CN112608366A - 超正电荷聚多肽及其制备方法、应用 - Google Patents

超正电荷聚多肽及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种超正电荷聚多肽及其应用。所述超电荷聚多肽是全人工设计构建的，由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸5种氨基酸及赖氨酸和/或精氨酸共6‑7种类型的氨基酸构成，可与生物活性蛋白质或多肽融合表达。所述超正电荷聚多肽可以作为蛋白质和多肽的胞内递送载体。本发明提供的超正电荷聚多肽作为蛋白质或多肽的胞内递送载体的方法，可将不同分子量及等电点的蛋白质和多肽由细胞外高效递送至细胞内，且保留所递送蛋白质或多肽的生物功能及活性。同时，所述超电荷聚多肽具有良好的生物安全性。本发明展示了一种高效且安全的蛋白质或多肽的胞内递送系统，在生物医药领域具有良好的研究和开发应用前景。

Description

超正电荷聚多肽及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及生物技术、蛋白质工程、细胞生物学等领域，具体涉及一种超正电荷聚多肽的制备及其在蛋白质和多肽的胞内递送中的应用。
背景技术
蛋白质由于其高特异性、高活性、明确的生物学功能和低毒性等特点，成为了许多疾病的研究工具和治疗手段。自1982年FDA批准第一个治疗性重组蛋白——胰岛素开始，重组蛋白产品的数量大幅度增加。然而，值得注意的是，目前FDA批准的蛋白药物靶点都是位于胞外的膜蛋白或分泌蛋白，而靶点位于胞内的蛋白质相对来说，还处于未被开发的阶段。据估计，超过70％的基因组编码蛋白位于细胞内，而这些细胞内蛋白被认为是“不可成药”的靶点。
目前，使蛋白到达胞内靶点主要有以下几种形式，(1)通常可以通过传递其DNA编码序列来实现，但在细胞内引入外源DNA可能会整合到宿主基因组中，存在破坏内源基因的危险性；(2)递送体外转录的mRNA或mRNA类似物是另一种选择，因其不需要进行核转运，很大程度上降低了基因整合的风险，但RNA本身的不稳定性和免疫原性限制了其应用；(3)相比之下，直接递送蛋白进入到胞内，能使蛋白迅速响应，无需经过转录以及翻译的复杂过程，且避免递送基因所产生的插入基因组风险，作用完成后易被降解，从而避免对细胞的长期毒副作用，具有更高的安全性、特异性和适用性。但是由于蛋白质本身分子量大，结构复杂等特性，很难自发穿透细胞膜进入到细胞内，因此开发有效的蛋白质跨膜递送系统尤为重要。
基于此，研究者们开发出了众多的蛋白递送载体，如脂质体、聚合物、纳米颗粒、细胞穿透肽等等。尽管这些方法促进了蛋白质胞内递送领域的发展，但仍存在一些挑战，包括效率低、细胞毒性、内体逃逸差、对种类多样的蛋白质递送无普适性等。因此，开发一种能使蛋白质高效穿透细胞膜、生物安全性好、能实现内体逃逸的载体，对于推进基于蛋白的基础研究和治疗具有重要意义。
在前期研究中，发明人所在课题组创新性的从头设计，全人工合成了无生物活性的、低免疫原性、生物降解性、无规卷曲、亲水性和不带电荷的聚多肽PsTag。PsTag是由数种人工设计的非免疫原性短肽非重复组合而成的聚多肽链。PsTag由P、S、T、A、G 5种氨基酸组成，可通过与生物活性蛋白质融合表达，成为一种PEG修饰的替代方法，聚多肽融合蛋白具有增强稳定性、延长半衰期、降低免疫原性、不改变生物活性等诸多优点。我们建立了一整套聚多肽的设计、建库、筛选的方法，获得了一系列不带电荷的聚多肽(100-5000个氨基酸残基)，并申请了中国发明专利(专利授权公告号为CN105524147B)。在此基础上，发明人课题组有了更进一步的研究成果。
发明内容
本发明的主要目的在于：克服现有技术存在的问题，创新地发明设计了一种超正电荷聚多肽，作为蛋白质和多肽的胞内递送载体。该载体可以将不同分子量及不同等电点的蛋白质和多肽由细胞外高效递送至细胞内，且被递送到胞内的蛋白质或多肽仍具有生物功能及活性；同时，载体自身具有良好的生物相容性和生物安全性。
技术方案
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明的第一目的是提供超正电荷聚多肽的组合物，所述的超正电荷聚多肽为介导递送生物活性蛋白质或多肽进入细胞的聚多肽。
其中，所述超正电荷聚多肽包括20至90个氨基酸残基，其中所述的超正电荷聚多肽由G、A、S、T、P 5种氨基酸及K和/或R共计6-7种类型的氨基酸组成；氨基酸G、A、S、T、P、K和R的总和占总氨基酸序列的95％以上；任意一种氨基酸占所述超正电荷聚多肽序列的不超过50％；所述超正电荷聚多肽序列是可重复的；甲硫氨酸(M)在超正电荷聚多肽的总氨基酸序列中最多含有1个。
作为优化方案，本发明提供包含20至90个氨基酸残基的超正电荷聚多肽，其中所述超正电荷聚多肽的特征在于，由短肽基序构成，其中每个短肽具有10个氨基酸残基；短肽基序由G、A、S、T、P 5中氨基酸及K和/或R共计6-7种类型的氨基酸组成，且除K和R以外，其余任何一种氨基酸残基都不会在短肽基序中连续出现。
所述超正电荷聚多肽的序列包括但不局限于SEQ ID No.1至SEQ ID No.84所示序列。
本发明的第二目的是提供一种如上所述的超正电荷聚多肽作为细胞胞内递送载体的用途。
优选的，所述的超正电荷聚多肽作为在细胞内递送蛋白质或多肽的载体的用途。
具体的是指，本发明筛选出的超正电荷聚多肽作为运载货物分子的载体，将运载的货物分子递送至细胞的细胞内。所述的货物分子可以为需要以超正电荷聚多肽为载体进入细胞内部的大分子，包括但不局限于具有不同分子量和等电点的、具有药物活性的蛋白质和多肽、具有标记作用的蛋白质和多肽、具有靶向作用的蛋白质和多肽中的至少一种，如荧光蛋白、酶类、毒性蛋白、抗体、细胞因子、重组激素/蛋白类、转录因子、蛋白质疫苗、多肽疫苗或毒性多肽等。
本发明的第三目的是提供一种蛋白质或多肽的胞内递送载体，其特征在于，所述超正电荷聚多肽连接到生物活性蛋白质或多肽形成融合蛋白，将其由细胞外递送到细胞内，同时降低其免疫原性或提高溶解性。
本发明的第四目的是提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括如上所述的超正电荷聚多肽和蛋白质或多肽。
优选的，所述蛋白质分子或多肽分子融合在超正电荷聚多肽的末端(N端或C端)。
本发明的第五目的是提供一种编码如上所述的超正电荷聚多肽或融合蛋白的核苷酸序列。
本发明的第六目的是提供一种包含编码如上所述的超正电荷聚多肽或融合蛋白的核苷酸序列的载体。
其中，载体可以为表达载体、穿梭载体、整合载体等任一种可用载体。
优选的，所述的重组载体为表达载体。
本发明的第七目的在于提供如上所述表达载体的宿主细胞。
其中，宿主细胞可以为细菌、真菌、病毒或动物细胞等。
本发明的第八目的是提供所述融合蛋白在蛋白质或多肽胞内递送和/或蛋白质治疗中的应用。
其中，所述的蛋白质或多肽包括但不局限于具有不同分子量和等电点的、具有药物活性的蛋白质和多肽、具有标记作用的蛋白质和多肽、具有靶向作用的蛋白质和多肽中的至少一种，如荧光蛋白、酶类、毒性蛋白、抗体、细胞因子、重组激素/蛋白类、转录因子、蛋白质疫苗、多肽疫苗或毒性多肽等。
本发明所提供的超正电荷聚多肽与重组聚多肽(专利授权号：CN105524147B)相比，应用长度为20至90个氨基酸残基，区别于重组聚多肽的100至5000个氨基酸残基。此外，相同的电荷密度条件下，较短的超正电荷聚多肽(不超过90个氨基酸)比较长的重组聚多肽(大于100个氨基酸)能够更有效的递送蛋白进入到细胞内，且所递送的蛋白能更好地保留其生物活性，猜测可能是由于较短的超正电聚多肽对目标蛋白的空间位阻较小。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1.本发明利用建库筛选的方法得到稳定的、低免疫原性的由G、A、S、T、P 5种氨基酸及K和/或R共计6-7种类型的氨基酸构成的包含20至90个氨基酸残基的超正电荷聚多肽，并且因为聚多肽序列是可重复的，相较于基本非重复序列可以利用构建的筛选系统进行快速的筛选，即降低了筛选工作量又保证了超正电荷聚多肽优越的性质。
