CN114395016A - 一种作为蛋白质和/或核酸胞内递送载体的多肽及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种作为蛋白质和/或核酸胞内递送载体的多肽及应用，属于生物分子胞内递送载体技术领域。本发明作为蛋白质和/或核酸胞内递送载体的多肽的序列为：Nap‑Phe‑Phe‑Gly‑Pro‑Leu‑Gly‑Leu‑Ala‑Gly‑Cys‑Arg‑Arg‑Arg‑Cys‑Arg‑Arg‑Arg‑Cys‑Arg‑Arg‑Arg‑Cys‑NH2，本发明的多肽具有良好的生物相容性，不仅能够有效的促进细胞对生物分子的摄取，更重要的是，其通过非共价相互作用与生物分子结合，对生物分子起到一定的保护作用，使递送后的生物分子仍维持其生物学活性。
Description
技术领域
本发明属于生物分子胞内递送载体技术领域，具体涉及一种作为蛋白质和/或核酸胞内递送载体的多肽及应用。
背景技术
蛋白质作为一种构成细胞的重要成分，是生命活动的主要承担者。它参与几乎所有的生命过程并发挥着重要的作用，例如人体内的物质运输、催化、信号转导、免疫防御等。很多疾病的发生与相关蛋白质的功能障碍有关，例如第一例商用重组药物蛋白质-人胰岛素，是治疗糖尿病的有效手段；以及近年来新兴的免疫治疗方法，主要使用的也是单克隆抗体类的药物，因此使得蛋白质成为十分有潜力的候选药物。目前市场上的蛋白类药物主要为单抗类药物，且基本都是针对细胞外靶点开发的。由于这类药物研发难度大，周期长，且作用靶点有限制，在治疗过程中容易产生获得性耐药，因此难以满足临床治疗的需求。
与单抗类药物不同，基于胞内靶点的治疗性蛋白药物(如细胞色素C，saporin等)往往具有生物活性强、毒副作用低等优点。但由于蛋白质属于亲水性的生物大分子，分子量较大、表面电荷较少，且细胞膜具有选择透过性的特点，使得这类功能蛋白自身难以穿透生理屏障、结构不稳定，且在生理条件下易被降解等，难以充分发挥疗效，无法满足应用要求。因此开发安全、高效的蛋白质胞内递送策略对于蛋白质治疗十分关键。
近年来，大量的研究都致力于探究蛋白质胞内递送策略，开发出一系列新型载体用于蛋白质的递送。目前用于蛋白质胞内递送的方法主要分为三种类型：传统的物理方法(电穿孔、微流控)、基于蛋白质进行修饰的方法以及新型纳米载体(无机纳米颗粒、聚合物载体、细胞穿透肽)。其中，相比于其他递送方法，基于细胞穿透肽作为蛋白质递送载体的方法，具有机理明确、生物相容性好、操作简便、成本低等优势，避免了对蛋白质进行额外修饰等复杂的步骤，在蛋白质胞内递送中具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胞内生物分子递送载体以及使用该载体进行胞内生物分子递送的方法，方法简单，条件温和，制备的多肽/生物分子复合物稳定性好，且具有良好的生物相容性。该胞内递送载体不仅能够有效的促进细胞对生物分子的摄取，更重要的是，其通过非共价相互作用与生物分子结合，对生物分子起到一定的保护作用，使递送后的生物分子仍维持其生物学活性。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种作为蛋白质和/或核酸胞内递送载体的多肽(简称(CR3)3C)，具有如下序列：
Nap-Phe-Phe-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly-Cys-Arg-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg-Cys-NH2，具体结构如下：
其中，Nap为1-萘乙酸，Phe为苯丙氨酸，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Leu为亮氨酸，Ala为丙氨酸，Cys为半胱氨酸，Arg为精氨酸，分子质量为2863.46g/mol。
上述作为蛋白质和/或核酸胞内递送载体的多肽在蛋白质和/或核酸胞内递送中的应用，其中，所述的蛋白质可以为在等电点条件下pH小于7的蛋白质，例如BSA、β-Gal、绿色荧光蛋白(GFP)，所述的核酸分子可以是质粒，例如增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)。
一种蛋白质胞内递送的方法，将蛋白质与上述的胞内递送载体混合，制备成胞内递送载体与蛋白质的复合物，然后将该复合物与待转运细胞共培养，其中，所述胞内递送载体与蛋白质的复合物是由以下方法制备而成：
按照5:1-90:1的摩尔比，向胞内递送载体的多肽溶液中加入蛋白质溶液，室温孵育后，即得。
在一个具体的实施例中，所述胞内递送载体的多肽与蛋白质的摩尔比≤30:1时，对待转运细胞的毒性较小，因而，进一步优选胞内递送载体的多肽与蛋白质的摩尔比为5:1-30:1。
