KR20230083294A - 폴리펩타이드 접합체 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

GLP-1 수용체 작용제 및 펩타이드 링커를 포함하는 폴리펩타이드 접합체, 및 이를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 질환을 치료하기 위해 이를 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

폴리펩타이드 접합체 및 사용 방법
본 발명은 폴리펩타이드 접합체, 이의 약학 조성물, 및 이를 사용하여 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1)의 주요 생물학적 활성 단편은 프로글루카곤 펩타이드의 번역후 가공으로부터 유래된 30개 또는 31개의 아미노산 펩타이드 단편(GLP-1의 아미노산 7-36 또는 7-37)이다. 초기 GLP-1 제품 GLP-1은 인슐린 합성 및 분비를 자극하고 당뇨병, 특히 2형 당뇨병에서 고혈당을 예방하는 것으로 나타났다. 그러나, 내인성 GLP-1은 단지 대략 2분의 반감기를 가지며, 이는 단지 0-15 pmol/L의 GLP-1의 공복 혈장 수준을 초래한다.
대사 장애는 일반적으로 인슐린 저항성, 내장 지방, 동맥경화성 이상지질혈증 등과 관련이 있으며, 이는 전 세계적으로 주요하고 증가하는 공중 보건 및 임상 문제를 제기한다. 그러나, 대사 질환에 대한 기존의 치료는 짧은 반감기 및/또는 낮은 효능과 같은 문제에 직면한다.
또한, 기존의 GLP-1 화합물은 주로 주사에 의해 투여되며, 투여 빈도가 너무 잦으면, 환자들은 스스로 주사하는 것에 대한 두려움을 가질 수 있다.
따라서, 대사 질환을 치료하고, 또한 투여 빈도를 감소시키기 위해 개선된 치료 해법이 요구된다.
폴리펩타이드 접합체, 및 이를 포함하는 약학 조성물 및 대사 장애를 치료/예방하기 위한 사용 방법이 본원에 제공된다.
제1 양태에서, 본 개시내용은 펩타이드 링커의 N-말단에 부착된 단일 생물학적 활성 펩타이드, 및 펩타이드 링커 내의 제1 클리어런스-감소 모이어티(clearance-reducing moiety: CRM) 잔기에 접합된 제1 CRM을 포함하는 폴리펩타이드 접합체로서, 생물학적 활성 펩타이드는 GLP-1 수용체 작용제를 포함하고, 제1 CRM 잔기는 GLP-1 수용체 작용제의 C-말단 아미노산 잔기로부터 적어도 5개의 아미노산 잔기(CRM 잔기 제외) 떨어져 있는 폴리펩타이드 접합체를 제공한다.
일부 구현예에서, 제1 CRM 잔기는 생물학적 활성 펩타이드의 C-말단 아미노산으로부터 적어도 10, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 35, 38, 40, 45, 46, 50, 55, 58, 60, 65, 70, 75, 78개의 아미노산 잔기(CRM 잔기 제외) 떨어져 있다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체 내의 GLP-1 수용체 작용제는 70, 60, 또는 50개 이하의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체 내의 GLP-1 수용체 작용제는 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 또는 30개 이하의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, GLP-1 수용체 작용제는 GLP-1을 포함한다.
일부 구현예에서, 생물학적 활성 펩타이드는 접합된 CRM을 갖지 않는다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체는 단일접합되고, 펩타이드 링커에 접합되지만 생물학적 활성 펩타이드(예컨대, GLP-1)에는 접합되지 않은 CRM을 갖는다. 이들 구현예 중 일부에서, 본원에 제공된 이러한 단일접합된 폴리펩타이드 접합체는 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체와 비교하여 인간 혈청 알부민(HSA)의 존재 하에 증가된 GLP-1 수용체 작용제 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 단일접합된 폴리펩타이드 접합체는 동일하거나 유사한 분석에서 결정된 바와 같이 HSA의 존재 하에 세마글루타이드의 50% 이하(또는 40%, 30%, 20%, 10%, 5%,, 또는 3% 이하)의 EC50으로 HSA의 존재하에 GLP-1 수용체를 활성화시킨다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 단일접합된 폴리펩타이드 접합체는 동일하거나 유사한 분석에서 결정된 바와 같이 HSA의 부재 하에 세마글루타이드와 유사한(예컨대, 약 20% 내지 약 300%) EC50으로 HSA의 부재 하에 GLP-1 수용체를 활성화시킨다.
특정 구현예에서, HSA는 GLP-1 수용체 활성화에 대한 HSA 결합의 영향의 평가를 허용하는 적합한 양으로 GLP-1 수용체 활성화를 위한 시험관내 분석에 존재한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 단일접합된 폴리펩타이드 접합체는 동일하거나 유사한 분석에서 결정된 바와 같이 세마글루타이드와 유사한(약 70% 내지 약 500%) 결합 친화도(KD)로 HSA에 결합한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 단일접합된 폴리펩타이드 접합체는 유사한 생체내 연구 조건 하에서 그리고 동일한 유형의 실험 동물에서 결정된 바와 같이 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드와 비교하여 적어도 유사한 말단 반감기를 갖는다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체는 이중접합된 폴리펩타이드 접합체이며, 제2 CRM 잔기에 접합된 제2 CRM을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 CRM 잔기는 생물학적 활성 펩타이드 내에 있거나 펩타이드 링커 내에 있다. 특정 구현예에서, 제2 CRM 잔기는 GLP-1 펩타이드의 K26에 있다.
이들 구현예 중 일부에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체와 비교하여 HSA의 존재 하에 유사하거나 허용가능한 GLP-1 수용체 작용제 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 동일하거나 유사한 분석에서 결정된 바와 같이 HSA의 존재 하에 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드보다 2000% 이하(또는 1500%, 1000%, 900%, 900%, 800%, 700%, 600%, 또는 500% 이하)의 EC50으로 HSA의 존재하에 GLP-1 수용체를 활성화시킨다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 동일하거나 유사한 분석에서 결정된 바와 같이 HSA의 존재 하에 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드와 유사한(예컨대, 500%, 400%, 300%, 또는 200% 이하, 심지어 그 미만) EC50으로 HSA의 부재 하에 GLP-1 수용체를 활성화시킨다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 HSA의 존재 하에 제1 EC50으로, 그리고 HSA의 부재 하에 제2 EC50으로 GLP-1 수용체를 활성화시키고, 제1 EC50은 제2 EC50보다 높지만 제2 EC50의 1000배 이하이며, 예를 들어, 제1 EC50(HSA의 존재 하에)은 제2 EC50(HSA의 부재 하에)의 900배, 800배, 700배, 600배 또는 500배 이하이다. 특정 구현예에서, HSA는 GLP-1 수용체 활성화에 대한 HSA 결합의 영향의 평가를 허용하는 적합한 양으로 GLP-1 수용체 활성화를 위한 시험관내 분석에 존재한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 동일하거나 유사한 분석에서 결정된 바와 같이 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드보다 유의하게 낮은 KD 값으로 표시되는 더 높은 결합 친화도로 HSA에 결합한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 유사한 생체내 연구 조건 하에서 그리고 동일한 유형의 실험 동물에서 결정된 바와 같이 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%, 300%, 400%까지 말단 반감기의 증가를 갖는다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 유사한 생체내 연구 조건 하에서 그리고 동일한 유형의 실험 동물에서 결정된 바와 같이 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드의 적어도 약 50% 더 긴(60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%, 300%, 또는 400% 더 긴) 기간 동안 폴리펩타이드 접합체에 대한 치료 창 내에 남아 있는 혈액 또는 혈장 또는 혈청 농도를 갖는다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 유사한 생체내 연구 조건 하에서 그리고 동일한 유형의 실험 동물에서 결정된 바와 같이 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드와 비교하여 치료 효능의 연장된 지속 기간을 제공한다. 특정 구현예에서, 치료 효능의 연장된 지속 기간은 시간-반응 곡선에 대한 곡선하 면적(AUC) 및/또는 치료 반응의 지속 기간을 특징으로 할 수 있다.
특정 구현예에서, 치료 반응은 체중의 감소, 음식 섭취의 감소, 또는 글루코스 수준의 감소(공복 글루코스 수준 또는 비공복 글루코스 수준)를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 유사한 생체내 연구 조건 하에서 그리고 동일한 유형의 실험 동물에서 결정된 바와 같이 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%까지 시간-반응 곡선에 대한 AUC의 증가를 갖는다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 유사한 생체내 연구 조건 하에서 그리고 동일한 유형의 실험 동물에서 결정된 바와 같이 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%, 200%,, 300%, 또는 400%까지 치료 반응의 지속 기간의 증가를 갖는다.
일부 구현예에서, GLP-1은 서열번호: 1의 실질적인 생물학적 활성을 보유하면서 서열번호: 1에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, GLP-1은 서열번호: 1의 실질적인 생물학적 활성을 보유하면서 서열번호: 1에 대해 9, 8, 7, 6, 5, 또는 4개 이하의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, GLP-1은 서열번호: 1에 대해 A8, G22, Q23, E27, K26, A30, K34, R36, 및 H7, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, GLP-1은 A8Aib, G22E, K26R, K34R 및 R36G, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 제1 CRM 잔기는 리신 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 오직 하나의 리신 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 CRM 잔기는 둘다 리신 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 오직 2개의 리신 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 리신 잔기는 GLP-1 내에 있고, 선택적으로 K23, K26, K27, K30 및 K34로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 구현예에서, GLP-1 내의 CRM 잔기(들) 이외의 모든 리신 잔기(들)는 선택적으로 아르기닌(R), 글루타민(Q), 알라닌(A), 글리신(G), 히스티딘(H), 세린(S), 및 트레오닌(T)으로 이루어진 군에서 선택되는 비-리신 잔기로 치환된다.
일부 구현예에서, 제1 CRM 잔기는 시스테인 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 오직 하나의 시스테인 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 CRM 잔기는 둘다 시스테인 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 오직 2개의 시스테인 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 시스테인 잔기는 GLP-1 내에 있고, 선택적으로 C23, C26, C27, C30 및 C34로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 구현예에서, 제1 CRM 잔기는 비천연 아미노산 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 CRM 잔기로서 오직 하나의 비천연 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 비천연 아미노산 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 CRM 잔기로서 오직 2개의 비천연 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, GLP-1은 X7X8EGTFTSDVSSYLEX22 X23AAX26X27FI X30WLVX34GX36G(서열번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X7은 H, 이미다졸-4-아세테이트(IA), 또는 이미다졸프로피온산(IPA)이고; X8은 A, G, S, V, Aib, T, I, 또는 L이며; X22는 G, 또는 E이고; X23은 Q, C 또는 K이며, X26은 K, R, 또는 C이고; X27은 E, K, 또는 C이며; X30은 A, C 또는 K이고; X34는 R, K, 또는 C이며; X36은 R 또는 G이다.
일부 구현예에서, X7은 H이고, X8은 G 또는 Aib이며, X22는 G 또는 E이고; X23은 Q, C 또는 K이며, X26은 K, R 또는 C이고; X27은 E, K, 또는 C이며; X30은 A, C 또는 K이고, X34는 K, R 또는 C이며, X36은 R 또는 G이다.
일부 구현예에서, GLP-1은 서열번호: 1, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 22, 23, 25, 27, 28, 30, 32, 33, 35, 36, 38 및 40-44로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, GLP-1은 서열번호: 3-6, 8-11, 13-16, 18-21, 23-26, 28-31, 33, 34, 36-39 및 184로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드 링커는 적어도 10개의 아미노산 잔기(예컨대, 적어도 12, 24, 32, 40, 48, 60, 또는 80개의 아미노산 잔기)의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드 링커는 12-80개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 펩타이드 링커는 CRM 잔기를 제외한 G, Q, A, E, P, S 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 잔기로 이루어진다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드 링커는 CRM 잔기를 제외한 반복 서열의 하나 이상의 반복을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 반복 서열은 서열번호: 45(GQEPGAQP), 서열번호: 46(GAQPGAQP), 서열번호: 47(GQEP), 서열번호: 48(GAQP), 서열번호: 49(GAQPGQEPGAQP), 서열번호: 50(GAQPGQEP), 서열번호: 51(GEQP), 서열번호: 52(GPQE), 서열번호: 53(GPEQ), 서열번호: 54(GSEP), 서열번호: 55(GESP), 서열번호: 56(GPSE), 서열번호: 57(GPES), 서열번호: 58(GQAP), 서열번호: 59(GPAQ), 서열번호: 60(GPQA), 서열번호: 61(GSQP), 서열번호: 62(GASP), 서열번호: 63(GPAS), 서열번호: 64(GPSA), 서열번호: 65(GGGS), 서열번호: 66(GSGS), 서열번호: 67(GGGGS), 서열번호: 68(GQEPGQAP), 서열번호: 69(GQAPGQEP), 서열번호: 70(SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG), 서열번호: 71(SEPATS), 서열번호: 72(GSETPG), 서열번호: 73(TSESAT), 서열번호: 74(PESGPG), 서열번호: 75(TSTEPS) 및 GS로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 이루어진다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드 링커는 (반복1)r(반복2)s(반복3)x(반복4)y를 포함하며, 여기서 반복1, 반복2, 반복3 및 반복4는 펩타이드 결합을 통해 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 통해 연결되고, 반복1, 반복2, 반복3 및 반복4는 독립적으로 서열번호: 45(GQEPGAQP), 서열번호: 46(GAQPGAQP), 서열번호: 47(GQEP), 서열번호: 48(GAQP), 서열번호: 49(GAQPGQEPGAQP), 서열번호: 50(GAQPGQEP), 서열번호: 51(GEQP), 서열번호: 52(GPQE), 서열번호: 53(GPEQ), 서열번호: 54(GSEP), 서열번호: 55(GESP), 서열번호: 56(GPSE), 서열번호: 57(GPES), 서열번호: 58(GQAP), 서열번호: 59(GPAQ), 서열번호: 60(GPQA), 서열번호: 61(GSQP), 서열번호: 62(GASP), 서열번호: 63(GPAS), 서열번호: 64(GPSA), 서열번호: 65(GGGS), 서열번호: 66(GSGS), 서열번호: 67(GGGGS), 서열번호: 68(GQEPGQAP), 서열번호: 69(GQAPGQEP), 서열번호: 70(SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG), 서열번호: 71(SEPATS), 서열번호: 72(GSETPG), 서열번호: 73(TSESAT), 서열번호: 74(PESGPG), 서열번호: 75(TSTEPS) 및 GS로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, r, s, x 및 y는 독립적으로 0 내지 30 또는 0 내지 20으로부터 선택되는 정수이고, 단, r, s, x 및 y는 동시에 0이 아니다.
일부 구현예에서, x 및 y는 0이며, r, 및 s는 독립적으로 1 내지 30으로부터 선택되는 정수이고, 반복1 및 반복2는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 조합이다:
a) 반복1은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
b) 반복1은 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
c) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
d) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
e) 반복1은 서열번호: 49의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
f) 반복1은 서열번호: 70의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
g) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며
h) 반복1은 서열번호: 70의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, r, x 및 y는 0이고, s는 1 내지 30 또는 0 내지 20으로부터 선택되는 정수이며, 반복1은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, y는 0이고, r, s 및 x는 독립적으로 1 내지 30으로부터 선택되는 정수이며, 반복1, 반복2, 및 반복3은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 조합이다:
a) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 49의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
b) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
c) 반복1은 서열번호: 70의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
d) 반복1은 서열번호: 70의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
e) 반복1은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 58의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
f) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
g) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
h) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, r, s, x 및 y는 독립적으로 1 내지 30 또는 0 내지 20으로부터 선택되는 정수이고, 반복1, 반복2, 반복3 및 반복4는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 조합이다:
a) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 50의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복4는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
b) 반복1은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복4는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
c) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복4는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
d) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 58의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복4는 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
e) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 69의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복4는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 펩타이드 링커는 하나의 잔기가 CRM 잔기에 의해 대체된 것을 제외하고 서열번호: 76-89로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 펩타이드 링커는 서열번호: 90-117, 175 및 176으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체는 서열번호: 118-174 및 177-183으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, CRM은 혈장 단백질 결합 모이어티, 중합체, Fc, HSA(알부민), Xten 서열, 또는 PAS 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CRM은 알부민 결합 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 *-A-B-C-D-E의 구조, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하고, 여기서 A, B, C, D 및 E는 아미드 결합을 통해 상호연결되며, A의 * 말단은 폴리펩타이드 복합체 내의 CRM 잔기의 반응성 기에 연결되고, 여기서:
A는 결합,
Figure pct00001
및
Figure pct00002
으로부터 선택되고, a, b, c 및 d는 독립적으로 0 내지 4의 정수이며, R1은 수소 또는 -COOH이고;
B는 결합,
Figure pct00003
및
Figure pct00004
로부터 선택되고, 위치 α는 위치 α'에 연결되며, e는 1 내지 4의 정수이고,
C는 결합 또는
Figure pct00005
이고, R2는 -CH2SO3H 또는 -COOH이며, f는 1 내지 4의 정수이고, n은 1 내지 25의 정수이며, 여기서 B가 결합이 아닌 경우, 위치 β'는 위치 β에 연결되거나, 또는 B가 결합인 경우, 위치 β'는 위치 α'에 연결되고;
D는 결합,
Figure pct00006
및
Figure pct00007
로부터 선택되고, g 및 h는 독립적으로 0 또는 1이며, R3은 H 또는 -CH2COOH이고, 여기서:
B가 결합이 아니고 C가 결합인 경우, 위치 γ'는 위치 β에 연결되며;
C가 결합이 아닌 경우, 위치 γ'는 위치 γ에 연결되고;
B가 결합이고 C가 결합인 경우, 위치 γ'는 위치 α에 연결되며;
E는 화학식:
Figure pct00008
(I)을 갖는 산성기이고,
상기 식에서 W는 -(CR4R5)l-을 나타내고,
R4 및 R5는 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, 하이드록시알킬, 아미노, 아미노알킬, 카르복실, 카르복실알킬, 알콕시, 아릴옥시, 및 카르복사미드로 이루어진 군에서 선택되며;
R6은 하이드록실 또는 NR7R8로부터 선택되고;
R7 및 R8은 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록실, 및
Figure pct00009
로 이루어진 군에서 선택되며;
l은 10 내지 20, 10 내지 18, 10 내지 16의 정수, 예를 들어, 12, 14, 16, 또는 18이고, 여기서:
D가 결합이 아닌 경우, 위치 δ는 위치 δ'에 연결되고,
C가 결합이 아니고, D가 결합인 경우, 위치 δ는 위치 γ에 연결되며,
B가 결합이 아니고, C가 결합이며, D가 결합인 경우, 위치 δ는 위치 β에 연결되고,
A가 결합이 아니고, B, C 및 D 모두가 결합인 경우, 위치 δ는 위치 α'에 연결된다.
일부 구현예에서, CRM은 리신 잔기에 접합된다.
일부 구현예에서, A는 결합이다.
일부 구현예에서, A는 결합이고, B는 결합 또는
Figure pct00010
이며, 여기서 e는 1, 2 또는 3이다.
일부 구현예에서, A는 결합이고, B는
Figure pct00011
이며, C는
Figure pct00012
이고, 여기서 위치 β'는 위치 β에 연결되며, 여기서 e는 1, 2 또는 3이고, f는 1, 2 또는 3이며, n은 1 또는 2이다. 특정 구현예에서, D는 결합이고, E는 화학식:
Figure pct00013
을 갖는 산성기이다. 특정 구현예에서, R2는 -COOH이고, R6은 하이드록실이다. 특정 구현예에서, W는 -(CR4R5)l-을 나타내고, R4 및 R5는 독립적으로 수소이며, l은 10 내지 20, 10 내지 18, 10 내지 16의 정수, 예를 들어, 12, 14, 16, 또는 18이다.
일부 구현예에서, A는 결합이고, B는 결합이며, C는 결합이다.
일부 구현예에서, A는 결합이고, B는 결합이며, C는
Figure pct00014
이고, 여기서 f는 1, 2 또는 3이며, n은 1 또는 2이다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00015
이고, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00016
이고, B는
Figure pct00017
이며, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, e는 1, 2 또는 3이다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00018
이고, B는
Figure pct00019
이며, C는
Figure pct00020
이고, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 위치 β'는 위치 β에 연결되며, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, e는 1, 2 또는 3이며, f는 1, 2 또는 3이고, n은 1 또는 2이다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00021
이고, B는
Figure pct00022
이며, C는 결합이고, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, e는 1, 2 또는 3이다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00023
이고, B는 결합이며, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00024
이고, B는 결합이며, C는
Figure pct00025
이고, 여기서 위치 β'는 위치 α'에 연결되고, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, f는 1, 2 또는 3이며, n은 1 또는 2이다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00026
이고, B는 결합이며, C는 결합이고, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이다.
