CN105524147B - 重组聚多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可以筛选构建各种长度的重组聚多肽的组合物。所述的本发明首次构建了全人工设计的由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸和赖氨酸中的3‑6种类型的氨基酸构成的稳定的、无结构、无免疫原性的聚多肽分子，可与生物活性蛋白质融合表达，可克服原有生物活性蛋白溶解性差或免疫原性高或半衰期短等问题。

Description

重组聚多肽及其应用

技术领域

本发明涉及可以筛选构建各种长度的重组聚多肽和包含该重组聚多肽的药物组合物。

背景技术

生物活性大分子，一般是不稳定的多肽或者蛋白质，大部分半衰期都较短，为了维持一定的疗效需要大剂量频繁给药，长期的反复注射不仅增加了病人的痛苦而且易引发一系列副反应。另外，许多生物活性肽和蛋白质只具有有限的溶解度，或者在重组生产过程中易聚集，需要复杂的溶解和重折叠过程。多种化学聚合物可以连接到这些蛋白质上以改变其性质。特别有意义的是具有柔性构象并且在水溶液中良好水合的亲水性聚合物。一种常用的聚合物是聚乙二醇(PEG)，目前已用于多种蛋白质药物或非蛋白质药物的修饰，在国外已经上市的PEG化药物已达11种，并且国内外有多种PEG化药物在研或者已经进入临床。这些聚合物常常具有依赖于它们分子量的较大的流体动力学半径，并且会显著增强药代动力学性质。但PEG修饰蛋白质类药物需要额外的下游工艺和纯化步骤，从而会降低产量、增加成本；并且，常用的PEG化修饰位点是赖氨酸和蛋白质的N-端氨基酸残基，这种随机性的修饰方式会形成多种结构，影响PEG修饰后的蛋白质纯化，这种不均一性也会影响修饰后的蛋白质活性，因此需要开发PEG的定点修饰技术；同时现在大量临床实验发现反复长期给予PEG化的药用蛋白后，可能会形成抗PEG的抗体介导机体对药用蛋白的清除；在动物实验中发现PEG还可能在组织中蓄积，严重时可对肾脏造成损伤。

白蛋白和免疫球蛋白片段如Fc区也已经用于偶联其它生物活性蛋白质，但在半衰期或免疫原性提高方面具有不可预测的结果。遗憾的是，Fc融合或者白蛋白融合都需要在真核重组表达系统中进行。这是一个耗时的、昂贵的过程。因此，仍然非常需要能够提高生物活性多肽或蛋白质安全性和药学性质的聚合物和方法。

近年来研究，为了解决PEG修饰的问题，开发了模拟PEG的聚多肽融合技术。模拟PEG的聚多肽融合技术经过了多年的发展，从一开始的天然来源的聚多肽、明胶样蛋白聚多肽、弹性蛋白样聚多肽、多聚谷氨酸、多聚甘氨酸到现在的最新的XTEN技术(如专利102348715A记载)。聚多肽XTEN技术已经可以解决原有聚多肽免疫原性高、易聚集、不能显著增加半衰期等问题。目前，聚多肽融合技术虽还在发展的初期，但XTEN修饰的长效rhGH已经进入了临床Phase II期，XTEN修饰的Exendin-4也进入临床Phase I期，我们相信聚多肽技术将会为多肽和蛋白质类药物长效化提供更好的选择。现有模拟PEG的聚多肽融合技术具有以下诸多优点：1.通过基因工程技术构建，可与药用蛋白融合表达，避免了体外PEG化学偶联和修饰后的纯化步骤；2.区别于PEG修饰技术融合表达的聚多肽链是完全可生物降解的；3.动物实验结果表明，这些PEG模拟肽都是安全和低免疫原性的；4.多肽链有确切的长度和氨基酸组成，可通过调节多肽链长度，调节融合蛋白的半衰期；5.适用范围广泛，原核、真核系统都可以表达。与PEG修饰相比，聚多肽在下游纯化、免疫原性、安全性等方面都具有明显的优势。但新型聚多肽XTEN融合技术并没有完全模拟PEG。XTEN带有显著的负电荷(Schellenberger，Volker，et al.Nature biotechnology27.12(2009)：1186-1190.)，区别与传统的PEG修饰技术，显著负电荷存在着一些缺点：1.影响药物的组织分布；2.减低与靶受体的亲和力，降低生物活性；并且XTEN基本是由非重复基序组成，筛选过程复杂且庞大。因此，仍然需要建立筛选过程相对简单的模拟PEG的聚多肽分子用于提高生物活性蛋白质的药用性质。

发明内容

本发明涉及能够用于提高生物活性蛋白质的生物学、药学、安全性和治疗性质的组合物和方法。该组合物和方法可用于提高药代动力学性质，如半衰期，延长生物活性蛋白质治疗窗内停留的时间，以及简化这种生物活性蛋白质的生产过程和药学性质，如溶解性。

部分上，本发明涉及包含融合蛋白的药物组合物及其在治疗疾病、障碍或病症中的应用。可以治疗的具体的疾病取决于生物活性蛋白质的选择。

本发明提供聚多肽的组合物，当重组聚多肽连接到生物活性蛋白质时提高药代动力学性质，和/或治疗活性。这样的组合物可以用于治疗某些疾病、障碍或病症。得到的融合蛋白可以表现出更好的安全性性质，并且允许频率较低的给药，这又导致了更好的患者依从性。本发明也提供了编码聚多肽与聚多肽连接的生物活性蛋白质的融合蛋白的多聚核苷酸序列。

本发明提供分离的聚多肽，其包含超过大约100至大约5000个氨基酸残基，其中该聚多肽的特征在于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)和赖氨酸(K)六种氨基酸残基的总和占聚多肽总氨基酸序列的超过大约95％以上；聚多肽序列是可重复的；通过GOR算法确定，该聚多肽序列至少具有95％的无规则卷曲形成；通过Chou-Fasman算法确定，该聚多肽序列具有α螺旋和β折叠的总和小于2％。

作为优化方案，本发明提供包含超过大约100至大约5000个氨基酸残基的聚多肽，其中该聚多肽的特征在于由短序列组成，重复的短序列可以占到总序列大约30％以上，其中每个短序列具有大约8至24个氨基酸残基，其中任意一种氨基酸在序列中都不会连续出现，该序列由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)和赖氨酸(K)中的3-6种类型的氨基酸组成。该聚多肽当连接到生物活性蛋白质时增强生物活性蛋白质的药代动力学性质，其中药代动力学性质通过测定施用于受试者的生物活性蛋白质的血浆半衰期与连接到生物活性蛋白质并以相当的剂量施用于受试者的聚多肽融合蛋白来确定。

在上述实施方案的一些情况中，没有一种类型的氨基酸占聚多肽序列的50％以上，没有任何一种类型的氨基酸会连续出现。

在一些情况中，分离的具有上述实施方案的聚多肽的融合蛋白包括胰岛素、胰岛血糖素样肽-1、胰高血糖素、蜥外泌肽-4、生长激素、促卵泡激素、甲状腺激素、降钙素、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、胰岛素样生长因子-1、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、人成纤维细胞因子-21、白介素-1Ra、白介素-2、凝血因子VIIa、天冬酰胺酶、凝血因子VIII、凝血因子IX及其他蛋白类或多肽药物。

在一些实施方案中，所得融合蛋白的增强的药代动力学性质包括血浆半衰期提高至至少5倍。

在一个实施方案中，分离的融合蛋白与未连接到聚多肽的生物活性蛋白质相比可以具有较低的免疫原性，其中通过在给受试者施用相当剂量后测定选择性结合生物活性蛋白质的IgG抗体的产生确定免疫原性。

