JP2023545684A - ポリペプチドコンジュゲートおよび使用の方法 - Google Patents

ポリペプチドコンジュゲートおよび使用の方法 Download PDF

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Abstract

ＧＬＰ－１受容体アゴニストおよびペプチドリンカーを含むポリペプチドコンジュゲート、ならびにそれを含む医薬組成物が提供される。疾患を処置するためにそのようなものを使用する方法も提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、疾患を阻止しかつ／または処置するための、ポリペプチドコンジュゲート、その医薬組成物、およびそのようなものを使用する方法に関する。
グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）の主要な生物活性フラグメントは、プログルカゴンペプチドの翻訳後プロセシングにより生じる３０または３１アミノ酸ペプチドフラグメント（ＧＬＰ－１のアミノ酸７～３６または７～３７）である。初期ＧＬＰ－１産物ＧＬＰ－１は、インスリン合成および分泌を刺激し、糖尿病、とりわけ２型糖尿病における高血糖症を阻止することが示されている。しかしながら、内因性ＧＬＰ－１は、おおよそ２分間の半減期を有するのみであり、それは、ほんの０～１５ｐｍｏｌ／ＬというＧＬＰ－１の空腹時血漿レベルをもたらす。
代謝性障害は、一般に、インスリン抵抗性、内臓脂肪症、アテローム性脂質異常症等と関連しており、それは、世界的に大きくかつ高まる公衆衛生および臨床課題を提起している。しかしながら、代謝性疾患に対する既存の処置は、短い半減期および／または低い効力等の問題に直面している。
さらに、既存のＧＬＰ－１化合物は主に注射によって投与され、投薬頻度があまりにも頻繁である場合、患者は注射自体への恐怖を有し得る。
したがって、代謝性疾患を処置するための、およびまた投薬頻度を低下させるための、治療的解決策の向上の必要性がある。
代謝性障害を処置する／阻止するための、ポリペプチドコンジュゲート、およびそれを含む医薬組成物、および使用の方法が本明細書において提供される。
第１の態様において、本開示は、ペプチドリンカーのＮ末端に付着した単一の生物活性ペプチド、およびペプチドリンカーにおける第１のクリアランス低下部分（ＣＲＭ）残基にコンジュゲートした第１のＣＲＭ、を含むポリペプチドコンジュゲートであって、生物活性ペプチドはＧＬＰ－１受容体アゴニストを含み、第１のＣＲＭ残基は、ＧＬＰ－１受容体アゴニストのＣ末端アミノ酸残基から少なくとも５個のアミノ酸残基（ＣＲＭ残基を除外して）離れている、ポリペプチドコンジュゲートを提供する。
一部の実施形態において、第１のＣＲＭ残基は、生物活性ペプチドのＣ末端アミノ酸から少なくとも１０、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３５、３８、４０、４５、４６、５０、５５、５８、６０、６５、７０、７５、７８個のアミノ酸残基（ＣＲＭ残基を除外して）離れている。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートにおけるＧＬＰ－１受容体アゴニストは、多くとも７０、６０、または５０個のアミノ酸残基の長さを有する。ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートにおけるＧＬＰ－１受容体アゴニストは、多くとも４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、または３０個のアミノ酸残基の長さを有する。
一部の実施形態において、ＧＬＰ－１受容体アゴニストはＧＬＰ－１を含む。
一部の実施形態において、生物活性ペプチドは、コンジュゲートしたＣＲＭを有しない。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートはモノコンジュゲートしており、生物活性ペプチド（例えば、ＧＬＰ－１）にではなく、ペプチドリンカーにコンジュゲートしたＣＲＭを有する。これらの実施形態の一部において、本明細書において提供されるそのようなモノコンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートと比較して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下でＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性の増加を有する。ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるモノコンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同じまたは同等のアッセイにおいて決定される、ＨＳＡの存在下におけるセマグルチドのものの５０％以下（または４０％、３０％、２０％、１０％、５％、もしくは３％以下）のＥＣ５０で、ＨＳＡの存在下でＧＬＰ－１受容体を活性化する。ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるモノコンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同じまたは同等のアッセイにおいて決定される、ＨＳＡの非存在下におけるセマグルチドのものに匹敵する（例えば、その約２０％～約３００％の）ＥＣ５０で、ＨＳＡの非存在下でＧＬＰ－１受容体を活性化する。
ある特定の実施形態において、ＨＳＡは、ＧＬＰ－１受容体活性化に対するＨＳＡ結合の影響についての査定を可能にする適切な量で、ＧＬＰ－１受容体活性化に対するインビトロアッセイに存在する。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるモノコンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同じまたは同等のアッセイにおいて決定される、セマグルチドのものに匹敵する（例えば、その約７０％～約５００％の）結合アフィニティー（ＫＤ）で、ＨＳＡに結合する。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるモノコンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同等のインビボ調査条件下でおよび同じタイプの実験動物において決定される、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートと比較して、少なくとも同等の終末相半減期〔terminal half life〕を有する。
一部の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートは、二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートであり、第２のＣＲＭ残基にコンジュゲートした第２のＣＲＭをさらに含む。
一部の実施形態において、第２のＣＲＭ残基は、生物活性ペプチド内またはペプチドリンカー内にある。ある特定の実施形態において、第２のＣＲＭ残基は、ＧＬＰ－１ペプチドのＫ２６にある。
これらの実施形態の一部において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートと比較して、ＨＳＡの存在下で同等のまたは許容されるＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性を有する。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同じまたは同等のアッセイにおいて決定される、ＨＳＡの存在下における、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートのものの２０００％以下（または１５００％、１０００％、９００％、８００％、７００％、６００％、もしくは５００％以下）のＥＣ５０で、ＨＳＡの存在下でＧＬＰ－１受容体を活性化する。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同じまたは同等のアッセイにおいて決定される、ＨＳＡの存在下における、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートのものに匹敵する（例えば、その５００％、４００％、３００％、もしくは２００％以下の、またはさらにそれ未満の）ＥＣ５０で、ＨＳＡの非存在下でＧＬＰ－１受容体を活性化する。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、ＨＳＡの存在下において第１のＥＣ５０で、およびＨＳＡの非存在下において第２のＥＣ５０でＧＬＰ－１受容体を活性化し、第１のＥＣ５０は第２のＥＣ５０よりも高いが、第２のＥＣ５０のものの１０００倍以下であり、例えば第１のＥＣ５０（ＨＳＡの存在下における）は、第２のＥＣ５０（ＨＳＡの非存在下における）の９００倍、８００倍、７００倍、６００倍、または５００倍以下である。ある特定の実施形態において、ＨＳＡは、ＧＬＰ－１受容体活性化に対するＨＳＡ結合の影響についての査定を可能にする適切な量で、ＧＬＰ－１受容体活性化に対するインビトロアッセイに存在する。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同じまたは同等のアッセイにおいて決定される、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートのものよりも有意に低い（例えば、その５０％、４０％、３０％、または２０％以下の）ＫＤ値によって表される、より高い結合アフィニティーでＨＳＡに結合する。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同等のインビボ調査条件下でおよび同じタイプの実験動物において決定される、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートのものよりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、３００％、４００％の終末相半減期の増加を有する。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同等のインビボ調査条件下でおよび同じタイプの実験動物において決定される、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートのものよりも少なくとも約５０％長い（６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、３００％、または４００％長い）期間、ポリペプチドコンジュゲートに対する治療ウィンドウ内にとどまる血中または血漿または血清濃度を有する。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同等のインビボ調査条件下でおよび同じタイプの実験動物において決定される、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートと比較して、治療効力の延長した継続期間を提供する。ある特定の実施形態において、治療効力の延長した継続期間は、時間応答曲線に対する曲線下面積（ＡＵＣ）によっておよび／または治療応答の継続期間によって特徴付けされ得る。
ある特定の実施形態において、治療応答は、体重の低下、食物摂取量の低下、またはグルコースレベルの低下（空腹時グルコースレベルまたは非空腹時グルコースレベル）を含む。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同等のインビボ調査条件下でおよび同じタイプの実験動物において決定される、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートのものよりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％の、時間応答曲線に対するＡＵＣの増加を有する。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同等のインビボ調査条件下でおよび同じタイプの実験動物において決定される、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートのものよりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、３００％、または４００％の、治療応答の継続期間の増加を有する。
一部の実施形態において、ＧＬＰ－１は、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一方で配列番号１の実質的な生物学的活性を保持する。
一部の実施形態において、ＧＬＰ－１は、配列番号１と比べて多くとも９、８、７、６、５、または４個の変異を含み、一方で配列番号１の実質的な生物学的活性を保持する。
一部の実施形態において、ＧＬＰ－１は、配列番号１と比べて、Ａ８、Ｇ２２、Ｑ２３、Ｅ２７、Ｋ２６、Ａ３０、Ｋ３４、Ｒ３６、およびＨ７、またはその任意の組み合わせからなる群から選択される位置における１つまたは複数の変異を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態において、ＧＬＰ－１は、Ａ８Ａｉｂ、Ｇ２２Ｅ、Ｋ２６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、およびＲ３６Ｇ、またはその任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の置換を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態において、第１のＣＲＭ残基はリジン残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは１つのみのリジン残基を含む。
一部の実施形態において、第１および第２のＣＲＭ残基は両方ともリジン残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは２つのみのリジン残基を含む。
一部の実施形態において、第２のリジン残基はＧＬＰ－１内にあり、Ｋ２３、Ｋ２６、Ｋ２７、Ｋ３０、およびＫ３４からなる群から任意で選択される。
一部の実施形態において、ＧＬＰ－１におけるＣＲＭ残基以外のすべてのリジン残基は、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）からなる群から任意で選択される非リジン残基に置換されている。
一部の実施形態において、第１のＣＲＭ残基はシステイン残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは１つのみのシステイン残基を含む。
一部の実施形態において、第１および第２のＣＲＭ残基は両方ともシステイン残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは２つのみのシステイン残基を含む。
一部の実施形態において、第２のシステイン残基はＧＬＰ－１内にあり、Ｃ２３、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ３０、およびＣ３４からなる群から任意で選択される。
一部の実施形態において、第１のＣＲＭ残基は非天然アミノ酸残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは、ＣＲＭ残基としての１つのみの非天然アミノ酸残基を含む。
一部の実施形態において、第１および第２のアミノ酸残基は非天然アミノ酸残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは、ＣＲＭ残基としての２つのみの非天然アミノ酸残基を含む。
一部の実施形態において、ＧＬＰ－１は、Ｘ７Ｘ８ＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＸ２２Ｘ２３ＡＡＸ２６Ｘ２７ＦＩＸ３０ＷＬＶＸ３４ＧＸ３６Ｇ（配列番号２）のアミノ酸配列を含み、式中：Ｘ７はＨ、イミダゾール－４－アセテート（ＩＡ）、またはイミダゾールプロピオン酸（ＩＰＡ）であり；Ｘ８はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、Ａｉｂ、Ｔ、Ｉ、またはＬであり；Ｘ２２はＧまたはＥであり；Ｘ２３はＱ、Ｃ、またはＫであり、Ｘ２６はＫ、Ｒ、またはＣであり；Ｘ２７はＥ、Ｋ、またはＣであり；Ｘ３０はＡ、Ｃ、またはＫであり、Ｘ３４はＲ、Ｋ、またはＣであり、Ｘ３６はＲまたはＧである。
一部の実施形態において、Ｘ７はＨであり、Ｘ８はＧまたはＡｉｂであり、Ｘ２２はＧまたはＥであり；Ｘ２３はＱ、Ｃ、またはＫであり、Ｘ２６はＫ、Ｒ、またはＣであり；Ｘ２７はＥ、Ｋ、またはＣであり；Ｘ３０はＡ、Ｃ、またはＫであり、Ｘ３４はＫ、Ｒ、またはＣであり、Ｘ３６はＲまたはＧである。
一部の実施形態において、ＧＬＰ－１は、配列番号１、３、５、７、８、１０、１２、１３、１５、１７、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２８、３０、３２、３３、３５、３６、３８、および４０～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、ＧＬＰ－１は、配列番号３～６、８～１１、１３～１６、１８～２１、２３～２６、２８～３１、３３、３４、３６～３９、および１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、少なくとも１０個のアミノ酸残基（例えば、少なくとも１２、２４、３２、４０、４８、６０、または８０個のアミノ酸残基）の長さを有する。
一部の実施形態において、ポリペプチドリンカーは１２～８０個のアミノ酸残基の長さを有する。
一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、ＣＲＭ残基を除いて、Ｇ、Ｑ、Ａ、Ｅ、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸残基からなる。
一部の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、ＣＲＭ残基を除いて、リピート配列の１つまたは複数のリピートを含むまたはそれからなる。
一部の実施形態において、リピート配列は、配列番号４５（ＧＱＥＰＧＡＱＰ）、配列番号４６（ＧＡＱＰＧＡＱＰ）、配列番号４７（ＧＱＥＰ）、配列番号４８（ＧＡＱＰ）、配列番号４９（ＧＡＱＰＧＱＥＰＧＡＱＰ）、配列番号５０（ＧＡＱＰＧＱＥＰ）、配列番号５１（ＧＥＱＰ）、配列番号５２（ＧＰＱＥ）、配列番号５３（ＧＰＥＱ）、配列番号５４（ＧＳＥＰ）、配列番号５５（ＧＥＳＰ）、配列番号５６（ＧＰＳＥ）、配列番号５７（ＧＰＥＳ）、配列番号５８（ＧＱＡＰ）、配列番号５９（ＧＰＡＱ）、配列番号６０（ＧＰＱＡ）、配列番号６１（ＧＳＱＰ）、配列番号６２（ＧＡＳＰ）、配列番号６３（ＧＰＡＳ）、配列番号６４（ＧＰＳＡ）、配列番号６５（ＧＧＧＳ）、配列番号６６（ＧＳＧＳ）、配列番号６７（ＧＧＧＧＳ）、配列番号６８（ＧＱＥＰＧＱＡＰ）、配列番号６９（ＧＱＡＰＧＱＥＰ）、配列番号７０（ＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧ）、配列番号７１（ＳＥＰＡＴＳ）、配列番号７２（ＧＳＥＴＰＧ）、配列番号７３（ＴＳＥＳＡＴ）、配列番号７４（ＰＥＳＧＰＧ）、配列番号７５（ＴＳＴＥＰＳ）、およびＧＳからなる群から選択される配列からなる。
一部の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、（リピート１）ｒ（リピート２）ｓ（リピート３）ｘ（リピート４）ｙを含み、式中、リピート１、リピート２、リピート３、およびリピート４は、ペプチド結合を介してまたは１つもしくは複数のアミノ酸残基を介して連結され、リピート１、リピート２、リピート３、およびリピート４は、独立して、配列番号４５（ＧＱＥＰＧＡＱＰ）、配列番号４６（ＧＡＱＰＧＡＱＰ）、配列番号４７（ＧＱＥＰ）、配列番号４８（ＧＡＱＰ）、配列番号４９（ＧＡＱＰＧＱＥＰＧＡＱＰ）、配列番号５０（ＧＡＱＰＧＱＥＰ）、配列番号５１（ＧＥＱＰ）、配列番号５２（ＧＰＱＥ）、配列番号５３（ＧＰＥＱ）、配列番号５４（ＧＳＥＰ）、配列番号５５（ＧＥＳＰ）、配列番号５６（ＧＰＳＥ）、配列番号５７（ＧＰＥＳ）、配列番号５８（ＧＱＡＰ）、配列番号５９（ＧＰＡＱ）、配列番号６０（ＧＰＱＡ）、配列番号６１（ＧＳＱＰ）、配列番号６２（ＧＡＳＰ）、配列番号６３（ＧＰＡＳ）、配列番号６４（ＧＰＳＡ）、配列番号６５（ＧＧＧＳ）、配列番号６６（ＧＳＧＳ）、配列番号６７（ＧＧＧＧＳ）、配列番号６８（ＧＱＥＰＧＱＡＰ）、配列番号６９（ＧＱＡＰＧＱＥＰ）、配列番号７０（ＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧ）、配列番号７１（ＳＥＰＡＴＳ）、配列番号７２（ＧＳＥＴＰＧ）、配列番号７３（ＴＳＥＳＡＴ）、配列番号７４（ＰＥＳＧＰＧ）、配列番号７５（ＴＳＴＥＰＳ）、およびＧＳからなる群から選択される配列を含みまたはそれからなり、ｒ、ｓ、ｘ、およびｙは同時に０ではないという条件で、ｒ、ｓ、ｘ、およびｙは、独立して０～３０または０～２０から選択される整数である。
一部の実施形態において、ｘおよびｙは０であり、ｒおよびｓは、独立して１～３０から選択される整数であり、リピート１およびリピート２は、
ａ）リピート１は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
ｂ）リピート１は配列番号４７の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
ｃ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４７の配列を含むまたはそれからなる；
ｄ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４５の配列を含むまたはそれからなる；
ｅ）リピート１は配列番号４９の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
ｆ）リピート１は配列番号７０の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
ｇ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号６８の配列を含むまたはそれからなる；および
ｈ）リピート１は配列番号７０の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４７の配列を含むまたはそれからなる
からなる群から選択される組み合わせである。
一部の実施形態において、ｒ、ｘ、およびｙは０であり、ｓは、１～３０または０～２０から選択される整数であり、リピート１は配列番号４５の配列を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態において、ｙは０であり、ｒ、ｓ、およびｘは、独立して１～３０から選択される整数であり、リピート１、リピート２、およびリピート３は、
ａ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４９の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
ｂ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４７の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
ｃ）リピート１は配列番号７０の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４７の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
ｄ）リピート１は配列番号７０の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４７の配列を含むまたはそれからなる、
ｅ）リピート１は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号５８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる、
ｆ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号６８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４５の配列を含むまたはそれからなる、
ｇ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる、および
ｈ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号６８の配列を含むまたはそれからなる
からなる群から選択される組み合わせである。
一部の実施形態において、ｒ、ｓ、ｘ、およびｙは、独立して１～３０または０～２０から選択される整数であり、リピート１、リピート２、リピート３、およびリピート４は、
ａ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号５０の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４７の配列を含みまたはそれからなり、リピート４は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる、
ｂ）リピート１は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号６８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり、リピート４は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる、
ｃ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号６８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり、リピート４は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる、
ｄ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号５８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート４は配列番号４５の配列を含むまたはそれからなる、および
ｅ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号６９の配列を含みまたはそれからなり、リピート４は配列番号６８の配列を含むまたはそれからなる
からなる群から選択される組み合わせである。
一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、１つの残基がＣＲＭ残基によって置換されているという点を除いて、配列番号７６～８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号９０～１１７、１７５、および１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートは、配列番号１１８～１７４および１７７～１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態において、ＣＲＭは、血漿タンパク質結合部分、ポリマー、Ｆｃ、ＨＳＡ（アルブミン）、Ｘｔｅｎ配列、またはＰＡＳ配列を含む。
一部の実施形態において、ＣＲＭはアルブミン結合部分を含む。
一部の実施形態において、アルブミン結合部分は、＊－Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅの構造、またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、アミド結合を介して相互接続され、Ａの＊末端は、ポリペプチド複合体におけるＣＲＭ残基の反応基に接続され、式中：
Ａは、結合、
から選択され、ａ、ｂ、ｃ、およびｄは独立して０～４の整数であり、Ｒ１は水素または－ＣＯＯＨであり；
Ｂは、結合、
から選択され、式中、α位はα’位に連結され、ｅは１～４の整数であり、
Ｃは、結合または
であり、Ｒ２は－ＣＨ２ＳＯ３Ｈまたは－ＣＯＯＨであり、ｆは１～４の整数であり、ｎは１～２５の整数であり、Ｂが結合ではない場合には、β’位はβ位に連結され、またはＢが結合である場合には、β’位はα’位に連結され；
Ｄは、結合、