일부 구현예에서, D는 결합이다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00027
이고, B는
Figure pct00028
이며, C는
Figure pct00029
이고, D는 결합이며, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 위치 β'는 위치 β에 연결되며, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, e는 1, 2 또는 3이며, f는 1, 2, 또는 3이고, n은 1 또는 2이다.
일부 구현예에서, D는
Figure pct00030
이고, 여기서 g는 0 또는 1이며, h는 0 또는 1이다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00031
이고, B는
Figure pct00032
또는 결합이며, C는 결합이고, D는
Figure pct00033
이며, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, e는 1, 2 또는 3이며, g는 0 또는 1이고, h는 0 또는 1이며, 여기서 B가 결합이 아닌 경우, 위치 α는 위치 α'에 연결되고 위치 γ'는 위치 β에 연결되며, 여기서 B가 결합인 경우, 위치 γ'는 위치 α'에 연결된다.
일부 구현예에서, D는
Figure pct00034
이다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00035
이고, B는
Figure pct00036
이며, C는 결합 또는
Figure pct00037
이고, D는
Figure pct00038
이며, 여기서 C가 결합인 경우, 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 위치 γ'는 위치 β에 연결되거나, 또는 C가 결합이 아닌 경우, 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 위치 β'는 위치에 β에 연결되며, 위치 γ'는 위치 γ에 연결되고, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, e는 1, 2 또는 3이며, f는 1, 2 또는 3이고, n은 1 또는 2이다.
일부 구현예에서, CRM은 하기 화학식:
Figure pct00039
의 구조를 포함한다
일부 구현예에서, CRM은 시스테인 잔기에 접합된다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00040
이고, B는
Figure pct00041
, 또는
Figure pct00042
이며, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결된다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00043
이고, B는
Figure pct00044
, 또는
Figure pct00045
이며, C는
Figure pct00046
이고, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 위치 β'는 위치 β에 연결되며, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, d는 1, 2 또는 3이며, f는 1, 2 또는 3이고, n은 1 또는 2이다. 특정 구현예에서, D는 결합이고, E는 화학식:
Figure pct00047
을 갖는 산성기이다. 특정 구현예에서, R2는 -COOH이고, R6은 하이드록실이다. 특정 구현예에서, W는 -(CR4R5)l-을 나타내고, R4 및 R5는 독립적으로 수소이며, l은 10 내지 20, 10 내지 18, 10 내지 16의 정수, 예를 들어, 12, 14, 16, 또는 18이다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00048
이고, B는
Figure pct00049
이며, C는
Figure pct00050
이고, D는 결합이며, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 위치 β'는 위치 β에 연결되며, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, d는 1, 2, 또는 3이며, f는 1, 2, 또는 3이고, n은 1 또는 2이다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00051
이고, B는
Figure pct00052
이며, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 여기서 d는 1, 2 또는 3이고, e는 1, 2 또는 3이다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00053
이고, B는
Figure pct00054
이며, C는 결합이고, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 여기서 d는 1, 2 또는 3이고, e는 1, 2 또는 3이다.
일부 구현예에서, A는
Figure pct00055
이고, B는
Figure pct00056
이며, C는 결합이고, D는
Figure pct00057
이며, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 위치 γ'는 위치 β에 연결되며, 여기서 d는 1, 2 또는 3이고, e는 1, 2 또는 3이며, g는 0 또는 1이고, h는 0 또는 1이다.
일부 구현예에서, CRM은 하기 화학식:
Figure pct00058
의 구조를 포함한다.
제2 양태에서, 본 개시내용은 제1 양태의 폴리펩타이드 접합체의 폴리펩타이드 부분(또는 이의 단편)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
제3 양태에서, 본 개시내용은 제2 양태의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
제4 양태에서, 본 개시내용은 제3 양태의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다.
제5 양태에서, 본 개시내용은 제2 양태의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 허용하는 조건 하에 제4 양태의 숙주 세포를 배양하여 폴리펩타이드 접합체의 폴리펩타이드 부분을 얻는 단계를 포함하는, 제1 양태의 폴리펩타이드 접합체를 제조하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드 부분은 가용성 단백질로서 발현된다.
일부 구현예에서, 방법은 CRM을 폴리펩타이드 부분에 접합시키는 단계를 추가로 포함한다.
제6 양태에서, 본 개시내용은 제1 양태에 따른 폴리펩타이드 접합체 및 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
제7 양태에서, 본 개시내용은 제1 양태의 폴리펩타이드 접합체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 대사 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
제8 양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체의 치료적 유효량을 투여하여 대상체의 체중을 관리하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 체중을 관리하는 방법을 제공한다.
제9 양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체의 치료적 유효량을 투여하여 대상체의 음식 섭취를 감소시키는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 음식 섭취를 감소시키는 방법을 제공한다.
제10 양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체의 치료적 유효량을 투여하여 대상체의 체중을 감소시키는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 체중을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 대사 장애는 당뇨병, 비만, 과체중, 비알콜성 지방간염(NASH), 심혈관 유사 이상지질혈증, 동맥경화증, 알콜성 지방간염(ASH), 당뇨병성 신증, 임신성 당뇨병, 대사 증후군, 예컨대 대사 증후군 X, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 말기 간 질환, 간 지방증(지방간), 간경변, 또는 원발성 담즙성 간경변증(PBC)이다.
특정 구현예에서, 당뇨병은 비제한적으로 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 1형 당뇨병, 비인슐린 의존성 당뇨병, 저연령대 성숙기 발병 당뇨병(maturity onset diabetes of the young: MODY), 임신성 당뇨병, 및 HbA1C의 상승된 수준을 포함하는 임의의 형태의 당뇨병일 수 있다.
특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
특정 구현예에서, 대상체는 125 mg/dL 이상의 공복 혈당 수준을 갖는다.
특정 구현예에서, 대상체는 적어도 25 또는 25 초과의 체질량 지수(BMI)를 갖는다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체는 매일 1회, 3일마다 1회, 또는 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 매월 1회 이하인 투여 요법으로 투여된다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체는 매주 2회, 매주 1회, 격주 1회, 3주마다 1회, 매월 1회, 또는 2개월 1회 투여된다.
특정 구현예에서, 투여 요법은 3일마다 약 1회 내지 1개월당 약 1회, 또는 매주 약 1회 내지 1개월당 약 1회의 범위의 투여 간격을 갖는다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체는 피하 또는 정맥내 또는 경구 투여된다.
본 개시내용 전반에 걸쳐, 관사 "a", "an," 및 "the"는 관사의 하나 또는 둘 이상(즉, 적어도 하나)의 문법적 목적어를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예로서, "융합 폴리펩타이드"는 하나의 융합 폴리펩타이드 또는 둘 이상의 융합 폴리펩타이드를 의미한다.
일련의 인용된 수치 값들이 존재하는 본 출원의 모든 발생에서, 임의의 인용된 수치 값은 수치 범위의 상한 또는 하한일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 이러한 모든 수치 범위, 즉 상한 및 하한 수치 한계의 조합을 갖는 범위를 포괄하며, 여기서 상한 및 하한 각각에 대한 수치 값은 본원에 인용된 임의의 수치 값일 수 있음을 추가로 이해해야 한다. 본원에 제공된 범위는 범위 내의 모든 값을 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 1-10은 값 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 및 적절한 분수 값 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 유사하게, "적어도"에 의해 한계가 정해진 범위는 제공된 낮은 값 및 모든 더 높은 숫자를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, "약"은 특정 분야에서 평균의 3 표준 편차 이내 또는 표준 허용 범위 내를 포함하는 것으로 이해된다. 특정 구현예에서, 약은 0.5 이하의 변화로 이해된다.
관사 "a" 및 "an"은 관사의 하나 또는 둘 이상(즉, 적어도 하나)의 문법적 목적어를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 둘 이상의 요소를 의미한다.
용어 "포함하는"은 문구 "비제한적으로 포함하는"을 의미하기 위해 본원에서 사용되고, 이와 상호교환적으로 사용된다. 유사하게, "예컨대"는 문구 "예컨대, 제한되지 않는"을 의미하기 위해 본원에서 사용되고, 이와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "또는"은 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 용어 "및/또는"을 의미하기 위해 본원에서 포괄적으로 사용되며, 이와 상호교환적으로 사용된다.
도 1a 내지 1c는 C57BL/6 마우스에서 분자 001, 002 및 012의 생체내 활성을 나타낸다. 체중을 평가하기 위해, 10주령의 수컷 C57BL/6 마우스에게 시험 약물 물질을 1회 피하 투여하였다. 도 1a는 1일부터 8일까지 분자 001 처리 후의 체중 손실을 나타낸다. 도 1b는 1일부터 8일까지 분자 002 처리 후의 체중 손실을 나타낸다. 도 1c는 1일부터 8일까지 분자 012 또는 분자 001 처리 후의 체중 손실을 나타낸다. 도 1d는 1일부터 8일까지 분자 007, 008, 012 및 016 처리 후의 체중 손실을 나타낸다. 데이터는 평균값 및 표준 오차(SEM)로 표시된다. 세마글루타이드를 비교 대조군으로서 병행하여 시험하였다.
도 2a, 2b 및 2c는 db/db 마우스에서 분자 001, 002 및 012의 생체내 활성을 나타낸다. 도 2a는 분자 001 단일 용량 처리 후의 공복 글루코스를 나타낸다. 도 2b는 분자 002 단일 용량 처리 후의 공복 글루코스를 나타낸다. 데이터는 평균값 및 표준 오차(SEM)로 표시된다. 도 2c는 분자 012 단일 용량 처리 후의 비공복 글루코스를 나타낸다. 글루코스를 평가하기 위해, 10주령의 수컷 db/db 마우스에게 지정된 GLP-1 폴리펩타이드 접합체를 지시된 투여량으로 피하 투여하였다. 공복 글루코스(도 2a 및 2b) 또는 비공복 글루코스(도 2c)를 상이한 시간에 측정하였고, 각 그룹에 대해 5마리의 동물을 사용하였다. 델타 혈당은 기준선 수준에 의해 차감된 글루코스이다. 데이터는 평균값 및 표준 오차(SEM)로 표시된다.
도 3a 및 3b는 식이 유도 비만(DIO) 마우스에서의 생체내 효능을 나타낸다. 각각의 GLP-1 폴리펩타이드 접합체가 체중, 음식 섭취 및 글루코스 수준에 미치는 영향을 평가하기 위해, 22주령 DIO 마우스(13주 동안 고지방 식이 C57BL/6 마우스)에게 25일 동안 상이한 농도의 지정된 GLP-1 폴리펩타이드 접합체를 격일로 피하 투여하였다. 도 3a는 10, 30 및 100 nmol/kg의 분자 012의 용량 적정에 따른 체중 변화를 나타낸다. 도 3b는 처리시 공복 글루코스 변화를 나타낸다. 데이터는 평균값 및 표준오차(SEM)로 표현된다.
도 4a 내지 도 4l은 본 개시내용에 개시된 모든 서열을 나타낸다.
본 개시내용의 하기 설명은 단지 본 개시내용의 다양한 구현예를 예시하기 위한 것이다. 이와 같이, 논의된 특정 변형은 본 개시내용의 범위에 대한 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 다양한 균등물, 변화, 및 변형이 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이며, 이러한 균등한 구현예가 본원에 포함되어야 하는 것으로 이해된다. 간행물, 특허 및 특허 출원을 포함한 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 각 아미노산에 특이적인 측쇄와 함께 아민(-NH2) 및 카르복실(-COOH) 작용기를 함유하는 유기 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자연 발생" 아미노산 잔기는 천연 단백질 또는 펩타이드에서 발견되는 아미노산 잔기를 지칭하며, 이들의 구조가 이러한 입체이성질체 형태를 허용하는 경우 모두 D 및 L 입체이성질체이다. 자연 발생 아미노산 잔기의 예는, 비제한적으로 글리신(Gly 또는 G), 알라닌(Ala 또는 A), 발린(Val 또는 V), 류신(Leu 또는 L), 이소류신(Ile 또는 I), 세린(Ser 또는 S), 시스테인(Cys 또는 C), 트레오닌(Thr 또는 T), 메티오닌(Met 또는 M), 프롤린(Pro 또는 P), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 티로신(Tyr 또는 Y), 트립토판(Trp 또는 W), 히스티딘(His 또는 H), 리신(Lys 또는 K), 아르기닌(Arg 또는 R), 아스파르테이트(Asp 또는 D), 글루타메이트(Glu 또는 E), 아스파라긴(Asn 또는 N), 및 글루타민(Gln 또는 Q)을 포함하는 20개의 표준 아미노산, 및 이들의 천연 유사체, 예컨대 카나바닌, 피롤리신(PYL), 셀레노시스테인, 피롤린-카르복시-리신(PCL), 사르코신, 베타-알라닌, 포스포세린, γ- 카르복시글루타메이트, 및 오르니틴을 포함한다. 그의 D 입체이성질체 내의 자연 발생 아미노산 잔기의 예는, 예를 들어 D-아스파르테이트, D-세린, D-시스테인, D-알라닌, D-글루타메이트 등을 포함한다.
"아미노산 유사체"는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카르복실기, 아미노기, 및 R기, 예컨대 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄에 결합된 탄소를 갖는 화합물이다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 백본을 가질 수 있지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "비천연" 아미노산 잔기는 비제한적으로 변형된 아미노산 잔기, 및/또는 아미노산 모방체를 포함하는 자연에서 발견되지 않는 임의의 아미노산 잔기를 지칭하며, 이는 공지된 자연 발생 아미노산 중 하나는 아니지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능한다. 변형된 아미노산 또는 모방체는 탄수화물기, 포스페이트기, 파네실기, 이소파메실기, 지방산기, 접합, 기능화 또는 다른 변형을 위한 링커 등과 같은 화학적 엔티티의 첨가에 의해 생성될 수 있다. 비천연 아미노산은 또한 화학적 합성에 의해 제조된 아미노산을 지칭할 수 있다. 예시적인 비천연 아미노산은, 비제한적으로, 2-아미노이소부티르산(Aib), 이미다졸-4-아세테이트(IA), 이미다졸프로피온산(IPA), 아미노부티르산(Abu), tert-부틸글리신(Tle), b-알라닌, 3-아미노메틸 벤조산, 안트라닐산, 데스-아미노-히스티딘(약칭 데사미노His, 대안적인 명칭 이미다조프로피온산, 약칭 lmpr), 아미노산의 베타 유사체, 예컨대 β-알라닌, 2-아미노-히스티딘, β-하이드록시-히스티딘, 호모히스티딘, Nα-아세틸-히스티딘, α-플루오로-메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, α,α- 디메틸-글루탐산, m-CF3-페닐알라닌, α,β-디아미노프로피온산(약칭 Dap), 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌, (1-아미노사이클로프로필)카르복실산, (1-아미노사이클로부틸)-카르복실산, (1-아미노사이클로펜틸)카르복실산, (1-아미노사이클로헥실)카르복실산, (1-아미노사이클로헵틸)카르복실산, 및 (1-아미노사이클로옥틸)카르복실산을 포함한다.
폴리펩타이드 내로의 비천연 아미노산의 도입은 문헌[Wang et al., Science 292:498-500, 2001 ; Deiters et al., J Am Chem Soc 125:1 1782-1 1783, 2003; Wang and Schultz, Science 301 :964- 967, 2003; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004 또는 미국 특허 제7,083,970호]에 기재된 기술에 의해 실현될 수 있다. 간략하게, 이들 발현 시스템 중 일부는 본 개시내용의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 내로 정지 코돈, 예컨대 앰버(amber(UAG)), 오커(ochre(UAA)), 및 오팔(opal(UGA) 코돈)을 도입하기 위해 부위 지시 돌연변이유발을 수반한다. 다른 코돈, 예컨대 4-염기 코돈(예컨대, AGGA, AGGU, CGGU, CGCU, CGAU, CCCU, CUCU, CUAU 및 GGGU), 5-염기 코돈, 6-염기 코돈 등이 또한 비천연 아미노산에 대한 발현 시스템 내로 도입될 수 있다. 그 다음, 이러한 발현 벡터는 도입된 정지 코돈 또는 다른 코돈에 특이적인 tRNA를 이용할 수 있는 숙주 내로 도입되고, 선택되는 비천연 아미노산과 함께 운반된다. 또 다른 예로, 비천연 아미노산은 화학적으로 합성되고, 아실화와 같은 화학 반응에 의해 폴리펩타이드 내로 삽입되거나 이에 부착될 수 있다.
"퍼센트(%) 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우 동일한 아미노산(또는 핵산)의 최대 개수를 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 참조 서열 내의 아미노산(또는 핵산) 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산(또는 핵산) 잔기의 백분율로서 정의된다. 즉, 아미노산 서열(또는 핵산 서열)의 퍼센트(%) 서열 동일성은 어떤 것이 더 짧든 간에, 비교되는 참조 서열에 대해 동일한 아미노산 잔기(또는 염기)의 수를 후보 서열 또는 참조 서열 내의 아미노산 잔기(또는 염기)의 총 수로 나눔으로써 계산될 수 있다. 아미노산 잔기의 보존적 치환은 동일한 잔기로 간주되지 않는다. 퍼센트 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은, 예를 들어 BLASTN, BLASTp(미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 웹사이트에서 이용가능함, 또한 Altschul S.F. et al, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Stephen F. et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997) 참고), ClustalW2(유럽 생물학정보 연구소의 웹사이트에서 이용가능함, 또한 Higgins D.G. et al, Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin M.A. et al, Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007) 참고), 및 ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 도구를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 도구에 의해 제공되는 기본 파라미터를 사용할 수 있거나, 또는 예를 들어, 적합한 알고리즘을 선택함으로써 정렬에 대해 적절하게 파라미터를 바꿀 수 있다.
아미노산 서열과 관련된 "보존적 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 보존적 치환은 소수성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기(예컨대, Met, Ala, Val, Leu 및 Ile) 사이에서, 중성 친수성 측쇄를 갖는 잔기(예컨대, Cys, Ser, Thr, Asn 및 Gln) 사이에서, 산성 측쇄를 갖는 잔기(예컨대 Asp, Glu) 사이에서, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, His, Lys, 및 Arg) 사이에서, 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기(예컨대, Trp, Tyr 및 Phe) 사이에서 이뤄질 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 보존적 치환은 일반적으로 단백질 입체 구조에 유의한 변화를 야기하지 않으며, 따라서 단백질의 생물학적 활성을 보유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능적 형태"는 아미노산 서열 또는 화학 구조에서 차이를 갖지만, 여전히 모 분자의 실질적인 생물학적 활성을 보유하는 모 분자의 상이한 형태(예컨대, 변이체, 단편, 융합체, 유도체 및 모방체)를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 표현 "실질적인 생물학적 활성을 보유하는"은 모 분자의 생물학적 활성의 적어도 일부(예를 들어, 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상) 또는 전부를 나타내는 것을 의미한다. 모 폴리펩타이드의 기능적 형태는 자연 발생 변이체 형태 및 비자연 발생 형태, 예컨대 재조합 방법 또는 화학적 합성에 의해 수득된 것 모두를 포함할 수 있다. 기능적 형태는 비천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 모 폴리펩타이드에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 변이체는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 모 펩타이드와 상이할 수 있다. 예를 들어, 변이체는 모 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 부가, 결실, 삽입 또는 절단을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단편"은 임의의 길이의 모 폴리펩타이드의 부분적 서열을 지칭한다. 단편은 여전히 모 폴리펩타이드의 적어도 부분적인 기능을 보유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유도체"는 하나 이상의 잘 정의된 수의 치환기가 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드의 하나 이상의 특정 아미노산 잔기에 공유 부착된 화학적으로 변형된 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 지칭한다. 예시적인 화학적 변형은, 예컨대 알킬화, 아실화, 에스테르화, 아미드화, 인산화, 글리코실화, 표지화, 하나 이상의 아미노산의 메틸화, 또는 하나 이상의 모이어티와의 접합일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "모방체"는 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 융합 폴리펩타이드의 대체물로서 작용하는 분자 구조를 지칭한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같은 아미노산 모방체는 합성 구조(알려져 있거나 아직 알려져 있지 않음)일 수 있으며, 이는 아미노산일 수도 있거나 아닐 수도 있지만, 모 아미노산의 기능적 특징을 보유할 수 있는 반면, 아미노산 모방체의 구조는 모 아미노산의 구조와 상이하다. 예는 아미드, β-, γ-, δ-이미노산(예컨대, 피페리딘-4-카르복실산) 등의 의 메타크릴로일 또는 아크릴로일 유도체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 병태의 "치료하는 것" 또는 "치료"는 병태를 예방 또는 완화시키는 것, 병태의 발병 또는 발달 속도를 늦추는 것, 병태를 발병시킬 위험을 감소시키는 것, 병태와 관련된 증상의 발달을 예방 또는 지연시키는 것, 병태와 관련된 증상을 감소 또는 종료시키는 것, 병태의 완전한 또는 부분적 퇴행을 발생시키는 것, 병태를 치유하는 것, 또는 이들의 일부의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 상기 단백질의 발현을 유발하도록 작동가능하게 삽입될 수 있는 비히클을 지칭한다. 벡터는 숙주 세포 내에서 그것이 운반하는 유전 요소의 발현을 가져오도록 숙주 세포를 형질전환, 형질도입 또는 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC), 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC), 박테리오파지, 예컨대 람다 파지 또는 M13 파지, 및 동물 바이러스를 포함한다. 벡터로서 사용되는 동물 바이러스의 카테고리는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스(예컨대, 헤르페스 심플렉스 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 파필로마바이러스, 및 파포바바이러스(예컨대, SV40)를 포함한다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택가능한 요소, 및 리포터 유전자를 포함하는, 발현을 제어하기 위한 다양한 요소를 함유할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 원점을 함유할 수 있다. 벡터는 또한 비제한적으로 바이러스 입자, 리포솜, 또는 단백질 코팅을 포함하는, 세포 내로의 그의 진입을 보조하는 물질을 포함할 수 있다. 벡터는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터일 수 있다. 본 개시내용은 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 본원에 제공된 핵산 서열, 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터(예컨대, SV40, CMV, EF-1α), 및 적어도 하나의 선택 마커를 함유하는 벡터(예컨대, 발현 벡터)를 제공한다. 벡터의 예는, 비제한적으로, 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스(예컨대, 헤르페스 심플렉스 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 파필로마바이러스, 파포바바이러스(예컨대, SV40), 람다 파지, 및 M13 파지, 플라스미드 pcDNA3.3, pMD18-T, pOptivec, pCMV, pEGFP, pIRES, pQD-Hyg-GSeu, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS10, pLexA, pACT2.2, pCMV-SCRIPT.RTM., pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, PCR 2.1, pEF-1, pFB, pSG5, pXT1, pCDEF3, pSVSPORT, pEF-Bos 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 문구 "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터가 도입된 세포를 지칭한다.