一种基因转染的方法，将核酸分子与上述的胞内递送载体混合，制备成胞内递送载体与核酸的复合物，然后将该复合物与待转运细胞共培养，其中，所述胞内递送载体与核酸的复合物是由以下方法制备而成：
按照10:1-50:1的电荷比，向胞内递送载体的多肽溶液中加入核酸分子溶液，室温孵育后，即得。
上述作为蛋白质和/或核酸胞内递送载体的多肽在制备蛋白质胞内递送试剂或基因转染试剂中的应用。
上述蛋白质和/或核酸胞内递送的方法对递送的目标细胞类型无特殊要求，对递送细胞具有通用性。不仅能够用于HepG2细胞、人胚肾细胞293E的胞内递送，还适用于其它类型的细胞，包括正常细胞L929(小鼠皮下结缔组织和脂肪成纤维细胞)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、癌细胞Hela(人宫颈癌细胞)等。
本发明技术方案的优点：
现有技术中进行胞内蛋白质递送前需要配制新鲜的多肽/生物分子复合物；而且根据生物分子种类、性质的不同，需要对具体的实验条件进行优化。本发明通过合理的分子设计，制备了一种两亲性阳离子多肽。以该多肽分子作为生物大分子胞内运输的载体，所形成的多肽-生物分子复合物尺寸合适，粒径均一；其水溶液具有良好的单分散性及稳定性，在生理条件下也能保持良好的稳定性；而且该材料具有良好的生物相容性。
以本发明设计的多肽分子作为载体进行生物大分子的胞内递送的方法简单、温和，无需进行复杂的修饰；一方面，利用其序列中氨基酸残基与蛋白质表面基团间的非共价相互作用形成稳定的复合物；另一方面，利用该多肽分子中的穿透肽序列促进细胞对多肽/生物分子复合物的摄取，从而进一步实现有效的生物分子的胞内递送，具有成本低、递送效率高的优点。
附图说明
图1(CR3)3C多肽与BSA-FITC的摩尔配比对胞内递送量的影响；
图2HepG2细胞内(CR3)3C多肽递送的BSA-FITC结果图；
图3游离的BSA和(CR3)3C/BSA复合物的TEM图像；
图4BSA与(CR3)3C复合前后的圆二色光谱；
图5不同摩尔比条件下制备的(CR3)3C/BSA-FITC复合物的细胞毒性；
图6(CR3)3C多肽对β-Gal的胞内递送的原位染色后的倒置荧光显微镜图像；
图7不同电荷比的(CR3)3C/pEGFP复合物的Zeta电势(ζ)测量；
图8(CR3)3C多肽介导的pEGFP基因转染的倒置荧光显微镜图像。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
以下实施例中所采用的试剂的配制方法如下：
1、磷酸盐缓冲液(1×PBS)配制：用电子天平分别称取8g氯化钠(NaCl),0.2g氯化钾(KCl)，2.9g十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)，置于1L烧杯中，加入800mL去离子水，充分搅拌溶解，加入适量浓盐酸将pH值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1L，备用。
2、Tris-HCl缓冲液(50mM,pH＝7.3，10mM氯化镁)配制：用电子天平称取0.095g氯化镁(MgCl2)，溶于50mL三羟甲基氨基甲烷(Tris，100mM)溶液中，随后向其中加入43.4mL盐酸(100mM)，混匀，并稀释至100mL，备用。
3、异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白溶液(BSA-FITC)配制：以一定量的磷酸盐缓冲液(1×PBS)将BSA-FITC原溶液(5mg/mL)进行稀释，得到相应溶度的蛋白质溶液，避光保存备用。
4、β-Galactosidase(β-Gal)溶液配制：用电子天平称取适量的β-Gal粉末于离心管中，加入一定量的Tris-HCl缓冲液(50mM,pH＝7.3，10mM氯化镁)，充分搅拌至完全溶解，现配现用，备用。
实施例1
一种作为蛋白质胞内递送载体的多肽分子(简称(CR3)3C)，具有如下序列：
Nap-Phe-Phe-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly-Cys-Arg-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg-Cys-NH2，
具体结构如下：
其中，Nap为1-萘乙酸，Phe为苯丙氨酸，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Leu为亮氨酸，Ala为丙氨酸，Cys为半胱氨酸，Arg为精氨酸，分子质量为2863.46g/mol。
上述的多肽序列可作为新型的蛋白质胞内递送载体。首先，多肽分子中含有苯环、巯基、氨基、胍等基团，与蛋白质表面通常带有的羧酸、胺、咪唑等基团，通过静电相互作用、疏水相互作用以及苯环与胍基间的阳离子-π相互作用等非共价相互作用，络合形成稳定的复合物；其次，多肽分子中具有细胞膜穿透作用的聚精氨酸片段，能够穿透细胞膜屏障。因此，该多肽分子能够对蛋白质进行络合，进而与细胞膜发生相互作用，实现生物大分子的胞内递送，此外，该材料具有良好的生物相容性，因此可以用作蛋白质胞内运输载体。
