DE69725747T2

DE69725747T2 - Liposome enthaltend cisplatin

Info

Publication number: DE69725747T2
Application number: DE69725747T
Authority: DE
Inventors: M. Robert ABRA; Karen Reis
Original assignee: Sequus Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alza Corp
Priority date: 1996-08-23
Filing date: 1997-08-19
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2017-08-20
Also published as: EP0929293A1; ES2208946T3; DK0929293T3; AU3985697A; TW483759B; CA2263455A1; HK1021320A1; PT929293E; US6126966A; WO1998007409A1; ATE252372T1; US5945122A; AU714992B2; CA2263455C; DE69725747D1; EP0929293B1; JP2001501173A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Liposomzusammensetzung, die eine eingeschlossene Cisplatinverbindung enthält.
Verweise
Freise, J., et al., Arch. Int. Pharmacodyn. 258: 180–192 (1982).
Gondal, J. A., et al., Eur. J. Cancer 29A (11): 1536–1542 (1993).
Mabrey, S., et al., Biochem. 17: 2464–2468 (1978).
Martin, F. J., SPECIALIZED DRUG DELIVERY SYSTEMS-MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY, (P. Tyle, Ed.) Marcel Dekker, New York, S. 267–316 (1990).
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Potkul, R. K., et al., Am. J. Obstet Gynecol. 164 (2): 652–658 (1991).
Prestayko, A. W., CANCER AND CHEMO. VOL III (Crooke, et al., Eds.) Academic Press, NY, 133–154 (1981).
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Sur, B., et al., Oncology 40: 372–376 (1983).
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Weiss, R. B., et al., Drugs 46 (3): 360–377 (1993).
Hintergrund der Efindung
Cisplatin – cis-Diamin-dichlorplatin(II) – ist eines der effektivsten Antitumormittel, die bei der systemischen Behandlung von Keimzellkrebsarten verwendet werden. Dieses chemotherapeutische Arzneimittel ist äußerst wirksam bei der Behandlung von Tumormodellen bei Labortieren und bei humanen Tumoren, wie Gebärmutterschleimhaut-, Harnblasen-, Eierstock- und Hoden-Neoplasmen sowie Plattenepithelkarzinom des Kopfes oder Nackens (Sur, et al., 1983; Steerenberg, et al., 1987).
Wie andere Krebschemotherapeutika ist Cisplatin ein hochtoxisches Arzneimittel. Die Hauptnachteile von Cisplatin sind seine extreme Nephrotoxizität, was der dosisbegrenzende Hauptfaktor ist, seine schnelle Ausscheidung durch die Nieren mit einer Kreislaufhalbwertszeit von nur wenigen Minuten, und seine starke Affinität zu Plasmaproteinen (Freise, et al., 1982).
Versuche, die Toxizität des Arzneimittels zu verringern, umfaßten Kombinationschemotherapie, Synthese von Cisplatinanaloga (Prestayko, 1991; Weiss, et al., 1993), Immuntherapie und Einschluß in Liposomen (Sur, et al., 1983; Weiss, et al., 1993). Antineoplastische Mittel, einschließlich Cisplatin, die in Liposomen eingeschlossen werden, weisen eine verringerte Toxizität in bezug auf das Mittel in freier Form auf, während die Antitumoraktivität erhalten bleibt (Steerenberg, et al., 1987; Weiss, et al., 1993).
Jedoch ist es schwierig, Cisplatin effektiv in Liposomen aufgrund der geringen wässerigen Löslichkeit des Arzneimittels, ungefähr 1,0 mg/ml bei Raumtemperatur, und geringen Lipophilie einzuschließen, wobei beide zu einem geringen Arzneimittel/Lipid-Verhältnis beitragen.
Liposomen, die Cisplatin enthalten, leiden an einem anderen Problem – Stabilität der Zusammensetzung. Insbesondere ist die Erhaltung des Arzneimittels in dem Liposom während der Lagerung ein erkanntes Problem (Freise, et al., 1982; Gondal, et al., 1993; Potkul, et al., 1991; Steerenberg, et al., 1987; Weiss, et al., 1993) und eine begrenzte Lagerfähigkeit der Liposomen, die Cisplatin enthalten, in der Größenordnung von mehreren Wochen bei 4°C ist berichtet worden (Gondal, of al., 1993; Potkul, et al., 1991).
EP-A-0551169 beschreibt eine Liposomzusammensetzung, in der eine wässerige Lösung ein wasserlösliches Arzneimittel in gesättigter Konzentration oder mehr bei normaler Temperatur als eingeschlossen in Liposomen enthält. Liposome mit einer Beschichtung einer hydrophilen Polymerbeschichtung werden nicht offenbart.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt umfaßt die Erfindung eine Liposomzusammensetzung, die eine eingeschlossene Cisplatinverbindung enthält. Die Zusammensetzung umfaßt Liposome mit einer äußeren Oberfläche und einer inneren Oberfläche, die ein wässeriges Liposomkompartiment definieren. Die Liposome bestehen aus einem Vesikelbildenden Lipid und zwischen 1 und 20 mol-% eines Vesikel-bildenden Lipids, das mit einem hydrophilen Polymer derivatisiert ist. Die Liposome werden so gebildet, daß das hydrophile Polymer eine Beschichtung von hydrophilen Polymerketten auf sowohl den inneren als auch den äußeren Oberflächen bildet. Die Cisplatinverbindung wird in die Liposome mit wesentlich größerer Retention als in Liposome, denen es an den inneren und äußeren Polymeroberflächenbeschichtungen mangelt, eingeschlossen.
Die Cisplatinverbindung ist in einer Ausführungsform natives Cisplatin und wird in die Liposome bei einem Arzneimittel/Lipid-Verhältnis von zwischen 10 und 20 μg/mg Gesamtlipid eingeschlossen. In einer anderen Ausführungsform ist die Cisplatinverbindung ein Cisplatinanalogon.
In einer anderen Ausführungsform bestehen die hydrophilen Polymerketten aus einem hydrophilen Polymer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethylether, Polymethyloxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid, Polyhydroxypropylmethacrylat, Polyhydroxyethylacrylat, Hydroxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Polyethlyenglykol und Polyaspartamid. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das hydrophile Polymer Polyethylenglykol.
Die Liposome weisen in einer Ausführungsform Größen zwischen 80 und 160 nm, vorzugsweise 100 und 140 nm, am stärksten bevorzugt zwischen 100 und 120 nm auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Vesikel-bildende Lipid hydriertes Sojaphosphatidylcholin und das derivatisierte Vesikel-bildende Lipid ist Distearylphosphatidylethanolamin, das mit Polyethylenglykol derivatisiert ist.
In einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Einschließen einer Cisplatinverbindung in Liposome durch Erwärmen einer wässerigen Lösung einer Cisplatinverbindung auf eine Temperatur, die ausreichend ist, dessen Löslichkeit über die Löslichkeit der Verbindung bei Raumtemperatur anzuheben. Zu der erwärmten Cisplatinverbindungslösung wird ein Vesikel-bildendes Lipid und zwischen etwa 1 und 20 Mol-% eines Vesikel-bildenden Lipids, derivatisiert mit einem hydrophilen Polymer, zugegeben. Durch das Zugeben werden Liposome mit einer inneren Oberflächenbeschichtung und einer äußeren Oberflächenbeschichtung der hydrophilen Polymerketten gebildet und die Cisplatinverbindung wird in die Liposome mit wesentlich größerer Retention als in Liposome, denen es an den Polymerbeschichtungen mangelt, eingeschlossen.
In einer Ausführungsform des Verfahrens ist die Cisplatinverbindung natives Cisplatin und die wäßrige Cisplatinlösung wird auf eine Temperatur erwärmt, die ausreichend ist, einen zweifachen Anstieg in der Cisplatinlöslichkeit über dessen Raumtemperaturlöslichkeit zu erreichen.
In einer anderen Ausführungsform wird eine Lösung von Vesikel-bildenden Lipiden, die auf innerhalb von etwa 10°C der Temperatur der Cisplatinlösung erwärmt wird, zu der Cisplatinverbindungslösung zugegeben.
In einer anderen Ausführungsform wird zu der Cisplatinlösung eine Lösung, enthaltend ein Vesikel-bildendes Lipid mit einer Phasenübergangstemperatur von innerhalb etwa 10°C der Temperatur, auf welche die Cisplatinlösung erwärmt wird, zugegeben.
In einer anderen Ausführungsform enthält die Vesikel-bildende Lipidlösung, die zu der Cisplatinlösung zugegeben wurde, ein Vesikel-bildendes Lipid mit einer Phasenübergangstemperatur zwischen 40 und 70°C.
Diese und andere Gegenstände und Merkmale der Erfindung werden ausführlicher beurteilt, wenn die folgende ausführliche Beschreibung der Erfindung zusammen mit den beiliegenden Zeichnungen gelesen wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung eines Liposoms, das gemäß der Erfindung gebildet wurde;
2 zeigt ein allgemeines Reaktionsschema zum Derivatisieren eines Vesikelbildenden Lipids mit einem Polyalkylether;
3 ist ein Reaktionsschema zum Herstellen von Phosphatidylethanolamin, derivatisiert mit Polyethylenglykol, mittels eines Cyanurchlorid-Verknüpfungsmittels:
4 zeigt ein Reaktionsschema zum Herstellen von Phosphatidylethanolamin, derivatisiert mit Polyethylenglykol, durch ein Diimidazolaktivierungsreagens;
5 ist ein Diagramm des Tumorvolumens in mm³ als Funktion von Tagen nach der Impfung von Mäusen, die mit C26-Kolontumormodell geimpft und an den Tagen 12, 19 und 26 mit Salzlösung (∎), freiem Cisplatin (
), freiem Carboplatin (•) oder mit Liposom-eingeschlossenem Cisplatin (
) behandelt werden;
6 ist ein Diagramm des Tumorvolumens in mm³ als Funktion von Tagen nach der Impfung von Mäusen, die mit C26-Kolontumormodell geimpft und an den Tagen 12, 19 und 26 mit Salzlösung (∎), freiem Cisplatin (
) oder mit Lipsosomeingeschlossenem Cisplatin gemäß den drei Dosierungsregimen (
, ♦, •) behandelt wurden; und
7 ist ein Diagramm des Tumorvolumens in mm³ als Funktion von Tagen nach der Impfung von Mäusen, die mit Lewis-Lungenkarzinom geimpft und an den Tagen 7, 14 und 21 mit Salzlösung (∎), freiem Cisplatin IV (♦), freiem Cisplatin IP (•) oder mit Lipsom-eingeschlossenem Cisplatin IV (
) oder IP (
) behandelt wurden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
I. Liposomzusammensetzung
Die Liposomzusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfaßt Liposome mit einer fest eingeschlossenen Cisplatinverbindung. Wie hierin verwendet, bezieht sich die „fest eingeschlossene Cisplatinverbindung" auf natives Cisplatin oder ein Cisplatinanalogon, das innerhalb eines Liposoms in erster Linie innerhalb des wässerigen Zwischenraums des Liposoms eingefangen wird, so daß die Cisplatinverbindung im wesentlichen innerhalb des Liposoms vor der Verabreichung gehalten wird.