2.本发明将超正电荷聚多肽与具有不同分子量、等电点或生物功能的靶蛋白质或多肽融合，融合蛋白对多种细胞均具有高效的穿透效率，能够有效从内含体逃逸释放至细胞内，递送效率远高于TAT和聚精氨酸等传统的细胞穿透肽。通过GFP、mCherry、PE、FITC标记的BSA等荧光蛋白检测发现本发明能有效递送蛋白进入到细胞内；通过β-Gal、HRP、saporin、KLA、抗体等功能蛋白质或多肽的活性检测，发现本发明递送到细胞内的蛋白质仍保持生物活性及功能；通过细胞毒性实验溶血实验、免疫原性检测等实验发现本发明提供的超正电荷聚多肽载体其本身具有良好的生物相容性和生物安全性。超正电荷聚多肽作为载体递送蛋白质或多肽具有广泛的应用前景。
附图说明
下面参考一下附图对本发明的具体实施方式和优点作进一步详细的阐述。
图1显示超正电荷聚多肽融合蛋白的原理示意图。绿色荧光蛋白(GFP)为示意分子，超正电荷聚多肽可以和任意蛋白质或多肽融合表达。超正电荷聚多肽可以连接在生物活性大分子药物的N端或者C端，这取决于生物活性分子的活性中心而定。图中的超正电荷聚多肽长度可以为多种长度，长度可按照对于融合蛋白的细胞摄取效率的要求而定。
图2是超正电荷聚多肽装配、生产和评价的典型步骤的示意流程图。
图3为超正电荷聚多肽基因的示例性多核苷酸构建载体的示意图。图中显示的载体，可为表达载体、穿梭载体、整合载体等任一种可用载体。优选的，图中所述的重组载体为表达载体。各氨基酸序列(如10氨基酸序列)通过自连接反应连接得到更长的序列，将超正电荷聚多肽插入GFP筛选载体的BspQ I位点。BspQ I位点始终位于插入片段的5’端，可根据需求不断插入序列，从而达到我们需要的长度，进行筛选。
图4是短肽基序自连接反应琼脂糖电泳图，通过调整连接酶的反应时间和温度可以得到不同长度的超正电荷聚多肽的基因片段。
图5显示包含超正电荷聚多肽和GFP融合蛋白(仅列举部分以作示例)的荧光筛选和表达量筛选的结果。使用TECANinfinite M200PRO多功能酶标仪测定荧光强度(图5A)；利用SDS-PAGE确定融合蛋白表达量(图5B)。
图6为超正电荷聚多肽和GFP融合蛋白的理化性质鉴定，利用SDS-PAGE(图6A)、SEC-HPLC(图6B)、发射光谱(图6C)、吸收光谱(图6D)等对融合蛋白的分子量、纯度及荧光特性等进行了鉴定。
图7为本发明实施例4所述，不同长度及不同电荷密度的超正电荷聚多肽向HeLa细胞内递送GFP荧光蛋白的效率，及与经典细胞穿透肽TAT的比较；其中，图7A为超正电荷聚多肽与GFP融合蛋白和不同细胞37℃孵育4h后的流式检测结果；图7B为超正电荷聚多肽与经典细胞穿透肽TAT对GFP递送效率的比较。
图8为本发明实施例5所述，HeLa细胞对超正电荷聚多肽与藻红蛋白(R-PE)的融合蛋白的细胞摄取效果图。
图9为本发明实施例6所述，HeLa细胞对绿色荧光标记的超正电荷聚多肽与牛血清白蛋白(BSA)的融合蛋白的细胞摄取效果图。
图10为本发明实施例7所述，中超正电荷聚多肽向HeLa细胞内递送酶类的效果图。图10A为超正电荷聚多肽与辣根过氧化物酶(HRP)融合蛋白转染的HeLa细胞的显微镜图像；图10B为HRP定量检测试剂盒对HeLa细胞中HRP相对活性的检测结果。
图11为本发明实施例8中超正电荷聚多肽与KLA多肽、BH3多肽及Smac多肽的融合蛋白对HeLa细胞的毒性。
图12为本发明实施例9中HeLa细胞对超正电荷聚多肽与FITC标记的兔血清来源的IgG融合蛋白的细胞摄取效果图。
图13为本发明实施例10中相同的电荷密度下(含30％正电荷氨基酸)和相同的氨基酸组成条件下(均由P，S，T，A，G，K和R组成)，较短的超正电荷聚多肽(例如60个氨基酸)与较长的带正电重组聚多肽(例如360个氨基酸)对saporin的递送效率(图13A)和所递送的saporin对细胞的毒性对比结果(图13B)。
图14为本发明实施例11中相同肽链长度(例如90个氨基酸)的条件下，超正电荷聚多肽(由P，S，T，A，G，K和R组成)与不带电荷聚多肽(由P，S，T，A和G组成)对GFP的胞内递送效率。
图15为本发明实施例12中，本发明强调的氨基酸组成的超正电荷聚多肽(P，S，T，A，G，K和R)与非本发明强调的氨基酸组成的聚多肽(从20种天然氨基酸中随机挑选)，其对红色荧光蛋白mCherry的胞内递送效率。
图16为超正电荷聚多肽自身在不同浓度条件下的对不同细胞的毒性，HeLa(图16A)、MCF-7(图16B)、MCF-7/ADR(图16C)和PC12(图16D)。
图17为不同浓度的单独的超正电荷聚多肽的溶血活性研究。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。在描述本发明的实施方案之前，应该理解这些实施方案只是以举例方式提供，本发明的保护内容不局限于以下实施例，在实施本发明时可以使用此处所述的本发明实施方案的各种替代方案。另外，材料、方法和实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的定义。
本发明提供包含重组超正电荷聚多肽的组合物。在一些实施方案中，超正电荷聚多肽序列可以具有20至90个氨基酸残基。该超正电荷聚多肽是非天然存在、可重复的序列，主要由亲水性氨基酸组成，该序列在生理条件下根据氨基酸的排列组成具有特定的二级或三级结构。
本发明提供包含重组超正电荷聚多肽的组合物，其可连接到生物活性蛋白质或多肽，产生超正电荷聚多肽融合蛋白。超正电荷聚多肽可作为融合配体，因为它们当连接到生物活性蛋白质或多肽产生融合蛋白时，可以提供某些化学和药学性质。这些希望的性质包括但不限于增强对细胞膜的穿透能力、改善所携带分子的稳定性和免疫原性等特征。
本发明提供方法，其中通过选择超正电荷聚多肽长度和电荷密度来设计超正电荷聚多肽融合蛋白，以使施用于受试者的融合蛋白具有细胞穿透能力。通常，在融合蛋白中引入较长的超正电荷聚多肽比较短的导致更有效的细胞穿透，较大的电荷密度比较小的电荷密度导致更有效地细胞穿透。
实施例1：短肽基序的设计与构建
下列实施例以设计构建长度为10个氨基酸的短肽基序为例。分别选择了组成短肽基序的G、A、S、T、P 5种氨基酸及K和/或R共计6-7种类型氨基酸，且除K和R以外，其余任何一种氨基酸残基都不会在短肽中连续出现。如，选择G、A、S、T、P及K这6种类型氨基酸，设计10条含有10个氨基酸的肽段，命名为序列文库SP01(以Short Peptide的首字母缩写SP命名超正电荷聚多肽的短肽基序文库，以SCP(Supercharged Polypeptide)命名超正电荷聚多肽)，氨基酸和核苷酸序列的序列名和这些区段的SEQ ID NO在表1中列出。如，选择G、A、S、T、P及R这6种类型氨基酸，设计10条含有10个氨基酸的肽段，命名为序列文库SP02，氨基酸和核苷酸序列的序列名和这些区段的SEQ ID NO在表2中列出。如，选择G、A、S、T、P、K及R这7种类型氨基酸，设计10条含有10个氨基酸的肽段，命名为序列文库SP03，氨基酸和核苷酸序列的序列名和这些区段的SEQ ID NO在表3中列出。
表1：SP01氨基酸序列及核苷酸序列
Figure BDA0002878322170000091
表2：SP02氨基酸序列及核苷酸序列
Figure BDA0002878322170000092
Figure BDA0002878322170000101
表3：SP03氨基酸序列及核苷酸序列
Figure BDA0002878322170000102
实施例2：超正电荷聚多肽长度为20、30、40、50、60、70、80和90个氨基酸的构建
利用SP01、SP02和SP03的短肽基序文库，通过自连接反应获得编码20、30、40、50、60、70、80和90个氨基酸的目的基因片段。通过T4连接酶连接该目的基因片段和被BspQ I消化的筛选载体片段(筛选载体为pET-28a(+)载体，载体来源购自EMD Biosciences，编号69864-3，通过在其EcoR I和Hind III酶切位点中插入绿色荧光蛋白基因GFP获得)，将连接混合物转入BL21(DE3)感受态细胞中，获得SCP20、SCP30、SCP40、SCP50、SCP60、SCP70、SCP80和SCP90菌落。从文库中筛选500个分离物用于蛋白质表达。将各菌落转移到96孔板上，并且培养过夜作为起始培养物。将这些起始培养物稀释到新鲜的LB培养基中，37℃培养到OD600值为0.6-0.8后，添加终浓度为1mM的IPTG 25℃诱导培养4h。利用具有488nm激发和509nm发射的荧光扫描仪检测GFP荧光表达。文库中的大多数克隆显示良好的表达和相似的物理化学性质，提示SCP20至SCP90区段的大多数组合产生有用的超正电荷聚多肽序列。我们从中筛选出荧光强度较高的分离物。挑选100株经PCR证实具有正确大小和具有强荧光的分离物进行测序，并根据测序结果选择适当数量的分离物供以后使用。筛选的SCP20至SCP90区段的文库分别命名为SP04、SP05、SP06、SP07、SP08、SP09、SP10和SP11(由于库容量大，每种文库仅列举3条氨基酸序列以作示例)。