在一个实施方案中，本发明提供一种分离的融合蛋白，与聚多肽进行融合的蛋白其表现出与表24的序列至少大约90％的序列同一性。其中聚多肽包含超过大约100至大约5000个氨基酸残基，其中该聚多肽的特征在于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)和赖氨酸(K)六种氨基酸残基的总和占聚多肽总氨基酸序列的超过大约95％以上；通过GOR算法确定，该聚多肽序列至少具有95％的无规则卷曲形成；通过Chou-Fasman算法确定，该聚多肽序列具有α螺旋和β折叠的总和小于2％。

在一个实施方案中，本发明提供的分离的融合蛋白与含有大量谷氨酸残基的带有显著负电荷的聚多肽的融合蛋白相比，具有较高的对相应靶受体的结合亲和力。在一个实施方案中，该聚多肽融合蛋白表现出与靶受体的结合，其范围为带有负电荷的聚多肽的融合蛋白的相应靶受体的结合能力的大约120％-150％。

其中，与该聚多肽进行融合的蛋白可以设计为具有不同的融合方式，可以在生物活性蛋白质的N端或者C端融合，可以根据不同的需求，选择不同的融合位置。

其中，与该聚多肽进行融合的蛋白可以融合不止一个的生物活性蛋白质；融合蛋白中也可以含有不止一个聚多肽序列。

本发明提供分离的核酸，其包含选自以下的多核苷酸序列：(a)编码上述任一实施方案的融合蛋白的多核苷酸及其多核苷酸的互补序列；(b)上述表达的任一表达载体进一步包含连接到多核苷酸序列的重组调节序列。

一种改善生物活性蛋白质的性质的方法，包括将生物活性蛋白质连接到该聚多肽以实现一种性质的步骤，该性质的特征在于：(a)连接到聚多肽的生物活性蛋白质的血浆半衰期比未连接到聚多肽的生物活性蛋白质的血浆半衰期长；(b)因聚多肽本身完全不带电荷的性质，连接到聚多肽的生物活性蛋白质与未连接到聚多肽的生物活性蛋白质相比，生物活性并未有显著改变；(c)连接到聚多肽的生物活性蛋白质在生理条件下的溶解度比未连接到聚多肽的生物活性蛋白质的溶解度提高；(d)当施用于受试者时选择性结合连接到聚多肽的生物活性蛋白质的IgG抗体的产生比当以相当的剂量向受试者施用未连接到聚多肽的生物活性蛋白质时IgG的产生减少；(e)连接到聚多肽的生物活性蛋白质当比未连接到聚多肽的生物活性蛋白质施用于受试者时只需要更低的给药频率。

有益效果

1.本发明首次利用建库筛选的方法得到稳定的、无结构的、低免疫原性的由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸和赖氨酸中的3-6种类型的氨基酸构成的各种长度的聚多肽，并且因为聚多肽序列是可重复的，相较于基本非重复序列可以利用构建的筛选系统进行快速的筛选，即降低了筛选工作量又保证了聚多肽优越的性质。

2.本发明构建的聚多肽模拟PEG修饰技术，可以通过显著的增加流体动力学体积从而显著延长半衰期，此新型聚多肽随着序列长度的增加，融合蛋白的半衰期会出现高于比例的延长；并且该聚多肽克服了原有带显著负电荷聚多肽易降低与靶受体亲和力的缺点。

3.本发明构建并表达了多种聚多肽与生物活性蛋白质的融合蛋白，具有增强稳定性、延长半衰期、降低免疫原性、不改变生物活性等诸多优点，其有望成为生物活性分子的新型改造策略。

附图说明

本发明的特征和优点可以参考以下详细说明和阐述说明性实施方案的附图进一步解释。

图1显示聚多肽融合蛋白的原理示意图。FGF21为示意分子，聚多肽可以和任意多肽或蛋白质药物融合表达。图中显示的表达载体，可以为真核表达载体或者为原核表达载体。聚多肽可以连接在生物活性大分子药物的N端或者C端，这取决于生物活性分子的活性中心而定。图中的聚多肽长度可以为多种长度，长度可按照对于融合蛋白的半衰期的要求而定。

图2是聚多肽基因的示例性多核苷酸构建体的示意图。各氨基酸序列(如9氨基酸或10氨基酸序列)通过自连接反应连接得到更长的序列，将聚多肽插入GFP筛选载体的BspQI位点。BspQ I位点始终位于插入片段的5’端，可根据需求不断插入序列，从而达到我们需要的长度，进行筛选。

图3是聚多肽装配、生产和评价的典型步骤的示意流程图。短序列文库的装配是随机的过程，必然会出现短序列的连续重复出现，因此聚多肽序列中短序列是可重复的，并且会有一定的比值。

图4是改造的筛选质粒DMT-GFP示意图及酶切鉴定图。图B中显示一种筛选载体，来自于多点突变pET28a(+)载体而得。通过单酶切鉴定，该载体只含有一个BspQ I位点。图A琼脂糖核酸电泳中1泳道为pET28a-GFP质粒，2泳道为pET28a-GFP质粒BspQ I单酶切，3泳道为DMT-GFP质粒，4泳道为DMT-GFP质粒BspQ I单酶切。

图5是短序列自连接反应琼脂糖电泳图。

图6显示包含GFP和聚多肽序列的所示构建图的表达实验的结果。使用TECANinfinite M200PRO多功能酶标仪，荧光扫描(激发波长397nm，发射波长506nm)测定表达培养物，以确定的GFP报道分子表达量。绘制为柱状图的结果表明，插入聚多肽序列后与GFP的融合蛋白的表达量会有所降低。

图7是P200-FGF21，P400-FGF21，P600-FGF21载体示意图以及双酶切鉴定图。琼脂糖凝胶电泳1泳道为pET28a-P200-FGF21质粒，2泳道为pET28a-P200-FGF21质粒Nco I和HindIII双酶切，3泳道为pET28a-P400-FGF21质粒，4泳道为pET28a-P400-FGF21质粒Nco I和Hind III双酶切，5泳道为pET28a-P600-FGF21质粒，6泳道为pET28a-P600-FGF21质粒NcoI和HindIII双酶切

图8显示是来自稳定性研究的SDS-PAGE电泳图A及Western-blotting结果图B。其研究融合到FGF21的N末端的P600-FGF21。P600-FGF21在小鼠血中可稳定存在2天。在第0h，1h，3h，6h，18h，24h，48h，通过SDS-PAGE分析，然后利用Western-blotting分析并用抗FGF21抗体检测。SDS-PAGE电泳图以及Western-blotting图其中1泳道为serum only(ascontrol)，2泳道P600-FGF21蛋白，3泳道P600-FGF21蛋白与血清孵育0h，4泳道P600-FGF21蛋白与血清孵育1h，5泳道P600-FGF21蛋白与血清孵育3h，6泳道P600-FGF21蛋白与血清孵育6h，7泳道P600-FGF21蛋白与血清孵育18h，8泳道P600-FGF21蛋白与血清孵育24h，9泳道P600-FGF21蛋白与血清孵育48h。