용어 "약학적으로 허용되는"은 지정된 담체, 비히클, 희석제, 부형제(들), 및/또는 염이 일반적으로 제제를 구성하는 다른 성분과 화학적 및/또는 물리적으로 양립가능하고, 이의 수용자와 생리학적으로 양립가능하다는 것을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자"는 질환 또는 장애의 진단, 예후, 개선, 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 포유동물 또는 영장류를 포함하는 인간 또는 비인간 동물을 지칭한다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완용 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 돼지, 소, 곰 등을 포함한다.
폴리펩타이드 접합체
일 양태에서, 본 개시내용은 펩타이드 링커의 N-말단에 부착된 단일 생물학적 활성 펩타이드, 및 펩타이드 링커 내의 제1 클리어런스-감소 모이어티 잔기에 접합된 제1 CRM을 포함하는 폴리펩타이드 접합체로서, 여기서 생물학적 활성 펩타이드는 GLP-1 수용체 작용제를 포함하고, 제1 CRM 잔기는 GLP-1 수용체 작용제의 C-말단 아미노산 잔기로부터 적어도 5개의 아미노산 잔기(CRM 잔기 제외) 떨어져 있다.
용어 "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 펩타이드 결합과 같은 공유 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 본원에 제공된 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 자연 발생 또는 비천연 아미노산 잔기, 또는 둘다를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 폴리펩타이드 및 펩타이드는 임의의 적합한 길이의 아미노산 잔기, 예를 들어, 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 길이를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드 접합체는 단일, 즉 오직 하나의 생물학적 활성 펩타이드를 포함한다. 생물학적 활성 펩타이드에 대하여 "단일"은 폴리펩타이드 접합체가 펩타이드 링커에 각각 부착된 2개 이상의 상이한 생물학적 활성 펩타이드를 함유하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 그러나, 단일 생물학적 활성 펩타이드는 이들 부분이 하나의 펩타이드로서 통합되고 링커에 각각 부착되지 않는 한, 예를 들어, 하이브리드 또는 키메라로서, 함께 융합된 상이한 생물학적 활성 펩타이드로부터의 단편 또는 부분을 포함할 수 있다. 그러나, 2개의 상이한 생물학적 활성 펩타이드가 링커의 N-말단 및 C-말단에 각각 부착되는 경우, 그것은 본 개시내용에서 사용되는 바와 같은 단일 생물학적 활성 펩타이드가 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 활성 펩타이드"는 생물학적 기능 또는 활성, 예를 들어, 생리학적 기능, 또는 치료적 기능을 갖는 펩타이드를 의미한다. 특정 구현예에서, 생물학적 활성 펩타이드는 치료적으로 활성이다. 단독으로 있을 때 생물학적 기능을 갖지 않는 펩타이드는 생물학적 활성 펩타이드가 아니다. 예를 들어, 펩타이드 링커는, 예를 들어 단독으로 사용될 때, 그 자신의 생물학적 기능 또는 활성을 갖지 않는 한, 생물학적 활성 펩타이드가 아니다.
생물학적 활성 펩타이드는 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1) 수용체 작용제를 포함한다.
용어 "글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1) 수용체"(GLP1R로도 지칭됨)는 하나의 세포외 도메인 및 하나의 막횡단 도메인을 포함하는, 췌장 상의 베타 세포 및 뇌의 뉴런 상에서 발견되는 수용체 단백질이다. 세포외 도메인은 GLP-1의 C-말단 나선에 결합할 수 있고, 막횡단 도메인은 GLP-1의 N-말단 영역에 결합할 수 있다. GLP-1 수용체는 인슐린 분비를 향상시킴으로써 혈당 수준의 제어에 관여한다. 뇌에서 발현될 때, GLP-1 수용체는 또한 식욕의 제어에 관여할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1) 수용체 작용제" 또는 "GLP-1 수용체 작용제"는 GLP-1 수용체에 결합하고 활성화시킬 수 있는 분자를 지칭한다. GLP-1 수용체 작용제는 천연 리간드 또는 이의 부분과 유사한 GLP-1 수용체 반응의 크기를 유도할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "클리어런스-개질 모이어티" 또는 "CRM"은 하나 이상의 약동학(PK) 특성을 변경할 수 있는(예를 들어, 생체내 반감기를 증가시키기 위한) 모이어티를 의미한다. CRM의 예는, 비제한적으로 지방산, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 글루쿠론산 또는 다른 당 기반 링커, 석신이미딜 고리의 가수분해 속도를 증가시키고 역 마이클 반응의 속도를 감소 또는 최소화하여 약물의 손실 속도를 감소 또는 최소화하는 극성, 양전하 또는 음전하를 띤 그룹 및 생물학적 활성 펩타이드로부터 다른 티올 함유 단백질 및 소분자까지의 링커 그룹을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "CRM 잔기"는 CRM에 접합되는 아미노산 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "접합체"는 하나의 물리적 엔티티를 형성하기 위해 함께 결합된 2개 이상의 분자의 결과로서의 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 본 개시내용의 접합체는 폴리펩타이드와 하나 이상의 클리어런스-개질 모이어티가 함께 접합된 결과로서의 화합물을 의미한다. 분자는 공유 결합, 비공유 결합, 링커, 화학적 변형, 또는 단백질 융합에 의해 또는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 함께 부착될 수 있다. 바람직하게는, 분자는 공유 결합에 의해 함께 부착될 수 있다. 결합은 영구적이거나 가역적일 수 있다. 일부 구현예에서, 특정한 절단가능한 또는 비절단가능한 연결이 포함될 수 있다.
GLP-1 수용체 작용제에 대한 CRM의 접합은 GLP-1 수용체 작용제의 반감기를 연장시킬 수 있지만, GLP-1 수용체 작용제의 생물학적 활성에 부정적으로 영향을 미쳐 비접합된 대응물보다 덜 활성이 되게 할 수 있다. 예를 들어, 접합된 GLP-1 유도체인 세마글루타이드는 유의하게 연장된 반감기를 갖지만, 그의 비접합된 대응물에 비해 인간 혈청 알부민(HSA)의 존재 하에서 GLP-1 수용체 결합에서 939배의 손실을 겪는다(J. Med. Chem. 2015, 58, 7370-7380).
그러나, CRM이 그의 C-말단에 부착된 펩타이드 링커 상에 GLP-1 수용체 작용제의 외부에 접합되는 경우, GLP-1 수용체 작용제를 포함하는 특정 CRM 접합된 폴리펩타이드가 연장된 반감기 및 유지된 생물학적 활성 모두를 가질 수 있다는 것이 본 발명자들에 의해 예기치 않게 발견된다. 흥미롭게도, GLP-1 수용체 작용제의 C-말단과 접합 부위 사이의 거리는 본 발명자들에 의해 특히 중요한 것으로 밝혀졌다. 펩타이드 링커 상의 CRM 접합이 GLP-1 수용체 작용제의 C-말단에 가까운 위치에 있는 경우, 그것은 생물학적 활성을 유의하게 감소시킬 것이며, 이는 GLP-1 수용체 작용제 자체 상의 접합보다 훨씬 더 낮을 수 있다. 그러나, 접합이 GLP-1 수용체 작용제의 C-말단으로부터 충분히 더 멀리 떨어진 위치에 있는 경우, CRM 접합된 GLP-1 수용체 작용제는 연장된 반감기 및 유지된 생물학적 활성 둘다를 가질 수 있다. 이러한 예상치 못한 효과는 특정 GLP-1 수용체 작용제 및 특정 CRM에서 발견된다.
특정 구현예에서, 제1 CRM 잔기는 GLP-1 수용체 작용제의 C-말단 아미노산 잔기로부터 적어도 10, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 35, 38, 40, 45, 46, 50, 55, 58, 60, 65, 70, 75, 또는 78개의 아미노산 잔기(CRM 잔기 제외) 떨어져 있다. 특정 구현예에서, 제1 CRM 잔기 및 GLP-1 수용체 작용제의 C-말단 아미노산 사이의 거리는 10 내지 120, 15 내지 120, 20 내지 120, 25 내지 120, 30 내지 120, 31 내지 120, 32 내지 120, 33 내지 120, 34 내지 120, 35 내지 120, 36 내지 120, 37 내지 120, 38 내지 120, 39 내지 120, 40 내지 120, 30 내지 80, 31 내지 80, 32 내지 80, 33 내지 80, 34 내지 80, 35 내지 80, 36 내지 80, 37 내지 80, 38 내지 80, 39 내지 80, 또는 40 내지 80이다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체 내의 GLP-1 수용체 작용제는 70, 60, 또는 50개 이하의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체 내의 GLP-1 수용체 작용제는 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 또는 30개 이하의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체 내의 GLP-1 수용체 작용제는 본 개시내용에서 제공된 바과 같은 GLP-1을 포함하거나 GLP-1이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체 내의 GLP-1은 서열번호: 1, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 22, 23, 25, 27, 28, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 40-44 및 184로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체 내의 GLP-1은 서열번호: 3(8Aib, 34R, 36G), 또는 서열번호: 8(8Aib, 22E, 34R, 36G)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
임의의 이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, GLP-1에 대한 CRM(또는 지방산) 접합은 HSA의 존재 하에서 그의 활성을 감소시킬 수 있다고 여겨진다. 예를 들어, GLP-1 활성의 감소가 GLP-1(8Aib, 36R)의 K26에 접합된 지방산을 갖는 세마글루타이드에 대해 보고되었으며, HSA의 존재 하에 그의 비접합된 대응물과 비교하여 활성의 유의한 감소를 나타내었다. HSA는 인간 혈액에 존재하고 생리학적 조건 하에서 불가피하므로, HSA의 존재 하에 GLP-1 수용체 작용제 활성의 감소는 단백질 접합체의 치료 활성을 손상시키는 것으로 여겨진다. 그러나, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체 중 일부는 CRM 접합에도 불구하고 HSA의 존재 하에 GLP-1 활성의 대부분을 보유할 수 있다. 이러한 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체는 단일접합되고, 펩타이드 링커에 접합되지만 생물학적 활성 펩타이드(예컨대, GLP-1)에는 접합되지 않은 CRM을 갖는다.
이들 구현예 중 일부에서, 본원에 제공된 이러한 단일접합된 폴리펩타이드 접합체는 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체와 비교하여, HSA의 존재 하에 증가된 GLP-1 수용체 작용제 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, HSA의 존재 하에서의 GLP-1 수용체 작용제 활성은 당업계에 공지된 바와 같이, cAMP 분석과 같은 무세포 분석에서 또는 리포터 세포 분석과 같은 세포 기반 분석에서 GLP-1 수용체 활성화를 위한 시험관내 분석에서 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 비교 폴리펩타이드 접합체는 세마글루타이드이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 단일접합된 폴리펩타이드 접합체는 동일하거나 유사한 분석에서 결정된 바와 같이, HSA의 존재 하에 세마글루타이드보다 50% 이하(또는 40%, 30%, 20%, 10%, 5%,, 또는 3% 이하)의 EC50으로 인간 혈청 알부민(HSA)의 존재 하에 GLP-1 수용체를 활성화시킨다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 단일접합된 폴리펩타이드 접합체는 동일하거나 유사한 분석에서 결정된 바와 같이, HSA의 부재 하에 세마글루타이드와 유사한(예컨대, 20% 내지 300%)의 EC50으로 HSA의 부재 하에 GLP-1 수용체를 활성화시킨다. 특정 구현예에서, 인간 혈청 알부민(HSA)의 양은 GLP-1 수용체 활성화에 대한 HSA 결합의 영향의 평가를 허용한다. 특정 구현예에서, GLP-1 수용체 활성화를 위한 시험관내 분석은 적어도 0.5%, 1%, 1.2%, 1.5%, 1.8% 또는 2% HSA의 존재 하에 수행된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 단일접합된 폴리펩타이드 접합체는 동일하거나 유사한 분석에서 결정된 바와 같이, 세마글루타이드와 유사한(약 70% 내지 약 500%) 결합 친화도(KD)로 HSA에 결합한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 단일접합된 폴리펩타이드 접합체는 유사한 생체내 연구 조건 하에서 그리고 동일한 유형의 실험 동물에서 결정된 바와 같이, 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드와 비교하여 적어도 유사한 말단 반감기를 갖는다. 말단 반감기 결정에 적합한 동물은, 예를 들어 마우스, 래트, 미니피그, 또는 원숭이를 포함한다. 특정 구현예에서, 말단 반감기는 치료 효능을 제공하기에 적합한 용량으로 단일 용량 정맥내 투여 또는 피하 투여 또는 경구 투여 후에 적합한 동물에서 결정된다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체는 제2 CRM 잔기에 접합된 제2 CRM을 추가로 포함한다. 즉, 본 개시내용은 또한 이중접합된 폴리펩타이드 접합체를 제공한다. 제2 CRM 접합이 폴리펩타이드 접합체의 반감기를 더 연장시킬 수 있다는 것이 본 발명자에 의해 예기치 않게 발견된다. 특정 구현예에서, 제1 및 제2 CRM 접합 모두를 갖는 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 오직 하나의 CRM 접합을 갖는 상응하는 폴리펩타이드 접합체(예컨대, 세마글루타이드)보다 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배 또는 심지어 더 긴 연장된 반감기를 가질 수 있다.
제2 CRM 잔기는 임의의 적절한 위치에 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 CRM 잔기는 GLP-1 수용체 작용제 내에 있거나 또는 펩타이드 링커 내에 있다.
특정 구현예에서, 제2 CRM 잔기는 GLP-1 펩타이드의 K26에 있다. GLP-1 펩타이드 상의 2개의 지방산 모이어티와의 접합은 활성을 유의하게 감소시키거나 심지어 접합된 GLP-1 펩타이드를 비효율적이게 만들 수 있는 것으로 보고되었다. 따라서, GLP-1 펩타이드의 C-말단으로부터 충분히 떨어진 위치에서 GLP-1(예컨대, K26) 및 펩타이드 링커 상의 접합이 HSA의 존재 하에 GLP-1 폴리펩타이드의 생물학적 활성에 대한 지방산 접합의 부정적인 영향을 최소화할 수 있다는 것이 본 발명자에 의해 예기치 않게 발견된다.
이들 구현예 중 일부에서, 본원에 제공된 이러한 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체와 비교하여, HSA의 존재 하에 유사하거나 허용가능한 GLP-1 수용체 작용제 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 동일하거나 유사한 분석에서 결정된 바와 같이, HSA의 존재 하에 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드보다 2000% 이하(또는 1500%, 1000%, 900%, 900%, 800%, 700%, 600%, 또는 500% 이하)의 EC50으로 HSA의 존재 하에 GLP-1 수용체를 활성화시킨다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 동일하거나 유사한 분석에서 결정된 바와 같이, 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드, 예컨대 세마글루타이드와 유사한(예컨대, 500% 이하, 400%, 300%, 또는 200% 이하) EC50으로 HSA의 부재 하에 GLP-1 수용체를 활성화시킨다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 HSA의 존재 하에 제1 EC50으로, 및 HSA의 부재 하에 제2 EC50으로 GLP-1 수용체를 활성화시키고, 제1 EC50은 제2 EC50보다 높지만 제2 EC50의 1000배 이하이며, 예를 들어, 제1 EC50(HSA의 존재 하에)은 제2 EC50(HSA의 부재 하에)의 900배, 800배, 700배, 600배 또는 500배 이하이다. 특정 구현예에서, HSA는 GLP-1 수용체 활성화에 대한 HSA 결합의 영향의 평가를 허용하는 적합한 양으로 GLP-1 수용체 활성화에 대한 시험관내 분석에 존재한다. 특정 구현예에서, GLP-1 수용체 활성화에 대한 시험관내 분석은 GLP-1 수용체 활성화에 대한 HSA 결합의 영향의 평가를 허용하는 적합한 양의 인간 혈청 알부민(HSA)의 존재 하에 수행된다. 특정 구현예에서, GLP-1 수용체 활성화에 대한 시험관내 분석은 적어도 0.5%, 1%, 1.2%, 1.5%, 1.8% 또는 2% HSA의 존재 하에 수행된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 동일하거나 유사한 분석에서 결정된 바와 같이, 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드보다 유의하게 낮은 KD 값으로 표시되는 더 높은 결합 친화도로 HSA에 결합한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 펩타이드 링커가 없고 생물학적 활성 펩타이드(예컨대, GLP-1) 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체와 비교하여 향상된 약동학 특성을 가지며, 여기서 약동학 특성은 치료적 유효 용량을 대상체에게 투여한 후 폴리펩타이드 접합체의 혈중 농도를 측정함으로써 결정된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 유사한 생체내 연구 조건 하에서 그리고 동일한 유형의 실험 동물에서 결정된 바와 같이, 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%, 300%, 또는 400%까지 말단 반감기의 증가를 갖는다. 말단 반감기 결정에 적합한 동물은, 예를 들어 마우스, 래트, 미니피그, 또는 원숭이를 포함한다. 특정 구현예에서, 말단 반감기는 치료 효능을 제공하기에 적합한 용량으로 단일 용량 정맥내 투여 또는 피하 투여 후에 적합한 동물에서 결정된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 유사한 생체내 연구 조건 하에서 그리고 동일한 유형의 실험 동물에서 결정된 바와 같이, 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드보다 적어도 약 50% 더 긴(60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%, 300%, 또는 400% 더 긴) 기간 동안 폴리펩타이드 접합체에 대한 치료 창 내에 남아 있는 혈액 또는 혈장 또는 혈청 농도를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료 창"은 허용불가능한 독성 없이 치료될 병태에 대해 치료 이익 또는 효능을 제공하는 혈액 또는 혈장 또는 혈청 내의 폴리펩타이드 접합체의 농도 수준의 범위를 의미한다. 농도 수준의 범위는 치료 반응을 초래하는 최소 농도로부터 허용할 수 없는 독성을 유도하지 않으면서 치료 반응을 제공하는 최대 농도까지일 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 유사한 생체내 연구 조건 하에서 그리고 동일한 유형의 실험 동물에서 결정된 바와 같이, 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드와 비교하여 치료 효능의 연장된 지속 기간을 제공한다. 이러한 확장된 치료 효능은 시간-반응 곡선에 대한 곡선하 면적(AUC)을 특징으로 할 수 있으며, 이는 대사 병태를 갖는 대상체(예컨대, 질환 모델 동물)에서 의도된 치료 효과를 제공하기에 적합한 단일 용량 후 또는 반복 용량 후에 플롯팅될 수 있다. 연장된 치료 효능 지속 기간은 또한 치료 반응의 지속 기간을 특징으로 할 수 있다.