表4：SCP20区段的氨基酸序列
序列名 SEQ ID NO.
SCP20-1 61
SCP20-2 62
SCP20-3 63
表5：SCP30区段的氨基酸序列
序列名 SEQ ID NO.
SCP30-1 64
SCP30-2 65
SCP30-3 66
表6：SCP40区段的氨基酸序列
Figure BDA0002878322170000111
Figure BDA0002878322170000121
表7：SCP50区段的氨基酸序列
序列名 SEQ ID NO.
SCP50-1 70
SCP50-2 71
SCP50-3 72
表8：SCP60区段的氨基酸序列
序列名 SEQ ID NO.
SCP60-1 73
SCP60-2 74
SCP60-3 75
表9：SCP70区段的氨基酸序列
序列名 SEQ ID NO.
SCP70-1 76
SCP70-2 77
SCP70-3 78
表10：SCP80区段的氨基酸序列
序列名 SEQ ID NO.
SCP80-1 79
SCP80-2 80
SCP80-3 81
表11：SCP90区段的氨基酸序列
序列名 SEQ ID NO.
SCP90-1 82
SCP90-2 83
SCP90-3 84
实施例3：将超正电荷聚多肽应用于多种蛋白质或多肽分子形成融合蛋白
本发明筛选出的超正电荷聚多肽作为运载货物分子的载体，将运载的货物分子递送至细胞的细胞内。所述的货物分子可以为需要以超正电荷聚多肽为载体进入细胞内部的大分子，包括但不局限于具有不同分子量和等电点的、具有药物活性的蛋白质和多肽、具有标记作用的蛋白质和多肽、具有靶向作用的蛋白质和多肽中的至少一种，如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(mCherry)、藻红蛋白(PE)、牛血清白蛋白(BSA)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、辣根过氧化物酶(HRP)、RNAse A、皂草素(saporin)、单克隆抗体(mAb)、多肽如Bak、BH3、Bcl-2、Bax、Bid、Beclin-1、Smac、KLA等。超正电荷聚多肽可以连接在生物活性大分子药物的N端或者C端，这取决于生物活性分子的活性中心而定。
一个具体的实施例中，以SCP40-1序列为递送载体，以绿色荧光蛋白GFP(分子量为26.9kDa，等电点为5.9)为货物蛋白，融合蛋白的构建、表达纯化及鉴定的具体方法如下：
1.融合蛋白的构建及表达纯化
通过以上超正电荷聚多肽基序设计原则，设计短肽序列。选择大肠杆菌的偏爱密码子，设计与之对应的DNA引物，组成的编码超正电荷聚多肽基序的基因文库。取20条5’端加磷酸的DNA片段，进行自连接反应，每管混匀，4℃孵育5min后，75℃m灭活10min，90V、90min2％TBE琼脂糖凝胶电泳对产物进行分离。影响自连接反应条件有：模板浓度、DNA连接酶浓度、反应温度、反应时间、琼脂糖凝胶电泳缓冲液的选择、凝胶浓度的选择以及电泳时间。可以通过改变这些参数，改变自连接反应的进行程度，从而可以按照需求选择最合适大小的目的基因片段。
优选的，所述的重组载体为pET-28a表达载体。将通过自连接反应连接得到的超正电荷聚多肽基因片段插入载体的BspQ I位点。通过PCR反应或基因合成获得货物蛋白的基因片段，将GFP基因片段引入载体的EcoR I和Hind III酶切位点中间。将上述获得的超正电荷基因片段构建表达载体转化至大肠杆菌工程菌株。之后，将工程菌株的种子液接种于LB培养基，37℃、220rpm培养过夜。次日转接，37℃继续培养至OD600为0.6-0.8，加入IPTG诱导融合蛋白表达。过夜发酵后，将发酵液离心后收集菌体，超声破碎至半透明状，取超声上清经硫酸铵沉淀、CM阳离子交换柱和Ni2+亲和层析柱纯化即可得到融合蛋白。
实验结果：图1显示超正电荷聚多肽融合蛋白的原理示意图。GFP为示意分子，超正电荷聚多肽可以和任意蛋白质或多肽融合表达。图2是超正电荷聚多肽装配、生产和评价的典型步骤的示意流程图。超正电荷聚多肽长度可以为多种长度，可根据融合蛋白的细胞摄取效率的要求而定。图3为超正电荷聚多肽基因的示例性多核苷酸构建载体的示意图。图4是短肽基序自连接反应琼脂糖电泳图，通过调整连接酶的反应时间和温度可以得到不同长度的超正电荷聚多肽的基因片段。图5显示包含超正电荷聚多肽和GFP融合蛋白(仅列举部分以作示例)的荧光筛选(图5A)和SDS-PAGE表达量筛选(图5B)的结果。
2.融合蛋白的理化性质鉴定
通过SDS-PAGE测定各融合蛋白的纯度；圆二色谱(CD)测定各融合蛋白的二级结构；质谱(ESI-MS)测定各融合蛋白的分子量及均一度；MALDI-TOF和分子排阻色谱(SEC-HPLC)检测各融合蛋白的实际分子量及表观分子量；等电聚焦电泳(IEF)测定各融合蛋白的等电点；融合蛋白的荧光激发及发射光谱测定：利用全波长扫描酶标仪测定融合蛋白中GFP的激发波长和发射波长，评估超正电荷对GFP荧光特性的影响；各融合蛋白的聚集程度、热稳定性及血浆稳定性检测：各融合蛋白在不同温度(如-20℃、4℃、25℃及37℃)下放置不同时间或与小鼠血浆孵育不同时间后，SDS-PAGE及Western Blot检测目的蛋白含量，蛋白聚集分析试剂盒分析蛋白聚集程度，评估融合蛋白的稳定性等。
实验结果：图6包含了部分超正电荷聚多肽和GFP融合蛋白的理化性质鉴定结果。利用SDS-PAGE(图6A)和RP-HPLC(图6B)对融合蛋白的分子量和纯度进行了鉴定。此外通过荧光酶标仪测定融合蛋白的发射光谱(图6C)、吸收光谱(图6D)，结果显示，SCP-GFP融合蛋白的荧光特性与原型GFP非常相似，这意味着SCP不会干扰GFP的功能，使我们能够通过荧光强度直接比较细胞对各个SCP-GFPs的摄取效率。
实施例4：不同长度及电荷密度的超正电荷聚对绿色荧光蛋白GFP的胞内递送效率及与经典细胞穿透肽TAT的比较
具体方法如下：基于实施例1和实施例2，以GFP为模式蛋白，构建不同长度及不同电荷密度的超正电荷聚多肽与GFP融合蛋白(具体序列信息如表12所示)。融合蛋白的表达载体的构建及融合蛋白的分离纯化方法参照实施例3进行。将HeLa细胞以适当密度接种于24孔板，过夜培养使细胞贴壁。当细胞汇合度到达80％时，加入浓度为2μM的不同的超正电荷聚多肽与GFP融合蛋白，与HeLa细胞在37℃，5％CO2培养箱孵育4h后，取出细胞培养板，吸弃细胞培养基，用含肝素(20U/mL)的PBS洗涤细胞三次，每次5min，洗去细胞膜表面结合的蛋白。之后再用胰酶消化，PBS洗三次，每次1000rpm离心5min，最后用适当体积的PBS重悬，使用流式细胞术检测各融合蛋白的细胞摄取效率，同时不同浓度的细胞穿透肽TAT与GFP融合蛋白作为对照组。
实验结果：表12显示与空白细胞相比，超正电荷聚多肽与GFP融合蛋白孵育后，HeLa细胞内的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)增加倍数。图7A显示不同长度及不同电荷密度的超正电荷聚多肽与GFP融合蛋白和不同细胞37℃孵育4h后的流式检测结果，以柱状图显示与空白组细胞相比，给药融合蛋白组的细胞内荧光强度增加倍数。结果显示，通常在融合蛋白中引入较长的超正电荷聚多肽比较短的导致更有效的细胞穿透，较大的电荷密度比较小的电荷密度导致更有效地细胞穿透。同时，图7B流式检测结果显示，超正电荷聚多肽比经典的细胞穿透肽TAT能更有效地递送蛋白进入细胞内。
表12：超正电荷聚多肽与GFP融合蛋白与HeLa细胞孵育后，细胞内的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)增加倍数
Figure BDA0002878322170000161
Figure BDA0002878322170000171
实施例5：超正电荷聚多肽向HeLa细胞内递送藻红蛋白R-PE