图9显示来自生物可降解性研究的样品的SDS-PAGE电泳图及Western-Blotting结果图。其研究融合到FGF21的N末端的P600-FGF21的融合蛋白。P600-FGF21在小鼠肾裂解物中37℃孵育会被降解。用不同稀释度的肾匀浆孵育1h后采集样品，通过SDS-PAGE分析，然后利用Western分析并用抗FGF21抗体检测。SDS-PAGE电泳图以及Western-blotting图其中1泳道为P600-FGF21蛋白与肾匀浆(未稀释)孵育，2泳道为肾匀浆(稀释比1∶5)as control，3泳道为P600-FGF21蛋白，4泳道为P600-FGF21蛋白与肾匀浆(稀释比1∶5)孵育，5泳道为P600-FGF21蛋白与肾匀浆(稀释比1∶10)孵育，6泳道为P600-FGF21蛋白与肾匀浆(稀释比1∶50)孵育，7泳道为P600-FGF21蛋白与肾匀浆(稀释比1∶100)孵育，8泳道为P600-FGF21蛋白与肾匀浆(稀释比1∶1000)孵育。

图10显示PT20-3，PT20-4的圆二色谱(CD)分析。

图11显示P200-FGF21，P400-FGF21，P600-FGF21及原型FGF21的圆二色谱(CD)分析。

图12显示连接到P600序列的FGF21融合蛋白的等电聚集电泳结果。与原型FGF21相比，P600-FGF21的等电点与其相仿。

图13显示连接到不同聚多肽序列的FGF21的三种不同长度的融合蛋白在单次尾静脉等摩尔剂量后的药代动力学分布，它们分别尾静脉施用于C57BL/6小鼠，如实例12所述。

图14显示连接P600序列的FGF21融合蛋白在C57BL/6小鼠的免疫原性研究。

图15显示P300-GFP、Arg₁₀-GFP、penetratin-GFP在Hela细胞和BSR细胞中的流式细胞术结果分析。

图16显示连接P600序列的FGF21融合蛋白的药效学和代谢研究的体重结果，在饮食诱导的肥胖小鼠模型中研究有效性。该图显示饮食诱导的肥胖小鼠在15天的连续给药期间的体重变化。

图17显示来自药效学和代谢研究的OGTT实验结果。该研究在饮食诱导的肥胖小鼠模型中使用P600-FGF21。该图显示了饮食诱导的肥胖小鼠在15天连续给药后OGTT实验结果。

图18显示来自细胞药效学的实验结果。该研究在大鼠胰腺原代细胞模型中使用了GLP-1和P600-GLP-1。该图显示了融合了P600以后的GLP-1与原型GLP-1对该细胞的增殖效率并没有明显差异。

图19显示了纯化后的Exendin-4和P600-Exendin4对INS-1细胞GSIS/BIS比值的影响。该图显示随着给药剂量的增加，P600-Exendin4与Exendin4在各剂量水平都没有明显差异。

图20rhGH和P600-GH体外活性测定标准曲线图。显示P600融合的GH与原型的GH细胞活性并没有明显差异。

图21采用G-CSF依赖细胞株NFS60测定活性。显示P600对G-CSF细胞活性没有影响。

图22利用干扰素α在体外抑制Daudi淋巴瘤细胞株增殖的活性，检测蛋白活性。

具体实施方式

在描述本发明的实施方案之前，应该理解这些实施方案只是以举例方式提供，在实施本发明时可以使用此处所述的本发明实施方案的各种替代方案。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到大量的变化、改变和替换。另外，材料、方法和实施例只是说明性的，并非意在限制。

本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的定义。

本发明提供包含重组聚多肽的组合物。该聚多肽是非天然存在、可重复的序列，主要由亲水性氨基酸组成，该序列在生理条件下具有极低的或者没有二级或三级结构。

本发明提供包含重组聚多肽的组合物，其可连接到生物活性蛋白质，产生聚多肽融合蛋白。该聚多肽可作为融合配体，因为它们当连接到生物活性蛋白质产生融合蛋白时可以提供某些化学和药学性质。这些希望的性质包括但不限于增强的药代动力学参数和溶解度特征。

在一些实施方案中，该聚多肽是长多肽，当用作单序列时具有可以大约100至大约5000个氨基酸残基。在其他情况中，在不需要融合蛋白半衰期延长，但希望生物活性蛋白质融合提高其溶解度或物理/化学性质改善时，可以将短于100个氨基酸残基，如大约90、80或者更少的氨基酸残基的聚多肽序列引入融合蛋白的组合物中，以实现该性质。

本发明提供方法，其中通过选择聚多肽长度来设计聚多肽融合蛋白，以使施用于受试者的融合蛋白具有目标半衰期。通常，引入聚多肽融合蛋白中较长的聚多肽长度比较短的聚多肽导致更长的半衰期。

本发明的聚多肽可以表现出一个或多个以下有利性质：构象柔性、增强的水溶解度、高度的蛋白酶抗性、低免疫原性、增强的流体动力学半径。

短序列的可重复性实例定义

本发明包括包含多个单元的短序列的聚多肽，其中短序列是可重复的，也就是相同的短序列可以在该聚多肽中连续出现，例如含有1000个氨基酸残基的聚多肽，其由10个氨基酸为一个单元的短序列自连接反应而来，因此具有100个10个氨基酸的单元，以相同单元连续在一条聚多肽链中的出现数之和来定义聚多肽的可重复性：将相同单元的连续出现数之和相加除以构成该聚多肽的总的单元数减去一。如完全由同一个10个氨基酸短序列为一个单元的构成一条长1000个氨基酸残基的聚多肽，该条聚多肽的相同单元的连续出现数为99，除以总单元数减去一，其可重复性为100％；如构成一条长1000个氨基酸残基的聚多肽完全由100条不同的10个氨基酸的短序列构成，该条聚多肽的可重复性为0％。但组成短序列的甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)和赖氨酸(K)中的3-6种类型的氨基酸排列是随机的，且每一种氨基酸在短序列中不会连续出现，因为通常连续的同一种氨基酸都有形成某一种二级结构的倾向，而氨基酸的间隔出现可以打破原有同种氨基酸连续出现易形成二级结构的倾向，使序列本身不易形成二级结构。在设计聚多肽序列时，采用自连接反应体系，使短序列本身或相互间连接，从而获得更长的聚多肽分子，从而聚多肽序列中可以由多个不同单元和相同单元的短序列组成，因为自连接反应体系本身有易形成相同单元连接的倾向，因此，聚多肽序列中的短序列是可重复的，并且重复性达到30％以上。可重复的短序列可以使序列的自连接反应完全是随机的，比起非重复序列或者低重复序列不需要额外添加筛选流程使筛选过程更加简单，并且短序列内的氨基酸间隔出现已经能够很好解决易聚集形成高级结构的倾向(Schlapschy，Martin，et al.ProteinEngineering Design and Selection 26.8(2013)：489-501.)，含有可重复的序列并不会影响该聚多肽序列含有极低或不含有二级或高级结构的性质，因此非重复序列构成的聚多肽所强调的可形成极低或不含二级或高级结构的性质，含有可重复序列依旧可以实现。

在一个实施方案中，该聚多肽可以具有大于100至5000个氨基酸残基，其中每个短序列具有大约8-24个氨基酸残基。在这些实施方案中，优选地序列主要由亲水性氨基酸组成，使得总体序列具有无结构、柔性的、无免疫原性的特征。该聚多肽中去除了疏水的苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸；去除了带负电荷的天冬氨酸、谷氨酸；去除了带酰胺基团的天冬酰胺、谷氨酰胺；去除了带二硫键的光胱氨酸；最后经过优选的聚多肽序列主要包括甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)和赖氨酸(K)。其中每个序列都是由其中的3-6种类型氨基酸组成，并且其中全长聚多肽中任一种氨基酸类型的含量不超过50％。