1 zeigt ein Liposom 10, das gemäß der Erfindung hergestellt wird, wobei es eine innere Lipiddoppelschicht 12 und eine äußere Lipiddoppelschicht 14 umfaßt. Die inneren und äußeren Lipiddoppelschichten werden überwiegend aus Vesikelbildenden Lipiden, wie Lipid 16, das eine polare Kopfgruppe 16a und einen hydrophoben Schwanz 16b umfaßt, gebildet. Beispielhafte Vesikel-bildende Lipide werden nachstehend aufgelistet.
Liposom 10 umfaßt ebenso Vesikel-bildende Lipide, die mit einem hydrophilen Polymer derivatisiert wurden, wie das derivatisierte Lipid 18 in 1. Das derivatisierte Lipid 18 umfaßt einen hydrophoben Schwanz 18a, eine polare Kopfgruppe 18b und ein hydrophiles Polymer 18c, das an die polare Kopfgruppe durch nachstehend beschriebene Weisen angelagert ist. Das hydrophile Polymer stellt Oberflächenbeschichtungen 20, 21 von hydrophilen Polymerketten auf sowohl einer äußeren Oberfläche 22 der äußeren Lipiddoppelschicht 14 als auch einer inneren Oberfläche 24 der inneren Lipiddoppelschicht 12 bereit. Die äußere Oberflächenbeschichtung von hydrophilen Polymerketten ist dahingehend wirkungsvoll, ein Liposom mit einer langen Blutzirkulationslebensdauer in vivo bereitzustellen. Wie es nachstehend darge stellt wird, sind die inneren und äußeren Oberflächenbeschichtungen außerdem dahingehend wirkungsvoll, eine Cisplatin-Liposomzusammensetzung mit langer Lagerfähigkeit, beispielsweise eine stabile Liposomzusammensetzung, wo die Cisplatinverbindung in dem Liposom gehalten wird, bereitzustellen.
Liposom 10 umfaßt ebenso eine Cisplatinverbindung, beispielsweise natives Cisplatin oder ein Cisplatinanalogon, in eingeschlossener Form. Das Arzneimittel wird in dem inneren, wässerigen Kompartiment 26 in gelöster Form oder in ausgefällter Form eingeschlossen. In Untersuchungen, die zur Unterstützung der Erfindung durchgeführt wurden, wurde Cisplatin in Liposome, die mit einer Oberflächenbeschichtung von hydrophilen Polymerketten auf den inneren und äußeren Oberflächen des Liposoms hergestellt wurden, eingeschlossen. Diese Liposome wiesen, wenn sie mit Liposomen verglichen werden, denen es an der hydrophilen Polymerbeschichtung mangelt, eine verbesserte Stabilität auf, wie es durch die Fähigkeit, das Arzneimittel innerhalb des Liposoms für einen längeren Zeitraum zu halten, bewiesen wird.
A. Vesikel-bildende Lipidkomponente
Die Liposomzusammensetzung der vorliegenden Erfindung besteht überwiegend aus Vesikel-bildenden Lipiden. Ein derartiges Vesikel-bildendes Lipid ist eines, das (a) spontan zu doppelschichtigen Vesikeln in Wasser geformt werden kann, wie durch die Phospholipide veranschaulicht, oder (b) fest in Lipiddoppelschichten aufgenommen wird, wobei dessen hydrophober Teil mit dem inneren, hydrophoben Bereich der doppelschichtigen Membran in Kontakt ist, und dessen polarer Kopfgruppenteil gegen die äußere, polare Oberfläche der Membran gerichtet ist.
Die Vesikel-bildenden Lipide dieses Typs sind vorzugsweise die mit zwei Kohlenwasserstoffketten, typischerweise Acylketten, und einer polaren Kopfgruppe. Es gibt eine Vielzahl an synthetischen Vesikel-bildenden Lipiden und natürlichvorkommenden Vesikel-bildenden Lipiden, einschließlich Phospholipide, wie Phosphatidylchlolin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylinositol (PI) und Sphingomyelin (SM), wo die zwei Kohlenstoffketten typischerweise zwischen 14 und 22 Kohlenstoffatome lang sind, und variierende Un gesättigtheitsgrade aufweisen. Ein bevorzugtes Lipid zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist hydriertes Sojaphosphatidylcholin (HSPC).
Die oben beschriebenen Lipide und Phospholipide, deren Acylketten variierende Ungesättigtheitsgrade aufweisen, können kommerziell erhalten oder gemäß den veröffentlichten Verfahren hergestellt werden.
Das Vesikel-bildende Lipid kann so ausgewählt werden, daß ein spezieller Grad an Fließfähigkeit oder Steifigkeit erreicht wird, um die Stabilität des Liposoms in Serum zu kontrollieren, und um die Freisetzungsrate des eingeschlossenen Mittels in dem Liposom zu kontrollieren. Liposome mit einer steiferen Lipiddoppelschicht oder einer flüssigen Kristalldoppelschicht werden durch Einbringen eines relativ steifen Lipids, beispielsweise ein Lipid mit einer relativ hohen Phasenübergangstemperatur, beispielsweise bis zu 80°C, erreicht. Steife d. h. gesättigte, Lipide tragen zur größeren Membransteifigkeit in der Lipiddoppelschicht bei. Andere Lipidkomponenten, wie Cholesterin, sind ebenso dafür bekannt, zur Membransteifigkeit in den Lipiddoppelschichtstrukturen beizutragen.
Die Lipidfließfähigkeit wird durch Einbringen eines relativ flüssigen Lipids, typischerweise eines mit einer Lipidphase mit einer relativ geringen Lipid-zu-Lipid-Kristallphasenübergangstemperatur, beispielsweise bei oder unter Raumtemperatur (20 bis 25°C), erreicht.
Lipide, die zur Verwendung in der Cisplatin-Liposomzusammensetzung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Vesikel-bildende Lipide mit Phasenübergangstemperaturen bei oder unter Raumtemperatur und die mit einer hohen Phasenübergangstemperatur. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Vesikel-bildendes Lipid mit einer Phasenübergangstemperatur zwischen 40 und 70°C eingesetzt. In einer anderen Ausführungsform ist das Lipid, das zum Bilden der Liposomen verwendet wird, eines mit einer Phasenübergangstemperatur innerhalb etwa 20°C, stärker bevorzugt 10°C, am stärksten bevorzugt 5°C, der Temperatur, auf welche die Lösung, die die Cisplatinverbindung enthält, während der Liposomherstellung erwärmt wird, wie es beschrieben wird. Die Phasenübergangstemperaturen von Lipiden werden in einer Vielzahl an Quellen, wie Avanti Polar Lipids Katalog und Lipid Thermotropic Phase Transition Database (LIPIDAT, NIST Standard Reference Database 34), tabellarisch dargestellt.
Die Liposome können andere Lipide umfassen, die ein Vesikel oder Liposom, das überwiegend aus Phospholipiden besteht, stabilisieren können. Ein häufig eingesetztes Lipid für diesen Zweck ist Cholesterin bei zwischen 25 und 40 Mol-%. Bei zwischen 0 und 20 Mol-% Cholesterin in einer Doppelschicht existieren separate Domänen, enthaltend Cholesterin und Phospholipide und reines Phospholipid (Mabrey, et al., 1978). Diese Doppelschichten zeigen eine erhöhte Wasserdurchlässigkeit (Tsong, 1975). In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Cholesterin in die Liposomzusammensetzung eingeschlossen, wie es nachstehend beschrieben wird.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Liposome, die eine Cisplatinverbindung enthalten, durch Zugabe eines Gemisches aus Vesikel-bildenden Lipiden, die zwischen 1 und 20 Mol-% eines Vesikel-bildenden Lipids enthalten, das mit einem hydrophilen Polymer derivatisiert wurde, zu einer erwärmten wässerigen Lösung einer Cisplatinverbindung hergestellt. Die Lipide werden in einem geeigneten Lipidlösungsmittel, wie Ethanol, Methanol, Chloroform oder Gemischen davon gelöst.
Vor der Zugabe der Lipide wird die wässerige Lösung der Cisplatinverbindung auf eine Temperatur erwärmt, die ausreichend ist, deren Löslichkeit über die Raumtemperaturlöslichkeit der Cisplatinverbindung anzuheben. Das heißt, die Lösung wird auf eine Temperatur erwärmt, die mindestens etwa eine zweifache, vorzugsweise eine dreifache, stärker bevorzugt eine vierfache Erhöhung in der Löslichkeit über die wässerige Raumtemperaturlöslichkeit der Cisplatinverbindung erreicht. Beispielsweise kann Cisplatin mit einer wässerigen Löslichkeit von 1 mg/ml bei 20 bis 25°C auf etwa 63°C erwärmt werden, um die wässerige Löslichkeit auf etwa 8,5 mg/ml anzuheben. Die Löslichkeit von Cisplatin und von Cisplatinanaloga kann ohne weiteres durch einen Fachmann gemäß den Standardverfahrensweisen bestimmt werden.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Lösung, die das Vesikelbildende Lipid enthält, auf innerhalb etwa 20°C, stärker bevorzugt 10°C, am stärksten bevorzugt 5°C, der Temperatur der Cisplatinlösung erwärmt.
In dem nachstehenden ausführlichen Beispiel werden das Vesikel-bildende Lipid HSPC, das derivatisierte Vesikel-bildende Lipid PEG-DSPE und Cholesterin in Ethanol, das auf etwa 65°C erwärmt wurde, noch über den Phasenübergangstemperaturen von HSPC zwischen etwa 52 bis 60°C gelöst. Eine wässerige Lösung aus nativem Cisplatin wird auf zwischen 63 und 67°C erwärmt. Die Lösungen werden miteinander vermischt, um Liposome zu bilden, die die Cisplatinverbindung in eingeschlossener Form enthalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren erreicht eine hohe Einkapselung von Cisplatin, typischerweise eine Einkapselung zwischen 10 und 20 μg Arzneimittel/mg Lipid, und stellt Liposome bereit, die zusätzlich zu der äußeren Oberflächenbeschichtung eine innere Oberflächenbeschichtung von hydrophilen Polymerketten aufweisen, wobei die Cisplatinverbindung fest innerhalb des Liposoms eingeschlossen ist.
B. Derivatisierte Vesikel-bildende Lipidkomponente
Wie oben erläutert, weisen die erfindungsgemäßen Liposome eine Oberflächenbeschichtung von hydrophilen Polymerketten auf sowohl der inneren als auch der äußeren Lipiddoppelschichtoberfläche auf. Die Oberflächenbeschichtung wird durch Einschluß von zwischen 1 und 20 Mol-% eines Lipids, das mit einem hydrophilen Polymer derivatisiert wurde, in die Liposomzusammensetzung bereitgestellt.