から選択され、ｇおよびｈは独立して０または１であり、Ｒ３はＨまたは－ＣＨ２ＣＯＯＨであり、
Ｂが結合ではなくかつＣが結合である場合には、γ’位はβ位に連結され；
Ｃが結合ではない場合には、γ’位はγ位に連結され；
Ｂが結合でありかつＣが結合である場合には、γ’位はα位に連結され；
Ｅは、式：
を有する酸性基であり、
式中、Ｗは－（ＣＲ４Ｒ５）ｌ－を表し、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、およびカルボキサミドからなる群から選択され、
Ｒ６はヒドロキシルまたはＮＲ７Ｒ８から選択され；
Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシル、および
からなる群から選択され、
ｌは１０～２０、１０～１８、１０～１６の整数、例えば１２、１４、１６、または１８であり、
Ｄが結合ではない場合には、δ位はδ’位に連結され、
Ｃが結合ではなくかつＤが結合である場合には、δ位はγ位に連結され、
Ｂが結合ではなく、Ｃが結合であり、かつＤが結合である場合には、δ位はβ位に連結され、
Ａが結合ではなくかつＢ、Ｃ、およびＤのすべてが結合である場合には、δ位はα’位に連結されている。
一部の実施形態において、ＣＲＭはリジン残基にコンジュゲートされる。
一部の実施形態において、Ａは結合である。
一部の実施形態において、Ａは結合であり、Ｂは結合または
であり、式中、ｅは１、２、または３である。
一部の実施形態において、Ａは結合であり、Ｂは
であり、Ｃは、
であり、式中、β’位はβ位に連結され、式中、ｅは１、２、または３であり、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。ある特定の実施形態において、Ｄは結合であり、Ｅは、式：
を有する酸性基である。ある特定の実施形態において、Ｒ２は－ＣＯＯＨであり、Ｒ６はヒドロキシルである。ある特定の実施形態において、Ｗは－（ＣＲ４Ｒ５）ｌ－を表し、Ｒ４およびＲ５は独立して水素であり、ｌは１０～２０、１０～１８、１０～１６の整数、例えば１２、１４、１６、または１８である。
一部の実施形態において、Ａは結合であり、Ｂは結合であり、Ｃは結合である。
一部の実施形態において、Ａは結合であり、Ｂは結合であり、Ｃは
であり、式中、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。
一部の実施形態において、Ａは
であり、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２である。
一部の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、式中、α位はα’位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｅは１、２、または３である。
一部の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは
であり、式中、α位はα’位に連結され、β’位はβ位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｅは１、２、または３であり、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。
一部の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは結合であり、式中、α位はα’位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｅは１、２、または３である。
一部の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは結合であり、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２である。
一部の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは結合であり、Ｃは
であり、式中、β’位はα’位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。
一部の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは結合であり、Ｃは結合であり、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２である。
一部の実施形態において、Ｄは結合である。
一部の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは
であり、Ｄは結合であり、式中、α位はα’位に連結され、β’位はβ位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｅは１、２、または３であり、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。
一部の実施形態において、Ｄは
であり、式中、ｇは０または１であり、ｈは０または１である。
一部の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
または結合であり、Ｃは結合であり、Ｄは
であり、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｅは１、２、または３であり、ｇは０または１であり、ｈは０または１であり、Ｂが結合ではない場合には、α位はα’位に連結され、γ’位はβ位に連結され、Ｂが結合である場合には、γ’位はα’位に連結されている。
一部の実施形態において、Ｄは
である。
一部の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは結合または
であり、Ｄは
であり、Ｃが結合である場合には、α位はα’位に連結され、γ’位はβ位に連結され、またはＣが結合ではない場合には、α位はα’位に連結され、β’位はβ位に連結され、γ’位はγ位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｅは１、２、または３であり、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。
一部の実施形態において、ＣＲＭは、下の式：
の構造を含む。
一部の実施形態において、ＣＲＭはシステイン残基にコンジュゲートされる。
一部の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、式中、α位はα’位に連結されている。
一部の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは
であり、式中、α位はα’位に連結され、β’位はβ位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｄは１、２、または３であり、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。ある特定の実施形態において、Ｄは結合であり、Ｅは、式：
を有する酸性基である。ある特定の実施形態において、Ｒ２は－ＣＯＯＨであり、Ｒ６はヒドロキシルである。ある特定の実施形態において、Ｗは－（ＣＲ４Ｒ５）ｌ－を表し、Ｒ４およびＲ５は独立して水素であり、ｌは１０～２０、１０～１８、１０～１６の整数、例えば１２、１４、１６、または１８である。
一部の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは
であり、Ｄは結合であり、式中、α位はα’位に連結され、β’位はβ位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｄは１、２、または３であり、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。
一部の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、式中、α位はα’位に連結され、式中、ｄは１、２、または３であり、ｅは１、２、または３である。
一部の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは結合であり、式中、α位はα’位に連結され、式中、ｄは１、２、または３であり、ｅは１、２、または３である。
一部の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは結合であり、Ｄは
であり、式中、α位はα’位に連結され、γ’位はβ位に連結され、式中、ｄは１、２、または３であり、ｅは１、２、または３であり、ｇは０または１であり、ｈは０または１である。
一部の実施形態において、ＣＲＭは、下の式：
の構造を含む。
第２の態様において、本開示は、第１の態様のポリペプチドコンジュゲートのポリペプチド部（またはそのフラグメント）をコードするポリヌクレオチドを提供する。
第３の態様において、本開示は、第２の態様のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
第４の態様において、本開示は、第３の態様のベクターを含む宿主細胞を提供する。
一部の実施形態において、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。
第５の態様において、本開示は、第２の態様のポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で第４の態様の宿主細胞を培養して、ポリペプチドコンジュゲートのポリペプチド部を獲得することを含む、第１の態様のポリペプチドコンジュゲートを産生する方法を提供する。
一部の実施形態において、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。
一部の実施形態において、ポリペプチド部は可溶性タンパク質として発現される。
一部の実施形態において、方法は、ポリペプチド部にＣＲＭをコンジュゲートすることをさらに含む。
第６の態様において、本開示は、第１の態様に従ったポリペプチドコンジュゲート、および薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を提供する。
第７の態様において、本開示は、第１の態様のポリペプチドコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における代謝性障害を阻止するまたは処置する方法を提供する。
第８の態様において、本開示は、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートの治療有効量を投与し、それによって対象の体重を管理することを含む、それを必要とする対象における体重を管理する方法を提供する。
第９の態様において、本開示は、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートの治療有効量を投与し、それによって対象の食物摂取量を低下させることを含む、それを必要とする対象における食物摂取量を低下させる方法を提供する。
第１０の態様において、本開示は、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートの治療有効量を投与し、それによって対象の体重を低下させることを含む、それを必要とする対象における体重を低下させる方法を提供する。
ある特定の実施形態において、代謝性障害は、糖尿病、肥満、重量超過、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、心血管様脂質異常症〔cardiovascular like dyslipidemia〕、アテローム性動脈硬化症〔artherosclerosis〕、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、糖尿病性腎症〔diabeticnephropathy〕、妊娠性糖尿病、メタボリックシンドロームＸ等のメタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、末期肝疾患、肝臓脂肪症（脂肪肝）、肝硬変、または原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）である。
ある特定の実施形態において、糖尿病は、限定されることなく、高血糖症、２型糖尿病、耐糖能異常、１型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、ＭＯＤＹ（若年発症成人型糖尿病）、妊娠性糖尿病、およびＨｂＡ１Ｃのレベルの上昇を含めた、任意の形態の糖尿病であり得る。
ある特定の実施形態において、対象はヒトである。
ある特定の実施形態において、対象は、１２５ｍｇ／ｄＬまたはそれを上回る空腹時血中グルコースレベルを有する。
ある特定の実施形態において、対象は、少なくとも２５または２５よりも高いボディマス指数（ＢＭＩ）を有する。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートは、１日に１回、３日ごとに１回、または週に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、または月に１回よりも低頻度の投薬レジメンで投与される。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートは、週に２回、週に１回、２週間に１回、３週間ごとに１回、月に１回、または２カ月ごとに１回投与される。
ある特定の実施形態において、投薬レジメンは、およそ３日ごとに１回～およそ１月あたり１回、またはおよそ週に１回～およそ１月あたり１回に及ぶ投薬間隔を有する。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートは、皮下にまたは静脈内にまたは経口的に投与される。
本開示を通して、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という冠詞は、１つまたは１つを上回る（すなわち、少なくとも１つの）、冠詞の文法的対象を指すために本明細書において使用される。例として、「融合ポリペプチド（ａ ｆｕｓｉｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、１種の融合ポリペプチドまたは１種を上回る融合ポリペプチドを意味する。
一連の列挙される数値がある本出願におけるすべての発生において、列挙される数値のいずれかは、数の範囲の上限または下限であり得ることが理解されるべきである。本発明は、すべてのそのような数の範囲、すなわち数値上限および数値下限の組み合わせを有する域を包含し、上限および下限のそれぞれに対する数値は、本明細書において列挙される任意の数値であり得ることがさらに理解されるべきである。本明細書において提供される域は、域内のすべての値を含むと理解される。例えば、１～１０は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０という値のすべて、ならびに必要に応じて小数値を含むと理解される。同様に、「少なくとも」によって区切られた域は、提供される低値およびすべてのより高い数を含むと理解される。
本明細書において使用するとき、「約」は、平均の３標準偏差内または具体的技術分野における認容の標準域内を含むと理解される。ある特定の実施形態において、約は、多くとも０．５の変動と理解される。
「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、１つまたは１つを上回る（すなわち、少なくとも１つの）、冠詞の文法的対象を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１種の要素または１種を上回る要素を意味する。
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含むが、それらに限定されるわけではない」という語句を意味するために本明細書において使用され、それと互換可能に使用される。同様に、「等」は、「等であるが、それらに限定されるわけではない」という語句を意味するために本明細書において使用され、それと互換可能に使用される。
「または」という用語は、文脈上別様にはっきりと示されない限り、「および／または」という用語を意味するために本明細書において包括的に使用され、それと互換可能に使用される。
図１（図１Ａ～１Ｄ）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける分子００１、００２、および０１２のインビボ活性を示す。体重を評価するために、１０週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、試験薬物物質を１回皮下に投薬した。図１Ａは、１日目から８日目までの、分子００１処理後の体重喪失を示している。図１Ｂは、１日目から８日目までの、分子００２処理後の体重喪失を示している。図１Ｃは、１日目から８日目までの、分子０１２または分子００１処理後の体重喪失を示している。図１Ｄは、１日目から８日目までの、分子００７、００８、０１２、および０１６処理後の体重喪失を示している。データは、平均値および標準誤差（ＳＥＭ）として示される。セマグルチドを、比較対照として並行して試験した。 図２（図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）は、ｄｂ／ｄｂマウスにおける分子００１、００２、および０１２のインビボ活性を示す。図２Ａは、分子００１単回投薬処理後の空腹時グルコースを示している。図２Ｂは、分子００２単回投薬処理後の空腹時グルコースを示している。データは、平均値および標準誤差（ＳＥＭ）として示される。図２Ｃは、分子０１２単回投薬処理後の非空腹時グルコースを示している。グルコースを評価するために、１０週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウスに、表示される投薬量で指定されたＧＬＰ－１ポリペプチドコンジュゲートを皮下投与した。空腹時グルコース（図２Ａおよび２Ｂ）または非空腹時グルコース（図２Ｃ）を種々の時点で測定し、５匹の動物を各群に使用した。デルタ血中グルコースは、ベースラインレベルを差し引かれたグルコースである。データは、平均値および標準誤差（ＳＥＭ）として示される。 図３（図３Ａおよび３Ｂ）は、食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスにおけるインビボ効力を示す。体重、食物摂取量、およびグルコースレベルに対するそれぞれのＧＬＰ－１ポリペプチドコンジュゲートの効果を評価するために、２２週齢のＤＩＯマウス（１３週間高脂肪食餌中のＣ５７ＢＬ／６マウス）に、種々の濃度の指定されたＧＬＰ－１ポリペプチドコンジュゲートを２５日間、隔日に皮下投与した。図３Ａは、１０、３０、および１００ｎｍｏｌ／ｋｇの分子０１２の用量漸増〔dose titration〕を用いた体重変化を示している。図３Ｂは、処理があり次第の空腹時グルコース変化を示している。データは、平均値および標準誤差（ＳＥＭ）として表現される。 図４（図４Ａ～４Ｌ）は、本開示に開示されるすべての配列を示す。
詳細な説明
本発明の以下の説明は、本発明の様々な実施形態を例示することが意図されるにすぎない。そのため、論じられる具体的な改変は、本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではない。本発明の範囲から逸脱することなく、様々な均等物、変形形態、および改変形態が実現され得ることは当業者に明白であると考えられ、そのような均等の実施形態は本明細書に含まれるべきであることが理解される。刊行物、特許、および特許出願を含めた、本明細書において引用されるすべての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
定義
本明細書において使用される「アミノ酸」という用語は、各アミノ酸に特異的な側鎖とともに、アミン（－ＮＨ２）およびカルボキシル（－ＣＯＯＨ）官能基を含有する有機化合物を指す。
本明細書において使用される「天然に存在する」アミノ酸残基という用語は、それらの構造がそのような立体異性体形態を可能にする場合にはそれらのＤおよびＬ立体異性体すべて込みで、天然タンパク質またはペプチドに見出されるアミノ酸残基を指す。天然に存在するアミノ酸残基の例は、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、およびグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）を含めた２０種の標準アミノ酸、ならびにカナバニン、ピロリジン（ＰＹＬ）、セレノシステイン、ピロリン－カルボキシ－リジン（ＰＣＬ）、サルコシン、ベータ－アラニン、ホスホセリン、γ－カルボキシグルタミン酸、およびオルニチン等、それらの天然類似体を含むが、それらに限定されるわけではない。それらのＤ立体異性体にある天然に存在するアミノ酸残基の例は、例えばＤ－アスパラギン酸、Ｄ－セリン、Ｄ－システイン、Ｄ－アラニン、Ｄ－グルタミン酸等を含む。
「アミノ酸類似体」とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち水素に結合している炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。そのような類似体は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有し得るが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持するであろう。
本明細書において使用される「非天然」アミノ酸残基とは、限定されることなく、公知の天然に存在するアミノ酸の１種ではないが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する改変アミノ酸残基および／またはアミノ酸模倣体を含めた、天然に見出されない任意のアミノ酸残基を指す。改変アミノ酸または模倣体は、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーションのためのリンカー、官能基化、または他の改変等の化学的実体の付加によって作出され得る。非天然アミノ酸は、化学合成によって製造されたアミノ酸も指し得る。例示的な非天然アミノ酸は、２－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、イミダゾール－４－アセテート（ＩＡ）、イミダゾールプロピオン酸（ＩＰＡ）、ａ－アミノ酪酸（Ａｂｕ）、ｔｅｒｔ－ブチルグリシン（Ｔｌｅ）、ｂ－アラニン、３－アミノメチル安息香酸、アントラニル酸、デス－アミノ－ヒスチジン（ＤｅｓａｍｉｎｏＨｉｓと略される、代替名イミダゾプロピオン酸、ｌｍｐｒと略される）、β－アラニン等のアミノ酸のベータ類似体、２－アミノ－ヒスチジン、β－ヒドロキシ－ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎα－アセチル－ヒスチジン、α－フルオロ－メチル－ヒスチジン、α－メチル－ヒスチジン、α，α－ジメチル－グルタミン酸、ｍ－ＣＦ３－フェニルアラニン、α，β－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐと略される）、３－ピリジルアラニン、２－ピリジルアラニンまたは４－ピリジルアラニン、（１－アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１－アミノシクロブチル）－カルボン酸、（１－アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１－アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１－アミノシクロヘプチル）カルボン酸、および（１－アミノシクロオクチル）カルボン酸を含むが、それらに限定されるわけではない。
ポリペプチド内への非天然アミノ酸の導入は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８－５００，２００１；Ｄｅｉｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２５：１１７８２－１１７８３，２００３；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４－９６７，２００３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：３７１－３７３，２００４、または米国特許第７，０８３，９７０号に記載される技術によって実現され得る。簡潔には、これらの発現システムの一部は、本開示の融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに、アンバー（ＵＡＧ）、オーカー（ＵＡＡ）、およびオパール（ＵＧＡ）コドン等の終止コドンを導入する部位指向性変異導入を伴う。４塩基コドン（例えば、ＡＧＧＡ、ＡＧＧＵ、ＣＧＧＵ、ＣＧＣＵ、ＣＧＡＵ、ＣＣＣＵ、ＣＵＣＵ、ＣＵＡＵ、およびＧＧＧＵ）、５塩基コドン、６塩基コドン等の他のコドンも、非天然アミノ酸に対する発現システムに導入され得る。次いで、そのような発現ベクターは、導入された終止コドンまたは他のコドンに特異的でかつ選定対象の非天然アミノ酸を担持したｔＲＮＡを利用し得る宿主に導入される。別の例として、非天然アミノ酸は、化学合成され得、アシル化等の化学反応によってポリペプチドに挿入され得るまたは付着され得る。
「配列同一性パーセント（％）」とは、配列をアラインし、必要な場合にはギャップを導入して、最大数の同一アミノ酸（または核酸）を達成した後の、参照配列におけるアミノ酸（または核酸）残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージとして定義される。言い換えれば、アミノ酸配列（または核酸配列）の配列同一性パーセント（％）は、それが比較されている参照配列と比べて同一であるアミノ酸残基（または塩基）の数を、いずれか短いほうの、候補配列におけるまたは参照配列におけるアミノ酸残基（または塩基）の総数で割ることによって算出され得る。アミノ酸残基の保存的置換は、同一の残基と見なされない。アミノ酸（または核酸）配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ（米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで利用可能、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０（１９９０）；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９７）も参照されたい）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（欧州バイオインフォマティクス研究所のウェブサイトで利用可能、Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：３８３－４０２（１９９６）；Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ），２３（２１）：２９４７－８（２００７）も参照されたい）、およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に利用可能なツールを使用して達成され得る。当業者であれば、ツールによって提供される初期設定パラメーターを使用し得る、または例えば適切なアルゴリズムを選択する等によって、アライメントに対して必要に応じてパラメーターをカスタマイズし得る。
アミノ酸配列に関連した「保存的置換」とは、アミノ酸残基を、同様の生理化学的特性を有する側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置き換えることを指す。例えば、保存的置換は、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ）の間で、中性親水性側鎖を有する残基（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎ）の間で、酸性側鎖を有する残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の間で、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＡｒｇ）の間で、または芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅ）の間で行われ得る。当技術分野において公知のように、保存的置換は、通常、タンパク質立体構造の重大な変化を引き起こさず、したがって、タンパク質の生物学的活性を保持し得る。
