明は、所望される長さ及び配列のＸＴＥＮをコードする遺伝子を組み合わせるために用いることができる、ＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを提供する。
特定の実施形態においてＸＴＥＮをコードするライブラリー構築物は、固定された長さのポリペプチドセグメントをコードするポリヌクレオチドを含む。最初の工程として、９〜１４アミノ酸残基のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドのライブラリーを組み合わせることができる。好ましい実施形態においては、１２アミノ酸のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドらリブラリーを組み合わせる。
ＸＴＥＮをコードする配列セグメントをより長い配列をコードするように、二量体化又は多量体化することができる。二量体化又は多量体化は、ライゲーション、オーバーラップエクステンション、ＰＣＲアセンブリー又は類似した、当該分野において既知のクローニング技術によって行うことができる。この工程は、生じるＸＴＥＮをコードする配列が、ＸＴＥＮをコードする遺伝子を提供する配列の構成及び所望される長さに達するまで、複数回繰り返すことができる。理解できるように、例えば、１２アミノ酸のモチーフをコードするポリヌクレオチドのライブラリーを、３６アミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリーになるように二量体化及び／又はライゲーションすることができる。本発明においては、異なる長さ、例えば、９〜１４アミノ酸の長さのモチーフをコードするモチーフのライブラリーからは、２７〜４２アミノ酸をコードするライブラリーが生じると考えられる。次に、２７〜４２アミノ酸、好ましくは３６アミノ酸（実施例に示すように）をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを、本明細書で開示したようなＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子中に組み込むための、所望の長さのＸＴＥＮ配列をコードする、連続したより長い長さのポリヌクレオチドを含むライブラリーになるように、順に二量体化することができる。いくつかの実施形態においてライブラリーは、特定の配列のＸＴＥＮファミリーに限定される、例えば表１のＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、又はＡＱ配列に限定されるアミノ酸をコードする、ポリヌクレオチドの組み合わせであり得る。その他の実施形態においてライブラリーは、２つ以上の表１のモチーフファミリー配列をコードする配列を含むことができる。３６ｍｅｒをコードするライブラリー中のポリヌクレオチド配列の、代表的で非限定的な名前及び配列を表１０〜１３に示し、それらの作出に用いられた方法を実施例においてより詳細に記載する。その他の場合においてＸＴＥＮをコードするライブラリーを、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のコドンがグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）アミノ酸からなる群より選択される、アミノ酸をコードする無作為化した配列と結合しているポリヌクレオチドコドンのセグメントから構築することができる。その後このライブラリーを、例えば、４８、７２、１４４、２８８、５７６、８６４、９１２、９２３、１３１８のアミノ酸、又は全長が最大約３０００アミノ酸、並びにその中間の長さで、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質の構成要素として発現させた場合に、コードされたＸＴＥＮが本明細書において開示した１つ以上の特性を有することができるＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチド配列ライブラリーになるように、連続した二量体化又はライゲーションに用いることができる。いくつかの例においては、ポリヌクレオチドライブラリー配列は以下により詳細に記述した、「シークエンスアイランド」をもまた含む場合もある。
図５は、ＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物及び本発明の実施形態におけるＧＰＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の組み合わせに含まれる、代表的で非限定的な工程のフローチャートの模式図である。個々のオリゴヌクレオチド５０１を１２アミノ酸（「１２−ｍｅｒ」）のモチーフである配列モチーフ５０２になるようにアニーリングさせることができ、これを次にＢｂｓＩ及びＫｐｎＩ制限酵素部位を有するオリゴ５０３とライゲーションする。所望の長さのＸＴＥＮ遺伝子５０４が得られるまで、ライブラリー由来の配列モチーフを１２−ｍｅｒにさらにアニーリングさせる。ＸＴＥＮ遺伝子をｓｔｕｆｆｅｒベクター中にクローニングする。ベクターは、Ｆｌａｇ配列５０６と、それに続くＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ部位に隣接したｓｔｕｆｆｅｒ配列を任意にコードすることができ、この例では単一のＧＰ遺伝子（本実施例のｈＧＨをコードする）５０８、単一のＧＰを含むＧＰＸＴＥＮをコードする遺伝子５００が得られる。ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチド及び前駆配列の、非網羅的なリストを表９に示した。
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
ＸＴＥＮをコードする遺伝子のライブラリーを、当該分野において既知の１つ以上の発現ベクターにクローニングすることができる。ライブラリー中での発現量が高いメンバーの同定を促進するために、レポータータンパク質に融合したものとしてライブラリーを構築することができる。公的なレポーター遺伝子の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、及びベータ−ガラクトシダーゼがある。スクリーニングすることにより、選択した宿主生物において高濃度で発現し得る、短いＸＴＥＮ配列を同定することができる。続いて、ランダムなＸＴＥＮ二量体のライブラリーを生成し、高レベルの発現を指標としてスクリーニングを繰り返すことができる。その後、発現レベル、プロテアーゼ安定性、又は抗血清への結合のような数多くの特性について、得られた構築物をスクリーニングすることができる。
本発明の一態様は、配列の作出においてコドンの最適化を行った、融合タンパク質の構成要素をコードするポリヌクレオチド配列を提供するものである。特に興味がもたれるものは、ポリペプチド組成物の発現の増加及び生産宿主におけるコード遺伝子の安定性が向上、という結果を有するコドン最適化である。例えば、コドン最適化は、グリシンに富んだ、又は非常に反復性のアミノ酸配列を有するＸＴＥＮ配列にとって、特に重要である。コドン最適化は、コンピュータープログラム（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ、Ｃ．、ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２２：３４６−５３）を用いて行われることができ、それらのうちのいくつかは、リボソーム休止を最小限にする（Ｃｏｄａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）。一実施形態においては、ライブラリー中の全メンバーが同じアミノ酸配列をコードするが、そのコドン使用頻度は多様であるコドンライブラリーを構築することにより、コドン最適化を行うことができる。そのようなライブラリーを、発現量が高く、かつ、ＸＴＥＮを含む製品の大規模生産に特に好適な遺伝的に安定なメンバーについてスクリーニングすることができる。ＸＴＥＮ配列を設計する場合には数多くの特性を考慮することができる。コードＤＮＡ配列中の反復性を最小限にすることができる。加えて、生産宿主中での使用頻度がきわめて低いコドンの使用を避ける又は最低限にすることができる（例えば大腸菌におけるＡＧＧ及びＡＧＡアルギニンコドン、並びに１つのロイシンコドン）。大腸菌の例では、発現量の多いタンパク質においては、２つのグリシンコドン、ＧＧＡ及びＧＧＧ、はまれにしか使用されない。従って、ＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子のコドン最適化が強く求められる場合がある。高レベルのグリシンを含むＤＮＡ配列は、不安定性又は低い発現レベルを引き起こす場合のある、高いＧＣ含量になる傾向にある。従って、可能な場合には、ＸＴＥＮをコードする配列のＧＣ含量が、ＸＴＥＮの生産に用いられるだろう生産生物に好適になるように、コドンを選択することが好ましい。
任意に、完全長ＸＴＥＮをコードする遺伝子は、１つ以上のシークエンスアイランドを含み得る。本明細書中においては、シークエンスアイランドとは、ＸＴＥＮライブラリー構築物配列からは区別され、完全長のＸＴＥＮをコードする遺伝子中には存在しない又は存在するとは考えられない制限酵素部位を含む、短い長さの配列である。一実施形態において、シークエンスアイランドの配列は、５’−ＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＧＧＧＡＧＧＴ−３’である。別の実施形態において、シークエンスアイランドの配列は、５’−ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴ−３’である。
別の方法として、ライブラリー中の全メンバーが同じアミノ酸配列をコードするが、配列におけるそれぞれのアミノ酸のコドン使用頻度が多様であるコドンライブラリーを構築することができる。そのようなライブラリーを、発現量が高く、かつ、ＸＴＥＮを含む製品の大規模生産に特に好適な遺伝的に安定なメンバーについてスクリーニングすることができる。
任意に、望ましくない配列を含む単離物を除去するために、ライブラリー中のクローンについて配列決定を行うことができる。短いＸＴＥＮ配列から構築した、最初のライブラリーのアミノ酸配列にはいくつかの変異型が含まれる可能性がある。例えば、特定に位置に数多くの親水性アミノ酸が生じることが可能になるように、いくつかのコドンを無作為化することができる。多量体化を繰り替える工程の間に、得られたライブラリーメンバーを、溶解度又はプロテアーゼ抵抗性のようなその他の特徴についてスクリーニングすることができ、加えて発現量の高さについてスクリーニングすることができる。
所望の長さ及び特性のＸＴＥＮをコードする遺伝子を選択したら、その方法は、構築物中のＧＰをコードする遺伝子に隣接して及びインフレームで、又は任意にスペーサー配列に隣接してクローニングすることにより、ＧＰ遺伝子のＮ及び／又はＣ末端をコードするヌクレオチドに遺伝的に融合させることができることを提供する。本発明は、コードされるＧＰＸＴＥＮに依存して、様々な前述の置換を提供する。例えば、上に図示した、式ＶＩの態様のような、１つのＧＰと２つのＸＴＥＮを含むＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を遺伝子がコードする場合、この遺伝子はＧＰをコードするポリヌクレオチドと、その組成及び配列長が同じであっても異なっていてもよい、２つのＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドを含むであろう。前述の非限定的な一実施形態においては、ＧＰポリヌクレオチドはエキセンジン４をコードし、Ｎ末端ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドはＡＥ９１２をコード氏、そしてＣ末端ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドはＡＥ１４４をコードするだろう。ＧＰ遺伝子をＸＴＥＮ構築物中にクローニングする工程は、ライゲーション又は多量体化工程を介して行うことができる。図２に示したように、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする構築物を、構成要素ＸＴＥＮ ２０２、ＧＰ ２０３、及びスペーサー配列 ２０４を異なる配置で設計することができる。図２Ａに示したように、一実施形態において構築物は、以下の方向（５’から３’）又は逆向きに、構成要素ＧＰ ２０３及びＸＴＥＮ ２０２を含む単量体ポリペプチドをコードする、又はそれに相補的なポリヌクレオチド配列を含む。図２Ｂに示したように、別の実施形態において構築物は、以下の方向（５’から３’）又は逆向きに、ＧＰ ２０３、スペーサー配列 ２０４、及びＸＴＥＮ ２０２を含む単量体ポリペプチドをコードする、又はそれに相補的なポリヌクレオチド配列を含む。図２Ｃに示したように、別の実施形態において構築物 ２０１は、以下の方向（５’から３’）又は逆向きに、２分子のＧＰ ２０３及びＸＴＥＮ ２０２の構成要素をコードする、又はそれに相補的なポリヌクレオチド配列を含む単量体ポリペプチドをコードする。図２Ｄに示したように、別の実施形態において構築物は、以下の方向（５’から３’）又は逆向きに、２分子のＧＰ ２０３、スペーサー配列 ２０４、及びＸＴＥＮ ２０２の構成要素を含む単量体ポリペプチドをコードする、又はそれに相補的なポリヌクレオチド配列を含む。図２Ｅに示したように、別の実施形態において構築物は、以下の方向（５’から３’）又は逆向きに、ＧＰ ２０３、スペーサー配列 ２０４、第二のＧＰ分子 ２０３、及びＸＴＥＮ ２０２の構成要素を含む単量体ポリペプチドをコードする、又はそれに相補的なポリヌクレオチド配列を含む。図２Ｆに示したように、別の実施形態において構築物は、以下の方向（５’から３’）又は逆向きに、ＧＰ ２０３、ＸＴＥＮ ２０２、ＧＰ ２０３、及び第二のＸＴＥＮ ２０２の構成要素を含む単量体ポリペプチドをコードする、又はそれに相補的なポリヌクレオチド配列を含む。スペーサーポリヌクレオチドは、任意に開裂配列をコードする配列を含む場合がある。当業者には明らかであるように、前述のその他の置換も可能である。
本発明はまた、（ａ）表９のポリヌクレオチド配列、又は、（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的な配列、と高いパーセンテージの配列同一性を有するＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチド変異体を含むポリヌクレオチドをも包含する。高いパーセンテージの配列同一性を有するポリヌクレオチドは、前述の（ａ）又は（ｂ）と少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、あるいは少なくとも約８２％、あるいは少なくとも約８３％、あるいは少なくとも約８４％、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約８６％、あるいは少なくとも約８７％、あるいは少なくとも約８８％、あるいは少なくとも約８９％、あるいは少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約９１％、あるいは少なくとも約９２％、あるいは少なくとも約９３％、あるいは少なくとも約９４％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは少なくとも約９６％、あるいは少なくとも約９７％、あるいは少なくとも約９８％、及びあるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するポリヌクレオチドか、又はストリンジェント条件下で標的ポリヌクレオチド又はその相補鎖にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドである。
ヌクレオチド又はアミノ酸配列の相同性、配列類似性又は配列同一性は、ＢｅｓｔＦｉｔ又はＧａｐペアワイズ比較プログラム（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ． ５３７１１）のような既知のソフトウェア又はコンピュータープログラムにより、簡便に決定することもできる。ＢｅｓｔＦｉｔは、２つの配列間で最も一致する又は類似するセグメントを見つけるために、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの部分的な相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ． １９８１．２：４８２−４８９）を利用する。Ｇａｐは全体的なアライメント、つまり１つの配列全体と別の類似した配列の全体のアライメントを、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの方法を（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． １９７０．４８：４４３−４５３）用いて行う。配列相同性、類似性又は同一性の度合いを決定するために、ＢｅｓｔＦｉｔのような配列アライメントプログラムを用いる場合、デフォルトの設定を用いることができ、又は同一性、類似性若しくは相同性スコアを最適化するために適切な採点マトリックスを選択することができる。
「相補的な」核酸配列とは、標準的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの相補性の規定に従って、塩基対を形成することができる核酸配列である。本明細書で使用する場合、用語「相補的な配列」とは、上に示したものと同じヌクレオチド比較によって評価し得る場合に、又は本明細書において記載したようなストリンジェント条件下でＧＰＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができることを指標として決定した場合に、実質的に相補的な核酸配列を意味する。
得られるＧＰＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを次に、個別に発現ベクター中にクローニングすることができる。核酸配列は様々な方法によってベクター中に挿入され得る。通常、当該分野において既知の技術を用い、ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ベクター構成要素は通常、これらには限定されないが、１つ以上のシグナル配列、複製開始点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終止配列を含む。１つ以上のこれらの構成要素を含む好適なベクターの構築には、当業者に知られている、標準的なライゲーション技術が用いられる。そのような技術は当該分野において周知であり、そして科学的及び特許文献に詳細に記述されている。
様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態であってもよい。本発明は、宿主細胞に適合し、及び宿主細胞から認識され、並びにＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質の発現を制御するようにＧＰＸＴＥＮ遺伝子に操作可能に連結した、複製及び制御配列を含むプラスミドベクターの使用を提供する。ベクターは通常、複製開始点、並びに形質転換細胞中において、表現型での選択を提供することができるタンパク質をコードする配列を含む。例えば、大腸菌は、大腸菌種（Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５３： １５４ （１９７０））に由来するプラスミド、ｐＢＲ３２２を用いて形質転換され得る。ｐＢＲ３２２プラスミドはアンピシリン及びテトラサイクリン抵抗性のための遺伝子を含み、従って選択際の容易な手段を提供する。様々な細菌、酵母、及びウイルスについてのそのようなベクター配列が周知である。用いることができる、有用な発現ベクターには、例えば、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列のセグメントが含まれる。「発現ベクター」とは、好適な宿主中において、融合タンパク質をコードするＤＮＡの発現に影響を及ぼすことができる好適な制御配列に操作可能に連結したＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ構築物を指す。そのような制御配列には、転写に効果を及ぼすためのプロモーター、そのような転写を制御するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終止を制御する配列が含まれる。その他の好適なベクターには、これらには限定されないが、ＳＶ４０及びｐｃＤＮＡの誘導体、並びにＳｍｉｔｈ， ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ ５７：３１−４０（１９８８）に記載されたような、ｃｏｌ ＥＩ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸなどの既知の細菌性プラスミド、ｐＭＢ９及びその誘導体、ＲＰ４などのプラスミド、ＮＭ９８ ９などの数多くのｐｈａｇｅＩ誘導体のようなファージＤＮＡと、Ｍ１３などのその他のファージＤＮＡ、及び繊維状一本鎖ファージＤＮＡ；２ミクロンプラスミド又は２ｍプラスミドの誘導体などの酵母プラスミドと、セントロメアベクター及び種間を繋ぐ酵母シャトルベクター；昆虫又は哺乳類細胞において有用なベクターなどの、真核生物において有用なベクター；ファージＤＮＡ又は発現制御配列を用いるために改変されたプラスミドなどの、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから誘導したベクター；などが含まれる。そのベクターが複製可能であり、かつ、選択した宿主細胞中で生存可能なことが必要とされる。必要に応じて、低又は高コピー数のベクターを用いることができる。
原核生物宿主を用いた発現ベクターへの使用に好適なプロモーターには、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２７５：６１５ （１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：５４４ （１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ８：４０５７ （１９８０）； 欧州特許明細書第３６，７７６号］、並びにｔａｃプロモーターのような雑種プロモーター［ｄｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０：２１−２５ （１９８３）］が含まれ、これらの全てがＧＰＸＴＥＮポリペプチドをコードするＤＮＡに操作可能に連結されるだろう。細菌系に使用するプロモーターにはまた、ＧＰＸＴＥＮポリペプチドをコードするＤＮＡに操作可能に連結した、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列も加えることができる。
本発明は、例えば、非融合移入ベクター及び融合移入ベクターの両方を用いるバキュロウイルス発現系を含む、その他の発現系の使用についても検討する。非融合移入ベクターとしては、これらには限定されないが、ｐＶＬ９４１（ＢａｍＨＩクローニング部位、Ｓｕｍｍｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４：３９０−４０２ （１９７８）で入手できる）、ｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨＩ、Ｓｍａｌ、Ｘｂａｌ、ＥｃｏＲＩ、ＩＶｏｔｌ、Ｘｍａｌｌｌ、ＢｇＩＩＩ、及びＰｓｔｌ クローニング部位、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２（ＢｇＩＩＩ， Ｐｓｔｌ， ＮｏｔＩ， ＸｍａＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｘｂａｌｌ、Ｓｍａｌ、及びＢａｍＨＩ クローニング部位、Ｓｕｍｍｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４：３９０−４０２ （１９７８）及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ＢａｍＨＩ、ＢｇＩＩＩ、Ｐｓｔｌ、Ｎｃｏｌ、及びＨｉｎｄｉ ＩＩ クローニング部位、ブルー／ホワイト組み換えスクリーニングを用いた、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など、及び融合移入ベクターとしては、これらには限定されないが、ｐＡｃ７ ００（ＢａｍＨＩ及びＫｐｎｌクローニング部位、ＢａｍＨＩ組み換え部位が開始コドンで開始される、Ｓｕｍｍｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４：３９０−４０２ （１９７８））、ｐＡｃ７０１及びｐＡｃ７０−２（ｐＡｃ７００と同じだが、リーディングフレームが異なる）、ｐＡｃ３６０（ポリヘドリン開始コドンの下流のＢａｍＨＩクローニング部位３６塩基対、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（１９９５））及びｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＢａｍＨ Ｉ、ＢｇＩ ＩＩ、Ｐｓｔｌ、Ｎｃｏ ｌ、及びＨｉｎｄ ＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ生成のためのＮ−末端ペプチド、及びプラークのブルー／ホワイト組み換えスクリーニング、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（２２０））などを用いることができる。
哺乳類の発現ベクターは、複製開始点、好適なプロモーター及びエンハンサー、並びに任意の必要とされるリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終止配列、及び５’隣接非翻訳配列、を含み得る。非翻訳遺伝子エレメントを提供するために、ＳＶ４０のスプライシングから生じたＤＮＡ配列、及びポリアデニル化部位を用いてもよい。本発明においてその使用が検討される哺乳類の発現ベクターには、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーターのような誘導プロモーターを含むベクター、ＤＨＦＲ発現カセットを含む任意の発現ベクター又はｐＥＤ（Pstl, Sail, Sbal, Smal、及びEcoRIクローニング部位、クローン遺伝子とＤＨＦＲの両者を発現するベクターを用いた、Ｒａｎｄａｌ Ｊ． Ｋａｕｆｍａｎ， １９９１， Ｒａｎｄａｌ Ｊ． Ｋａｕｆｍａｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １６，１２ （１９９１））のようなＤＨＦＲ／メトトレキサート共増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ベクターが含まれる。あるいは、ｐＥＥ１４（ベクターがグルタミンシンセターゼ及びクローン遺伝子を発現するような、Hindlll,Xball, Smal, Sbal, EcoRI 、及びSellクローニング部位、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）のような、グルタミンシンテターゼ／メチオニンスルホキシミン共増幅ベクターがある。ｐＲＥＰ４（ＢａｍＨＩ ｒ ＳｆＨ、Ｘｈｏｌ、ＮｏｔＩ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄｉ ＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩ、及びＫｐｎｌクローニング部位、恒常的なＲＳＶ−ＬＴＲプロモータ、ハイグロマイシン選択マーカー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨＩ、ＳｆＨ、Ｘｈｏｌ、ＮｏｔＩ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｎｈｅｌ、ＰｖｕＩＩ、及びＫｐｎｌ クローニング部位、恒常的なｈＣＭＶ即時型初期プロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＥＰ４（．Ｋｐｎｌ、Ｐｖｕｌ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＮｏｔＩ、Ｘｈｏｌ、Ｓｆｉｌ、ＢａｍＨＩ クローニング部位，誘導性メタロチオネイン Ｈ 遺伝子プロモーター、ハイドロマイシン選択マーカー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨＩ、Ｘｈｏｌ、ＮｏｔＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｎｈｅｌ、及びＫｐｎｌ クローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ヒスチジノール選択マーカー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（Ｋｐｎｌ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄ ｌｌｌ、ＮｏｔＩ、Ｘｈｏ ｌ、Ｓｆｉ ｌ、ＢａｍＨ Ｉ クローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲ プロモーターｒ、Ｇ４１８選択マーカー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びｐＥＢＶＨｉｓ（RSV-LTR プロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂を介し精製可能であり、エンテロキナーゼにより切断されるN−末端ペプチド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの、エプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ）又は核抗原（ＥＢＮＡ）の制御下においてエピソームでの発現を誘導するベクターを使用することができる。
本発明で使用するために選択できる哺乳類の発現ベクターには、これらには限定されないが、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｈｉｎｄ ｌｌｌ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、Ｓｂａｌ、及びＡｐａｌ クローニング部位、Ｇ４１８選択、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｈｉｎｄ ＩＩ、Ｓｐｅｌ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、Ｘｂａｌ クローニング部位、Ｇ４１８選択、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが含まれる。本発明において使用することができるワクシニアウイルス哺乳類発現ベクター（例えば、Ｒａｎｄａｌｌ Ｊ． Ｋａｕｆｍａｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６．１２ （Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． Ｗｉｌｅｙ １９９１を参照のこと）には、これらには限定されないが、ｐＳＣ１１ （小さなクローン部位、ＴＫ−及びβゲル選択）、ｐＭＪ６０１（Ｓａｌ ｌ、Ｓｍａ ｌ、Ａ ｆｌＩ、Ｎａｒｌ、ＢｓｐＭｌＩ、ＢａｍＨＩ、Ａｐａｌ、Ｎｈｅｌ、ＳａｃＩＩ、Ｋｐｎｌ、及びＨｉｎｄｌｌｌクローニング部位、ＴＫ−及びゲル選択）、ｐＴＫｇｐｔＦｌＳ（ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ、ＳａＩＩＩ、Ａｃｃｌ、ＨｉｎｄＩＩ、Ｓｂａｌ、ＢａｍＨＩ及びＨｐａクローニング部位、ＴＫまたはＸＰＲＴ選択）などが含まれる。
本発明はにおいて使用することができる酵母発現系にはまた、これらには限定されないが、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸＪｂａｌ， Ｓｐｈｌ， Ｓｈｏｌ， ＮｏｔＩ， ＧｓｔＸＩ， ＥｃｏＲＩ， ＢｓｔＸＩ， ＢａｍＨＩ， Ｓａｄ， Ｋｐｎｌ、及びＨｉｎｄｌｌｌ クローニング部位、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（Ｘｂａｌｌ， Ｓｐｈｌ， Ｓｈｏｌ， ＮｏｔＩ， ＢｓｔＸＩ， ＥｃｏＲＩ， ＢａｍＨＩ， Ｓａｄ， Ｋｐｎｌ、及びＨｉｎｄｉ ＩＩ クローニング部位、 ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂を用いて精製され、エンテロキナーゼにより切断されるＮ−末端ペプチド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳベクターなどが含まれる。
加えて、キメラＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターは、薬剤選択マーカーを含んでいてもよい。そのようなマーカーは、キメラＤＮＡ分子を含むベクターのクローニング及び選抜及び同定において補助的な役割を果たす。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）阻害剤、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、ゼオシン、及びヒスチジノールに対する抵抗性を付与する遺伝子が有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のような酵素を使用してもよい。免疫学的なマーカーもまた使用することができる。遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現させることが可能な限り、任意の既知の選択マーカーを使用してもよい。選択マーカーのさらなる例は当業者において周知であり、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのレポーターも含まれる。
一実施形態においては、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物をコードするポリヌクレオチドを、発現宿主系に適切なＮ末端シグナル配列のＣ末端に融合させることができる。一般的にシグナル配列は、転座及び分泌過程に際してタンパク質からタンパク分解によって除去され、定義したＮ末端を生じる。細菌、酵母、昆虫、及び哺乳類の系を含む大部分の発現系について、多様なシグナル配列が記載されてきた。各発現系における、非限定的な、好ましい例のリストを本明細書の以下に記載する。大腸菌での発現において好ましいシグナル配列は、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、及びＤｓｂＡである。酵母での発現において好ましいシグナルペプチドは、ｐｐＬ−ａｌｐｈａ、ＤＥＸ４、インベルターゼシグナルペプチド、酸性ホスファターゼシグナルペプチド、ＣＰＹ、又はＩＮＵ１である。昆虫細胞での発現において好ましいシグナル配列は、スズメガ脂肪動態（ｓｅｘｔａ ａｄｉｐｏｋｉｎｅｔｉｃ）ホルモン前駆体、ＣＰ１、ＣＰ２、ＣＰ３、ＣＰ４、ＴＰＡ、ＰＡＰ、又はｇｐ６７である。哺乳類での発現において好ましいシグナル配列は、ＩＬ２Ｌ、ＳＶ４０、ＩｇＧカッパ及びＩｇＧラムダである。
別の実施形態においては、発現量が高い独立したタンパク質ドメインを潜在的に含むリーダー配列を、ＧＰＸＴＥＮ配列のＮ末端に、プロテアーゼ開裂部位によって離して融合させることができる。設計したタンパク質分解部位での開裂を阻害しない、任意のリーダーペプチド配列を使用することができるが、好ましい実施形態における配列は、組成物全体の発現及び折り畳みが有意に悪影響を受けないように、及び好ましくは発現、溶解度、及び／又は折り畳み効率が有意に改善されるように、安定で、発現量の高い配列を含むだろう。多様な、好適なリーダー配列が文献において記載されてきた。好適な配列の非限定的なリストには、マルトース結合タンパク質、セルロース結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、６ｘＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニンタグ、及び緑色蛍光タンパク質が挙げられる。リーダー配列を、文献及び上記に詳細に記載した方法によるコドン最適化、特にＡＴＧ開始コドンの次の２番目のコドンを最適化することにより、さらに改善することができる。
インビトロにおいてタンパク質を特定の部位で開裂させる、様々な酵素を用いた方法が知られている。そのような方法には、エンテロキナーゼ（ＤＤＤＫ）、Ｘａ因子（ＩＤＧＲ）、トロンビン（ＬＶＰＲＧＳ）、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）（ＬＥＶＬＦＱＧＰ）、ＴＥＶプロテアーゼ（ＥＱＬＹＦＱＧ）、３Ｃプロテアーゼ（ＥＴＬＦＱＧＰ）、ソルターゼＡ（ＬＰＥＴＧ）、グランザイムＢ（Ｄ／Ｘ、Ｎ／Ｘ、Ｍ／Ｎ又はＳ／Ｘ）、インテイン、ＳＵＭＯ、ＤＡＰａｓｅ（ＴＡＧＺｙｍ（商標））、エロモナスアミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼＭ、及びカルボシキペプチダーゼＡ及びＢの使用が含まれる。さらに別の方法が、Ａｒｎａｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４８： １−１３ （２００６）に開示されている。
その他の例において本発明は、ポリヌクレオチド構築物及び、ヘルパードメインなしにタンパク質のＮ末端にあるＸＴＥＮ融合タンパク質の発現を可能にするための翻訳の開始を促進するために、ＸＴＥＮの特徴を有する少なくとも約２０〜約６０アミノ酸をコードし、ＸＴＥＮコード配列のＮ末端に組み込むことが可能な最適化されたポリヌクレオチド配列を含む構築物（例えば、実施例に記載されるような）の作出方法を提供する。前述の構築物の利点は、配列がその後のヘルパードメインの開裂を必要とせず、それによりＸＴＥＮを含む組成物の製造工程の数が少なくなることである。実施例により詳細に記載したように、最適化されたＮ末端配列は非構造性タンパク質としての特徴をもつが、その翻訳の開始を促進する能力及び発現の向上のために選択したアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基を含み得る。前述の一実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＥ９１２と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の別の実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＭ９２３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の別の実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＥ６２４と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の別の実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＥ４８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の別の実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＭ４８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。一実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドＮＴＳは、