具体方法如下：超正电荷聚多肽与R-PE(R-PE分子量为240kDa，等电点为4.3)融合蛋白的表达载体的构建及融合蛋白的分离纯化方法参照实施例3进行。将HeLa细胞以适当密度接种于激光共聚焦培养皿，过夜培养使细胞贴壁。当细胞汇合度到达80％时，加入浓度为2μM的超正电荷聚多肽与R-PE融合蛋白。与HeLa细胞在37℃，5％CO2培养箱孵育4h后，取出细胞培养板，吸弃细胞培养基，用含肝素(20U/mL)的PBS洗涤细胞三次，每次5min，洗去细胞膜表面结合的蛋白。之后再2μg/mL Hoechst 33342对细胞核进行染色，室温避光染色5min后，用PBS洗涤三次，每次5min，最后加入适当体积的PBS，使用激光共聚焦分析检测融合蛋白在HeLa细胞内的荧光强度和分布情况。
实验结果：图8为本发明实施例5中，HeLa细胞对超正电荷聚多肽与R-PE的融合蛋白的细胞摄取效果图。从图8可以看出，超正电荷聚多肽与R-PE的融合蛋白能够有效进入HeLa细胞，被转染的细胞中可以观察到均匀的红色荧光，且胞内具有较强的荧光强度。
实施例6：超正电荷聚多肽向HeLa细胞内递送荧光标记的牛血清白蛋白BSA
具体方法如下：超正电荷聚多肽与BSA(BSA分子量为69.3kDa，等电点为4.7)融合蛋白的表达载体的构建及融合蛋白的分离纯化方法参照实施例3进行。首先，对纯化后的超正电荷聚多肽与BSA的融合蛋白进行FITC标记。其次，将HeLa细胞以适当密度接种于激光共聚焦培养皿，过夜培养使细胞贴壁。当细胞汇合度到达80％时，加入浓度为2μM的超正电荷聚多肽与BSA融合蛋白。与HeLa细胞在37℃，5％CO2培养箱孵育4h后，取出细胞培养板，吸弃细胞培养基，用含肝素(20U/mL)的PBS洗涤细胞三次，每次5min，洗去细胞膜表面结合的蛋白。之后再2μg/mL Hoechst 33342对细胞核进行染色，室温避光染色5min后，用PBS洗涤三次，每次5min，最后加入适当体积的PBS，使用激光共聚焦分析检测融合蛋白在HeLa细胞内的荧光强度和分布情况。
实验结果：图9为本发明实施例6中，HeLa细胞对超正电荷聚多肽与BSA的融合蛋白的细胞摄取效果图。从图9可以看出，超正电荷聚多肽与BSA的融合蛋白能够有效进入HeLa细胞，被转染的细胞中可以观察到均匀的绿色荧光，且胞内具有较强的荧光强度。
实施例7：超正电荷聚多肽向HeLa细胞内递送辣根过氧化物酶HRP
具体方法如下：超正电荷聚多肽与HRP(HRP分子量为40.0kDa，等电点为7.2)融合蛋白的表达载体的构建及融合蛋白的分离纯化方法参照实施例3进行。将HeLa细胞以适当密度接种于24孔细胞培养板，过夜培养使细胞贴壁。当细胞汇合度到达80％时，加入浓度为1μM的超正电荷聚多肽与HRP融合蛋白。与HeLa细胞在37℃，5％CO2培养箱孵育4h后，取出细胞培养板，吸弃细胞培养基，用含肝素(20U/mL)的PBS洗涤细胞三次，每次5min，洗去细胞膜表面结合的蛋白。加入含有酶底物DAB的显色液，室温孵育30min后，移除底物溶液，用PBS清洗细胞三次，使用光学显微镜观察细胞的显色情况。同时，使用HRP定量检测试剂盒，检测细胞内的HRP相对酶活水平，评估超正电荷聚多肽递送HRP的效率，所有步骤按照试剂盒手册操作，使用酶标仪检测细胞裂解液与HRP底物反应后的溶液吸光度。
实验结果：图10为本发明实施例7中超正电荷聚多肽向HeLa细胞内递送酶类HRP的效果图。其中，图10A为超正电荷聚多肽与HRP融合蛋白转染的HeLa细胞的显微镜图像，可以看出，使用含有酶底物DAB的显色液之后，超正电荷聚多肽与HRP融合蛋白处理的细胞具有明显的棕色沉淀，而单独的酶HRP处理的细胞显示无色；图10B为HRP定量检测试剂盒对HeLa细胞中HRP相对活性的检测结果，可以看出，本发明制备的超正电荷聚多肽递送到细胞内的酶HRP的活性能保持在95％以上。以上结果提示，超正电荷聚多肽与HRP的融合蛋白能够有效进入HeLa细胞，且货物蛋白HRP的酶活性得到了较好的保留。
实施例8：超正电荷聚多肽向HeLa细胞内递送荧光标记的细胞毒性多肽
具体方法如下：超正电荷聚多肽与几种多肽的融合蛋白的表达载体的构建及融合蛋白的分离纯化方法参照实施例3进行。几种多肽包括：KLA多肽、BH3结构域来源的多肽及Smac多肽。将HeLa细胞以适当密度接种于96孔细胞培养板，过夜培养使细胞贴壁。当细胞汇合度到达80％时，吸弃培养基，加入一系列浓度梯度的超正电荷聚多肽与多肽的融合蛋白。与HeLa细胞在37℃，5％CO2培养箱孵育24h后，取出细胞培养板，吸弃细胞培养基，通过MTT试验检测被处理的HeLa细胞存活率，每组实验重复5个样品。
实验结果：图11为本发明实施例8中，几种超正电荷聚多肽与多肽的融合蛋白在不同浓度时对HeLa细胞的细胞毒性。从图11可以看出，随着融合蛋白浓度的提高，融合蛋白处理的细胞存活率出现明显的下降。结果表明本发明制备的超正电荷聚多肽可以高效地递送多种毒性多肽进入细胞，并且维持多肽自身的生物学活性。
实施例9：超正电荷聚多肽向HeLa细胞内递送荧光标记的免疫球蛋白IgG
具体方法如下：超正电荷聚多肽与IgG(IgG分子量约为150kDa，等电点约为8.0)融合蛋白的表达载体的构建及融合蛋白的分离纯化方法参照实施例3进行。首先，对纯化后的超正电荷聚多肽与IgG的融合蛋白进行FITC标记。其次，将HeLa细胞以适当密度接种于激光共聚焦培养皿，过夜培养使细胞贴壁。当细胞汇合度到达80％时，加入浓度为2μM的超正电荷聚多肽与BSA融合蛋白。与HeLa细胞在37℃，5％CO2培养箱孵育4h后，取出细胞培养板，吸弃细胞培养基，用含肝素(20U/mL)的PBS洗涤细胞三次，每次5min，洗去细胞膜表面结合的蛋白。之后再2μg/mL Hoechst 33342对细胞核进行染色，室温避光染色5min后，用PBS洗涤三次，每次5min，最后加入适当体积的PBS，使用激光共聚焦分析检测融合蛋白在HeLa细胞内的荧光强度和分布情况。
实验结果：图12为本发明实施例9中，HeLa细胞对超正电荷聚多肽与IgG的融合蛋白的细胞摄取效果图。从图12可以看出，超正电荷聚多肽与IgG的融合蛋白能够有效进入HeLa细胞，被转染的细胞中可以观察到均匀的绿色荧光，且胞内具有较强的荧光强度。
实施例10：超正电荷聚多肽与正电荷重组聚多肽递送蛋白的效率比较
具体方法如下：选择相同的电荷密度(含有30％正电荷氨基酸)和相同氨基酸组成(均由P，S，T，A，G，K和R组成)条件下，较短的超正电荷聚多肽(含60个氨基酸残基)和较长的重组聚多肽(例如360个氨基酸)分别与saporin融合表达，融合蛋白的表达载体的构建及融合蛋白的分离纯化方法参照实施例3进行。首先，对纯化后的蛋白分别进行FITC标记。其次，将HeLa细胞以适当密度接种于24孔板或96孔板，过夜培养使细胞贴壁。当细胞汇合度到达80％时，加入浓度为2μM的超正电荷聚多肽与saporin融合蛋白或2μM的重组聚多肽与saporin融合蛋白。(1)对于24孔板，FITC标记的融合蛋白与HeLa细胞在37℃，5％CO2培养箱孵育4h后，取出细胞培养板，吸弃细胞培养基，用含肝素(20U/mL)的PBS洗涤细胞三次，每次5min，洗去细胞膜表面结合的蛋白。胰酶消化收集细胞，使用流式细胞术检测融合蛋白在HeLa细胞内的荧光强度。(2)对于96孔板，融合蛋白与HeLa细胞在37℃，5％CO2培养箱孵育24h后，取出细胞培养板，吸弃细胞培养基，通过MTT试验，检测相同剂量的超正电荷聚多肽与saporin融合蛋白和重组聚多肽与saporin融合蛋白对HeLa细胞活力的影响。
实验结果：图13A显示相同的电荷密度(含有30％正电荷氨基酸)和蛋白浓度条件下，较短的超正电荷聚多肽(含60个氨基酸残基)和较长的重组聚多肽(例如120个氨基酸)分别对saporin的递送效率，超正电荷聚多肽对saporin的递送效率显著高于重组聚多肽。图13B显示相同电荷密度和剂量条件下，较短的超正电荷聚多肽与saporin融合蛋白对HeLa细胞的毒性显著高于较长的重组聚多肽与saporin融合蛋白。以上结果显示，本发明提供的较短的超正电荷聚多肽(不超过90个氨基酸)比重组聚多肽(大于100个氨基酸)能够更有效的递送蛋白进入到细胞内，且所递送的蛋白能更好地保留其生物活性，猜测可能是由于较短的超正电聚多肽对目标蛋白的空间位阻较小。
实施例11：超正电荷聚多肽与不带电荷聚多肽递送蛋白的效率比较
具体方法如下：在相同肽链长度(例如70个氨基酸)的条件下，将超正电荷聚多肽(由P，S，T，A，G，K和R组成)与不带电荷聚多肽(由P，S，T，A和G组成)与绿色荧光蛋白GFP融合表达，融合蛋白的表达载体的构建及融合蛋白的分离纯化方法参照实施例3进行。将HeLa细胞以适当密度接种于24孔板，过夜培养使细胞贴壁。当细胞汇合度到达80％时，加入浓度为2μM的超正电荷聚多肽与GFP融合蛋白或2μM的不带电荷聚多肽与GFP融合蛋白，在37℃，5％CO2培养箱孵育4h。孵育结束后，取出细胞培养板，吸弃细胞培养基，用含肝素(20U/mL)的PBS洗涤细胞三次，每次5min，洗去细胞膜表面结合的蛋白，荧光显微镜观察。