本明細書において使用される「機能的形態」という用語は、アミノ酸配列のまたは化学構造の違いを有するにもかかわらず、親分子の実質的な生物学的活性を依然として保持する、親分子の種々の形態（変種、フラグメント、融合体、誘導体、および模倣体等）を指す。本明細書において使用される「実質的な生物学的活性を保持する」という表現は、親分子の生物学的活性の少なくとも一部（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）またはすべてを呈することを意味する。親ポリペプチドの機能的形態は、天然に存在する変種形態、および組み換え法または化学合成によって獲得されたもの等の天然に存在しない形態の両方を含み得る。機能的形態は、非天然アミノ酸残基を含有し得る。
本明細書において使用される「変種」という用語は、親ポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドを指す。変種は、親ペプチドと１つまたは複数のアミノ酸残基異なり得る。例えば、変種は、親ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、付加、欠失、挿入、または切り取りを有し得る。
本明細書において使用される「フラグメント」という用語は、任意の長さの親ポリペプチドの部分配列を指す。フラグメントは、親ポリペプチドの少なくとも部分的機能を依然として保持し得る。
本明細書において使用される「誘導体」という用語は、１つまたは複数の明確に規定された数の置換基が、ポリペプチドまたは融合ポリペプチドの１つまたは複数の特異的アミノ酸残基に共有結合で付着している、化学修飾されたポリペプチドまたは融合ポリペプチドを指す。例示的な化学修飾は、例えばアルキル化、アシル化、エステル化、アミド化、リン酸化、グリコシル化、標識化、１つもしくは複数のアミノ酸のメチル化、または１つもしくは複数の部分とのコンジュゲーションであり得る。
本明細書において使用される「模倣体」という用語は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチドの代わりになるものとして働く分子構造を指す。例えば、本明細書において使用されるアミノ酸模倣体は、アミノ酸であってもなくてもよいが、親アミノ酸の機能的特質を保持し、一方でアミノ酸模倣体の構造は親アミノ酸の構造とは異なる、合成構造（公知のまたは未知の）であり得る。例は、アミド、β－、γ－、δ－イミノ酸（ピペリジン－４－カルボン酸等）のメタクリロイルまたはアクリロイル誘導体等を含む。
本明細書において使用される病態の「処置すること」または「処置」は、病態を阻止することもしくは緩和すること、病態の発生もしくは進行の速度を遅らせること、病態を発症するリスクを低下させること、病態と関連した症状の発症を阻止することもしくは遅延させること、病態と関連した症状を低下させることもしくは終わらせること、病態の完全もしくは部分退縮を生じさせること、病態を治すこと、またはその一部の組み合わせを含む。
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、そのタンパク質の発現をもたらすように作動可能に挿入され得るビヒクルを指す。ベクターを使用して、それが宿主細胞内に運ぶ遺伝要素の発現をもたらすように宿主細胞を形質転換し得る、形質導入し得る、またはトランスフェクトし得る。ベクターの例は、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージ等のバクテリオファージ、および動物ウイルスを含む。ベクターとして使用される動物ウイルスのカテゴリーは、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）を含む。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能なエレメント、およびレポーター遺伝子を含めた、発現を制御するための多様なエレメントを含有し得る。加えて、ベクターは複製の起点を含有し得る。ベクターは、ウイルス粒子、リポソーム、またはタンパク質コーティングを含むがそれらに限定されない、細胞内へのその進入を支援する材料も含み得る。ベクターは、発現ベクターまたはクローニングベクターであり得る。本開示は、融合ポリペプチドをコードする本明細書において提供される核酸配列、核酸配列に作動可能に連結された少なくとも１種のプロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）、および少なくとも１種の選択マーカーを含有するベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。ベクターの例は、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ラムダファージ、およびＭ１３ファージ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．３、ｐＭＤ１８－Ｔ、ｐＯｐｔｉｖｅｃ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ、ｐＱＤ－Ｈｙｇ－ＧＳｅｕ、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ－Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ１０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２、ｐＣＭＶ－ＳＣＲＩＰＴ．ＲＴＭ．、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ＰＣＲ２．１、ｐＥＦ－１、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１、ｐＣＤＥＦ３、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＦ－Ｂｏｓ等を含むが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において使用される「宿主細胞」という語句は、外因性ポリヌクレオチドおよび／またはベクターが導入されている細胞を指す。
「薬学的に許容される」という用語は、指定された担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤、および／または塩が、製剤を含む他の成分と概ね化学的かつ／または物理的に適合し、かつそのレシピエントと生理学的に適合することを示す。
本明細書において使用される「対象」または「個体」または「動物」または「患者」という用語は、疾患または障害の診断、予後、改善、阻止、および／または処置を必要とする、哺乳類または霊長類を含めたヒトまたは非ヒト動物を指す。哺乳類対象は、ヒト、飼い慣らされた動物、農業用動物、および動物園用、運動用、またはペット用動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマ等を含む。
ポリペプチドコンジュゲート
１つの態様において、本開示は、ペプチドリンカーのＮ末端に付着した単一の生物活性ペプチド、およびペプチドリンカーにおける第１のクリアランス低下部分（ＣＲＭ）残基にコンジュゲートした第１のＣＲＭ、を含むポリペプチドコンジュゲートであって、生物活性ペプチドはＧＬＰ－１受容体アゴニストを含み、第１のＣＲＭ残基は、ＧＬＰ－１受容体アゴニストのＣ末端アミノ酸残基から少なくとも５個のアミノ酸残基（ＣＲＭ残基を除外して）離れている、ポリペプチドコンジュゲートを提供する。
「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、ペプチド結合等の共有結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書において提供されるペプチドまたはポリペプチドは、天然に存在するもしくは非天然のアミノ酸残基、またはその両方を含み得る。本明細書において提供されるポリペプチドおよびペプチドは、任意の適切な長さのアミノ酸残基、例えば長さが少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個、またはそれを上回るアミノ酸残基を含み得る。
ポリペプチドコンジュゲートは、単一の、すなわち１種のみの生物活性ペプチドを含む。生物活性ペプチドに関連した「単一の」とは、ポリペプチドコンジュゲートが、ペプチドリンカーにそれぞれ付着している２種以上の異なる生物活性ペプチドを含有しないことを意味することが意図される。しかしながら、単一の生物活性ペプチドは、一緒に融合した異なる生物活性ペプチド由来のフラグメントまたは一部分を、これらの部分が１つのペプチドとして一体化されかつリンカーにそれぞれ付着していない限りにおいて、例えばハイブリッドまたはキメラとして含み得る。しかしながら、２種の異なる生物活性ペプチドが、リンカーのＮ末端およびＣ末端にそれぞれ付着している場合には、それは、本開示において使用される単一の生物活性ペプチドではない。
本明細書において使用される「生物活性ペプチド」という用語は、生物学的機能または活性、例えば生理学的機能または治療的機能を有するペプチドを意味する。ある特定の実施形態において、生物活性ペプチドは治療活性がある。単独にある場合に生物学的機能を有しないペプチドは、生物活性ペプチドではない。例えば、ペプチドリンカーは、例えば単独で使用される場合、それがそれ自身の生物学的機能または活性を有しない限り、生物活性ペプチドではない。
生物活性ペプチドは、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体アゴニストを含む。
「グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体」（ＧＬＰ１Ｒとも称される）という用語は、１つの細胞外ドメインおよび１つの膜貫通ドメインを含む、膵臓におけるベータ細胞上および脳のニューロン上に見出される受容体タンパク質である。細胞外ドメインは、ＧＬＰ－１のＣ末端ヘリックスに結合し得、膜貫通ドメインは、ＧＬＰ－１のＮ末端領域に結合し得る。ＧＬＰ－１受容体は、インスリン分泌を増強することによって血糖レベルの制御に関わる。脳において発現される場合、ＧＬＰ－１受容体は、食欲の制御にも関わり得る。
本明細書において使用される「グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体アゴニスト」または「ＧＬＰ－１受容体アゴニスト」という用語は、ＧＬＰ－１受容体に結合し得かつ活性化し得る分子を指す。ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、天然リガンドと同程度であるまたはその部分的である大きさのＧＬＰ－１受容体応答を引き出し得る。
本明細書において使用される「クリアランス改変部分」または「ＣＲＭ」という用語は、１種または複数の薬物動態（ＰＫ）特性（例えば、インビボにおける半減期を増加させること）を変更し得る部分を指す。ＣＲＭの例は、限定されることなく、スクシンイミジル環の加水分解の速度を増加させ得、逆マイケル反応の速度を低下させ得または最小限に抑え得、したがって、薬物の喪失の速度、ならびに生物活性ペプチドから他のチオール含有タンパク質および小分子へのリンカー基の喪失の速度を低下させ得るまたは最小限に抑え得る、脂肪酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グルクロン酸または他の糖類ベースのリンカー、極性のある、正に帯電したまたは負に帯電した基を含み得る。
本明細書において使用される「ＣＲＭ残基」とは、ＣＲＭにコンジュゲートされるアミノ酸残基を指す。
本明細書において使用される「コンジュゲート」という用語は、１つの物理的実体を形成するために一緒に接合された２種以上の分子の結果としての化合物を指す。例えば、本開示のコンジュゲートは、一緒に接合されたポリペプチドおよび１種または複数のクリアランス改変部分の結果としての化合物を意味する。分子は、共有結合、非共有結合、リンカー、化学修飾、もしくはタンパク質融合によって、または当業者に公知の任意の手段によって一緒に付着し得る。好ましくは、分子は、共有結合によって一緒に付着し得る。接合は、永続的または可逆的であり得る。一部の実施形態において、ある特定の切断可能なまたは切断不能な連結が含まれ得る。
ＧＬＰ－１受容体アゴニストへのＣＲＭのコンジュゲーションは、ＧＬＰ－１受容体アゴニストの半減期を延長し得るものの、それは、ＧＬＰ－１受容体アゴニストの生物学的活性に悪影響も及ぼし得、コンジュゲートされていない対応物よりもそれを活性が低い状態にする。例えば、コンジュゲートしたＧＬＰ－１誘導体であるセマグルチドは、有意に延長した半減期を有するが、そのコンジュゲートしていない対応物と比べて、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下でＧＬＰ－１受容体結合の、９３９分の１への減少を被る（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１５，５８，７３７０－７３８０）。
しかしながら、ＧＬＰ－１受容体アゴニストを含むある特定のＣＲＭコンジュゲートポリペプチドは、ＣＲＭが、そのＣ末端に付着したペプチドリンカー上にてＧＬＰ－１受容体アゴニストの外側でコンジュゲートされた場合、延長した半減期および保持された生物学的活性の両方を有し得ることが本発明者らによって予想外に見出されている。興味深いことに、ＧＬＰ－１受容体アゴニストのＣ末端とコンジュゲーション部位との間の距離は特に重要であることが本発明者らによって見出されている。ペプチドリンカー上でのＣＲＭコンジュゲーションが、ＧＬＰ－１受容体アゴニストのＣ末端に近い位置にある場合、それは生物学的活性を有意に低下させると考えられ、それはＧＬＰ－１受容体アゴニスト自体上でのコンジュゲーションよりもさらにはるかに低いことがある。しかしながら、コンジュゲーションが、ＧＬＰ－１受容体アゴニストのＣ末端から十分に離れた位置にある場合には、ＣＲＭコンジュゲートＧＬＰ－１受容体アゴニストは、延長した半減期および保持された生物学的活性の両方を有し得る。そのような予想外の効果は、ある特定のＧＬＰ－１受容体アゴニストおよびある特定のＣＲＭを用いて見出される。
ある特定の実施形態において、第１のＣＲＭ残基は、ＧＬＰ－１受容体アゴニストのＣ末端アミノ酸残基から少なくとも１０、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３５、３８、４０、４５、４６、５０、５５、５８、６０、６５、７０、７５、または７８個の残基（ＣＲＭ残基を除外して）離れている。ある特定の実施形態において、第１のＣＲＭ残基とＧＬＰ－１受容体アゴニストのＣ末端アミノ酸との間の距離は、１０～１２０、１５～１２０、２０～１２０、２５～１２０、３０～１２０、３１～１２０、３２～１２０、３３～１２０、３４～１２０、３５～１２０、３６～１２０、３７～１２０、３８～１２０、３９～１２０、４０～１２０、３０～８０、３１～８０、３２～８０、３３～８０、３４～８０、３５～８０、３６～８０、３７～８０、３８～８０、３９～８０、または４０～８０である。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートにおけるＧＬＰ－１受容体アゴニストは、多くとも７０、６０、または５０個のアミノ酸残基の長さを有する。ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートにおけるＧＬＰ－１受容体アゴニストは、多くとも４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、または３０個のアミノ酸残基の長さを有する。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートにおけるＧＬＰ－１受容体アゴニストは、本開示において提供されるＧＬＰ－１を含む、または本開示において提供されるＧＬＰ－１である。一部の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートにおけるＧＬＰ－１は、配列番号１、３、５、７、８、１０、１２、１３、１５、１７、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２８、３０、３２、３３、３５、３６、３８、４０～４４、および１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートにおけるＧＬＰ－１は、配列番号３（８Ａｉｂ、３４Ｒ、３６Ｇ）または配列番号８（８Ａｉｂ、２２Ｅ、３４Ｒ、３６Ｇ）のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
いかなる理論によっても拘束されることを望むことなく、ＧＬＰ－１へのＣＲＭ（または脂肪酸）コンジュゲーションは、ＨＳＡの存在下でその活性を低下させ得ると思われる。例えば、ＧＬＰ－１活性の低下はセマグルチドに関して報告されており、それは、ＧＬＰ－１（８Ａｉｂ、３６Ｒ）のＫ２６にコンジュゲートした脂肪酸を有し、ＨＳＡの存在下で、そのコンジュゲートされていない対応物と比較して活性の有意な低下を示した。ＨＳＡはヒト血中に存在し、生理学的条件下で不可避であることから、ＨＳＡの存在下におけるＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性の低下は、タンパク質コンジュゲートの治療活性を損なわせると思われる。しかしながら、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートの一部は、ＣＲＭコンジュゲーションにもかかわらず、ＨＳＡの存在下でＧＬＰ－１活性のほとんどを保持し得る。そのような実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートはモノコンジュゲートしており、生物活性ペプチド（例えば、ＧＬＰ－１）にではなく、ペプチドリンカーにコンジュゲートしたＣＲＭを有する。
これらの実施形態の一部において、本明細書において提供されるそのようなモノコンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートと比較して、ＨＳＡの存在下でＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性の増加を有する。ある特定の実施形態において、ＨＳＡの存在下におけるＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性は、当技術分野において公知の、ｃＡＭＰアッセイ等の無細胞アッセイまたはレポーター細胞アッセイ等の細胞ベースのアッセイいずれかにおける、ＧＬＰ－１受容体活性化に対するインビトロアッセイにおいて決定され得る。ある特定の実施形態において、比較ポリペプチドコンジュゲートはセマグルチドである。ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるモノコンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同じまたは同等のアッセイにおいて決定される、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下におけるセマグルチドのものの５０％以下（または４０％、３０％、２０％、１０％、５％、もしくは３％以下）のＥＣ５０で、ＨＳＡの存在下でＧＬＰ－１受容体を活性化する。ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるモノコンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同じまたは同等のアッセイにおいて決定される、ＨＳＡの非存在下におけるセマグルチドのものに匹敵する（例えば、その２０％～３００％の）ＥＣ５０で、ＨＳＡの非存在下でＧＬＰ－１受容体を活性化する。ある特定の実施形態において、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の量は、ＧＬＰ－１受容体活性化に対するＨＳＡ結合の影響についての査定を可能にする。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１受容体活性化に対するインビトロアッセイは、少なくとも０．５％、１％、１．２％、１．５％、１．８％、または２％ＨＳＡの存在下で行われる。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるモノコンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同じまたは同等のアッセイにおいて決定される、セマグルチドのものに匹敵する（例えば、その約７０％～約５００％の）結合アフィニティー（ＫＤ）で、ＨＳＡに結合する。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるモノコンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同等のインビボ調査条件下でおよび同じタイプの実験動物において決定される、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートと比較して、少なくとも同等の終末相半減期を有する。終末相半減期決定のための適切な動物は、例えばマウス、ラット、ミニブタ、またはサルを含む。ある特定の実施形態において、終末相半減期は、治療効力を提供するのに適切な用量での、単回投薬の静脈内投与または皮下投与または経口投与の後に、適切な動物において決定される。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートは、第２のＣＲＭ残基にコンジュゲートした第２のＣＲＭをさらに含む。言い換えれば、本開示は、二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートも提供する。第２のＣＲＭコンジュゲーションは、ポリペプチドコンジュゲートの半減期をさらに延長し得ることが本発明者らによって予想外に見出されている。ある特定の実施形態において、第１および第２のＣＲＭコンジュゲーションの両方を有する二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、１つのみのＣＲＭコンジュゲーションを有する対応するポリペプチドコンジュゲート（例えば、セマグルチド）よりも少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍である、またはさらに長い延長した半減期を有し得る。
第２のＣＲＭ残基は、任意の適切な位置にあり得る。ある特定の実施形態において、第２のＣＲＭ残基は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト内またはペプチドリンカー内にある。
ある特定の実施形態において、第２のＣＲＭ残基は、ＧＬＰ－１ペプチドのＫ２６にある。ＧＬＰ－１ペプチド上での２つの脂肪酸部分とのコンジュゲーションは、活性を有意に低下させ得るまたはコンジュゲートしたＧＬＰ－１ペプチドを無効の状態にさらにし得ることが報告されている。したがって、ＧＬＰ－１（例えば、Ｋ２６）上、およびＧＬＰ－１ペプチドのＣ末端から十分に離れた位置におけるペプチドリンカー上の両方でのコンジュゲーションは、ＨＳＡの存在下におけるＧＬＰ－１ポリペプチドの生物学的活性に対する脂肪酸コンジュゲーションの負の影響を最小限に抑え得ることが本発明者らによって予想外に見出されている。
これらの実施形態の一部において、本明細書において提供されるそのような二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートと比較して、ＨＳＡの存在下で同等のまたは許容されるＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性を有する。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同じまたは同等のアッセイにおいて決定される、ＨＳＡの存在下における、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートのものの２０００％以下（または１５００％、１０００％、９００％、８００％、７００％、６００％、もしくは５００％以下）のＥＣ５０で、ＨＳＡの存在下でＧＬＰ－１受容体を活性化する。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同じまたは同等のアッセイにおいて決定される、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートのものに匹敵する（例えば、その５００％、４００％、３００％、もしくは２００％以下の、またはさらにそれ未満の）ＥＣ５０で、ＨＳＡの非存在下でＧＬＰ－１受容体を活性化する。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、ＨＳＡの存在下において第１のＥＣ５０で、およびＨＳＡの非存在下において第２のＥＣ５０でＧＬＰ－１受容体を活性化し、第１のＥＣ５０は第２のＥＣ５０よりも高いが、第２のＥＣ５０のものの１０００倍以下であり、例えば第１のＥＣ５０（ＨＳＡの存在下における）は、第２のＥＣ５０（ＨＳＡの非存在下における）の９００倍、８００倍、７００倍、６００倍、または５００倍以下である。ある特定の実施形態において、ＨＳＡは、ＧＬＰ－１受容体活性化に対するＨＳＡ結合の影響についての査定を可能にする適切な量で、ＧＬＰ－１受容体活性化に対するインビトロアッセイに存在する。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１受容体活性化に対するインビトロアッセイは、ＧＬＰ－１受容体活性化に対するＨＳＡ結合の影響についての査定を可能にする適切な量のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下で行われる。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１受容体活性化に対するインビトロアッセイは、少なくとも０．５％、１％、１．２％、１．５％、１．８％、または２％ＨＳＡの存在下で行われる。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同じまたは同等のアッセイにおいて決定される、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートのものよりも有意に低い（例えば、その５０％、４０％、３０％、または２０％以下の）ＫＤ値によって表される、より高い結合アフィニティーでＨＳＡに結合する。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、ペプチドリンカーを有せずかつ生物活性ペプチド（例えば、ＧＬＰ－１）上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートと比較して増強した薬物動態特性を有し、薬物動態特性は、対象への治療有効用量の投与の後にポリペプチドコンジュゲートの血中濃度を測定することによって決定される。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同等のインビボ調査条件下でおよび同じタイプの実験動物において決定される、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートのものよりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、３００％、または４００％の終末相半減期の増加を有する。終末相半減期決定のための適切な動物は、例えばマウス、ラット、ミニブタ、またはサルを含む。ある特定の実施形態において、終末相半減期は、治療効力を提供するのに適切な用量での、単回投薬の静脈内投与または皮下投与の後に、適切な動物において決定される。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同等のインビボ調査条件下でおよび同じタイプの実験動物において決定される、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートのものよりも少なくとも約５０％長い（６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、３００％、または４００％長い）期間、ポリペプチドコンジュゲートに対する治療ウィンドウ内にとどまる血中または血漿または血清濃度を有する。本明細書において使用される「治療ウィンドウ」という用語は、許容されない毒性を有することなく、処置される対象となる病態に対して治療的有益性または効力を提供する、血中または血漿または血清におけるポリペプチドコンジュゲートの濃度レベルの域を意味する。濃度レベルの域は、治療応答をもたらす最小濃度から、治療応答を提供するが許容されない毒性を誘導することのない最大濃度であり得る。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同等のインビボ調査条件下でおよび同じタイプの実験動物において決定される、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートと比較して、治療効力の延長した継続期間を提供する。そのような延長した治療効力は、時間応答曲線に対する曲線下面積（ＡＵＣ）によって特徴付けされ得、それは、代謝性病態を有する対象（例えば、疾患モデル動物）において意図される治療効果を提供するのに適切である単回投薬の後または反復投薬の後にプロットされ得る。延長した治療効力継続期間は、治療応答の継続期間によっても特徴付けされ得る。