Hydrophile Polymere, die zum Derivatisieren mit einem Vesikel-bildenden Lipid geeignet sind, umfassen Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethylether, Polymethyloxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid, Polyhydroxypropylmetacrylat, Polyhydroxyethylacrylat, Hydroxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Polyethylenglykol und Polyaspartamid. Die Polymere können als Homopolymere oder als Block- oder statistische Copolymere eingesetzt werden.
Eine bevorzugte hydrophile Polymerkette ist Polyethylenglykol (PEG), vorzugsweise als eine PEG-Kette mit einem Molekulargewicht zwischen 500 und 10.000 Dalton, stärker bevorzugt zwischen 1.000 und 5.000 Dalton. Methoxy- oder Ethoxygeschütze Analoga von PEG sind ebenso bevorzugte hydrophile Polymere, die in einer Vielzahl an Polymergrößen, beispielsweise 120 bis 20.000 Dalton, kommerziell erhältlich sind.
Vesikel-bildende Lipide, die zum Derivatisieren mit einem hydrophilen Polymer geeignet sind, umfassen irgendeines dieser Lipide, die oben aufgelistet sind, und insbesondere Phospholipide, wie Distearylphosphatidylethanolamin (DSPE). Die Herstellung von DSPE, das mit PEG derivatisiert wurdr, wird nachstehend (Beispiel 1) beschrieben.
Das derivatisierte Lipid wird in das Liposom durch Einschließen eines amphiphilen Lipids, das mit hydrophilem Polymer derivatisiert wurde, mit Vesikel-bildenden Lipiden während der Bildung der Lipidvesikel eingebracht.
Wenn ein Liposom einmal gebildet worden ist, stellen die hydrophilen Polymerketten eine Oberflächenbeschichtung von Ketten auf sowohl den inneren als auch den äußeren Oberflächen der Lipiddoppelschicht bereit, wie es in bezug auf 1 erläutert wird. Wichtig ist, daß die Oberflächenbeschichtung wirkungsvoll ist, die Stabilität der Liposomen, wie es nachstehend beschrieben wird, zu verbessern. Die Oberflächenbeschichtung ist ebenso wirkungsvoll, die Blutzirkulationszeit der Liposomen in Abwesenheit einer derartigen Beschichtung zu verlängern. Der Umfang der Verstärkung der Blutzirkulationszeit ist vorzugsweise mehrfach über der, die in Abwesenheit der Polymerbeschichtung erreicht wird, wie in unserem US-Patent Nr. 5,013,556 beschrieben.
C. Andere Liposomkomponenten
Die Liposome in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung können andere Komponenten umfassen, wie Targetmoleküle, einschließlich Antikörper, Antikörperfragmente oder Zelloberflächen-Erkennungsmoleküle, die an das Liposom mittels hydrophiler Polymerketten angelagert sind. Beispielsweise wird ein Vesikel bildendes Lipid mit einer hydrophilen Polymerkette derivatisiert, wie oben beschrieben, und das hydrophile Polymer wird hinsichtlich der Kupplungsantikörper an seinem funktionalisierten Ende end-funktionalisiert. Die funktionalisierte Endgruppe kann eine Hydrazid- oder Hydrazin-Gruppe sein, die gegen Aldehydgruppen reaktiv ist, obwohl irgendeine Zahl von PEG-terminalen reaktiven Gruppen zur Kupplung an Antikörper verwendet werden kann. Hydrazide können ebenso durch aktive Ester oder Carbodiimid-aktivierte Carboxylgruppen acyliert werden. Acylazidgruppen, die als acylierende Spezies reaktiv sind, können leicht aus Hydraziden erhalten werden und ermöglichen die Anlagerung von Amino-enthaltenden Molekülen. Die funktionalisierte Endgruppe kann ebenso 2-Pyridyldithio-propionamid zum Kuppeln eines Antikörpers oder anderen Moleküls an das Liposom durch eine Disulfidverknüpfung sein.
D. Cisplatinverbindung
Die erfindungsgemäße Liposomzusammensetzung ist für die Verwendung bei der Krebstherapie, insbesondere bei der Tumortherapie, vorgesehen. Eine Cisplatinverbindung wird innerhalb der Liposome eingeschlossen und die Liposomzusammensetzung wird dem Patienten verabreicht. Wie hierin verwiesen, bezieht sich die Cisplatinverbindung auf natives Cisplatin und seine Analoga. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Cisplatinverbindung natives Cisplatin, und in einer anderen Ausführungsform ist die Cisplatinverbindung ein Cisplatinanalogon, vorzugsweise ein hydrophiles Cisplatinanalogon.
Natives Cisplatin, das hierin ebenso als Cisplatin bezeichnet wird, ist ein Schwermetallkomplex, enthaltend ein zentrales Atom von Platin, das von zwei Chloridatomen und zwei Ammoniakmolekülen in der cis-Stellung umgeben ist. Es ist ein gelbes Pulver mit der molekularen Formel P_tCl₂H₆N₂ und einem Molekulargewicht von 300,1. Es ist bei Raumtemperatur in Wasser oder Salzlösung bei 1 mg/ml löslich und weist einen Schmelzpunkt von 207°C auf (PHYSICIAN'S DESK REFERENCE, 1994) und zersetzt sich bei 270°C.
Die Chloratome in dem Cisplatinmolekül werden den chemischen Verdrängungsreaktionen durch Nukleophile, wie Wasser oder Sulfhydrylgruppen, unterzogen. Bei einem physiologischen pH in Gegenwart von 0,1 M NaCl sind die überwiegenden molekularen Spezies Cisplatin und Monohydroxymonochlor-cis-diaminplatin(II) in nahezu gleichen Konzentrationen.
Das Arzneimittel ist als sterile wässerige Lösung, die 1 mg Cisplatin und 9 mg NaCl pro ml Wasser enthält, erhältlich, und wird in dieser Form typischerweise intravenös zur Tumortherapie bei einer Dosierung zwischen etwa 20 bis 120 mg/m² (PHYSICIAN'S DESK REFERENCE, 1994) verabreicht. Das Arzneimittel kann allein oder in Kombination mit anderen chemotherapeutischen Mitteln als eine Bolusinjektion oder als langsame Infusion über einen Zeitraum von mehreren Stunden verabreicht werden.
Als einzelnes Mittel kann Cisplatin verabreicht werden, beispielsweise bei einer Dosierung von 100 mg/m² intravenös einmal alle 4 Wochen (PHYSICIAN'S DESK REFERENCE, 1994) oder bei einer Dosierung von 20 mg/m², wobei Cisplatin als schnelle intravenöse Infusion täglich für 5 Tage verabreicht und bei einem 4-Wochenintervall (Prestayko, 1991) wiederholt wird. Bei der Behandlung von Plattenepithelkrebs des Kopfes oder Nackens wird Cisplatin als 24-Stunden-Infusion bei einer Dosierung von 80 mg/m² intravenös verabreicht, was eine positive Reaktion erzielte (Prestayko, 1991).
Während es als einzelnes Mittel aktiv ist, wird Cisplatin oftmals in Kombination mit anderen Mitteln, einschließlich Vinblastine, Bleomycin, Actinomycin, Adriamycin, Prednison, Vincristin und andere, verabreicht (Prestayko, 1991). Beispielsweise kann die Therapie von Eierstoffkrebs 60 mg/m² Cisplatin und 60 mg/m² Adriamycin umfassen, die als 24-Stunden-Infusion verabreicht werden. In der vorliegenden Erfindung kann die Kombinationstherapie Liposom-eingeschlossenes Cisplatin umfassen, das mit einem anderen chemotherapeutischen Mittel in freier Form oder in Liposom-eingeschlossener Form, wie Liposom-eingeschlossenes Doxorubicin, beschrieben in US-Patent Nr. 5,527,528, verabreicht wird.
In der vorliegenden Erfindung wird Cisplatin in die Liposome eingeschlossen, die auf zwischen 80 und 160 nm, stärker bevorzugt zwischen 100 und 140 nm, am stärksten bevorzugt zwischen 100 und 120 nm dimensioniert werden, was zur intravenösen Verabreichung geeignet ist. Die Cisplatin-enthaltenden Liposome werden bei den oben angegebenen Dosierungen für das freie Arzneimittel verabreicht, jedoch können derartige Dosierungen entsprechend der Berechnung für die verringerte Toxizität des Arzneimittels, das durch Liposomeinschluß bereitgestellt wird, eingestellt werden. Eine derart eingestellte Dosierung kann ohne weiteres experimentell durch einen Fachmann bestimmt werden.
Die innere Liposomkonzentration von Cisplatin liegt zwischen 1 und 9 mg Cisplatin/ml, stärker bevorzugt zwischen 4 und 9 mg/ml, am stärksten bevorzugt zwischen 6 und 8,5 mg/ml. Die Cisplatin-enthaltende Liposomsuspension liegt bei einer Konzentration von zwischen etwa 1 und 2 mg Cisplatin/ml Gesamtsuspensionsvolumen zur intravenösen Verabreichung.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Cisplatinverbindung, die innerhalb der Liposome eingeschlossen ist, ein Cisplatinanalogon. Ein breites Spektrum von Cisplatinanaloga ist synthetisiert worden, was ein unterschiedliches Antitumorspektrum, besseren therapeutischen Index und verringerte Toxizität als das, das durch natives Cisplatin geboten wird, bietet. Derartige Analoga umfassen Carboplatin, Ormaplatin, Oxaliplatin, DWA2114R, Zeniplatin, Enloplatin, Lobaplatin, CI-973, 254-S und JM-216 (Weiss, et al., 1993). Bei einigen Cisplatinanaloga, wie Spiroplatin, ist herausgefunden worden, daß sie toxischer als natives Cisplatin sind. Während toxischere Analoga zur intravenösen Verabreichung in freier Form nicht wünschenswert sind, können derartige Analoga in Liposom-eingeschlossener Form Verwendung finden, was die Arzneimitteltoxizität verringert.
Für die Zwecke der vorliegenden Efindung werden Analoga mit einem gewissen Grad an Wasserlöslichkeit, wie Carboplatin, Iproplatin und andere, bevorzugt, so daß das Arzneimittel in erster Linie in dem inneren wässerigen Kompartiment des Liposoms eingeschlossen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Cisplatinanalogon Carboplatin, (1,1-Cyclobutandicarboxylat-diaminplatin), das organische Liganden in einem vierfach koordinierten, ebenen Komplex aus Platin enthält. Dieses Cisplatinanalogon zeigte äquivalente oder größere Antitumoraktivität als Cisplatin und weniger Nephrotoxizität bei vorklinischen Untersuchungen (Weiss, et al., 1993).
Liposome, die ein Cisplatinanalogon enthalten, können allein oder in Kombination mit anderen chemotherapeutischen Mitteln in freier Form oder in Liposom-eingeschlossener Form verabreicht werden, wie es oben in bezug auf das native Cisplatin erläutert wird.