특정 구현예에서, 치료 반응은 체중의 감소, 음식 섭취의 감소, 또는 글루코스 수준의 감소(공복 글루코스 수준 또는 비공복 글루코스 수준)를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 유사한 생체내 연구 조건 하에서 그리고 동일한 유형의 실험 동물에서 결정된 바와 같이, 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%까지 시간-반응 곡선에 대한 AUC의 증가를 갖는다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중접합된 폴리펩타이드 접합체는 유사한 생체내 연구 조건 하에서 그리고 동일한 유형의 실험 동물에서 결정된 바와 같이, 펩타이드 링커가 없고 GLP-1 상에 접합된 CRM을 갖는 비교 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 세마글루타이드보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 120%, 150%, 180%, 200%, 200%, 300%, 또는 400%까지 치료 반응의 지속 기간의 증가를 갖는다. 특정 구현예에서, 치료 반응을 위한 실험 동물은 질환 모델 동물, 예컨대 db/db 마우스, 또는 식이 유도 비만(DIO) 동물이다.
GLP-1 수용체 작용제
GLP-1 수용체 작용제는 수용체의 천연 리간드 및 천연 리간드와 유사하거나 이의 30%, 40% 또는 50% 이상의 작용제 활성을 나타내는 인위적으로 설계되거나 변형된 분자 모두를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, GLP-1 수용체 작용제는 천연 GLP-1, 옥시토모둘린, 엑센딘-4, 엑세나티드, 베이나글루타이드, 에페글레나타이드, 랑글레나타이드, 세마글루타이드, 타스포글루타이드, 페가파모두타이드, 리라글루타이드, 알비글루타이드, 둘라글루타이드, 또는 릭시세나타이드의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, GLP-1 수용체 작용제는 GLP-1을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "글루카곤 유사 펩타이드-1" 또는 "GLP-1"은 천연 GLP-1 펩타이드 및 그의 모든 기능적 형태, 예컨대 그의 기능적 변이체, 단편, 융합체, 유도체 및 모방체를 광범위하게 포괄하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "천연 GLP-1 펩타이드"는 천연 인간 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1(7-37))을 지칭하며, 그 서열은 서열번호: 1에 제시되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 서열번호: 1(즉, GLP-1(7-37)) 내의 특정 아미노산 잔기를 언급할 때, GLP-1(1-37)의 넘버링을 따른다. 즉, 서열번호: 1은 GLP-1(7-37)에 상응하고, 따라서 서열번호: 1에서의 1번째 잔기(히스티딘(H))는 7H로 지칭되며, 이는 그것이 GLP(1-37) 내의 7번째 잔기에 상응한다는 것을 의미하며; 서열번호: 1 내의 31번째 잔기(이는 글리신(G)임)는 37G로 지칭되고, 이는 GLP(1-37) 내의 37번째 잔기에 상응한다는 것을 의미한다.
천연 GLP-1 펩타이드의 기능적 형태는 천연 GLP-1 펩타이드과 유사하거나 이의 약 20% 이상(또는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상)의 수준으로 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있다. GLP-1 수용체의 활성화는 전형적으로 당업계에 공지된 바와 같이 인슐린분비성 작용 또는 다른 생리학적 효과를 초래하는 신호 전달 경로를 개시한다. 천연 GLP-1 펩타이드의 기능적 형태는 서열번호: 1에 대해 하나 이상의 치환, 부가, 또는 결실을 함유할 수 있다. 천연 GLP-1 펩타이드의 많은 기능적 형태, 예를 들어, 비제한적으로, 리라글루타이드, 세마글루타이드, 둘라글루타이드, 알비글루타이드, 및 WO2000055203A1, WO 98/08871, WO 2006/097537에 개시된 것이 당업계에 알려져 있으며, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 포함된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 GLP-1은 서열번호: 1의 실질적인 생물학적 활성을 보유하면서 서열번호: 1에 대해 적어도 70%(예컨대, 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, GLP-1은 서열번호: 1의 실질적인 생물학적 활성을 보유하면서 서열번호: 1에 대해 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 돌연변이(예컨대 부가, 결실, 치환)를 포함한다. 특정 구현예에서, GLP-1은 서열번호: 1의 실질적인 생물학적 활성을 보유하면서 서열번호: 1에 대해 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 돌연변이(예컨대, 부가, 결실, 치환)를 포함한다.
당업자는 다양한 아미노산 치환, 예컨대, 보존적 아미노산 치환이 반드시 그의 활성을 감소시키는 것은 아니지만 본원에 기재된 임의의 폴리펩타이드 단편의 서열에서 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 아미노산 치환의 예는 그의 상응하는 D-아미노산을 L-아미노산으로 치환하는 것, 호모시스테인 또는 티올 함유 측쇄를 갖는 다른 비천연 아미노산을 시스테인으로 치환하는 것, 호모리신, 디아미노부티르산, 디아미노프로피온산, 오르니틴 또는 아미노 함유 측쇄를 갖는 다른 비천연 아미노산을 리신으로 치환하는 것, 또는 노르발린을 알라닌으로 치환하는 것 등을 포함한다.
다양한 치환이 천연 GLP-1 펩타이드에 도입되었고, 이는 그의 생물학적 활성을 유지하거나 심지어 개선할 수 있는 것으로 나타났다. 특정 구현예에서, GLP-1은 A8, G22, Q23, E27, K26, A30, K34, R36, 및 H7로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 하나 이상의 돌연변이, 및/또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나 이로 이루어진다. 예를 들어, A8에서의 치환은 잔기에서 DPP4 효소 절단을 방지하는데 유용하고, G22에서의 치환은 활성 및 용해도를 개선시키는 데 바람직하며, R36에서의 치환은 면역원성을 감소시키는 데 유용한 것으로 여겨진다. 이들 위치에서의 치환의 예는, 비제한적으로, H7IA, H7IPA, A8G, A8S, A8V, A8Aib, A8T, A8I, A8L, G22E, K34R, R36G뿐만 아니라 그 전체가 본원에 포함된 미국 특허 제8,273,854호에 기재된 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 치환은 보존적 치환을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, GLP-1 내의 잔기의 넘버링은 GLP-1(7-37)로도 공지된 서열번호: 1에 제시된 31개의 아미노산 서열을 참조하여 언급되며, 여기서 잔기 7은 히스티딘(H7, 즉 서열번호: 1 내의 제1 잔기)이고 잔기 37은 글리신(G37, 즉 서열번호: 1 내의 마지막 잔기)이다.
특정 구현예에서, GLP-1은 A8G, A8S, A8V, A8Aib, A8T, A8I 및 A8L로 이루어진 군에서 선택되는 A8의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, GLP-1은 G22E의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, GLP-1은 R36G의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, GLP-1은 H7IA 또는 H7IPA인 H7의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, GLP-1은 K34R인 K34의 치환을 포함한다.
특정 구현예에서, GLP-1은 H7, A8, G22, K34, 및 R36으로 이루어진 군에서 선택되는 위치에서의 하나 이상의 치환, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, GLP-1은 H7IA, H7IPA, A8G, A8Aib, K34R, G22E, 및 R36G로 이루어진 군에서 선택되는 위치에서의 하나 이상의 치환, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구현예에서, GLP-1은 8Aib, K26R, G22E, K34R, 및 R36G로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구현예에서, GLP-1은 X7X8EGTFTSDVSSYLEX22 X23AAX26X27FI X30WLVX34GX36G (서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X7은 H, 이미다졸-4-아세테이트(IA), 또는 이미다졸프로피온산(IPA)이며; X8은 A, G, S, V, Aib, T, I, 또는 L이고; X22는 G, 또는 E이며; X23은 Q, C 또는 K이고; X26은 K, R, 또는 C이며; X26은 K, R, 또는 C이고; X27은 E, K, 또는 C이며; X30은 A, C 또는 K이고; X34는 R, K, 또는 C이며, X36은 R, 또는 G이다.
특정 구현예에서, X7은 H이고, X8은 G 또는 Aib이며, X22는 G 또는 E이고; X23은 Q, C 또는 K이며; X26은 K, R 또는 C이고; X27은 E, K, 또는 C이며; X30은 A, C 또는 K이고; X34는 K, R 또는 C이며, X36은 R, 또는 G이다.
특정 구현예에서, GLP-1은 서열번호: 1, 3-44 및 184로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, GLP-1은 하나 이하의 리신 잔기를 포함한다. 특정 구현예에서, GLP-1은 하나 이하의 시스테인 잔기를 포함한다.
특정 구현예에서, GLP-1은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
서열번호: 1(WT GLP-1)
서열번호: 3(8Aib, 34R, 36G),
서열번호: 5(8Aib, 26R, 27K, 34R, 36G),
서열번호: 7(8Aib, 26R 34R, 36G),
서열번호: 8(8Aib, 22E, 34R, 36G),
서열번호: 10(8Aib, 22E, 26R, 27K, 34R, 36G),
서열번호: 12(8Aib, 22E, 26R, 34R, 36G),
서열번호: 13(8Aib, 34R),
서열번호: 15(8Aib, 26R, 27K, 34R),
서열번호: 17(8Aib, 26R, 34R),
서열번호: 18(8Aib, 22E, 34R),
서열번호: 20(8Aib, 22E, 26R, 27K, 34R),
서열번호: 22(8Aib, 22E, 26R, 34R),
서열번호: 23(8G, 34R, 36G),
서열번호: 25(8G, 26R, 27K, 34R, 36G),
서열번호: 27(8G, 26R, 34R, 36G),
서열번호: 28(8G, 22E, 34R, 36G),
서열번호: 30(8G, 22E, 26R, 27K, 34R, 36G),
서열번호: 32(8G, 22E, 26R, 34R, 36G),
서열번호: 33(8G, 34R),
서열번호: 35(8G, 26R, 34R),
서열번호: 36(8G, 22E, 34R),
서열번호: 38(8G, 22E, 26R, 27K, 34R),
서열번호: 40(8G, 22E, 26R, 34R),
서열번호: 41(8G, 22E, 36G),
서열번호: 42(8G, 36G)
서열번호: 43(8G, 22E), 및
서열번호: 44(8G).
특정 구현예에서, GLP-1은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
서열번호: 3(8Aib, 34R, 36G),
서열번호: 4(8Aib, 26C, 34R, 36G),
서열번호: 5(8Aib, 26R, 27K, 34R, 36G),
서열번호: 6(8Aib, 27C, 34R, 36G),
서열번호: 8(8Aib, 22E, 34R, 36G)
서열번호: 9(8Aib, 22E, 26C, 34R, 36G),
서열번호: 10(8Aib, 22E, 26R, 27K, 34R, 36G),
서열번호: 11(8Aib, 22E, 27C, 34R, 36G),
서열번호: 13(8Aib, 34R),
서열번호: 14(8Aib, 26C, 34R),
서열번호: 15(8Aib, 26R, 27K, 34R),
서열번호: 16(8Aib, 27C, 34R),
서열번호: 18(8Aib, 22E, 34R),
서열번호: 19(8Aib, 22E, 26C, 34R),
서열번호: 20(8Aib, 22E, 26R, 27K, 34R),
서열번호: 21(8Aib, 22E, 27C, 34R),
서열번호: 23(8G, 34R, 36G),
서열번호: 24(8G, 26C, 34R, 36G),
서열번호: 25(8G, 26R, 27K, 34R, 36G),
서열번호: 26(8G, 27C, 34R, 36G),
서열번호: 28(8G, 22E, 34R, 36G),
서열번호: 29(8G, 22E, 26C, 34R, 36G),
서열번호: 30(8G, 22E, 26R, 27K, 34R, 36G),
서열번호: 31(8G, 22E, 27C, 34R, 36G),
서열번호: 33(8G, 34R)
서열번호: 34(8G, 26C, 34R),
서열번호: 36(8G, 22E, 34R),
서열번호: 37(8G, 22E, 26C, 34R),
서열번호: 38(8G, 22E, 26R, 27K, 34R),
서열번호: 39(8G, 22E, 27C, 34R) 및
서열번호: 184(8Aib, 22E, 26C, 34R, 36G)
특정 구현예에서, GLP-1은 서열번호: 7, 8, 12, 32 및 184로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, GLP-1은 서열번호: 3, 4, 8, 28, 29 및 184로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, GLP-1은 서열번호: 3, 8 및 28로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, GLP-1은 서열번호: 7, 12 및 32로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, GLP-1은 서열번호: 4, 29 및 184로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, GLP-1은 서열번호: 7 및 32로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
펩타이드 링커
폴리펩타이드 접합체에서, GLP-1 수용체 작용제는 펩타이드 링커의 N-말단에 부착된다. GLP-1 수용체 작용제는, 예를 들어 펩타이드 결합과 같은 공유 결합과 같은 직접적인 결합을 통해 펩타이드 링커에 부착될 수 있다.
펩타이드 링커는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 펩타이드 링커는 하나 이상의 비천연 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 펩타이드 링커는 적어도 10개의 아미노산 잔기(예컨대, 적어도 15, 20, 24, 40, 50, 60, 70, 또는 80개의 아미노산 잔기)의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드 링커는 10 내지 120, 15 내지 120, 20 내지 120, 25 내지 120, 30 내지 120, 31 내지 120, 32 내지 120, 33 내지 120, 34 내지 120, 35 내지 120, 36 내지 120, 37 내지 120, 38 내지 120, 39 내지 120, 40 내지 120, 20 내지 80, 30 내지 80, 31 내지 80, 32 내지 80, 33 내지 80, 34 내지 80, 35 내지 80, 36 내지 80, 37 내지 80, 38 내지 80, 39 내지 80, 또는 40 내지 80개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드 링커는 12 내지 80, 20 내지 60, 30 내지 60, 30 내지 50, 30 내지 40, 40 내지 50, 30 내지 45, 또는 35 내지 45개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.
특정 구현예에서, 펩타이드 링커는 12-80개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.
임의의 적합한 폴리펩타이드 링커가 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 링커는 아미노산 글리신(G), 세린(S), 알라닌(A), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 시스테인(C) 및 리신(K)으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 링커는 입체적으로 방해받지 않는 대다수의 아미노산, 예컨대 글리신 및 알라닌으로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 폴리글리신, 폴리알라닌, 글리신과 알라닌의 조합(예컨대, 폴리(Gly-Ala)), 또는 글리신과 세린의 조합(예컨대, 폴리(Gly-Ser))이다.
특정 구현예에서, 펩타이드 링커는 CRM 잔기를 제외한 G, Q, A, E, P, S 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 잔기로 이루어진다.
특정 구현예에서, 펩타이드 링커는 CRM 잔기를 제외한 반복 서열의 하나 이상의 반복을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 펩타이드 링커는 반복 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개, 또는 상기 열거된 임의의 2개의 숫자에 의해 정의된 임의의 수치 범위 내의 반복을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구현예에서, 반복 서열은 G, Q, A, E, P, T 및 S로 이루어진 군에서 선택되는 4, 5 또는 6개 이하의 유형의 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 반복 서열은 G, Q, A, E, P, 및 S로 이루어진 군에서 선택되는 4, 5 또는 6개 이하의 유형의 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 반복 서열은 Q를 포함한다. 특정 구현예에서, 반복 서열은 G, A, E, P 및 S로 이루어진 군에서 선택되는 3, 4 또는 5개 이하의 유형의 아미노산 잔기 및 Q로 이루어진다.
특정 구현예에서, 반복 서열은 G, Q, A, E, 및 P로 이루어진다. 특정 구현예에서, 반복 서열은 G, Q, A 및 P로 이루어진다.
특정 구현예에서, 반복 서열은 서열번호: 45-75 및 GS로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 링커는 둘 이상의 반복 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 예를 들어, 폴리펩타이드 링커는 2, 3, 또는 4개의 상이한 반복 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드 링커는 상이한 반복 서열의 순차적 또는 탠덤 반복을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 링커는 (반복1)r(반복2)s(반복3)x(반복4)y를 포함하거나 구성하며, 여기서:
반복1, 반복2, 반복3 및 반복4는 펩타이드 결합을 통해 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 통해 연결되고;
반복1, 반복2, 반복3 및 반복4는 독립적으로 서열번호:: 45-75및 GS로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
r, s, x 및 y는 독립적으로 0 내지 30으로부터 선택되는 정수(예컨대, 0-29, 0-28, 0-27, 0-26, 0-25, 0-24, 0-23, 0-22, 0-21, 0-20, 0-19, 0-18, 0-17, 0-16, 0-15, 0-14, 0-13, 0-12, 0-11, 0-10, 0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4, 0-3, 0-2, 또는 0-1)이며, 단, r, s, x 및 y는 동시에 0이 아니다.
특정 구현예에서, x 및 y는 0이고, r, 및 s는 독립적으로 1 내지 30으로부터 선택되는 정수(예컨대, 1-29, 1-28, 1-27, 1-26, 1-25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-21, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 또는 1-2)이며, 반복1 및 반복2는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 조합이다:
a) 반복1은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
b) 반복1은 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
c) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 반복2는 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
d) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
e) 반복1은 서열번호: 49의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
f) 반복1은 서열번호: 70의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
g) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며
h) 반복1은 서열번호: 70의 서열을 포함하거나 이를 이루어지고, 반복2는 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구현예에서, r, x 및 y는 0이고, s는 1 내지 30으로부터 선택되는 정수(예컨대, 1-29, 1-28, 1-27, 1-26, 1-25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-21, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 또는 1-2)이며, 반복1은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구현예에서, y는 0이고, r, s 및 x는 독립적으로 1 내지 30으로부터 선택되는 정수(예컨대, 1-29, 1-28, 1-27, 1-26, 1-25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-21, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 또는 1-2)이며, 반복1, 반복2 및 반복3은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 조합이다:
a) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 49의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
b) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
c) 반복1은 서열번호: 70의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
d) 반복1은 서열번호: 70의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
e) 반복1은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 58의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
f) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
g) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 서열로 이루어지고,
h) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 구성한다.
특정 구현예에서, r, s, x 및 y는 독립적으로 1 내지 30으로부터 선택되는 정수(예컨대, 1-29, 1-28, 1-27, 1-26, 1-25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-21, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 또는 1-2)이며, 반복1, 반복2, 반복3 및 반복4는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 조합이다:
a) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 50의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복4는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
b) 반복1은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고; 반복3은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복4는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
c) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고; 반복3은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복4는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
d) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 58의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복4는 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
e) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 69의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복4는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구현예에서, 펩타이드 링커는 하나의 잔기가 CRM 잔기에 의해 치환된 것을 제외하고 서열번호: 76-89로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 펩타이드 링커는 서열번호: 90-117, 175, 및 176으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
CRM 잔기
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체는 CRM과 단일접합될 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 CRM 잔기는 리신 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 오직 하나의 리신 잔기를 포함한다. 이러한 구현예에서, 펩타이드 링커는 오직 하나의 리신 잔기를 포함하고, GLP-1 수용체 작용제는 리신 잔기를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체 내의 단일 생물학적 활성 펩타이드는 GLP-1을 포함하고, 천연 GLP-1 서열에서 발견되는 자연 발생 잔기, 즉 K26 및 K34는 비-리신 잔기로 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, GLP-1은 K26R, K26Q, K26A, K26G, K26H, K26S, 및 K26T로 이루어진 군에서 선택되는 K26의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, GLP-1은 K34R, K34Q, K34A, K34G, K34H, K34S, 및 K34T로 이루어진 군에서 선택되는 K34의 치환을 포함하거나 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, K26의 치환은 K26R 및 K26Q로부터 선택되고/되거나, K34에서의 치환은 K34R 및 K34Q로부터 선택된다. 명세서 전체에 걸쳐, K 잔기가 GLP-1에 존재하는 경우, K의 위치는 GLP-1(1-37)의 아미노산 서열을 참조하여 확인된다. 예를 들어, K26은 GLP-1(1-37)의 아미노산 서열을 참조하여 26번째 위치(GLP-1(7-37), 즉 서열번호: 1의 아미노산 서열에 대해 20번째 위치에 해당함)가 K임을 나타낸다. 유사하게, K34는 GLP-1(1-37)의 아미노산 서열에 대해 34번째 위치(GLP-1(7-37), 즉 서열번호: 1의 아미노산 서열에 대해 28번째 위치에 해당함)가 K임을 나타낸다.