实施例1：短序列的设计与构建

下列实施例以设计构建长度为10个氨基酸的短序列为例。分别选择了组成短序列的甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)和赖氨酸(K)中的3-6种类型氨基酸，且其中任何一种氨基酸残基都不会在短序列中连续出现。如，选择了丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸这3种类型氨基酸，设计了10条含有10个氨基酸的肽段，命名为序列文库PT01(以Polypeptide Tag的首字母缩写PT命名聚多肽文库，以P命名聚多肽)，氨基酸和核苷酸序列的序列名和这些区段的SEQ ID NO在表1中列出。如，选择了甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸、赖氨酸这4种类型氨基酸，设计了10条含有10个氨基酸的肽段，命名为序列文库PT02，氨基酸和核苷酸序列的序列名和这些区段的SEQ ID NO在表2中列出。如，选择了甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸这5种类型氨基酸，设计了10条含有10个氨基酸的肽段，命名为序列文库PT03，氨基酸和核苷酸序列的序列名和这些区段的SEQ ID NO在表3中列出。如，选择了甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、赖氨酸这6种类型氨基酸，设计了10条含有10个氨基酸的肽段，命名为序列文库PT04，氨基酸和核苷酸序列的序列名和这些区段的SEQ ID NO在表4中列出。

表1：PT01氨基酸序列及核苷酸序列

表2：PT02氨基酸序列及核苷酸序列

表3：PT03氨基酸序列及核苷酸序列

表4：PT04氨基酸序列及核苷酸序列

实施例2：长度为20个氨基酸的短序列区段的构建

下列实施例描述了构建长度为20个氨基酸短序列区段的方法。如实施例1所述，实施例2也可以从头设计该区段。同时也可通过含有10个氨基酸的短序列为例描述了编码20个氨基酸的序列的密码子优化的基因集合的构建。在第一步，基于pET28a载体进行改造，去除其载体骨架区上的BspQ I位点。将改造后的载体命名为DMT载体。将GFP基因(SEQ NO：155)(5’端带有Nco I、BamH I、BspQ I、EcoR I，3’端带有HindIII酶切位点)克隆至DMT载体的Nco I和HindIII位点上，得到重组载体DMT-Nco I-BamH I-BspQ I-EcoR I-GFP-HindIII。用BspQ I消化载体DMT，可以在BspQ I位点插入填充序列(填充序列可为以下所述的各种长度的聚多肽序列)。将20个氨基酸的聚多肽序列，命名为P20。其20个氨基酸序列具有[X]2，其中X是含10个氨基酸的肽段，选择PT04文库为例。通过将以上PT05序列库中磷酸化合成寡聚核苷酸对退火获得插入片段，连接退火的寡核苷酸对，产生具有不同长度的产物的混合物，该不同的长度代表连接到BspQ I位点的不同长度的10个氨基酸肽段的重复片段。通过制备型琼脂糖凝胶电泳从该混合物中分离出对应于20个氨基酸的长度的产物，并连接到BspQ I消化的筛选载体中。得到的文库被命名为PT05，其中大多数克隆在诱导后显示绿色荧光，这表明PT20的序列已经与GFP基因符合读框地连接，并且大多数PT20序列具有良好的表达水平。

我们通过将其单菌落IPTG诱导表达从文库PT05中筛选了100个高荧光水平的分离物。通过PCR评价了这些分离物，鉴定出20个含有20个氨基酸的区段以及强荧光的分离物。对这些分离物进行分离，鉴定出5个含有正确的PT20区段的克隆。氨基酸构建体的区段在表5中列出。

表5：P20氨基酸序列

序列名	SEQ ID NO：
		PT05-1	81
PT05-2	82
		PT05-3	83
PT05-4	84
		PT05-5	85

实施例3：长度为18个氨基酸的短序列区段的构建

下列实施例如实施例2所述，可以有两种方法构建PT18序列区段。第一，如实施例1所述，直接设计合成P18序列区段。第二，如实施例2所述的筛选方法，可由9个氨基酸序列为例描述了编码18个氨基酸的序列的密码子优化的基因集合的构建。采用与实施例2中相同的方法构建DMT载体。用BspQ I消化载体DMT，可以在BspQ I位点插入填充序列。将18个氨基酸的聚多肽序列，命名为P18。其18个氨基酸序列具有[X]2，其中X是含9个氨基酸的肽段，选择了甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、赖氨酸中的6种类型氨基酸构成该9个氨基酸的肽段，命名为序列文库PT06，氨基酸和核苷酸序列的序列名和这些区段的SEQ ID NO在表6中列出。

表6：PT06氨基酸序列及核苷酸序列

通过将以下磷酸化合成寡聚核苷酸对退火获得插入片段，连接退火的寡核苷酸对，产生具有不同长度的产物的混合物，该不同的长度代表连接到BspQ I位点的不同长度的9个氨基酸肽段的重复片段。通过制备型琼脂糖凝胶电泳从该混合物中分离出对应于18个氨基酸的长度的产物，并连接到BspQ I消化的筛选载体中。得到的文库被命名为PT07，其中大多数克隆在诱导后显示绿色荧光，这表明PsTag20的序列已经与GFP基因符合读框地连接，并且大多数PsTag18序列具有良好的表达水平。

我们通过将其单菌落IPTG诱导表达从文库PT07中筛选了100个高荧光水平的分离物。通过PCR评价了这些分离物，鉴定出5个含有18个氨基酸的区段以及强荧光的分离物。对这些分离物进行分离，鉴定出5个含有正确的P18区段的克隆。核苷酸和氨基酸构建体的区段在表7中列出。

表7：P18氨基酸序列

序列名	SEQ ID NO：
		PT07-1	106
PT07-2	107
		PT07-3	108
PT07-4	109
		PT07-5	110

实施例4：聚多肽长为100、200、400、600、800、1000、2000、3000、4000、5000个氨基酸的构建

通过PT03至100、200、400、600、800、1000的系列通过自连接构建，从10个不同P10区段构建100区段的集合。通过自连接反应，得到的含有100个氨基酸的核苷酸序列，其100个氨基酸序列具有[X]10，其中X是含有10个氨基酸的肽段。连接该片段和被BspQ I消化的筛选载体片段，将连接混合物转入BL21(DE3)细胞，获得P100菌落。该P100区段的文库命名为PT08。从文库中筛选100个分离物用于蛋白质表达。将各菌落转移到96孔板上，并且培养过夜作为起始培养物。将这些起始培养物稀释到新鲜的LB培养基中，37℃培养到OD600值到0.8-1.0后添加IPTG到终浓度1mM并培养4小时。利用具有397nm激发和506nm发射的荧光扫描仪检测GFP荧光表达。文库中的大多数克隆显示良好的表达和相似的物理化学性质，提示P100区段的大多数组合产生有用的聚多肽序列。我们从PT08文库中筛选出荧光强度最高的分离物。挑选5株经PCR证实具有正确大小和具有强荧光的分离物进行测序，并根据测序和表达数据选择一个分离物供以后使用。氨基酸构建体的区段在表8中列出。