实验结果：图14为本发明实施例11中，HeLa细胞对超正电荷聚多肽与GFP融合蛋白和不带电荷聚多肽与GFP融合蛋白摄取的荧光显微镜观察图。如权利要求2所述，本发明提供的超正电荷聚多肽应由G、A、S、T、P 5种氨基酸及K和/或R共计6-7种类型的氨基酸构成。如图14所示，不带电荷聚多肽与GFP融合蛋白的细胞摄取效率显著低于超正电荷聚多肽与GFP融合蛋白，与空白组相当。结果表明，当去除了正电荷氨基酸K和/或R后，仅由P，S，T，A和G组成的不带电荷聚多肽不具备将蛋白递送到细胞内的能力。
实施例12：超正电荷聚多肽与其他氨基酸组成的聚多肽递送蛋白的效率比较
具体方法如下：将超正电荷聚多肽(例如80个氨基酸，SEQ ID NO.81)与红色荧光蛋白mCherry融合表达。同时，选择相同长度的非本发明强调的氨基酸组成的聚多肽(随机挑选天然氨基酸，如选择P，S，D，E，H，V和P)，将其与mCherry融合表达，研究其他氨基酸组成的聚多肽对蛋白的胞内递送效率。融合蛋白的表达载体的构建及融合蛋白的分离纯化方法参照实施例3进行。将HeLa细胞以适当密度接种于24孔板，过夜培养使细胞贴壁。当细胞汇合度到达80％时，加入浓度为2μM的超正电荷聚多肽与GFP融合蛋白或2μM的不带电荷聚多肽与GFP融合蛋白，在37℃，5％CO2培养箱孵育4h。孵育结束后，取出细胞培养板，吸弃细胞培养基，用含肝素(20U/mL)的PBS洗涤细胞三次，每次5min，洗去细胞膜表面结合的蛋白，荧光显微镜观察。
实验结果：图15为本发明实施例12中，HeLa细胞对超正电荷聚多肽与mCherry融合蛋白和其他类聚多肽与mCherry融合蛋白摄取的荧光显微镜结果。如权利要求2所述，本发明提供的超正电荷聚多肽应由G、A、S、T、P 5种氨基酸及K和/或R共计6-7种类型的氨基酸构成。如图15所示，非发明强调的氨基酸组成的聚多肽与mCherry融合蛋白的细胞摄取效率显著低于超正电荷聚多肽与mCherry融合蛋白，与空白组相当。结果表明，随机挑选的、非发明强调的氨基酸组成的聚多肽，其不具备将蛋白递送到细胞内的能力。
实施例13：超正电荷聚多肽自身在不同浓度条件下的对不同细胞的毒性
具体方法如下：本实施例采用超正电荷聚多肽(随机序列)验证其细胞毒性。单独的超正电荷聚多肽通过多肽合成得到(以SEQ ID NO.69为例)。将不同细胞以适当密度接种于96孔细胞培养板，过夜培养使细胞贴壁。当细胞汇合度到达80％时，加入不同浓度的超正电荷聚多肽，与细胞在37℃，5％CO2培养箱孵育4h后，加入5mg/mL MTT终止培养，每孔10μL，置37℃，5％CO2培养箱中培养4h，弃去细胞上清，每孔加入150μL的DMSO，摇板机振摇10min，使用酶标仪测定570nm(参比波长630nm)下的OD值，比较分析超正电荷聚多肽对不同细胞的细胞毒性。
实验结果：如图16所述，本发明制备的超正电荷聚多肽即使在较大浓度(128μM，为递送实验浓度的64倍)条件下，几种细胞(HeLa、MCF-7、MCF-7/ADR和PC12)的存活率基本都高于95％。初步表明本发明制备的超正电荷聚多肽对细胞的毒性较低，具有良好的生物安全性。
实施例14：超正电荷聚多肽的溶血活性研究
具体方法如下：首先制备红血细胞悬液。取新鲜鼠血10-20mL，放入盛有玻璃珠的三角烧瓶中振摇10min，使成脱纤血液。加入生理盐水100mL摇匀，1500rpm离心15min，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水洗涤至上清液不显红色为止。将所得红细胞用生理盐水配成2％的混悬液(v/v)备用。在制备好的红细胞悬液中加入不同浓度的超正电荷聚多肽，同时无菌PBS、50％(v/v)无菌水及0.1％(v/v)Triton X-100作为对照组，混匀后，置于37℃的恒温水浴中进行温育，观察并记录各管的溶血情况。开始每隔15min观察一次，1h后，每隔1h观察一次，一般观察3h后，取上清测定540nm处的吸光度，计算溶血活性。
实验结果：图17为不同浓度的单独的超正电荷聚多肽(以SEQ ID NO.75为例)的溶血活性研究。从图可以看出，与加50％(v/v)无菌水及0.1％(v/v)Triton X-100的阳性对照组相比，不同浓度的超正电荷聚多肽对细胞的溶血活性可忽略，与加无菌PBS的阴性对照组无显著性差异。以上结果均说明，本发明制备的超正电荷聚多肽具有良好的生物安全性。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 超正电荷聚多肽及其制备方法、应用
<160> 84
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> PRT
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<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 22
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<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 23
Gly Ser Thr Ala Arg Pro Arg Thr Ser Gly
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 27
Gly Thr Arg Ala Ser Pro Arg Ser Arg Arg
1 5 10
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 28
Gly Arg Thr Arg Ser Gly Arg Ala Arg Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 29
Gly Arg Ser Arg Arg Pro Ala Arg Thr Arg
1 5 10
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 30
Gly Arg Thr Arg Arg Pro Ala Arg Ser Arg
1 5 10
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 31
ggctctcgtg ctacttccgg cgccacctca 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 32
ggcgctactt ctaccgccgg cgcacgtcct 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 33
ggctctactg ctcgtcctcg cacctccggc 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 34
ggcacttctc gttccgctcg cgccggccct 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 35
ggcactcgtg ctggccctcg cacctctcga 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 36
ggcgcttctc gtactcgcac cgcccgacct 30
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 37
ggcactcgtg cttctcctcg ctcccgacgg 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 38
ggccgtactc gctctggccg agctcggcct 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 39
ggccgttctc gccgacctgc tcggactaga 30
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 40