ある特定の実施形態において、治療応答は、体重の低下、食物摂取量の低下、またはグルコースレベルの低下（空腹時グルコースレベルまたは非空腹時グルコースレベル）を含む。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同等のインビボ調査条件下でおよび同じタイプの実験動物において決定される、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートのものよりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％の、時間応答曲線に対するＡＵＣの増加を有する。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される二重コンジュゲートしたポリペプチドコンジュゲートは、同等のインビボ調査条件下でおよび同じタイプの実験動物において決定される、セマグルチド等、ペプチドリンカーを有せずかつＧＬＰ－１上でコンジュゲートしたＣＲＭを有する比較ポリペプチドコンジュゲートのものよりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、３００％、または４００％の、治療応答の継続期間の増加を有する。ある特定の実施形態において、治療応答に対する実験動物は、ｄｂ／ｄｂマウスまたは食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）動物等の疾患モデル動物である。
ＧＬＰ－１受容体アゴニスト
ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、受容体の天然リガンド、および天然リガンドのものに匹敵するまたはその少なくとも３０％、４０％、もしくは５０％のアゴニスト活性を呈する人工的に設計されたまたは改変された分子の両方を含み得る。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、天然ＧＬＰ－１のアミノ酸配列、オキシントモジュリン、エキセンディン－４、エキセナチド、ベイナグルチド、エフペグレナチド、ラングレナチド〔langlenatide〕、セマグルチド、タスポグルチド、ペガパモズチド、リラグルチド、アルビグルチド、デュラグルチド、またはリキシセナチドを含む。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１受容体アゴニストはＧＬＰ－１を含む。
本明細書において使用される「グルカゴン様ペプチド－１」または「ＧＬＰ－１」という用語は、天然ＧＬＰ－１ペプチド、ならびにその機能的変種、フラグメント、融合体、誘導体、および模倣体等のすべてのその機能的形態を広く包含することが意図される。
本明細書において使用される「天然ＧＬＰ－１ペプチド」という用語は、その配列が配列番号１に明記される天然ヒトグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１（７～３７））を指す。本明細書において使用するとき、配列番号１（すなわち、ＧＬＰ－１（７～３７））における特定のアミノ酸残基に言及する場合、ＧＬＰ－１（１～３７）の番号付けに従う。言い換えれば、配列番号１はＧＬＰ－１（７～３７）に対応し、したがって、配列番号１における１番目の残基（ヒスチジン（Ｈ）である）は、それがＧＬＰ（１～３７）における７番目の残基に対応することを意味する７Ｈと称され；配列番号１における３１番目の残基（グリシン（Ｇ）である）は、ＧＬＰ（１～３７）における３７番目の残基に対応することを意味する３７Ｇと称される。
天然ＧＬＰ－１ペプチドの機能的形態は、天然ＧＬＰ－１ペプチドのものに匹敵するまたはその少なくとも２０％（または少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％）のレベルで、ＧＬＰ－１受容体を活性化し得る。ＧＬＰ－１受容体の活性化は、典型的に、当技術分野において公知であるように、インスリン分泌刺激作用または他の生理学的効果をもたらすシグナル変換経路を開始する。天然ＧＬＰ－１ペプチドの機能的形態は、配列番号１と比べて、１つまたは複数の置換、付加、または欠失を含有し得る。天然ＧＬＰ－１ペプチドの多くの機能的形態、例えば、限定されることなく、リラグルチド、セマグルチド、デュラグルチド、アルビグルチド、およびその開示全体が本明細書に組み入れられるＷＯ２００００５５２０３Ａ１、ＷＯ９８／０８８７１、ＷＯ２００６／０９７５３７に開示されるものが当技術分野において公知である。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるＧＬＰ－１は、配列番号１と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一方で配列番号１の実質的な生物学的活性を保持する。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、配列番号１と比べて多くとも９、８、７、６、５、４、３、または２個の変異（例えば、付加、欠失、置換）を含み、一方で配列番号１の実質的な生物学的活性を保持する。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、配列番号１と比べて少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９個の変異（例えば、付加、欠失、置換）を含み、一方で配列番号１の実質的な生物学的活性を保持する。
当業者であれば、様々なアミノ酸置換、例えば保存的アミノ酸置換は、必ずしもその活性を減少させることなく、本明細書に記載されるポリペプチドフラグメントのいずれかの配列において行われ得ることを解するであろう。アミノ酸置換の例は、その対応するＤ－アミノ酸の代わりにＬ－アミノ酸を置換すること、チオール含有側鎖を有するホモシステインもしくは他の非天然アミノ酸の代わりにシステインを置換すること、アミノ含有側鎖を有するホモリジン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸、オルニチン、もしくは他の非天然アミノ酸の代わりにリジンを置換すること、またはノルバリンもしくは同様のものの代わりにアラニンを置換することを含む。
様々な置換が天然ＧＬＰ－１ペプチドに導入されており、その生物学的活性を保持し得るまたはさらに向上させ得ることが示されている。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、Ａ８、Ｇ２２、Ｑ２３、Ｅ２７、Ｋ２６、Ａ３０、Ｋ３４、Ｒ３６、およびＨ７、ならびに／またはその任意の組み合わせからなる群から選択される位置における１つまたは複数の変異を含むまたはそれからなる。例えば、Ａ８における置換は、該残基におけるＤＰＰ４酵素的切断を阻止するのに有用であり、Ｇ２２における置換は、活性および溶解度を向上させるのに望ましく、ならびにＲ３６における置換は、免疫原性を低下させるのに有用であると思われる。これらの位置における置換の例は、限定されることなく、Ｈ７ＩＡ、Ｈ７ＩＰＡ、Ａ８Ｇ、Ａ８Ｓ、Ａ８Ｖ、Ａ８Ａｉｂ、Ａ８Ｔ、Ａ８Ｉ、Ａ８Ｌ、Ｇ２２Ｅ、Ｋ３４Ｒ、Ｒ３６Ｇ、ならびにその全体によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，２７３，８５４号に記載される置換を含む。ある特定の実施形態において、１つまたは複数の置換は保存的置換を含む。本明細書において使用するとき、ＧＬＰ－１における残基の番号付けは、残基７がヒスチジン（Ｈ７、すなわち配列番号１における最初の残基）であり、残基３７がグリシン（Ｇ３７、すなわち配列番号１における最後の残基）であるＧＬＰ－１（７～３７）としても知られる、配列番号１に明記される３１アミノ酸配列を参照して言及される。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、Ａ８Ｇ、Ａ８Ｓ、Ａ８Ｖ、Ａ８Ａｉｂ、Ａ８Ｔ、Ａ８Ｉ、およびＡ８Ｌからなる群から選択されるＡ８の置換を含む。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１はＧ２２Ｅの置換を含む。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１はＲ３６Ｇの置換を含む。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、Ｈ７ＩＡまたはＨ７ＩＰＡであるＨ７の置換を含む。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、Ｋ３４ＲであるＫ３４の置換を含む。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、Ｈ７、Ａ８、Ｇ２２、Ｋ３４、およびＲ３６、またはその任意の組み合わせからなる群から選択される位置における１つまたは複数の置換を含むまたはそれからなる。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、Ｈ７ＩＡ、Ｈ７ＩＰＡ、Ａ８Ｇ、Ａ８Ａｉｂ、Ｋ３４Ｒ、Ｇ２２Ｅ、およびＲ３６Ｇ、またはその任意の組み合わせからなる群から選択される位置における１つまたは複数の置換を含むまたはそれからなる。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、Ａ８Ａｉｂ、Ｋ２６Ｒ、Ｇ２２Ｅ、Ｋ３４Ｒ、およびＲ３６Ｇ、またはその任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の置換を含むまたはそれからなる。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、Ｘ７Ｘ８ＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＸ２２Ｘ２３ＡＡＸ２６Ｘ２７ＦＩＸ３０ＷＬＶＸ３４ＧＸ３６Ｇ（配列番号２）のアミノ酸配列を含み、式中：Ｘ７はＨ、イミダゾール－４－アセテート（ＩＡ）、またはイミダゾールプロピオン酸（ＩＰＡ）であり；Ｘ８はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、Ａｉｂ、Ｔ、Ｉ、またはＬであり；Ｘ２２はＧまたはＥであり；Ｘ２３はＱ、Ｃ、またはＫであり；Ｘ２６はＫ、Ｒ、またはＣであり；Ｘ２７はＥ、Ｋ、またはＣであり；Ｘ３０はＡ、Ｃ、またはＫであり；Ｘ３４はＲ、Ｋ、またはＣであり、Ｘ３６はＲまたはＧである。
ある特定の実施形態において、Ｘ７はＨであり、Ｘ８はＧまたはＡｉｂであり、Ｘ２２はＧまたはＥであり；Ｘ２３はＱ、Ｃ、またはＫであり；Ｘ２６はＫ、Ｒ、またはＣであり；Ｘ２７はＥ、Ｋ、またはＣであり；Ｘ３０はＡ、Ｃ、またはＫであり；Ｘ３４はＫ、Ｒ、またはＣであり、Ｘ３６はＲまたはＧである。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、配列番号１、３～４４、および１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、多くとも１つのリジン残基を含む。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、多くとも１つのシステイン残基を含む。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、
配列番号１（ＷＴ ＧＬＰ－１）
配列番号３（８Ａｉｂ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号５（８Ａｉｂ、２６Ｒ、２７Ｋ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号７（８Ａｉｂ、２６Ｒ ３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号８（８Ａｉｂ、２２Ｅ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号１０（８Ａｉｂ、２２Ｅ、２６Ｒ、２７Ｋ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号１２（８Ａｉｂ、２２Ｅ、２６Ｒ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号１３（８Ａｉｂ、３４Ｒ）、
配列番号１５（８Ａｉｂ、２６Ｒ、２７Ｋ、３４Ｒ）、
配列番号１７（８Ａｉｂ、２６Ｒ、３４Ｒ）、
配列番号１８（８Ａｉｂ、２２Ｅ、３４Ｒ）、
配列番号２０（８Ａｉｂ、２２Ｅ、２６Ｒ、２７Ｋ、３４Ｒ）、
配列番号２２（８Ａｉｂ、２２Ｅ、２６Ｒ、３４Ｒ）、
配列番号２３（８Ｇ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号２５（８Ｇ、２６Ｒ、２７Ｋ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号２７（８Ｇ、２６Ｒ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号２８（８Ｇ、２２Ｅ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号３０（８Ｇ、２２Ｅ、２６Ｒ、２７Ｋ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号３２（８Ｇ、２２Ｅ、２６Ｒ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号３３（８Ｇ、３４Ｒ）、
配列番号３５（８Ｇ、２６Ｒ、３４Ｒ）、
配列番号３６（８Ｇ、２２Ｅ、３４Ｒ）、
配列番号３８（８Ｇ、２２Ｅ、２６Ｒ、２７Ｋ、３４Ｒ）、
配列番号４０（８Ｇ、２２Ｅ、２６Ｒ、３４Ｒ）、
配列番号４１（８Ｇ、２２Ｅ、３６Ｇ）、
配列番号４２（８Ｇ、３６Ｇ）
配列番号４３（８Ｇ、２２Ｅ）、および
配列番号４４（８Ｇ）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、
配列番号３（８Ａｉｂ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号４（８Ａｉｂ、２６Ｃ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号５（８Ａｉｂ、２６Ｒ、２７Ｋ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号６（８Ａｉｂ、２７Ｃ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号８（８Ａｉｂ、２２Ｅ、３４Ｒ、３６Ｇ）
配列番号９（８Ａｉｂ、２２Ｅ、２６Ｃ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号１０（８Ａｉｂ、２２Ｅ、２６Ｒ、２７Ｋ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号１１（８Ａｉｂ、２２Ｅ、２７Ｃ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号１３（８Ａｉｂ、３４Ｒ）、
配列番号１４（８Ａｉｂ、２６Ｃ、３４Ｒ）、
配列番号１５（８Ａｉｂ、２６Ｒ、２７Ｋ、３４Ｒ）、
配列番号１６（８Ａｉｂ、２７Ｃ、３４Ｒ）、
配列番号１８（８Ａｉｂ、２２Ｅ、３４Ｒ）、
配列番号１９（８Ａｉｂ、２２Ｅ、２６Ｃ、３４Ｒ）、
配列番号２０（８Ａｉｂ、２２Ｅ、２６Ｒ、２７Ｋ、３４Ｒ）、
配列番号２１（８Ａｉｂ、２２Ｅ、２７Ｃ、３４Ｒ）、
配列番号２３（８Ｇ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号２４（８Ｇ、２６Ｃ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号２５（８Ｇ、２６Ｒ、２７Ｋ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号２６（８Ｇ、２７Ｃ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号２８（８Ｇ、２２Ｅ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号２９（８Ｇ、２２Ｅ、２６Ｃ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号３０（８Ｇ、２２Ｅ、２６Ｒ、２７Ｋ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号３１（８Ｇ、２２Ｅ、２７Ｃ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号３３（８Ｇ、３４Ｒ）
配列番号３４（８Ｇ、２６Ｃ、３４Ｒ）、
配列番号３６（８Ｇ、２２Ｅ、３４Ｒ）、
配列番号３７（８Ｇ、２２Ｅ、２６Ｃ、３４Ｒ）、
配列番号３８（８Ｇ、２２Ｅ、２６Ｒ、２７Ｋ、３４Ｒ）、
配列番号３９（８Ｇ、２２Ｅ、２７Ｃ、３４Ｒ）、および
配列番号１８４（８Ａｉｂ、２２Ｅ、２６Ｃ、３４Ｒ、３６Ｇ）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、配列番号７、８、１２、３２、および１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、配列番号３、４、８、２８、２９、および１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、配列番号３、８、および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、配列番号７、１２、および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、配列番号４、２９、および１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、配列番号７および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ペプチドリンカー
ポリペプチドコンジュゲートにおいて、ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、ペプチドリンカーのＮ末端に付着される。ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、例えばペプチド結合等の共有結合等、直接連結を介してペプチドリンカーに付着され得る。
ペプチドリンカーは、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基から構成され得る。ペプチドリンカーは、１つまたは複数の非天然アミノ酸をさらに含み得る。
ある特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、少なくとも１０個のアミノ酸残基（例えば、少なくとも１５、２０、２４、４０、５０、６０、７０、または８０個のアミノ酸残基）の長さを有する。ある特定の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、１０～１２０、１５～１２０、２０～１２０、２５～１２０、３０～１２０、３１～１２０、３２～１２０、３３～１２０、３４～１２０、３５～１２０、３６～１２０、３７～１２０、３８～１２０、３９～１２０、４０～１２０、２０～８０、３０～８０、３１～８０、３２～８０、３３～８０、３４～８０、３５～８０、３６～８０、３７～８０、３８～８０、３９～８０、または４０～８０個のアミノ酸残基の長さを有する。ある特定の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、１２～８０、２０～６０、３０～６０、３０～５０、３０～４０、４０～５０、３０～４５、または３５～４５個のアミノ酸残基の長さを有する。
ある特定の実施形態において、ペプチドリンカーは１２～８０個のアミノ酸残基の長さを有する。
任意の適切なポリペプチドリンカーが使用され得る。例えば、ポリペプチドリンカーは、アミノ酸グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、およびリジン（Ｋ）から選択されるアミノ酸残基を含み得るまたはそれからなり得る。一部の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、グリシンおよびアラニン等、立体障害のないアミノ酸の大多数から構成され得る。一部の実施形態において、リンカーは、ポリグリシン、ポリアラニン、グリシンとアラニンとの組み合わせ（ポリ（Ｇｌｙ－Ａｌａ）等）、またはグリシンとセリンとの組み合わせ（ポリ（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）等）である。
ある特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、ＣＲＭ残基を除いて、Ｇ、Ｑ、Ａ、Ｅ、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸残基からなる。
ある特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、ＣＲＭ残基を除いて、リピート配列の１つまたは複数のリピートを含むまたはそれからなる。ある特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、リピート配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０リピートの、または上で挙げられる任意の２つの数によって規定される任意の数の範囲内のリピートを含むまたはそれからなる。
ある特定の実施形態において、リピート配列は、Ｇ、Ｑ、Ａ、Ｅ、Ｐ、Ｔ、およびＳからなる群から選択される多くとも４、５、または６種のタイプのアミノ酸残基を含むまたはそれからなる。ある特定の実施形態において、リピート配列は、Ｇ、Ｑ、Ａ、Ｅ、Ｐ、およびＳからなる群から選択される多くとも４、５、または６種のタイプのアミノ酸残基を含むまたはそれからなる。ある特定の実施形態において、リピート配列はＱを含む。ある特定の実施形態において、リピート配列は、Ｑと、Ｇ、Ａ、Ｅ、Ｐ、およびＳからなる群から選択される多くとも３、４、または５種のタイプのアミノ酸残基とからなる。
ある特定の実施形態において、リピート配列は、Ｇ、Ｑ、Ａ、Ｅ、およびＰからなる。ある特定の実施形態において、リピート配列は、Ｇ、Ｑ、Ａ、およびＰからなる。
ある特定の実施形態において、リピート配列は、配列番号４５～７５およびＧＳからなる群から選択される配列を含むまたはそれからなる。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、１種を上回るリピート配列を含むまたはそれからなる。例えば、ポリペプチドリンカーは、２、３、または４種の異なるリピート配列を含むまたはそれからなる。ある特定の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、異なるリピート配列の逐次または縦列リピートを含むまたはそれからなる。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、（リピート１）ｒ（リピート２）ｓ（リピート３）ｘ（リピート４）ｙを含みまたはそれからなり、式中：
リピート１、リピート２、リピート３、およびリピート４は、ペプチド結合を介してまたは１つもしくは複数のアミノ酸残基を介して連結され；
リピート１、リピート２、リピート３、およびリピート４は、独立して、配列番号４５～７５およびＧＳからなる群から選択される配列を含みまたはそれからなり、
ｒ、ｓ、ｘ、およびｙは同時に０ではないという条件で、ｒ、ｓ、ｘ、およびｙは、独立して０～３０（例えば、０～２９、０～２８、０～２７、０～２６、０～２５、０～２４、０～２３、０～２２、０～２１、０～２０、０～１９、０～１８、０～１７、０～１６、０～１５、０～１４、０～１３、０～１２、０～１１、０～１０、０～９、０～８、０～７、０～６、０～５、０～４、０～３、０～２、または０～１）から選択される整数である。
ある特定の実施形態において、ｘおよびｙは０であり、ｒおよびｓは、独立して１～３０（例えば、１～２９、１～２８、１～２７、１～２６、１～２５、１～２４、１～２３、１～２２、１～２１、１～２０、１～１９、１～１８、１～１７、１～１６、１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または１～２）から選択される整数であり、リピート１およびリピート２は、
ａ）リピート１は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
ｂ）リピート１は配列番号４７の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
ｃ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４７の配列を含むまたはそれからなる；
ｄ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４５の配列を含むまたはそれからなる；
ｅ）リピート１は配列番号４９の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
ｆ）リピート１は配列番号７０の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
ｇ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号６８の配列を含むまたはそれからなる；および
ｈ）リピート１は配列番号７０の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４７の配列を含むまたはそれからなる
からなる群から選択される組み合わせである。
ある特定の実施形態において、ｒ、ｘ、およびｙは０であり、ｓは、１～３０（例えば、１～２９、１～２８、１～２７、１～２６、１～２５、１～２４、１～２３、１～２２、１～２１、１～２０、１～１９、１～１８、１～１７、１～１６、１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または１～２）から選択される整数であり、リピート１は配列番号４５の配列を含むまたはそれからなる。
ある特定の実施形態において、ｙは０であり、ｒ、ｓ、およびｘは、独立して１～３０（例えば、１～２９、１～２８、１～２７、１～２６、１～２５、１～２４、１～２３、１～２２、１～２１、１～２０、１～１９、１～１８、１～１７、１～１６、１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または１～２）から選択される整数であり、リピート１、リピート２、およびリピート３は、
ａ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４９の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
ｂ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４７の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
ｃ）リピート１は配列番号７０の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４７の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
ｄ）リピート１は配列番号７０の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４７の配列を含むまたはそれからなる、
ｅ）リピート１は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号５８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる、