表8：P100氨基酸序列

序列名	SEQ ID NO：
		PT08-1	111
PT08-2	112
		PT08-3	113
PT08-4	114
		PT08-5	115

通过上述相同的方法，通过自连接反应，得到的含有200个氨基酸的核苷酸序列，其200个氨基酸序列具有[X]20，其中X是含有10个氨基酸的肽段。连接该片段和被BspQ I消化的筛选载体片段，将连接混合物转入BL21(DE3)细胞，获得P200菌落。该P200区段的文库命名为PT09。从文库中筛选100个分离物用于蛋白质表达。将各菌落转移到96孔板上，并且培养过夜作为起始培养物。将这些起始培养物稀释到新鲜的LB培养基中，37℃培养到OD600值到0.8-1.0后添加IPTG到终浓度1mM并培养4小时。利用具有397nm激发和506nm发射的荧光扫描仪检测GFP荧光表达。文库中的大多数克隆显示良好的表达和相似的物理化学性质，提示P200区段的大多数组合产生有用的聚多肽序列。我们从PT09文库中筛选出荧光强度最高的分离物。挑选5株经PCR证实具有正确大小和具有强荧光的分离物进行测序，并根据测序和表达数据选择一个分离物供以后使用。氨基酸构建体的区段在表9中列出。

表9：P200氨基酸序列

序列名	SEQ ID NO：
		PT09-1	116
PT09-2	117
		PT09-3	118
PT09-4	119
		PT09-5	120

我们从选定的一个分离的P200分子，将带有这个P200分子的筛选载体，命名为DMT-200。通过重复上述的相同方法，通过自连接反应，得到的含有200个氨基酸的核苷酸序列，其200个氨基酸序列具有[X]20，其中X是含有10个氨基酸的肽段。将DMT-200载体BspQ I消化和该混合的200个氨基酸的片段连接，将连接的混合物转入BL21(DE3)细胞，获得P400菌落。该P400区段的文库命名为PT10。我们从PT10文库中筛选出荧光强度最高的分离物。从文库中筛选100个分离物用于蛋白质表达。将各菌落转移到96孔板上，并且培养过夜作为起始培养物。将这些起始培养物稀释到新鲜的LB培养基中，37℃培养到OD600值到0.8-1.0后添加IPTG到终浓度1mM并培养4小时。利用具有397nm激发和506nm发射的荧光扫描仪检测GFP荧光表达。文库中的大多数克隆显示良好的表达和相似的物理化学性质，提示P400区段的大多数组合产生有用的聚多肽序列。挑选5株经PCR证实具有正确大小和具有强荧光的分离物进行测序，并根据测序和表达数据选择一个分离物供以后使用。氨基酸构建体的区段在表10中列出。

表10：P400区段的氨基酸序列

序列名	SEQ ID NO：
		PT10-1	121
PT10-2	122
		PT10-3	123
PT10-4	124
		PT10-5	125

我们从选定的一个分离的P400分子，将带有这个P400分子的筛选载体，命名为DMT-400。

通过重复上一步的相同方法，可以再依次获得P600、P800、P1000菌落，分别将P600、P800、P1000区段的文库分别命名为PT11、PT12、PT13。我们从PT11、PT12、PT13文库中筛选出各荧光强度最高的分离物。通过检测GFP荧光表达。文库中的大多数克隆显示良好的表达和相似的物理化学性质，提示P600、P800、P1000区段的大多数组合产生有用的聚多肽序列。根据测序和表达数据各选择5条分离物供以后使用。P600、P800、P1000区段氨基酸构建体的区段在表11、表12、表13中列出。

表11：P600区段的氨基酸序列

序列名	SEQ ID NO：
		PT11-1	126
PT11-2	127
		PT11-3	128
PT11-4	129
		PT11-5	130

表12：P800区段的氨基酸序列

序列名	SEQ ID NO：
		PT12-1	131
PT12-2	132
		PT12-3	133
PT12-4	134
		PT12-5	135

表13：P1000区段的氨基酸序列

序列名	SEQ ID NO：
		PT13-1	136
PT13-2	137
		PT13-3	138
PT13-4	139
		PT13-5	140

P2000、3000、4000、5000区段的构建与上述的自连接方法相似，选择PT13库中序列，以其为模板，通过自连接反应体系可以依次得到P2000、3000、4000、5000菌落。分别将P2000、P3000、P4000、P5000区段的文库分别命名为PT14、PT15、PT16、PT17。我们从PT14、PT15、PT16、PT17文库中筛选出各荧光强度最高的分离物。通过检测GFP荧光表达。文库中的大多数克隆显示良好的表达和相似的物理化学性质，提示P2000、P3000、P4000、P5000区段的大多数组合产生有用的聚多肽序列。根据测序和表达数据各选择1条分离物供以后使用。P2000、P3000、P4000、P5000区段氨基酸构建体的区段在表14、表15、表16、表17中列出。

表14：P2000区段的氨基酸序列

序列名	SEQ ID NO：
		PT14-1	141

表15：P3000区段的氨基酸序列

序列名	SEQ ID NO：
		PT15-1	142

表16：P4000区段的氨基酸序列

序列名	SEQ ID NO：
		PT16-1	143

表17：P5000区段的氨基酸序列

序列名	SEQ ID NO：
		PT17-1	144

实施例5：多种类型的长达1000个氨基酸的聚多肽的构建

上述的实施例仅以举例的方式，以PT03为基础构建了包含100-5000个氨基酸残基的聚多肽。如上述所述的方法，分别采用PT01、PT02、PT04、PT05为例构建包含1000个氨基酸残基的聚多肽的构建。通过上述相同的方法，通过自连接反应，以PT01为基础库得到的含有1000个氨基酸的核苷酸序列，其1000个氨基酸序列具有[X]100，其中X是含有10个氨基酸的肽段。连接该片段和被BspQ I消化的筛选载体片段，将连接混合物转入BL21(DE3)细胞，获得P1000菌落。该P1000区段的文库命名为PT18。从文库中筛选100个分离物用于蛋白质表达。将各菌落转移到96孔板上，并且培养过夜作为起始培养物。将这些起始培养物稀释到新鲜的LB培养基中，37℃培养到OD600值到0.8-1.0后添加IPT6到终浓度1mM并培养4小时。利用具有397nm激发和506nm发射的荧光扫描仪检测GFP荧光表达。文库中的大多数克隆显示良好的表达和相似的物理化学性质，提示P1000区段的大多数组合产生有用的聚多肽序列。我们从PT18文库中筛选出荧光强度最高的分离物。挑选2株经PCR证实具有正确大小和具有强荧光的分离物进行测序，并根据测序和表达数据选择一个分离物供以后使用。氨基酸构建体的区段在表18中列出。

表18：P1000区段的氨基酸序列

序列名	SEQ ID NO：
		PT18-1	145
PT18-2	146

以PT02为基础库得到的含有1000个氨基酸的核苷酸序列。其1000个氨基酸序列具有[X]100，其中X是含有10个氨基酸的肽段。连接该片段和被BspQ I消化的筛选载体片段，将连接混合物转入BL21(DE3)细胞，获得P1000菌落。该P1000区段的文库命名为PT19。我们从PT19文库中筛选出荧光强度最高的分离物。挑选2株经PCR证实具有正确大小和具有强荧光的分离物进行测序，并根据测序和表达数据选择一个分离物供以后使用。氨基酸构建体的区段在表19中列出。

表19：P1000区段的氨基酸序列

以PT04为基础库得到的含有1000个氨基酸的核苷酸序列。其1000个氨基酸序列具有[X]100，其中X是含有10个氨基酸的肽段。连接该片段和被BspQ I消化的筛选载体片段，将连接混合物转入BL21(DE3)细胞，获得P1000菌落。该P1000区段的文库命名为PT20。我们从PT20文库中筛选出荧光强度最高的分离物。挑选2株经PCR证实具有正确大小和具有强荧光的分离物进行测序，并根据测序和表达数据选择一个分离物供以后使用。氨基酸构建体的区段在表20中列出。