ggccgtactc gccgacctgc tcggtctaga 30
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 41
Gly Ser Thr Ala Lys Pro Ala Arg Ser Pro
1 5 10
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 42
Gly Thr Ser Ala Gly Pro Arg Pro Ser Lys
1 5 10
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 43
Gly Thr Arg Ala Lys Pro Ala Pro Ser Lys
1 5 10
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 44
Gly Arg Ser Ala Thr Arg Lys Ala Gly Pro
1 5 10
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 45
Gly Thr Arg Ala Arg Pro Lys Pro Ser Lys
1 5 10
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 46
Gly Lys Ser Lys Thr Gly Arg Ala Lys Pro
1 5 10
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 47
Gly Lys Ser Arg Thr Arg Arg Ala Arg Pro
1 5 10
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 48
Gly Ser Lys Arg Thr Arg Lys Ala Arg Pro
1 5 10
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 49
Gly Lys Thr Arg Ser Lys Arg Ala Lys Pro
1 5 10
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 50
Gly Ser Lys Ala Arg Pro Lys Lys Thr Lys
1 5 10
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 51
ggctctactg ctaaacctgc ccgttccccc 30
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 52
ggcacttctg ctggccctcg tccctccaaa 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 53
ggcactcgtg ctaaacctgc cccctctaag 30
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 54
ggccgttctg ctactcgcaa agccggccct 30
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 55
ggcactcgtg ctcgccctaa accctctaag 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 56
ggcaaatcta agactggccg tgctaaacct 30
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 57
ggcaaatctc gtactcgccg agctcggcct 30
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 58
ggctctaaac gtactcgcaa ggctcgacct 30
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 59
ggcaaaactc gttctaagcg cgctaaacct 30
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 60
ggctctaaag ctcgtcctaa gaaaactaag 30
<210> 61
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 61
Gly Ser Lys Ala Lys Pro Ser Lys Thr Lys Gly Thr Arg Ala Arg Pro
1 5 10 15
Lys Pro Ser Lys
20
<210> 62
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 62
Gly Ser Lys Ala Lys Pro Ser Lys Thr Lys Gly Thr Arg Ala Lys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ser Lys
20
<210> 63
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 63
Gly Ser Thr Ala Lys Pro Ala Arg Ser Pro Gly Ala Thr Ser Thr Ala
1 5 10 15
Gly Ala Arg Pro
20
<210> 64
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 64
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Lys Gly Pro Lys Thr Lys Gly
1 5 10 15
Ser Pro Lys Thr Gly Thr Lys Ala Lys Pro Lys Ser Lys Lys
20 25 30
<210> 65
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 65
Gly Ser Lys Ala Lys Pro Ser Lys Thr Lys Gly Pro Lys Ala Lys Thr
1 5 10 15
Gly Pro Lys Ser Gly Thr Arg Ala Ser Pro Arg Ser Arg Arg
20 25 30
<210> 66
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 66
Gly Arg Ser Arg Arg Pro Ala Arg Thr Arg Gly Thr Arg Ala Arg Pro
1 5 10 15
Lys Pro Ser Lys Gly Ser Lys Arg Thr Arg Lys Ala Arg Pro
20 25 30
<210> 67
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 67
Gly Pro Lys Ala Ser Thr Gly Ser Pro Lys Gly Thr Arg Ala Gly Pro
1 5 10 15
Arg Thr Ser Arg Gly Thr Ser Ala Gly Pro Arg Pro Ser Lys Gly Ser
20 25 30
Lys Arg Thr Arg Lys Ala Arg Pro
35 40
<210> 68
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 68
Gly Thr Lys Ala Lys Pro Lys Lys Ser Lys Gly Ser Lys Ala Lys Pro
1 5 10 15
Lys Thr Pro Lys Gly Thr Arg Ala Gly Pro Arg Thr Ser Arg Gly Thr
20 25 30
Arg Ala Arg Pro Lys Pro Ser Lys