ｆ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号６８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４５の配列を含むまたはそれからなる、
ｇ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる、および
ｈ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号６８の配列を含むまたはそれからなる
からなる群から選択される組み合わせである。
ある特定の実施形態において、ｒ、ｓ、ｘ、およびｙは、独立して１～３０（例えば、１～２９、１～２８、１～２７、１～２６、１～２５、１～２４、１～２３、１～２２、１～２１、１～２０、１～１９、１～１８、１～１７、１～１６、１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または１～２）から選択される整数であり、リピート１、リピート２、リピート３、およびリピート４は、
ａ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号５０の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４７の配列を含みまたはそれからなり、リピート４は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる、
ｂ）リピート１は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号６８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり、リピート４は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる、
ｃ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号６８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり、リピート４は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる、
ｄ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号５８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート４は配列番号４５の配列を含むまたはそれからなる、および
ｅ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号６９の配列を含みまたはそれからなり、リピート４は配列番号６８の配列を含むまたはそれからなる
からなる群から選択される組み合わせである。
ある特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、１つの残基がＣＲＭ残基によって置換されているという点を除いて、配列番号７６～８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号９０～１１７、１７５、および１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ＣＲＭ残基
ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートは、ＣＲＭとモノコンジュゲートされ得る。ある特定の実施形態において、第１のＣＲＭ残基はリジン残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは１つのみのリジン残基を含む。そのような実施形態において、ペプチドリンカーは１つのみのリジン残基を含み、ＧＬＰ－１受容体アゴニストはリジン残基を含まない。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートにおける単一の生物活性ペプチドはＧＬＰ－１を含み、天然ＧＬＰ－１配列に見出される天然に存在する残基、すなわちＫ２６およびＫ３４は、非リジン残基に置換され得る。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、Ｋ２６Ｒ、Ｋ２６Ｑ、Ｋ２６Ａ、Ｋ２６Ｇ、Ｋ２６Ｈ、Ｋ２６Ｓ、およびＫ２６Ｔからなる群から選択されるＫ２６の置換を含む。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、Ｋ３４Ｒ、Ｋ３４Ｑ、Ｋ３４Ａ、Ｋ３４Ｇ、Ｋ３４Ｈ、Ｋ３４Ｓ、およびＫ３４Ｔからなる群から選択されるＫ３４の置換を含むまたはさらに含む。ある特定の実施形態において、Ｋ２６の置換はＫ２６ＲおよびＫ２６Ｑから選択され、かつ／またはＫ３４における置換はＫ３４ＲおよびＫ３４Ｑから選択される。本明細書を通して、Ｋ残基はＧＬＰ－１に存在するとき、Ｋの位置は、ＧＬＰ－１（１～３７）のアミノ酸配列を参照して識別される。例えば、Ｋ２６は、ＧＬＰ－１（１～３７）のアミノ酸配列を参照した２６番目の位置（ＧＬＰ－１（７～３７）のアミノ酸配列、すなわち配列番号１を参照した２０番目の位置に対応する）がＫであることを示す。同様に、Ｋ３４は、ＧＬＰ－１（１～３７）のアミノ酸配列を参照した３４番目の位置（ＧＬＰ－１（７～３７）のアミノ酸配列、すなわち配列番号１を参照した２８番目の位置に対応する）がＫであることを示す。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、Ａ８、Ｇ２２、Ｅ２７、Ｒ３６、およびＨ７、ならびに／またはその任意の組み合わせからなる群から選択される位置における１つまたは複数の付加的な変異をさらに含み得る。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、Ｋ２６ＲおよびＫ３４Ｒを含む。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１は、
配列番号７（８Ａｉｂ、２６Ｒ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号１２（８Ａｉｂ、２２Ｅ、２６Ｒ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号１７（８Ａｉｂ、２６Ｒ、３４Ｒ）、
配列番号２２（８Ａｉｂ、２２Ｅ、２６Ｒ、３４Ｒ）、
配列番号２７（８Ｇ、２６Ｒ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号３２（８Ｇ、２２Ｅ、２６Ｒ、３４Ｒ、３６Ｇ）、
配列番号３５（８Ｇ、２６Ｒ、３４Ｒ）、および
配列番号４０（８Ｇ、２２Ｅ、２６Ｒ、３４Ｒ）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、第１のＣＲＭ残基はシステイン残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは１つのみのシステイン残基を含む。そのような実施形態において、ペプチドリンカーは１つのみのシステイン残基を含み、ＧＬＰ－１受容体アゴニストはシステイン残基を含まない。ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートにおける単一の生物活性ペプチドポリペプチドはＧＬＰ－１を含む。天然ＧＬＰ－１はいかなるシステイン残基も含有せず、したがって、任意のＧＬＰ－１誘導体（本明細書において提供されるものを含む）が、それがシステイン残基を含有しない限りにおいて使用され得る。
ある特定の実施形態において、第１のＣＲＭ残基は非天然アミノ酸残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは、ＣＲＭ残基としての１つのみの非天然アミノ酸残基を含む。非天然アミノ酸は、付加的な機能および／または反応性を提供し得る多様な官能基または反応基を含有し得る。本開示の融合ポリペプチドに部分をコンジュゲートする目的に有益である特定の非天然アミノ酸は、アジド、アルキン、アルケン、シクロアルキン、またはハロゲン化物を有する側鎖を有するものを含む。
第１のＣＲＭ残基がシステインまたは非天然アミノ酸残基である場合、ＧＬＰ－１は、配列番号１、３、５、７、８、１０、１２、１３、１５、１７、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２８、３０、３２、３３、３５、３６、３８、および４０～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートは第２のＣＲＭ残基をさらに含む。ある特定の実施形態において、第２のＣＲＭ残基はペプチドリンカー内にある。そのような実施形態において、第２のＣＲＭ残基は、両ＣＲＭ残基が適正にコンジュゲートされ得るという限りにおいて、第１のＣＲＭ残基から任意の適切な距離にあり得る。ある特定の実施形態において、第２のＣＲＭ残基は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、例えばＧＬＰ－１内にある。ある特定の実施形態において、第２のＣＲＭ残基は、天然ＧＬＰ－１配列に見出される天然に存在する残基、または例えば天然に存在する残基の置換によるもしくは新たな残基の挿入による導入された残基である。
ある特定の実施形態において、第１および第２のＣＲＭ残基は両方ともリジン残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは２つのみのリジン残基を含む。ある特定の実施形態において、第２のリジン残基はＧＬＰ－１内にあり、Ｋ２３、Ｋ２６、Ｋ２７、Ｋ３０、およびＫ３４からなる群から選択される。ある特定の実施形態において、第２のＣＲＭ残基は、天然ＧＬＰ－１配列に見出される天然に存在する残基、例えばＫ２６またはＫ３４である。ある特定の実施形態において、第２のＣＲＭ残基は、導入された残基である。ＣＲＭ残基は、例えば置換によって、そのような置換がＧＬＰ－１のＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を実質的に減退させない限りにおいて、任意の適切な位置でＧＬＰ－１配列に導入され得る。第２のＣＲＭ残基は、例えばＱ２３Ｋ、Ｅ２７Ｋ、またはＡ３０Ｋの置換によって導入され得る。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１におけるＣＲＭ残基以外のすべてのリジン残基は非リジン残基に置換され、それによりポリペプチドコンジュゲートは、ＣＲＭ残基を除いて付加的なリジン残基を含まない。例えば、Ｋ２６が第２のＣＲＭ残基である場合には、Ｋ３４が非リジン残基に置換される、または逆もまた同様である。非リジン残基は当業者によって選択され得、例は、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、セリン（Ｓ）、またはトレオニン（Ｔ）を含む。
第１および第２のＣＲＭ残基の両方がリジン残基である場合、ＧＬＰ－１は、配列番号３、５、８、１０、１３、１５、１８、２０、２３、２５、２８、３０、３３、３６、および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
ある特定の実施形態において、第１および第２のＣＲＭ残基は両方ともシステイン残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは２つのみのシステイン残基を含む。ある特定の実施形態において、第２のシステイン残基はＧＬＰ－１内にある。ある特定の実施形態において、第２のシステイン残基はペプチドリンカー内にある。
ある特定の実施形態において、第１および第２のＣＲＭ残基は両方とも非天然アミノ酸残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは、ＣＲＭ残基としての２つのみの非天然アミノ酸残基を含む。
ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１におけるシステイン残基または非天然アミノ酸残基は、配列番号１と比べて、Ｑ２３、Ｋ２６、Ｅ２７、Ａ３０、およびＫ３４からなる群から選択される位置における置換によって導入される。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１におけるシステイン残基またはＮＮＡＡは、配列番号１と比べて、Ｋ２６またはＥ２７の位置における置換によって導入される。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１における第２のＣＲＭ残基はシステインであり、Ｑ２３Ｃ、Ｋ２６Ｃ、Ｅ２７Ｃ、Ａ３０Ｃ、およびＫ３４Ｃからなる群から選択される位置における置換によって導入される。
第１および第２のＣＲＭ残基の両方がシステイン残基である場合、ＧＬＰ－１は、配列番号４、６、９、１１、１４、１６、１９、２１、２４、２６、２９、３１、３４、３７、３９、および１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
ＣＲＭ
ある特定の実施形態において、ＣＲＭは、血漿タンパク質結合部分、ポリマー、Ｆｃ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびその機能的フラグメント、Ｘｔｅｎ配列、またはＰＡＳ配列を含む。ある特定の実施形態において、Ｘｔｅｎ配列は、その開示がそれらの全体によって組み入れられているＷＯ２００７１０３５１５、ＷＯ２００９０２３２７０、ＷＯ２０１００９１１２２、ＷＯ２０１１１２３８１３、ＷＯ２０１３１３０６８３、ＷＯ２０１７１４６９７９、ＷＯ２０１１０８４８０８、ＷＯ２０１３０４００９３、ＷＯ２０１３１２２６１７、ＷＯ２０１４０１１８１９、ＷＯ２０１３１８４２１６、ＷＯ２０１４１６４５６８、ＷＯ２０１５０２３８９１、ＷＯ２０１６０７７５０５、およびＷＯ２０１７０４０３４４に記載されるアミノ酸配列を有する延長した組み換えポリペプチド配列である。ある特定の実施形態において、「ＡＰＳ」という用語とも互換可能に使用され得る「ＰＡＳ」という用語は、その開示がその全体によって組み入れられているＵＳ８５６３５２１Ｂ２に記載される、Ａｌａ、Ｓｅｒ、およびＰｒｏ残基からなるアミノ酸リピートを指す。
ある特定の実施形態において、ＣＲＭはアルブミン結合部分を含む。「アルブミン結合部分」という用語は、十分な特異性を有して、好ましくは非共有結合的に、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）またはその任意の機能的フラグメントに結合し得る任意の機能的部分を指す。治療用融合ポリペプチド、ポリペプチド、またはポリペプチド複合体に付着したアルブミン結合部分は、典型的に、ヒト血清アルブミンに対する１０μＭを下回る、好ましくは１ｐＭを下回るアフィニティーを有する。アルブミン結合部分は、限定されることなく、アルブミン結合ドメイン、合成ペプチド由来のアルブミン結合配列、およびアルブミン結合化学部分を含み得る。例えば、アルブミン結合部分は、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌプロテインＧ由来のアルブミン結合ドメイン、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓタンパク質ＰＡＢ由来のアルブミン結合ドメイン、コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号１７３）を有するアルブミン結合ペプチドから選択される。アルブミン結合部分であるいくつかの小ペプチドは、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７，３８（２００２）３５０３５－３５０４３に記載されている。別の例として、アルブミン結合部分は、４～４０個の炭素原子を含有する線状および分岐状の親油性〔lipohophillic〕部分、シクロペンタノフェナントレン骨格を有する化合物等から選択される。例えば、アルブミン結合部分は、式ＣＨ３（ＣＨ２）ｖＣＯ－ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）２ＣＯ－の基であり、式中、ｖは１０～２４の整数である。
ある特定の実施形態において、アルブミン結合部分は、＊－Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅの構造、またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、アミド結合を介して相互接続され、Ａの＊末端は、ポリペプチド複合体上のコンジュゲート可能な残基の反応基に接続され、式中：
Ａは、結合、
から選択され、ａ、ｂ、ｃ、およびｄは独立して０～４の整数であり、Ｒ１は水素または－ＣＯＯＨであり；
Ｂは、結合、
から選択され、ｅは１～４の整数であり、式中、α位はα’位に連結され、
Ｃは、結合または
であり、Ｒ２は－ＣＨ２ＳＯ３Ｈまたは－ＣＯＯＨであり、ｆは１～４の整数であり、ｎは１～２５の整数であり、Ｂが結合ではない場合には、β’位はβ位に連結され、またはＢが結合である場合には、β’位はα’位に連結され；
Ｄは、結合、
から選択され、ｇおよびｈは独立して０または１であり、Ｒ３はＨまたは－ＣＨ２ＣＯＯＨであり、
Ｂが結合ではなくかつＣが結合である場合には、γ’位はβ位に連結され；
Ｃが結合ではない場合には、γ’位はγ位に連結され；
Ｂが結合でありかつＣが結合である場合には、γ’位はα’位に連結され；
Ｅは、式：
を有する酸性基であり、
式中、Ｗは－（ＣＲ４Ｒ５）ｌ－を表し、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、およびカルボキサミドからなる群から選択され、
Ｒ６はヒドロキシルまたはＮＲ７Ｒ８から選択され；
Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシル、および
からなる群から選択され、
ｌは１０～２０の整数であり、
Ｄが結合ではない場合には、δ位はδ’位に連結され、
Ｃが結合ではなくかつＤが結合である場合には、δ位はγ位に連結され、
Ｂが結合ではなく、Ｃが結合であり、かつＤが結合である場合には、δ位はβ位に連結され、
Ａが結合ではなくかつＢ、Ｃ、およびＤのすべてが結合である場合には、δ位はα’位に連結されている。
ある特定の実施形態において、ＣＲＭはリジン残基にコンジュゲートされ、任意で、リジン残基は、ペプチドリンカー内またはＧＬＰ－１内にある。
ある特定の実施形態において、Ａは結合である。
ある特定の実施形態において、Ａは結合であり、Ｂは結合または
であり、式中、ｅは１、２、または３である。ある特定の実施形態において、Ａは結合であり、Ｂは
であり、Ｃは、
であり、式中、β’位はβ位に連結され、式中、ｅは１、２、または３であり、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。ある特定の実施形態において、Ｄは結合であり、Ｅは、式：
を有する酸性基である。ある特定の実施形態において、Ｒ２は－ＣＯＯＨであり、Ｒ６はヒドロキシルである。ある特定の実施形態において、Ｗは－（ＣＲ４Ｒ５）ｌ－を表し、Ｒ４およびＲ５は独立して水素であり、ｌは１０～２０の整数である。
ある特定の実施形態において、Ａは結合であり、Ｂは結合であり、Ｃは結合である。
ある特定の実施形態において、Ａは結合であり、Ｂは結合であり、Ｃは
であり、式中、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２である。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｅは１、２、または３であり、式中、α位はα位に連結されている。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは
であり、式中、α位はα’位に連結され、β’位はβ位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｅは１、２、または３であり、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは結合であり、式中、α位はα’位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｅは１、２、または３である。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは結合であり、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２である。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは結合であり、Ｃは
であり、式中、β’位はα’位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは結合であり、Ｃは結合であり、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２である。
ある特定の実施形態において、Ｄは結合である。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは
であり、Ｄは結合であり、式中、α位はα’位に連結され、β’位はβ位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｅは１、２、または３であり、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。
ある特定の実施形態において、Ｄは
であり、式中、ｇは０または１であり、ｈは０または１である。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
または結合であり、Ｃは結合であり、Ｄは
であり、Ｂが結合ではない場合には、α位はα’位に連結され、γ’位はβ位に連結され、またはＢが結合である場合には、γ’位はα’位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｅは１、２、または３であり、ｇは０または１であり、ｈは０または１である。
ある特定の実施形態において、Ｄは
である。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは結合または
であり、Ｄは
であり、式中、α位はα’位に連結され、Ｃが結合である場合には、γ’位はβ位に連結され、またはＣが結合ではない場合、β’位はβ位に連結され、γ’位はγ位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｅは１、２、または３であり、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。
そのような実施形態において、ＣＲＭは、下の式：
の構造（－ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ－ｇＧｌｕ－２ＸＡＤＯとも称される、式中、２ＸＡＤＯとは２つの連続したＡＤＯ部分を意味し、ＡＤＯとは８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸の略である）を含む。
ある特定の実施形態において、ＣＲＭはシステイン残基にコンジュゲートされ、任意で、システイン残基は、ペプチドリンカー内またはＧＬＰ－１内にある。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、式中、α位はα’位に連結されている。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは
であり、式中、α位はα’位に連結され、β’位はβ位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｄは１、２、または３であり、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。ある特定の実施形態において、Ｄは結合であり、Ｅは、式：
を有する酸性基であり、式中、δ位はγ位に連結されている。ある特定の実施形態において、Ｒ２は－ＣＯＯＨであり、Ｒ６はヒドロキシルである。ある特定の実施形態において、Ｗは－（ＣＲ４Ｒ５）ｌ－を表し、Ｒ４およびＲ５は独立して水素であり、ｌは１０～２０の整数である。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは
であり、Ｄは結合であり、式中、α位はα’位に連結され、β’位はβ位に連結され、式中、ａは１、２、または３であり、ｂは１、２、または３であり、ｃは１または２であり、ｄは１、２、または３であり、ｆは１、２、または３であり、ｎは１または２である。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、式中、α位はα’位に連結され、式中、ｄは１、２、または３であり、ｅは１、２、または３である。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは結合であり、式中、α位はα’位に連結され、式中、ｄは１、２、または３であり、ｅは１、２、または３である。
ある特定の実施形態において、Ａは
であり、Ｂは
であり、Ｃは結合であり、Ｄは
であり、式中、α位はα’位に連結され、γ’位はβ位に連結され、式中、ｄは１、２、または３であり、ｅは１、２、または３であり、ｇは０または１であり、ｈは０または１である。
そのような実施形態において、ＣＲＭは、下の式：
の構造（ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ－ｇＧｌｕ－２ＸＡＤＯ－ＥＤＡ－ＣＯ－ＣＨ２またはＨＯＯＣ－（ＣＨ２）２０－ＣＯ－ｇＧｌｕ－２ＸＡＤＯ－ＥＤＡ－ＣＯ－ＣＨ２とも称される）を含む。
コンジュゲート
ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートは、配列番号１１８～１７４および１７７～１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートは、配列番号１１９、１２６～１２８、１３６～１３９、１４７～１５０、１５８～１６１、１６９～１７４、および１７７～１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびにリジンまたはシステイン残基に付着したＣＲＭを含む。ある特定の実施形態において、ＣＲＭは、－ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ－ｇＧｌｕ－２ＸＡＤＯ（リジンコンジュゲーションに関して）またはＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ－ｇＧｌｕ－２ＸＡＤＯ－ＥＤＡ－ＣＯ－ＣＨ２（システインコンジュゲーションに関して）の構造を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートは、配列番号１１８、１２０～１２５、１２９～１３５、１４０～１４６、１５１～１５７、１６２～１６８、１７３、１７４、および１７７～１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびに２つのリジン残基にまたは２つのシステイン残基にそれぞれ付着した２つのＣＲＭを含む。ある特定の実施形態において、ＣＲＭは、－ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ－ｇＧｌｕ－２ＸＡＤＯ（リジンコンジュゲーションに関して）またはＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ－ｇＧｌｕ－２ＸＡＤＯ－ＥＤＡ－ＣＯ－ＣＨ２（システインコンジュゲーションに関して）の構造を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートは、配列番号１１８、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１７３、１７４、および１７７～１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびに２つのリジン残基にそれぞれ付着した２つのＣＲＭを含む。ある特定の実施形態において、ＣＲＭは、－ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ－ｇＧｌｕ－２ＸＡＤＯの構造を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートは、配列番号１１９、１２６、１２７、１２８、１３６、１３７、１３８、１３９、１４７、１４８、１４９、および１５０からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびにリジン残基に付着したＣＲＭを含む。ある特定の実施形態において、ＣＲＭは、－ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ－ｇＧｌｕ－２ＸＡＤＯの構造を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートは、配列番号１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、および１７７～１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびに２つのシステイン残基にそれぞれ付着した２つのＣＲＭを含む。ある特定の実施形態において、ＣＲＭは、ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ－ｇＧｌｕ－２ＸＡＤＯ－ＥＤＡ－ＣＯ－ＣＨ２の構造を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートは、配列番号１５８、１５９、１６０、１６１、１６９、１７０、１７１、および１７２からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびにシステイン残基に付着したＣＲＭを含む。ある特定の実施形態において、ＣＲＭは、ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ－ｇＧｌｕ－２ＸＡＤＯ－ＥＤＡ－ＣＯ－ＣＨ２の構造を含む。