특정 구현예에서, GLP-1은 A8, G22, E27, R36, 및 H7로 이루어진 군에서 선택되는 위치에서의 하나 이상의 추가의 돌연변이, 및/또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, GLP-1은 K26R 및 K34R을 포함한다. 특정 구현예에서, GLP-1은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
서열번호: 7(8Aib, 26R, 34R, 36G),
서열번호: 12(8Aib, 22E, 26R, 34R, 36G),
서열번호: 17(8Aib, 26R, 34R),
서열번호: 22(8Aib, 22E, 26R, 34R),
서열번호: 27(8G, 26R, 34R, 36G),
서열번호: 32(8G, 22E, 26R, 34R, 36G),
서열번호: 35(8G, 26R, 34R), 및
서열번호: 40(8G, 22E, 26R, 34R).
특정 구현예에서, 제1 CRM 잔기는 시스테인 잔기이고 폴리펩타이드 접합체는 오직 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 이러한 구현예에서, 펩타이드 링커는 오직 하나의 시스테인 잔기를 포함하고, GLP-1 수용체 작용제는 시스테인 잔기를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체 내의 단일 생물학적 활성 펩타이드 폴리펩타이드는 GLP-1을 포함한다. 천연 GLP-1은 어떠한 시스테인 잔기도 함유하지 않으며, 따라서 임의의 GLP-1 유도체(본원에 제공된 것 포함)가 시스테인 잔기를 함유하지 않는 한 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 CRM 잔기는 비천연 아미노산 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 CRM 잔기로서 오직 하나의 비천연 아미노산 잔기를 포함한다. 비천연 아미노산은 추가적인 기능 및/또는 반응성을 제공할 수 있는 다양한 작용기 또는 반응성 기를 함유할 수 있다. 본 개시내용의 융합 폴리펩타이드에 모이어티를 접합시키는 목적에 유익한 특정 비천연 아미노산은 아지드, 알킨, 알켄, 사이클로알킨 또는 할라이드를 갖는 측쇄를 갖는 것을 포함한다.
제1 CRM 잔기가 시스테인 또는 비천연 아미노산 잔기인 경우, GLP-1은 서열번호: 1, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 22, 23, 25, 27, 28, 30, 32, 33, 35, 36, 38 및 40-44로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체는 제2 CRM 잔기를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 CRM 잔기는 펩타이드 링커 내에 있다. 이러한 구현예에서, 제2 CRM 잔기는 두 CRM 잔기가 적절하게 접합될 수 있는 한, 제1 CRM 잔기로부터 임의의 적합한 거리에 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 CRM 잔기는 GLP-1 수용체 작용제, 예를 들어 GLP-1 내에 있다. 특정 구현예에서, 제2 CRM 잔기는 천연 GLP-1 서열에서 발견되는 자연 발생 잔기이거나, 또는 예를 들어 자연 발생 잔기의 치환에 의해, 또는 새로운 잔기의 삽입에 의해 도입된 잔기이다.
특정 구현예에서, 제1 및 제2 CRM 잔기는 모두 리신 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 오직 2개의 리신 잔기를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 리신 잔기는 GLP-1 내에 있고, K23, K26, K27, K30, 및 K34로 이루어진 군에서 선택된다. 특정 구현예에서, 제2 CRM 잔기는 천연 GLP-1 서열에서 발견되는 자연 발생 잔기, 예를 들어 K26 또는 K34이다. 특정 구현예에서, 제2 CRM 잔기는 도입된 잔기이다. CRM 잔기는, 예를 들어 치환이 GLP-1의 GLP-1R 작용제 활성을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 치환에 의해, 임의의 적합한 위치에서 GLP-1 서열 내로 도입될 수 있다. 제2 CRM 잔기는, 예를 들어 Q23K, E27K,또는 A30K의 치환에 의해 도입될 수 있다. 특정 구현예에서, GLP-1 내의 CRM 잔기(들) 이외의 모든 리신 잔기(들)는 비-리신 잔기로 치환되고, 이에 따라 폴리펩타이드 접합체는 CRM 잔기를 제외한 추가의 리신 잔기를 포함하지 않는다. 예를 들어, K26이 제 2 CRM 잔기인 경우, K34는 비-리신 잔기로 치환되거나 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 비-리신 잔기는 당업자에 의해 선택될 수 있으며, 예는 아르기닌(R), 글루타민(Q), 알라닌(A), 글리신(G), 히스티딘(H), 세린(S), 또는 트레오닌(T)을 포함한다.
제1 및 제2 CRM 잔기 둘다가 리신 잔기인 경우, GLP-1은 서열번호: 3, 5, 8, 10, 13, 15, 18, 20, 23, 25, 28, 30, 33, 36 및 38로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 및 제2 CRM 잔기 둘다는 시스테인 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 오직 2개의 시스테인 잔기를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 시스테인 잔기는 GLP-1 내에 있다. 특정 구현예에서, 제2 시스테인 잔기는 펩타이드 링커 내에 있다.
특정 구현예에서, 제1 및 제2 CRM 잔기 둘다는 비천연 아미노산 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 CRM 잔기로서 오직 2개의 비천연 아미노산 잔기를 포함한다.
특정 구현예에서, GLP-1 내의 시스테인 잔기 또는 비천연 아미노산 잔기는 서열번호: 1에 대해 Q23, K26, E27, A30, 및 K34로 이루어진 군에서 선택되는 위치에서의 치환에 의해 도입된다. 특정 구현예에서, GLP-1 내의 시스테인 잔기 또는 NNAA는 서열번호: 1에 대해 K26 또는 E27의 위치에서의 치환에 의해 도입된다. 특정 구현예에서, GLP-1 내의 제2 CRM 잔기는 시스테인이고, Q23C, K26C, E27C, A30C 및 K34C로 이루어진 군에서 선택되는 위치에서의 치환에 의해 도입된다.
제1 및 제2 CRM 잔기 둘다가 시스테인 잔기인 경우, GLP-1은 서열번호: 4, 6, 9, 11, 14, 16, 19, 21, 24, 26, 29, 31, 34, 37, 39 및 184로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
CRM
특정 구현예에서, CRM은 혈장 단백질 결합 모이어티, 중합체, Fc, 인간 혈청 알부민(HSA) 및 이의 기능적 단편, Xten 서열, 또는 PAS 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, Xten 서열은 WO2007103515, WO2009023270, WO2010091122, WO2011123813, WO2013130683, WO2017146979, WO2011084808, WO2013040093, WO2013122617, WO2014011819, WO2013184216, WO2014164568, WO2015023891, WO2016077505 및 WO2017040344에 기재된 아미노산 서열을 갖는 확장된 재조합 폴리펩타이드 서열이며, 이들의 개시내용은 그 전체가 포함되었다. 특정 구현예에서, 용어 "APS"와 상호교환가능하게 사용될 수도 있는 용어 "PAS"는 그 개시내용이 전체가 포함된 US8563521B2에 기재된 바와 같은 Ala, Ser, 및 Pro 잔기로 구성된 아미노산 반복을 지칭한다.
특정 구현예에서, CRM은 알부민 결합 모이어티를 포함한다. 용어 "알부민 결합 모이어티"는 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민) 또는 이의 임의의 기능적 단편과 충분한 특이성, 바람직하게는 비공유적으로 결합할 수 있는 임의의 기능적 모이어티를 의미한다. 치료적 융합 폴리펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 폴리펩타이드 복합체에 부착된 알부민 결합 모이어티는 전형적으로 인간 혈청 알부민에 대해 10 μM 미만, 바람직하게는 1 pM 미만의 친화도를 갖는다. 알부민 결합 모이어티는, 비제한적으로 알부민 결합 도메인, 합성 펩타이드로부터의 알부민 결합 서열, 및 알부민 결합 화학적 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 알부민 결합 모이어티는 스트렙토코커스 단백질 G로부터의 알부민 결합 도메인, 펩토스트렙토코커스 매그너스(Peptostreptococcus magnus) 단백질 PAB로부터의 알부민 결합 도메인, 핵심 서열 DICLPRWGCLW(서열번호: 173)를 갖는 알부민 결합 펩타이드로부터 선택된다. 알부민 결합 모이어티인 다수의 작은 펩타이드가 문헌[J. Biol Chem. 277, 38 (2002) 35035-35043]에 기재되어 있다. 또 다른 예로서, 알부민 결합 모이어티는 4-40개의 탄소 원자를 함유하는 선형 및 분지형 친유성 모이어티, 사이클로펜타노페난트렌 골격을 갖는 화합물 등으로부터 선택된다. 예를 들어, 알부민 결합 모이어티는 화학식 CH3 (CH2)vCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-의 기이고, 여기서 v는 10 내지 24의 정수이다.
특정 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 *-A-B-C-D-E의 구조 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하고, 여기서, A, B, C, D 및 E는 아미드 결합을 통해 상호연결되며, A의 * 말단은 폴리펩타이드 복합체 상의 접합가능한 잔기의 반응성 기에 연결되고, 여기서:
A는 결합,
Figure pct00059
및
Figure pct00060
로부터 선택되고 a, b, c 및 d는 독립적으로 0 내지 4의 정수이며, R1은 수소 또는 -COOH이고;
B는 결합,
Figure pct00061
및
Figure pct00062
로부터 선택되고, e는 1 내지 4의 정수이며, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고,
C는 결합 또는
Figure pct00063
이고, R2는 -CH2SO3H 또는 -COOH이며, f는 1 내지 4의 정수이고, n은 1 내지 25의 정수이며, 여기서 B가 결합이 아닌 경우, 위치 β'는 위치 β에 연결되거나, 또는 B가 결합인 경우, 위치 β'는 위치 α'에 연결되고;
D는 결합,
Figure pct00064
및
Figure pct00065
로부터 선택되고, g 및 h는 독립적으로 0 또는 1이며, R3은 H 또는 -CH2COOH이고, 여기서:
B가 결합이 아니고 C가 결합인 경우, 위치 γ'는 위치 β에 연결되며;
C가 결합이 아닌 경우, 위치 γ'는 위치 γ에 연결되고;
B가 결합이고 C가 결합인 경우, 위치 γ'는 위치 α'에 연결되며;
E는 화학식:
Figure pct00066
(I)을 갖는 산성기이고
상기 식에서 W는 -(CR4R5)l-을 나타내고,
R4 및 R5는 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, 하이드록시알킬, 아미노, 아미노알킬, 카르복실, 카르복실알킬, 알콕시, 아릴옥시, 및 카르복사미드로 이루어진 군에서 선택되며,
R6은 하이드록실 또는 NR7R8로부터 선택되고;
R7 및 R8은 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록실, 및
Figure pct00067
로 이루어진 군에서 선택되며;
l은 10 내지 20의 정수이고
여기서:
D가 결합이 아닌 경우, 위치 δ는 위치 δ'에 연결되고,
C가 결합이 아니고 D가 결합인 경우, 위치 δ는 위치 γ에 연결되며,
B가 결합이 아니고, C가 결합이며, D가 결합인 경우, 위치 δ는 위치 β에 연결되고,
A가 결합이 아니고, B, C 및 D 모두가 결합인 경우, 위치 δ는 위치 α'에 연결된다.
특정 구현예에서, CRM은 리신 잔기에 접합되고, 선택적으로 리신 잔기는 펩타이드 링커 내 또는 GLP-1 내에 있다.
특정 구현예에서, A는 결합이다.
특정 구현예에서, A는 결합이고, B는 결합 또는
Figure pct00068
이며, 여기서 e는 1, 2 또는 3이다.
특정 구현예에서, A는 결합이고, B는
Figure pct00069
이며, C는
Figure pct00070
이고, 여기서 위치 β'는 위치 β에 연결되며, 여기서 e는 1, 2 또는 3이고, f는 1, 2 또는 3이며, n은 1 또는 2이다. 특정 구현예에서, D는 결합이고, E는 화학식:
Figure pct00071
을 갖는 산성기이다. 특정 구현예에서, R2는 -COOH이고, R6은 하이드록실이다. 특정 구현예에서, W는 -(CR4R5)l-을 나타내고, R4 및 R5는 독립적으로 수소이며, l은 10 내지 20의 정수이다.
특정 구현예에서, A는 결합이고, B는 결합이며, C는 결합이다.
특정 구현예에서, A는 결합이고, B는 결합이며, C는
Figure pct00072
이고, 여기서 f는 1, 2 또는 3이며, n은 1 또는 2이다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00073
이고, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00074
이고, B는
Figure pct00075
이며, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, e는 1, 2 또는 3이며, 위치 α는 위치 α에 연결된다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00076
이고, B는
Figure pct00077
이며, C는
Figure pct00078
이고, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 위치 β'는 위치 β에 연결되며, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, e는 1, 2 또는 3이며, f는 1, 2 또는 3이고, n은 1 또는 2이다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00079
이고, B는
Figure pct00080
이며, C는 결합이고, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, e는 1, 2 또는 3이다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00081
이고, B는 결합이며, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00082
이고, B는 결합이며, C는
Figure pct00083
이고, 여기서 위치 β'는 위치 α'에 연결되고, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, f는 1, 2 또는 3이며, n은 1 또는 2이다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00084
이고, B는 결합이며, C는 결합이고, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이다.
특정 구현예에서, D는 결합이다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00085
이고, B는
Figure pct00086
이며, C는
Figure pct00087
이고, D는 결합이며, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 위치 β'는 위치 β에 연결되며, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, e는 1, 2 또는 3이며, f는 1, 2, 또는 3이고, n은 1 또는 2이다.
특정 구현예에서, D는
Figure pct00088
이고, 여기서 g는 0 또는 1이며, h는 0 또는 1이다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00089
이고, B는
Figure pct00090
또는 결합이며, C는 결합이고, D는
Figure pct00091
이며, 여기서 B가 결합이 아닌 경우, 위치 α는 위치 α'에 연결되고 위치 γ'는 위치 β에 연결되거나, B가 결합인 경우, 위치 γ'는 위치 α'에 연결되며, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, e는 1, 2 또는 3이며, g는 0 또는 1이고, h는 0 또는 1이다.
특정 구현예에서, D는
Figure pct00092
이다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00093
이고, B는
Figure pct00094
이며, C는 결합 또는
Figure pct00095
이고, D는
Figure pct00096
이며, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 여기서 C가 결합인 경우, 위치 γ'는 위치 β에 연결되거나, 또는 C가 결합이 아닌 경우, 위치 β'는 위치에 β에 연결되며, 위치 γ'는 위치 γ에 연결되고, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, e는 1, 2 또는 3이며, f는 1, 2 또는 3이고, n은 1 또는 2이다.
이러한 구현예에서, CRM은 하기 화학식(-HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO로도 지칭됨, 여기서 2XADO는 2개의 연속적인 ADO 모이어티를 의미하고, ADO는 8-아미노-3,6-디옥사옥타노산의 약어임):
Figure pct00097
의 구조를 포함한다.
특정 구현예에서, CRM은 시스테인 잔기에 접합되고, 선택적으로 시스테인 잔기는 펩타이드 링커 내 또는 GLP-1 내에 있다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00098
이고, B는
Figure pct00099
, 또는
Figure pct00100
이며, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결된다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00101
이고, B는
Figure pct00102
, 또는
Figure pct00103
이며, C는
Figure pct00104
이고, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 위치 β'는 위치 β에 연결되며, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, d는 1, 2 또는 3이며, f는 1, 2 또는 3이고, n은 1 또는 2이다. 특정 구현예에서, D는 결합이고, E는 화학식:
Figure pct00105
을 갖는 산성기이며, 여기서 위치 δ는 위치 γ에 연결된다. 특정 구현예에서, R2는 -COOH이고, R6은 하이드록실이다. 특정 구현예에서, W는 -(CR4R5)l-을 나타내고, R4 및 R5는 독립적으로 수소이며, l은 10 내지 20의 정수이다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00106
이고, B는
Figure pct00107
이며, C는
Figure pct00108
이고, D는 결합이며, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 위치 β'는 위치 β에 연결되며, 여기서 a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, d는 1, 2, 또는 3이며, f는 1, 2, 또는 3이고, n은 1 또는 2이다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00109
이고, B는
Figure pct00110
이며, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 여기서 d는 1, 2 또는 3이고, e는 1, 2 또는 3이다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00111
이고, B는
Figure pct00112
이며, C는 결합이고, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 여기서 d는 1, 2 또는 3이고, e는 1, 2 또는 3이다.
특정 구현예에서, A는
Figure pct00113
이고, B는
Figure pct00114
이며, C는 결합이고, D는
Figure pct00115
이며, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결되고, 위치 γ'는 위치 β에 연결되며, 여기서 d는 1, 2 또는 3이고, e는 1, 2 또는 3이며, g는 0 또는 1이고, h는 0 또는 1이다.
이러한 구현예에서, CRM은 하기 화학식(HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2 또는 HOOC-(CH2)20-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2로도 지칭됨):
Figure pct00116
또는
Figure pct00117
의 구조를 포함한다.
접합체
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체는 서열번호: 118-174 및 177-183으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체는 서열번호: 119, 126-128, 136-139, 147-150, 158-161, 169-174 및 177-183으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 및 리신 또는 시스테인 잔기에 부착된 CRM을 포함한다. 특정 구현예에서, CRM은 HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO(리신 접합의 경우) 또는 HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2(시스테인 접합의 경우)의 구조를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체는 서열번호: 118, 120-125, 129-135, 140-146, 151-157, 162-168, 173, 174, 및 177-183으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 및 2개의 리신 잔기에 또는 2개의 시스테인 잔기에 각각 부착된 2개의 CRM을 포함한다. 특정 구현예에서, CRM은 -HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO(리신 접합의 경우) 또는 HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2(시스테인 접합의 경우)의 구조를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체는 서열번호: 118, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 173, 174, 및 177-183으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 및 2개의 리신 잔기에 각각 부착된 2개의 CRM을 포함한다. 특정 구현예에서, CRM은 -HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO의 구조를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체는 서열번호: 119, 126, 127, 128, 136, 137, 138, 139, 147, 148, 149, 및 150으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 및 리신 잔기에 부착된 CRM을 포함한다. 특정 구현예에서, CRM은 -HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO의 구조를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체는 서열번호: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 및 177-183으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 및 2개의 시스테인 잔기에 각각 부착된 2개의 CRM을 포함한다. 특정 구현예에서, CRM은 HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2의 구조를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체는 서열번호: 158, 159, 160, 161, 169, 170, 171, 및 172로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 및 시스테인 잔기에 부착된 CRM을 포함한다. 특정 구현예에서, CRM은 HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2의 구조를 포함한다.
특정 구현예에서, CRM은 융합 폴리펩타이드 내의 비천연 아미노산 잔기에 접합된다. 특정 구현예에서, CRM은 폴리펩타이드 내의 비천연 아미노산 잔기에 접합된다.
하기 표 1은 폴리펩타이드 부분, GLP-1, 및 펩타이드 링커, 및 CRM 잔기의 서열번호를 포함하여 예시적인 폴리펩타이드 접합체 각각의 상세한 정보를 보여준다. GLP-1 내의 돌연변이뿐만 아니라 펩타이드 링커 서열 내의 반복의 서열 및 개수가 또한 나타나 있다.
표 1: 예시적인 폴리펩타이드 접합체 서열
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
Figure pct00121
**: GLP-1 내의 돌연변이는 서열번호: 1에 대한 돌연변이를 의미하며, 여기서 첫 번째 잔기는 7H이고, 마지막 잔기는 37G이다;
#: CRM 잔기(들)는 펩타이드 링커에 부착된 그의 C-말단을 갖는 GLP-1(여기서, 첫 번째 잔기는 7H임)을 함유하는 폴리펩타이드 서열에서 N부터 C까지 계수된 CRM 잔기의 위치를 의미한다.
&: 모이어티 A는 HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO 또는
Figure pct00122
를 지칭한다.
&&: 모이어티 B는 HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO-EDA-CO-CH2 또는 하기 구조:
Figure pct00123
를 지칭한다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 접합체는 하기에 도시된 구조를 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 회색 원 안에 한 글자 약어로서 표시된다:
분자 001:
Figure pct00124
분자 002:
Figure pct00125
,
또는
분자 012:
Figure pct00126
제조 방법
본 개시내용은 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체의 폴리펩타이드 부분(또는 이의 단편)을 코딩하는 단리된 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이의 중합체를 지칭한다. 명시적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열뿐만 아니라 이의 보존적으로 변형된 변이체(예컨대, 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그, SNP 및 상보적 서열을 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994) 참조).
본원에 제공된 폴리펩타이드(또는 이의 단편)를 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 재조합 기술을 사용하여 제작될 수 있다. 이를 위해, GLP-1 수용체 작용제(예컨대, GLP-1)를 코딩하는 DNA 및 펩타이드 링커를 코딩하는 DNA가 수득되고 숙주 세포에서 전사 및 발현을 허용하여 융합 폴리펩타이드를 생산하도록 작동가능하게 연결될 수 있다. 필요한 경우, 하나 이상의 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 원하는 생성물의 발현을 허용하도록 작동가능하게 연결된다.