ＡＥ ４８： ５’− ＡＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＧＧＧＴＡＧＣＧＧＴＡＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＧＣＴＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＡＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＣＣＧＧＴＴＣＴＣＣＡ−３’
及び
ＡＭ ４８： ５’− ＡＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＣＡＴＣＣＣＣＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＣＣＧＧＴＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＧＣＴＣＴＡＣＣＣＣＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＧＣＴＣＴＡＣＣＣＣＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＡ−３’
から選択された配列又はその相補鎖と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を示す配列を含む。
別の実施形態においては、インビボのプロテアーゼによって認識されるように、リーダー配列構築物中のプロテアーゼ部位を選択する。この実施形態においては、適切なプロテアーゼの接触を回避しながら、リーダーを保持した状態で、タンパク質を発現系から精製する。次に、完全長構築物を患者に注入する。注入に際しては、構築物は開裂部位に特異的なプロテアーゼと接触するようになり、そしてプロテアーゼにより開裂される。開裂されていないタンパク質の活性が開裂した形態のタンパク質の活性よりも実質的に低い例においては、この方法は、活性形態のタンパク質がインビボで徐々に生成されるため、毒性を回避しながらもより高い初期投与量にすることができるので、有益な効果を有する。この適用に有用なインビボのプロテアーゼの、いくつかの非限定的な例には、組織カリクレイン、血漿カリクレイン、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、トロンビン及びマトリックスメタプロテアーゼ、又は表８のプロテアーゼが挙げられる。
この方法では、単量体ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子が構築物中で生成される。任意に、このキメラＤＮＡ分子をより適切な発現ベクターである、別の構築物中に転移又はクローニングしてもよい。このとき、キメラＤＮＡ分子を発現することができる宿主細胞を、キメラＤＮＡ分子を用いて形質転換することができる。目的のＤＮＡセグメントを含むベクターを、細胞宿主の型による、周知の方法によって宿主細胞中に転移させることもできる。例えば、原核細胞の場合には塩化カルシウムトランスフェクションが一般的に用いられるが、その他の細胞宿主に対しては、リン酸カルシウム処理、リポフェクション、又はエレクトロポレーションを用いてもよい。哺乳類細胞の形質転換に用いられるその他の方法には、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、及びマイクロインジェクションが挙げられる。通常、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ ａｌ．、前記を参照のこと。
形質転換は、発現ベクターのような担体を使用して又は使用せずに行うこともできる。その後、形質転換した宿主細胞を、ＧＰＸＴＥＮをコードするキメラＤＮＡ分子の発現に好適な条件下で培養する。
本発明はまた、本明細書において開示した単量体融合タンパク質組成物を発現させるための宿主細胞をも提供する。好適な真核宿主細胞の例には、これらには限定されないが、ＶＥＲＯ細胞などの哺乳類細胞、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ２などのＨＥＬＡ細胞、ＣＨＯ細胞株、ＣＯＳ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞、ＰＣ１２細胞、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｓｆ９細胞及びＣｖＩ細胞が挙げられる。好適な非哺乳類真核細胞の例としては、コードするベクターのクローニング又は発現宿主に好適な、糸状菌又は酵母のような真核微生物が挙げられる。サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、一般的に用いられる、より原始的な真核宿主微生物である。その他には、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ ａｎｄ Ｎｕｒｓｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ２９０： １４０ ［１９８１］；欧州特許第１３９，３８３号、１９８５年５月２日公開）；例えば、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ７３７ ［１９８３］）、Ｋ．フラジリス（Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ウケラミ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ワルチ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６，９０６；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８：１３５ （１９９０））、Ｋ．テルモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ．マルシキアヌスヤロウィア（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ）（欧州特許第４０２，２２６号）などのクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９：９６８−９７５ （１９９１））；ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（欧州特許第１８３，０７０号；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２８：２６５−２７８ ［１９８８］）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４，２３４号）；ニューロスポーラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）（Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６：５２５９−５２６３ ［１９７９］）；シュワンニオミセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（欧州特許第３９４，５３８号、１９９０年１０月３１日公開）などのシュワンニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；及び例えばニューロスポーラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポカルジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（国際公開第９１／００３５７号、１９９１年１月１０日公開）などの糸状菌、及びＡ．ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １１２：２８４−２８９ ［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ２６：２０５−２２１ ［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： １４７０−１４７４ ［１９８４］）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）（Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｈｙｎｅｓ， ＥＭＢＯ Ｊ．， ４：４７５−４７９ ［１９８５］）などのアルペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主が挙げられる。メチロトローフ酵母は本明細書において好適であり、そして、これらには限定されないが、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、及びロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）を含む属から選択される、メタノール上で成長することが可能な酵母を含む。このクラスの酵母の例を挙げた、特定の種の酵母のリストを、Ｃ． Ａｎｔｈｏｎｙ， Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ， ２６９ （１９８２）において見ることができる。
本発明において使用することができる、その他の好適な細胞には、これらには限定されないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（例えば、ＤＨ５−α菌株）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの原核宿主細胞系統、又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の系統が挙げられる。好適な原核生物の非限定的な例としては、アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）；アルカオエグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）；デロビブリオ（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）；ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）；クロロフレクサス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）；エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）；ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）；オセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）；ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）；ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；テルモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）；及びビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属のものが挙げられる。特定の系統の非限定的な例としては、アルカオエグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）；デロビブリオ・バクテリオボラス（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ）；ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；クロロフレクサス ・アウランチアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）；エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）；エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）；ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）；ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）；ラクトバチルス ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）；リステリア ・イノクア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）；リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；オセアノバチルス・イヘイエンシス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ）；パラコッカス ・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）；シュードモナス・メバロニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）；スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）；スタフィロコッカス・エピデルミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）；スタフィロコッカス・ヘモリチクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）；ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）；ストレプトミセス・グリセオロスポレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｌｏｓｐｏｒｅｕｓ）；ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）；ストレプトコッカス ・プニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）；テルモプラズマ ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）；テルモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）；ビブリオ ・コラレ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）；ビブリオ・パラヘモリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）；及びビブリオ ・ブルニフィクス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）が挙げられる。
目的のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、プロモーターの活性、形質転換体の選抜又は遺伝子の増幅について適切に改変した、標準的な組成の培地（例えば、Ｈａｍ’ｓ栄養素混合物）中で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現させるために選択した宿主細胞の使用について既に知られている条件であり、当業者には明かであろう。一般的には、細胞を遠心分離により回収し、物理的又は化学的な手段を用いて破砕し、そして得られた粗抽出物をさらなる精製にかける。宿主細胞から分泌される組成物の場合は、遠心分離で得られた上清を分離し、さらなる精製にかける。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的な破砕、又は細胞溶解剤の使用を含む任意の簡便な方法によって破砕することができ、これら方法の全ては当業者には周知である。細胞溶解を含む実施形態は必然的に、キメラＤＮＡ分子の発現後の分解を制限する、プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液の使用を伴うだろう。好適なプロテアーゼ阻害剤には、これらには限定されないが、ロイペプチン、ペプスタチン又はアプロチニンが挙げられる。次に、飽和硫酸アンモニウムの濃度を段階的に上げることにより、上清を沈殿させることができる。
試料中の遺伝子発現は、例えば，標準的なサザンブロット、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノザンブロット［Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：５２０１−５２０５ （１９８０）］、ドットブロット（ＤＮＡ解析）、又は本明細書において示した配列に基づく、適切に標識したプローブを使用したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、直接測定してもよい。あるいは、ＤＮＡデュプレックス、ＲＮＡデュプレックス、及びＤＮＡ−ＲＮＡ雑種デュプレックス又はＤＮＡ−タンパク質デュプレックスを含む特異的なデュプレックスを認識することができる抗体を用いてもよい。その後、抗体を標識することができ、そしてデュプレックスが表面上に結合している場合、表面上でのデュプレックスの形成に際して、デュプレックスに結合する抗体の存在を検出することができるようなアッセイを行ってもよい。
あるいは、遺伝子産物の発現を直接定量するために、細胞又は組織切片の免疫組織学的染色及び培養細胞若しくは体液のアッセイ又は選択マーカーの検出のような、蛍光を用いた免疫学的な手法によって遺伝子発現を測定してもよい。免疫組織学的染色及び／又は体液試料に有用な抗体は、モノクローナルであっても又はポリクローナルであってもよく、そして任意の動物を用いて調製することができる。簡便に、天然のＧＰポリペプチド配列に対する若しくは本明細書において示したＤＮＡ配列に基づいた合成ペプチドに対する抗体を調製することができ、又はＧＰに融合させた外生の配列であって、かつ、特異的な抗体エピトープをコードする配列に対する抗体を調製してもよい。当業者に周知の選択マーカーの例には、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などが含まれる。
発現したＧＰＸＴＥＮポリペプチド産物を当該分野において既知の方法、又は本明細書に開示した方法を介して精製することができる。ゲルろ過、アフィニティ精製、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びゲル電気泳動などの方法を用いることができ、各方法は、それぞれの宿主細胞によって生産された融合タンパク質を回収及び精製するために調整される。いくつかの発現ＧＰＸＴＥＮは、単離及び精製の間にリフォールディングを必要とする場合がある。精製方法は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ． Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ． Ｃａｓｔｏｒ （ｅｄ．）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９９４，及びＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．，前記、に記載されている。複数工程の分離についてはまた、Ｂａｒｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０：１７９−９０ （１９９０）及び Ｂｅｌｏｗ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ． ６７９：６７−８３ （１９９４）に記載されている。
ＶＩＩＩ）．医薬組成物
本発明は、ＧＰＸＴＥＮを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、医薬組成物は、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質及び少なくとも１種類の薬学上許容可能な担体を含む。本発明のＧＰＸＴＥＮポリペプチドを、ポリペプチドを水溶液又は緩衝液、薬学上許容可能な懸濁液及び乳濁液のような薬学上許容可能な担体媒体と共に混合する、薬学上有用な組成物を調製するための既知の方法に従って処方することができる。非水性溶媒の例としてはプロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール及び植物油が挙げられる。保管のためには、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． （１９８０）に記載されているように、所望される純度の有効成分を、任意に生理的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液として調製する。
医薬組成物を経口的に、経鼻的に、非経口的に又は吸入治療によって投与することができ、また、医薬組成物は錠剤、トローチ、顆粒、カプセル、丸薬、アンプル、座薬又はエアロゾルの形態にしてもよい。医薬組成物を、水性又は非水性希釈剤、シロップ、顆粒又は粉末に加えられた、活性成分の懸濁液、溶液及び乳濁液の形態としてもよい。加えて、医薬組成物に、その他の薬学的に活性な化合物、又は複数の本発明の化合物を含めることもできる。
より具体的には、本医薬組成物を治療のために、経口、直腸、経鼻、局所（経皮、エアロゾル、バッカル及び舌下を含む）、経膣、非経口（皮下、注入ポンプによる皮下、筋内、静脈内及び皮内を含む）、硝子体内、及び経肺を含む、任意の好適な経路により投与してもよい。当然のことながら、好ましい経路は受容者の状態及び年齢、並びに治療する疾患によって多様になるだろう。
一実施形態においては医薬組成物を皮下に投与する。この実施形態において組成物は、投与の前に再構成する、凍結乾燥した粉末剤として提供されるだろう。組成物を、患者に直接投与することができる、液体の形状で提供してもよい。一実施形態においては、患者がその組成物を容易に自己投与することができるように、予めシリンジに充填された溶液剤として組成物を提供する。
本発明において有用な持続放出型製剤は、マトリックス及びコーティングした組成物を含む、経口製剤となるだろう。好適なマトリックス材料には、ワックス（例えば、カルナバろう、密ろう、パラフィンワックス、セレシン、セラックろう、脂肪酸、及び脂肪アルコール）、油、硬化油又は脂質（例えば、硬化菜種油、ヒマシ油、牛脂、ヤシ油、及び大豆油）、及びポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリエチレングリコール）が含まれ得る。その他の好適なマトリックス打錠材料としては、その他の担体及び増量剤を含む、微結晶セルロース、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、がある。錠剤は、顆粒、被覆した粉末、又はペレットをもまた含み得る。錠剤は多層であってもよい。多層錠は、活性成分が顕著に異なる薬物動態学的プロファイルを有する場合に特に好ましい。任意に、成形した錠剤を被覆しても又は被覆しなくてもよい。
被覆用の組成物は、不溶性マトリックスポリマー及び／又は水溶性材料を含み得る。水溶性材料は、ポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールのようなポリマー、又は、糖（例えば、ラクトース、ショ糖、フルクトース、マンニトールなど）、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなど）、有機酸（例えば、フマル酸、コハク酸、乳酸、及び酒石酸）、のような単量体材料、及びその混合物になるだろう。任意に、腸溶性ポリマーを被覆組成物中に組み込んでもよい。好適な腸溶性ポリマーには、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アセテートスクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタラート、ポリビニルアセテートフタラート、セルロースアセテートフタラート、セルロースアセテートトリメリテート、セラック、ゼイン、及びカルボキシ基を含むポリメタクリレートが挙げられる。好適な可塑化剤、例えば、ジエチルフタル酸、クエン酸エステル、ポリエチレングリコール、グリセロール、アセチル化グリセリド、アセチル化クエン酸エステル、セバチン酸ジブチル、及びヒマシ油を加えることにより、被覆組成物を可塑化してもよい。被覆組成物に、二酸化ケイ素、二酸化チタン、タルク、カオリン、アルミナ、澱粉、粉末セルロース、ＭＣＣ、又はポラクリリンカリウムのような不溶性材料である場合のある、充填剤をもまた加えてもよい。被覆組成物を、有機溶媒又は水性溶媒に溶解した溶液又は乳液、又はその混合物としてもよい。水、低級アルコール、低級塩素化炭化水素、ケトン、又はその混合物のような溶媒もまた使用することができる。
本発明の組成物は、様々な賦形剤を用いて処方することができる。好適な賦形剤には、微結晶セルロース（例えばＡｖｉｃｅｌ ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ１０１）、ポリメタクリレート、ポリ（エチルアクリレート、メチルメタクリレート、トリメチルアンモニオエチルメタクリレートクロリド）（ＥｕｄｒａｇｉｔＲＳ−３０Ｄなど）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｋ１００Ｍ、Ｐｒｅｍｉｕｍ ＣＲ Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｋ１００Ｍ、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｅ５、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標））、ステアリン酸マグネシウム、タルク、クエン酸トリエチル、水性エチルセルロース分散剤（Ｓｕｒｅｌｅａｓｅ（登録商標））、及び硫酸プロタミンが含まれる。徐放性製剤もまた、例えば、溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤を含む可能性がある担体を含み得る。薬学上許容可能な塩もまたこれら徐放性製剤中で使用することができ、塩の例としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、又は硫酸塩のような無機塩、並びにアセテート、プロピオン酸塩、マロン酸塩、又は安息香酸塩のような、有機酸の塩がある。組成物または、水、塩水、グリセロール、及びエタノールなどの液体、並びに湿潤剤、乳化剤、又はｐＨ緩衝剤のような物質を含み得る。リポソームを担体として用いてもよい。
別の実施形態においては、本発明の組成物はリポソーム中に封入される。リポソームは、制御された方法で長期間にわたり、有益な活性薬剤を送達する上で有用であることが示されてきたものである。リポソームは、封入された水性の物質を含む、閉じた二重の膜である。リポソームはまた、単一の膜二重層を有するユニラメラ媒体、又は隣あうそれぞれの膜が水層によって離されている、複数の膜二重層を有するマルチラメラであってもよい。生じる膜二重層の構造は、脂質の疎水性（非極性）テールが二重膜の中心の方向にむき、親水性（極性）ヘッドが水相の方向に向いているというものである。一実施形態においては、主に肝臓及び脾臓において、単核食細胞系の組織による取り込みを回避するために、弾力性のある水溶性ポリマーを用いてリポソームを被覆してもよい。リポソームを覆うための好適な親水性ポリマーとしては、これらには限定されないが、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロースヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパラギン酸アミド及び、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第６，３１６，０２４号；同第６，１２６，９６６号；同第６，０５６，９７３号；同第６，０４３，０９４号に記載されている親水性ペプチド配列が含まれる。
リポソームは、当該分野において既知の、任意の脂質又は脂質の組み合わせを含んでいてもよい。例えば、ベシクル形成脂質は天然に生じるものであっても、又はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、並びに米国特許第６，０５６，９７３号及び同第５，８７４，１０４号に開示されたスフィンゴミエリンなどのリン脂質を含む合成した脂質であってもよい。ベシクル形成脂質はまた、糖脂質、セレブロシド、又は１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−［１−（２，３，−テトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；Ｎ−［１［（２，３，-−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；３［Ｎ−（Ｎ’、Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）のような陽イオン性脂質；又は米国特許第６，０５６，９７３号にまた開示されたジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）であってもよい。米国特許第５，９１６，５８８号及び同第５，８７４，１０４号に開示されたように、ベシクルに安定性を付与するために、一定の範囲のコレステロールもまた含まれ得る。
さらに別のリポソーム技術が、参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第６，７５９，０５７号；同第６，４０６，７１３号；同第６，３５２，７１６号；同第６，３１６，０２４号；同第６，２９４，１９１号；同第６，１２６，９６６号；同第６，０５６，９７３号；同第６，０４３，０９４号；同第５，９６５，１５６号；同第５，９１６，５８８号；同第５，８７４，１０４号；同第５，２１５，６８０号；及び同第４，６８４，４７９号に記載されている。これらは、リポソーム及び脂質に覆われたマイクロバブル、並びにそれらの製造方法について記載しているものである。従って、当業者は、本発明の開示及びこれらその他特許の開示の両方を考慮することにより、本発明のポリペプチドを持続放出型にするためのリポソームを作出することができるだろう。
液体製剤に求められる特性は、その製剤が静脈内、筋内、関節内、又は皮下投与に用いられる、２５、２８、３０、３１、３２ゲージの針の中を通過できるような形態で提供されることである。
経皮的製剤を用いた投与は、一般的に、例えば、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第５，１８６，９３８号及び同第６，１８３，７７０号、同第４，８６１，８００号、同第６，７４３，２１１号、同第６，９４５，９５２号、同第４，２８４，４４４号、及び国際公開第８９／０９０５１号に記載されている方法を含む、当該分野において既知の方法を用いてもまた、行うことができる。経皮パッチは、吸収に問題のあるポリペプチドを用いる場合に、特に有用な実施形態である。パッチは、皮膚を通過する活性成分の放出を、１２時間、２４時間、３日、及び７日間、制御することができる。一例として、１日用量の２倍を超える本発明のポリペプチドを、非揮発性の液体中に溶解する。本発明の組成物は、粘性のある、非揮発性の液体の形態で提供される。特定の製剤の皮膚への浸透は、当該分野における標準的な方法（例えば、Ｆｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍ． ６４：１９４−１９５ （１９７５））により、測定され得る。好適なパッチの例としては、受身伝達皮膚パッチ，イオン導入皮膚パッチ，又はＮｉｃｏｄｅｒｍのような極微針を有するパッチがある。
その他の実施形態においては、活性薬剤の嗅覚系を介したＣＮＳへの移動を可能にするように、及び全身投与を低減するために、組成物を経鼻的、口腔内、又は舌下経路を介して脳へと送達してもよい。この投与経路で一般的に用いられる装置は、米国特許第６，７１５，４８５号に含まれている。この経路を介して送達された組成物は、ＣＮＳへの投薬を増加させることが、又は特定の薬剤に関連する全身性毒性リスクを低減させることで、全身負荷を低減させることができるだろう。皮下に移植可能な装置を用いた送達のための医薬組成物の調製は、例えば、米国特許第３，９９２，５１８号；同第５，６６０，８４８号；及び同第５，７５６，１１５号に記載された方法などの、当該分野において既知の方法を用いて行うことができる。
浸透圧ポンプを、錠剤、丸薬、カプセル又は移植可能な装置の形態での遅延放出型薬剤として用いても良い。浸透圧ポンプは当該分野において周知であり、そして当業者は、持続放出性薬剤のための浸透圧ポンプの提供に実績のある業者から、容易に入手することができる。例としては、ＡＬＺＡ社のＤＵＲＯＳ（商標）；ＡＬＺＡ社のＯＲＯＳ（商標）；Ｏｓｍｏｔｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社のＯｓｍｏｄｅｘ（商標）システム；Ｓｈｉｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のＥｎＳｏＴｒｏｌ（商標）システム；及びＡｌｚｅｔ（商標）がある。浸透圧ポンプの技術について記載している特許としては、参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第６，８９０，９１８号；同第６，８３８，０９３号；同第６，８１４，９７９号；同第６，７１３，０８６号；同第６，５３４，０９０号；同第６，５１４，５３２号；同第６，３６１，７９６号；同第６，３５２，７２１号；同第６，２９４，２０１号；同第６，２８４，２７６号；同第６，１１０，４９８号；同第５，５７３，７７６号；同第４，２００，０９８４号；及び同第４，０８８，８６４号がある。当業者は、本発明の開示及びこれらその他特許の開示の両方を考慮することにより、本発明のポリペプチドを持続放出型にするための浸透圧ポンプを生産することができるだろう。
シリンジポンプもまた、遅延放出型製剤として用いることができる。それらの装置は、参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第４，９７６，６９６号；同第４，９３３，１８５号；同第５，０１７，３７８号；同第６，３０９，３７０号；同第６，２５４，５７３号；同第４，４３５，１７３号；同第４，３９８，９０８号；同第６，５７２，５８５号；同第５，２９８，０２２号；同第５，１７６，５０２号；同第５，４９２，５３４号；同第５，３１８，５４０号；及び同第４，９８８，３３７号に記載されている。当業者は、当業者は、本発明の開示及びこれらその他特許の開示の両方を考慮することにより、本発明の組成物を持続放出型にするためのシリンジポンプを生産することができるだろう。
ＩＸ）．医薬キット
別の態様において、本発明は、ＧＰＸＴＥＮポリペプチドの使用を促進するためのキットを提供する。このキットは、本明細書において示した医薬組成物、医薬組成物について記載したラベル、並びに、医薬組成物の保管、再構成及び／又は対象への投与についての説明を含む。いくつかの実施形態において、キットは好ましくは、（ａ）それを必要とする対象に投与することで、疾患、状態又は障害を治療するために十分な、一定の量のＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物、及び（ｂ）一定量の薬学上許容可能な担体を含み；注入又は再構成に直ちに用いられる製剤には水、緩衝液、若しくはデキストロースが共に；ＧＰＸＴＥＮ薬剤及び保管及び取扱い条件を記載したラベル、及び薬剤の認可された適用を示すシート、予防的使用における再構成及び／又はＧＰＸＴＥＮ薬剤の投与についての説明、及び／又は認可された適用の治療、適切な用量及び安全情報、及び薬剤のロット及び有効期限を示す情報が共に含まれる。前述の別の実施形態においてキットは、対象に送達するための適切な濃度のＧＰＸＴＥＮを使用者に提供する、好適に希釈されたＧＰＸＴＥＮ組成物を含む場合がある、第二の容器を含む場合がある。
実施例
実施例１：ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６モチーフセグメントの構築
以下の実施例においては、３６アミノ酸のモチーフ配列をコードする、コドン最適化した遺伝子コレクションの構築について記載する。第一の工程として、ｐＥＴベクターベースで、かつ、Ｔ７プロモーターを含むｓｔｕｆｆｅｒベクターである、ｐＣＷ０３５９を構築した。ｐＣＷ０３５９は、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）及びＴＥＶプロテアーゼ認識部位、それに続くｓｔｕｆｆｅｒ配列と隣接したＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ部位をコードする。ＢｓａＩ及びＢｂｓＩは、消化後に一致する突出末端が生成されるように挿入された。ｓｔｕｆｆｅｒ配列の後には切断型のＧＦＰ遺伝子及びＨｉｓタグが続く。ｓｔｕｆｆｅｒ配列は終止コドンを含むため、ｓｔｕｆｆｅｒプラスミドｐＣＷ０３５９を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は蛍光を発しないコロニーを形成する。ｓｔｕｆｆｅｒセグメントを除去するためにｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９をＢｓａＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られたベクター断片をアガロースゲル精製により単離した。モチーフのＡＤファミリーを反映させ、配列をＸＴＥＮ＿ＡＤ３６と命名した。そのセグメントは、［Ｘ］３で表せるアミノ酸配列を有し、ここでＸは、配列がＧＥＳＰＧＧＳＳＧＳＥＳ、ＧＳＥＧＳＳＧＰＧＥＳＳ、ＧＳＳＥＳＧＳＳＥＧＧＰ、又はＧＳＧＧＥＰＳＥＳＧＳＳの、１２ｍｅｒのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
ＡＤ１ｆｏｒ： ＡＧＧＴＧＡＡＴＣＴＣＣＤＧＧＴＧＧＹＴＣＹＡＧＣＧＧＴＴＣＹＧＡＲＴＣ
ＡＤ１ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＡＹＴＣＲＧＡＡＣＣＧＣＴＲＧＡＲＣＣＡＣＣＨＧＧＡＧＡＴＴＣ
ＡＤ２ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＧＣＧＡＡＧＧＴＴＣＴＴＣＹＧＧＴＣＣＤＧＧＹＧＡＲＴＣＹＴＣ
ＡＤ２ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＡＲＧＡＹＴＣＲＣＣＨＧＧＡＣＣＲＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＣＴ
ＡＤ３ｆｏｒ： ＡＧＧＴＴＣＹＴＣＹＧＡＡＡＧＣＧＧＴＴＣＴＴＣＹＧＡＲＧＧＹＧＧＴＣＣ
ＡＤ３ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＡＣＣＲＣＣＹＴＣＲＧＡＡＧＡＡＣＣＧＣＴＴＴＣＲＧＡＲＧＡ
ＡＤ４ｆｏｒ： ＡＧＧＴＴＣＹＧＧＴＧＧＹＧＡＡＣＣＤＴＣＹＧＡＲＴＣＴＧＧＴＡＧＣＴＣ
我々はまた、リン酸化したオリゴヌクレオチドである３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ（ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ）とリン酸化していないオリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ（ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ）もアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに結合した、様々な数の１２ｍｅｒの繰り返しを有する、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さに相当する産物を分離用のアガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、そしてＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションした。ＬＣＷ０４０１と命名した、得られたライブラリーの大部分のコロニーは誘導後に緑色蛍光を呈し、このことからＸＴＥＮ＿ＡＤ３６配列がＧＦＰ遺伝子にインフレームで結合されたこと、及び大部分のＸＴＥＮ＿ＡＤ３６配列が良い発現レベルを有することが示された。
ＬＣＷ０４０１ライブラリーから単離した９６コロニーの蛍光強度について、それらをＩＰＴＧを含む寒天培地上に押しつけることにより、スクリーニングした。単離した同じクローンについてＰＣＲによる評価も行い、４８単離体を３６アミノ酸のセグメントを含み、かつ、高レベルの蛍光をはっするものとして同定した。これら単離体について配列決定を行い、３９のクローンがＸＴＥＮ＿ＡＤ３６セグメントを含むことを同定した。これらセグメントについてのヌクレオチド及びアミノ酸構築物のファイル名を表１０に列挙した。
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
実施例２：ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントの構築
３６アミノ酸の長さのＸＴＥＮ配列をコードするコドンライブラリーを構築した。ＸＴＥＮ配列はＸＴＥＮ＿ＡＥ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３で表せるアミノ酸配列を有し、ここでＸは、配列がＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥ、ＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰ、ＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰ、又はＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰの、１２ｍｅｒのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
ＡＥ１ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＧＣＣＣＤＧＣＷＧＧＹＴＣＴＣＣＤＡＣＹＴＣＹＡＣＹＧＡＲＧＡ
ＡＥ１ｒｅｖ： ＡＣＣＴＴＣＹＴＣＲＧＴＲＧＡＲＧＴＨＧＧＡＧＡＲＣＣＷＧＣＨＧＧＧＣＴ
ＡＥ２ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＧＣＧＡＡＣＣＫＧＣＷＡＣＹＴＣＹＧＧＹＴＣＴＧＡＲＡＣＹＣＣ
ＡＥ２ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＲＧＴＹＴＣＡＧＡＲＣＣＲＧＡＲＧＴＷＧＣＭＧＧＴＴＣＧＣＴ
ＡＥ３ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＴＧＡＡＡＧＣＧＣＷＡＣＹＣＣＫＧＡＲＴＣＹＧＧＹＣＣ
ＡＥ３ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＲＣＣＲＧＡＹＴＣＭＧＧＲＧＴＷＧＣＧＣＴＴＴＣＡＧＡＲＧＴ
ＡＥ４ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＴＡＣＹＧＡＡＣＣＫＴＣＹＧＡＲＧＧＹＡＧＣＧＣＷＣＣ
ＡＥ４ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＷＧＣＧＣＴＲＣＣＹＴＣＲＧＡＭＧＧＴＴＣＲＧＴＡＧＡＲＧＴ
我々はまた、リン酸化したオリゴヌクレオチドである３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ（ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ）とリン酸化していないオリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ（ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ）もアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに結合した、様々な数の１２ｍｅｒの繰り返しを有する、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さに相当する産物を分離用のアガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、そしてＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションした。ＬＣＷ０４０２と命名した、得られたライブラリーの大部分のコロニーは誘導後に緑色蛍光を呈し、このことからＸＴＥＮ＿ＡＥ３６がＧＦＰ遺伝子にインフレームで結合されたこと、及び大部分のＸＴＥＮ＿ＡＥ３６配列が良い発現レベルを有することが示された。
ＬＣＷ０４０２ライブラリーから単離した９６コロニーの蛍光強度について、それらをＩＰＴＧを含む寒天培地上に押しつけることにより、スクリーニングした。単離した同じクローンについてＰＣＲによる評価も行い、４８単離体を３６アミノ酸のセグメントを含み、かつ、高レベルの蛍光を発するものとして同定した。これら単離体について配列決定を行い、３７のクローンがＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントを含むことを同定した。これらセグメントについてのヌクレオチド及びアミノ酸構築物のファイル名を表９に列挙した。
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
実施例３：ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントの構築
３６アミノ酸の長さのＸＴＥＮ配列をコードするコドンライブラリーを構築した。ＸＴＥＮ配列をＸＴＥＮ＿ＡＦ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３で表せるアミノ酸配列を有し、ここでＸは、配列がＧＳＴＳＥＳＰＳＧＴＡＰ、ＧＴＳＴＰＥＳＧＳＡＳＰ、ＧＴＳＰＳＧＥＳＳＴＡＰ、又はＧＳＴＳＳＴＡＥＳＰＧＰの、１２ｍｅｒのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
ＡＦ１ｆｏｒ： ＡＧＧＴＴＣＴＡＣＹＡＧＣＧＡＡＴＣＹＣＣＫＴＣＴＧＧＹＡＣＹＧＣＷＣＣ
ＡＦ１ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＷＧＣＲＧＴＲＣＣＡＧＡＭＧＧＲＧＡＴＴＣＧＣＴＲＧＴＡＧＡ
ＡＦ２ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＴＡＣＹＣＣＫＧＡＡＡＧＣＧＧＹＴＣＹＧＣＷＴＣＴＣＣ
ＡＦ２ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＡＧＡＷＧＣＲＧＡＲＣＣＧＣＴＴＴＣＭＧＧＲＧＴＡＧＡＲＧＴ
ＡＦ３ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＹＣＣＫＡＧＣＧＧＹＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＣＹＧＣＷＣＣ
ＡＦ３ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＷＧＣＲＧＴＡＧＡＡＧＡＴＴＣＲＣＣＧＣＴＭＧＧＲＧＡＲＧＴ
ＡＦ４ｆｏｒ： ＡＧＧＴＴＣＹＡＣＹＡＧＣＴＣＴＡＣＹＧＣＷＧＡＡＴＣＴＣＣＫＧＧＹＣＣ
ＡＦ４ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＲＣＣＭＧＧＡＧＡＴＴＣＷＧＣＲＧＴＡＧＡＧＣＴＲＧＴＲＧＡ
我々はまた、リン酸化したオリゴヌクレオチドである３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ（ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ）とリン酸化していないオリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ（ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ）もアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに結合した、様々な数の１２ｍｅｒの繰り返しを有する、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さに相当する産物を分離用のアガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、そしてＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションした。ＬＣＷ０４０３と命名した、得られたライブラリーの大部分のコロニーは誘導後に緑色蛍光を呈し、このことからＸＴＥＮ＿ＡＦ３６がＧＦＰ遺伝子にインフレームで結合されたこと、及び大部分のＸＴＥＮ＿ＡＦ３６配列が良い発現レベルを有することが示された。
ＬＣＷ０４０３ライブラリーから単離した９６コロニーの蛍光強度について、それらをＩＰＴＧを含む寒天培地上に押しつけることにより、スクリーニングした。単離した同じクローンについてＰＣＲによる評価も行い、４８単離体を３６アミノ酸のセグメントを含み、かつ、高レベルの蛍光を発するものとして同定した。これら単離体について配列決定を行い、４４のクローンが正しいＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントを含むことを同定した。これらセグメントについてのヌクレオチド及びアミノ酸構築物のファイル名を表１２に列挙した。
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
実施例４：ＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントの構築
３６アミノ酸の長さのＸＴＥＮ配列をコードするコドンライブラリーを構築した。ＸＴＥＮ配列はＸＴＥＮ＿ＡＧ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３で表せるアミノ酸配列を有し、ここでＸは、配列がＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰ、ＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰ、ＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰ、又はＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰの、１２ｍｅｒのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
ＡＧ１ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＣＹＣＣＫＧＧＹＡＧＣＧＧＴＡＣＹＧＣＷＴＣＴＴＣＹＴＣＴＣＣ
ＡＧ１ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＡＧＡＲＧＡＡＧＡＷＧＣＲＧＴＡＣＣＧＣＴＲＣＣＭＧＧＲＧＴ
ＡＧ２ｆｏｒ： ＡＧＧＴＡＧＣＴＣＴＡＣＹＣＣＫＴＣＴＧＧＴＧＣＷＡＣＹＧＧＹＴＣＹＣＣ
ＡＧ２ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＲＧＡＲＣＣＲＧＴＷＧＣＡＣＣＡＧＡＭＧＧＲＧＴＡＧＡＧＣＴ
ＡＧ３ｆｏｒ： ＡＧＧＴＴＣＴＡＧＣＣＣＫＴＣＴＧＣＷＴＣＹＡＣＹＧＧＴＡＣＹＧＧＹＣＣ
ＡＧ３ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＲＣＣＲＧＴＡＣＣＲＧＴＲＧＡＷＧＣＡＧＡＭＧＧＧＣＴＡＧＡ
ＡＧ４ｆｏｒ： ＡＧＧＴＧＣＷＴＣＹＣＣＫＧＧＹＡＣＹＡＧＣＴＣＴＡＣＹＧＧＴＴＣＴＣＣ
ＡＧ４ｒｅｖ： ＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＲＧＴＡＧＡＧＣＴＲＧＴＲＣＣＭＧＧＲＧＡＷＧＣ
我々はまた、リン酸化したオリゴヌクレオチドである３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ（ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ）とリン酸化していないオリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ（ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ）もアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに結合した、様々な数の１２ｍｅｒの繰り返しを有する、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さに相当する産物を分離用のアガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、そしてＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションした。ＬＣＷ０４０４と命名した、得られたライブラリーの大部分のコロニーは誘導後に緑色蛍光を呈し、このことからＸＴＥＮ＿ＡＧ３６がＧＦＰ遺伝子にインフレームで結合されたこと、及び大部分のＸＴＥＮ＿ＡＧ３６配列が良い発現レベルを有することが示された。
ＬＣＷ０４０４ライブラリーから単離した９６コロニーの蛍光強度について、それらをＩＰＴＧを含む寒天培地上に押しつけることにより、スクリーニングした。単離した同じクローンについてＰＣＲによる評価も行い、４８単離体を３６アミノ酸のセグメントを含み、かつ、高レベルの蛍光を発するものとして同定した。これら単離体について配列決定を行い、４４のクローンが正しいＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントを含むことを同定した。これらセグメントについてのヌクレオチド及びアミノ酸構築物のファイル名を表１３に列挙した。
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
実施例５：ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の構築
ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６を順次二量体化し、ＡＥ７２、１４４、２８８、５７６及び８６４にすることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を構築した。３７種類の異なるＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントから、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントのコレクションを構築した。３７種類の異なる３６−アミノ酸セグメントの全てを含む大腸菌培養を混合し、そしてプラスミドを単離した。このプラスミドプールをＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化し、挿入断片となる短い断片を生成した。同じプラスミドプールをＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化し、ベクターとしての長い断片を生成した。挿入断片及びベクター断片を倍の長さになるようにライゲーションし、ライゲーション混合物を用いてＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞を形質転換し、そしてＸＴＥＮ＿ＡＥ７２のコロニーを得た。
このＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４０６と命名した。ＬＣＷ０４０６由来の全てのクローンを合わせ、上述したものと同じ工程により再度二量体化し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４のライブラリーであるＬＣＷ０４１０を得た。ＬＣＷ０４１０由来の全てのクローンを合わせ、上述したものと同じ工程により再度二量体化し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８のライブラリーであるＬＣＷ０４１４を得た。ライブラリーから無作為に２つの単離体であるＬＣＷ０４１４．００１及びＬＣＷ０４１４．００２を選択し、その同一性を確認するために配列を決定した。ＬＣＷ０４１４由来の全てのクローンを合わせ、上述したものと同じ工程により再度二量体化し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のライブラリーであるＬＣＷ０４１８を得た。ＬＣＷ０４１８ライブラリー由来の９６の単離体をＧＦＰの蛍光強度についてスクリーニングした。ＰＣＲによって確認した挿入断片のサイズが正しく、かつ強い蛍光を呈する８つの単離体の配列を決定し、決定された配列及び発現のデータに基づき、２つの単離体（ＬＣＷ０４１８．０１８及びＬＣＷ０４１８．０５２）をその後の使用のために選択した。
ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の特定のクローンであるｐＣＷ０４３２を、上述したもの同じ二量体化工程を介してＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のＬＣＷ０４１８．０１８及びＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８のＬＣＷ０４１４．００２を組み合わせることにより構築した。
実施例６：ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４の構築
３７種類の異なるＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメント、４４種類のＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメント、及び４４種類のＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントを出発材料として、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントのコレクションを構築した。
１２５種類の異なる３６−アミノ酸セグメントの全てを含む大腸菌培養を混合し、プラスミドを単離した。このプラスミドプールをＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化し、挿入断片となる短い断片を生成した。同じプラスミドプールをＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化し、ベクターとしての長い断片を生成した。挿入断片及びベクター断片を倍の長さになるようにライゲーションし、ライゲーション混合物を用いてＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞を形質転換し、そしてＸＴＥＮ＿ＡＭ７２のコロニーを得た。
このＸＴＥＮ＿ＡＭ７２セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４６１と命名した。ＬＣＷ０４６１の全てのクローンを合わせ、上述したものと同じ工程により再度二量体化し、ＬＣＷ０４６２を得た。ＬＣＷ０４６２由来の１５１２単離体をタンパク質発現を指標にスクリーニングした。個々のコロニーを９６ウェルプレートに移し、初期培養として一晩培養した。これらの初期培養を新しい自動誘導培地で希釈し、２０〜３０時間培養した。蛍光プレートリーダーを用い、励起３９５ｎｍ及び放射５１０ｎｍで発現を測定した。１９２の単離体が高レベルの発現を示したため、これらをＤＮＡ配列決定にかけた。ＬＣＷ０４６２中の大部分のクローンが、高い発現及び類似した物理化学的特性を示したことから、ＸＴＥＮ＿ＡＭ３６セグメントの組み合わせの大部分から有用なＸＴＥＮ配列が得られたことが示唆される。ＬＣＷ０４６２由来の３０の単離体を、複数のＸＴＥＮセグメントを含む多機能タンパク質の構築に有用な、好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントのコレクションとして選抜した。これらセグメントのヌクレオチド及びアミノ酸構築物のファイル名を表１４に列挙する。
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
実施例７：ＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８の構築
ＬＣＷ０４６２ライブラリー全体を実施例６に記載したように二量体化し、ＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８クローンのライブラリーを得て、これをＬＣＷ０４６３と命名した。ＬＣＷ０４６３ライブラリー由来の１５１２の単離体を実施例６に記載したプロトコールを用いてスクリーニングした。１７６の多く発現しているクローンについて配列決定を行い、４０の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８セグメントを、２８８アミノ酸残基を有する、複数のＸＴＥＮセグメントを含む多機能タンパク質の構築のために選択した。
実施例８：ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２の構築
ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントのＬＣＷ０４６２ライブラリー由来のセグメントとＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８セグメントのＬＣＷ０４６３ライブラリー由来のセグメントとを再び組み合わせることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのライブラリーを生成した。この新しい、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４６４と命名した。ＬＣＷ０４６２及びＬＣＷ０４６３をそれぞれ含む培養した大腸菌から、プラスミドを単離した。ＬＣＷ０４６４由来の１５１２の単離体を、実施例６に記載したプロトコールを用いてスクリーニングした。発現の高い１７６のクローンについて配列決定を行い、３９の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントを、より長いＸＴＥＮの構築、及び４３２アミノ酸残基を有する複数のＸＴＥＮセグメントを含む多機能タンパク質の構築のために選択した。
並行して、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４及びＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８の好ましいセグメントを用い、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのＬＭＳ０１００ライブラリーを構築した。さらなる構築のために選択される収量４のこのライブラリーをスクリーニングし、単離した。
実施例９：ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５の構築
ｓｔｕｆｆｅｒセグメントを除去するためにｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９をＢｓａＩ及びＫｐｎＩで消化し、生じたベクター断片をアガロースゲル精製によって単離した。
ＧＡＳＡＳＧＡＰＳＴＧのアミノ酸をコードし、かつ、この配列中に制限酵素ＡｓｃＩの認識部位であるヌクレオチド配列ＧＧＣＧＣＧＣＣを含むシークエンスアイランドＡ（ＳＩ−Ａ）を導入するために、リン酸化したオリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＡｓｃＩ−ＫｐｎＩｆｏｒＰ：
ＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＧＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣと、リン酸化していいないオリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＡｓｃＩ−ＫｐｎＩｒｅｖ：
ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＴＧＣＧＣＴＴＧＣとをアニーリングさせた。アニーリングさせたオリゴヌクレオチド対を、ＢｓａＩ及びＫｐｎＩで消化し、上述したように準備したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションさせ、ＳＩ−Ａを含むｐＣＷ０４６６を得た。次に、実施例８からの４３種類の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントとｐＣＷ０４６６からのＳＩ−ＡセグメントのＣ末端を、実施例５に記載したものと同じ二量体化工程介して再度組み合わせ、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーを構築した。この新しいＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４７９と命名した。
ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのＬＣＷ０４７９ライブラリー由来のセグメントと、４３種類の実施例８からの好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントを、実施例５に記載したものと同じ二量体化工程介して再度組み合わせることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグメントのライブラリーを構築した。この新しいＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４８１と命名した。
実施例１０：ＴＥＮ＿ＡＭ１３１８の構築
ＧＰＥＰＴＧＰＡＰＳＧのアミノ酸をコードし、かつ、この配列中に制限酵素ＦｓｅＩの認識部位であるヌクレオチド配列ＧＧＣＣＧＧＣＣを含むシークエンスアイランドＢ（ＳＩ−Ｂ）を導入するために、リン酸化したオリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＦｓｅＩ−ＫｐｎＩｆｏｒＰ：
ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣと、リン酸化していないオリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＦｓｅＩ−ＫｐｎＩｒｅｖ：
ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＣＴＣＣＧＣＴＴＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＧＴＴＧＧＴＴＣＴＧＧとをアニーリングさせた。アニーリングさせたオリゴヌクレオチド対を、実施例９で用いたようなＢｓａＩ及びＫｐｎＩで消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションさせ、ＳＩ−Ｂを含むｐＣＷ０４６７を得た。次に、実施例８からの４３種類の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントとｐＣＷ０４６７からのＳＩ−ＢセグメントのＣ末端を、実施例５に記載したものと同じ二量体化工程介して再度組み合わせることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーを構築した。この新しいＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４７９と命名した。この新しいＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４８０と命名した。
ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのＬＣＷ０４８０ライブラリー由来のセグメントと、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグメントのＬＣＷ０４８１ライブラリー由来のセグメントを、実施例５に記載したものと同じ二量体化工程介して再度組み合わせることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８セグメントのライブラリーを構築した。この新しいＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４８７と命名した。
実施例１１：ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４の構築
複数回、連続して二量体化を行うことにより、実施例１に挙げたＸＴＥＮ＿ＡＤ３６のセグメントを出発材料として、ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４配列のコレクションを構築した。これらの配列を実施例５に記載したように組み合わせた。ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４由来の複数の単離体を評価し、生理学的な条件下で高く発現し、非常に良い溶解度を示すクローンを見いだした。１種類のＸＴＥＮ＿ＡＤ５７６の中間構築物について配列決定を行った。このクローンをカニクイザルを用いたＰＫ実験において評価し、半減期が約２０時間であることを測定した。
実施例１２：ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４の構築
複数回、連続して二量体化を行うことにより、実施例３に挙げたＸＴＥＮ＿ＡＦ３６のセグメントを出発材料として、ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４配列のコレクションを構築した。これらの配列を実施例５に記載したように組み合わせた。ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４由来の複数の単離体を評価し、生理学的な条件下で高く発現し、非常に良い溶解度を示すクローンを見いだした。１種類のＸＴＥＮ＿ＡＦ５４０の中間構築物について配列決定を行った。このクローンをカニクイザルを用いたＰＫ実験において評価し、半減期が約２０時間であることを測定した。ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４の完全長クローンの１つが非常に高い溶解度を有し、カニクイザルにおいて６０時間を超える半減期を示した。シークエンスアイランドを含むＸＴＥＮ＿ＡＦ配列の二番目のセットを実施例９に記載したように組み合わせた。
実施例１３：実施例ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４の構築
複数回、連続して二量体化を行うことにより、実施例１に挙げたＸＴＥＮ＿ＡＤ３６のセグメントを出発材料として、ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４配列配列のコレクションを構築した。これらの配列を実施例５に記載したように組み合わせた。ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４由来の複数の単離体を評価し、生理学的な条件下で高く発現し、非常に良い溶解度を示すクローンを見いだした。ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４の完全長クローンの１つが非常に高い溶解度を有し、カニクイザルにおいて６０時間を超える半減期を示した。
実施例１４：ＸＴＥＮ構築物のＮ末端伸張の構築及び１２ｍｅｒ付加ライブラリー（Ａｄｄｉｔｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ）のスクリーニング
この実施例では、ＸＴＥＮ融合が融合タンパク質のＮ末端にある融合タンパク質の発現を、ヘルパードメインなしで可能にするような翻訳の開始を促進するために、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端を最適化する工程について詳細に記載する。これまで、ＸＴＥＮをＮ末端に有するタンパク質の発現は低く、得られる値は本質的に、ＧＦＰ蛍光アッセイにおいては検出できなかった（Ｎ末端ＣＢＤヘルパードメインを有するタンパク質の発現の＜２５％）。コドンレベルでの多様性を作出するために、７種類のアミノ酸配列を選択し、コドン多様性を有するものを準備した。異なるコドンを有し、１２アミノ酸をコードする７対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングさせ、ＮｄｅＩ／ＢｓａＩで制限消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０５５１（Ｓｔｕｆｆｅｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）とライゲーションし、そして、７種類のライブラリーのコロニーを得るために、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換した。得られたクローンは、発現のスクリーニングにＧＦＰの蛍光を用いることができるように、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５-ＧＦＰにＮ末端ＸＴＥＮ１２ｍｅｒをインフレームで融合させた配列を有するものである。作出した７種類のライブラリーから個別のコロニーを選択し、深型の９６ウェルプレートに入れた５００μｌのｓｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ培地中で飽和に達するまで一晩生育させた。理論的なライブラリーの多様性のおよそ１／２から１／３の数の範囲のコロニーを選択した（表１５を参照のこと）。
Figure 0005839597
飽和した一晩培養を自動誘導培地を用いた新しい５００μｌ培養中に播種し、これを２６℃で一晩培養した。次に、含まれるレポーターであるＧＦＰの量を決定するために、これらの発現培養を、蛍光プレートリーダーを用いてアッセイした（励起３９５ｎｍ、放射５１０ｎｍ）（発現アッセイの結果を示す、図９を参照のこと）。箱ひげ図としてグラフ化した結果は、ライブラリー由来の最も発現量の高いクローンの値は基準により近かったが、発現レベルの中間値は、「基準」であるＣＢＤＮ末端ヘルパードメインの発現レベルのおよそ半分であったことを示し、このことはこれらの配列の近傍にさらなる最適化が求められることを示すものであった。この結果は、発現レベルが基準となるＣＢＤＮ末端の＜２５％であった、これまでの型のＸＴＥＮとは著しく異なる。この結果はまた、アミノ酸ＭＥから始まるライブラリーの発現レベルよりも、アミノ酸ＭＡから始まるものの方が発現レベルが高いことを示す。このことは、最も発現レベルが高いクローンについて見た場合に最も顕著であり、基準により近いクローンの多くがＭＡを含む配列から始まるものである。ライブラリー中の配列の７５％のみがＭＡから始まる配列であるのに対し、基準であるＣＢＤ−ＡＭ８７５の３３％以内に入った１７６クローンのうち、８７％がＭＡから始まるものであり、最高レベルの発現についてはＭＡから始まるクローンの有意に高い割合が示された。最も発現の高い９６クローンについて同一性を確認するために配列決定を行い、ＬＣＷ５４６から４配列、ＬＣＷ５４７から４配列及びＬＣＷ５５２から４配列の、総和１２配列をさらなる最適化のために選抜した（表１６を参照のこと）。
Figure 0005839597
実施例１５：ＸＴＥＮ構築物のＮ末端伸張の構築、及びコドン３と４を最適化したライブラリーのスクリーニング
この実施例では、ＸＴＥＮ融合が融合タンパク質のＮ末端にある融合タンパク質の発現を、ヘルパードメインなしで可能にするような翻訳の開始を促進するために、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端を最適化する工程について詳細に記載する。確立した、好ましい最初の２つのコドン（前記実施例を参照のこと）を含む配列の３番目及び４番目のコドンを、好ましいコドンを決定するために無作為化したＬＣＷ５４６、ＬＣＷ５４７及びＬＣＷ５５２由来のクローンに基づく３種類のライブラリーの３番目及び４番目の残基を、これらの位置が可能な限り全てのＸＴＥＮコドンの組み合わせを含むように変更した（図１０を参照のこと）。各ライブラリーに可能な限り全てのＸＴＥＮコドンが含まれるようにするため、３番目と４番目のコドンが異なり、１２アミノ酸をコードする９対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングさせ、ＮｄｅＩ／ＢｓａＩで制限消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０５５１（Ｓｔｕｆｆｅｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）とライゲーションし、そして、ＬＣＷ０５６９〜５７１の３種類のライブラリーのコロニーを得るために、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞中に形質転換した。２４のＸＴＥＮコドンを用いた場合、各ライブラリーの理論的な多様性は５７６のユニークなクローンとなる。作出した３種類のライブラリー由来の総和５０４の個別のコロニーを選択し、深型の９６ウェルプレートに入れた５００μｌのｓｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ培地中で飽和に達するまで一晩生育させた。これにより、相対的なライブラリーの効率及び好ましい配列を把握するために必要なコロニーを十分にカバーできる。飽和した一晩培養を自動誘導培地を用いた新しい５００μｌ培養中に播種し、これを２６℃で一晩培養した。次に、含まれるレポーターであるＧＦＰの量を決定するために、これらの発現培養を、蛍光プレートリーダーを用いてアッセイした（励起３９５ｎｍ、放射５１０ｎｍ）。スクリーニングから得られた最も良い７５クローンについて配列決定を行い、レポーターであるＧＦＰの発現対基準試料についての再試験を行った（図１１を参照のこと）。５２のコロニーから使用可能なシークエンスデータが得られ、これをその後の解析に用いた。ライブラリー毎に分類した結果は、ＬＣＷ５４６が最も良いライブラリーであったことを示す。結果を表１７に示す。驚くべきことに、基準であるＣＢＤＮ末端のベースラインの測定値がたったの〜６００ＡＵであったのに対し、最も良いクローンのベースラインでの蛍光の測定値が〜９００ＡＵであったことを発見した。このことは、基準であるＣＢＤＮ末端の発現とおよそ同じ発現レベルを有した前段階のライブラリーの最もよいクローン（実施例１４）よりも、このライブラリーがおよそ３３％改良されたことを示すものである。