表20：P1000区段的氨基酸序列

序列名	SEQ ID NO：
		PT20-1	149
PT20-2	150

以PT05为基础库得到的含有1000个氨基酸的核苷酸序列。其1000个氨基酸序列具有[X]50，其中X是含有20个氨基酸的肽段。连接该片段和被BspQ I消化的筛选载体片段，将连接混合物转入BL21(DE3)细胞，获得P1000菌落。该P1000区段的文库命名为PT21。我们从PT21文库中筛选出荧光强度最高的分离物。挑选2株经PCR证实具有正确大小和具有强荧光的分离物进行测序，并根据测序和表达数据选择一个分离物供以后使用。氨基酸构建体的区段在表21中列出。

表21：P1000区段的氨基酸序列

序列名	SEQ ID NO：
		PT21-1	151
PT21-2	152

实施例6：聚多肽的可重复性分析

可以通过定量相同单元短序列连续在一条聚多肽链中的出现数之和来定义聚多肽的可重复性：将相同单元的连续出现数之和相加除以构成该聚多肽的总的单元数减去一。如完全由同一个10个氨基酸短序列为一个单元的构成一条长1000个氨基酸残基的聚多肽，该条聚多肽的相同单元的连续出现数为99，除以总单元数减去一，其可重复性为100％；如构成一条长1000个氨基酸残基的聚多肽完全由100条不同的10个氨基酸的短序列构成，该条聚多肽的可重复性为0％。得到的重复性比例反映了该聚多肽内的重复性的程度。表22中列出实施例1-5中所有举例序列的重复性程度。结果表明含有100-5000个氨基酸的聚多肽的总序列是可重复的，并且重复程度都大于30％，甚至可以达到100％。

表22：聚多肽序列的重复性分析

实施例7：聚多肽的可重复与非重复的对比研究

为了研究聚多肽中短序列重复性的意义，我们在库PT04的基础上增加库的容量，进行与实施例2-4所描述的相似的筛选步骤，将经过自连接反应所得的[X]100，其中X是PT04库中10个氨基酸短序列，筛选得到100个含有10个氨基酸短序列连接而成的1000个氨基酸的聚多肽，挑选1000株全部进行核酸测序鉴定，从中挑选出一株完全非重复的聚多肽。并与PT20文库中筛选出的一株完全连续重复的序列进行理化性质比较，通过GOR算法确定，这两条聚多肽都至少具有95％的无规则蜷曲形成；通过Chou-Fasman算法，这两条聚多肽的α螺旋和β折叠的总和都小于2％。并且本领域中已经建立了多种方法用来判定多肽的二级结构，其中通过圆二色谱法测定这两种聚多肽，如图10所示，这两种聚多肽的二级结构均无显著差异，都是在198nm处有显著负峰，说明这两种聚多肽都有极高比例的无规则卷曲的存在。因此这两种聚多肽在生理条件下都是缺乏二级结构的。因此完全连续重复的聚多肽并没有出现聚集形成更高级结构的倾向。并且对于重复性比较高的聚多肽来说其在筛选工艺上的简单快捷使其比基本非重复的聚多肽拥有更大的优势。

表23：可重复聚多肽与非重复聚多肽的对比

序列名	SEQ ID NO：	重复性
			PT20-3	153	0％
PT20-4	154	100％

实施例8：将该聚多肽应用于多种蛋白质分子

本发明的一个方面是向多种蛋白质分子中引入该聚多肽，从而产生用于治疗多种疾病或病症的组合物。表24提供了部分本发明的聚多肽融合蛋白(胰岛素，胰岛血糖素样肽-1，胰高血糖素，蜥外泌肽-4，生长激素，促卵泡激素，甲状腺激素，降钙素，促红细胞生成素，粒细胞集落刺激因子，胰岛素样生长因子-1，干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，人成纤维细胞因子-21，白介素-1Ra，白介素-2，凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX或天冬酰胺酶)，选择融合的蛋白或多肽的序列。本发明的选择与聚多肽融合的蛋白质可以是显示与选自表24的蛋白质或多肽序列有至少80％以上的序列一致性。

表24：本发明中用于融合的蛋白质的氨基酸序列

实施例9：产生和评价聚多肽的方法，以聚多肽融合的FGF21为例

用于生产和评价聚多肽组合物的示意图在图1中显示，并且构成了本实施例的一般性说明的基础。使用公开的方法和本领域普通技术人员已经的方法，结合说明性实施例提供的指导，本领域技术人员能够产生和评价一定范围的包换PsTag的融合蛋白因此本实施例被解释为只是说明性的，并非以任何方式限制所述方法，许多变化对于本领域技术人员是明显的。在本实施例中，将聚多肽连接到人成纤维细胞生长因子-21(FGF21)。

图2、图3是本发明一个实施方案的聚多肽的多聚核苷酸构建体装配的代表性步骤的示意流程图。图2中各个短寡核苷酸(如PT01中10氨基酸序列或PT06中9氨基酸序列)退火成双链DNA片段，它们可通过自连接反应得到多聚化产物，例如通过10个氨基酸序列两连接得到20个氨基酸的区段。编码PsTag序列的基因可以通过连接20个氨基酸的区段得到我们希望的长度来装配，如图1所描述的示意图，最终得到的是长度为600个氨基酸残基，同时通过这种方法可以达到更长的长度。

在图7所示的实施例中，可以在载体中插入P200，P400，P600序列，其后为FGF21序列，该填充序列两端为EcoR I和HindIII，在此情况中该基因编码N至C末端结构为P-FGF21的融合蛋白。

编码人FGF21的DNA序列可以通过本领域已知的标准方法从由适当细胞来源、由基因组文库制备的eDNA文库方便地获得，或者可以使用从公开数据库、专利或参考文献中获得的DNA序列合成产生。编码该蛋白质的FGF21的部分基因或多核苷酸后可以克隆构建体如本文所述的构建体内，该构建体可以是在适当转录和翻译序列控制下的质粒或其它载体，用于在生物系统中高水平蛋白质表达。并且该构建体可以设计为不同的结构，以编码融合蛋白的各种排列。例如，可以产生编码以下顺序的融合蛋白的基因(N-到C-末端)：P-FGF21，FGF21-P，FGF21-P-FGF21，P-FGF21-P等。任选地，该嵌合DNA分子可以转移或克隆到作为更合适的表达载体的另一构建体中。在这点上，能够表达该嵌合DNA分子的宿主细胞将用该嵌合DNA分子转化。含有目标DNA区段的载体可以通过众所周知的方法将转移到合适的宿主细胞中，这取决于细胞宿主的类型，如上文所述。

含有P-FGF21表达载体的宿主细胞在常规LB培养基中培养。培养条件如温度、pH等是以前用于为表达选择的宿主细胞的条件，对于本领域技术人员来说是明显的。在融合蛋白表达后，通过离心收集细胞，通过物理或化学手段破碎，保留得到的粗提物用于如以下所述纯化融合蛋白。P-FGF21产物通过本领域已知的方法纯化。诸如凝胶过滤、亲和纯化、盐分级分离、离子交换层析、尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法或凝胶电泳等操作都是可以在纯化中使用的技术。然后，我们使用本领域已知的方法表征分离的融合蛋白的序列、纯度、表观分子量、溶解度和稳定性。最后评价满足预期标准的融合蛋白的活性，这可以使用一种或多种本文提到的在体外或体内的检测手段。