융합 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체의 발현 또는 생산이 실현가능하고 적절한 제어 하에 있도록 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열은 선택적으로 발현 벡터에서 하나 이상의 조절 서열에 추가로 작동가능하게 연결될 수 있다.
코딩 폴리뉴클레오타이드 서열(들)은 당업계에 공지된 재조합 기술을 사용하여, 추가 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로, 비제한적으로 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터(예컨대, 원핵생물 프로모터, 예컨대 T7, T7lac, Sp6, araBAD, trp, lac, tac, pLm, A3, lac, lpp, npr, pac, syn, trc 및 T3, 또는 진핵생물 프로모터, 예컨대 SV40, CMV, 및 EF-1α), 및 전사 종결 서열을 포함한다.
벡터 및 숙주 세포
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 벡터는 클로닝 또는 유전자 발현을 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 문구 "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 다른 구현예에서, 벡터는 염색체외이다. 숙주 세포는 원하는 경우 단리될 수 있다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다.
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포는 주로 원핵생물이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 진정세균, 예컨대 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, 장내세균과(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리치아, 예컨대, E. coli, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예컨대, 살모넬라 티피무리움, 세라티아, 예컨대, 세라티아 마르세스칸스, 및 쉬겔라뿐만 아니라 바실리, 예컨대 B. 서브틸리스 및 B. 리케니포르미스, 슈도모나스, 예컨대 P. 애루지노사, 및 스트렙토마이세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물, 예컨대 효모 및 포유동물 세포(예컨대, 불멸화된 포유동물 세포)이다.
본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 벡터는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법, 예컨대, 형질전환, 형질감염 또는 형질도입을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 일 예에서, GLP-1 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있고, 이는 숙주 세포에서 봉입체로서 발현된다. 벡터는 바이러스 벡터일 수 있고, 임의의 적합한 바이러스 벡터가 이러한 능력으로 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 전술한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 프로모터 유도, 형질전환체 선택, 또는 클로닝 벡터 증폭을 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드의 발현을 허용하는 조건 하에서 본원에 제공된 숙주 세포를 배양하여 폴리펩타이드 접합체의 폴리펩타이드 부분을 얻는 단계를 포함하는, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체를 생성하는 방법을 제공한다.
본원에 제공된 폴리펩타이드 부분의 생성을 위해, 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 박테리아 성장 배지, 예컨대 Terrific 브로쓰, LB 브로쓰, LB 아가, M9 최소 배지, MagiaMedia 배지 및 ImMedia 배지(ThermoFisher)가 박테리아 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 Ham's F10(Sigma), 최소 필수 배지(MEM)(Sigma), RPMI-1640(Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Sigma)가 진핵 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 이러한 배지 중 어느 것은 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염(예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제(예컨대, HEPES), 뉴클레오타이드(예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대, 젠타마이신TM 약물), 미량 원소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제가 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택되는 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이며, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 폴리펩타이드 부분이 발현되는 조건 하에 본원에 제공된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체의 폴리펩타이드 부분을 발현시키는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드 부분은 가용성 폴리펩타이드로서 발현된다.
재조합 기술을 사용하는 경우, 본원에 제공된 폴리펩타이드는 세포내에서, 주변세포질 공간에서 생성될 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 생성물이 세포내에서 생성되는 경우, 첫 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편 중 하나인 미립자 파편은, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌[Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]은 E. coli의 주변세포질 공간으로 분비되는 단백질을 단리하는 절차를 기술한다. 간략하게, 세포 페이스트는 약 30분에 걸쳐 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 해동된다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 생성물이 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상층액은 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질분해를 억제하기 위해 전술한 단계 중 어느 하나에 포함될 수 있으며, 항생제는 우발적인 오염물질의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, 방법은 폴리펩타이드를 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
세포로부터 제조된 본원에서 제공된 폴리펩타이드는, 예를 들어 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, DEAE-셀룰로오스 이온 교환 크로마토그래피, 황산암모늄 침전, 염석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다.
단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온 교환 컬럼 상의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예컨대, 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 헤파린 SEPHAROSETM 크로마토그래피 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 회수될 항체에 따라 이용가능하다.
특정 구현예에서, 방법은 CRM을 폴리펩타이드에 접합시키는 단계를 추가로 포함한다. 폴리펩타이드는, 예를 들어 적합한 접합 반응에 의해 리신 잔기, 시스테인 잔기, 또는 비천연 아미노산에서 접합될 수 있다.
예를 들어, 리신과 같은 하나 이상의 CRM 잔기를 갖는 폴리펩타이드는 아미노 반응제와 반응할 수 있다. 특정 구현예에서, CRM은 아실화 반응에서 아실기를 통해 리신 잔기에 접합된다. 아실화 반응의 예시적인 방법은, 예를 들어 WO2009083549 및 WO2010029159에 기재되어 있으며, 그 내용은 그 전체가 본원에 포함된다. 아실화 반응에서 접합되는 CRM은 그 중에서도 카르복실산기, α,ω-지방 이산 잔기, 활성화된 에스테르, 또는 활성화된 N-하이드록시 이미드 에스테르를 함유할 수 있다. 활성화된 에스테르의 예는 N-하이드록시석신이미딜(NHS) 또는 설포-NHS 에스테르와 같은 O-석신이미드 시약 및 Traut 시약과 같은 이미도 에스테르 화합물을 포함하며, 이는 접합가능한 리신 잔기의 ε-아미노기와 반응하여 아미드 또는 아미딘 결합을 형성할 수 있다. 적합한 아미노 반응제의 추가의 예는, O-아실이소우레아, N-하이드록시 트리아졸 에스테르, 무수물, 페닐 활성 에스테르, P-하이드록사믹 활성 에스테르, 아실이미다졸, 아실벤조트리아졸, 아실 아지드, 산 할라이드, 포포늄 염, 암모늄/우로늄 염을 포함한다.
또 다른 예를 들어, 시스테인과 같은 하나 이상의 CRM 잔기를 갖는 폴리펩타이드는 티올 반응제에 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, CRM은 알킬화 반응에서 시스테인 잔기에 접합된다. 특정 구현예에서, CRM은 말레이미드 또는 아이오도아세트아미드를 통해 접합가능한 시스테인 잔기에 접합되어 탄소-황 결합을 형성한다. 특정 구현예에서, CRM은 디설파이드를 통해 접합가능한 시스테인 잔기에 접합되어 디설파이드 결합을 형성한다. 적합한 티올-반응성 기의 추가의 예는, 디에닐 설폰, α-할로아실, 또는 다른 티올-반응성 접합 파트너를 포함한다. 세부사항의 경우, 문헌[Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671]을 참조한다.
예를 들어, 비천연 아미노산 잔기(NNAA)와 같은 하나 이상의 CRM 잔기를 갖는 폴리펩타이드는 CRM에 접합되어 융합 폴리펩타이드의 NNAA와 CRM 사이에서 안정한 연결이 형성될 수 있다. 예를 들어, 케토기 또는 알데하이드 또는 β-디케토모이어티를 함유하는 NNAA는 히드라지드- 또는 O-알킬하이드록실아민-, 하이드록실아민-함유 제제와 반응하여 히드라존 또는 O-알킬화된 옥심 연결을 형성할 수 있다. 또 다른 예를 들어, 아지드기를 함유하는 NNAA는 알킨 유도체와 반응하여 구리(I) 촉매된 [3+2] 고리첨가에 의해 안정한 트리아졸 링커를 형성할 수 있다(그 반대의 경우도 마찬가지임). 또 다른 예를 들어, 아지드기를 함유하는 NNAA는 적절한 수용성 포스핀 함유 제제와 라이게이션되어 슈타우딩거(Staudinger) 라이게이션에 의해 아미드 연결을 형성할 수 있다. 또한, NNAA 내의 티오에스테르 모이어티는 아민 함유 제제와 반응하여 아미드 연결을 형성할 수 있다. NNAA와 함께 혼입된 본원에 제공된 융합 폴리펩타이드는 고리첨가 반응, 예컨대 디엔과 디에노필 사이의 (4+2) 고리첨가(딜스-알더(Diels-Alder) 반응), 1,3-쌍극성 후이스겐(Huisgen) 고리첨가를 통한 (3+2) 고리첨가, 및 니트로네-올레핀(Nitrone-olefin) 고리첨가를 통한 (3+2) 고리첨가를 통해 제제와 접합될 수 있다. 항체 접합에 적합한 고리첨가 방법은, 예를 들어 WO05003294, US20120004183, WO06009901, WO07130453 및 US 특허 6,737,236에 기재되어 있다.
또 다른 예를 들어, 폴리펩타이드는 비오틴에 접합된 다음, 아비딘에 접합된 CRM에 간접적으로 접합될 수 있다. 또 다른 예를 들면, 융합 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체는 커플링제에 연결될 수 있고, 이는 CRM에 추가로 연결된다. 커플링제의 예는 이작용성 모이어티, 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예컨대, 디석신이미딜 수헤레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 his-활성 불소 화합물(예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 포함한다. 특히 바람직한 커플링제는 디설파이드 연결을 제공하기 위해 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP)(Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) 및 N-석신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트(SPP)를 포함한다.
폴리펩타이드에 대한 CRM의 접합을 위한 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 5,208,020; 미국 특허 6,4411,163; WO2005037992; WO2005081711; 및 WO2006/034488에서 발견되며, 이들은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본 개시내용의 접합체를 제조하는 방법의 구체적인 예가 또한 본 개시내용의 실험 부분에 포함되어 있다.
약학 조성물
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 또한 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
용어 "약학적으로 허용되는"은 지정된 담체, 비히클, 희석제, 부형제(들), 및/또는 염이 일반적으로 다른 성분을 포함하는 제제와 화학적으로 및/또는 물리적으로 양립가능하고, 이의 수용자와 생리학적으로 양립가능하다는 것을 나타낸다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외의 약학적 제제 내의 성분을 지칭하며, 이는 생체활성 허용가능하고 대상체에게 비독성이다. 본원에 개시된 약학 조성물에 사용하기 위한 약학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어, 약학적으로 허용되는 액체, 겔, 또는 고체 담체, 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장화제, 완충제, 항산화제, 마취제, 현탁/분산제, 금속이온봉쇄제 또는 킬레이트화제, 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비독성 보조 물질, 당업계에 공지된 다른 성분, 또는 이들의 다양한 조합을 포함할 수 있다.
적합한 구성요소는, 예를 들어, 항산화제, 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 보존제, 윤활제, 방향제, 증점제, 착색제, 유화제 또는 안정화제, 예컨대 당 및 사이클로덱스트린을 포함할 수 있다. 적합한 항산화제는, 예를 들어 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 나트륨 티오설페이트, 백금, 카탈라제, 시트르산, 시스테인, 티오글리세롤, 티오글리콜산, 티오소르비톨, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 및/또는 프로필 갈레이트를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 본원에 제공된 약학 조성물에 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제를 포함시키는 것은 폴리펩타이드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩타이드 복합체의 산화를 감소시킨다. 이러한 산화의 감소는 결합 친화도의 손실을 방지하거나 감소시켜, 항체 안정성을 개선하고 저장 수명을 극대화시킨다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 개시된 융합 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 복합체 또는 접합체 및 하나 이상의 항산화제, 예컨대 메티오닌을 포함하는 조성물이 제공된다.
추가로 예시하기 위해, 약학적 허용가능한 담체는, 예를 들어 수성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사, 링거 주사, 등장성 덱스트로스 주사, 멸균수 주사, 또는 덱스트로스 및 락테이티드 링거 주사, 비수성 비히클, 예컨대 식물 기원의 고정유, 면실유, 옥수수유, 참깨유, 또는 땅콩유, 정균 또는 진균 농도의 항미생물제, 등장화제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스, 완충제, 예컨대 포스페이트 또는 시트레이트 완충제, 항산화제, 예컨대 나트륨 바이설페이트, 국소 마취제, 예컨대 프로카인 하이드로클로라이드, 현탁 및 분산제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 또는 폴리비닐피롤리돈, 유화제, 예컨대 폴리소르베이트 80(TWEEN-80), 금속이온봉쇄제 또는 킬레이트화제, 예컨대 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 EGTA(에틸렌 글리콜 테트라아세트산), 에틸 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 수산화나트륨, 염산, 시트르산, 또는 락트산을 포함할 수 있다. 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드를 포함하는 담체로서 이용되는 항미생물제는 다중 용량 용기 내의 약학 조성물에 첨가될 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 또는 에탄올을 포함할 수 있다. 적합한 비독성 보조 물질은, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해도 향상제, 또는 제제, 예컨대 아세트산나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 또는 사이클로덱스트린을 포함할 수 있다.
약학 조성물은 액체 용액, 현탁액, 유화액, 환제, 캡슐, 정제, 서방형 제제, 또는 분말일 수 있다. 경구 제제는 표준 담체, 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐 피롤리돈, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함할 수 있다.
구현예에서, 약학 조성물은 주사가능한 조성물로 제제화된다. 주사용 약학 조성물은 임의의 통상적인 형태, 예를 들어 액체 용액, 현탁액, 유화액, 또는 액체 용액, 현탁액, 또는 유화액을 생성하기에 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다. 주사용 제제는 주사를 위해 준비가 된 멸균 및/또는 비발열 용액, 피하주사 정제를 포함하여 사용 직전에 용매와 조합될 준비가 된 동결건조된 분말과 같은 멸균 건조 가용성 생성물, 주사 준비가 된 멸균 현탁액, 사용 직전에 비히클과 조합될 준비가 된 멸균 건조 불용성 제품, 및 멸균 및/또는 비발열 유화액을 포함할 수 있다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다.
특정 구현예에서, 단위 용량 비경구 제제는 앰플, 바이알 또는 바늘이 있는 주사기에 포장된다. 비경구 투여를 위한 모든 제제는 당업계에 공지되어 있고 실시되는 바와 같이 멸균이고 비발열이어야 한다.
특정 구현예에서, 멸균, 동결건조된 분말은 본원에 개시된 폴리펩타이드 접합체를 적합한 용매에 용해시킴으로써 제조된다. 용매는 분말 또는 분말로부터 제조된 재구성된 용액의 안정성 또는 다른 약리학적 성분을 개선하는 부형제를 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 비제한적으로, 물, 덱스트로스, 소르비톨, 프럭토스, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스 또는 다른 적합한 제제를 포함한다. 용매는 완충제, 예컨대 시트레이트, 나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 일 구현예에서, 약 중성 pH의 당업자에게 공지된 다른 이러한 완충제를 함유할 수 있다. 당업자에게 공지된 표준 조건 하에서 용액의 후속 멸균 여과 후 동결건조는 바람직한 제제를 제공한다. 일 구현예에서, 생성된 용액은 동결건조를 위해 바이알에 분배될 것이다. 각각의 바이알은 본원에 제공된 융합 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 복합체, 또는 접합체 또는 이들의 조성물의 단일 투여량 또는 다중 투여량을 함유할 수 있다. 정확한 샘플 인출 및 정확한 투약을 용이하게 하기 위해 하나의 용량 또는 용량 세트에 필요한 것을 초과하는 소량(예컨대, 약 10%)을 갖는 과충전 바이알이 허용가능하다. 동결건조된 분말은 약 4℃ 내지 실온과 같은 적절한 조건 하에서 저장될 수 있다.
동결건조된 분말을 주사용수로 재구성하는 것은 비경구 투여에 사용하기 위한 제제를 제공한다. 일 구현예에서, 재구성을 위해 멸균 및/또는 비발열수 또는 다른 액체 적합한 담체가 동결건조된 분말에 첨가된다. 정확한 양은 주어지는 선택되는 요법에 의존하며, 경험적으로 결정될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물의 투여는 통상의 기술을 가진 의사에 의해 효과적인 것으로 알려진 임의의 경로를 통해 이루어질 수 있다. 일 예는 멸균 주사기 또는 일부 다른 기계적 장치, 예컨대 주입 펌프에 의한 말초 비경구 투여이다. 특정 구현예에서, 말초 비경구 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 또는 복강내 투여 경로이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드 접합체는 비경구 경로 투여, 예컨대 경구, 직장, 비강, 또는 하부 호흡기 경로 투여에 적합한 형태로 제제화된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드 접합체는 동결건조 또는 분무 건조와 같은 고체 제제로 제제화되고, 이어서 투여 전에 적합한 희석제 용액에서 재이루어진다. 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)]에 기재된 것과 같은 표준 약학적 제제 기술이 이용될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 폴리펩타이드 접합체는 혀, 설하, 협측, 입내, 경구, 위 및 장내, 비강, 폐, 예를 들어, 세기관지 및 폐포 또는 이들의 조합을 통해, 표피, 진피, 경피, 질, 직장, 안구, 예를 들어 결막을 통해, 요도, 경피, 또는 폐 경로를 통해 투여되도록 제제화될 수 있다. 또 다른 옵션으로서, 본원에 기재된 폴리펩타이드 접합체는 경피 투여를 통한 투여, 예를 들어 무바늘 주사에 의해 또는 패치로부터, 선택적으로 이온영동 패치, 또는 경점막, 예를 들어 협측 투여를 통해 투여되도록 제제화될 수 있다.
치료 방법
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 대사 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여, 병태 또는 장애를 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는 치료 방법이 또한 제공된다. 특정 구현예에서, 대상체는 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체에 반응할 가능성이 있는 장애 또는 병태를 갖는 것으로 확인되었다.
특정 구현예에서, 대사 장애는 당뇨병, 비만, 과체중, 비알콜성 지방간염(NASH), 심혈관 유사 이상지질혈증, 동맥경화증, 알콜성 지방간염(ASH), 당뇨병성 신증, 임신성 당뇨병, 대사 증후군, 예컨대 대사 증후군 X, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 말기 간 질환, 간 지방증(지방간), 간경변, 또는 원발성 담즙성 간경변증(PBC)이다.
특정 구현예에서, 병태 당뇨병은 모든 형태의 당뇨병, 예컨대 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 1형 당뇨병, 비인슐린 의존성 당뇨병, 저연령대 성숙기 발병 당뇨병(MODY), 임신성 당뇨병, 및/또는 HbA1c의 상승된 수준을 포함한다.
특정 구현예에서, 병태는 당뇨병 합병증, 예컨대 혈관병을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 체중을 관리하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 음식 섭취를 감소시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 체중을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체를 사용하여 치료 또는 개선될 수 있는 병태 또는 대사 장애는 인간 대상체가 125 mg/dL 이상, 예를 들어 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 또는 200 mg/dL 초과의 공복 혈당 수준을 갖는 병태를 포함한다. 혈당 수준은 섭식 또는 금식 상태에서 또는 무작위로 결정될 수 있다. 대사 병태 또는 장애는 또한 대상체가 대사 병태를 발병할 위험이 증가된 병태를 포함할 수 있다. 인간 대상체의 경우, 이러한 병태는 100 mg/dL의 공복 혈당 수준을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체를 사용하여 치료 또는 개선될 수 있는 병태 또는 대사 장애는 인간 대상체가 적어도 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 또는 그 이상의 체질량 지수(BMI)를 갖는 병태를 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 대상체는 25 내지 30, 26 내지 30, 27 내지 30, 28 내지 30, 25 내지 29, 또는 25 내지 28 범위의 BMI를 갖는다.