35 40
<210> 69
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 69
Gly Pro Lys Ala Lys Thr Gly Pro Lys Ser Gly Ala Ser Arg Thr Arg
1 5 10 15
Thr Ala Arg Pro Gly Arg Thr Arg Arg Pro Ala Arg Ser Arg Gly Ser
20 25 30
Lys Ala Arg Pro Lys Lys Thr Lys
35 40
<210> 70
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 70
Gly Pro Ala Ser Thr Ser Gly Pro Lys Ser Gly Pro Lys Thr Lys Gly
1 5 10 15
Ser Pro Lys Thr Gly Ser Lys Ala Lys Pro Lys Thr Pro Lys Gly Thr
20 25 30
Lys Ala Lys Pro Lys Lys Ser Lys Gly Thr Arg Ala Gly Pro Arg Thr
35 40 45
Ser Arg
50
<210> 71
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 71
Gly Pro Lys Ala Ser Thr Gly Ser Pro Lys Gly Ser Pro Ala Lys Pro
1 5 10 15
Thr Ala Thr Lys Gly Thr Ser Arg Ser Ala Arg Ala Gly Pro Gly Ser
20 25 30
Thr Ala Lys Pro Ala Arg Ser Pro Gly Ser Arg Ala Thr Ser Gly Ala
35 40 45
Thr Ser
50
<210> 72
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 72
Gly Ser Lys Ala Lys Pro Ser Lys Thr Lys Gly Thr Lys Ala Lys Pro
1 5 10 15
Lys Ser Lys Lys Gly Arg Thr Arg Arg Pro Ala Arg Ser Arg Gly Arg
20 25 30
Ser Arg Arg Pro Ala Arg Thr Arg Gly Ser Lys Arg Thr Arg Lys Ala
35 40 45
Arg Pro
50
<210> 73
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 73
Gly Arg Thr Arg Ser Gly Arg Ala Arg Pro Gly Arg Thr Arg Ser Gly
1 5 10 15
Arg Ala Arg Pro Gly Pro Lys Thr Lys Gly Ser Pro Lys Thr Gly Thr
20 25 30
Ser Arg Ser Ala Arg Ala Gly Pro Gly Thr Arg Ala Lys Pro Ala Pro
35 40 45
Ser Lys Gly Thr Arg Ala Lys Pro Ala Pro Ser Lys
50 55 60
<210> 74
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 74
Gly Pro Lys Thr Lys Gly Ser Pro Lys Thr Gly Pro Lys Ala Lys Thr
1 5 10 15
Gly Pro Lys Ser Gly Pro Lys Ala Lys Thr Gly Pro Lys Ser Gly Pro
20 25 30
Lys Ala Lys Thr Gly Pro Lys Ser Gly Ser Thr Ala Arg Pro Arg Thr
35 40 45
Ser Gly Gly Ala Ser Arg Thr Arg Thr Ala Arg Pro
50 55 60
<210> 75
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 75
Gly Thr Lys Ala Lys Pro Lys Lys Ser Lys Gly Thr Lys Ala Lys Pro
1 5 10 15
Lys Ser Lys Lys Gly Lys Thr Arg Ser Lys Arg Ala Lys Pro Gly Lys
20 25 30
Thr Arg Ser Lys Arg Ala Lys Pro Gly Ser Lys Arg Thr Arg Lys Ala
35 40 45
Arg Pro Gly Arg Ser Arg Arg Pro Ala Arg Thr Arg
50 55 60
<210> 76
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 76
Gly Pro Ala Ser Thr Ser Gly Pro Lys Ser Gly Ser Pro Ala Gly Ser
1 5 10 15
Pro Thr Ser Lys Gly Pro Lys Thr Lys Gly Ser Pro Lys Thr Gly Pro
20 25 30
Lys Thr Lys Gly Ser Pro Lys Thr Gly Ser Thr Ala Arg Pro Arg Thr
35 40 45
Ser Gly Gly Arg Thr Arg Ser Gly Arg Ala Arg Pro Gly Ala Thr Ser
50 55 60
Thr Ala Gly Ala Arg Pro
65 70
<210> 77
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 77
Gly Ser Thr Ala Lys Pro Ala Arg Ser Pro Gly Thr Ser Ala Gly Pro
1 5 10 15
Arg Pro Ser Lys Gly Thr Arg Ala Lys Pro Ala Pro Ser Lys Gly Thr
20 25 30
Arg Ala Lys Pro Ala Pro Ser Lys Gly Arg Ser Arg Arg Pro Ala Arg
35 40 45
Thr Arg Gly Arg Thr Arg Ser Gly Arg Ala Arg Pro Gly Arg Thr Arg
50 55 60
Ser Gly Arg Ala Arg Pro
65 70
<210> 78
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 78
Gly Pro Lys Ala Lys Thr Gly Pro Lys Ser Gly Ser Lys Ala Lys Pro
1 5 10 15
Lys Thr Pro Lys Gly Ala Ser Arg Thr Arg Thr Ala Arg Pro Gly Lys
20 25 30
Ser Lys Thr Gly Arg Ala Lys Pro Gly Lys Thr Arg Ser Lys Arg Ala
35 40 45
Lys Pro Gly Lys Thr Arg Ser Lys Arg Ala Lys Pro Gly Thr Arg Ala
50 55 60
Ser Pro Arg Ser Arg Arg
65 70
<210> 79
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 79
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Lys Gly Pro Ala Ser Thr Ser
1 5 10 15
Gly Pro Lys Ser Gly Pro Ala Ser Thr Ser Gly Pro Lys Ser Gly Ser
20 25 30
Thr Ala Arg Pro Arg Thr Ser Gly Gly Ala Ser Arg Thr Arg Thr Ala
35 40 45