实施例10：聚多肽的稳定性

含有融合到FGF21的N端P600的融合蛋白在小鼠血清和小鼠肾匀浆中进行稳定性实验。在小鼠血清中37℃孵育，分别在0h，1h，3h，6h，18h，24h，48h取样，并通过SDS-PAGE分析，然后使用Western Blotting分析并使用抗FGF21抗体检测，如图8所示。P600-FGF21融合蛋白在血浆中48h才开始显示出有降解的迹象。在小鼠肾均浆中37℃孵育1h，分别使用不稀释的肾匀浆、稀释比为1∶5、1∶10、1∶50、1∶100、1∶1000，并通过SDS-PAGE分析，然后用Western Blotting分析并使用抗FGF21抗体检测。如图9所示，P600-FGF21在肾匀浆中快速降解。这些结果证明了P600-FGF21对血清蛋白酶引起的的降解有抗性，这是聚多肽融合蛋白增强药代动力学性质的一个因素。而P600-FG21能在肾匀浆中迅速降解也说明了聚多肽分子显著区别于PEG分子的特性，可以克服PEG分子在肾细胞中不易被降解从而易引起肾空泡现象的问题。

实施例11：聚多肽的理化性质

含有融合到FGF21的N端P200、P400、P600以及原型FGF21进行圆二色谱实验，鉴定其蛋白质二级结构。在PBS缓冲体系中扫描CD紫外区段190-240nm。如图11所示，融合了聚多肽后在198nm处有显著负峰，并且随着聚多肽链的增长，198nm处的负值显著增加，表明无规卷曲程度也逐渐增加。含有融合到FGF21的N端的P600进行等电聚焦电泳，鉴定融合蛋白的等电点。如图12所示，P600-FGF21的等电点在5.3左右，如原型FGF21等电点相似，可以说明组成聚多肽的甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)因为其自身不带电荷的性质，与蛋白融合并不会改变其等电点。

实施例12：聚多肽融合FGF21在小鼠中的药代动力学

在小鼠中检测原型人FGF21、P200-FGF21、P400-FGF21、P600-FGF21的药代动力学。在注射后的不同时间分析血液样品，通过ELISA测定血清中FGF21的浓度，其中使用抗FGF21抗体用于捕获，结果总结在图13中。它们显示随着聚多肽序列长度增加，半衰期惊人的增加。例如，确定原型人FGF21只具有0.34h，对于融合了该聚多肽的分子，当聚多肽长度达到200个氨基酸时，半衰期达到5.67h。聚多肽长度从200到400个残基增加了200个残基使半衰期增加到8.8h。并且，聚多肽长度从400到600个残基增加了200个氨基酸残基使半衰期延长达到12.93h。这些结果显示聚多肽长度具有惊人的阈值，它导致体内半衰期高于比例的延长。因此，预期任何融合了聚多肽的蛋白具有与更长的药代动力学性质。

表25：包含FGF21和聚多肽组合物的药代动力学参数

实施例13：聚多肽与多种蛋白融合后的在小鼠体内的半衰期研究

采用与实施例12中描述相同的方法，结果发现融合了聚多肽的蛋白质或多肽的血浆半衰期都有显著性提高。相比于未融合前的蛋白半衰期至少提高5倍。

表26：聚多肽与多种蛋白质融合前后的半衰期对比

实施例14：聚多肽在小鼠中免疫原性分析

在小鼠中检测P600-FGF21和FGF21在小鼠中的免疫原性，一共给药8次，隔天给药，第一次加弗氏完全佐剂，后七次加弗氏不完全佐剂。给药完一周后开始使用ELISA的方法检测小鼠血清，血清中抗FGF21的抗体含量如图14所示。融合了聚多肽的FGF21在小鼠体内免疫原性明显下降。不加佐剂组的P600-FGF21并没有检测到抗体。这些结果都表明了聚多肽分子在小鼠体内可以显著降低免疫原性。

实施例15：通过连接到聚多肽可以提高FGF21的溶解度和稳定性

为了评价聚多肽增加溶解度和稳定性的物理化学性质，制备了P600-FG21，在中性pH的Tris-缓冲液中制备测试物，P600-FGF21溶液的表征通过反相HPLC和尺寸排阻色谱法进行，以证实该蛋白质在溶液中是均质和非聚集的。另外，评价了P600-FGF21的稳定性，发现在液体制剂中在冷藏条件下可以至少稳定存在6个月，在37℃稳定至少大约1周。

实施例16：该聚多肽与带负电荷聚多肽融合FGF21的体外受体亲和力对比研究

为了研究该聚多肽与带负电荷的多聚肽的体外性质。我们在基础库PT03中将一个丝氨酸替换成谷氨酸，筛选过程与实施例1-4所述一致，最终得到长度为600个氨基酸的带有显著负电荷的聚多肽，命名为E600。将E600融合到FGF21的N端，得到E600-FGF21融合蛋白。然后我们采用荧光素酶报告基因法检测FGF21体外亲和力，具体方法：使用中国仓鼠卵巢CHO细胞，共稳转人βKlotho和人FGFR1c。然后也稳转5*UAS荧光素酶和GAL4的DNA连接区域融合到Elk1(GAL4-Elk1)这两个报告基因。这一系统中，荧光素酶活性被内源性的ERK磷酸化调节。第一天，将CHO稳转细胞株以1*10⁵cell/孔的密度接种到96孔板中，隔一天，添加各FGF21蛋白到培养上清中，共孵育6h，然后将细胞收集检测荧光。由表27中可以看出，带有显著负电荷的聚多肽体外亲和力要显著低于原型FGF21，而该聚多肽融合的FGF21其体外亲和力与原型FGF21并没有显著差异。

表27：各聚多肽融合FGF21蛋白的体外亲和力研究

FGF21variants	EC<sub>50</sub>(nm)
		WT	0.44±0.05
P200-FGF21	0.42±0.08
		P400-FGF21	0.46±0.12
P600-FGF21	0.47±0.06
		E600-FGF21	0.83±0.09

实施例17：含有赖氨酸聚多肽增强细胞通透性研究

基于PT04文库，按照实施例1-4所描述方法，筛选含有300个氨基酸的聚多肽链，进行测序鉴定，筛选得到一条含有20个正电荷的聚多肽，命名为P300。P300与绿色荧光蛋白GFP融合表达，同时选取了两个常用的蛋白质传递结合域包括多聚精氨酸(含有10个连续精氨酸)，果蝇触角足来源的penetratin多肽。这两种蛋白质都也与GFP融合表达。选择了HeLa细胞和BSR细胞，分别给予500nM P300-GFP、Arg₁₀-GFP、penetratin-GFP。细胞培养在48孔板中，密度为5*10⁵个细胞/孔。细胞培养18小时后，用PBS冲洗细胞，用含有蛋白的无血清的DMEM培养基孵育。孵育之后，细胞用含有20U/ml肝素的PBS冲洗3次去除膜结合蛋白，之后用胰蛋白酶处理，重悬于500ul缓冲液中。细胞使用Fortessa flow cytometer(BDBiosciences)分析GFP荧光强度(488nm)。结果如图15所示，在Hela和BSR两种细胞内，P300的融合可以使GFP蛋白更易于穿过细胞膜，增加转染效率；其增强细胞通透性的效果显著优于Arg₁₀和penetratin。