ある特定の実施形態において、ＣＲＭは、融合ポリペプチドにおける非天然アミノ酸残基にコンジュゲートされる。ある特定の実施形態において、ＣＲＭは、ポリペプチドにおける非天然アミノ酸残基にコンジュゲートされる。
下の表１は、ポリペプチド部、ＧＬＰ－１、およびペプチドリンカーの配列番号、ならびにＣＲＭ残基を含めた、例示的なポリペプチドコンジュゲートのそれぞれについての詳細な情報を示している。ＧＬＰ－１における変異、ならびにペプチドリンカー配列におけるリピート配列およびリピートの数も示されている。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートは、アミノ酸残基が灰色の丸の中に１文字略語として表されている、下に示される構造を含む。
分子００１：
分子００２：
分子０１２：
調製の方法
本開示は、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートのポリペプチド部（またはそのフラグメント）をコードする単離された核酸またはポリヌクレオチドを提供する。
本明細書において使用される「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかにあるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、該用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有するポリヌクレオチドを包含する。別様に示されない限り、特定のポリヌクレオチド配列は、その保存的に改変された変種（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、および相補的配列、ならびに明示的に示された配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作出することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４）を参照されたい）。
本明細書において提供されるポリペプチド（またはそのフラグメント）をコードする核酸またはポリヌクレオチドは、組み換え技法を使用して構築され得る。この目的のために、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（ＧＬＰ－１等）をコードするＤＮＡおよびペプチドリンカーをコードするＤＮＡが獲得され得、宿主細胞における転写および発現を可能にするように作動可能に連結されて、融合ポリペプチドが産生され得る。必要な場合、１種または複数のリンカーをコードするポリヌクレオチド配列も、所望の産物の発現を可能にするように作動可能に連結される。
コードポリヌクレオチド配列は、融合ポリペプチドまたはポリペプチド複合体の発現または産生が実現可能でありかつ適正な制御下にあるように、任意で発現ベクターにおける、１種または複数の調節配列にさらに作動可能に連結され得る。
コードポリヌクレオチド配列は、当技術分野において公知の組み換え技法を使用して、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のためのまたは発現のためのベクターに挿入され得る。多くのベクターが使用可能である。ベクター構成要素は、一般的に、以下のもの：シグナル配列、複製の起点、１種または複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃ、Ｓｐ６、ａｒａＢＡＤ、ｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃ、ｐＬｍ、Ａ３、ｌａｃ、ｌｐｐ、ｎｐｒ、ｐａｃ、ｓｙｎ、ｔｒｃ、およびＴ３等の原核生物プロモーター、またはＳＶ４０、ＣＭＶ、およびＥＦ－１α等の真核生物プロモーター）、および転写終結配列、のうちの１種または複数を含むが、それらに限定されるわけではない。
ベクターおよび宿主細胞
別の態様において、本開示は、本明細書において提供されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列を含むベクターは、クローニングまたは遺伝子発現のための宿主細胞に導入され得る。本明細書において使用される「宿主細胞」という語句は、外因性ポリヌクレオチドおよび／またはベクターが導入されている細胞を指す。他の実施形態において、ベクターは染色体外性である。所望の場合、宿主細胞は単離され得る。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。
本明細書におけるベクターにおけるＤＮＡをクローニングするまたは発現させるための適切な宿主細胞は、主に原核生物である。この目的のための適切な原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性生物等の真正細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えばＥ．ｃｏｌｉ等のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えばＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ等のＢａｃｉｌｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、酵母および哺乳類細胞（例えば、不死化哺乳類細胞）等の真核生物である。
本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列を含むベクターは、当業者に公知の任意の適切な方法、例えば形質転換、トランスフェクション、または形質導入を使用して、宿主細胞に導入され得る。１つの例において、ＧＬＰ－１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は発現ベクター内にサブクローニングされ得、それは宿主細胞において封入体として発現される。ベクターはウイルスベクターであり得、任意の適切なウイルスベクターがこの能力において使用され得る。
別の態様において、本開示は、本明細書において提供されるベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。上で記載される発現またはクローニングベクターで形質転換された宿主細胞は、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、またはクローニングベクターを増幅するための、必要に応じて改変された従来の栄養培地中で培養され得る。
別の態様において、本開示は、本明細書において提供されるポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で本明細書において提供される宿主細胞を培養して、ポリペプチドコンジュゲートのポリペプチド部を獲得することを含む、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートを産生する方法を提供する。
本明細書において提供されるポリペプチド部の産生のために、発現ベクターで形質転換された宿主細胞は、多様な培地中で培養され得る。テリフィックブロス、ＬＢブロス、ＬＢ寒天、Ｍ９最小培地、ＭａｇｉａＭｅｄｉａ培地、およびＩｍＭｅｄｉａ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）等の市販の細菌成長培地は、細菌宿主細胞を培養するのに適切である。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地は、真核宿主細胞を培養するのに適切である。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子等）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩等）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジン等）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物等）、微量元素（マイクロモル域内の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースまたは等価のエネルギー源を補給され得る。任意の他の必要な補給剤も、当業者に公知であろう適当な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともに以前に使用されたものであり、当業者に明白であろう。
１つの態様において、本開示は、ポリペプチド部が発現される条件下で本明細書において提供される宿主細胞を培養することを含む、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートのポリペプチド部を発現させる方法を提供する。ある特定の実施形態において、ポリペプチド部は可溶性ポリペプチドとして発現される。
組み換え技法を使用する場合、本明細書において提供されるポリペプチドは、細胞内に、ペリプラズム空間において産生され得る、または培地に直接分泌され得る。産物が細胞内に産生される場合、第１の工程として、宿主細胞でも溶解されたフラグメントでも、微粒子残屑が、例えば遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌されるタンパク質を単離するための手順を記載する。簡潔には、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間にわたって融解する。細胞残屑は遠心分離によって除去され得る。産物が培地に分泌される場合、そのような発現システムからの上清は、一般的にまず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤が前述の工程のいずれかに含まれ得、偶発的な夾雑物の成長を阻止するために抗生物質が含まれ得る。
ある特定の実施形態において、方法は、ポリペプチドを単離することをさらに含む。
細胞から調製された本明細書において提供されるポリペプチドは、例えばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥ－セルロースイオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、塩析、およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得る。
イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィーでのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、およびリン酸アンモニウム沈殿等のタンパク質精製のための他の技法も、回収される対象となるタンパク質に応じて使用可能である。
ある特定の実施形態において、方法は、ポリペプチドにＣＲＭをコンジュゲートすることをさらに含む。ポリペプチドは、適切なコンジュゲーション反応によって、例えばリジン残基、システイン残基、または非天然アミノ酸においてコンジュゲートされ得る。
例えば、リジン等の１つまたは複数のＣＲＭ残基を有するポリペプチドは、アミノ反応性作用物質と反応し得る。ある特定の実施形態において、ＣＲＭは、アシル化反応においてアシル基を介してリジン残基にコンジュゲートされる。アシル化反応の例示的な方法は、例えば、その内容全体が本明細書に組み入れられるＷＯ２００９０８３５４９およびＷＯ２０１００２９１５９に記載される。アシル化反応においてコンジュゲートされる対象となるＣＲＭは、数ある中でも、カルボン酸基、α，ω－脂肪二酸〔fatty diacid〕残基、活性化エステル、または活性化Ｎ－ヒドロキシイミドエステルを含有し得る。活性化エステルの例は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）またはスルホ－ＮＨＳエステルのようなＯ－スクシンイミド試薬、およびトラウト試薬〔Traut’s reagent〕のようなイミドエステル化合物を含み、それは、コンジュゲート可能なリジン残基のε－アミノ基と反応してアミドまたはアミジン結合を形成し得る。適切なアミノ反応性作用物質の付加的な例は、Ｏ－アシルイソ尿素、Ｎ－ヒドロキシトリアゾールエステル、無水物、フェニル活性エステル、Ｐ－ヒドロキサム酸活性エステル、アシルイミダゾール、アシルベンゾトリアゾール、アシルアジド、酸ハロゲン化物〔acid hylide〕、ホスホニウム〔phophonium〕塩、アミニウム／ウロニウム塩を含む。
別の例として、システイン等の１つまたは複数のＣＲＭ残基を有するポリペプチドは、チオール反応性作用物質に連結され得る。ある特定の実施形態において、ＣＲＭは、アルキル化反応においてシステイン残基にコンジュゲートされる。ある特定の実施形態において、ＣＲＭは、マレイミドまたはヨードアセトアミドを介して、コンジュゲート可能なシステイン残基にコンジュゲートされて炭素－硫黄結合を形成する。ある特定の実施形態において、ＣＲＭは、ジスルフィドを介して、コンジュゲート可能なシステイン残基にコンジュゲートされてジスルフィド結合を形成する。適切なチオール反応基の付加的な例は、ジエニルスルホン、α－ハロアシル、または他のチオール反応性コンジュゲーションパートナーを含む。詳細に関しては、Ｈａｕｇｌａｎｄ，２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，１９９２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：２；Ｇａｒｍａｎ，１９９７，Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｅａｎｓ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：２；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．４０－５５，６４３－６７１を参照されたい。
例えば、非天然アミノ酸残基（ＮＮＡＡ）等の１つまたは複数のＣＲＭ残基を有するポリペプチドはＣＲＭにコンジュゲートされ得、それにより、融合ポリペプチドのＮＮＡＡとＣＲＭとの間に安定な連結が形成され得る。例えば、ケト基またはアルデヒドまたはβ－ジケト部分を含有するＮＮＡＡは、ヒドラジド－またはＯ－アルキルヒドロキシルアミン－、ヒドロキシルアミン－含有作用物質と反応して、ヒドラゾンまたはＯ－アルキル化オキシム連結を形成し得る。別の例として、アジド基を含有するＮＮＡＡはアルキン誘導体と反応して、銅（Ｉ）触媒による［３＋２］付加環化によって安定なトリアゾールリンカーを形成し得る（逆もまた同様）。別の例として、アジド基を含有するＮＮＡＡは、適当な水溶性ホスフィン含有作用物質とライゲートして、シュタウディンガーライゲーションによってアミド連結を形成し得る。さらに、ＮＮＡＡにおけるチオエステル部分はアミン含有作用物質と反応して、アミド連結を形成し得る。ＮＮＡＡを有して組み入れられた本明細書において提供される融合ポリペプチドは、ジエンとジエノフィルとの間の（４＋２）付加環化（ディールス・アルダー反応）、１，３－双極子ヒュスゲン付加環化による（３＋２）付加環化、およびニトロン－オレフィン付加環化による（３＋２）付加環化等、付加環化反応により作用物質とコンジュゲートされ得る。抗体コンジュゲーションに適切な付加環化法は、例えばＷＯ０５００３２９４、ＵＳ２０１２０００４１８３、ＷＯ０６００９９０１、ＷＯ０７１３０４５３、および米国特許第６，７３７，２３６号に記載されている。
別の例として、ポリペプチドはビオチンにコンジュゲートされ得、次いで、アビジンにコンジュゲートされているＣＲＭに間接的にコンジュゲートされる。なお別の例として、融合ポリペプチドまたはポリペプチド複合体はカップリング剤に連結され得、それはＣＲＭにさらに連結する。カップリング剤の例は、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）等の二官能性部分、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジル〔disuccinimidyl suherate〕等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネート等）、およびｈｉｓ活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン等）を含む。特に好ましいカップリング剤は、ジスルフィド連結を提供するＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３－７３７（１９７８））およびＮ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）を含む。
ポリペプチドへのＣＲＭのコンジュゲーションのための付加的な方法は、例えば、全体を参照することにより本明細書に組み入れられる米国特許第５，２０８，０２０号；米国特許第６，４４１１，１６３号；ＷＯ２００５０３７９９２；ＷＯ２００５０８１７１１；およびＷＯ２００６／０３４４８８に見出される。本開示のコンジュゲートを調製する方法の具体的な例は、本開示の実験部分にも含まれる。
医薬組成物
別の態様において、本開示は、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲート、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
「薬学的に許容される」という用語は、指定された担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤、および／または塩が、製剤を含む他の成分と概ね化学的かつ／または物理的に適合し、かつそのレシピエントと生理学的に適合することを示す。
「薬学的に許容される担体」とは、対象に許容されかつ非毒性な生物活性である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。本明細書に開示される医薬組成物における使用のための薬学的な許容される担体は、例えば薬学的に許容される液体、ゲル、もしくは固体担体、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗微生物剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化物質、麻酔薬、懸濁化剤／分散剤、封鎖剤もしくはキレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または非毒性の補助物質、当技術分野において公知の他の構成要素、あるいはその様々な組み合わせを含み得る。
適切な構成要素は、例えば抗酸化物質、充填剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、防腐剤、潤滑剤、香味料、増粘剤、着色剤、乳化剤、または糖類およびシクロデキストリン等の安定剤を含み得る。適切な抗酸化物質は、例えばメチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化ヒドロキシアニソール〔hydroxanisol〕、ブチル化ヒドロキシトルエン、および／または没食子酸プロピルを含み得る。本明細書に開示されるように、本明細書において提供される医薬組成物における、メチオニン等の１種または複数の抗酸化物質の内包は、ポリペプチド複合体または二重特異性ポリペプチド複合体の酸化を減少させる。この酸化の低下は、結合アフィニティーの減少を阻止しまたは低下させ、それによってタンパク質安定性を向上させかつ貯蔵寿命を最大限に高める。したがって、ある特定の実施形態において、本明細書に開示される融合ポリペプチド、ポリペプチド複合体、またはコンジュゲート、およびメチオニン等の１種または複数の抗酸化物質を含む組成物が提供される。
さらに例示するために、薬学的な許容される担体は、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張デキストロース注射液、滅菌水注射液、またはデキストロース、および乳酸リンゲル注射液等の水性ビヒクル、植物起源の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、または落花生油等の非水性ビヒクル、静菌または静真菌濃度の抗微生物剤、塩化ナトリウムまたはデキストロース等の等張剤、リン酸またはクエン酸緩衝剤等の緩衝剤、重硫酸ナトリウム等の抗酸化物質、塩酸プロカイン等の局所麻酔薬、カルボキシメチルセルロースナトリウム〔sodium carboxymethylcelluose〕、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドン等の懸濁化剤および分散剤、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ－８０）等の乳化剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸等の封鎖剤またはキレート剤を含み得る。フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、ならびに塩化ベンゼトニウムを含む、担体として利用される抗微生物剤は、複数回投薬用容器中の医薬組成物に添加され得る。適切な賦形剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールを含み得る。適切な非毒性の補助物質は、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、安定剤、溶解度増強剤、または酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、もしくはシクロデキストリン等の作用物質を含み得る。
医薬組成物は、液体溶液、懸濁液、乳濁液、丸薬、カプセル、錠剤、持続放出製剤、または粉末であり得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン〔polyvinyl pyrollidone〕、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的担体を含み得る。
実施形態において、医薬組成物は、注射可能な組成物に製剤化される。注射可能な医薬組成物は、例えば液体溶液、懸濁液、乳濁液、または液体溶液、懸濁液、もしくは乳濁液を作出するのに適切な固体形態等、任意の従来の形態で調製され得る。注射用の調製物は、注射の準備ができている無菌でかつ／または非発熱性の溶液、皮下注射用錠剤を含めた、使用の直前に溶媒と組み合わされる準備ができている凍結乾燥粉末等の無菌の乾燥した可溶性産物、注射の準備ができている無菌懸濁液、使用の直前にビヒクルと組み合わされる準備ができている無菌の乾燥した不溶性産物、および無菌でかつ／または非発熱性の乳濁液を含み得る。溶液は、水性または非水性のいずれかであり得る。
ある特定の実施形態において、単位用量の非経口調製物は、アンプル、バイアル、または針を有する注射器にパッケージされる。非経口投与のためのすべての調製物は、当技術分野において公知でありかつ実践されるように、無菌でかつ非発熱性でなければならない。
ある特定の実施形態において、無菌の凍結乾燥粉末は、適切な溶媒に本明細書に開示されるポリペプチドコンジュゲートを溶かすことによって調製される。溶媒は、粉末または粉末から調製された復元溶液の安定性または他の薬理学的構成要素を向上させる賦形剤を含有し得る。使用され得る賦形剤は、水、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロース、または他の適切な作用物質を含むが、それらに限定されるわけではない。溶媒は、１つの実施形態ではおよそ中性のｐＨにおける、クエン酸塩、リン酸ナトリウムもしくはカリウム等の緩衝剤、または当業者に公知の他のそのような緩衝剤を含有し得る。溶液の後続の滅菌濾過、それに続く当業者に公知の標準的条件下での凍結乾燥は、望ましい製剤を提供する。１つの実施形態において、結果として生じる溶液は、凍結乾燥用のバイアルに分配されるであろう。各バイアルは、本明細書において提供される融合ポリペプチド、ポリペプチド複合体、もしくはコンジュゲート、またはその組成物の単回投薬量または複数回投薬量を含有し得る。１回の投薬または一連の投薬に必要とされるものを上回るわずかな量（例えば、約１０％）をバイアルに過剰充填することは、精確なサンプル引き出しおよび精確な投薬を容易にするために許容される。凍結乾燥粉末は、約４℃～室温等、適当な条件下で保管され得る。
注射用水を用いた凍結乾燥粉末の復元は、非経口投与における使用のための製剤を提供する。１つの実施形態において、復元のために、無菌でかつ／または非発熱性の水または他の液体の適切な担体が凍結乾燥粉末に添加される。正確な量は、与えられている選択された療法に依存し、経験的に決定され得る。
本明細書に記載される医薬組成物の投与は、通常の技能を有する医師によって有効であることが既知の任意の経路を介したものであり得る。１つの例は、無菌の注射器、または注入ポンプ等の何らかの他の機械的装置による、末梢静脈〔peripheral parenteral〕投与である。ある特定の実施形態において、末梢静脈経路は、静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内の投与の経路である。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドコンジュゲートは、経口、直腸、経鼻、または下気道経路投与等、非経口経路投与に適切な形態に製剤化される。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドコンジュゲートは、凍結乾燥または噴霧乾燥等、固体製剤に製剤化され、それは次いで、投与前に適切な希釈溶液中で復元される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｙ，Ｅｄｉｔｏｒ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６）に記載されるもの等、標準的な医薬製剤技法が採用され得る。代替的に、本明細書に記載されるポリペプチドコンジュゲートは、舌、舌下、頬側を通じた、口内の、経口の、胃および腸における、経鼻、肺内、例えば細気管支および肺胞もしくはその組み合わせを通じた、表皮、皮膚、経皮、膣内、直腸、眼球、例えば結膜、尿管、経皮、または肺内経路を通じた投与のために製剤化され得る。なおさらなる選択肢として、本明細書に記載されるポリペプチドコンジュゲートは、例えば無針注射によるもしくはパッチ、任意でイオン導入的パッチからの経皮投与、または経粘膜的、例えば頬側投与を通じた投与のために製剤化され得る。
処置の方法
別の態様において、本開示は、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における代謝性障害を阻止するまたは処置する方法を提供する。
それを必要とする対象に、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートの治療有効量を投与し、それによって病態または障害を処置するまたは阻止することを含む、治療法も提供される。ある特定の実施形態において、対象は、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートに応答する可能性がある障害または病態を有すると同定されている。