Figure 0005839597
このデータから、３番目及び４番目の位置の位置には好ましい特定のコドンがあることを示す、さらなる傾向が見いだされた。表１８に見られるようにＬＣＷ５６９ライブラリーでは、３番目の位置のグルタミン酸コドンＧＡＡとトレオニンコドンＡＣＴがより高い発現と相関した。
Figure 0005839597
加えて、最も良かった７５クローンについての再試験から、複数のクローンの発現量が、今回は、基準となるクローンよりも非常に良かったことが示された。
実施例１６：ＸＴＥＮ構築物のＮ末端伸張の構築、並びに１２ｍｅｒ及び３６ｍｅｒコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング
この実施例では、ＸＴＥＮ融合が融合タンパク質のＮ末端にある融合タンパク質の発現を、ヘルパードメインなしで可能にするような翻訳の開始を促進するために、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端を最適化する工程について詳細に記載する。確立した、好ましい最初の２つのコドン（前記実施例を参照のこと）に加えて、選択した１２の１２ｍｅｒ配列（前記実施例を参照のこと）を一番Ｎ末端側に、その後に１２５の先に構築した３６ｍｅｒセグメント（前記実施例を参照のこと）をコンビナトリアル手法を用いて組み合わせることにより、幅広い視点から、Ｎ末端について試験した。このことにより、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端に新規の４８ｍｅｒを作出し、そして、Ｎ末端でのより長い配列の相互作用が、より長い配列の発現に及ぼす影響について評価することを可能にした（図１２）。３６ｍｅｒを組み合わせるために用いた二量体化工程と同様に（以下の実施例を参照のこと）、１２５種類の選択した３６ｍｅｒセグメントを含むプラスミドを制限酵素ＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化し、適切な断片をゲルを用いて精製した。クローンＡＣ９４（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）からのプラスミドもまたＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化し、適切な断片をゲルを用いて精製した。これらの断片を一緒にライゲーションし、ＬＣＷ０５７９ライブラリーを得るために、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換した。このライブラリーは、一番Ｎ末端側の、選択した１２種類の１２ｍｅｒの今後のクローニングにおけるベクターとしても用いた。ＬＣＷ０５７９のプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化し、適切な断片をゲルを用いて精製した。選択した１２種類の１２ｍｅｒ配列をコードする１２対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングさせ、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化したＬＣＷ０５７９ベクターとライゲーションし、そしてＬＣＷ０５８０ライブラリーのコロニーを得るために、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンビテント細胞を形質転換した。理論的には多様性は１５００のユニークなクローンとなるため、作出したライブラリーから、総和して１５１２個の個別のコロニーを選択し、深型の９６ウェルプレートに入れた５００μｌのｓｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ培地中で、飽和に達するまで一晩生育させた。これにより、相対的なライブラリーの効率及び好ましい配列を把握するために必要なコロニーを十分にカバーされる。飽和した一晩培養を自動誘導培地を用いた新しい５００μｌ培養中に播種し、これを２６℃で一晩培養した。次に、含まれるレポーターであるＧＦＰの量を決定するために、これらの発現培養を、蛍光プレートリーダーを用いてアッセイした（励起３９５ｎｍ、放射５１０ｎｍ）。最も良かった９０のクローンについて配列決定を行い、レポーターであるＧＦＰの発現について再試験した。８３のクローンについて使用可能なシークエンスデータが得られたため、これらをその後の解析に用いた。それぞれのクローンに含まれるリーダーである１２ｍｅｒを決定するためにシークエンスデータを用い、そして各１２ｍｅｒが発現に及ぼす影響について評価した。クローンＬＣＷ５４６＿０６及びＬＣＷ５４６＿０９が非常に優れたＮ末端であるとして突出していた（表１９を参照のこと）。
Figure 0005839597
Figure 0005839597
配列決定及び再試験のデータにおいて、同じ配列を有する独立した複数の例で同様の結果が示されたことは、このアッセイの信頼性を向上させるものである。加えて、６種類のユニーク配列を有する１０のクローンは基準となるクローンよりも非常に良いものであった。これらを表２０に示す。これらの配列について生じたものはこれらの配列のみであり、これらの配列についてはその他の配列は得られず、また、基準となるクローンよりも優れたものもなかったことが示された。これら６種類の配列がさらなる最適化のために優れていた。
Figure 0005839597
Figure 0005839597
実施例１７：ＸＴＥＮ構築物のＮ末端伸張の構築、並びにＸＴＥＮ−ＡＭ８７５及びＸＴＥＮ−ＡＥ８６４のための１２ｍｅｒと３６ｍｅｒのコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング
ＸＴＥＮ融合が融合タンパク質のＮ末端にある融合タンパク質の発現を、ヘルパードメインなしで可能にするような翻訳の開始を促進するために、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端を最適化する工程について詳細に記載する。確立した、好ましい最初の４つのコドン（前記実施例を参照のこと）及びＮ末端１２ｍｅｒと３６ｍｅｒとの最も良い組み合わせ（前記実施例を参照のこと）に加えて、これらの好ましい配列のまとまりについて試験するために、コンビナトリアル手法を用いた。このことにより、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端に新規の４８ｍｅｒを作出し、そして、これまでの結果のコンフルエンスについて試験することを可能にした。加えて、これらリーダー配列の能力が、全てのＸＴＥＮタンパク質の低い発現量に対する普遍的な解決となるかについて、新しい４８ｍｅｒをＸＴＥＮ−ＡＥ８６４及びＸＴＥＮ−ＡＭ８７５の両方の前に配置することによって評価した。３６ｍｅｒセグメントの全１２５のクローンを用いる代わりに、コンビナトリアルライブラリー中で最も良いＧＦＰの発現を示した、選択した６つの３６ｍｅｒセグメントのクローンからのプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化し、適切な断片をゲルを用いて精製した。ＡＣ９４（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）及びＡＣ１０４（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦＰ）からのプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化し、適切な断片をゲルを用いて精製した。これらの断片を一緒にライゲーションし、ＬＣＷ０５８５（−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）及びＬＣＷ０５８６（−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦＰ）ライブラリーのコロニーを得るために、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換した。これらのライブラリーは、一番Ｎ末端側の、選択した８種類の１２ｍｅｒの今後のクローニングにおけるベクターとしてもまた役立つ場合がある。ＬＣＷ０５８５及びＬＣＷ０５８６のプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化し、適切な断片をゲルを用いて精製した。先のスクリーニング（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ２）において最も良いＧＦＰの発現を示した、選択した８種類の１２ｍｅｒ配列をコードする８対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングさせ、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化したＬＣＷ０５８５及びＬＣＷ０５８６ベクターとライゲーションし、そして最終的なライブラリーである、ＬＣＷ０５８７（ＸＴＥＮ＿ＡＭ９２３−ＧＦＰ）及びＬＣＷ０５８８（ＸＴＥＮ＿ＡＥ９１２−ＧＦＰ）ライブラリーのコロニーを得るために、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンビテント細胞を形質転換した。理論的には多様性は４８のユニークなクローンとなるため、作出したライブラリーから総和２５２個の個別のコロニーを選択し、深型の９６ウェルプレートに入れた５００μｌのｓｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ培地中で、飽和に達するまで一晩生育させた。これにより、相対的なライブラリーの効率及び好ましい配列を把握するために必要なコロニーを十分にカバーされる。飽和した一晩培養を自動誘導培地を用いた新しい５００μｌ培養中に播種し、これを２６℃で一晩培養した。次に、含まれるレポーターであるＧＦＰの量を決定するために、これらの発現培養を、蛍光プレートリーダーを用いてアッセイした（励起３９５ｎｍ、放射５１０ｎｍ）。最も良かった３６のクローンについて配列決定を行い、レポーターであるＧＦＰの発現について再試験した。３６のクローンについて使用可能なシークエンスデータが得られたため、これら３６クローンをその後の解析に用いた。シークエンスデータを用いて、クローン中に含まれる１２ｍｅｒ、３番目のコドン、４番目のコドン及び３６ｍｅｒを決定し、多くのクローンが、同じ配列を含む独立した産物であることを明らかにした。加えて、これらのクローンについての再試験の結果の値は類似しており、このことはスクリーニング工程がロバストであることを示している。Ｎ末端における好ましい特定の組み合わせが見られ、そして基準である対照よりも一貫しておよそ５０％高い、蛍光の値が得られた（表２１及び２２を参照のこと）。これらのデータは、最適化したＮ末端ＸＴＥＮをコードする配列を融合タンパク質遺伝子に加えることにより、融合タンパク質の発現が顕著に増加する、と言う結果を支持するものである．
Figure 0005839597
Figure 0005839597
特に、ＸＴＥＮ−ＡＭ８７５への好ましいＮ末端の組み合わせとＸＴＥＮ−ＡＥ８６４への好ましい組み合わせは同じではなく（表２１及び２２）、このことは、開始部位から１５０塩基離れた配列とのより複雑な相互作用が発現レベルに影響することを示している。好ましいヌクレオチド配列の配列を表２３に示し、そして独立して発現を確認するために、好ましいクローンをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した（図１３を参照のこと）。ＸＴＥＮ＿ＡＭ９２３及びＸＴＥＮ＿ＡＥ９１２の完全長配列をさらなる解析用に選択した。
Figure 0005839597
実施例１８：ＧＰＸＴＥＮの作出及び評価方法；ＸＴＥＮ−Ｅｘ４を例として
ＧＰＸＴＥＮ組成物の作出及び評価の一般的な模式図が図６に示されており、そしてこれは本実施例の基本的な説明の基礎となる。開示した方法及び当業者に既知の方法を、例示となる実施例に示した指針と共に用いることにより、熟練者は、ＸＴＥＮ、ＧＰ及び当該分野において既知のＧＰ変異体を含む、広範囲のＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を作出及び評価することができる。そのため、本実施例は単に例示するためだけのものであると解釈され、かつ、方法を制限するものでは一切なく；数々の変異型が当業者には明かであろう。本実施例においては、ＡＥファミリーモチーフのＸＴＥＮに結合した、ｅｘｅｎｄｉｎ−４のＧＰＸＴＥＮ（「Ｅｘ４」）が作出されるだろう。
ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドの作出の一般的な模式図を、図４及び５に示す。図５は、本発明の実施形態のうちの１つの、ＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の組み合わせにおける、代表的な工程を示す模式的なフローチャートである。個別のオリゴヌクレオチド ５０１をアニーリングさせ、１２アミノ酸モチーフ（「１２−ｍｅｒ」）のような配列モチーフ ５０２にし、これを次にＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ制限部位を含むオリゴ ５０３とライゲーションする。モチーフライブラリーは、例えば、表１のＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、又はＡＱ配列のような、特定の配列のＸＴＥＮファミリーに限定することができる。この例においては、ＡＥファミリーモチーフ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１８６−１８９）をモチーフライブラリーとして用いることができ、これを「ビルディングブロック」の長さにするために、例えば３６アミノ酸をコードするセグメントにするために、１２−ｍｅｒとアニーリングさせる。ＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子を、所望される長さのＸＴＥＮ遺伝子 ５０４になるまで、ライゲーションと「ビルディングブロック」の多量体化により組み合わせることができる。図５に示すように、この例におけるＸＴＥＮの長さは４８アミノ酸残基であるが、この方法により、より長い長さにすることもできる。例えば、多量体化は、ライゲーション、オーバーラップエクステンション、ＰＣＲアセンブリ−、又は当該分野において既知の同様のクローニング技術を用いて行うことができる。ＸＴＥＮ遺伝子をｓｔｕｆｆｅｒベクター中にクローニングすることができる。図５に示したこの例においては、ベクターは、Ｆｌａｇ配列 ５０６とそれに続く、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ部位に隣接したｓｔｕｆｆｅｒ配列 ５０７及びＧＰ遺伝子（例えば、ｅｘｅｎｄｉｎ−４） ５０８をコードすることができ、結果としてＧＰＸＴＥＮ ５００をコードする遺伝子となり、これはこの例においては、Ｎ末端側からＣ末端側方向への配置がＸＴＥＮ−Ｅｘ４である融合タンパク質をコードする。
Ｅｘ４（又は別の候補ＧＰ）をコードするＤＮＡ配列は、適切な細胞源から調製したｃＤＮＡライブラリーから、若しくはゲノムライブラリーから当該分野において既知の標準的な方法を用いて簡便に得ることができ、又は公的に使用可能なデータベース、特許若しくは参考文献から得られたＤＮＡ配列を用いて合成的に（例えば自動核酸合成で）作出することもできる。その後、タンパク質のＥｘ４部分をコードする遺伝子又はポリヌクレオチドを構築物中にクローニングすることができ、本明細書において記載した構築物のように、これらは、生物系において高レベルのタンパク質を発現するために適切な転写及び翻訳配列の制御下にある、プラスミド又はその他のベクターであってもよい。ＸＴＥＮ部分をコードする二番目の遺伝子又はポリヌクレオチド（図５の例においてはＡＥを含む４８アミノ酸残基として示される）を、ライゲーション又は多量体化工程を介して構築物中のＥｘ４をコードする遺伝子に隣接して及びインフレームでクローニングすることにより、Ｅｘ４遺伝子のＮ末端（又はその相補体）をコードするヌクレオチドに遺伝的に融合させることができる。より長い長さにＸＴＥＮをコードする付加的なヌクレオチドは、所望される長さのＸＴＥＮ成分を得るために、ＸＴＥＮ-Ｅｘ４遺伝子をランゲーションすることができる。さらに、ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドは、Ｅｘ４配列のＣ末端側（又はその相補体）にコードするヌクレオチドに隣接し、インフレームしてライゲーションすることができ、結果として、図８に示すように、最適化したＮ末端配列（ＮＴＳ）を含む、エキセンジン４ グルコース調節ペプチドのＮ末端側とＣ末端側の両方に結びついたＸＴＥＮにＧＰＸＴＥＮをコードする遺伝子となる。この方法では、ＸＴＥＮ−Ｅｘ４−ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子（又はその相補鎖）が構築物中に生成されるだろう。単量体ポリペプチドとして、融合パートナーの様々な置換をコードするように、構築物を異なる配置になるように設計することができる。例えば、Ｎ末端側からＣ末端側への配置が、Ｅｘ４−ＸＴＥＮ；ＸＴＥＮ−Ｅｘ４；Ｅｘ４−ＸＴＥＮ−ＥＸ４；ＸＴＥＮ−Ｅｘ４−ＸＴＥＮ；並びに前述のものの多量体である融合タンパク質をコードする遺伝子を作出することができる。任意に、このキメラＤＮＡ分子をより適切な発現ベクターである、別の構築物中に導入又はクローニングしてもよい。この時点で、キメラＤＮＡ分子を発現することができる宿主細胞を、キメラＤＮＡ分子を用いて形質転換するだろう。目的のＤＮＡセグメントを含むベクターを、細胞宿主の型に依存する周知の方法により、前述のように、適切な宿主細胞に導入することができる。
ＸＴＥＮ−Ｅｘ４発現ベクターを含む宿主細胞を、プロモーターを適切に活性化するために改変した、標準的な栄養培地中で培養するだろう。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現させるために選択した宿主細胞の使用について既に知られている条件であり、当業者には明かであろう。融合タンパク質を発現させた後に、細胞を遠心分離により回収し、物理的又は化学的な手段を用いて破砕し、そして、以下に記載したように融合タンパク質を精製するため、得られた粗抽出物をさらに用いるだろう。宿主細胞から分泌されるＧＰＸＴＥＮ組成物の場合は、遠心分離で得られた上清を分離し、さらなる精製にかけるだろう。
試料中の遺伝子発現を、例えば、標準的なサザンブロット、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノザンブロット［Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：５２０１−５２０５（１９８０）］、ドットブロット（ＤＮＡ解析）、又は本明細書において示した配列に基づく、適切に標識したプローブを使用したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、直接測定するだろう。あるいは、遺伝子産物の発現を直接定量するために、細胞の免疫組織学的染色のような、蛍光を用いた免疫学的な手法によって遺伝子発現を測定するだろう。免疫組織学的染色及び／又は体液試料に有用な抗体は、モノクローナルであっても又はポリクローナルであってもよく、そして任意の動物を用いて調製することができる。簡便に、本明細書において提供した配列に基づく合成ペプチドを用いてＥｘ４ポリペプチド配列に対する抗体を調製してもよく、又はＥｘ４に融合させた外生の配列であって、かつ、特異的な抗体エピトープをコードする配列に対する抗体を調製してもよい。選択マーカーの例は当業者には周知であり、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などが含まれる。
ＸＴＥＮ−Ｅｘ４ポリペプチド産物を当該分野において既知の方法を介して精製するだろう。ゲルろ過、アフィニティ精製、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びゲル電気泳動などの方法は全て、精製工程において使用することができる。精製の特定の方法は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ． Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ． Ｃａｓｔｏｒ （ｅｄ．）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９９４，及びＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．，前記、に記載されている。複数工程の分離についてはまた、Ｂａｒｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０：１７９−９０ （１９９０）及び Ｂｅｌｏｗ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ． ６７９：６７−８３ （１９９４）に記載されている。
図６に示したように、次に、単離したＸＴＥＮ−Ｅｘ４融合タンパク質をそれらの化学的及び活性の特性についての特徴付けを行うだろう。単離した融合タンパク質を、例えば、配列、純度、見かけの分子量、溶解度及び安定性について、当該分野において既知の標準的な方法を用いて解析するだろう。期待される基準を満たしている融合タンパク質を次に、活性について評価するだろう。活性は、インビトロ又はインビボで、本明細書、例えば、実施例若しくは表３５のアッセイで開示した１つ以上のアッセイを用いて、測定することができる。
加えて、実施例２５に記載したように、標準的な薬物動態学的指標を特定するために、ＸＴＥＮ−Ｅｘ４融合タンパク質を１種以上の動物種に投与するだろう。
ＸＴＥＮ−Ｅｘ４構築物の作出、発現及び回収、並びにその後、本明細書に開示した方法又は当該分野において既知のその他方法によりそれらの特徴を解析することを繰り返すことにより、当業者はＥｘ４及びＸＴＥＮを含むＧＰＸＴＥＮ組成物を生産することができ、そして高い溶解度、高い安定性、薬物動態の改善及び免疫原性の低下のような、融合していない対応するＥｘ４と比較して全体的に向上した治療用活性を生じる期待される特性を確認するために、評価を行うことができる。求められる特性をもたないそれらの融合タンパク質については、異なる配列を構築し、発現させ、単離し、そしてそれらの特性を有する組成物を得るためにこれらの方法により評価することができる。
実施例１９：エキセンジン４ ＸＴＥＮの遺伝子及びベクターの構築
セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を、エキセンジン４をコードする配列にアセンブルし、ＸＴＥＮのＮ末端側の配列をコードするために遺伝的に融合した。エキセンジン４の天然Ｎ末端を処理するために、ＣＢＤのすぐ後にタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ開裂部位（ＥＮＬＹＦＱ）が続く。ＣＢＤ−エキセンジン４フラグメントをＴＥＶ開裂部位に優先してエキセンジン４配列を融合する３’オリゴヌクレオチドを用いてＣＢＤ遺伝子を増幅することによりアセンブルし、結果として、ＣＢＤ遺伝子のＣ末端側にエキセンジン４のインフレーム融合が生じる。ＸＴＥＮデスティネーションベクター（図７Ａ）中のｓｔｕｆｆｅｒに隣接したＮｄｅＩ及びＢｓａＩ制限部位（ＮｄｅＩ及びＢｓａＩと末端が一致している）を導入した、十分な長さのＣＢＤ−エキセンジン４を次にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ｐｒＸＴＥＮプラスミドは、Ｔ７プロモーターの制御下で挿入されたＳｔｕｆｆｅｒ−ＸＴＥＮ配列である、Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴ３０の派生物であり、ここでＳｔｕｆｆｅｒは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）かＣＢＤをコードし、用いた特定のプラスミドに依存している配列であり得る。ＸＴＥＮは３６〜８６４アミノ酸又は、用いた特定のプラスミドに再び依存している、それを超える任意の長さであってよい。ｐｒＸＴＥＮ中のそのｓｔｕｆｆｅｒ配列をＣＢＤ−エキセンジン４をコードする断片（図７Ｂ）と置換することにより、構築物を生成した。ｐｒＸＴＥＮの特徴としては、Ｓｔｕｆｆｅｒ配列の上流のＴ７プロモーター、及びｓｔｕｆｆｅｒ配列の下流にインフレームで融合したＸＴＥＮ配列がある。この実施例の中で用いたＸＴＥＮ配列は８６４アミノ酸を含むＡＥ８６４をコードする。ＮｄｅＩ及びＢｓａＩエンドヌクレアーゼを用いて制限消化することにより、ｓｔｕｆｆｅｒ断片を除去した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限消化したＣＢＤ−エキセンジン４フラグメントと開裂させたｐＸＴＥＮベクターとをライゲーションし、そしてＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にエレクトロポレーションで導入した。ＤＮＡミニプレップで形質転換体をスクリーニングし、所望の構築物をＤＮＡシークエンシングで確認した。最終的なベクターは、Ｔ７プロモーターの制御下にあるＣＢＤエキセンジン４ＸＴＥＮ遺伝子である。
実施例２０：グルカゴン−ＸＴＥＮ遺伝子及びベクターの構築
セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を、グルカゴンをコードする配列にアセンブルし、ＸＴＥＮの配列をコードするために遺伝的に融合した。グルカゴンの天然Ｎ末端を処理するために、ＣＢＤのすぐ後にタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ開裂部位（ＥＮＬＹＦＱ）が続く。ＣＢＤ−グルカゴンフラグメントをＴＥＶ開裂部位に優先してグルカゴン配列を融合する３’オリゴヌクレオチドを用いてＣＢＤ遺伝子を増幅することによりアセンブルし、結果として、ＣＢＤ遺伝子のＣ末端側にグルカゴンのインフレーム融合が生じる。十分な長さのＣＢＤ−グルカゴンを次に、ＸＴＥＮデスティネーションベクター（ｐＸＴＥＮ；図９Ａ）中のｓｔｕｆｆｅｒに隣接したＮｄｅＩ及びＢｂｓＩ制限部位（ＮｄｅＩ及びＢｓａＩと末端が一致している）を導入した、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ＴｈｅｐＸＴＥＮプラスミドはＳｔｕｆｆｅｒ−ＸＴＥＮの形態をもつ、Ｔ７プロモーターの制御下で挿入されたＳｔｕｆｆｅｒ−ＸＴＥＮ配列である、Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴ３０の派生物であり、ここでＳｔｕｆｆｅｒは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はＣＢＤのいずれかをコードする配列であってもよく、用いた特定のプラスミドに依存している。ＸＴＥＮは３６〜８７５アミノ酸又は、用いた特定のプラスミドに同様に依存している、それを超える任意の長さであってよい。ｐｒＸＴＥＮ中のそのｓｔｕｆｆｅｒ配列をＣＢＤ−グルカゴンをコードする断片と置換することにより、構築物を生成した。ｐＸＴＥＮの特徴としては、ｓｔｕｆｆｅｒ配列の上流のＴ７プロモーター、及びｓｔｕｆｆｅｒ配列の下流にインフレームで融合したＸＴＥＮ配列がある。この特定の実施例において用いたＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮのＹファミリーに属し、かつ、３６、７２、１４４、２８８、及び５７６アミノ酸を含む長さの配列をコードするコードする。ＮｄｅＩ及びＢｓａＩエンドヌクレアーゼを用いて制限消化することにより、ｓｔｕｆｆｅｒ断片を除去した。制限消化したＣＢＤ−グルカゴン断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて開裂させたｐｒＸＴＥＮベクターとをライゲーションし、そしてＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にエレクトロポレーションで導入した。ＤＮＡミニプレップで形質転換体をスクリーニングし、所望の構築物をＤＮＡシークエンシングで確認した。最終的なベクターは、Ｔ７プロモーターの制御下にあるＣＢＤグルカゴン−ＸＴＥＮ遺伝子である。結果得られたＤＮＡ配列は、それぞれ３６、７２、１４４、２８８、及び５７６アミノ酸のＸＴＥＮの長さに関連するグルカゴンをコードすることができる。
実施例２１：Ｇｅｇ−ＸＴＥＮの精製と特徴解析
ＸＴＥＮに関連するグルカゴンのＧＰＸＴＥＮを、大腸菌において組み換え生産し、３段ステップを用いて均一に精製した。最終的な構築物は、Ｔ７プロモーターの制御下で、ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ （ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃ＡＢＮ５４２７３）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ開裂部位（ＥＮＬＹＦＱ）、グルカゴン配列、及び適当なＸＴＥＮ配列からｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇタンパク質結合領域セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）をコードする遺伝子を含んでいた。簡潔には、タンパク質発現を、発現プラスミドを担持しているＢＬ２１―Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）大腸菌のログ相培養に１ｍＭのＩＰＴＧの追加によって誘導した。ＣＢＤ配列を取り除き、グルカゴンの天然Ｎ末端を生成するために、ＴＥＶプロテアーゼをＧｃｇ―ＸＴＥＮを含む熱処理した細胞可溶化物に加えた。次に、開裂タンパク質を、ＤＥ５２、ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ、及びブチル・セファロースＦＦカラムを通じて精製した。最終的なマテリアルを、２０ｍＭ トリス ｐＨ７．５、１３５ｍＭのＮａＣｌで調製し、０．２２のミクロンフィルタを用いて無菌濾過した。発現は湿った細胞重量（〜１００ｍｇ／Ｌ最終的に ＯＤ〜４）グラム当たり約７ｍｇのタンパク質であると特定され、全体の精製収率は約６０％であった。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＴＳＫ―Ｇｅｌ、Ｇ３０００ ＳＷＸＬ、オートサンプラーを備えているＨＰＬＣシステムに接続している７．８ｘ３００ｍｍ ＨＰＬＣカラム（東ソー社製 Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及びＵＶ／ＶＩＳ検出器（島津製作所製）を使用して行った。そのシステムを、周囲温度で０．７ｍＬ／分の流速で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の中で平衡にした。カラムの検定のために、ゲル濾過標準（バイオラド、ｃａｔ＃１５１―１９０１）を用いた。試料の分析のために、１ｍｇ／ｍｌのＧｃｇ―ＸＴＥＮの２０のμｌを注入し、吸収度はＯＤ２１４ｎｍを使用して２０分間調べた。
逆相Ｃ１８クロマトグラフィ（ＲＰＣ１８）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ ５μｍ Ｃ１８−１１０Ａ、オートサンプラー及びＵＶ／ＶＩＳ検出器（島津製作所社製）を備えているＨＰＬＣシステムに接続した４．６ｘ１００ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いて行った。緩衝液Ａは水液中０．１％ＴＦＡであり、緩衝液Ｂは１００％アセトニトリル中０．１％ＴＦＡであった。そのシステムを、１ｍｌ／分の混合流量で動作させた。カラムを、３５°Ｃ、５％のＢｕｆｆｅｒＢ中で平衡にした。Ｇｃｇ―ＸＴＥＮのクロマトグラフィ分離を、１５分にわたり５％から９５％のＢまで線形勾配により実施した。試料分析のために、１ｍｇ／ｍｌのＧｃｇ―ＸＴＥＮの１０μｌを注入し、吸収度はＯＤ２１４ｎｍを用いて調べた。試料分析は、トランスフェクトしたＧｃｇＲ細胞系（Ｃａｔ＃ＨＴＳ１１２Ｃ）を用いて、ミリポア社のＧＰＣＲＰｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）サービスによって行われた。カルシウム流量を、Ｇｃｇ―ＸＴＥＮ又は合成グルカゴンの連続希釈物の追加の後、ＦＬＩＰＲ分析によってリアルタイムに調べた。特徴解析及び安定性分析の結果を、図１９に示す。データは、Ｇｃｇ―ＸＴＥＮが均一な、明確な化学的存在であることを示す。さらに、最終的なタンパク質の可溶性および安定性は、未修飾グルカゴン（データは不示）を通じて著しく向上する。
実施例２２：異なるペイロードを有するＸＴＥＮ融合タンパク質の分析サイズ排除クロマトグラフィー
様々な治療用タンパク質及び伸張した長さの非構造性組換えタンパク質を含む融合タンパク質について、サイズ排除クロマトグラフィー分析を行った。ＴＳＫＧｅｌ−Ｇ４０００ ＳＷＸＬ（７．８ｍｍｘ３０ｃｍ）カラムを用いた例示的なアッセイにおいて、１ｍｇ／ｍｌ濃度の精製したグルカゴン融合タンパク質４０μｇを、２０ｍＭリン酸塩ｐＨ６．８、１１４ｍＭ ＮａＣｌを用い、流速０．６ｍｌ／分で分離した。クロマトグラムプロファイルをＯＤ２１４ｎｍ及びＯＤ２８０ｎｍでモニターした。全てのアッセイにおいて、カラムの検定は、チログロブリン（６７０ｋＤａ）、ウシγ−グロブリン（１５８ｋＤａ）、トリオボアルブミン（４４ｋＤａ）、ウマミオグロブリン（１７ｋＤａ）及びビタミンＢ１２（１．３５ｋＤａ）を含むマーカーである、ＢｉｏＲａｄのサイズ排除校正基準を用いて行った。図１６に、グルカゴン−Ｙ２８８、グルカゴン−Ｙ１４４、グルカゴン−Ｙ７２、グルカゴン−Ｙ３６の代表的なクロマトグラフィープロファイルを重ねて示す。データは、各化合物の見かけの分子量は結合させたＸＴＥＮ配列の長さに比例することを示す。しかしながら、データはまた、各構築物の見かけの分子量が球状タンパク質の予測される分子量よりも有意に大きいことを示す（同じアッセイで解析した基準と成るタンパク質との比較により、及び図１５のＳＤＳゲルにおいて示す分子量標準との比較により示すように）。ＧＰＸＴＥＮ組成物を含む、評価した全ての構築物のＳＥＣ分析に基づく、見かけの分子量、見かけの分子量因子（算出した分子量に対する見かけの分子量の比率として示す）及び流体力学半径（ＲＨ、単位ｎｍ）を表２４に示す。結果は、５７６アミノ酸又はそれより大きい異なるＸＴＥＮを組み込むと、融合タンパク質の見かけの分子量がおよそ３３９ｋＤａ〜７６０大きくなり、８６４アミノ酸又はそれより大きいＸＴＥＮはおよそ８００ｋＤＡの見かけの分子量を付与することを示す。見かけの分子量が実際の分子量に対して比例的に増加するという結果は、いくつかの異なるモチーフファミリー、すなわちＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、及びＡＭ由来のＸＴＥＮを含むように作出した融合タンパク質と一致するものであり、その増加は少なくとも４倍であり、かつ比率は約１７倍ほど高かった。加えて、５７６又はそれ以上のアミノ酸のＸＴＥＮ融合パートナーを、様々なペイロード（グルカゴンをＹ２８８に融合させた場合にはさらに２８８残基）を含む融合タンパク質中に組み込むと、流体力学半径は７ｎｍ又はそれより大きくなり、これはおよそ３−５ｎｍである糸球体細孔径よりもかなり大きいものである。従って、成長及びＸＴＥＮを含む融合タンパク質の腎クリアランスが低減するであろうと結論づけられ、このことは、対応する融合していない生物学的ペイロードタンパク質と比較して、終末相半減期の増大及び治療用又は生物学的効果の向上に寄与する。
Figure 0005839597
・様々な順番で共に使用されると「ファミリー配列」になる個々のモチーフ配列を示す
表２４：様々なポリペプチドのＳＥＣ解析
実施例２３：ＧＦＰに融合させた伸張ポリペプチドの、カニクイザルにおける薬物動態
ＰＫ指標に及ぼす組成物及び非構造性ポリペプチドの長さの効果を特定するために、ＧＦＰ−Ｌ２８８、ＧＦＰ−Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｙ５７６及びＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰの薬物動態学的をカニクイザルにおいて試験した。注入後、様々な時点で血液試料を解析し、捕捉抗体として抗ＧＦＰポリクローナル抗体及び検出抗体として同じポリクローナル抗体をビオチン化したものを用いたＥＬＩＳＡによって、血漿中のＧＦＰ濃度を測定した。結果を図２６にまとめた。それらは、ＸＴＥＮ配列の長さが長くなると、半減期が驚くほど長くなっていることを示す。例えば、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｌ２８８（ＸＴＥＮが２８８アミノ酸残基である）の半減期は１０時間であると特定された。非構造性ポリペプチド融合パートナーの長さを５７６アミノ酸へと倍にすることにより、複数の融合タンパク質構築物、すなわちＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｙ５７６の半減期が２０〜２２時間へと増加した。非構造性ポリペプチド融合パートナーの長さをさらに８３６残基へと増加させると、ＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰの半減期は７２〜７５時間になった。従って、ポリマーの長さを２８８から５７６残基へと２８８残基増加させることで、インビボでの半減期が約１０時間長くなった。しかしながら、ポリペプチドの長さを５７６残基から８３６残基へと２６０残基させることによっては、半減期は５０時間よりも長くなった。これらの結果は、非構造性ポリペプチドの長さが、比例的よりも高くインビボ半減期を長くする、驚くべき閾値を有することを示す。従って、伸張した、非構造性ポリペプチドを含む融合タンパク質は、より短い長さのポリペプチドと比較して向上した薬物動態学的特性を有すると予測される。
実施例２４：ＸＴＥＮの血清安定性