II. Herstellen der Liposomzusammensetzung
Abschnitt A beschreibt nachstehend die Synthese von Vesikel-bildenden Lipiden, die mit einem hydrophilen Polymer derivatisiert wurden, zur Verwendung bei der Bildung der erfindungsgemäßen Liposome. Abschnitt B beschreibt ein Verfahren zum Herstellen von Liposomen, einschließlich der derivatisierten Lipide, und einer Cisplatinverbindung.
A. Herstellung von derivatisierten Vesikel-bildenden Lipiden
2 zeigt ein allgemeines Reaktionsschema zum Herstellen eines Vesikelbildenden Lipids, das mit einem biokompatiblen, hydrophilen Polymer derivatisiert wurde, wie durch Polyethylenglykol (PEG) veranschaulicht, das ohne weiteres wasserlöslich ist, an die Vesikel-bildenden Lipide geknüpft werden kann und ohne toxische Wirkungen in vivo toleriert wird. Das Polymer wird vorzugsweise durch eine Methoxy-, Ethoxy- oder andere nicht-reaktive Gruppe an einem Ende geschützt, oder ist ein Polymer, bei dem ein Ende reaktiver als das andere ist.
Das Polymer wird an einem Ende durch die Umsetzung mit einem geeigneten Aktivierungsmittel, wie Cyanursäure-, Diimidazol-, Anhydridreagens oder dergleichen, wie nachstehend beschrieben, aktiviert. Die aktivierte Verbindung wird dann mit einem Vesikel-bildenden Lipid, wie Phosphatidylethanol (PE), umgesetzt, um das derivatisierte Lipid herzustellen.
Alternativ kann die polare Gruppe in dem Vesikel-bildenden Lipid zur Umsetzung mit dem Polymer aktiviert werden oder die zwei Gruppen können in einer gemeinsamen Verknüpfungsreaktion gemäß den bekannten Verknüpfungsverfahren verbunden werden. PEG, das an einem Ende mit einer Methoxy- oder Ethoxygruppe geschützt wurde, kann in einer Vielzahl von Polymergrößen, beispielsweise 500 bis 20.000 Dalton Molekulargewicht, kommerziell erhalten werden.
Das Vesikel-bildende Lipid ist vorzugsweise eines mit zwei Kohlenwasserstoffketten, typischerweise Acylketten, und einer polaren Kopfgruppe, wie die, die oben aufgelistet sind.
3 zeigt ein Reaktionsschema zum Herstellen eines PE-PEG-Lipids, bei dem PEG zu PE durch eine Cyanurchloridgruppe derivatisiert wurde. Einzelheiten der Umsetzung werden in Beispiel 1 bereitgestellt. Kurz gesagt, Methoxy-geschütztes PEG wird mit Cyanurchlorid in Gegenwart von Natriumcarbonat unter Bedingungen aktiviert, die die aktivierte PEG-Verbindung in der Figur erzeugten. Dieses Material wird gereinigt, um nicht-umgesetzte Cyanursäure zu entfernen. Die aktivierte PEG-Verbindung wird mit PE in Gegenwart von Triethylamin umgesetzt, um die gewünschte PE-PEG-Verbindung, die ebenso in der Figur gezeigt wird, herzustellen. Die Ausbeute beträgt etwa 8 bis 10% in bezug auf die anfänglichen Mengen an PEG.
Das Verfahren, das gerade beschrieben wird, kann auf eine Vielzahl von Lipidaminen, einschließlich PE, Cholesterinamin, und Glykolipide mit Zuckeramingruppen angewendet werden.
Ein zweites Verfahren zum Verknüpfen eines Polyalkylethers, wie geschütztes PEG an ein Lipidamin, wird in 4 dargestellt. Hier wird das geschützte PEG mit einem Carbonyldiimidazol-Verknüpfungsreagens aktiviert, um die aktivierte Imidazolverbindung, die in 4 gezeigt wird, zu bilden. Die Umsetzung mit einem Lipidamin, wie PE, führt zur PEG-Verknüpfung an das Lipid durch eine Amidkupplung, wie es in der in der Figur gezeigten PEG-PE-Verbindung dargestellt wird. Einzelheiten der Umsetzung werden in Beispiel 2 angegeben.
B. Liposomherstellung
Die Liposomen können durch eine Vielzahl an Techniken hergestellt werden, wie die, die in Szoka et al., 1980, einzeln aufgeführt werden. Ein Verfahren zum Herstellen Arzneimittel-enthaltender Liposome ist das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren, das von Szoka und in US-Patent Nr. 4,235,871 beschrieben wird. Umkehrphasen-Verdampfungsvesikel (REVs) weisen typische durchschnittliche Größen zwischen 2 und 4 μm auf und sind überwiegend oligolamellar, d. h., enthalten ein oder ein paar Lipiddoppelschichtschalen.
In einem anderen Verfahren können multilamellare Vesikel (MLVs) durch einfache Lipid-Film-Hydratisierungstechniken gebildet werden. In dieser Verfahrensweise wird ein Gemisch aus Liposom-bildenden Lipiden des Typs, der oben einzeln aufgeführt wurde, die in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst wurden, in einem Gefäß verdampft, um einen dünnen Film zu bilden, der dann durch ein wässeriges Medium bedeckt wird. Der Lipidfilm hydratisiert, wodurch MLVs gebildet werden, typischerweise mit Größen zwischen etwa 0,1 und 10 μm.
Die Liposomen werden dann vergrößert, und ein wirkungsvolles Vergrößerungsverfahren für REVs und MLVs umfaßt das Extrudieren einer wässerigen Suspension der Liposome durch eine Reihe von Polycarbonatmembranen mit einer ausgewählten einheitlichen Porengröße in dem Bereich von 0,03 bis 0,2 μm, typischerweise 0,05, 0,08, 0,1 oder 0,2 μm. Die Porengröße der Membran entspricht annähernd den größten Größen von Liposomen, die durch Extrusion durch diese Membran hergestellt werden, insbesondere wo das Präparat zwei oder mehrere Male durch dieselbe Membran extrudiert wird. Homogenisierungsverfahren sind ebenso zur Größenverringerung von Liposomen auf Größen von 100 nm oder weniger nützlich (Martin, 1990).
In der vorliegenden Erfindung wird die Liposomzusammensetzung typischerweise mit zwischen etwa 25 und 80 Mol-% Vesikel-bildenden Lipiden, 10 und 40 Mol-% Cholesterin und 1 und 20 Mol-% Polymer-derivatisiertem Lipid hergestellt. Eine beispielhafte Liposomformulierung umfaßt hydriertes Sojaphosphatidylcholin (HSPC) und Cholesterin (Chol) in etwa einem 1 : 1-Molverhältnis und zwischen etwa 1 und 5 Mol-% DSPE-PEG, das zugegeben wird, um Liposome mit einer inneren und äußeren Doppelschichtoberflächenbeschichtung von PEG zu bilden.
Im allgemeinen wird die Cisplatinverbindung in die Liposome während der Liposombildung durch Zugabe der Lösung aus Lipiden zu einer Lösung, die das Arzneimittel enthält, eingebracht, wie es nachstehend beschrieben wird.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Beschreibung in Beispiel 3 wurde eine Lipidlösung, die zwischen 50 und 200 mg/ml Gesamtlipide, bestehend aus mPEG-DSPE, HSPC und Cholesterin (Molverhältnis von 50,6/44,3/5,1), enthält, durch Auflösen der Lipide in warmem Ethanol (60 bis 65°C) hergestellt. Eine wässerige Lösung aus Cisplatin (8,5 mg/ml Cisplatin in 0,9% Natriumchlorid) wurde auf eine Temperatur erwärmt, die ausreichend ist, deren Löslichkeit über die Löslichkeit der Verbindung bei Raumtemperatur zu erhöhen, speziell wurde die Cisplatinlösung auf etwa 63°C erhöht, was die Cisplatinlöslichkeit ungefähr achtfach von 1 mg/ml auf 8,5 mg/ml erhöhte.
Die Cisplatinlösung und die Lipidlösung wurden zusammen zugegeben, um Liposome zu bilden, wobei die Temperatur des Gemisches zwischen 60 und 65°C gehalten wird.
Die Liposome wurden nach der Diafiltration und Dialyse durch 0,2 μm und 0,1 μm Polycarbonatfilter extrudiert, um die Liposome auf zwischen etwa 100 und 120 nm zu bemessen. Die Liposomsuspension wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und das nicht-eingeschlossene, ausgefällte Cisplatin wurde durch Filtrieren und durch Diafiltration entfernt.
Die endgültigen Liposome enthielten eine innere Phase von eingeschlossenem Cisplatin bei einer Konzentration von 8,5 mg/ml in 0,9% Natriumchlorid und eine äußere Phase von Saccharose/Natrumchlorid-Lösung. Vor dem Verpacken hinsichtlich der Stabilitätsuntersuchungen, die nachstehend beschrieben werden, und/oder vor der Verabreichung wurde die Liposomsuspension auf eine Cisplatinkonzentration von 1,05 mg/ml mit einer Saccharose/Natriumchlorid/Histidin-Lösung gebracht und der pH wurde auf 6,5 eingestellt.
III. Stabilität der Liposomzusammensetzung
Die Stabilität von Liposomen, die wie oben beschrieben hergestellt wurden (Beispiel 3), wurde durch (i) Analysieren der Liposomsuspension für Cisplatin- und Platinkonzentrationen, (ii) Bestimmen der Prozentzahl von eingeschlossenem Platin, (iii) Messen der Liposomgröße und (iv) Messen des pH der Liposomkonzentration jeweils als eine Funktion der Zeit und der Temperatur bewertet.
Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde die Cisplatinkonzentration durch Analysieren der Liposomsuspension hinsichtlich der Cisplatinkonzentration durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) gemessen. In diesem Verfahren wird ein organisches Lösungsmittel zu der Liposomprobe zugegeben, um die Lipiddoppelschicht zu lösen, was das eingeschlossene Cisplatin vor dem Analysieren hinsichtlich der Cisplatinkonzentration freisetzt. Die Platinkonzentration der Liposomsuspension wurde durch Atomabsorption bestimmt. Der Prozentsatz von eingeschlossenem Platin wurde durch Trennen der Liposome aus dem nicht-eingekapselten Arzneimittel mittels Größenausschlußchromatographie und Analysieren von sowohl der Liposom- als auch Arzneimittelfraktionen hinsichtlich des Platingehalts durch Atomabsorption gemessen. Die Liposomgröße wurde durch dynamische Lichtstreuung bestimmt.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Tabelle 1 Stabilität von Cisplatin-enthaltenden Liposomen
Liposome, die bei Temperaturen von –40 °C und –20 °C gelagert wurden, zeigten keinen meßbaren Verlust bei den Konzentrationen von Cisplatin oder Platin nach der Lagerung von drei Monaten. Noch wurde eine signifikante Veränderung in der Liposomgröße oder dem Suspensions-pH nach dem Lagerzeitraum von drei Monaten beobachtet. Bei –20°C und nach 18 Monaten Lagerung wurde das Cisplatin in den Liposomen behalten, wie es durch keinen signifikanten Verlust in entweder den Cisplatin- oder Platinkonzentrationen bewiesen wird. Die Liposomzusammensetzung war ebenso stabil, wenn sie bei 2 bis 8°C 18 Monate gelagert wurde. Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, wurden keine meßbaren Verluste in den Konzentrationen von Cisplatin oder Platin beobachtet. Zum Zeitpunkt von 18 Monaten betrug der Prozentsatz von eingeschlossenem Platin 99%, was zeigt, daß alles bis auf 1% des eingeschlossenen Platins in den Liposomen behalten wurde. Daß das eingeschlossene Platin in Form von Cisplatin vorliegt, wird aus der Cisplatinkonzentration, die sich über einen Lagerzeitraum von 18 Monaten nicht verringert, deutlich.