ある特定の実施形態において、代謝性障害は、糖尿病、肥満、重量超過、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、心血管様脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、糖尿病性腎症、妊娠性糖尿病、メタボリックシンドロームＸ等のメタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、末期肝疾患、肝臓脂肪症（脂肪肝）、肝硬変、または原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）である。
ある特定の実施形態において、糖尿病という病態は、高血糖症、２型糖尿病、耐糖能異常、１型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、ＭＯＤＹ（若年発症成人型糖尿病）、妊娠性糖尿病、および／またはＨｂＡ１Ｃのレベルの上昇等、すべての形態の糖尿病を含む。
ある特定の実施形態において、糖尿病という病態は、血管障害等の糖尿病性合併症を含む。
別の態様において、本開示は、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における体重を管理する方法を提供する。
別の態様において、本開示は、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における食物摂取量を低下させる方法を提供する。
別の態様において、本開示は、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における体重を低下させる方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートを使用して処置され得るまたは改善され得る病態または代謝性障害は、ヒト対象が、１２５ｍｇ／ｄＬまたはそれを上回る、例えば１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、または２００ｍｇ／ｄＬを上回る空腹時血中グルコースレベルを有する病態を含む。血中グルコースレベルは、食事摂取もしくは絶食状態で、または無作為に決定され得る。代謝性病態または障害は、対象が、代謝性病態を発症する増加したリスクがある病態も含み得る。ヒト対象に関して、そのような病態は、１００ｍｇ／ｄＬの空腹時血中グルコースレベルを含む。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートを使用して処置され得るまたは改善され得る病態または代謝性障害は、ヒト対象が、少なくとも２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０、または２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０よりも高いボディマス指数（ＢＭＩ）を有する病態を含む。ある特定の実施形態において、ヒト対象は、２５～３０、２６～３０、２７～３０、２８～３０、２５～２９、または２５～２８に及ぶＢＭＩを有する。
本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートの治療有効量は、例えば対象の体重、年齢、既往歴、現在の医薬、健康の状態、ならびに交差反応、アレルギー、感受性、および有害な副作用の潜在性、ならびに投与経路および疾患進行の程度等、当技術分野において公知の様々な因子に依存するであろう。投薬量は、これらのおよび他の状況または要件によって示されるように、当業者（例えば、医師または獣医）によって比例的に低下し得るまたは増加し得る。治療有効量は、処置されている疾患または障害の症状の緩和または改善を含む、研究者、医師、または他の臨床医によって探求されている、組織系、動物、またはヒトにおいて生物学的または医薬的応答を引き出す、本明細書において提供される融合ポリペプチド、ポリペプチド複合体、およびコンジュゲートの量、すなわち観察可能なレベルの、１種または複数の所望の生物学的または医薬的応答、例えば血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルの低下；体重の低下；または耐糖能、エネルギー消費、もしくはインスリン感受性の向上を支持する量であり得る。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇ）の治療有効投薬量で投与され得る。ある特定のこれらの実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートは、約５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の投薬量で投与され、ある特定のこれらの実施形態において、投薬量は、１０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、１ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、０．５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、または０．１ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満である。ある特定の実施形態において、投与投薬量は、処置の経過にわたって変化し得る。例えば、ある特定の実施形態において、初回の投与投薬量は、後続の投与投薬量よりも高くてもよい。ある特定の実施形態において、投与投薬量は、対象の反応に応じて処置の経過にわたって変動し得る。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートは、１日に１回、３日ごとに１回、週に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、または月に１回よりも低頻度の投薬レジメンで対象（例えば、ヒト）に投与され得る。ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートは、週に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、または月に１回の投薬間隔で対象（例えば、ヒト）に投与され得る。低い投薬頻度を有する治療効力は、患者の順守および長期にわたる処置成功を向上させる潜在性を有する。現在使用可能な処置であるセマグルチドは、週に１回投薬される。いかなる理論によっても拘束されることを望むことなく、本明細書において提供されるある特定のポリペプチドコンジュゲートは、有意に延長した半減期を有し、代謝性病態を処置することに対して、セマグルチドよりも低い頻度の投薬、例えば週に１回よりも低い頻度の投薬（例えば、８日ごとに１回、９日ごとに１回、１０日ごとに１回、１１日ごとに１回、１２日ごとに１回、１３日ごとに１回、１４日ごとに１回、１８日ごとに１回、３週間ごとに１回、２４日ごとに１回、４週間ごとに１回、または毎月１回）に適切であると思われる。ある特定の実施形態において、投薬レジメンは、週に２回の投薬、週に１回の投薬、２週間に１回の投薬、３週間ごとに１回の投薬、月に１回の投薬、または２カ月ごとに１回の投薬から選択される継続的投薬レジメンである。ある特定の実施形態において、投薬レジメンは、およそ３日ごとに１回～およそ１月あたり１回、またはおよそ週に１回～およそ１月あたり１回に及ぶ投薬間隔を有する。
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整され得る。例えば、単回投薬が投与され得る、または数回の分割された投薬が経時的に投与され得る。
本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートは、例えば非経口（例えば、皮下、腹腔内、静脈内注入を含めた静脈内、筋肉内、または皮内注射）または非経口以外（例えば、経口、鼻腔内、眼内、舌下、直腸、または局部）経路等、当技術分野において公知の任意の経路によって投与され得る。ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートは、皮下に、静脈内に、筋肉内に、または皮内に投与される。
ポリペプチドコンジュゲートは、単独で、または１種もしくは複数の付加的な治療手段もしくは治療剤との組み合わせで投与され得る。
ある特定の実施形態において、代謝性疾患を処置するために使用される場合、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートは、代謝性疾患または関連する任意の医学的障害の処置における使用のための任意の他の治療剤との組み合わせで投与され得る。本明細書において使用される「組み合わせで投与される」は、同じ医薬組成物の一部として同時での、別個の組成物として同時での、または別個の組成物として異なるタイミングでの投与を含む。別の作用物質の前または後に投与される組成物は、たとえ組成物および第２の作用物質が異なる経路を介して投与されるとしても、該語句が本明細書において使用されるように、その作用物質との「組み合わせで」投与されると見なされる。可能な場合、本明細書において提供される融合ポリペプチド、ポリペプチド複合体、またはコンジュゲートとの組み合わせで投与される付加的な治療剤は、付加的な治療剤の製品情報シートに挙げられたスケジュールに従って、またはＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，７０ｔｈ Ｅｄ（２０１６））もしくは当技術分野において周知のプロトコールに従って投与される。本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートを含む医薬組成物との組み合わせで投与され得る化合物の例の非限定的なリストは、ロシグリタゾン〔rosiglitizone〕、ピオグリタゾン〔pioglitizone〕、レパグリニド、ナテグリニド〔nateglitinide〕、メトホルミン、エキセナチド、シタグリプチン〔stiagliptin〕、プラムリンタイド、グリピジド、グリメピリド〔glimepriride〕、アカルボース、およびミグリトールを含む。
キット
開示される方法を実践するためのキットも提供される。そのようなキットは、無菌容器中に提供され得る、本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートをコードする核酸、そのような核酸を含むベクターおよび細胞、ならびにそのような核酸含有化合物を含む医薬組成物を含めた、本明細書に記載されるもの等の医薬組成物を含み得る。任意で、代謝性障害の処置において、提供される医薬組成物をどのように採用するかについての使用説明書も含まれ得る、または患者もしくは医療提供者に使用可能にされ得る。
１つの態様において、キットは、（ａ）本明細書において提供されるポリペプチドコンジュゲートまたはその変異体形態の治療有効量を含む医薬組成物；および（ｂ）医薬組成物用の１つまたは複数の容器、を含む。そのようなキットは、その使用のための使用説明書も含み得；使用説明書は、処置されている正確な代謝性障害に合わせられ得る。使用説明書は、キットにおいて提供される材料の使用および性質を記載し得る。ある特定の実施形態において、キットは、グルコースレベルの上昇、インスリンレベルの上昇、糖尿病、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、心血管様脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、糖尿病性腎症、メタボリックシンドロームＸ等のメタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、末期肝疾患、肝臓脂肪症（脂肪肝）、肝硬変、または原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）等の代謝性障害を処置する投与を行うための、患者に対する使用説明書を含む。
使用説明書は、紙またはプラスチック等の基板に印刷され得、添付文書としてキット内に、キットの容器またはその構成要素（例えば、パッケージングと関連した）のラベル等に存在し得る。他の実施形態において、使用説明書は、適切なコンピューター可読の記憶媒体、例えばＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット等に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態において、実際の使用説明書はキットに存在しないが、インターネットを通じて等、遠隔の供給元から使用説明書を獲得するための手段が提供される。この実施形態の例は、使用説明書を見ることができかつ／またはそこから使用説明書をダウンロードし得るウェブアドレスを含むキットである。しばしば、キットの一部またはすべての構成要素は、無菌性を維持する適切なパッケージングにパッケージされることが望ましいであろう。キットの構成要素は、単一の容易に扱われる単位を作るキット格納要素にパッケージされ得、キット格納要素、例えば箱または類似構造は、例えばキットの構成要素の一部またはすべてについての無菌性をさらに保つために、密閉容器であってもなくてもよい。
［実施例１］
ＧＬＰ－１タンパク質の組み換え発現および精製
表１に挙げられるＧＬＰ－１タンパク質を、ＢＬ２１（ＤＥ３）誘導体系統を使用した細菌Ｅ．ｃｏｌｉ発現システムから産生した。ＧＬＰ－１前駆体をコードするＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ発現に対してコドン最適化し、デノボ合成し、ＰＥＴ誘導体発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。対応する遺伝子コードの改変によってアミノ酸置換を遂行した。細胞密度がテリフィックブロス（ＴＢ）培地において２．０のＯＤ６００に到達した時点で、ＧＬＰ－１前駆体の過剰発現を０．５ｍＭイソプロピルｂ－ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。２０～２２時間の３７℃でのタンパク質誘導の後、細胞を収集した。細胞を収集し、細胞粉砕器（９００バール、２回）によって２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液に溶解した。ＧＬＰ－１タンパク質を含有する可溶性画分を遠心分離（８，０００×ｇ、３０分間）によって回収した。プロテアーゼによってタグを除去した後、タンパク質を逆相クロマトグラフィーによって精製した。各工程におけるサンプルをＬＣ／ＭＳによって特徴付けして、正しい分子量を確認した。
［実施例２］
組み換えタンパク質における非タンパク質新生アミノ酸の組み入れ
Ｎ末端Ｈｉｓ－Ａｉｂ－Ｇｌｕ－ＧｌｙテトラペプチドまたはＨｉｓ－Ａｉｂジペプチドを有機溶媒に溶かし、有機溶媒中ＧＬＰ－１タンパク質の溶液に添加した。反応液を室温で３時間撹拌した。次いで、ピペリジンを反応溶液に添加して、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。
［実施例３］
ＣＲＭを用いたＧＬＰ－１化合物の調製
ＮａＯＨ中ＧＬＰ－１タンパク質の溶液に、有機溶媒中ＣＲＭ試薬（すなわち、ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ－ｇＧｌｕ－２ＸＡＤＯ）を液滴で添加した。反応液を室温で１時間撹拌した。次いで、産物を逆相クロマトグラフィーに適用した。これは、上で示される表１に挙げられる化合物を提供した。
コンジュゲートしたＧＬＰ－１タンパク質を、供給元のマニュアルに従って、種々のコンジュゲートに対して最適化された条件を使用して、Ｗａｔｅｒｓ ＢｉｏＡｃｃｏｒｄ ＬＣ－ＭＳシステムを用いたＬＣ－ＭＳ法によって、またはＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムを用いたＵＰＬＣによって検出しかつ特徴付けした。
［実施例４］
インビトロ活性
方法：インビトロＧＬＰ－１活性を、１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の有無で、ヒトＧＬＰ－１受容体およびＣＲＥルシフェラーゼレポーターを過剰発現するＢＨＫ細胞株を使用して測定した。試験融合タンパク質を、３倍連続希釈を用いて、１％ＨＳＡの非存在または存在下の場合において、最上位濃度としての１ｎＭまたは１００ｎＭで測定した。細胞を分子で４時間処理した後、ルシフェラーゼ活性をＳｔｅａｄｙｌｉｔｅ ｐｌｕｓキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、６０６６７５１）によって測定した。
各タンパク質の活性を、非線形回帰分析から導き出されるＥＣ５０によって表した。
結論：ほとんどすべての分子は、ＨＳＡ補給なしのアッセイにおいて、セマグルチドに匹敵するまたはそれよりもさらに優れた効能を示す。しかしながら、種々の分子は、１％ＨＳＡの存在下でＧＬＰ－１活性の種々の程度の低下（すなわち、ＥＣ５０の増加）を呈した。表２におけるデータは、リンカー長、脂肪酸位置、およびコンジュゲートした脂肪酸部分の数がＧＬＰ－１活性に関係し得ることを示唆した。表２に示されるように、短いリンカー長（すなわち、１２個のアミノ酸残基）を有する分子（モノアシル化または二重アシル化にかかわらず）は、より長いリンカー長を有するそうした分子と比較して、有意に低下したＧＬＰ－１活性を有した。ＧＬＰ－１のＣ末端残基とＣＲＭ残基（すなわち、リンカーにおけるリジン）との間の距離が増加するにつれて、ＨＳＡの存在下における分子のＧＬＰ－１活性は着実に向上するように見えた。
表２に示されるように、モノアシル化分子００２、０１０、および０１１は、１％ＨＳＡの存在下でセマグルチドよりもはるかに高い活性を示した。二重アシル化分子０１２、０１６、００４、００６、００７、００５、００１、および０６１に関しては、すべてが、セマグルチドよりも、１％ＨＳＡの存在下で相対的に低いＧＬＰ－１活性を示したが、依然として許容される域内にあった。
［実施例５］
Ｃ５７痩せマウスにおけるインビボ活性
方法：１０週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１日目に１回タンパク質を皮下注射した。体重を毎日測定し、５匹の動物を各処理群に使用した。それぞれ個々の動物に関して体重をモニターした。ＢＷ喪失％＝１００＊（ｎ日目のＢＷ－１日目のＢＷ）／（１日目のＢＷ）。データは、平均値および標準誤差（ＳＥＭ）として示される。０から８日目までの体重喪失（％）に対する曲線下面積（ＡＵＣ ΔＢＷ ０～８ｄ）を算出した。
結論：分子００１、００２、および０１２は、体重制御に対する用量依存的効力を示した（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および表３）。図１Ｄおよび表３に示されるように、分子００７および００８は、分子０１２および０１６よりも低い効力を有し、それはインビトロ活性データと一致している。二重脂肪酸を有する分子００１、０１６、および０１２は、セマグルチドよりも持続可能な効力を呈し、分子００１、０１６、および０１２がより長い半減期を有し得ることを示唆した（図１Ａ、１Ｃ、および１Ｄ）。
［実施例６］
ｄｂ／ｄｂマウスにおけるインビボ活性
方法：１０週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウスに、タンパク質を１回皮下注射した。空腹時グルコースを種々の時点で測定し、３匹の動物を各群に使用した。デルタ血中グルコースは、ベースラインレベルを差し引かれたグルコースである。データは、平均値および標準誤差（ＳＥＭ）として示される。
結論：分子００１および００２の両方とも、グルコース制御に対する用量依存的効力を示した（図２Ａおよび２Ｂ）。二重脂肪酸を有する分子００１は、セマグルチドよりも持続可能な効力を呈し、分子００２がより長い半減期を有し得ることを示唆した。
方法：１０週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウスに、タンパク質を１回皮下注射した。非空腹時グルコースを種々の時点で測定し、５匹の動物を各群に使用した。デルタ血中グルコースは、ベースラインレベルを差し引かれたグルコースである。データは、平均値および標準誤差（ＳＥＭ）として示される。０から１９２時間までのデルタ血中グルコースに対する曲線下面積（ＡＵＣ ΔＢＧ ０～１９２ｈ）を算出した。
結論：分子０１２は、グルコース制御に対する用量依存的効力を示した（図２Ｃ、表４）。二重脂肪酸を有する分子０１２は、セマグルチドよりも持続可能な効力を呈した。
［実施例７］
薬物動態学的測定
方法：６～８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、３０ｎｍｏｌ／ｋｇタンパク質の単回皮下投薬で投与した（ｎ＝３／群）。血漿サンプルを、投薬前（－５分）、注射の０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間、および１９２時間後に回収した。血漿におけるタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。皮下注射後の各タンパク質の血漿濃度対時間を示したグラフに基づき、薬物動態学的パラメーターをＷｉｎＮｏｎｌｉｎによって算出した。
結論：分子００１および０１２は、マウスにおいてセマグルチドおよび分子００２よりも長い半減期を示し（表５）、インビボ効力と一致した。
方法：６～８週齢の雄ＳＤラットに、それぞれ１５ｎｍｏｌ／ｋｇタンパク質の単回皮下投薬（ｎ＝３／群）および１５ｎｍｏｌ／ｋｇタンパク質の単回静脈内投薬（ｎ＝３／群）で投与した。血漿サンプルを、投薬前（－５分）、皮下投与の０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間、３２時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間、１９２時間、２１６時間、および２４０時間後に回収した。血漿サンプルを、投薬前（－５分）、静脈内投与の０．０８３時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間、３２時間、４８時間、７２時間、９６時間、および１２０時間後に回収した。血漿におけるポリペプチドコンジュゲートの濃度をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法によって測定した。皮下注射後の各ポリペプチドコンジュゲートの血漿濃度対時間を示したグラフに基づき、薬物動態学的パラメーターをＷｉｎＮｏｎｌｉｎによって算出した。
結論：表６に示されるように、分子００１および０１２は、セマグルチドよりも長い半減期を示し、それは、ラットにおいて１２時間のＴ１／２を有することが報告された（ｓ．ｃ．投与、ＦＤＡからの非臨床審査において報告される）。
方法：１０カ月齢の雄Ｂａｍａミニブタに、それぞれ５ｎｍｏｌ／ｋｇ ＧＬＰ－１ポリペプチドコンジュゲートの単回皮下投薬（ｎ＝２／群）および５ｎｍｏｌ／ｋｇタンパク質の単回静脈内投薬（ｎ＝２／群）を投与した。分子０１２およびセマグルチド群に対する血漿サンプルを、投薬前（－５分）、皮下投与の０．５時間、１時間、３時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１６８時間、３３６時間、５０４時間、および６７２時間後に回収した。分子０１２およびセマグルチド群に対する血漿サンプルを、投薬前（－５分）、静脈内投与の０．０８３時間、０．５時間、１時間、３時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１６８時間、３３６時間、および５０４時間後に回収した。セマグルチド群に関しては、血漿におけるタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。分子０１２群に関しては、血漿におけるタンパク質の濃度をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法によって測定した。投与後の各ＧＬＰ－１ポリペプチドコンジュゲートの血漿濃度対時間を示したグラフに基づき、薬物動態学的パラメーターをＷｉｎＮｏｎｌｉｎによって算出した。
結論：分子０１２は、ミニブタにおいてセマグルチドよりも長い半減期を示した（表７）。
［実施例８］
疾患モデルにおける効力調査
選択された分子を疾患動物モデル（ｄｂ／ｄｂマウス等）において査定して、慢性調査における用量応答に関して体重、食物摂取量、グルコース効力を決定する。空腹時インスリン、血漿トリグリセリド、コレステロール、肝臓トリグリセリド、および炎症バイオマーカー（ＡＬＴ、ＡＳＴ、およびＣＲＰ）を含めた、いくつかのバイオマーカーも測定する。
方法：
２２週齢のＤＩＯ雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（約５０ｇ）に、指定されたＧＬＰ－１ポリペプチドコンジュゲート（すなわち、分子０１２）を２５日間皮下に１日おきに（Ｑ２Ｄ）注射した。食物摂取量および体重を１週間に２回測定し、空腹時血中グルコースを１週間に１回測定した。５匹の動物を各処理群に使用した。体重および空腹時血中グルコースは、それぞれ個々の動物に関してモニターされたが、各群動物に関する食物摂取量は一緒に測定された。１日目および２５日目が、分子投薬の初日および最終日である。データは、平均値および標準誤差（ＳＥＭ）またはプールされた値として示される。統計分析を一元配置ＡＮＯＶＡによって実施した。２５日目の体重低下を、－１＊（ＢＷ喪失％－ビヒクル群のＢＷ喪失％）によって算出し；累積的食物摂取量低下を、－１００＊（累積的食物摂取量－ビヒクルの累積的食物摂取量）／ビヒクルの累積的食物摂取量によって算出する。
結論：ＤＩＯ調査において、図３Ａ、３Ｂ、および表８に示されるように、分子０１２は、体重低下、食物摂取量低下、および血中グルコース制御に対する用量依存的効力を示した。
［実施例９］
非ヒト霊長類におけるＰＫ調査
選択された分子の薬物動態をサルにおいて査定する。皮下および静脈内注射の両方を実施する。
方法：３～５年齢の雄カニクイザルに、５ｎｍｏｌ／ｋｇタンパク質の単回皮下投薬で投与した（ｎ＝２／群）。セマグルチド群に対する血漿サンプルを、投薬前（－５分）、注射の２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、２１６時間、２８８時間、３６０時間、４３２時間、および５０４時間後に回収した。０１２群に対する血漿サンプルを、投薬前（－５分）、注射の０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間、４８時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間、１９２時間、２１６時間、２８８時間、４３２時間、および５０４時間後に回収した。セマグルチド群に関しては、血漿におけるタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。０１２群に関しては、血漿におけるタンパク質の濃度をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法によって測定した。皮下注射後の各タンパク質の血漿濃度対時間を示したグラフに基づき、薬物動態学的パラメーターをＷｉｎＮｏｎｌｉｎによって算出した。
結論：分子０１２は、サルにおいてセマグルチドおよび分子００２よりも長い半減期を示した（表９）。
［実施例１０］
免疫原性査定
選択されたＧＬＰ－１ポリペプチドコンジュゲートを、インシリコ（ｉＴｏｐｅおよびＴＣＥＤ法）およびエクスビボ（ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ）法によって免疫原性についても査定する。
［実施例１１］
ヒト血清アルブミン結合
方法：血清アルブミンへの分子の結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器において表面プラズモン共鳴によって特徴付けした。異なる種由来の血清アルブミンを、４０００ＲＵに到達するまで、ＣＭ５センサーチップ表面に共有結合させた。チップを、１０μＬ／分の流速で４２０秒間１Ｍエタノールアミンによってブロッキングした。各分子サンプルを希釈し、３０μＬ／分の流速でインジェクトして、チップに結合しているアルブミンへの結合を１２０秒間、および解離を３００秒間可能にした。分子を有しない結合緩衝液を２０秒間の流速でチップ上に送って、結合している分子の自発的解離を３０秒間可能にした。
結論：分子００４、００１、００６、および０１２は、セマグルチドおよび分子００２よりもヒト血清アルブミンについての高い結合アフィニティーを示し（表１０を参照されたい）、それはＰＫデータと一致している。

Claims (70)

  1. ａ）ペプチドリンカーのＮ末端に付着した単一の生物活性ペプチド、および
    ｂ）ペプチドリンカーにおける第１のクリアランス低下部分（ＣＲＭ）残基にコンジュゲートした第１のＣＲＭ
    を含むポリペプチドコンジュゲートであって、