ＧＦＰのＮ末端に融合させたＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を含む融合タンパク質を、３７℃で最長７日間、サル血漿及びラット腎臓溶解物中でインキュベートした。試料を０時点、１日目及び７日目で採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥで解析し、その後ウエスタン解析で解析した。抗ＧＦＰ抗体を用いた検出を図１４に示す。ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の配列は血漿中で７日間にわたりインキュベートしても、無視できるほどしか分解の徴候を示さなかった。しかしながら、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４はラット腎臓溶解物では３日間で速やかに分解された。ＧＦＰ−ＡＥ８６４を免疫沈降し、上述したようにＳＤＳ ＰＡＧＥで解析して、融合タンパク質のインビボでの安定性を試験した。注入後７日までに採取した試料は、ほとんど分解の徴候を示さなかった。結果は、ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質の薬物動態学的特性の向上における因子である、血清プロテアーゼによる分解に対してＧＰＸＴＥＮが抵抗性であることを示す。
実施例２５：エキセンジン４及びＸＴＥＮを含む融合タンパク質のＰＫ解析
ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質Ｅｘ４＿ＡＥ８６４を、１回分の皮下投与の後、融合タンパク質のインビボで薬物動態学パラメータを特定するために、カニクイザルに評価を行った。
方法：ＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質を、２つの異なった濃度、すなわち８ｍｇ／ｍＬ及び４０ｍｇ／ｍＬにおいて、２０ｍＭ トリス ｐＨ７．５ １３５ｍＭ Ｎａｃｌで形成した。４個体のサルの３群（２個体メス、２個体オス、２−６ｋｇ）は、各動物の背中の皮膚と、肩甲部の組織の下位層との間に、大量瞬時投与を経て、１ｍｇ／ｋｇ（群１、０．１２５ｍＬ／ｋｇ）、１ｍｇ／ｋｇ（群２、０．０２５ｍＬ／ｋｇ）、又は５ｍｇ／ｋｇ（群３、０．１２５ｍＬ／ｋｇ）に各々投与した。連続的な血液サンプル（１ｍｌ±０．５ｍｌ）を、拘束椅子を利用し,麻痺することなく注射器を用いて以前から順応している動物の大腿動脈又は動脈から１４日間にわたり採取した。必要に応じて、拘束椅子は、最大３０分間利用された。全ての動物は、投与前一晩および血液サンプル採取（該当する場合、食物は、４時間の採取間隔で最後の血液サンプル採取の後、３０分以内に戻された）の最初の４時間の間絶食させた。各血液サンプルを、ヘパリン血漿分離器に集め、遠心分離中、約５分間、氷（２℃〜８℃）に維持した。血液サンプルを、遠心分離し（５分間で８０００ｘｇ）、血漿をポリプロピレン管に移した。血漿サンプルを冷凍してスナップし、検査するまで約−７０℃で保管した。解析は、サンドイッチＥＬＩＳＡ形式を用いて行われた。
結果：サルについて薬物動態学的パラメータを算出し、結果を表２５に示した。薬物動態学的パラメータを、投薬せずプールしている全ての動物と標準二段階分析の両方を用いて解析した。その結果は、Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ及び分配（Ｖｚ）値の量によって証明されたように、群１対群２において投与した投与量に基づく、融合タンパク質の吸収の違いを示している。しかしながら、算出された半減期値は、３つの群全体に相当し、報告された２．４時間のエクセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）の終末相半減期をかなり上回る。
Figure 0005839597
結論：霊長類モデルにおいて示されるように、半減期が少なくとも３０倍増加すると、ＧＰＸＴＥＮ融合を引き起こすためにエキセンジン４をＸＴＥＮに結合することは、結果として全３つの製剤に対して薬物動態学的パラメータを著しく強化することになる。
実施例２６：食餌性肥満のマウスモデルにおけるＧＰＸＴＥＮの使用
単一のＧＰＸＴＥＮ組成物としてモノマー融合タンパク質の固定した組合せの有用性を確認するために、食餌性肥満のマウスモデルにおいて、ＸＴＥＮに結合されるグルコースを調節するペプチドの併用療法の効果を評価した。
方法：Ｙ―２８８―ＸＴＥＮ（「Ｇｃｇ―ＸＴＥＮ」）に結合されるグルカゴン、及び単一のＡＥ５７６―ＸＴＥＮ（「Ｅｘ４―ＸＴＥＮ」）又は単一のｅｘｅｎａｔｉｄｅに結合されるｅｘｅｎａｔｉｄｅの併用療法の効果を、オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ食餌性肥満（ＤＩＯ）マウス（１０週齢）で試験した。６０％高脂肪にさせたマウスを、治療群（群当たりｎ＝１０）Ｅｘ４―ＸＴＥＮ８６４（１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ２Ｄ）、Ｅｘ４―ＸＴＥＮ８６４（２０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ４Ｄ）、Ｅｘ４―ＸＴＥＮ８６４（１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ２Ｄ）プラスＧｃｇ―ＸＴＥＮ２８８（２０μｇ／ｋｇ ＩＰ ＢＩＤ）、及びＥｘ４―ＸＴＥＮ８６４（２０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ４Ｄ）プラスＧｃｇ―ＸＴＥＮ２８８（４０μｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ１Ｄ）にランダム化した。２０ｍＭトリスｐＨ７．５、１３５ｍＭ ＮａＣｌ ＩＰ Ｑ１Ｄで治療したプラセボ群（ｎ＝１０）を、同時に検査した。全ての群に、２８日間継続的に投薬した。体重を研究を通して定期的にモニターし、絶食の血糖を治療期間の前後で測定した。群は、２８日の治療の間、連続的に投薬された。体重を研究の全体にわたって連続的にモニターし、絶食の血糖は治療期間の前後で測定し、脂質濃度を治療期間の後特定した。
結果：その結果を図２３−２５に示す。データは、研究過程のプラセボと関連し、連続的に月一回投薬することがＧｃｇ―ＸＴＥＮ単独及びＥｘ４―ＸＴＥＮ単独で治療した動物の体重増加について有意な減少を得たことを示している。さらに、Ｅｘ４―ＸＴＥＮ、又はＧｃｇ―ＸＴＥＮ及びＥｘ４―ＸＴＥＮを同時に投与された動物は、Ｇｃｇ―ＸＴＥＮの単独投与、及びプラセボと比較して、統計学的に有意に多大なる体重減少を示した。グルカゴン投与の毒性作用は、十分確認されている。最近、ラット及びビーグルイヌにおけるグルカゴンに対する効果のない最大投与量は、１ｍｇ／ｋｇ／日が明らかに両方の種において毒性効果のないレベルであるとみなされたと報告された（組み換えＤＮＡ技術によって産出されるＥｉｓｔｒｕｐ Ｃ、グルカゴン：反復投与毒性研究、４週間、ＣＤラット及びビーグルイヌに対する静脈内投与。Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ.１９９３ Ａｕｇ；７３（２）：１０３−１０８）。
データはまた、１カ月間の連続投薬が、単一のＧｃｇ―ＸＴＥＮで治療された動物ではなく、プラセボと関連した、Ｇｃｇ―ＸＴＥＮ単独で治療された動物ではなく、Ｅｘ４―ＸＴＥＮ単独で治療された動物について絶食の血糖の有意な減少を得たことを示している。しかしながら、Ｇｃｇ―ＸＴＥＮ及びｅｘｅｎａｔｉｄｅの両方を同時に投与された動物は、単独投与されたブドウ糖調節ペプチドと比較しても、絶食での血糖濃度の統計学的に有意により大きな減少を示した。注目すべきは、Ｅｘ４―ＸＴＥＮとの組み合わせにおける有益な効果となるＧｃｇ―ＸＴＥＮ組成物の投与量が、２０〜４０μｇ／ｋｇであることである（融合タンパク質組成物の全重量）。すなわち、齧歯類モデルにおいて、グルカゴン単独について報告された効果のない投与量よりも少なくとも２５倍低かった。さらに、プラセボと比較し、ＧＰを受けているマウスは、トリグリセリド及びコレステロール濃度が減少した。
結論：データは、それぞれＸＴＥＮに結合している、エキセンジン４及びグルカゴンのような、２つのグルコースを調節するペプチドの２つの融合タンパク質を用いた併用療法は、結果として、単一のグルコースを調節するペプチドでみられる効果に対して相乗作用の有益な効果となり得、結合組成物の投与が、毒性または容認できない副作用の恐れを減らすために単独の生物学的投与と比較して投薬の回数又は投薬量を減少させるように調整することができるという結論を裏付けている。
実施例２７：カニクイザルのＥｘ４―ＸＴＥＮ ＧＰＸＴＥＮのＰＫ解析
１分間にわたり０．５ｍｇ／ｋｇのＧＰＸＴＥＮの皮下又は静脈注入によって投与されたＧＰＸＴＥＮを有するカニクイザル（群当たり３個体）において、Ｅｘ４―ＡＥ８６４ ＧＰＸＴＥＮの薬物動態を特定した。血漿サンプルを、注射後１４日まで、さまざまな時点に集め、テストアーティクル血清濃度及び免疫原性の両方を特定するためにＥＬＩＳＡによって分析した。反テストアーティクル抗体反応は、投与後いかなる動物のＥｘ４―ＡＥ８６４にも観察されなかった。サンドイッチＥＬＩＳＡを、ポリスチレン・マイクロタイタ・プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６９０、コーニング社、コーニング、Ｎ．Ｙ．）の各ウェルに１００ｎｇの捕捉抗体（ウサギ ａｎｔｉ−ｅｘｅｎａｔｉｄｅ、ペニンシュラ研究所、サンカルロス、ＣＡ）を１２時間を超えて固定化することにより実施し、続いて３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてブロッキングした。ＰＢＳによって３回洗浄後、プラズマ・サンプルを１％のＢＳＡ及び０．５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳのプレート全体に逐次滴定した。２時間の培養及び洗浄の後、サンプルを、それぞれよくビオチン化したＩｇＧ（屋内において抗−ｅｘｅｎａｔｉｄｅでビオチン化されたウサギ 、ペニンシュラ研究所、サンカルロス、ＣＡ）の各々を追加して精査した。培養および洗浄の後、プレートをホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合型ストレプトアビジン（サーモ・フィッシャーＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォード、ＩＬ）を用い、その後、四メチル・ベンジジン基質（Ｎｅｏｇｅｎ社、レキシントン、ＫＹ）を用いた培養によって発育させた。次いで、０．２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で急冷し、４５０ｎｍで読み取った。非コンパートメント薬物動態学的パラメータを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、Ｖｉｅｗ、ＣＡ））を用いて算出した。
その結果を図１７に示す。この構築物の製剤の終末相半減期は、皮下注入から８０％バイオアベイラビリティを有し、６０時間であった。これは、エキセンジン４の商用版、Ｂｙｅｔｔａ（登録商標）について報告された半減期２．４時間に匹敵する。重要なことに、遅い吸収相（ＸＴＥＮ融合タンパク質に特徴的であると思われる）が、皮下注入の後に認められた。吸収相は、注射後の２４―４８時間と、線形除去相に達する前〜１００時間の基本的に均一な血清濃度プロフィールとの間に結果としてＣｍａｘとなった。
結論：結果から、エキセンジン４のような、グルコースを調節するペプチドにＸＴＥＮを付加することにより、ＸＴＥＮに結合していないペプチドと比較して、終末相半減期を大きく増加させることができ、他の薬物動態学的パラメータを強化することができると結論することもができる。
実施例２８：複数の種におけるＥｘ４−ＸＴＥＮ ＧＰＸＴＥＮのＰＫ解析及び予測されるヒト半減期
ＸＴＥＮに融合させた治療用タンパク質の、ヒトにおける予測される薬物動態学的プロファイルを特定するために、単一の融合ポリペプチドとしてＡＥ８６４ＸＴＥＮに融合させたエキセンジン４を用いて研究を行った。Ｅｘ４−ＸＴＥＮ構築物を、４種の異なる動物種の皮下及び静脈内に０．５−１．０ｍｇ／ｋｇで投与した。投与後、一定の間隔で血清試料を採取し、標準的な方法を用いて血清濃度を特定した。各種について半減期を特定し、表２６に示した。平均体重に対する終末相半減期、分布容積、及びクリアランス率のアロメトリック・スケーリング）を使用し、ヒトにおける半減期を予測するためにこの結果を用いた。図１８Ａは、動物種における測定した終末相半減期対体重のプロットを示す。報告されたエクセナチドの半減期が２．４時間であるのに対し（Ｂｏｎｄ， Ａ． Ｐｒｏｃ （Ｂａｙｌ Ｕｎｉｖ Ｍｅｄ Ｃｅｎｔ） １９（３）： ２８１−２８４． （２００６））、７５ｋｇのヒトにおけるＥｘ４−ＸＴＥＮ構築物の予測されるＴ１／２は１４０時間である。図１８Ｂは測定した薬剤クリアランス対体重を示し、これによって予測されるクリアランス率の値は、７５ｋｇのヒトで３０ｍｌ／時間である。図１８Ｃは、測定した分布容積対体重を示し、ここで予測される値は、７５ｋｇのヒトにおいて５９７０ｍｌである。
結論：結果から、エキセンジン４のような、グルコースを調節するペプチドにＸＴＥＮを付加することにより、ＸＴＥＮに結合していないペプチドと比較して、終末相半減期を大きく増大させることができ、匹敵する半減期を有するＧＰＸＴＥＮ製剤は、可能な限り、毎週、隔週、月間隔で投与して、グルコースを調節するペプチドの商品として現在使用されているものより、かなり投与頻度を少なくすることが可能となると結論することができる。
Figure 0005839597
実施例２９：イヌのＧｃｇ―ＸＴＥＮの薬物動態学
指定した服用量の合成グルカゴン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）、Ｇｃｇ―ＸＴＥＮ、又はプラセボをビーグル・イヌ（群あたり４個体）の皮下に注射した。動物は、投与に先行して１２時間絶食し、続いて６時間投与した。血糖を、ハンドヘルドのグルコメーター（Ｗａｌｇｒｅｅｎｓ ＴＲＵＥｒｅｓｕｌｔ（商標））を用いて投与した前後に、指定された時間、試験した。生データは、検査室（Ａｎｔｅｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で同時に測定された全ての線形範囲（４０―２５０ｍｇ／ｄＬ）にわたる参照サンプルと比較的して人間とイヌの血液の間に系統的バイアスで修正した。
注入後の血糖分析結果を、図２０に示す。データは、Ｇｃｇ―ＸＴＥＮが変更されていないグルカゴンと関連して長期間血糖を上昇させることを示す。Ｇｃｇ―ＸＴＥＮ投与後の血糖値は、投与後１０―１２時間後に基準値に戻り、カニクイザル（データ示されず）において前もって特定されたように、ＰＫ分析結果と一致している。
結論：未変性タンパク質と比較して、ＸＴＥＮのグルコースを調節するペプチド・グルカゴンへの追加は、終末相半減期を含む薬物動態学的特性を著しく改善する。さらに、選択された長さのグルカゴンを含むＧＰＸＴＥＮの設計により、夜間の血糖低下のコントロールに役立つようにする間隔で基準値に戻すことができる半減期が得られる。
実施例３０：Ｇｃｇ―ＸＴＥＮは、イヌに、インシュリンにより誘発された低血糖症に対し時間的に制御された抵抗を与える
ビーグルイヌ（群あたり４個体、総計８）は２段階の低血糖誘発モデルを受け、４日の休薬期間で分けた。各相において、注射の３時間前に動物に餌を与え、研究の残りの間は絶食させた。各段階において、群は、時間ゼロでＧｃｇ―ＸＴＥＮ又はプラセボ０．６ｎｍｏｌ／ｋｇで、皮下に注射された。第１段階において、低血糖の誘発は、０．０５Ｕ／ｋｇインシュリン（Ｎｏｖｏｌｉｎ―Ｒ、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）の投与によって、被験物質注射の６時間後に開始した。第２段階における低血糖の誘発は、被験物質注射に続いて１２時間であることを除いて、同じく開始した。血糖値を、上記のようにハンドヘルドのグルコメーターを用いて指定した時間でテストした。血液サンプルは、すべての動物において、投与前に採取し、引き続きインシュリンの誘発を１時間行った。サンプルを、ハンドヘルドのグルコメーター記録の精度を確認するために、臨床化学によって検査した。さらに、臨床化学により、すべての群において低血糖の誘発の後は、著しく高いインシュリン濃度が確認された。Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ群においてわずかにより低い（〜３０％、データは示されず）にもかかわらず、プラセボ群と関連して、群間の違いは統計的に有意でなかった。
経時的なグルコースの分析結果を、図２１に示す。データは、Ｇｃｇ―ＸＴＥＮを受けている動物が、投与後１２時間後ではなく（図２１Ｂ）、投与後６時間にインシュリンによって誘発された低血糖症に抵抗したことを示す（図２１Ａ）。仮定上のヒト タイムラインに基づき、２１：００、６時間のＧｃｇ―ＸＴＥＮ投与を想定するポスト用量は、低血糖症の保護が要求される０３：００（睡眠中）に対応し、１２時間のポスト用量は薬力学的効果が朝食を取ることができるようにするために終了しなければならなかった０９：００に対応する。
結論：グルコースを調節するペプチド・グルカゴンへのＸＴＥＮの付加、及びＸＴＥＮの長さに関してＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質の特定の設計は、１）インシュリンによって誘発された血糖低下から保護すること、２）夜間の血糖低下と一致する時間の長さであって、朝食と一致する時刻におさまること、が薬力学的効果として得られる。この薬力学的なプロファイルは、糖尿病患者の低血糖症の臨床応用のために好適である。
実施例３１：Ｇｃｇ―ＸＴＥＮ２８８は、カニクイザルにおいて絶食終了後、血糖の増加を阻害する
食欲抑制上の長命のＧｃｇ―ＸＴＥＮ＿Ｙ２８８の効果を、通常のカニクイザルにおいて試験した。動物を投与前１２時間、及び投与後６時間絶食した。時間０に、動物は、Ｇｃｇ―ＸＴＥＮ＿Ｙ２８８（構築物１）かプラセボのいずれか７ｎｍｏｌ／ｋｇのランダム化された投与量を受けた。血糖を、研究の全体にわたって指定した時間、ハンドヘルドグルコメーターによって測定した。第２段階において、同じ動物を、同じ手順に従って交互の被験物質で治療した。図２２は、個々の動物に対しプラセボ又はＧｃｇ―ＸＴＥＮ＿Ｙ２８８投与後の血糖分析結果の重ね合わせたプロット線を示す。実線の矢印は、食物が動物に戻された時間（ｔ＝６時間）をマークしている。
各動物において、プラセボを投薬した時、食物が１８時間絶食期間が続いているのを認められた直後、血糖は上方への急上昇が観察される。これは、食物が任意に認められている時に食べている動物と一致する。相対的に、同じ動物が食物のリターン前６時間にＧｃｇ―ＸＴＥＮ２８８を投薬する時に、血糖の急上昇は観察されない。この観察によれば、絶食の期間後のこれらの動物の食欲がＧｃｇ−ＸＴＥＮ２８８投与によって抑制されたことを示唆する。
実施例３２：カニクイザルにおけるグルカゴン−ＸＴＥＮ組成物のＰＫ分析
様々な長さのＸＴＥＮに結合させたグルカゴンのＧＰＸＴＥＮ組成物を、カニクイザルにおいて、薬物動態学的度合を決定するため評価した。グルカゴンに融合されるＸＴＥＮの様々な長さの３つの異なる構築物を、解離指数の度合における効果のために評価した。構築物 グルカゴン−Ｙ２８８、グルカゴンＹ−１４４、及びグルカゴン−Ｙ７２をカニクイザルに対し、０．２ｍｇ／ｋｇの用量で皮下に投与した。血清試料を投与に続く様々な時点で収集し、サンドイッチＥＬISA形式を用いて、構築物の血清中濃度のため、分析した。ウサギ 多クローン性 抗ＸＴＥＮ＿Ｙ抗体をＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁に被覆した。その後、被覆抗体により化合物を取り込ませるために、血清試料を様々な希釈でウェルにインキュベートした。ウェルを広範に洗浄し、多クローン性抗-XTEN_Y抗体及びストレプトアビジンＨＲＰのビオチン標識された調剤を用いて、結合タンパク質を検出した。血清タンパク質濃度は検量線と各血清希釈における比色分析の結果を比較することによって、各時点での血清タンパク質濃度を計算する。薬物動態的度合をWinNonLinソフトウェアパッケージを用いて、各時点で計算した。図２８はグルカゴン−ＸＴＥＮ融合タンパク質 １） グルカゴン−Ｙ２８８； ２） グルカゴンＹ−１４４；及び３） グルカゴン−Ｙ７の超過時間での血中濃度の結果を示す。グルカゴンＹ−１４４投与からの結果は、血中濃度が１０〜１２時間でＣmaxから１０倍の閾値以下に急降下する一方、０〜６時間を超えた血中濃度が三倍未満の変動であることを示し、夜間の低血糖のような状況の治療域内にＧＰＸＴＥＮを維持するための好ましいＰＫ特性を指し示す。
まとめ：より短い長さを有する構築物に比べ、伸長期間ゆえ、より長い長さのＸＴＥＮを有するグルカゴンが血中で検出可能であることを結果が指し示す。
実施例３３：ＸＴＥＮに結合させることによる、ＧＰの溶解度及び安定性の向上
ＸＴＥＮの、溶解度及び安定性の物理的／化学的特性を向上させる能力を評価するために、グルカゴンとより短い長さのＸＴＥＮを含む融合タンパク質を調製し、評価した。ｐＨが中性のトリス緩衝食塩水中に被験物質を調製し、タンパク質が溶液中において均一で、かつ、凝集していないことを確認するために、Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ溶液の特徴を逆相ＨＰＬＣ及びサイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。データを表２７に示す。比較する目的で、同じ緩衝液中に調製した、改変していないグルカゴン６０μＭ（０．２ｍｇ／ｍＬ）の溶解限度を測定した。結果は、付加した全ての長さのＸＴＥＮについて、溶解度が十分に向上したことを示す。重要なことは、大部分の例において、グルカゴン−ＸＴＥＮ融合タンパク質は目的の濃度になるように調製され、そして示した構築物の最大溶解限度を決定するために評価されたのではないということである。しかしながら、グルカゴンをＡＦ−１４４ＸＴＥＮに結合させた例においては溶解限度を決定し、その結果は、ＸＴＥＮに結合させていないグルカゴンと比較して、溶解度が６０倍に向上したというものであった。加えて、グルカゴン−ＡＦ１４４ＧＰＸＴＥＮの安定性を評価し、溶液製剤中でのグルカゴン−ＡＦ１４４ＧＰＸＴＥＮが、冷蔵条件では少なくとも６ヶ月間、３７℃ではおよそ１ヶ月間安定であることを見いだした（データは示さない）。
まとめ：このデータは、グルカゴンのような生物学的に活性なタンパク質に短い長さのＸＴＥＮポリペプチドを結合させると、融合タンパク質を生じることにより、そのタンパク質の溶解特性が向上し、並びに、より高いタンパク質濃度での安定性を付与するというまとめを支持するものである。
Figure 0005839597
実施例３４：ＧＰＸＴＥＮの二次構造の特性解析
円二色性分光法により、ＧＰＸＴＥＮＥｘ４−ＡＥ８６４の二次構造の度合いを評価した。ＣＤ分光法は、Ｊａｓｃｏ Ｐｅｌｔｉｅｒ温度コントローラー（ＴＰＣ−３４８ＷＩ）を備えたＪａｓｃｏＪ−７１５（Ｊａｓｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）円二色性分散計を用いて行った。２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌを用いて、タンパク質の濃度を０．２ｍｇ／ｍＬに調整した。ＨＥＬＬＭＡのクオーツセルを用い、光路長０．１ｃｍで実験を行った。５°、２５°、４５°、及び６５°ＣでのＣＤスペクトルを取得し、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＪ−７００ ｖｅｒｓｉｏｎ１．０８．０１（Ｂｕｉｌｄ １）Ｊａｓｃｏソフトウェアを用いて処理した。ＣＤ測定を行う前に５分間、試料を各温度で平衡化した。３００ｎｍから１８５ｎｍの範囲のスペクトルを、スキャン速度１００ｎｍ／分、バンド幅１ｎｍで２秒毎に測定し、全てのスペクトルは２回ずつ記録した。図２７に示したＣＤスペクトルは、二次構造の安定性の証拠を示さず、かつ、非構造性ポリペプチドのスペクトルと一致する。
実施例３５：グルカゴン及びＧＰＸＴＥＮ構築物の生物活性
それぞれＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質のようなＹ２８８に結合した精製グルカゴン及びエキセンジン３をインビトロ細胞アッセイを用いて生物活性のアッセイした。短時間に、ＣｈｅｍｉＳｃｒｅｅｎ安定カルシウム最適化グルカゴン受容細胞株を、グルカゴン及びグルカゴン−ＸＴＥＮ構築物の実時間カルシウム流動アッセイに使用し、一方、天然ＧＬＰ−１受容体を発現する最適化エキセンジン４受容細胞株をエキセンジン４及びＥｘ４構築物に使用した。該システムにおいて、細胞は、天然受容体を発現し、該受容体の活性化はＦＬＩＰＲ装置を使用して検出することができるカルシウム流動を細胞内で生じる。図２９に示すように、天然グルカゴンは、用量依存的様式でシグナルの増加を生じる。本システムにおける天然グルカゴンのＥＣ５０は４．１ｎＭであることが分かった。グルカゴン−Ｙ２８８構築物の滴定により、ＥＣ５０が７２ｎＭで相当する反応曲線を得た。図２９に示すように、２つの異なる市販元（Ａｎａｓｐｅｃ及びＴｏｃｒｉｓ）からの天然エキセンジン４は、ＥＣ５０（破線で示す）が各々７５ｐＭおよび１１０ｐＭで用量依存的様式で用量依存的様式にでのシグナルの増加を生じる。エキセンジン４−Ｙ５７６構築物の滴定はＥＣ５０が９８ｐＭで相当する反応曲線を得、それは、アクセサリータンパク質の融合が生物活性を保持することを指し示す。
まとめ：グルコース調節ペプチド、エキセンジン４、及びグルカゴンのＸＴＥＮへの融合が生物活性を保持する組成物を生じることを結果が指し示す。
実施例３６：エラスターゼ−２により放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
エキセンジン４のようなＧＰのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＧＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＧＰ及びＸＴＥＮ組成物の間に配置された、ＸＴＥＮの放出部位の切断配列を使用して作成することができる。例示的な配列は、表３８に提供する。この場合、放出部位は、エラスターゼ−２プロテアーゼによって認識され、切断されているアミノ酸配列を含む（ＥＣ ３．４．２１．３７，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０８２４６）。具体的には、配列ＬＧＰＶ↓ＳＧＶＰ（Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０）は、配列内でポジション４の後ろで切断され得る。エラスターゼは、構成的に好中球によって発現し、循環内で常時存在している。その活性は厳密にセルピンによって制御され、そのため、ほとんどの時間最小限に活性である。そのため、長寿命のＥｘ４−ＸＴＥＮが循環すると、その一部が切断され、グルコースの恒常性内で使用される、短寿命のエキセンジン４が生成される。本発明の組成物の所望の特徴において、これは、常時自由で完全にアクティブなエキセンジン４の総量を放出する、循環するプロドラッグデポ剤を作成する。
実施例３７：ＭＭＰ−１２により放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
アミリンのＣ末端に融合したＸＴＥＮタンパク質から成る、アミリン−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、アミリン及びＸＴＥＮ構成要素の間に配置された、ＸＴＥＮ放出部位の切断配列を用いて生成することができる。例示的な配列は、表３８に提供される。この場合、ＧＰＸＴＥＮ放出部位は、ＭＭＰ−１２プロテアーゼによって認識され、切断されているアミノ酸配列を含む（ＥＣ ３．４．２４．６５，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３９９００）。具体的には、配列ＧＰＡＧ↓ＬＧＧＡ（Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０）は、配列内でポジション４の後ろで切断され得る。ＭＭＰ−１２は、常時血液全体において発現する。そのため、長寿命のアミリン−ＸＴＥＮが循環すると、その一部が切断され、グルコースの恒常性内で使用される、短寿命のアミリンが生成される。本発明の組成物の所望の特徴において、これは、常時自由で完全にアクティブなアミリンの総量を放出する、循環するプロドラッグデポ剤を作成する。
実施例３８：ＧＰＸＴＥＮを評価するためのヒトの臨床試験の設計
単一の生物学的製剤に対して相対的なＧＰＸＴＥＮ組成物の有効性と利点をヒトにおいて評価できるように、臨床試験を設計することができる。例えば、グルカゴン及びエクセナチドの両方を含むＧＰＸＴＥＮ融合構造は、前述の実施例で記載したように、組成物の有効性を特徴づけるために臨床試験において使用することができる。試験は、グルカゴンとエクセナチドの投与により改善し、抑制される、１つまたは複数の代謝性疾患、障害、または状態で実施する。成人患者におけるそのような研究は、３つのフェーズを含む。第１は、フェーズＩの成人患者における安全性及び薬物動態試験を、ヒト（健常者又は代謝性疾患又は状態を有する患者のどちらか）における、潜在的な毒性および今後の研究で追跡される有害事象を画定するためだけではなく、最大耐量及び薬物動態と薬力学を決定するために実施する。グルカゴンと結合したＸＴＥＮの融合タンパク質構成物の単一上昇投与量において、研究を実行し、エクセナチドを投与し、生物化学、ＰＫ、及び臨床パラメータを測定する。このことにより、最大耐量を決定し、各構成要素のための治療のウィンドウを構成する投与量と循環薬剤内でのしきい値と最大濃度を確立することを可能にする。その後、臨床試験は、疾患、障害または状態を有する患者において行われるであろう。
糖尿病における臨床試験
フェーズＩＩの投薬試験は糖尿病患者で実施し、その試験では、血糖値薬力学、及び他の生理学、ＰＫ、安全性、及び、糖尿病、インスリン耐性と肥満の状況に適した臨床パラメータ（以下に挙げるような）を、グルカゴン及びエクセナチドに結合したＸＴＥＮを含む融合タンパク質の投与の関数として測定し、有害事象に関連する安全性データの収集に加えて、フェーズＩＩＩ臨床試験のための適切な用量設定情報をもたらす。ＰＫパラメータは、生理学的、臨床的および安全性パラメータ、ＧＰＸＴＥＮ組成物の各成分のための治療のウィンドウを確立するためのデータに対比され、臨床医が、それぞれが１つのグルコース調節ペプチドを含む二成分融合タンパク質のいずれかの適切な比率を確立することを可能にし、又は、２つのグルコース調節ペプチドを含む単量体ＧＰＸＴＥＮについての単一投与量を決定することを可能にする。最後に、フェーズＩＩＩ有効性試験は長期間に渡って、ＧＰＸＴＥＮ組成物、陽性対照、又は、毎日のプラセボ、隔週のプラセボ、毎週のプラセボのいずれか（又は、ＧＰＸＴＥＮ組成物の薬物動態および薬力学的特性によって与えられた適切であると考えられる他のスケジュール）を投与した糖尿病患者において実施する。二次評価項目が、プラセボまたは陽性対照群に対する相対追跡された体重、摂餌量、および他の受け入れられた糖尿病マーカーだけではなく、試験期間中のインスリン必要量、刺激されたＣペプチドとインスリン濃度、空腹時血糖値（ＦＰＧ）、血清サイトカイン濃度、ＣＲＰ値、及びインスリンとグルコースの測定値を用いてＯＧＴＴから派生したインスリン分泌及びインスリン感受性指数を含む一方、有効性の主要評価項目は、ＨｂＡｌｃ濃度を含むことができる。有効性の成果は、標準的な統計的方法を用いて決定する。毒性や有害事象のマーカーもまた、記載した方法を用いる場合、化合物が安全であることを確認するためにこの研究に従う。
実施例３９：予測アルゴリズムを用いた、配列の二次構造の解析
アミノ酸配列の二次構造は、周知のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ，Ｐ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２−４５）及びＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎ、又は「ＧＯＲ」法（Ｇａｒｎｉｅｒ Ｊ，Ｇｉｂｒａｔ ＪＦ，Ｒｏｂｓｏｎ Ｂ．（１９９６）．ＧＯＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６６：５４０−５５３）のような特定のコンピュータープログラム又はアルゴリズムを介して評価する。アルゴリズムは、指定した配列中に、例えばアルファ−ヘリックス若しくはベータシーを形成する配列残基の総数及び／又は割合として、又はランダムコイルを形成すると予測される配列残基の割合として表される、いくらかの二次構造が存在するか、又は二次構造がまったくないかどうかを予測することができる。
ＸＴＥＮ「ファミリー」に由来する複数の代表的な配列を、これら配列中の二次構造の度合いを評価するために、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及びＧＯＲ方法の２種類のアルゴリズムツールを用いて評価した。Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎツールは、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ及びバージニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ）により、インターネットサイト「Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ」において提供されたものであり、２００９年６月１９日時点でのワールドワイドウェブにおけるＵＲＬは ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ．ｃｇｉ？ｒｍ＝ｍｉｓｃ１ であった。ＧＯＲツールは、Ｐｏｌｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｑｕｅ Ｌｙｏｎｎａｉｓにより、インターネットサイト「Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」で提供されたものであり、２００８年６月１９日時点でのワールドワイドウェブでのＵＲＬは ．ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｅｃｐｒｅｄ＿ｇｏｒ４．ｐｌ であった。
解析の第一工程として、単一のＸＴＥＮ配列を２種類のアルゴリズムにより解析した。ＡＥ８６４組成物は、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、及びＡを含む、４種類の、１２アミノ酸配列モチーフの複数のコピーから作出した８６４アミノ酸残基のＸＴＥＮである。この配列モチーフは、モチーフ中の反復性が限られていること、及び１２アミノ酸モチーフのいずれにおいても、その配列全体にわたって、任意の２つの連続したアミノ酸が２回を超えて繰り返されないこと、並びに、完全長ＸＴＥＮ中の連続した３つのアミノ酸が同一ではないこと、によって特徴付けられる。ＡＦ８６４配列のＮ末端から順に、より長い長さの部分についてＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及びＧＯＲアルゴリズムによって解析した（後者は、最低１７の長さのアミノ酸を必要とする）。ＦＡＳＴＡ形式の配列を予測ツールに登録し、解析することによって、配列の解析を行った。解析の結果を表２８に示す。
結果は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎによる計算では、ＡＥファミリーの４種類のモチーフ（表４）は、アルファ−ヘリックス及びベータシートを含まないことを示す。２８８残基までの配列が同様に、アルファ−ヘリックス及びベータシートを含まないことが見いだされた。４３２残基の配列は、わずかに二次構造を有すると予測され、ここでは２アミノ酸のみがアルファ−ヘリックスを構成し、その全体における割合は０．５％である。完全長ＡＦ８６４ポリペプチドは、アルファ−ヘリックスを構成する同じ２つのアミノ酸を有し、その全体における割合は０．２％である。ランダムコイル形成についての計算により、長さが増加すると、ランダムコイル形成の割合も増加することが明らかになった。配列の最初の２４アミノ酸におけるランダムコイル形成の割合は９１％であり、これは長さの増加と共に、完全長配列の最大９９．７７％まで増加した。
その他のモチーフファミリーに由来する、５００アミノ酸又はそれより長い数多くのＸＴＥＮ配列についてもまた解析し、大部分が９５％を超えるランダムコイル形成を有することが明らかとなった。例外は、３つの連続したセリン残基を１回以上含む配列であり、これはベータシート形成を生じると予測された。しかしながら、これら配列でさえも、それでもなお、およそ９９％のランダムコイル形成を有した。
一方、アミノ酸がＡ、Ｓ、及びＰに限定された、８４残基のポリペプチド配列をＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより評価したところ、これは予測されるアルファ−ヘリックスを高い割合で含むことが予測された。「ＡＡ」及び「ＡＡＡ」配列の繰り返しを複数含む配列の、全体にわたるアルファ−ヘリックス構造の割合は６９％であると予測された。ＧＯＲアルゴリズムにより、ランダムコイル形成は７８．５７％であると予測された。これは、本実施例において解析した、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐアミノ酸を含む１２アミノ酸配列モチーフを含む、任意の配列における割合よりもずっと少ないものであった。
まとめ：この解析は、：１）連続したアミノ酸に関しては限られた反復性を有する、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、及びＡを含む複数の配列モチーフから作出したＸＴＥＮは、ごく僅かな量のアルファ−ヘリックス及びベータシートを含むと予測される；２）ＸＴＥＮの長さを長くすることによっても、アルファ−ヘリックス又はベータシート形成の確立の増加ははっきりとは認められない；及び３）Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、及びＡアミノ酸を含む非反復性の１２−ｍｅｒを付加することによりＸＴＥＮ配列の長さを徐々に長くすると、ランダムコイル形成の割合の増加が生じる、という結論を支持する。一方、高い度合いの内部反復性を有する、Ａ、Ｓ及びＰに限定したアミノ酸から作出したポリペプチドは、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムで決定したように、高い割合のアルファ−ヘリックス、並びにランダムコイル形成を有すると予測される。これら方法によって評価した多数の配列により、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、及びＡの配列モチーフから作出され、限られた反復性（いずれか１つのモチーフにおける、２つ以下の同一の連続したアミノ酸として定義される）を有し、長さが約４００アミノ酸残基より長いＸＴＥＮは、ごく限られた二次構造しかもたないと予測される。３つの連続したセリンを含むモチーフを除外すると、表４の配列モチーフの任意の順序又は組み合わせは、実質的に二次構造を含まないＸＴＥＮ配列を生じるであろう、約４００残基を超える長さのＸＴＥＮポリペプチドを作出するために用いることができると考えられる。そのような配列は、本明細書において開示した、本発明のＧＰＸＴＥＮ実施形態で記載した特徴を有すると予測される。
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597