Unter aggressiveren Lagerbedingungen von 30°C und 40°C wurde eine gewisse Verringerung bei den Cisplatin- und Platinkonzentrationen beobachtet, und der Protzentsatz des eingeschlossenen Platins betrug 93% nach 3 Monaten bei 30°C und 91% nach 1 Monat bei 40°C. Es wurde eine kleine Veränderung in der Liposomgröße beobachtet.
Die Daten zeigen, daß die erfindungsgemäße Liposomzusammensetzung wirkungsvoll ist, das Cisplatin in den Liposomen zu behalten, wodurch eine stabile Liposomzusammensetzung bereitgestellt wird. Diese Stabilität wird insbesondere durch den Zeitpunkt von 6 Monaten bei 2 bis 8°C bewiesen, wo die Konzentration von Cisplatin konstant blieb und 99% des Platins in die Liposomen eingeschlossen wurden.
Die erfindungsgemäßen Liposomen mit einer inneren und einer äußeren Oberflächenbeschichtung von hydrophilen Polymerketten wurden mit „konventionellen" Liposomen, d. h. Liposomen, denen es an der inneren und äußeren Oberflächenbeschichtung von hydrophilen Polymerketten mangelt, verglichen.
Wie in Beispiel 5 beschrieben, wurden die Cisplatin-enthaltenden Liposome gemäß der vorliegenden Erfindung aus HSPC/Chol/mPEG-DSPE in einem Molverhältnis von 50,6/44,3/5,1 hergestellt. Eine vergleichbare Liposomzusammensetzung, die zu den erfindungsgemäßen Liposomen identisch war, wurde hergestellt, außer daß mPEG-DSPE mit derselben Molmenge an Distearylphosphatidylglycerin (DSPG) ersetzt wurde, die denselben Kohlenwasserstoffschwanz und dieselbe Ladung in der polaren Kopfgruppe wie mPEG-DSPE aufwies. Die vergleichbare Liposomzusammensetzung, der es an hydrophilem Polymer mangelt, weist keine Oberflächenbeschichtung von hydrophilen Polymerketten auf entweder den inneren oder den äußeren Lipiddoppelschichten auf.
In einer ersten Untersuchung (Beispiel 5A) wurden die Liposomzusammensetzungen bei 60°C 6 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Cisplatinkonzen tration der Liposomsuspension, der Prozentsatz des eingeschlossenen Platins, die Liposomgröße und der Suspensions-pH gemäß den oben beschriebenen Verfahrensweisen gemessen. Die Ergebnisse, die in Tabelle 2 zusammengefaßt werden, zeigen, daß nach der Inkubationszeit die erfindungsgemäße Liposomzusammensetzung eine 24%ige (0,38 mg/ml auf 0,29 mg/ml) Verringerung in der Cisplatinkonzentration aufwies, während sich die Cisplatinkonzentration der vergleichbaren Liposomsuspension um 44% (0,25 mg/ml auf 0,14 mg/ml) verringerte. Der Prozentsatz des eingeschlossenen Platins der erfindungsgemäßen Liposomen betrug 96% nach der Inkubation. Die vergleichbaren Liposome wiesen einen Prozentsatz an Platineinschluß von 81% auf, was zeigt, daß 19% der Platin-enthaltenden Spezies aus den Liposomen austraten. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Liposomzusammensetzung durch einen Prozentsatz von eingeschlossenem Platin von über etwa 85%, stärker bevorzugt 90%, gekennzeichnet, wenn sie bei 60°C 6 Stunden gelagert wird.
Tabelle 2 Stabilität von PEG-beschichteten Liposomen und vergleichbaren Liposomen bei 60°C für 6 Stunden
In einer zweiten Untersuchung (Beispiel 5B) wurden die Lipososme, die die Zusammensetzungen, die oben für die in Tabelle 2 dargestellten Daten beschrieben wurden, aufweisen, bei 40°C 2 Wochen inkubiert, und die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. In dieser Untersuchung wurden die Liposome auf eine Cisplatinkonzentra tion von 1,0 mg/ml in einem Histidin/Saccharose/Natriumchlorid-Verdünnungsmittel, das in Beispiel 3G beschrieben wird, verdünnt. Nach der Inkubationszeit wurde eine 29%ige (von 0,75 auf 0,53 mg/ml) Verringerung in der Cisplationkonzentration der Suspension, die die Liposome mit einer PEG-Beschichtung enthält, beobachtet. Der Prozentsatz des eingeschlossenen Platins betrug 95%. Diese Daten zeigen, daß ein Teil des Cisplatins sich in eine andere molekulare Spezies umwandelte, wie Monohydroxymonochlor-cis-diaminplatin, das oben erläutert wurde, und daß nur etwa 5% der Platin-enthaltenden Spezies aus dem Liposom nach der zweiwöchigen Inkubation bei 40°C austraten.
Tabelle 3 Stabilität von PEG-beschichteten Liposomen und vergleichbaren Liposomen bei 40°C für 2 Wochen
Die vergleichbare Liposomzusammensetzung wies nach der Lagerung bei 40°C für 2 Wochen kein meßbares Cisplatin, das in den Liposomen verblieb, auf, was darauf schließen läßt, daß sich nahezu das gesamte Cisplatin in eine andere molekulare Spezies umwandelte. 81% der Platin-enthaltenden Spezies wurden in das Liposom eingeschlossen – mit anderen Worten – 19% der Platin-enthaltenden Spezies traten aus den Liposomen aus. Deutlicher gesagt, weist das Liposom, das gemäß der Erfindung hergestellt wurde, um eine innere und äußere Oberflächenbeschichtung von hydrophilen Polymerketten aufzuweisen, eine wesentlich größere Retention von Cisplatin als die vergleichbaren Liposome auf.
In einer anderen Untersuchung wurden vergleichbare Liposome wie oben beschrieben hergestellt und bei 2 bis 8°C 2 Monate gelagert. Die Stabilitätsdaten für diese Untersuchung werden in Tabelle 4 zusammen mit den Daten von Tabelle 1 bei derselben Temperatur für Liposome, die gemäß der Erfindung zum Vergleich hergestellt wurden, zusammengefaßt.
Tabelle 4 Stabilität von PEG-beschichteten Liposomen und vergleichbaren Liposomen bei 2 bis 8°C für 2 Monate
Es wird aus den in Tabelle 4 gezeigten Daten deutlich, daß im Vergleich zu den Liposomen, denen es an einer inneren und äußeren Oberflächenbeschichtung von hydrophilen Polymerketten mangelt, die erfindungsgemäße Liposomzusammensetzung mit einer derartigen Oberflächenbeschichtung wirkungsvoll ist, den Verlust von Cisplatin aus den Liposomen zu verringern. Insbesondere ist die Liposomzusammensetzung wirkungsvoll, die Umwandlung von Cisplatin in andere molekulare Spezies zu verringern, wie es durch Vergleich der Cisplatinkonzentrationen und dem Prozentsatz des eingeschlossenen Platins für die zwei Zusammensetzungen bewiesen wird.
Zusammenfassend zeigen die Stabilitätsdaten, die in den Tabellen 2, 3 und 4 dargestellt werden, daß Liposome, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, mit einer inneren und äußeren Oberflächenbeschichtung von hydrophilen Polymerketten eine fest eingeschlossene Liposomzusammensetzung von Cisplatin durch (1) Verringern der Umwandlung von Cisplatin in andere molekularen Spezies und (2) Verringern des Austretens von Cisplatin (und anderen Platin-enthaltenden Spezies) aus den Liposomen bereitstellen.
IV. In vivo-Verabreichung
Cisplatin-enthaltende Liposome, die gemäß der Erfindung hergestellt wurden, wurden Tumor-tragenden Mäusen verabreicht und mit freiem Cisplatin und Carboplatin hinsichtlich der Antitumorwirksamkeit verglichen. Wie in Beispiel 6 beschrieben, wurden die Mäuse, die das C26-Kolontumormodell tragen, mit der Liposom-eingeschlossenen Cisplatinzusammensetzung der vorliegenden Erfindung mit freiem Cisplatin oder mit freiem Carboplatin behandelt. Freies Cisplatin wurde intravenös bei der maximal tolerierten Dosierung von Cisplatin, 6 mg/kg einmal pro Woche für 3 Wochen, verabreicht. Freies Carboplatin wurde bei einer klinisch äquivalenten Dosierung zu Cisplatin von 100 mg/kg gegeben, das ebenso intravenös bei derselben Häufigkeit verabreicht wird. Liposom-eingeschlossenes Cisplatin wurde intravenös bei derselben Dosierung und Häufigkeit wie freies Cisplatin, 6 mg/kg einmal die Woche für 3 Wochen, verabreicht.
Die Ergebnisse werden in 5 gezeigt, wo das Tumorvolumen in mm³ als Funktion von Tagen nach der Impfung gezeigt wird. Die Behandlung der Testgruppen wurde etwa an Tag 12 begonnen, wenn eine eindeutige Tumormasse von etwa 100 mm³ deutlich wurde. Wie durch das volle Dreieck entlang der x-Achse gezeigt, wurden die Testgruppen an den Tagen 12, 19 und 26 behandelt. Der Tumor wuchs bei den Tieren, die die Salzlösung (∎) erhielten, weiter. Die Tiere, die mit freiem Cisplatin (
) oder mit freiem Carboplatin (•) behandelt wurden, wiesen eine ähnliche Verringerung des Tumorwachstums in bezug auf die nicht-behandelten Tiere auf. Die Tiere, die mit Cisplatin behandelt wurden, das in Liposome mit einer Beschichtung von Polyethylenglykol auf der inneren und äußeren Oberfläche der Liposome (
) einge schlossen ist, wiesen eine signifikante Verringerung in der Tumorgröße in bezug auf die Tiere auf, die mit dem freien Arzneimittel behandelt wurden.