    生物活性ペプチドはＧＬＰ－１受容体アゴニストを含み、
    第１のＣＲＭ残基は、ＧＬＰ－１受容体アゴニストのＣ末端アミノ酸から少なくとも５個のアミノ酸残基離れている、ポリペプチドコンジュゲート。
  2. 第１のＣＲＭ残基は、生物活性ペプチドのＣ末端アミノ酸から少なくとも１０、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３５、３８、４０、４５、４６、５０、５５、５８、６０、６５、７０、７５、７８個のアミノ酸残基離れている、請求項１に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  3. 第２のＣＲＭ残基にコンジュゲートした第２のＣＲＭをさらに含む、請求項１または２に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  4. 第２のＣＲＭ残基は、生物活性ペプチド内またはペプチドリンカー内にある、請求項３に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  5. ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、多くとも７０、６０、または５０個のアミノ酸残基の長さを有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  6. ＧＬＰ－１受容体アゴニストはＧＬＰ－１を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  7. ＧＬＰ－１は、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みまたはそれからなり、一方で配列番号１の実質的な生物学的活性を保持する、請求項６に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  8. ＧＬＰ－１は、配列番号１と比べて多くとも９、８、７、６、５、または４個の変異を含み、一方で配列番号１の実質的な生物学的活性を保持する、請求項６または７に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  9. ＧＬＰ－１は、配列番号１と比べて、Ａ８、Ｇ２２、Ｑ２３、Ｅ２７、Ｋ２６、Ａ３０、Ｋ３４、Ｒ３６、およびＨ７、またはその任意の組み合わせからなる群から選択される位置における１つまたは複数の変異を含む、請求項６から８のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  10. ＧＬＰ－１は、Ａ８Ａｉｂ、Ｇ２２Ｅ、Ｋ２６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、およびＲ３６Ｇ、またはその任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の置換を含むまたはそれからなる、請求項９に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  11. 第１のＣＲＭ残基はリジン残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは１つのみのリジン残基を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  12. 第１および第２のＣＲＭ残基は両方ともリジン残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは２つのみのリジン残基を含む、請求項２から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  13. 第２のリジン残基はＧＬＰ－１内にあり、Ｋ２３、Ｋ２６、Ｋ２７、Ｋ３０、およびＫ３４からなる群から任意で選択される、請求項１２に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  14. ＧＬＰ－１におけるＣＲＭ残基以外のすべてのリジン残基は、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）からなる群から任意で選択される非リジン残基に置換されている、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  15. 第１のＣＲＭ残基はシステイン残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは１つのみのシステイン残基を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  16. 第１および第２のＣＲＭ残基は両方ともシステイン残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは２つのみのシステイン残基を含む、請求項２から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  17. 第２のシステイン残基はＧＬＰ－１内にあり、Ｃ２３、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ３０、およびＣ３４からなる群から任意で選択される、請求項１６に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  18. 第１のＣＲＭ残基は非天然アミノ酸残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは、ＣＲＭ残基としての１つのみの非天然アミノ酸残基を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  19. 第１および第２のアミノ酸残基は非天然アミノ酸残基であり、ポリペプチドコンジュゲートは、ＣＲＭ残基としての２つのみの非天然アミノ酸残基を含む、請求項２から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  20. ＧＬＰ－１は、Ｘ７Ｘ８ＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＸ２２Ｘ２３ＡＡＸ２６Ｘ２７ＦＩＸ３０ＷＬＶＸ３４ＧＸ３６Ｇ（配列番号２）のアミノ酸配列を含み、式中：Ｘ７はＨ、イミダゾール－４－アセテート（ＩＡ）、またはイミダゾールプロピオン酸（ＩＰＡ）であり；Ｘ８はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、Ａｉｂ、Ｔ、Ｉ、またはＬであり；Ｘ２２はＧまたはＥであり；Ｘ２３はＱ、Ｃ、またはＫであり、Ｘ２６はＫ、Ｒ、またはＣであり；Ｘ２７はＥ、Ｋ、またはＣであり；Ｘ３０はＡ、Ｃ、またはＫであり、Ｘ３４はＲ、Ｋ、またはＣであり、Ｘ３６はＲまたはＧである、請求項２から１９のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  21. Ｘ７はＨであり、Ｘ８はＧまたはＡｉｂであり、Ｘ２２はＧまたはＥであり；Ｘ２３はＱ、Ｃ、またはＫであり、Ｘ２６はＫ、Ｒ、またはＣであり；Ｘ２７はＥ、Ｋ、またはＣであり；Ｘ３０はＡ、Ｃ、またはＫであり、Ｘ３４はＫ、Ｒ、またはＣであり、Ｘ３６はＲまたはＧである、請求項２０に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  22. ＧＬＰ－１は、配列番号１、３、５、７、８、１０、１２、１３、１５、１７、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２８、３０、３２、３３、３５、３６、３８、および４０～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  23. ＧＬＰ－１は、配列番号３～６、８～１１、１３～１６、１８～２１、２３～２６、２８～３１、３３、３４、３６～３９、および１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  24. ポリペプチドリンカーは、少なくとも１０個のアミノ酸残基（例えば、少なくとも１２、２４、３２、４０、４８、６０、または８０個のアミノ酸残基）の長さを有する、請求項１から２３のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  25. ポリペプチドリンカーは１２～８０個のアミノ酸残基の長さを有する、請求項２４に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  26. ペプチドリンカーは、ＣＲＭ残基を除いて、Ｇ、Ｑ、Ａ、Ｅ、Ｐ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸残基からなる、請求項１から２５のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  27. ポリペプチドリンカーは、ＣＲＭ残基を除いて、リピート配列の１つまたは複数のリピートを含むまたはそれからなる、請求項２４から２６のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  28. リピート配列は、配列番号４５（ＧＱＥＰＧＡＱＰ）、配列番号４６（ＧＡＱＰＧＡＱＰ）、配列番号４７（ＧＱＥＰ）、配列番号４８（ＧＡＱＰ）、配列番号４９（ＧＡＱＰＧＱＥＰＧＡＱＰ）、配列番号５０（ＧＡＱＰＧＱＥＰ）、配列番号５１（ＧＥＱＰ）、配列番号５２（ＧＰＱＥ）、配列番号５３（ＧＰＥＱ）、配列番号５４（ＧＳＥＰ）、配列番号５５（ＧＥＳＰ）、配列番号５６（ＧＰＳＥ）、配列番号５７（ＧＰＥＳ）、配列番号５８（ＧＱＡＰ）、配列番号５９（ＧＰＡＱ）、配列番号６０（ＧＰＱＡ）、配列番号６１（ＧＳＱＰ）、配列番号６２（ＧＡＳＰ）、配列番号６３（ＧＰＡＳ）、配列番号６４（ＧＰＳＡ）、配列番号６５（ＧＧＧＳ）、配列番号６６（ＧＳＧＳ）、配列番号６７（ＧＧＧＧＳ）、配列番号６８（ＧＱＥＰＧＱＡＰ）、配列番号６９（ＧＱＡＰＧＱＥＰ）、配列番号７０（ＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧ）、配列番号７１（ＳＥＰＡＴＳ）、配列番号７２（ＧＳＥＴＰＧ）、配列番号７３（ＴＳＥＳＡＴ）、配列番号７４（ＰＥＳＧＰＧ）、配列番号７５（ＴＳＴＥＰＳ）、およびＧＳからなる群から選択される配列からなる、請求項２７に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  29. ポリペプチドリンカーは、（リピート１）ｒ（リピート２）ｓ（リピート３）ｘ（リピート４）ｙを含み、式中：
    リピート１、リピート２、リピート３、およびリピート４は、ペプチド結合を介してまたは１つもしくは複数のアミノ酸残基を介して連結され、
    リピート１、リピート２、リピート３、およびリピート４は、独立して、配列番号４５（ＧＱＥＰＧＡＱＰ）、配列番号４６（ＧＡＱＰＧＡＱＰ）、配列番号４７（ＧＱＥＰ）、配列番号４８（ＧＡＱＰ）、配列番号４９（ＧＡＱＰＧＱＥＰＧＡＱＰ）、配列番号５０（ＧＡＱＰＧＱＥＰ）、配列番号５１（ＧＥＱＰ）、配列番号５２（ＧＰＱＥ）配列番号５３（ＧＰＥＱ）、配列番号５４（ＧＳＥＰ）、配列番号５５（ＧＥＳＰ）、配列番号５６（ＧＰＳＥ）、配列番号５７（ＧＰＥＳ）、配列番号５８（ＧＱＡＰ）、配列番号５９（ＧＰＡＱ）、配列番号６０（ＧＰＱＡ）、配列番号６１（ＧＳＱＰ）、配列番号６２（ＧＡＳＰ）、配列番号６３（ＧＰＡＳ）、配列番号６４（ＧＰＳＡ）、配列番号６５（ＧＧＧＳ）、配列番号６６（ＧＳＧＳ）、配列番号６７（ＧＧＧＧＳ）、配列番号６８（ＧＱＥＰＧＱＡＰ）、配列番号６９（ＧＱＡＰＧＱＥＰ）、配列番号７０（ＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧ）、配列番号７１（ＳＥＰＡＴＳ）、配列番号７２（ＧＳＥＴＰＧ）、配列番号７３（ＴＳＥＳＡＴ）、配列番号７４（ＰＥＳＧＰＧ）、配列番号７５（ＴＳＴＥＰＳ）、およびＧＳからなる群から選択される配列を含みまたはそれからなり、
    ｒ、ｓ、ｘ、およびｙは同時に０ではないという条件で、ｒ、ｓ、ｘ、およびｙは、独立して０～３０または０～２０から選択される整数である、
    請求項２８に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  30. ｘおよびｙは０であり、ｒおよびｓは、独立して１～３０から選択される整数であり、リピート１およびリピート２は、
    ａ）リピート１は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
    ｂ）リピート１は配列番号４７の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
    ｃ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４７の配列を含むまたはそれからなる；
    ｄ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４５の配列を含むまたはそれからなる；
    ｅ）リピート１は配列番号４９の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
    ｆ）リピート１は配列番号７０の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
    ｇ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号６８の配列を含むまたはそれからなる；および
    ｈ）リピート１は配列番号７０の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４７の配列を含むまたはそれからなる
    からなる群から選択される組み合わせである、
    請求項２９に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  31. ｒ、ｘ、およびｙは０であり、ｓは、１～３０または１～２０から選択される整数であり、リピート１は配列番号４５の配列を含むまたはそれからなる、請求項２９に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  32. ｙは０であり、ｒ、ｓ、およびｘは、独立して１～３０から選択される整数であり、リピート１、リピート２、およびリピート３は、
    ａ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４９の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
    ｂ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４７の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
    ｃ）リピート１は配列番号７０の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４７の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる；
    ｄ）リピート１は配列番号７０の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４７の配列を含むまたはそれからなる、
    ｅ）リピート１は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号５８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる、
    ｆ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号６８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４５の配列を含むまたはそれからなる、
    ｇ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる、および
    ｈ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号６８の配列を含むまたはそれからなる
    からなる群から選択される組み合わせである、
    請求項２９に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  33. ｒ、ｓ、ｘ、およびｙは、独立して１～３０または１～２０から選択される整数であり、リピート１、リピート２、リピート３、およびリピート４は、
    ａ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号５０の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４７の配列を含みまたはそれからなり、リピート４は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる、
    ｂ）リピート１は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号６８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり、リピート４は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる、
    ｃ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号６８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり、リピート４は配列番号４８の配列を含むまたはそれからなる、
    ｄ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号５８の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート４は配列番号４５の配列を含むまたはそれからなる、および
    ｅ）リピート１は配列番号４８の配列を含みまたはそれからなり、リピート２は配列番号４５の配列を含みまたはそれからなり；リピート３は配列番号６９の配列を含みまたはそれからなり、リピート４は配列番号６８の配列を含むまたはそれからなる
    からなる群から選択される組み合わせである、
    請求項２９に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  34. ペプチドリンカーは、１つの残基がＣＲＭ残基によって置換されているという点を除いて、配列番号７６～８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  35. ペプチドリンカーは、配列番号９０～１１７、１７５、および１７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  36. 配列番号１１８～１７４および１７７～１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１から３５のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  37. ＣＲＭは、血漿タンパク質結合部分、ポリマー、Ｆｃ、ＨＳＡ（アルブミン）、Ｘｔｅｎ配列、またはＰＡＳ配列を含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  38. ＣＲＭはアルブミン結合部分を含む、請求項３７に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  39. アルブミン結合部分は、＊－Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅの構造、またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、アミド結合を介して相互接続され、Ａの＊末端は、ポリペプチド複合体上のコンジュゲート可能な残基の反応基に接続され、式中：
    Ａは、結合、
    から選択され、ａ、ｂ、ｃ、およびｄは独立して０～４の整数であり、Ｒ１は水素または－ＣＯＯＨであり；
    Ｂは、結合、
    から選択され、ｅは１～４の整数であり、式中、α位はα’位に連結され、
    Ｃは、結合または
    であり、Ｒ２は－ＣＨ２ＳＯ３Ｈまたは－ＣＯＯＨであり、ｆは１～４の整数であり、ｎは１～２５の整数であり、Ｂが結合ではない場合には、β’位はβ位に連結され、またはＢが結合である場合には、β’位はα’位に連結され；
    Ｄは、結合、
    から選択され、ｇおよびｈは独立して０または１であり、Ｒ３はＨまたは－ＣＨ２ＣＯＯＨであり、
    Ｂが結合ではなくかつＣが結合である場合には、γ’位はβ位に連結され；
    Ｃが結合ではない場合には、γ’位はγ位に連結され；
    Ｂが結合でありかつＣが結合である場合には、γ’位はα’位に連結され；
    Ｅは、式：
    を有する酸性基であり、
    式中、Ｗは－（ＣＲ４Ｒ５）ｌ－を表し、
    Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、およびカルボキサミドからなる群から選択され、
    Ｒ６はヒドロキシルまたはＮＲ７Ｒ８から選択され；
    Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシル、および
    からなる群から選択され、ｌは１０～２０の整数であり、
    Ｄが結合ではない場合には、δ位はδ’位に連結され、
    Ｃが結合ではなくかつＤが結合である場合には、δ位はγ位に連結され、
    Ｂが結合ではなく、Ｃが結合であり、かつＤが結合である場合には、δ位はβ位に連結され、
    Ａが結合ではなくかつＢ、Ｃ、およびＤのすべてが結合である場合には、δ位はα’位に連結されている、
    請求項３８に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  40. ＣＲＭはリジン残基にコンジュゲートされている、請求項３９に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  41. Ａは結合であり、Ｂは結合である、請求項４０に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  42. Ａは
    であり、Ｂは
    であり、式中、α位はα’位に連結されている、請求項４０に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  43. Ａは
    であり、Ｂは結合である、請求項４０に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  44. Ａは結合であり、Ｂは
    である、請求項４０に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  45. ＣＲＭは、下の式：
    の構造を含む、請求項４０に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  46. ＣＲＭはシステイン残基にコンジュゲートされている、請求項３９に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  47. Ａは
    であり、Ｂは
    であり、式中、α位はα’位に連結されている、請求項４６に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  48. ＣＲＭは、下の式：
    の構造を含む、請求項４６に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  49. 請求項１から４８のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲートのポリペプチド部をコードするポリヌクレオチド。
  50. 請求項４９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  51. 請求項５０に記載のベクターを含む宿主細胞。
  52. 宿主細胞は原核細胞または真核細胞である、請求項５１に記載の宿主細胞。
  53. 請求項４９に記載のポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で請求項５１に記載の宿主細胞を培養して、ポリペプチドコンジュゲートのポリペプチド部を獲得することを含む、請求項１から４８のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲートを産生する方法。
  54. 宿主細胞は原核細胞または真核細胞である、請求項５３に記載の方法。
  55. ポリペプチド部は可溶性タンパク質として発現される、請求項５４に記載の方法。
  56. ポリペプチド部にＣＲＭをコンジュゲートすることをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 請求項１から４８のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲート、および薬学的に許容される塩を含む医薬組成物。
  58. 請求項１から４８のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における代謝性障害を阻止するまたは処置する方法。
  59. 代謝性障害は、糖尿病、肥満、重量超過、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、心血管様脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、糖尿病性腎症、妊娠性糖尿病、メタボリックシンドロームＸ等のメタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、末期肝疾患、肝臓脂肪症（脂肪肝）、肝硬変、または原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）である、請求項５８に記載の方法。
  60. 糖尿病は、高血糖症、２型糖尿病、耐糖能異常、１型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、ＭＯＤＹ（若年発症成人型糖尿病）、妊娠性糖尿病、およびＨｂＡ１Ｃのレベルの上昇からなる群から選択される１種または複数の病態を含む、請求項５８に記載の方法。
  61. 請求項１から４８のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における体重を管理する方法。
  62. 請求項１から４８のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における食物摂取量を低下させる方法。
  63. 請求項１から４８のいずれか一項に記載のポリペプチドコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における体重を低下させる方法。
  64. 対象はヒトである、請求項５８から６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 対象は、１２５ｍｇ／ｄＬまたはそれを上回る空腹時血中グルコースレベルを有する、請求項６３に記載の方法。
  66. 対象は、少なくとも２５または２５よりも高いボディマス指数（ＢＭＩ）を有する、請求項６３または６４に記載の方法。
  67. ポリペプチドコンジュゲートは、１日に１回、３日ごとに１回、または週に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、または月に１回よりも低頻度の投薬レジメンで投与される、請求項５８から６０のいずれか一項に記載の方法。
  68. ポリペプチドコンジュゲートは、週に２回、週に１回、２週間に１回、３週間ごとに１回、月に１回、または２カ月ごとに１回投与される、請求項６３から６６のいずれか一項に記載の方法。
  69. 投薬レジメンは、およそ３日ごとに１回～およそ１月あたり１回、またはおよそ週に１回～およそ１月あたり１回に及ぶ投薬間隔を有する、請求項６３から６７のいずれか一項に記載の方法。
  70. ポリペプチドコンジュゲートは、皮下にまたは静脈内にまたは経口的に投与される、請求項６３から６８のいずれか一項に記載の方法。
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