＊Ｈ：アルファ−ヘリックスＥ：ベータシート
実施例４０：ポリペプチド配列の反復性の解析
ポリペプチド全体に見られるより短い部分列の回数を定量することにより、ポリペプチドアミノ酸配列の反復性を評価することができる。例えば、２００アミノ酸残基のポリペプチドは、オーバーラップしている１９２個の、９アミノ酸の部分列（又は９−ｍｅｒ「フレーム」）を含むが、ユニークな９−ｍｅｒ部分列の回数は、その配列中の反復性の量に依存するであろう。本解析においては、ポリマー部分の最初の２００アミノ酸配列中にあるユニークな３−ｍｅｒ部分列の絶対数で割った、その２００アミノ酸にわたって存在する、各３アミノ酸フレームについてのユニークな３−ｍｅｒ部分列の数を総和することにより、異なる配列の反復性を評価した。得られた部分列スコアは、そのポリペプチドの反復性の度合いを反映するものである。
表２９に示した結果は、２又は３アミノ酸型の非構造性ポリペプチドは高い部分列スコアを有するが、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、及びＡの１２アミノ酸モチーフからなる、内部の反復性が低い非構造性ポリペプチドは、１０未満、いくつかの例においては５未満の部分列スコアを有することを示す。例えば、２つのアミノ酸型を有し、短く、かつ反復性の高い配列を有するＬ２８８配列の部分列スコアは５０．０である。３つのアミノ酸型を有するが、短く、かつ反復性の配列を有するポリペプチドＪ２８８の部分列スコアは３３．３である。Ｙ５７６もまた３つのアミノ酸型を有するが、内部の反復性は形成されておらず、このことは、最初の２００アミノ酸にわたる部分列スコアが１５．７であることに反映される。Ｗ５７６は４つのアミノ酸型を含むが、内部反復性の度合いが高く、例えば「ＧＧＳＧ」、２３．４の部分列スコアを生じる。ＡＤ５７６は４つの型の１２アミノ酸モチーフを含み、それぞれが４つの型のアミノ酸からなる。個々のモチーフの内部反復性の度合いが低いことから、最初の２００アミノ酸全体の部分列スコアは１３．６である。一方、それぞれにおける内部反復性の度合いが低い、６型のアミノ酸を含む４種類のモチーフからなるＸＴＥＮの部分列スコアはより低く、すなわち、ＡＥ８６４（６．１）、ＡＦ８６４（７．５）、及びＡＭ８７５（４．５）である。
まとめ：結果は、それぞれが４〜６型のアミノ酸を含む、１２アミノ酸部分列モチーフの組み合わせは本質的に非反復性であり、より長いＸＴＥＮポリペプチドにしても、配列全体が非反復性となることを示す。このことは、配列全体にわたって、各部分列モチーフが複数回用いられることには関わらない。一方、実際の配列は、部分列スコアをより低くするため、反復性の度合いが低くなるように設計することができるが、より少数のアミノ酸型から作出されたポリマーの部分列スコアはより高くなる。
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
実施例４１：ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの算出
９ｍｅｒペプチド配列のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏによって記載されたように［Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １７： ５５５］、ポケットポテンシャルを加算することにより算出することができる。本実施例においては、個々のＨＬＡアレルについて、別個のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを算出した。表３０は例として、コーカサス（白人）集団では高い頻度で生じる、ＨＬＡ＊０１０１Ｂのポケットポテンシャルを示す。配列Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４−Ｐ５−Ｐ６−Ｐ７−Ｐ８−Ｐ９を含むペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを算出するために、対応する個々のポケットポテンシャルを表３０に加えた。配列ＦＤＫＬＰＲＴＳＧを有する９ｍｅｒペプチドであるＨＬＡ＊０１０１Ｂのスコアは、０、−１．３、０、０．９、０、−１．８、０．０９、０、０の総和となるだろう。
配列中にある、全ての９ｍｅｒ部分列についての処理を繰り返すことで、長いペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを評価することができる。その他のＨＬＡアレルによってコードされたタンパク質について、この処理を繰り返すことができる。表３１〜３４は、コーカサス（白人）集団では高い頻度で生じるＨＬＡアレルのタンパク質産物のポケットポテンシャルを示す。
この方法によって算出されたＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、およそ−１０から＋１０までの範囲になる。しかしながら、Ｐ１位置に疎水性アミノ酸（ＦＫＬＭＶＷＹ）をもたない９ｍｅｒペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは−１００９から−９８９の範囲になると算出された。この値は生物学的に意味をもたず、疎水性アミノ酸がＨＬＡへの結合におけるアンカー残基となることを反映するものであり、そして、Ｐ１に疎水性残基をもたないペプチドはＨＬＡに対して結合しないと考えられる。大部分のＸＴＥＮ配列は疎水性残基を有さないことから、９ｍｅｒ部分列の、全組み合わせのＴＥＰＩＴＯＰＥの範囲は、−１００９から−９８９になるであろう。この方法は、ＸＴＥＮポリペプチドがＴ細胞エピトープをほとんどもたない、又は全くもたないということを確認するものである。
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
表３３：ＨＬＡ＊０７０１Ｂアレルのポケットポテンシャル
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597

Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597
Figure 0005839597

Claims (28)

  1. 配列番号８９６または配列番号９８６と少なくとも９０％の配列同一性を示す融合タンパク質をコードする、単離した核酸であって、該核酸が、配列番号４のエキセンジン−４、配列番号６のｈＧＬＰ−１、配列番号８のヒトＧＬＰ−１、ならびに配列番号４、６、および８のいずれのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるそれらのアゴニストから選択されたグルコース調節ペプチド（ＧＰ）を含む融合タンパク質をコードし、ここで該ＧＰが、伸張組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に結合しており、該アゴニストがＧＰ活性を有する、核酸。
  2. 配列番号８９６または配列番号９８６と少なくとも９５％の配列同一性を示す融合タンパク質をコードする、請求項１に記載の単離した核酸。
  3. 配列番号８９６または配列番号９８６と１００％の配列同一性を示す融合タンパク質をコードする、請求項１に記載の単離した核酸。
  4. 前記融合タンパク質は、その必要がある対象に投与した場合に、該融合タンパク質が、前記ＸＴＥＮを持たない対応するＧＰと比較して低頻度で対象に投与された場合であっても、該ＸＴＥＮを持たない対応するＧＰと同等の治療効果を達成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離した核酸。
  5. 前記ＧＰが、配列番号４のエキセンジン−４および配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるそのアゴニストから選択され、該アゴニストがＧＰ活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離した核酸。
  6. 前記融合タンパク質が、配列番号８９６のポリペプチド配列を含む、請求項５に記載の単離した核酸。
  7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  8. 対象におけるグルコース調節ペプチドに関連する状態を治療するための組成物であって、該組成物が、治療有効量の融合タンパク質を含み、該組成物が、該対象に投与されることを特徴とし、ここで、該投与が、対象への該投与後少なくとも５０時間にわたって該対象の血漿中で検出可能なレベルの融合タンパク質をもたらし、ここで該融合タンパク質が、配列番号４のエキセンジン−４および配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるそのアゴニストから選択されたグルコース調節ペプチド（ＧＰ）を含み、ここで該ＧＰが、少なくとも２００アミノ酸残基の伸張組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に結合しており、該アゴニストがＧＰ活性を有し、ここで該ＸＴＥＮが、
    （ａ）該ＸＴＥＮ配列が、配列番号１９９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を示す、少なくとも２００の連続したアミノ酸を含み；
    （ｂ）ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによって分析した場合に、該ＸＴＥＮ配列は予測されるＴ細胞エピトープを含まず、ここで、該ＸＴＥＮ配列中にあるエピトープについての該ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムの予測は、−９又はそれを超えるスコアに基づいており；
    （ｃ）１０未満の部分列スコアを有し；及び
    （ｄ）グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の総和が、該ＸＴＥＮの全アミノ酸残基の少なくとも９０％を構成する、
    ことを特徴とする、
    組成物。
  9. 前記投与が、前記対象への該投与の１００時間後に該対象の血漿中に検出可能なレベルの融合タンパク質をもたらす、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記投与が、前記対象への該投与の１５０時間後に該対象の血漿中に検出可能なレベルの融合タンパク質をもたらす、請求項８に記載の組成物。
  11. 前記投与が、前記対象への該投与の２００時間後に該対象の血漿中に検出可能なレベルの融合タンパク質をもたらす、請求項８に記載の組成物。
  12. 前記投与が、前記対象への該投与の２５０時間後に該対象の血漿中に検出可能なレベルの融合タンパク質をもたらす、請求項８に記載の組成物。
  13. 前記投与が、前記対象への該投与の３００時間後に該対象の血漿中に検出可能なレベルの融合タンパク質をもたらす、請求項８に記載の組成物。
  14. 前記融合タンパク質が、前記対象への前記組成物の投与後に少なくとも１３９時間の該対象における終末相半減期を有する、請求項８に記載の組成物。
  15. 前記融合タンパク質は、前記組成物が、前記ＸＴＥＮを持たない対応するＧＰと比較して低頻度で対象に投与された場合であっても、前記ＸＴＥＮを持たない対応するＧＰと同等の治療効果を達成する、請求項８に記載の組成物。
  16. 前記融合タンパク質は、前記組成物が、高血糖ｏｂ／ｏｂマウスに２日毎に１０ｍｇ／ｋｇで投与され、そして前記ＸＴＥＮを持たない対応するＧＰが１０ｍｇ／ｋｇで一日２回投与された場合に、該ＸＴＥＮを持たない対応するＧＰと比較して同等のレベルの治療効果を示し、そして該治療効果が、該対象の体重の実質的増加がないことによって証明される、請求項８に記載の組成物。
  17. 治療有効量の融合タンパク質を含む医薬組成物であって、該融合タンパク質は、配列番号４のエキセンジン−４および配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるそのアゴニストから選択されたグルコース調節ペプチド（ＧＰ）および伸張組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含み、ここで該アゴニストがＧＰ活性を有し、該医薬組成物は、該ＸＴＥＮを持たない対応するＧＰと比較して免疫原性がより低く、該ＸＴＥＮ配列が、配列番号１９９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を示す、少なくとも２００の連続したアミノ酸を含み、免疫原性は、対象へ同等の用量の投与の際に、生物学的に活性なタンパク質に選択的に結合するＩｇＧ抗体の産生を測定することにより確認される、医薬組成物。
  18. 前記融合タンパク質は、配列番号８９７と、少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記治療有効量が、投与された融合タンパク質とＸＴＥＮをもたない対応するＧＰが同等の用量である場合に、該ＸＴＥＮをもたない対応するＧＰと比較して、少なくとも３倍長い融合タンパク質の治療ウィンドウをもたらす、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記グルコース調節ペプチドに関連する状態が、若年性糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満、急性低血糖、急性高血糖、夜間の低血糖、慢性高血糖、グルカゴン産生腫瘍、気道の分泌性疾患、関節炎、骨粗鬆症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、うっ血性心不全、ネフローゼ症候群、硬変、肺水腫、高血圧、脳卒中、過敏性腸症候群、心筋梗塞、急性冠症候群、術後の異化の変化、冬眠心筋、糖尿病性心筋症、尿のナトリウム排泄が不十分であること、尿のカリウム濃度の過剰、多嚢胞性卵巣症候群、呼吸促迫、腎症、左心室収縮不全、下痢、術後のダンピング症候群、重症疾患多発ニューロパチー（ＣＩＰＮ）、脂質代謝異常、虚血後の血流の再灌流から生じる器官組織損傷、及び冠動脈性心疾患危険因子（ＣＨＤＲＦ）症候群から選択される請求項８〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 配列番号４のエキセンジン−４、配列番号６のｈＧＬＰ−１、配列番号８のヒトＧＬＰ−１、ならびに配列番号４、６、および８のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるそれらのアゴニストから選択されたグルコース調節ペプチド（ＧＰ）を含む融合タンパク質の生産方法であって、ここで該ＧＰが、１つ以上の伸張組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に結合しており、該アゴニストがＧＰ活性を有し、該方法は、
    （ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞を準備すること；
    （ｂ）該融合タンパク質が発現できる条件下において該宿主細胞を培養すること；及び
    （ｃ）該融合タンパク質を回収することを含む、生産方法。
  22. 前記ＧＰが、配列番号４のエキセンジン−４および配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるそのアゴニストから選択され、該アゴニストがＧＰ活性を有する、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記宿主細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記宿主細胞の細胞質から、前記融合タンパク質を実質的に可溶性の形態で回収する、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記融合タンパク質が、マウスに投与した場合に少なくとも１３時間の、ラットに投与した場合に少なくとも３１時間の、サルに投与した場合に少なくとも６０時間の、またはイヌに投与した場合に少なくとも７２時間の、終末相半減期を有する、請求項５に記載の単離した核酸。
  26. 請求項１〜６および２５のいずれか１項に記載の核酸を含む単離した宿主細胞であって、該宿主細胞が、原核宿主細胞または真核宿主細胞である、単離した宿主細胞。
  27. 前記宿主細胞が大腸菌またはピチア・パストリスである、請求項２６に記載の単離した宿主細胞。
  28. 前記ＧＰが、エキセンジン−４（配列番号４）である、請求項８に記載の組成物。
JP2012515082A 2009-06-08 2010-06-08 グルコース調節ポリペプチド並びにその作成及び使用方法 Active JP5839597B2 (ja)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26819309P 2009-06-08 2009-06-08
US61/268,193 2009-06-08
US23683609P 2009-08-25 2009-08-25
US61/236,836 2009-08-25
US28095509P 2009-11-10 2009-11-10
US61/280,955 2009-11-10
US12/699,761 2010-02-03
US12/699,761 US8673860B2 (en) 2009-02-03 2010-02-03 Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
PCT/US2010/023106 WO2010091122A1 (en) 2009-02-03 2010-02-03 Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
USPCT/US2010/023106 2010-02-03
PCT/US2010/037855 WO2010144508A1 (en) 2009-06-08 2010-06-08 Glucose-regulating polypeptides and methods of making and using same

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2012529297A JP2012529297A (ja) 2012-11-22
JP2012529297A5 JP2012529297A5 (ja) 2013-07-04
JP5839597B2 true JP5839597B2 (ja) 2016-01-06

Family

ID=43309202

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012515082A Active JP5839597B2 (ja) 2009-06-08 2010-06-08 グルコース調節ポリペプチド並びにその作成及び使用方法

Country Status (12)