Eine andere Untersuchung wurde gemäß Beispiel 6 durchgeführt, wo das Liposomeingeschlossene Cisplatin gemäß den unterschiedlichen Dosierungsplänen verabreicht wurde. Das heißt, das Liposom-eingeschlossene Cisplatin wurde mit einer größeren Ladungsdosis, gefolgt von kleineren Dosierungen in den zweiten und dritten Wochen verabreicht. Die Ergebnisse werden in 6 gezeigt, wo die Testtiere, die Salzlösung (∎) und freies Cisplatin (
) bei 6 mg/kg einmal die Woche für 3 Wochen erhielten, eine kontinuierliche Erhöhung der Tumormasse zeigten. Die Tiere, die mit Liposom-eingeschlossenem Cisplatin behandelt wurden, wiesen signifikant verringerte Tumormassen im Vergleich zu den Tieren, die mit Salzlösung oder freiem Cisplatin behandelt wurden, auf. Die Antitumorwirksamkeit des Liposom-eingeschlossenen Cisplatins war hinsichtlich der Dosierungspläne von 6 mg/kg einmal die Woche für 3 Wochen (•), einer Anfangsdosierung von 12 mg/kg mit anschließenden Dosierungen von 4 mg/kg an den Tagen 19 und 26 (♦) und einer Anfangsdosierung von 14 mg/kg mit anschließenden Dosierungen von 4 mg/kg an den Tagen 19 und 26 (
) ähnlich.
Mäuse, die das Lewis-Lungenkarzinom-Tumormodell tragen, wurden mit Cisplatin, das intravenös und intraperitoneal verabreicht wurde, oder mit Liposom-eingeschlossenem Cisplatin, das ähnlich verabreicht wurde, behandelt. Wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde die Behandlung begonnen, wenn eine Tumormasse von etwa 100 mm³ bei den Testtieren beobachtet wurde, wobei die Behandlung an den Tagen 7, 14 und 21 nach der Impfung stattfand. Eine Kontrollgruppe von Tumor-tragenden Mäusen wurde mit Salzlösung behandelt.
Die Ergebnisse werden in 7 gezeigt, wo das Tumorvolumen in mm³ als Funktion von Tagen nach der Impfung eingetragen wird. Die Behandlung wird durch die vollen Dreiecke entlang der X-Achse an den Tagen 7, 14 und 21 dargestellt. Der Tumor in Mäusen, die mit Salzlösung (∎) behandelt wurden, wuchs kontinuierlich während der Testzeit. Die Antwort in der Tumormasse auf freies Cisplatin, das intravenös (♦) oder intraperitoneal (•) bei einer Dosierung von 6 mg/kg an den ange zeigten Behandlungstagen verabreicht wurde, war ähnlich. Die Behandlung mit 12 mg/kg Liposom-eingeschlossenem Cisplatin, das intravenös (
) oder intraperitoneal (
) an den angezeigten Behandlungstagen verabreicht wurde, wies verbesserte Antitumorwirksamkeit in bezug auf die Tiere, die mit freiem Cisplatin behandelt wurden, auf. Die intravenösen und intraperitonealen Verabreichungen waren gleichermaßen wirksam.
Aus dem Vorhergehenden kann eingeschätzt werden, wie verschiedene Merkmale und Gegenstände der Erfindung zutreffen. Die erfindungsgemäße Liposomzusammensetzung umfaßt Liposome mit einer inneren Oberflächenbeschichtung und einer äußeren Oberflächenbeschichtung von hydrophilen Polymerketten und eine eingeschlossene Cisplatinverbindung. Die Untersuchungen, die zur Unterstützung der Erfindung durchgeführt wurden, zeigen, daß das Cisplatin fest in die Liposome eingeschlossen ist, wie es durch die Retention von Cisplatin und Platin nach der Inkubation für verschiedene Zeiten bei mehreren Temperaturen bewiesen wird. Cisplatin, des fest in Liposome eingeschlossen ist, bietet die Vorteile von verringerter Toxizität und verbesserter Wirksamkeit in bezug auf das Arzneimittel, das in freier Form verabreicht wird, da das Arzneimittel nach der Verabreichung in dem Liposom mit wenig Austreten in den Blutstrom eingeschlossen bleibt. Die äußere Oberflächenbeschichtung von PEG-Ketten stellt eine lange Blutzirkulationslebensdauer bereit, was es den Liposomen ermöglicht, einen Zielort, wie einen Tumor, zu erreichen.
V. Beispiele
Die folgenden Beispiele beabsichtigen, den Umfang der Erfindung darzustellen, aber nicht zu begrenzen.
Materialien: Cisplatin wurde von W. C. Heraeus GmbH (Hanau, Deutschland) erhalten. DSPE wurde von Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL) erworben und Methoxypolyethylenglykol (mPEG), MW 2000 Dalton, wurde von Fluka Chemie AG (Buchs, Schweiz) erhalten. Cholesterin wurde von Croda, Inc., (NY, NY) erhalten. HSPC wurde von Lipoid K. G. (Ludwigshafen, Deutschland) hergestellt und mPEG-DSPE wurde von Sygena, Inc., (Liestal, Schweiz) hergestellt.
Beispiel 1
Herstellung von PEG-derivatisiertem DSPE, das durch Cyanurchlorid verknüpft ist
A. Herstellung von aktivertem PEG
2-O-Methoxypolyethylenglykol-1900-4,6-dichlor-1,3,5-triazin, das zuvor aktiviertes PEG genannt wurde, wurde, wie in J. Biol. Chem. 252: 3582 (1977) beschrieben, mit den folgenden Modifikationen hergestellt.
Cyanurchlorid (5,5 g; 0,03 mol) wurde in 400 ml wasserfreiem Benzen, das 10 g wasserfreies Natriumcarbonat enthielt, gelöst, und PEG-1900 (19 g; 0,01 mol) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde filtriert, und 600 ml Petrolether (Siedebereich 35 bis 60°) wurde langsam unter Rühren zugegeben. Der genau abgetrennte Niederschlag wurde auf einem Filter gesammelt und in 400 ml Benzen erneut gelöst. Das Ausfällungs- und Filtrationsverfahren wurde mehrere Male wiederholt, bis der Petrolether frei von restlichem Cyanurchlorid war, wie es durch Hochdruckflüssigchromatographie auf einer Säule (250 × 3,2 mm) von 5-m „LiChrosor" (E. Merck) nachgewiesen wurde, mit Hexan entwickelt, und mit einem UV-Detektor bestimmt. Die Titration von aktiviertem PEG-1900 mit Silbernitrat nach der Hydrolyse über Nacht in wässerigem Puffer bei einem pH von 10,0, Raumtemperatur, ergab einen Wert von 1,7 mol freigesetztem Chlorid/mol PEG.
TLC-Analyse des Produktes wurde mit TLC-Umkehrphasenplatten, erhalten von Baker, unter Verwendung von Methanol : Wasser, 4 : 1 (v/v), als Entwickler und Exponierung mit Ioddampf hinsichtlich der Visualisierung durchgeführt. Unter diesen Bedingungen trat das Ausgangsmethoxypolyglykol 1900 bei R_f = 0,54 bis 0,60 auf. Das aktivierte PEG trat bei R_f = 0,41 auf. Nicht-umgesetztes Cyanurchlorid trat bei R_f = 0,88 auf und wurde entfernt.
Das aktivierte PEG wurde hinsichtlich des Stickstoffs analysiert und eine entsprechende Korrektur wurde beim Auswählen der Menge des Reaktanten zur Verwen dung in weiteren Syntheseschritten angewendet. Wenn daher das Produkt nur 20% der theoretischen Menge an Stickstoff enthielt, wurde die Menge des Materials, das in dem nächsten Syntheseschritt verwendet wird, um 100/20 oder fünfach erhöht. Wenn das Produkt 50% der theoretischen Menge an Stickstoff enthielt, wurden nur 100/50 oder eine zweifache Erhöhung benötigt.
B. Herstellung von N-(4-Chlor-polyglykol 1900)-1,3,5-triazinyl-Ei-Phosphatidylethanolamin
In einem schraubverschlossenen Teströhrchen wurden 0,74 ml einer 100 mg/ml (0,100 mmol) Stammlösung von Ei-Phosphatidylethanolamin in Chloroform unter einem Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft und wurde zu dem Rest des aktivierten PEGs, das in Abschnitt A beschrieben wurde, in der Menge zugegeben, um 205 mg (0,100 mmol) bereitzustellen. Zu diesem Gemisch wurden 5 ml wasserfreies Dimethylformamid zugegeben. 27 Mikroliter (0,200 mmol) Triethylamin wurden zu dem Gemisch zugegeben und die Luft wurde durch Stickstoffgas ersetzt. Das Gemisch wurde über Nacht in einem Sandbad, das bei 110°C gehalten wurde, erwärmt.
Das Gemisch wurde dann unter Vakuum zur Trockne eingedampft und eine pastenartige Masse aus kristallinem Feststoff wurde erhalten. Dieser Feststoff wurde in 5 ml eines Gemisches aus 4 Volumen Aceton und 1 Volumen Essigsäure gelöst. Das resultierende Gemisch wurde an der Spitze einer 21 mm × 240 mm chromatographischen Absorptionssäule eingebracht, die mit Kieselgel (Merck Kieselgel 60, 70 bis 230 Mesh) gepackt war, das zunächst mit einem Lösungsmittel, bestehend aus Acetonessigsäure, 80/20; v/v, befeuchtet worden ist.
Die Säulechromatographie wurde mit demselben Lösungsmittelgemisch entwickelt, und separate 20 bis 50 ml Allquote des Elutionsmittels wurden gesammelt. Jeder Teil des Elutionsmittels wurde durch TLC auf Kieselgel-beschichteten Platten unter Verwendung von 2-Butanon/Essigsäure/Wasser; 40/25/5; v/v/v als Entwickler und Ioddampfexponierung für der Visualisierung analysiert. Fraktionen, die nur Material von R_f = etwa 0,79 enthielten, wurden vereinigt und unter Vakuum zur Trockne ver dampft. Das Trocknen auf konstantes Gewicht unter hohem Vakuum erbrachte 86 mg (31,2 μmol) von nahezu farblosem, festem N-(4-Chlor-polyglykol 1900)-1,3,5-triazinyl-Ei-phosphatidylethanolamin, das Phosphor enthält.
Die Feststoffverbindung wurde in 24 ml Ethanol/Chloroform, 50/50 aufgenommen und zentrifugiert, um nicht-lösliches Material zu entfernen. Das Eindampfen der geklärten Lösung zur Trockne unter Vakuum erbrachte 21 mg (7,62 μmol) farblosen Feststoff.
Beispiel 2
Herstellung von PEG-derivatisiertem DSPE, das durch Carbamat verknüpft ist
A. Herstellung des Imidazolcarbamats von Polyethylenglykolmethylether 1900
9,5 Gramm (5 mmol) Polyethylenglykolmethylether 1900, erhalten von Aldrich Chemical Co., wurden in 45 ml Benzen gelöst, das über Molekularsieben getrocknet worden ist. 0,89 Gramm (5,5 mmol) reines Carbonyldiimidazol wurden zugegeben. Die Reinheit wurde durch ein Infrarotspektrum überprüft. Die Luft in dem Reaktionsbehälter wurde durch Stickstoff ersetzt. Der Behälter wurde geschlossen und in einem Sandbad bei 75 °C 16 Stunden erwärmt.
Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und eine klare Lösung wurde bei Raumtemperatur gebildet. Die Lösung wurde auf 50,0 ml mit trockenem Benzen verdünnt und im Kühlschrank als 100 μmol/ml Stammlösung des Imidazolcarbamats von PEG-Ether 1900 gelagert.
B. Herstellung von Phosphatidylethanolamincarbamat von Polyethylenglykolmethylether 1900
10,0 ml (1 mmol) der 100 mmol/ml Stammlösung des Imidazolcarbamats von Polyethylenglykolmethylether 1900 (Verbindung X) wurde in einen 10 ml birnenförmigen Kolben pipettiert. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. 3,7 ml einer 100 mg/ml Lösung von Ei-Phosphatidylethanolamin (V) in Chloroform (0,5 mmol) wurden zugegeben. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum verdampft. 2 ml 1,1,2,2-Tetrachlorethylen und 139 μl (1,0 mmol) Triethylamin VI wurden zugegeben. Der Behälter wurde verschlossen und in einem Sandbad, das bei 95 °C 6 Stunden gehalten wurde, erwärmt. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Dünnschichtchromatographie mit Fraktionen des obigen Gemisches durchgeführt, um das Ausmaß der Konjugation auf SiO₂-beschichteten TLC-Platten unter Verwendung von Butanon/Essigsäure/Wasser; 40/5/5; v/v/v; als Entwickler zu bestimmen. Ioddampfvisualisierung offenbarte, daß sich das meiste des freien Phosphatidylethanolamins von R_f = 0,68 umsetzte und durch ein Phosphor-enthaltendes Lipid bei R_f = 0,78 bis 0,80 ersetzt wurde.
Das Lösungsmittel aus dem verbliebenen Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum verdampft. Der Rest wurde in 10 ml Methylenchlorid aufgenommen und an der Spitze einer 21 mm × 270 mm chromatographischen Absorptionssäule eingebracht, die mit Merck Kieselgel 60 (70 bis 230 Mesh Kieselgel) gepackt war, das zunächst mit Methylenchlorid gespült worden ist. Das Gemisch wurde der Reihe nach durch eine Säule unter Verwendung der folgenden Lösungsmittel geleitet.
50 ml Teile des Elutionsmittels wurden gesammelt und jeder Teil wurde durch TLC auf SiO₂-beschichteten Platten unter Verwendung von I₂-Dampfabsorption zur Visualisierung nach der Entwicklung mit Chloroform/Methanol/Wasser/konzentriertem Ammoniumhydroxid; 130/70/8/0,5%; v/v/v/v analysiert. Das meiste der Phosphate wurde in den Fraktionen 11, 12, 13 und 14 gefunden.
Diese Fraktionen wurden vereinigt, zur Trockne unter Vakuum eingedampft und bei hohem Vakuum auf konstantes Gewicht getrocknet. Sie ergaben 669 mg eines farblosen Wachses aus Phosphatidylethanolamincarbamat von Polyethylenglykolmethylether. Dies stellte 263 μmol und eine Ausbeute von 52,6 %, basierend auf Phosphatidylethanolamin, dar.
Ein NMR-Spektrum des Produktes, das in Deutero-Chloroform gelöst wurde, zeigte Peaks, die dem Spektrum für Ei-PE entsprechen, zusammen mit einem starken Singulett aufgrund der Methylengruppen der Ethylenoxidkette bei Delta = 3,4 ppm. Das Verhältnis von Methylenprotonen aus dem Ethylenoxid zu den terminalen Methylprotonen der PE-Acylgruppen war groß genug, um ein Molekulargewicht von etwa 2000 für den Polyethylenoxidteil des Moleküls des gewünschten Produktes Polyethylenglykol-konjugerites Phosphatidylethanolamincarbamat, MW 2.654, zu bestätigen.
Beispiel 3
Liposomherstellung
A. Schritt 1: Arzneimittellösungsherstellung
Steriles Wasser wurde auf 63 bis 67°C in einem TEFLON-ausgekleideten Druckbehälter erwärmt und Natriumchlorid (0,9%) wurde zugegeben. Cisplatin wurde bei einer Konzentration von 8,5 mg/ml zugegeben und ungefähr 15 bis 25 Minuten gemischt, bis es gelöst war.
B. Schritt 2: Lipidauflösung
257,0 g PEG-DSPE, 719,4 g HSPC und 308,4 g Cholesterin (Molverhältnis von 50,6/44,3/5,1) wurden zu 900 ml dehydratisiertem Ethanol bei 60 bis 65°C zugegeben und ungefähr 2 Stunden gemischt, bis sie gelöst waren. Die gelösten Lipide wurden zu 7670 g Arzneimittellösung zugegeben, um eine Gesamtlipidkonzentration von ungefähr 150 mg/ml zu erhalten.
C. Schritt 3: Lipidhydratisierung/Arzneimittelladung
Die warme Lipidlösung wurde schnell zu der warmen (63 bis 67°C) Arzneimittellösung unter Mischen zugegeben, um eine Suspension aus Liposomen mit heterogenen Größen zu bilden. Die Suspension wurde für eine Stunde bei 63 bis 67°C gemischt. Die Cisplatinkonzentration in dem Hydratisierungsgemisch betrug 7,2 mg/ml und zu diesem Zeitpunkt wurden ungefähr 30% des Arzneimittels in die Liposome eingeschlossen. 10% des Gesamtlösungsvolumens waren Ethanol und die Gesamtlipidkonzentration betrug 150 mg Lipid/ml.
D. Schritt 4: Extrusion
Die Liposome wurden auf den gewünschten mittleren Teilchendurchmesser durch kontrollierte Extrusion durch Polycarbonatfilterpatronen, die in Teflon-ausgekleideten Edelstahlbehältern untergebracht waren, dimensioniert. Die Liposomsuspension wurde bei 63 bis 65°C während des Extrusionsverfahrens über einen Zeitraum von 6 bis 8 Stunden gehalten.
E. Schritt 5: Vorfiltrieren
Nach dem Dimensionieren wurde die Liposomsuspension auf Raumtemperatur (20 bis 25°C) abgekühlt und durch einen 1,2 μm 142-mm-Gelman-Versapor-Filter (Acrylcopolymer auf einem Nylon-66-Träger) filtriert, um ausgefälltes Arzneimittel zu entfernen. Zu diesem Zeitpunkt wurden ungefähr 50% des Arzneimittels eingeschlossen.
F. Schritt 6: Diafiltration
Eine Saccharose/Natriumchlorid-Lösung wurde durch Auflösen von Saccharose (100 mg/ml) und Natriumchlorid (0,058 mg/ml) in sterilem Wasser hergestellt. Der pH der Lösung wurde auf ungefähr 5,5 mit 2 N HCl oder NaOH eingestellt. Die Lösung wurde durch einen 0,22 μm Durapore-Filter filtriert.
Die Liposomsuspension wurde in ungefähr einem 1 : 1-Verhältnis (v/v) mit der Saccharose/Natriumchlorid-Lösung verdünnt und durch einen Polysulfonhohlfaser-Ultrafilter diafiltriert. Acht Volumen-Austausche wurden gegen die Saccarose/Natriumchlorid-Lösung durchgeführt, um das Ethanol und nicht-eingeschlossene Arzneimittel zu entfernen. Die Verfahrensflüssigkeitstemperatur wurde bei etwa 20 bis 30°C aufrechterhalten. Die Gesamtdiafiltrationszeit betrug ungefähr 4,5 Stunden.
Die Liposomsuspension wurde dann auf ungefähr 1,2 mg Cisplatin/ml durch Ultrafiltration konzentriert. Die Nachdiafiltrations-Verfahrensflüssigkeit wurde hinsichtlich des Cisplatingehalts durch HPLC analysiert. Die Liposome wiesen eine innere Phase von 8,5 mg/ml Cisplatin in 0,9% Natriumchlorid und eine äußere Phase der Saccharose/Natriumchloridlösung auf.
G. Schritt 7: Verdünnung
Ein Verdünnungsmittel wurde durch Auflösen von Histidin (10 mM) in einer Saccharose/Natriumchlorid-Lösung (10% Saccharose/1 mM NaCl) auf eine Zielhistidinkonzentration von 1,55 mg/ml in dem Endgemisch hergestellt. Die Liposomsuspension wurde auf eine Zielcisplatinkonzentration von 1,05 mg/ml mit dem Histidinverdünnungsmittel verdünnt. Der pH der Suspension wurde auf 6,5 mit 2 N NaOH oder HCl eingestellt.
H. Schritt 8: Sterile Filtration
Die Liposomsuspension wurde auf 33 bis 38°C erwärmt und durch einen 0,2 μm Gelman-Supor-Polyethersulfonfilter filtriert. Die Gesamtfiltrationszeit betrug ungefähr 10 Minuten.
Beispiel 4
Stabilität von Cisplatinliposomen
Eine Suspension aus Cisplatin-enthaltenden Liposomen wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt. 5 ml Aliquote der Liposomsuspension wurden in 10 cm³ Glas fläschchen eingebracht, unter sterilen Bedingungen versiegelt und in einen Inkubator oder Kühlschrank bei folgenden Temperaturen: –40 °C, –20 °C, 2 bis 8°C, 30°C, 40°C eingebracht. Bei Intervallen wurden Proben aus jedem Fläschchen, die bei jeder Temperatur gelagert wurden, gezogen und in dreifacher Ausfertigung getestet, hinsichtlich:

1. der Cisplatinkonzentration: Die Konzentration von Cisplatin wurde durch Aufbrechen der Liposomdoppelschicht mit einem organischen Lösungsmittel, um das eingeschlossene Cisplatin freizusetzen, und dann durch Bestimmen der Cisplatinkonzentration durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) gemessen;
2. der Platinkonzentration, die durch Atomabsorption gemessen wurde;
3. des Prozentsatzes des eingeschlossenen Platins: Der Prozentsatz des eingeschlossenen Platins wurde durch Trennen der Liposome aus nicht-eingeschlossenem Cisplatin durch Größenausschlußchromatographie und Analysieren der Liposom- und Arzneimittelfraktionen hinsichtlich des Platingehaltes durch Atomabsorption bestimmt;
4. der Liposomgröße, die durch dynamische Lichtstreuung bestimmt wurde; und
5. des pH der Liposomsuspension.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
Beispiel 5
Vergleichsstabilitätsuntersuchungen
Cisplatin-enthaltende Liposome wurden ohne innere und äußere Oberflächenbeschichtung von hydrophilen Polymerketten zum Vergleich der erfindungsgemäßen Liposome hergestellt. Vergleichsliposome wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt, außer daß Distearylphosphatidylglycerin (DSPG) durch das PEG-DSPE-Derivat, beispielsweise die Lipsomzusammensetzung, bestehend aus HSPC/Chol/DSPG in einem Molverhältnis von 50,6/44,3/5,1, ersetzt wurde.