Arg Pro Gly Lys Ser Lys Thr Gly Arg Ala Lys Pro Gly Lys Ser Arg
50 55 60
Thr Arg Arg Ala Arg Pro Gly Thr Arg Ala Gly Pro Arg Thr Ser Arg
65 70 75 80
<210> 80
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 80
Gly Thr Lys Ala Lys Pro Lys Lys Ser Lys Gly Thr Lys Ala Lys Pro
1 5 10 15
Lys Lys Ser Lys Gly Pro Lys Thr Lys Gly Ser Pro Lys Thr Gly Pro
20 25 30
Lys Ala Lys Thr Gly Pro Lys Ser Gly Thr Arg Ala Lys Pro Ala Pro
35 40 45
Ser Lys Gly Thr Ser Ala Gly Pro Arg Pro Ser Lys Gly Ser Lys Arg
50 55 60
Thr Arg Lys Ala Arg Pro Gly Lys Thr Arg Ser Lys Arg Ala Lys Pro
65 70 75 80
<210> 81
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 81
Gly Thr Lys Ala Lys Pro Lys Lys Ser Lys Gly Thr Lys Ala Lys Pro
1 5 10 15
Lys Ser Lys Lys Gly Thr Arg Ala Gly Pro Arg Thr Ser Arg Gly Thr
20 25 30
Arg Ala Ser Pro Arg Ser Arg Arg Gly Thr Lys Ala Lys Pro Lys Ser
35 40 45
Lys Lys Gly Lys Ser Lys Thr Gly Arg Ala Lys Pro Gly Thr Arg Ala
50 55 60
Arg Pro Lys Pro Ser Lys Gly Thr Arg Ala Arg Pro Lys Pro Ser Lys
65 70 75 80
<210> 82
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 82
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Lys Gly Pro Ala Ser Thr Ser
1 5 10 15
Gly Pro Lys Ser Gly Ser Lys Ala Lys Pro Ser Lys Thr Lys Gly Pro
20 25 30
Ala Ser Thr Ser Gly Pro Lys Ser Gly Thr Arg Ala Lys Pro Ala Pro
35 40 45
Ser Lys Gly Ser Lys Ala Lys Pro Ser Lys Thr Lys Gly Ala Thr Ser
50 55 60
Thr Ala Gly Ala Arg Pro Gly Arg Thr Arg Ser Gly Arg Ala Arg Pro
65 70 75 80
Gly Lys Ser Lys Thr Gly Arg Ala Lys Pro
85 90
<210> 83
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 83
Gly Lys Ser Arg Thr Arg Arg Ala Arg Pro Gly Lys Ser Lys Thr Gly
1 5 10 15
Arg Ala Lys Pro Gly Pro Lys Ala Lys Thr Gly Pro Lys Ser Gly Pro
20 25 30
Lys Ala Lys Thr Gly Pro Lys Ser Gly Ser Lys Ala Lys Pro Ser Lys
35 40 45
Thr Lys Gly Pro Lys Ala Ser Thr Gly Ser Pro Lys Gly Ser Arg Ala
50 55 60
Thr Ser Gly Ala Thr Ser Gly Thr Arg Ala Ser Pro Arg Ser Arg Arg
65 70 75 80
Gly Pro Lys Ala Lys Thr Gly Pro Lys Ser
85 90
<210> 84
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 84
Gly Thr Arg Ala Arg Pro Lys Pro Ser Lys Gly Lys Ser Lys Thr Gly
1 5 10 15
Arg Ala Lys Pro Gly Lys Thr Arg Ser Lys Arg Ala Lys Pro Gly Ala
20 25 30
Thr Ser Thr Ala Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Arg Thr Arg Thr Ala
35 40 45
Arg Pro Gly Lys Ser Lys Thr Gly Arg Ala Lys Pro Gly Thr Lys Ala
50 55 60
Lys Pro Lys Ser Lys Lys Gly Ser Lys Ala Lys Pro Lys Thr Pro Lys
65 70 75 80
Gly Lys Thr Arg Ser Lys Arg Ala Lys Pro
85 90

Claims (7)

1.一种超正电荷聚多肽，其特征在于，超正电荷聚多肽包括20至90个氨基酸残基，其中所述的超正电荷聚多肽为：
（1）由甘氨酸G、丙氨酸A、丝氨酸S、苏氨酸T、脯氨酸P及赖氨酸K和/或精氨酸R共6-7种类型的氨基酸组成；
（2）氨基酸G、A、S、T、P、K和R的总和占总氨基酸序列的95％以上；
（3）任意一种氨基酸占所述超正电荷聚多肽序列的不超过50％；
（4）所述超正电荷聚多肽序列是可重复的；
（5）甲硫氨酸M在超正电荷聚多肽的总氨基酸序列中最多含有1个。
2.根据权利要求1所述的超正电荷聚多肽，其特征在于：
（1）所述超正电荷聚多肽序列由短肽基序构成，其中每个短肽基序具有10个氨基酸残基；
（2）短肽基序由G、A、S、T、P 5种氨基酸及K和/或R共计6-7种类型的氨基酸组成，且除K和R以外，其余任何一种氨基酸残基都不会在短肽基序中连续出现。
3. 根据权利要求1-2所述的超正电荷聚多肽，其特征是，所述超正电荷聚多肽的序列包括SEQ ID No.1至SEQ ID No.84所示序列。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种超正电荷聚多肽在制备作为胞内递送蛋白质或多肽的载体中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于通过与权利要求1-3任意一项所述的超正电荷聚多肽与活性蛋白或多肽形成融合蛋白实现。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述活性蛋白质或多肽为具有药物活性的、具有标记作用或具有靶向作用的蛋白质或多肽。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的活性蛋白或多肽为：荧光蛋白、酶类、毒性蛋白、抗体、细胞因子、重组激素/蛋白类、转录因子、蛋白质疫苗、多肽疫苗或毒性多肽。
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陈荣等: "的聚多肽融合技术研究进展", 《中国药科大学学报》, vol. 47, no. 6, pages 1 - 2 *

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CN114395016A (zh) * 2022-01-19 2022-04-26 中国石油大学(华东) 一种作为蛋白质和/或核酸胞内递送载体的多肽及应用
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