본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체의 치료적 유효량은, 예를 들어 체중, 연령, 과거 병력, 현재 약물 치료, 대상체의 건강 상태 및 교차 반응의 가능성, 알레르기, 민감성 및 부작용뿐만 아니라 투여 경로 및 질환 발병 정도와 같은 당업계에 공지된 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 투여량은 이들 및 다른 상황 또는 요건에 의해 지시된 바와 같이 당업자(예컨대, 의사 또는 수의사)에 의해 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 치료적 유효량은 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화 또는 개선을 포함하는, 연구자, 의사, 또는 다른 임상의에 의해 추구되는 조직계, 동물, 또는 인간에서 생물학적 또는 의약 반응을 유도하는 본원에 제공된 융합 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 복합체 및 접합체의 양, 즉, 하나 이상의 원하는 생물학적 또는 의약 반응, 예를 들어 혈당, 인슐린, 트리글리세라이드, 또는 콜레스테롤 수준의 저하; 체중 감소; 또는 글루코스 내성, 에너지 소비, 또는 인슐린 민감성 개선의 관찰가능한 수준을 지지하는 양일 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체는 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg(예컨대, 약 0.01 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 55 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 65 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 75 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 85 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 95 mg/kg, 또는 약 100 mg/kg)의 치료적 유효 투여량으로 투여될 수 있다. 이들 구현예 중 특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체는 약 50 mg/kg 이하의 투여량으로 투여되고, 이들 구현예 중 특정 구현예에서, 투여량은 10 mg/kg 이하, 5 mg/kg 이하, 1 mg/kg 이하, 0.5 mg/kg 이하, 또는 0.1 mg/kg 이하이다. 특정 구현예에서, 투여량은 치료 과정 동안 변할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 초기 투여량은 후속 투여량보다 높을 수 있다. 특정 구현예에서, 투여량은 대상체의 반응에 따라 치료 과정 동안 달라질 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체는 매일 1회, 3일마다 1회, 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 매월 1회보다 더 빈번하지 않은 투여 요법으로 대상체(예컨대, 인간)에게 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체는 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 매월 1회의 투여 간격으로 대상체(예컨대, 인간)에게 투여될 수 있다. 낮은 투여 빈도의 치료 효능은 환자의 순응도와 장기적인 치료 성공을 개선할 가능성이 있다. 현재 이용가능한 치료 세마글루타이드는 매주 1회 투여된다. 임의의 이론에 얽매이지 않으면서, 본원에 제공된 특정 폴리펩타이드 접합체는 유의하게 연장된 반감기를 가지며, 대사 병태를 치료하기 위해 세마글루타이드보다 덜 빈번한 투약, 예를 들어, 매주 1회 투여보다 덜 빈번한(예컨대, 8일마다 1회, 9일마다 1회, 10일마다 1회, 11일마다 1회, 12일마다 1회, 13일마다 1회, 14일마다 1회, 18일마다 1회, 3주마다 1회, 24일마다 1회, 4주마다 1회, 또는 매월 1회) 투여에 적합한 것으로 여겨진다. 특정 구현예에서, 투여 요법은 매주 2회 투약, 매주 1회 투약, 격주 1회 투약, 3주마다 1회 투약, 매월 1회 투약, 또는 2개월마다 1회 투약으로부터 선택되는 연속 투여 요법이다. 특정 구현예에서, 투여 요법은 3일마다 약 1회 내지 매월 약 1회, 또는 매주 약 1회 내지 매월 약 1회의 범위의 투여 간격을 갖는다.
투여 요법은 최적의 원하는 반응(예컨대, 치료 반응)을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 예를 들어, 단일 용량이 투여될 수 있거나, 또는 몇 개의 분할 용량이 시간이 지남에 따라 투여될 수 있다.
본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체는 당업계에 공지된 임의의 경로, 예를 들어 비경구(예컨대, 피하, 복강내, 정맥내 주입을 포함하는 정맥내, 근육내, 또는 피내 주사) 또는 비경구(예컨대, 경구, 비강내, 안구내, 설하, 직장 또는 국소) 경로에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체는 피하, 정맥내, 근육내 또는 피내로 투여된다.
폴리펩타이드 접합체는 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 치료 수단 또는 제제와 조합하여 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 대사 질환을 치료하기 위해 사용될 때, 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체는 대사 질환 또는 관련된 임의의 의학적 장애의 치료에 사용하기 위해 임의의 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 "조합으로 투여된"은 동일한 약학 조성물의 일부로서 동시에, 별개의 조성물로서 동시에, 또는 별개의 조성물로서 상이한 시간에 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 작용제 이전 또는 이후에 투여된 조성물은 조성물 및 제2 제제가 상이한 경로를 통해 투여되는 경우에도 문구가 본원에 사용되는 바와 같이 상기 제제와 "조합하여" 투여되는 것으로 간주된다. 가능한 경우, 본원에 제공된 융합 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 복합체 또는 접합체와 조합하여 투여되는 추가 치료제는 추가 치료제의 제품 정보 시트에 열거된 스케줄에 따라, 또는 의사용 탁상 편람(Physicians' Desk Reference, 70th Ed(2016)) 또는 당업계에 잘 알려진 프로토콜에 따라 투여된다. 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체를 포함하는 약학 조성물과 조합하여 투여될 수 있는 화합물의 예의 비제한적인 목록은 로시글리티존, 피오글리티존, 레파글리니드, 나테글리티니드, 메트포르민, 엑세나티드, 스티아글립틴, 프람린티드, 글리피지드, 글리메프리리데아카보스, 및 미글리톨을 포함한다.
키트
개시된 방법을 실행하기 위한 키트가 또한 제공된다. 이러한 키트는 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체를 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 세포, 및 이러한 핵산 함유 화합물을 포함하는 약학 조성물을 포함하는 본원에 기재된 것과 같은 약학 조성물을 포함할 수 있으며, 이는 멸균 용기에 제공될 수 있다. 선택적으로, 대사 장애의 치료에 상기 제공된 약학 조성물을 사용하는 방법에 대한 지침이 또한 포함되거나 환자 또는 의료 서비스 제공자에게 이용가능하게 될 수 있다.
일 양태에서, 키트는 (a) 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체 또는 이의 돌연변이체 형태의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물; 및 (b) 약학 조성물을 위한 하나 이상의 용기를 포함한다. 이러한 키트는 또한 이의 사용을 위한 지침을 포함할 수 있고; 지침은 치료 중인 정확한 대사 장애에 맞게 조정될 수 있다. 지침은 키트에 제공된 물질의 용도 및 성질을 기술할 수 있다. 특정 구현예에서, 키트는 환자가 대사 장애, 예컨대 상승된 글루코스 수준, 상승된 인슐린 수준, 당뇨병, 비만, 비알콜성 지방간염(NASH), 심혈관 유사 이상지질혈증, 동맥경화증, 알콜성 지방간염(ASH), 당뇨병성 신증, 대사 증후군, 예컨대 대사 증후군 X, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 말기 간 질환, 간 지방증(지방간), 간경변 또는 원발성 담즙 성 간경변(PBC)을 치료하기 위한 투여를 수행하기 위한 지침을 포함한다.
지침은 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기판 상에 인쇄될 수 있고, 패키지 삽입물로서 키트 내에, 키트 또는 그 구성요소(예컨대, 포장과 관련된)의 라벨링 등에 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 지침은 적합한 컴퓨터 판독가능한 저장 매체, 예컨대 CD-ROM, 디스켓 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다. 또 다른 구현예에서, 실제 지침은 키트에 존재하지 않지만, 원격 소스로부터, 예컨대 인터넷을 통해, 지침을 획득하기 위한 수단이 제공된다. 이러한 구현예의 일 예는 지침이 보여질 수 있고/거나 지침이 다운로드될 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 종종 키트의 일부 또는 모든 구성요소가 멸균을 유지하기 위해 적합한 포장에 포장되는 것이 바람직할 것이다. 키트의 구성요소는 키트 봉쇄 요소에 포장되어 단일, 취급이 용이한 유닛을 만들 수 있으며, 여기서 키트 봉쇄 요소, 예컨대 상자 또는 유사한 구조는, 예컨대 키트의 구성요소의 일부 또는 모두의 멸균을 추가로 보존하기 위해, 밀폐 용기일 수도 있고 아닐 수도 있다.
실시예 1: GLP-1 단백질의 재조합 발현 및 정제
표 1에 열거된 GLP-1 단백질을 BL21(DE3) 유래 균주를 사용하여 박테리아 E. coli 발현 시스템으로부터 생산하였다. GLP-1 전구체를 코딩하는 DNA를 E. coli 발현을 위해 코돈 최적화하고, 드 노보 합성하고, PET 유도체 발현 벡터(Novagen) 내로 서브클로닝하였다. 상응하는 유전자 코드의 변형에 의해 아미노산 치환을 달성하였다. 세포 밀도가 Terrific Broth(TB) 배지에서 2.0의 OD600에 도달했을 때, 0.5 mM 이소프로필 b-d-티오갈락토사이드(IPTG)로 GLP-1 전구체의 과발현을 유도하였다. 37℃에서 20-22시간 동안 단백질 유도 후, 세포를 채취하였다. 세포를 채취하고, 세포 파쇄인자(900 bar, 2회)에 의해 20 mM Tris pH8.0, 0.15 M NaCl 완충액에서 용해시켰다. GLP-1 단백질을 함유하는 가용성 분획을 원심분리(8,000 X g, 30분 동안)에 의해 수집하였다. 프로테아제에 의해 태그를 제거한 후, 단백질을 역상 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정확한 분자량을 확인하기 위해 각 단계의 샘플을 LC/MS로 규명하였다.
실시예 2: 재조합 단백질에 비단백질성 아미노산의 혼입
N-말단 His-Aib-Glu-Gly 테트라펩타이드 또는 His-Aib 디펩타이드를 유기 용매에 용해시키고, 유기 용매 중의 GLP-1 단백질의 용액에 첨가하였다. 반응을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 그 다음, 피페리딘을 반응 용액에 첨가하여 Fmoc 보호기를 제거하였다.
실시예 3: CRM을 갖는 GLP-1 화합물의 제조
NaOH 중의 GLP-1 단백질의 용액에 유기 용매 중의 CRM 시약(즉, HOOC-(CH2)16-CO-gGlu-2XADO)을 적가하였다. 반응을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 생성물을 역상 크로마토그래피에 적용하였다. 이는 상기 나타낸 바와 같이 표 1에 열거된 바와 같은 화합물을 제공하였다.
상기 접합된 GLP-1 단백질을 검출하고, 공급업체의 매뉴얼에 따라 상이한 접합체에 최적화된 조건을 사용하여, Waters BioAccord LC-MS 시스템을 사용한 LC-MS 방법에 의해 또는 Waters Acquity UPLC 시스템을 사용한 UPLC에 의해 규명하였다.
실시예 4: 시험관내 활성
방법: 1% 인간 혈청 알부민(HSA)을 갖거나 갖지 않는 인간 GLP-1 수용체 및 CRE 루시퍼라제 리포터를 과발현하는 BHK 세포주를 사용하여 시험관내 GLP-1 활성을 측정하였다. 시험된 융합 단백질을 3배 연속 희석으로 1% HSA의 부재 또는 존재 하에 있을 때 최고 농도로서 1 nM 또는 100 nM에서 측정하였다. 세포를 4시간 동안 분자로 처리한 후, 루시퍼라아제 활성을 Steadylite plus 키트(Perkin Elmer, 6066751)에 의해 측정하였다.
각 단백질의 활성을 비선형 회귀 분석으로부터 유래된 EC50으로 나타내었다.
결론: 거의 모든 분자들은 HSA 보충제가 없는 분석에서 세마글루타이드보다 비슷하거나 더 나은 효능을 나타낸다. 그러나, 상이한 분자들은 1% HSA의 존재 하에 GLP-1 활성의 상이한 정도의 감소(즉, 증가된 EC50)를 나타내었다. 표 2의 데이터는 링커 길이, 지방산 위치 및 접합된 지방산 모이어티의 수가 GLP-1 활성과 관련될 수 있음을 시사하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 짧은 링커 길이(즉, 12개의 아미노산 잔기)를 갖는 분자들(모노 아실화 또는 이중 아실화이든 간에)은 더 긴 링커 길이를 갖는 분자와 비교하여 유의하게 감소된 GLP1 활성을 가지고 있었다. GLP-1의 C-말단 잔기와 CRM 잔기(즉, 링커 내의 리신) 사이의 거리가 증가함에 따라, HSA의 존재 하에 분자들의 GLP-1 활성은 꾸준히 개선된 것으로 보였다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 모노 아실화된 분자 002, 010 및 011은 1% HSA의 존재 하에 세마글루타이드보다 훨씬 더 높은 활성을 나타내었다. 이중 아실화된 분자 012, 016, 004, 006, 007, 005, 001 및 061의 경우, 모두 세마글루타이드보다 1% HSA의 존재 하에 상대적으로 낮은 GLP-1 활성을 나타내었지만, 여전히 허용가능한 범위에 있었다.
표 2. GLP-1 폴리펩타이드 접합체의 시험관내 활성. 시험관내 GLP-1 활성을 측정하기 위해, 인간 GLP-1 수용체를 과발현하는 BHK 세포주를 사용하였다.
Figure pct00127
실시예 5: C57 마른 마우스에서의 생체내 활성
방법: 10주령의 수컷 C57BL/6 마우스에게 1일에 1회 단백질을 피하 주사하였다. 체중을 매일 측정하고 각 처리군에 대해 5마리의 동물을 사용하였다. 각 개별 동물에 대해 체중을 모니터링하였다. %BW 손실 = 100 *(n일의 BW-1일의 BW)/(1일의 BW). 데이터는 평균값 및 표준 오차(SEM)로 표시된다. 0부터 8일까지 체중 손실(%)에 대한 곡선하 면적(AUC △BW 0-8d)을 계산하였다.
결론: 분자 001, 002 및 012는 체중 제어에 대한 용량 의존적 효능을 나타내었다(도 1a, 1b, 1c 및 표 3). 도 1d 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 분자 007 및 008은 분자 012 및 016보다 더 낮은 효능을 가지며, 이는 시험관내 활성 데이터와 일치한다. 이중 지방산을 갖는 분자 001, 016 및 012는 세마글루타이드보다 더 지속가능한 효능을 나타내었으며, 이는 분자 001, 016 및 012가 더 긴 반감기를 가질 수 있음을 시사한다(도 1a, 1c 및 1d).
표 3: C57 마른 마우스 연구에서 0부터 8일까지 체중 손실(%)에 대한 곡선하 면적(AUC △BW 0-8d).
Figure pct00128
실시예 6: db/db 마우스에서의 생체내 활동
방법: 10주령의 수컷 db/db 마우스에게 단백질을 1회 피하 주사하였다. 공복 글루코스를 상이한 시간에 측정하고, 각 그룹에 대해 3마리의 동물을 사용하였다. 델타 혈당은 기저 수준에 의해 차감된 글루코스이다. 데이터는 평균값 및 표준 오차(SEM)로 표시된다.
결론: 분자 001 및 002 모두 글루코스 제어에 대한 용량 의존적 효능을 보였다(도 2a 및 2b). 이중 지방산을 갖는 분자 001은 세마글루타이드보다 더 지속가능한 효능을 나타내었고, 이는 분자 002가 더 긴 반감기를 가질 수 있음을 시사한다.
방법: 10주령의 수컷 db/db 마우스에게 단백질을 1회 피하 주사하였다. 비공복 글루코스를 상이한 시간에 측정하였고, 각 그룹에 5마리의 동물을 사용하였다. 델타 혈당은 기저 수준에 의해 차감된 글루코스이다. 데이터는 평균값 및 표준 오차(SEM)로 표시된다. 0부터 192시간까지 델타 혈당에 대한 곡선하 면적(AUC△BG 0-192h)을 계산하였다.
결론: 분자 012는 글루코스 제어에 대해 용량 의존적 효능을 나타내었다(도 2c, 표 4). 이중 지방산을 갖는 분자 012는 세마글루타이드보다 더 지속가능한 효능을 나타내었다.
표 4: 도 2c에 대해 db/db 마우스에서 0부터 192시간까지 비공복 델타 혈당(%)에 대한 곡선하 면적(AUC △BG 0-192h)
Figure pct00129
실시예 7: 약동학 측정
방법: 6-8주령의 수컷 C57BL/6 마우스에게 30 nmol/kg 단백질(n=3/그룹)을 단일 피하 용량으로 투여하였다. 혈장 샘플을 투여전(-5분), 주사 후 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 144시간, 168시간 및 192시간에 수집하였다. 혈장 내 단백질의 농도를 ELISA 분석에 의해 측정하였다. 각 단백질의 혈장 농도 대 피하 주사 후 시간을 나타내는 그래프에 기초하여, 약동학 파라미터를 WinNonlin에 의해 계산하였다.
결론: 분자 001 및 012는 마우스에서 세마글루타이드 및 분자 002보다 더 긴 반감기를 나타내었고(표 5), 이는 생체내 효능과 일치하였다.
표 5: 마우스에서 GLP-1 폴리펩타이드 접합체의 약동학 파라미터. 약동학 데이터를 WinNonlin 소프트웨어에 의해 분석하였다. 각 분자에 대해 Tmax, Cmax, T1/2, AUC를 계산하였다.
Figure pct00130
방법: 6-8주 수컷 SD 래트에게 각각 15 nmol/kg 단백질(n=3/그룹)을 단일 피하 용량으로 그리고 15 nmol/kg 단백질(n=3/그룹)을 단일 정맥내 용량으로 투여하였다. 혈장 샘플을 투여전(-5분), 피하 투여 후 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 24시간, 32시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 144시간, 168시간, 192시간, 216시간 및 240시간에 수집하였다. 혈장 샘플을 투여전(-5분), 정맥내 투여 후 0.083시간, 0.25시간, 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 24시간, 32시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 120시간에 수집하였다. 혈장 내의 폴리펩타이드 접합체의 농도를 LC-MS/MS 방법에 의해 측정하였다. 각 폴리펩타이드 접합체의 혈장 농도 대 피하 주사 후 시간을 나타내는 그래프에 기초하여, 약동학 파라미터를 WinNonlin에 의해 계산하였다.
결론: 표 6에 나타낸 바와 같이, 분자 001 및 012는 세마글루타이드보다 더 긴 반감기를 나타내었고, 이는 래트에서 12시간의 T1/2(s.c. 투여, FDA로부터의 비임상 검토에서 보고된 바와 같음)를 갖는 것으로 보고되었다.
표 6: 래트에서 GLP-1 폴리펩타이드 접합체의 약동학 파라미터. 약동학 데이터를 WinNonlin 소프트웨어에 의해 분석하였다. 각 분자에 대해 Tmax, Cmax, T1/2, AUC를 계산하였다.
Figure pct00131
방법: 10개월령 수컷 바마 미니피그에게 5 nmol/kg GLP-1 폴리펩타이드 접합체(n=2/그룹)의 단일 피하 용량 및 5 nmol/kg 단백질(n=2/그룹)의 단일 정맥내 용량을 각각 투여 하였다. 분자 012 및 세마글루타이드 그룹에 대한 혈장 샘플을 투여전(-5분), 피하 투여 후 0.5시간, 1시간, 3시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 168시간, 336시간, 504시간 및 672시간에 수집하였다. 분자 012 및 세마글루타이드 그룹에 대한 혈장 샘플을 투여전(-5분), 정맥내 투여 후 0.083시간, 0.5시간, 1시간, 3시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 168시간, 336시간 및 504시간에 수집하였다. 세마글루타이드 그룹의 경우, 혈장 내 단백질의 농도를 ELISA 분석에 의해 측정하였다. 분자 012 그룹의 경우, 혈장 내의 단백질의 농도를 LC-MS/MS 방법에 의해 측정하였다. 각 GLP-1 폴리펩타이드 접합체의 혈장 농도 대 투여 후 시간을 나타내는 그래프에 기초하여, 약동학 파라미터를 WinNonlin에 의해 계산하였다.
결론: 분자 012는 미니피그에서 세마글루타이드보다 더 긴 반감기를 나타내었다(표 7)
표 7: 미니피그에서 GLP-1 폴리펩타이드 접합체의 약동학 파라미터. 약동학 데이터를 WinNonlin 소프트웨어에 의해 분석하였다. 각 분자에 대해 Tmax, Cmax, T1/2, AUC를 계산하였다.
Figure pct00132
실시예 8: 질환 모델에서의 효능 연구
선택된 분자를 질환 동물 모델(예컨대, db/db 마우스)에서 평가하하여 만성 연구에서 용량 반응을 이용하여 체중, 음식 섭취, 글루코스 효능을 결정하였다. 공복 인슐린, 혈장 트리글리세라이드, 콜레스테롤, 간 트리글리세라이드 및 염증성 바이오마커(ALT, AST 및 CRP)를 포함하는 일부 바이오마커를 또한 측정하였다.
방법:
22주령 DIO 수컷 C57BL/6 마우스(~50 g)에게 지정된 GLP-1 폴리펩타이드 접합체(즉, 분자 012)를 25일 동안 격일 1회(Q2D) 피하 주사하였다. 음식 섭취 및 체중을 매주 2회 측정하였고, 공복 혈당을 매주 1회 측정하였다. 각 처리군에 5마리의 동물을 사용하였다. 체중 및 공복 혈당을 각 개별 동물에 대해 모니터링하였으나, 각 그룹 동물에 대한 음식 섭취는 함께 측정하였다. 1일 및 25일은 분자 투여의 첫날 및 마지막 날이다. 데이터는 평균값과 표준 오차(SEM) 또는 통합된 값으로 표시된다. 통계 분석을 일원 ANOVA에 의해 수행하였다. 25일째의 체중 감소는 -1*(%BW 손실 - 비히클 그룹의 %BW 손실)에 의해 계산되고; 누적 음식 섭취 감소는 -100*(누적 음식 섭취-비히클의 누적 음식 섭취)/비히클의 누적 음식 섭취에 의해 계산된다.