A. Inkubation bei 60°C für 6 Stunden
Die Stabilität der Vergleichsliposomzusammensetzung und der erfindungsgemäßen Liposomzusammensetzung wurden durch Verdünnen der Liposomproben mit Salzlösung (1 : 1 v : v) und Inkubieren der Suspensionen für 6 Stunden bei 60°C verglichen. Nach der Inkubation wurden die Proben hinsichtlich der Cisplatinkonzentration, des %-Platineinschlußes, der Liposomgröße und des pH gemäß der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensweise getestet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 zusammengefaßt.
B. Inkubation bei 40°C für 2 Wochen
Die Liposomzusammensetzungen wurden auf eine Cisplatinkonzentration von 1 mg/ml mit dem Histidin/Saccarose/Natriumchlorid-Verdünnungsmittel, das in Beispiel 3G beschrieben wurde, verdünnt. Die Liposomsuspensionen wurden bei 40°C für 2 Wochen, nach dem die Cisplatinkonzentration, der %-Platineinschluß, die Liposomgröße und der pH gemessen wurden, inkubiert.
Beispiel 6
Behandlung von Tumor-tragenden Mäusen
Die Liposome, die eingeschlossenes Cisplatin enthalten, wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt und bestanden aus HSPC, Cholesterin und mPEG-DSPE in einem 50,6/44,3/5,1-Molverhältnis. Der Gesamtlipidgehalt betrug ungefähr 71 mg/ml und die Cisplatinkonzentration betrug 1 mg/ml.
A. C26-Kolontumormodell
Das C26-Kolontumormodell wuchs in Balb/c-männlichen Mäusen (Simonson Laboratories, Inc., Gilroy, CA). Tumore wurden aus den Spendermäusen entnommen und fein in RPMI-Medien mit 10% fetalem Kälberserum (FCS) zerkleinert. Die Tumore wurden dann mit einem Enzymgemisch (10 ml 0,25%ige Protease vom Typ IX und 0,25%ige Kollagenase vom Typ IV in Hank's Mineralsalzmedium (HBSS) und 0,2 ml 0,02%ige DNase in HBSS) für 30 bis 60 Minuten bei 37°C verdaut. Einzelzellsus pension von Tumorzellen wurde zweimal in RPMI-Medien mit FCS gewaschen, durch Zentrifugation konzentriert und in RPMI-Medien mit FCS zur Impfung resuspendiert. Eine Million Tumorzellen (0,1 ml) wurden in die linke Flanke von 5 bis 6 Wochen alten Mäusen geimpft.
Während aller Experimente wurden die Tiere in 12 Stunden Licht : 12 Stunden Dunkel-Kreisläufen gehalten, nach Belieben mit Nagetierfutter und Wasser gefüttert.
i. Vergleich von freiem Arzneimittel und Liposom-eingeschlossenem Arzneimittel
Die Tumor-tragenden Mäuse wurden in Gruppen von n = 9 zur Behandlung mit Liposom-eingeschlossenem Cisplatin, freiem Cisplatin (Platinol-AQ^®, Bristol Laboratories, Princeton, NJ) oder freiem Carboplatin (Paraplatin^®, Bristol Laboratories) gemäß der Behandlungsregime, die in Tabelle 5 gezeigt werden, unterteilt.
Tabelle 5
Freies Cisplatin und Liposom-eingeschlossenes Cisplatin wurde bei einer Dosierung von 6 mg/kg wöchentlich für 3 Wochen intravenös verabreicht. Carboplatin wurde bei einer Dosierung von 100 mg/kg wöchentlich für 3 Wochen intravenös verabreicht. Die Kontrollgruppe von Mäusen (n = 5) erhielt intravenös 0,1 ml Salzlösung wöchentlich für 3 Wochen. Die Ergebnisse werden in 5 gezeigt.
ii. Veränderter Dosierungsplan
Die Mäuse wurden mit C26-Kolontumorzellen gemäß der oben beschriebenen Verfahrensweise geimpft. Die Behandlung der Tumor-tragenden Mäuse wurde begonnen, wenn die Mehrheit der Tiere eindeutige Tumormassen von etwa 100 mm³ aufwiesen. Die Mäuse wurden mit Liposom-eingeschlossenem Cisplatin oder mit freiem Cisplatin einmal pro Woche für 3 Wochen gemäß den in Tabelle 6 gezeigten Regimen behandelt.
Tabelle 6
Freies Cisplatin wurde bei einer Dosierung von 6 mg/kg einmal pro Woche für 3 Wochen den Tumor-tragenden Mäusen (n = 9) intravenös verabreicht. Cisplatin, das in Liposome eingeschlossen ist, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurde gemäß den drei Dosierungsplänen den Tumor-tragenden Mäusen intravenös verabreicht. Eine Gruppe (n = 9) erhielt 6 mg/kg Liposom-eingeschlossenes Cisplatin einmal pro Woche für 3 Wochen; eine andere Gruppe (n = 9) erhielt eine erste Dosierung von 14 mg/kg, gefolgt von anschließenden Dosierungen in den Wochen 2 und 3 von 4 mg/kg; eine andere Gruppe (n = 9) erhielt eine erste Dosierung von 12 mg/kg, gefolgt von 4 mg/kg in den Wochen 2 und 3 der Untersuchung. Die Kontrollgruppe (n = 5) erhielt Salzlösung an jedem Behandlungstag. Die Ergebnisse werden in 6 gezeigt.
B. Mäuse, die Lewis-Lungentumormodell tragen
Das Lewis-Lungentumormodell (LV2, CRL-1642, ATCC, Rockville, MD) wuchs in G6C3-F1-männlichen Mäusen (Simonson Laboratories, Inc., Gilroy, CA). Tumore wurden aus den Spendermäusen entnommen und wie oben zur Impfung eines Experiments verarbeitet. Eine Million Tumorzellen (0,1 ml) wurden in die linke Flanke von 5 bis 6 Wochen alten, männlichen B6C3-F1-Mäusen geimpft.
Die Behandlung der Tumor-tragenden Tiere wurde sieben Tage nach der Impfung begonnen, wenn die Mehrheit der Tiere eindeutige Tumormassen aufwies. Die Tiere wurden gemäß den in Tabelle 7 gezeigten Regimen behandelt.
Tabelle 7
Die Kontrollgruppe (n = 9) erhielt Salzlösung an den Behandlungstagen (Tage 7, 14 und 21). Zwei Gruppen der Tiere erhielten freies Cisplatin bei 6 mg/kg an jedem Behandlungstag; wobei in einer Gruppe (n = 9) das freie Cisplatin intravenös verabreicht wurde, in der anderen Gruppe (n = 9) das Arzneimittel intraperitoneal verabreicht wurde. Zwei Gruppen erhielten Liposom-eingeschlossenes Cisplatin bei 12 mg/kg an jedem Behandlungstag; wobei eine Gruppe (n = 7) die Dosierung intravenös erhielt, die andere Gruppe (n = 9) die Dosierung intraperitoneal erhielt. Die Ergebnisse werden in 7 gezeigt.

Claims

Liposomzusammensetzung, enthaltend eine eingeschlossene Cisplatinverbindung, umfassend Liposome mit einer äußeren Oberfläche und einer inneren Oberfläche, welche ein wäßriges Liposomkompartiment definieren und aus einem Vesikelbildenden Lipid aufgebaut sind, wobei zwischen 1–20 Mol-% eines Vesikelbildenden Lipids mit einem hydrophilen Polymer derivatisiert sind, wobei die Liposome derart gebildet sind, daß das hydrophile Polymer eine Beschichtung von hydrophilen Polymerketten auf sowohl der inneren als auch der äußeren Oberfläche bildet, und wobei die Cisplatinverbindung in den Liposomen eingeschlossen ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die hydrophilen Polymerketten aus einem hydrophilen Polymer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethylether, Polymethyloxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid, Polyhydroxypropylmethacrylat, Polyhydroxyethylacrylat, Hydroxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Polyethylenglykol und Polyaspartamid, aufgebaut sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die hydrophilen Polymerketten aus Polyethylenglykol aufgebaut sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Liposome Größen zwischen 80–160 nm aufweisen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Vesikel-bildende Lipid hydriertes Sojaphosphatidylcholin ist und das derivatisierte Vesikel-bildende Lipid Distearylphosphatidylethanolamin, derivatisiert mit Polyethylenglykol, ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Cisplatinverbindung Cisplatin oder ein Cisplatinanaloges ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Carboplatin, Ormaplatin, Oxaliplatin, DW A2114R, Zeniplatin, Enloplatin, Lobaplatin, CI-973, 254-S und JM-216, ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Cisplatinverbindung Cisplatin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die Cisplatinverbindung in einem Arzneimittel-zu Lipid-Verhältnis von zwischen 10 bis 20 μg/mg Gesamtlipid eingeschlossen ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Liposome in einem wäßrigen Medium bei einer Liposom-Lipid-Konzentration von zwischen 50–200 mg/ml suspendiert sind und die Zusammensetzung durch einen Prozentanteil an eingeschlossenem Platin von oberhalb etwa 90%, wenn bei 60°C für eine 6-stündige Zeitdauer gelagert, gekennzeichnet ist.
Verfahren zum Einschließen einer Cisplatinverbindung in Liposome, umfassend das Erwärmen einer wäßrigen Lösung einer Cisplatinverbindung auf eine Temperatur, die ausreichend ist, dessen Löslichkeit über die Löslichkeit der Verbindung bei Raumtemperatur anzuheben; das Zugeben eines Vesikel-bildenden Lipids und zwischen 1–20 Mol-% eines Vesikel-bildenden Lipids, derivatisiert mit einem hydrophilen Polymer, zu der erwärmten Lösung; und durch das Zugeben das Bilden von Liposomen mit einer inneren Oberflächenbeschichtung und einer äußeren Oberflächenbeschichtung des hydro philen Polymers, wobei die Cisplatinverbindung in den Liposomen eingeschlossen wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Erwärmen das Erwärmen von nativem Cisplatin auf eine Temperatur einschließt, die ausreichend ist, einen zweifachen Anstieg in der Cisplatinlöslichkeit über dessen Raumtemperaturlöslichkeit zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Zugeben das Zugeben einer Lösung von Vesikel-bildenden Lipiden, erwärmt auf innerhalb von etwa 10°C der Temperatur der Cisplatinlösung, einschließt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Zugeben das Zugeben einer Lösung, enthaltend ein Vesikel-bildendes Lipid mit einer Phasenübergangstemperatur von innerhalb etwa 10°C der Temperatur, auf welche die Lösung, enthaltend die Cisplatinverbindung, erwärmt wird, einschließt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Zugeben das Zugeben einer Lösung, enthaltend ein Vesikel-bildendes Lipid mit einer Phasenübergangstemperatur zwischen 40–70°C, einschließt.