Country Link
US (3) US8957021B2 (ja)
EP (1) EP2440228B8 (ja)
JP (1) JP5839597B2 (ja)
CN (1) CN102481331B (ja)
AU (1) AU2010258898B8 (ja)
CA (1) CA2764108A1 (ja)
DK (1) DK2440228T3 (ja)
ES (1) ES2705249T3 (ja)
NZ (1) NZ596778A (ja)
PT (1) PT2440228T (ja)
WO (1) WO2010144508A1 (ja)
ZA (1) ZA201200122B (ja)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
EP2120994B1 (en) 2007-01-08 2014-06-11 The Trustees of the University of Pennsylvania Methods and compositions for treating hypoglycemic disorders
CN102348715B (zh) * 2009-02-03 2017-12-08 阿穆尼克斯运营公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
US8703717B2 (en) 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
US9849188B2 (en) 2009-06-08 2017-12-26 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
WO2010144508A1 (en) 2009-06-08 2010-12-16 Amunix Operating Inc. Glucose-regulating polypeptides and methods of making and using same
AU2010290077C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same
US8557961B2 (en) * 2010-04-02 2013-10-15 Amunix Operating Inc. Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same
US20130017997A1 (en) * 2010-08-19 2013-01-17 Amunix Operating Inc. Factor VIII Compositions and Methods of Making and Using Same
US9486507B2 (en) 2011-06-10 2016-11-08 Biogen Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
MX349950B (es) * 2011-08-12 2017-08-22 Ascendis Pharma As Profarmacos de treprostinil enlazados a un portador.
WO2013024049A1 (en) * 2011-08-12 2013-02-21 Ascendis Pharma A/S Protein carrier-linked prodrugs
US9006176B2 (en) 2011-10-18 2015-04-14 AmideBio LLC Chemically and thermodynamically stable insulin analogues and improved methods for their production
BR112014017165B1 (pt) 2012-01-12 2023-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc Proteína quimérica compreendendo uma proteína de fator viii, composição farmacêutica, e seus usos
CA2875983A1 (en) * 2012-02-08 2013-08-15 Seneb Biosciences, Inc. Treatment of hypoglycemia
WO2013122617A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Amunix Operating Inc. Factor viii compositions and methods of making and using same
CA2864126A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Biogen Idec Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
MX366864B (es) 2012-02-27 2019-07-26 Amunix Operating Inc Composiciones de conjugados de xten y métodos para realizarlas.
JP5967631B2 (ja) 2012-04-27 2016-08-10 学校法人日本大学 上皮及び内皮損傷の治療剤
JP2015521589A (ja) 2012-06-08 2015-07-30 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． プロコアグラント化合物
CA2875247A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Chimeric clotting factors
EP4269431A1 (en) 2012-07-11 2023-11-01 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof
PL3889173T3 (pl) 2013-02-15 2023-12-11 Bioverativ Therapeutics Inc. Zoptymalizowany gen czynnika viii
CA2899089C (en) 2013-03-15 2021-10-26 Biogen Ma Inc. Factor ix polypeptide formulations
US9163073B2 (en) 2013-04-17 2015-10-20 Amidebio, Llc Chemically and thermodynamically stable insulin analogues and improved methods for their production
WO2015021423A2 (en) 2013-08-08 2015-02-12 Biogen Idec Ma Inc. Purification of chimeric fviii molecules
EP3033098B1 (en) 2013-08-14 2022-06-22 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
US10548953B2 (en) 2013-08-14 2020-02-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
BR112016015512B1 (pt) 2014-01-10 2023-12-19 Bioverativ Therapeutics Inc Proteína quimérica, composição farmacêutica e seus usos
US10072060B2 (en) * 2014-05-02 2018-09-11 The Research Foundation For The State University Of New York Islet amyloid polypeptides with improved solubility
EP3160478A4 (en) 2014-06-30 2018-05-16 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor ix gene
DE102014112212A1 (de) * 2014-08-26 2016-03-03 Akesion Gmbh Rekombinante Fusionsproteine zur Vorbeugung oder Behandlung von Adhäsionen bei Geweben oder Organen
CA2962486A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Stabilized adrenomedullin derivatives and use thereof
JP6625627B2 (ja) 2014-10-14 2019-12-25 ハロザイム インコーポレイテッド アデノシンデアミナーゼ−２（ａｄａ２）、その変異体の組成物およびそれを使用する方法
MA40835A (fr) 2014-10-23 2017-08-29 Biogen Ma Inc Anticorps anti-gpiib/iiia et leurs utilisations
MA40861A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Anticorps anti-glycoprotéines iib/iiia
EP3936143A1 (en) 2015-05-22 2022-01-12 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Treatment of post-bariatric hypoglycemia with exendin (9-39)
CN108472337B (zh) 2015-08-03 2022-11-25 比奥贝拉蒂治疗公司 因子ix融合蛋白以及其制备和使用方法
IL307276A (en) 2015-08-28 2023-11-01 Amunix Operating Inc Chimeric polypeptide composition and methods for its preparation and use
CN105524147B (zh) * 2015-10-15 2020-06-09 中国药科大学 重组聚多肽及其应用
US20190382439A1 (en) * 2015-11-16 2019-12-19 Ubiprotein, Corp. Method for extending half-life of a protein
AU2016379403B2 (en) 2015-12-23 2020-03-12 The Johns Hopkins University Long-acting GLP-1r agonist as a therapy of neurological and neurodegenerative conditions
CN113456820B (zh) * 2015-12-29 2023-09-08 派格生物医药(苏州)股份有限公司 包含glp-1受体激动剂和胰高血糖素受体激动剂的组合物及其用途
SG10201913278PA (en) 2016-02-01 2020-02-27 Bioverativ Therapeutics Inc Optimized factor viii genes
WO2017152014A1 (en) * 2016-03-04 2017-09-08 Eiger Biopharmaceuticals, Inc. Treatment of hyperinsulinemic hypoglycemia with exendin-4 derivatives
TW201741333A (zh) * 2016-05-24 2017-12-01 諾佛 儂迪克股份有限公司 Ｍｉｃ－１化合物及其用途
US10738338B2 (en) 2016-10-18 2020-08-11 The Research Foundation for the State University Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate
US11020484B2 (en) 2016-11-21 2021-06-01 Eiger Biopharmaceuticals, Inc. Buffered formulations of exendin (9-39)
BR112019011115A2 (pt) 2016-12-02 2019-10-01 Bioverativ Therapeutics Inc métodos para tratar artropatia hemofílica usando fatores de coagulação quiméricos
KR20190091292A (ko) 2016-12-02 2019-08-05 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 응고 인자에 대한 면역 내성 유도 방법
EP3576762A1 (en) 2017-01-31 2019-12-11 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
US11028137B2 (en) * 2017-02-01 2021-06-08 The Research Foundation For The State University Of New York Mutant islet amyloid polypeptides with improved solubility and methods for using the same
US10540366B2 (en) 2017-03-09 2020-01-21 Bank Of America Corporation Transforming data structures and data objects for migrating data between databases having different schemas
EP3665289A1 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof
MX2020008152A (es) 2018-02-01 2020-11-24 Bioverativ Therapeutics Inc Uso de vectores lentivirales que expresan el factor viii.
PE20210313A1 (es) 2018-03-28 2021-02-12 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de fusion interleucina-2/receptor alfa de interleucina-2 y metodos de uso
JP2021522231A (ja) * 2018-04-25 2021-08-30 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． チオエーテル環状ペプチドアミリン受容体調節因子
EP3793588A1 (en) 2018-05-18 2021-03-24 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilia a
SG11202013240RA (en) 2018-07-03 2021-01-28 Bristol Myers Squibb Co Fgf21 formulations
CA3108799A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
BR112021008105A2 (pt) 2018-10-29 2021-08-03 Biogen Ma Inc. variantes de fc5 humanizadas e estabilizadas para intensificação de transporte através de barreira hematoencefálica
AU2019393880A1 (en) 2018-12-06 2021-07-15 Bioverativ Therapeutics Inc. Use of lentiviral vectors expressing factor IX
EP3986918A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 Bayer Aktiengesellschaft Adrenomedullin-analogues for long-term stabilization and their use
EP4038182A1 (en) 2019-09-30 2022-08-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Lentiviral vector formulations
EP4058466A1 (en) 2019-11-13 2022-09-21 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Barcoded xten polypeptides and compositions thereof, and methods for making and using the same
MX2023000156A (es) 2020-06-24 2023-02-16 Bioverativ Therapeutics Inc Metodos para la eliminacion de factor viii libre de preparaciones de vectores lentivirales modificados para expresar dicha proteina.
KR20230083294A (ko) 2020-09-30 2023-06-09 베이징 큐엘 바이오파마슈티컬 컴퍼니 리미티드 폴리펩타이드 접합체 및 사용 방법
AU2022332276A1 (en) 2021-08-23 2024-04-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor viii genes
CA3229668A1 (en) 2021-08-23 2023-03-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Baculovirus expression system
TW202346327A (zh) 2021-09-30 2023-12-01 美商百歐維拉提夫治療公司 編碼具有降低免疫原性的因子ｖｉｉｉ多肽之核酸

Family Cites Families (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3992518A (en) 1974-10-24 1976-11-16 G. D. Searle & Co. Method for making a microsealed delivery device
GB1478759A (en) 1974-11-18 1977-07-06 Alza Corp Process for forming outlet passageways in pills using a laser
US4284444A (en) 1977-08-01 1981-08-18 Herculite Protective Fabrics Corporation Activated polymer materials and process for making same
US4200098A (en) 1978-10-23 1980-04-29 Alza Corporation Osmotic system with distribution zone for dispensing beneficial agent
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
US4398908A (en) 1980-11-28 1983-08-16 Siposs George G Insulin delivery system
US4435173A (en) 1982-03-05 1984-03-06 Delta Medical Industries Variable rate syringe pump for insulin delivery
US4943529A (en) 1982-05-19 1990-07-24 Gist-Brocades Nv Kluyveromyces as a host strain
AU3145184A (en) 1983-08-16 1985-02-21 Zymogenetics Inc. High expression of foreign genes in schizosaccharomyces pombe
US5231112A (en) 1984-04-12 1993-07-27 The Liposome Company, Inc. Compositions containing tris salt of cholesterol hemisuccinate and antifungal
US5916588A (en) 1984-04-12 1999-06-29 The Liposome Company, Inc. Peptide-containing liposomes, immunogenic liposomes and methods of preparation and use
DE3581188D1 (de) 1984-07-24 1991-02-07 Key Pharma Klebende schicht zur transdermalen freigabe.
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
DK27885A (da) 1985-01-22 1986-07-23 Novo Industri As Fremstilling af peptider
US4684479A (en) 1985-08-14 1987-08-04 Arrigo Joseph S D Surfactant mixtures, stable gas-in-liquid emulsions, and methods for the production of such emulsions from said mixtures
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US5118666A (en) 1986-05-05 1992-06-02 The General Hospital Corporation Insulinotropic hormone
US6759057B1 (en) 1986-06-12 2004-07-06 The Liposome Company, Inc. Methods and compositions using liposome-encapsulated non-steroidal anti-inflammatory drugs
IE60901B1 (en) 1986-08-21 1994-08-24 Vestar Inc Improved treatment of systemic fungal infections with phospholipid particles encapsulating polyene antifungal antibiotics
US4933185A (en) 1986-09-24 1990-06-12 Massachusetts Institute Of Technology System for controlled release of biologically active compounds
US6406713B1 (en) 1987-03-05 2002-06-18 The Liposome Company, Inc. Methods of preparing low-toxicity drug-lipid complexes
US4976696A (en) 1987-08-10 1990-12-11 Becton, Dickinson And Company Syringe pump and the like for delivering medication
US4861800A (en) 1987-08-18 1989-08-29 Buyske Donald A Method for administering the drug deprenyl so as to minimize the danger of side effects
AU598958B2 (en) 1987-11-12 1990-07-05 Vestar, Inc. Improved amphotericin b liposome preparation
US5270176A (en) 1987-11-20 1993-12-14 Hoechst Aktiengesellschaft Method for the selective cleavage of fusion proteins with lysostaphin
GB8807504D0 (en) 1988-03-29 1988-05-05 Sandoz Ltd Improvements in/relating to organic compounds
JP2717808B2 (ja) 1988-08-10 1998-02-25 テルモ株式会社 シリンジポンプ
US5534617A (en) 1988-10-28 1996-07-09 Genentech, Inc. Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1
DE394538T1 (de) 1989-04-28 1991-04-11 Rhein Biotech Ges. Fuer Biotechnologische Prozesse Und Produkte Mbh, 4000 Duesseldorf, De Hefezellen der schwanniomyces-gattung.
US5017378A (en) 1989-05-01 1991-05-21 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Intraorgan injection of biologically active compounds contained in slow-release microcapsules or microspheres
US5599907A (en) 1989-05-10 1997-02-04 Somatogen, Inc. Production and use of multimeric hemoglobins
US5298022A (en) 1989-05-29 1994-03-29 Amplifon Spa Wearable artificial pancreas
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
FR2649120B1 (fr) 1989-06-30 1994-01-28 Cayla Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede
US5318540A (en) 1990-04-02 1994-06-07 Pharmetrix Corporation Controlled release infusion device
US5492534A (en) 1990-04-02 1996-02-20 Pharmetrix Corporation Controlled release portable pump
US5176502A (en) 1990-04-25 1993-01-05 Becton, Dickinson And Company Syringe pump and the like for delivering medication
US5215680A (en) 1990-07-10 1993-06-01 Cavitation-Control Technology, Inc. Method for the production of medical-grade lipid-coated microbubbles, paramagnetic labeling of such microbubbles and therapeutic uses of microbubbles
US5234906A (en) 1991-01-10 1993-08-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hyperglycemic compositions
US5206161A (en) 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
HU222249B1 (hu) 1991-03-08 2003-05-28 Amylin Pharmaceuticals Inc. Eljárás amilin agonista peptidszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
US5573776A (en) 1992-12-02 1996-11-12 Alza Corporation Oral osmotic device with hydrogel driving member
US5554730A (en) 1993-03-09 1996-09-10 Middlesex Sciences, Inc. Method and kit for making a polysaccharide-protein conjugate
US5424286A (en) 1993-05-24 1995-06-13 Eng; John Exendin-3 and exendin-4 polypeptides, and pharmaceutical compositions comprising same
US5660848A (en) 1994-11-02 1997-08-26 The Population Council, Center For Biomedical Research Subdermally implantable device
US7846455B2 (en) 1996-07-15 2010-12-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Attenuated chimeric respiratory syncytial virus
US6441025B2 (en) 1996-03-12 2002-08-27 Pg-Txl Company, L.P. Water soluble paclitaxel derivatives
AU735900B2 (en) 1996-03-12 2001-07-19 Pg-Txl Company, L.P. Water soluble paclitaxel prodrugs
DE69725747T2 (de) 1996-08-23 2004-07-29 Sequus Pharmaceuticals, Inc., Menlo Park Liposome enthaltend cisplatin
JP2001503396A (ja) 1996-10-11 2001-03-13 アルザ コーポレイション 治療用リポソーム組成物および方法
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
SK283760B6 (sk) 1996-10-15 2004-01-08 The Liposome Company, Inc. Farmaceutický prostriedok na dopravu bioaktívnych látok
AU721653B2 (en) 1996-10-25 2000-07-13 Supernus Pharmaceuticals, Inc. Soluble form osmotic dose delivery system
US6361796B1 (en) 1996-10-25 2002-03-26 Shire Laboratories, Inc. Soluble form osmotic dose delivery system
US6294170B1 (en) 1997-08-08 2001-09-25 Amgen Inc. Composition and method for treating inflammatory diseases
AT405516B (de) 1997-02-27 1999-09-27 Immuno Ag Faktor x-analoge mit modifizierter proteasespaltstelle
EP0983303B1 (en) 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
DE19747261A1 (de) 1997-10-25 1999-04-29 Bayer Ag Osmotisches Arzneimittelfreisetzungssystem
DE69838526T2 (de) 1998-02-05 2008-07-03 Biosense Webster, Inc., Diamond Bar Gerät zum Freisetzen eines Medikaments im Herzen
US6406632B1 (en) 1998-04-03 2002-06-18 Symyx Technologies, Inc. Rapid characterization of polymers
US7090976B2 (en) 1999-11-10 2006-08-15 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising Renilla GFP
GB9815157D0 (en) 1998-07-13 1998-09-09 Metron Designs Ltd High resolution pulse width setting from relatively low frequency clocks
US20030190740A1 (en) 1998-10-13 2003-10-09 The University Of Georgia Research Foundation, Inc Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use
US6713086B2 (en) 1998-12-18 2004-03-30 Abbott Laboratories Controlled release formulation of divalproex sodium
CN1736502A (zh) 1999-03-03 2006-02-22 奥普蒂诺斯公司 鼻传送装置
US6183770B1 (en) 1999-04-15 2001-02-06 Acutek International Carrier patch for the delivery of agents to the skin
US7666400B2 (en) 2005-04-06 2010-02-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. PEGylation by the dock and lock (DNL) technique
US6743211B1 (en) 1999-11-23 2004-06-01 Georgia Tech Research Corporation Devices and methods for enhanced microneedle penetration of biological barriers
US20030109428A1 (en) 1999-12-01 2003-06-12 John Bertin Novel molecules of the card-related protein family and uses thereof
US20050287153A1 (en) 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US6352721B1 (en) 2000-01-14 2002-03-05 Osmotica Corp. Combined diffusion/osmotic pumping drug delivery system
CA2405912A1 (en) 2000-04-12 2001-10-18 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20030228309A1 (en) 2000-11-08 2003-12-11 Theodora Salcedo Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US20030049689A1 (en) 2000-12-14 2003-03-13 Cynthia Edwards Multifunctional polypeptides
IN190699B (ja) 2001-02-02 2003-08-16 Sun Pharmaceutical Ind Ltd
US20020169125A1 (en) 2001-03-21 2002-11-14 Cell Therapeutics, Inc. Recombinant production of polyanionic polymers and uses thereof
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
EP1397160A1 (en) 2001-04-30 2004-03-17 Shire Laboratories Inc. Pharmaceutical composition including ace/nep inhibitors and bioavailability enhancers
US6838093B2 (en) 2001-06-01 2005-01-04 Shire Laboratories, Inc. System for osmotic delivery of pharmaceutically active agents
KR100407467B1 (ko) 2001-07-12 2003-11-28 최수봉 리모컨 방식의 인슐린 자동주사기
WO2003011213A2 (en) 2001-07-30 2003-02-13 Eli Lilly And Company Method for treating diabetes and obesity
US7125843B2 (en) 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
US20080167238A1 (en) 2001-12-21 2008-07-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
US6945952B2 (en) 2002-06-25 2005-09-20 Theraject, Inc. Solid solution perforator for drug delivery and other applications
US7294513B2 (en) 2002-07-24 2007-11-13 Wyatt Technology Corporation Method and apparatus for characterizing solutions of small particles
US20070161087A1 (en) 2003-05-29 2007-07-12 Wolfgang Glaesner Glp-1 fusion proteins
EP1636360A4 (en) 2003-06-03 2006-11-08 Cell Genesys Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCED EXPRESSION OF RECOMBINANT POLYPEPTIDES FROM A SINGLE VECTOR USING A PEPTIDE CLEAVAGE SITE
US20050152979A1 (en) 2003-09-05 2005-07-14 Cell Therapeutics, Inc. Hydrophobic drug compositions containing reconstitution enhancer
CA2539253A1 (en) 2003-09-19 2005-03-31 Novo Nordisk A/S Albumin-binding derivatives of therapeutic peptides
US20050123997A1 (en) 2003-10-30 2005-06-09 Lollar John S. Modified fVIII having reduced immunogenicity through mutagenesis of A2 and C2 epitopes
US20050143303A1 (en) 2003-12-26 2005-06-30 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Intranasal administration of glucose-regulating peptides
US20060026719A1 (en) 2004-01-14 2006-02-02 Kieliszewski Marcia J Methods of producing peptides/proteins in plants and peptides/proteins produced thereby
AU2005211725B2 (en) 2004-02-09 2010-07-15 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US8076288B2 (en) * 2004-02-11 2011-12-13 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides having glucose lowering activity
CA2891010C (en) 2004-07-23 2022-09-20 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
DK1797127T3 (en) 2004-09-24 2017-10-02 Amgen Inc Modified Fc molecules
AU2006208199B2 (en) 2005-01-25 2012-06-07 Cell Therapeutics, Inc. Conjugates of biologically active proteins having a modified in vivo half-life
US8263545B2 (en) 2005-02-11 2012-09-11 Amylin Pharmaceuticals, Inc. GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
US7846445B2 (en) 2005-09-27 2010-12-07 Amunix Operating, Inc. Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof
AU2006294644A1 (en) * 2005-09-27 2007-04-05 Amunix, Inc. Proteinaceous pharmaceuticals and uses thereof
ES2779992T3 (es) 2005-12-20 2020-08-21 Univ Duke Métodos y composiciones para suministrar agentes activos con propiedades farmacológicas potenciadas
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
AU2007223888A1 (en) * 2006-03-06 2007-09-13 Amunix, Inc. Genetic packages and uses thereof
EP2010222A1 (en) 2006-03-31 2009-01-07 Baxter International Inc. Pegylated factor viii
EP1867660A1 (en) 2006-06-14 2007-12-19 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
CA2658654A1 (en) * 2006-07-24 2008-01-31 Biorexis Pharmaceutical Corporation Exendin fusion proteins
WO2008049711A1 (en) 2006-10-27 2008-05-02 Novo Nordisk A/S Peptide extended insulins
EP2097096B1 (en) 2006-12-22 2017-05-31 CSL Behring GmbH Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
JP5702066B2 (ja) 2006-12-27 2015-04-15 ネクター セラピューティクス 解離可能な連結を有するフォンウィルブランド因子および第ｖｉｉｉ因子のポリマー共役体
KR101631323B1 (ko) 2007-06-21 2016-06-17 엑스엘-프로테인 게엠베하 증가된 생체내 및/또는 시험관내 안정성을 갖는 생물학적 활성 단백질
EP2185701A4 (en) 2007-08-15 2011-03-02 Amunix Operating Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCING THE PRODUCTION OF RECOMBINANT POLYPEPTIDES
JP2011526303A (ja) 2008-06-27 2011-10-06 デューク ユニバーシティ エラスチン様ペプチドを含む治療剤
CN102348715B (zh) * 2009-02-03 2017-12-08 阿穆尼克斯运营公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
NZ596787A (en) 2009-06-08 2014-03-28 Amunix Operating Inc Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
WO2010144508A1 (en) 2009-06-08 2010-12-16 Amunix Operating Inc. Glucose-regulating polypeptides and methods of making and using same
AU2010290077C1 (en) * 2009-08-24 2015-12-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same
US20110312881A1 (en) * 2009-12-21 2011-12-22 Amunix, Inc. Bifunctional polypeptide compositions and methods for treatment of metabolic and cardiovascular diseases
EP2552967A4 (en) * 2010-04-02 2014-10-08 Amunix Operating Inc BINDING FUSION PROTEINS, BINDING FUSION PROTEIN MEDICINAL CONJUGATES, XTEN MEDICAMENT CONJUGATES, AND METHOD FOR THEIR PREPARATION AND USE
US8557961B2 (en) * 2010-04-02 2013-10-15 Amunix Operating Inc. Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same

Also Published As

Publication number Publication date
US20150274800A1 (en) 2015-10-01
US20100323956A1 (en) 2010-12-23
AU2010258898B2 (en) 2015-01-29
US9540430B2 (en) 2017-01-10
US8957021B2 (en) 2015-02-17
NZ596778A (en) 2013-11-29
CN102481331A (zh) 2012-05-30
EP2440228A1 (en) 2012-04-18
ZA201200122B (en) 2013-03-27
EP2440228B8 (en) 2023-02-22
ES2705249T3 (es) 2019-03-22
US10000543B2 (en) 2018-06-19
DK2440228T3 (en) 2018-12-17
JP2012529297A (ja) 2012-11-22
WO2010144508A1 (en) 2010-12-16
EP2440228A4 (en) 2013-06-26
US20170158748A1 (en) 2017-06-08
AU2010258898B8 (en) 2015-02-05
EP2440228B1 (en) 2018-09-26
CA2764108A1 (en) 2010-12-16
AU2010258898A1 (en) 2011-12-22
PT2440228T (pt) 2018-12-24
CN102481331B (zh) 2017-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5839597B2 (ja) グルコース調節ポリペプチド並びにその作成及び使用方法
JP6543668B2 (ja) 成長ホルモンポリペプチド並びにその作成及び使用方法
JP6348946B2 (ja) 延長組換えポリペプチドおよび延長組換えポリペプチドを含む組成物
US9168312B2 (en) Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
WO2011028344A2 (en) Interleukin-1 receptor antagonist compositions and methods of making and using same
US9849188B2 (en) Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
AU2017200870B2 (en) Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
AU2015200260A1 (en) Glucose-regulating polypeptides and methods of making and using same

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20121030

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20121030

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130516

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20130516

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20140919

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20141219

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20150116

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150129

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20150324

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150616

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20151104

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20151106

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5839597

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250