결론: DIO 연구에서, 도 3a, 3b 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 분자 012는 체중 감소, 음식 섭취 감소 및 혈당 제어에 대한 용량 의존적 효능을 나타내었다.
표 8. 25일에 DIO 마우스에서 음식 섭취 및 체중 감소
Figure pct00133
실시예 9: 비인간 영장류에서의 PK 연구
선택된 분자의 약동학을 원숭이에서 평가한다. 피하 및 정맥내 주사 모두를 수행한다.
방법: 3-5년령의 수컷 시노몰구스 원숭이에게 5 nmol/kg 단백질(n=2/그룹)의 단일 피하 용량을 투여하였다. 세마글루타이드 그룹에 대한 혈장 샘플을 투여전(-5분), 주사 후 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 144시간, 216시간, 288시간, 360시간, 432시간 및 504시간에 수집하였다. 012 그룹에 대한 혈장 샘플을 투여전(-5분), 투여 후 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 24시간, 48시간, 96시간, 120시간, 144시간, 168시간, 192시간, 216시간, 288시간, 432시간 및 504시간에 수집하였다. 세마글루타이드 그룹의 경우, 혈장 내 단백질의 농도를 ELISA 분석에 의해 측정하였다. 012 그룹의 경우, 혈장 내 단백질의 농도를 LC-MS/MS 방법에 의해 측정하였다. 각 단백질의 혈장 농도 대 피하 주사 후 시간을 나타내는 그래프에 기초하여, 약동학 파라미터를 WinNonlin에 의해 계산하였다.
결론: 분자 012는 원숭이에서 세마글루타이드 및 분자 002보다 더 긴 반감기를 나타내었다(표 9).
표 9: 시노몰구스 원숭이에서 GLP-1 폴리펩타이드 접합체의 약동학 파라미터. 약동학 데이터를 WinNonlin 소프트웨어에 의해 분석하였다. 각 분자에 대해 Tmax, Cmax, T1/2, AUC를 계산하였다.
Figure pct00134
실시예 10: 면역원성 평가
선택된 GLP-1 폴리펩타이드 접합체를 또한 인실리코(iTope 및 TCED 방법) 및 생체외(EpiScreen) 방법에 의해 면역원성에 대해 평가한다.
실시예 11: 인간 혈청 알부민 결합
방법: 혈청 알부민에 대한 분자의 결합을 Biacore 8K 기기에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 규명하였다. 상이한 종의 혈청 알부민은 4000 RU에 도달할 때까지 CM5 센서 칩 표면에 공유 결합하였다. 칩을 420초 동안 10 μL/분의 유속으로 1 M 에탄올 아민에 의해 차단시켰다. 각 분자 샘플을 희석하고 30 μL/분의 유속으로 주입하여 120초 동안 칩 결합된 알부민에 결합시키고 300초 동안 해리시켰다. 분자가 없는 결합 완충액을 20초의 유속으로 칩 위로 보내어 30초 동안 결합된 분자의 자발적인 해리를 허용하였다.
결론: 분자 004, 001, 006 및 012는 세마글루타이드 및 분자 002보다 인간 혈청 알부민의 더 높은 결합 친화도(표 10 참조)를 나타내었고, 이는 PK 데이터와 일치한다.
표 10: 인간 혈청 알부민 결합 친화도
Figure pct00135
SEQUENCE LISTING <110> BEIJING QL BIOPHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> POLYPEPTIDE CONJUGATES AND METHODS OF USES <130> 074585-8003WO03 <150> PCT/CN2020/119335 <151> 2020-09-30 <150> PCT/CN2021/099030 <151> 2021-06-09 <160> 184 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is H, imidazole-4-acetate (IA), or imidazolepropionic acid (IPA) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is A, G, S, V, Aib, T, I, or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X is G, or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X is Q, C or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> X is K, R, or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> X is E, K, or C 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Aib <400> 12 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is Aib <400> 13 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 14 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is Aib <400> 14 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 15 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is Aib <400> 15 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Lys Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 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Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Gly Gly 20 25 30

Claims (70)

  1. a) 펩타이드 링커의 N-말단에 부착된 단일 생물학적 활성 펩타이드, 및
    b) 펩타이드 링커 내의 제1 클리어런스-감소 모이어티(clearance-reducing moiety: CRM) 잔기에 접합된 제1 CRM
    을 포함하는 폴리펩타이드 접합체로서,
    생물학적 활성 펩타이드는 GLP-1 수용체 작용제를 포함하고,
    제1 CRM 잔기는 GLP-1 수용체 작용제의 C-말단 아미노산으로부터 적어도 5개의 아미노산 잔기 떨어져 있는 폴리펩타이드 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 제1 CRM 잔기는 생물학적 활성 펩타이드의 C-말단 아미노산으로부터 적어도 10, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 35, 38, 40, 45, 46, 50, 55, 58, 60, 65, 70, 75, 78개의 아미노산 잔기 떨어져 있는 폴리펩타이드 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 CRM 잔기에 접합된 제2 CRM을 추가로 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  4. 제3항에 있어서, 제2 CRM 잔기는 생물학적 활성 펩타이드 내에 있거나 펩타이드 링커 내에 있는 폴리펩타이드 접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, GLP-1 수용체 작용제는 70, 60, 또는 50개 이하의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 폴리펩타이드 접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, GLP-1 수용체 작용제는 GLP-1을 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  7. 제6항에 있어서, GLP-1은 서열번호: 1의 실질적인 생물학적 활성을 보유하면서 서열번호: 1에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리펩타이드 접합체.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, GLP-1은 서열번호: 1의 실질적인 생물학적 활성을 보유하면서 서열번호: 1에 대해 9, 8, 7, 6, 5, 또는 4개 이하의 돌연변이를 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, GLP-1은 서열번호: 1에 대해 A8, G22, Q23, E27, K26, A30, K34, R36, 및 H7, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  10. 제9항에 있어서, GLP-1은 A8Aib, G22E, K26R, K34R 및 R36G, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리펩타이드 접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 CRM 잔기는 리신 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 오직 하나의 리신 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  12. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 CRM 잔기는 둘다 리신 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 오직 2개의 리신 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  13. 제12항에 있어서, 제2 리신 잔기는 GLP-1 내에 있고, K23, K26, K27, K30 및 K34로 이루어진 군에서 임의로 선택되는 폴리펩타이드 접합체.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, GLP-1 내의 CRM 잔기(들) 이외의 모든 리신 잔기(들)는 아르기닌(R), 글루타민(Q), 알라닌(A), 글리신(G), 히스티딘(H), 세린(S), 및 트레오닌(T)으로 이루어진 군에서 임의로 선택되는 비-리신 잔기로 치환되는 폴리펩타이드 접합체.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 CRM 잔기는 시스테인 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 오직 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  16. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 CRM 잔기는 둘다 시스테인 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 오직 2개의 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  17. 제16항에 있어서, 제2 시스테인 잔기는 GLP-1 내에 있고, C23, C26, C27, C30 및 C34로 이루어진 군에서 임의로 선택되는 폴리펩타이드 접합체.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 CRM 잔기는 비천연 아미노산 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 CRM 잔기로서 오직 하나의 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  19. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 비천연 아미노산 잔기이고, 폴리펩타이드 접합체는 CRM 잔기로서 오직 2개의 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  20. 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, GLP-1은 X7X8EGTFTSDVSSYLEX22 X23AAX26X27FI X30WLVX34GX36G(서열번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X7은 H, 이미다졸-4-아세테이트(IA), 또는 이미다졸프로피온산(IPA)이고; X8은 A, G, S, V, Aib, T, I, 또는 L이며; X22는 G, 또는 E이고; X23은 Q, C 또는 K이며, X26은 K, R, 또는 C이고; X27은 E, K, 또는 C이며; X30은 A, C 또는 K이고; X34는 R, K, 또는 C이며; X36은 R 또는 G인 폴리펩타이드 접합체.
  21. 제20항에 있어서, X7은 H이고, X8은 G 또는 Aib이며, X22는 G 또는 E이고; X23은 Q, C 또는 K이며, X26은 K, R 또는 C이고; X27은 E, K, 또는 C이며; X30은 A, C 또는 K이고, X34는 K, R 또는 C이며, X36은 R 또는 G인 폴리펩타이드 접합체.
  22. 제21항에 있어서, GLP-1은 서열번호: 1, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 22, 23, 25, 27, 28, 30, 32, 33, 35, 36, 38 및 40-44로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  23. 제21항에 있어서, GLP-1은 서열번호: 3-6, 8-11, 13-16, 18-21, 23-26, 28-31, 33, 34, 36-39 및 184로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드 링커는 적어도 10개의 아미노산 잔기(예컨대, 적어도 12, 24, 32, 40, 48, 60, 또는 80개의 아미노산 잔기)의 길이를 갖는 폴리펩타이드 접합체.
  25. 제24항에 있어서, 폴리펩타이드 링커는 12-80개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 폴리펩타이드 접합체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 링커는 CRM 잔기를 제외한 G, Q, A, E, P, S 및 T로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩타이드 접합체.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드 링커는 CRM 잔기를 제외한 반복 서열의 하나 이상의 반복을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리펩타이드 접합체.
  28. 제27항에 있어서, 반복 서열은 서열번호: 45(GQEPGAQP), 서열번호: 46(GAQPGAQP), 서열번호: 47(GQEP), 서열번호: 48(GAQP), 서열번호: 49(GAQPGQEPGAQP), 서열번호: 50(GAQPGQEP), 서열번호: 51(GEQP), 서열번호: 52(GPQE), 서열번호: 53(GPEQ), 서열번호: 54(GSEP), 서열번호: 55(GESP), 서열번호: 56(GPSE), 서열번호: 57(GPES), 서열번호: 58(GQAP), 서열번호: 59(GPAQ), 서열번호: 60(GPQA), 서열번호: 61(GSQP), 서열번호: 62(GASP), 서열번호: 63(GPAS), 서열번호: 64(GPSA), 서열번호: 65(GGGS), 서열번호: 66(GSGS), 서열번호: 67(GGGGS), 서열번호: 68(GQEPGQAP), 서열번호: 69(GQAPGQEP), 서열번호: 70(SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG), 서열번호: 71(SEPATS), 서열번호: 72(GSETPG), 서열번호: 73(TSESAT), 서열번호: 74(PESGPG), 서열번호: 75(TSTEPS) 및 GS로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 접합체.
  29. 제28항에 있어서, 폴리펩타이드 링커는 (반복1)r(반복2)s(반복3)x(반복4)y를 포함하며,
    여기서 반복1, 반복2, 반복3 및 반복4는 펩타이드 결합을 통해 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 통해 연결되고,
    반복1, 반복2, 반복3 및 반복4는 독립적으로 서열번호: 45(GQEPGAQP), 서열번호: 46(GAQPGAQP), 서열번호: 47(GQEP), 서열번호: 48(GAQP), 서열번호: 49(GAQPGQEPGAQP), 서열번호: 50(GAQPGQEP), 서열번호: 51(GEQP), 서열번호: 52(GPQE), 서열번호: 53(GPEQ), 서열번호: 54(GSEP), 서열번호: 55(GESP), 서열번호: 56(GPSE), 서열번호: 57(GPES), 서열번호: 58(GQAP), 서열번호: 59(GPAQ), 서열번호: 60(GPQA), 서열번호: 61(GSQP), 서열번호: 62(GASP), 서열번호: 63(GPAS), 서열번호: 64(GPSA), 서열번호: 65(GGGS), 서열번호: 66(GSGS), 서열번호: 67(GGGGS), 서열번호: 68(GQEPGQAP), 서열번호: 69(GQAPGQEP), 서열번호: 70(SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG), 서열번호: 71(SEPATS), 서열번호: 72(GSETPG), 서열번호: 73(TSESAT), 서열번호: 74(PESGPG), 서열번호: 75(TSTEPS) 및 GS로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    r, s, x 및 y는 독립적으로 0 내지 30 또는 0 내지 20으로부터 선택되는 정수이고, 단, r, s, x 및 y는 동시에 0이 아닌 폴리펩타이드 접합체.
  30. 제29항에 있어서, x 및 y는 0이며, r, 및 s는 독립적으로 1 내지 30으로부터 선택되는 정수이고, 반복1 및 반복2는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 조합인 폴리펩타이드 접합체:
    a) 반복1은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    b) 반복1은 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    c) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    d) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    e) 반복1은 서열번호: 49의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    f) 반복1은 서열번호: 70의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    g) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며;
    h) 반복1은 서열번호: 70의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
  31. 제29항에 있어서, r, x 및 y는 0이고, s는 1 내지 30 또는 1 내지 20으로부터 선택되는 정수이며, 반복1은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리펩타이드 접합체.
  32. 제29항에 있어서, y는 0이고, r, s 및 x는 독립적으로 1 내지 30으로부터 선택되는 정수이며, 반복1, 반복2, 및 반복3은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 조합인 폴리펩타이드 접합체:
    a) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 49의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
    b) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
    c) 반복1은 서열번호: 70의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
    d) 반복1은 서열번호: 70의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    e) 반복1은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 58의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    f) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    g) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    h) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
  33. 제29항에 있어서, r, s, x 및 y는 독립적으로 1 내지 30 또는 1 내지 20으로부터 선택되는 정수이고, 반복1, 반복2, 반복3 및 반복4는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 조합인 폴리펩타이드 접합체:
    a) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 50의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 47의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복4는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    b) 반복1은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복4는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    c) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복4는 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    d) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 58의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복4는 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    e) 반복1은 서열번호: 48의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복2는 서열번호: 45의 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 반복3은 서열번호: 69의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 반복4는 서열번호: 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
  34. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 링커는 하나의 잔기가 CRM 잔기에 의해 대체된 것을 제외하고 서열번호: 76-89로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  35. 제34항에 있어서, 펩타이드 링커는 서열번호: 90-117, 175 및 176으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 118-174 및 177-183으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리펩타이드 접합체.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, CRM은 혈장 단백질 결합 모이어티, 중합체, Fc, HSA(알부민), Xten 서열, 또는 PAS 서열을 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  38. 제37항에 있어서, CRM은 알부민 결합 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  39. 제38항에 있어서, 알부민 결합 모이어티는 *-A-B-C-D-E의 구조, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하고, 여기서 A, B, C, D 및 E는 아미드 결합을 통해 상호연결되며, A의 * 말단은 폴리펩타이드 복합체 상의 접합가능한 잔기의 반응성 기에 연결되고, 여기서:
    A는 결합,
    Figure pct00136
    및
    Figure pct00137
    으로부터 선택되고, a, b, c 및 d는 독립적으로 0 내지 4의 정수이며, R1은 수소 또는 -COOH이고;
    B는 결합,
    Figure pct00138
    및
    Figure pct00139
    로부터 선택되고, e는 1 내지 4의 정수이며, 위치 α는 위치 α'에 연결되고,
    C는 결합 또는
    Figure pct00140
    이고, R2는 -CH2SO3H 또는 -COOH이며, f는 1 내지 4의 정수이고, n은 1 내지 25의 정수이며, 여기서 B가 결합이 아닌 경우, 위치 β'는 위치 β에 연결되거나, 또는 B가 결합인 경우, 위치 β'는 위치 α'에 연결되고;
    D는 결합,
    Figure pct00141
    및
    Figure pct00142
    로부터 선택되고, g 및 h는 독립적으로 0 또는 1이며, R3은 H 또는 -CH2COOH이고, 여기서:
    B가 결합이 아니고 C가 결합인 경우, 위치 γ'는 위치 β에 연결되며;
    C가 결합이 아닌 경우, 위치 γ'는 위치 γ에 연결되고;
    B가 결합이고 C가 결합인 경우, 위치 γ'는 위치 α'에 연결되며;
    E는 화학식:
    Figure pct00143
    (I)을 갖는 산성기이고,
    상기 식에서 W는 -(CR4R5)l-을 나타내고,
    R4 및 R5는 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, 하이드록시알킬, 아미노, 아미노알킬, 카르복실, 카르복실알킬, 알콕시, 아릴옥시, 및 카르복사미드로 이루어진 군에서 선택되며;
    R6은 하이드록실 또는 NR7R8로부터 선택되고;
    R7 및 R8은 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록실, 및
    Figure pct00144
    로 이루어진 군에서 선택되며; l은 10 내지 20의 정수이고,
    여기서:
    D가 결합이 아닌 경우, 위치 δ는 위치 δ'에 연결되고,
    C가 결합이 아니고 D가 결합인 경우, 위치 δ는 위치 γ에 연결되며,
    B가 결합이 아니고 C가 결합이며 D가 결합인 경우, 위치 δ는 위치 β에 연결되고,
    A가 결합이 아니고 B, C 및 D 모두가 결합인 경우, 위치 δ는 위치 α'에 연결되는 폴리펩타이드 접합체.
  40. 제39항에 있어서, CRM은 리신 잔기에 접합된 폴리펩타이드 접합체.
  41. 제40항에 있어서, A는 결합이고 B는 결합인 폴리펩타이드 접합체.
  42. 제40항에 있어서, A는
    Figure pct00145
    이고, B는
    Figure pct00146
    이며, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결된 폴리펩타이드 접합체.
  43. 제40항에 있어서, A는
    Figure pct00147
    이고, B는 결합인 폴리펩타이드 접합체.
  44. 제40항에 있어서, A는 결합이고 B는
    Figure pct00148
    인 폴리펩타이드 접합체.
  45. 제40항에 있어서, CRM은 하기 화학식:
    Figure pct00149

    의 구조를 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  46. 제39항에 있어서, CRM은 시스테인 잔기에 접합된 폴리펩타이드 접합체.
  47. 제46항에 있어서, A는
    Figure pct00150
    이고, B는
    Figure pct00151
    , 또는
    Figure pct00152
    이며, 여기서 위치 α는 위치 α'에 연결된 폴리펩타이드 접합체.
  48. 제46항에 있어서, CRM은 하기 화학식:

    Figure pct00153

    또는
    Figure pct00154

    의 구조를 포함하는 폴리펩타이드 접합체.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 접합체의 폴리펩타이드 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  50. 제49항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  51. 제50항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  52. 제51항에 있어서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포인 숙주 세포
  53. 제49항의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 허용하는 조건 하에 제51항의 숙주 세포를 배양하여 폴리펩타이드 접합체의 폴리펩타이드 부분을 얻는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 접합체의 제조 방법.
  54. 제53항에 있어서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포인 제조 방법.
  55. 제54항에 있어서, 폴리펩타이드 부분은 가용성 단백질로서 발현되는 제조 방법.
  56. 제55항에 있어서, CRM을 폴리펩타이드 부분에 접합시키는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  57. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 접합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  58. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 접합체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대사 장애의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 대사 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 대사 장애는 당뇨병, 비만, 과체중, 비알콜성 지방간염(NASH), 심혈관 유사 이상지질혈증, 동맥경화증, 알콜성 지방간염(ASH), 당뇨병성 신증, 임신성 당뇨병, 대사 증후군, 예컨대 대사 증후군 X, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 말기 간 질환, 간 지방증(지방간), 간경변, 또는 원발성 담즙성 간경변증(PBC)인 방법.
  60. 제58항에 있어서, 당뇨병은 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능 장애, 1형 당뇨병, 비인슐린 의존성 당뇨병, 저연령대 성숙기 발병 당뇨병(maturity onset diabetes of the young: MODY), 임신성 당뇨병, 및 HbA1C의 상승된 수준으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 병태를 포함하는 방법.
  61. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 접합체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 체중 관리를 필요로 하는 대상체에서 체중을 관리하는 방법.
  62. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 접합체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 음식 섭취의 감소를 필요로 하는 대상체에서 음식 섭취를 감소시키는 방법.
  63. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 접합체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 체중 감소를 필요로 하는 대상체에서 체중을 감소시키는 방법.
  64. 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인 방법.
  65. 제63항에 있어서, 대상체는 125 mg/dL 이상의 공복 혈당 수준을 갖는 방법.
  66. 제63항 또는 제64항에 있어서, 대상체는 적어도 25 또는 25 초과의 체질량 지수(BMI)를 갖는 방법.
  67. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드 접합체는 매일 1회, 3일마다 1회, 또는 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 매월 1회보다 더 빈번하지 않은 투여 요법으로 투여되는 방법.
  68. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드 접합체는 매주 2회, 매주 1회, 격주 1회, 3주마다 1회, 매월 1회, 또는 2개월 1회 투여되는 방법.
  69. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 요법은 3일마다 약 1회 내지 1개월당 약 1회, 또는 매주 약 1회 내지 1개월당 약 1회의 범위의 투여 간격을 갖는 방법.
  70. 제63항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드 접합체는 피하 또는 정맥내 또는 경구 투여되는 방법.
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