实施例18：聚多肽修饰的FGF21的生物活性

纯化的P600-FGF21融合蛋白，使用高脂饮食引起的肥胖小鼠(DIO小鼠)测定其体内生物活性。以60％高脂饮食饲养的小鼠随机分为治疗组(每组6只)，安慰剂组，Rosigliazone(4mg/kg/day)，FGF21(1mg/kg/day)，P600-FGF21(0.37mg/kg/day)，P600-FGF21(3.7mg/kg/day)，P600-FGF21(11.1mg/kg/day)与普通小鼠安慰剂组一共6组。简要的说，原型FGF21对于HFD小鼠有显著的减肥和降糖效果。在该模型小鼠中，持续15天给药后，如图16所示，P600-FGF21的降低体重效果以剂量依赖的方式增强，与FGF21原型等摩尔质量的P600-FGF21的中剂量组的降低效果已经显著优于原型FGF21。如图17所示，在HFD小鼠进行口服糖耐量实验(OGTT)，聚多肽融合的FGF21的降低血糖效果也呈以剂量依赖的方式增加。综合来说，PsTag融合的FGF21很好的保留了全部的生物活性，并且因为其能显著延长半衰期的原因，在体内的疗效会显著优于未融合的FGF21。

实施例19：胰高血糖素样肽-1和P600-GLP-1的细胞活性对比效果

取大鼠胰腺原代细胞，培养至所需细胞量时，铺于96孔细胞培养板，铺板密度为0.8～1.0×105cell/mL每孔加100L细胞悬液，将融合蛋白以培养基稀释至系列浓度，加入以上96孔细胞培养板，每浓度点设3个复孔，同时设置空白点及阴性参照点，每实验孔均以培养基补至300μL，于37℃，5％CO培养箱中常规培养。实验结束前，小心吸去上清，每孔加入18μL新鲜培养基，再加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h；终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入150μL DMSO置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的吸光值(OD570nm)。如图18所示。

实施例20：Exendin-4和P600-Exendin4对葡萄糖刺激的胰岛素释放的影响

利用不同浓度的Exendin-4干预大鼠胰岛瘤细胞INS-1，观察对葡萄糖刺激的胰岛素释放的影响。胰岛瘤细胞采用1640培养基于37℃和5％CO2环境下培养，生长至80％时，富集接种于24孔板，相同条件下预培养12h，分别加入1、10、20、50、100nmol/L纯化后的Ps-Tag600-Exendin-4，同时设对照组(商品化的Exendin-4)，每组设6个重复。培养24h后，用PBS洗涤2次，每孔加入200μL含3mmol/L葡萄糖的KRBB缓冲液(118.5mmol/L NaCl、2.54mmol/L CaCl2·2H2O、1.19mmol/L KH2PO4、4.74mmol/L KCl、25mmol/L NaHCO3、1.19mmol/L MgSO4·7H2O、10mmol/L Hepes、5mmol/L丙酮酸及1％BSA，pH7.4)平衡30min，分别换用葡萄糖3mmol/L或20mmol/L的KRBB缓冲液200μL，37℃孵育20min，冰上终止孵育，取180μL上清液，酶联免疫法测定胰岛素含量。胰岛瘤细胞洗涤后加入100μL细胞裂解液，BCA法测定总蛋白含量。基础胰岛素分泌(BIS)为3mmol/L葡萄糖刺激下的胰岛素分泌，以上清液中胰岛素含量：总蛋白含量计算，葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)为20mmol/L葡萄糖刺激下的胰岛素分泌，以上清液中胰岛素含量：总蛋白含量计算。如图19所示。

实施例21：生长激素Gh和P600-Gh的细胞活性比较

采用大鼠淋巴瘤Nb2细胞进行体外生物学试验检测。将Nb2细胞在含10％胎牛血清、10％的马血清、2-琉基乙醇的Fischer’s基础培养基中，于37℃、5％CO2培养24小时，然后转移到只含10％马血清的培养基中培养24小时降低细胞的繁殖速率，离心收集(800rpm×3min)并用分析培养基悬浮成1×105个/ml。将rhGH和P600-GH用含0.1％BSA的0.01M PBS配制的浓度为10ng/ml溶液，2倍稀释度每孔上样50uI，每个样品做复孔，细胞每孔加入200ul。于37℃，5％CO2培养48小时，加入新鲜的配制的MTT溶液20ul/孔，继续培养4小时，离心(1200rpm×10min，弃上清，加入DMSO 100μL/孔震荡溶解，在测定波长570nm，参比波长630nm，读取吸收值。根据酶标仪显示的标准曲线计算出待测样品的生物学活。如图20所示。

实施例22：粒细胞集落刺激因子和P600-G-CSF依赖细胞株NFS60测定活性

采用G-CSF依赖细胞株NFS60测定活性。如图21所示。在96孔细胞培养板中接种一定浓度的NFS60细胞悬液(50μL孔)，将rhG-CSF标准品和聚多肽融合的CSF样品系列稀释，各50μL加入培养板相应孔中。37℃，5％CO2培养36～48h，加MTT溶解液100μL孔，次日测定各孔A570/A630值。

实施例23：IFNα和P600-IFNα的细胞活性的对比实验

利用干扰素在体外有抑制Daudi淋巴瘤细胞株增殖的活性，检测蛋白的活性。如图22所示。将要测活的蛋白样品用细胞培养基稀释，经0.22μm水系微孔滤膜过滤除菌。使每个样品最终的蛋白浓度达到104pg/mL，103pg/mL，10pg/mL，0.1pg/mL，10-3pg/mL。取Daudi细胞悬液，进行活细胞计数。将细胞离心后用培养基重悬，加入96孔板，每空99μL细胞悬液，细胞数目为2×104个。每孔再加入10μL稀释好的蛋白样品，每个浓度测3个孔，并设空白对照。将96孔板盖好，放二氧化碳培养箱4天。每孔加入1μL MTS，放二氧化碳培养箱培养2h。用酶标仪测量波长490nm下每孔的吸光度值。

Claims (6)

1.一种聚多肽，其特征在其包括100至5000个氨基酸残基，其中所述的聚多肽为:

（a）除了N末端第一个氨基酸为甲硫氨酸之外，所有其余氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸或脯氨酸；

（b）该聚多肽序列是可重复的；

（c）通过GOR算法确定，该聚多肽序列至少具有95%的无规则卷曲形成；

（d）通过Chou-Fasman算法确定，该聚多肽序列具有α螺旋和β折叠的总和小于2%；

（e）该聚多肽序列由短序列构成，其中每个短序列具有8至24个氨基酸残基，短序列在该聚多肽中的可重复性达到30%以上；

（f）短序列由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸的3-5种类型的氨基酸组成，且其中任何一种氨基酸残基都不会在短序列中连续出现。

2.根据权利要求1所述的聚多肽，其特征在于任意一种氨基酸占所述聚多肽序列的不超过50%。

3.根据权利要求1所述的一种聚多肽的应用，其特征在于所述的应用通过如下方式实现：聚多肽连接到生物活性蛋白质形成融合蛋白，其用来延长生物活性蛋白质的半衰期、降低免疫原性或提高溶解性。

4.根据权利要求3所述的聚多肽的应用，其特征在于所述的融合蛋白包含一种生物活性蛋白质。

5.根据权利要求4所述的聚多肽的应用，其特征在于，其中所述生物活性蛋白质是胰岛素、胰岛血糖素样肽-1、胰高血糖素、蜥外泌肽-4、生长激素、促卵泡激素、甲状腺激素、降钙素、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、胰岛素样生长因子-1、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、人成纤维细胞因子-21、白介素-1Ra、白介素-2、凝血因子Ⅶa、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ或天冬酰胺酶。

6.一种组合物，包含权利要求3-5中任一项所述的融合蛋白和至少一种药学可接受的载体。

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