上述多肽分子序列为自主设计，由上海淘普生物科技有限公司合成，纯度>96％。
实施例2(CR3)3C胞内递送BSA-FITC的应用
(1)(CR3)3C/BSA-FITC复合物，由以下方法制备而成：
①.将1.15mg(CR3)3C的多肽粉末溶于4mL磷酸盐缓冲液(1×PBS)中，得到浓度为100μM的(CR3)3C多肽溶液，根据实验需要将多肽稀释至相应的浓度；
②.利用磷酸盐缓冲液(1×PBS)将BSA-FITC原溶液(5mg/mL)稀释至浓度为3μM；
③.按照相应的摩尔比，将等体积的BSA-FITC溶液(3μM)缓慢加入到(CR3)3C溶液中，室温孵育30min，即得(CR3)3C/BSA-FITC复合物。
(2)(CR3)3C多肽对模型蛋白BSA-FITC的胞内递送
①.递送蛋白质所使用的细胞为人肝癌细胞HepG2；
②.在蛋白递送实验前，首先将HepG2细胞以1×105个/mL的密度，培养在24孔板中,过夜培养使细胞贴壁。之后将细胞培养板中的培养基吸出，利用1×PBS清洗三次，随后每孔加入400μL无血清培养基。接着将上述方法制备的(CR3)3C/BSA-FITC复合物溶液加入细胞培养板中，每孔中复合物用量为50μL。37℃培养箱孵育4小时。
③.之后将培养基吸出，利用1×PBS清洗三次，每孔加入400μL 4％多聚甲醛溶液对细胞进行固定，于37℃培养箱固定15min。
④.随后移去固定液，利用1×PBS清洗三次，加入400μL 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI，10μg/mL)荧光染料溶液，对细胞核进行染色，于37℃培养箱染色15min。
⑤.吸除DAPI染色液，利用1×PBS清洗三次。
⑥.利用激光共聚焦显微镜观察细胞摄取效果(DAPI、FITC激发波长：405、488nm)，或者收集细胞，利用流式细胞仪检测表达FITC荧光信号的细胞的百分比，评价蛋白质递送效率。在利用流式细胞仪检测前，细胞悬液与0.4％台盼蓝(Trypan Blue)溶液以9:1比例混匀(终浓度0.04％)，用以物理熄灭可能吸附在细胞表面的FITC荧光信号。
(3)(CR3)3C多肽与BSA-FITC的摩尔配比对胞内递送量的影响
分别制备不同摩尔配比的(CR3)3C/BSA-FITC复合物，采用上述(2)中的方法转染HepG2细胞，然后采用流式细胞仪检测不同摩尔配比下的(CR3)3C/BSA-FITC复合物对HepG2细胞的胞内递送量。
其中，不同摩尔配比的(CR3)3C/BSA-FITC复合物由以下方法制备而成：
(CR3)3C多肽与BSA-FITC的摩尔配比5:1：将等体积的BSA-FITC溶液(3μM)缓慢加入到(CR3)3C溶液(15μM)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与BSA-FITC的摩尔配比15:1：将等体积的BSA-FITC溶液(3μM)缓慢加入到(CR3)3C溶液(45μM)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与BSA-FITC的摩尔配比30:1：将等体积的BSA-FITC溶液(3μM)缓慢加入到(CR3)3C溶液(90μM)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与BSA-FITC的摩尔配比50:1：将等体积的BSA-FITC溶液(3μM)缓慢加入到(CR3)3C溶液(150μM)中，室温孵育30min，即得。
以未与(CR3)3C多肽结合的BSA-FITC溶液(3μM)单独处理细胞，作为阴性对照组，为保证实验的准确性，对照组与实验组中均加入等量的蛋白质，每孔(24孔板)蛋白质用量为5.1μg。
结果如图1所示，与单独BSA-FITC处理的阴性对照组相比，四种比例下制备的(CR3)3C/BSA-FITC处理的实验组检测出的带有FITC荧光信号的细胞数均高于阴性对照组，证明多肽(CR3)3C能够有效的将蛋白质BSA-FITC递送到细胞内。其中，在(CR3)3C与BSA-FITC摩尔比例为15:1条件下处理的细胞，其被检测出最显著的荧光信号，因此，在该摩尔配比下，能够实现最佳的递送效果。
利用激光共聚焦显微镜观察在HepG2细胞内(CR3)3C多肽递送的BSA-FITC结果如图2所示，其中，图2中的a为HepG2细胞对单独BSA-FITC的摄取效果，图2中的b为HepG2细胞对在摩尔比30:1的条件下制备的(CR3)3C/BSA-FITC摄取4小时后的激光扫描共聚焦显微镜图片。由图2可知，与仅采用BSA-FITC处理细胞的对照组相比，在摩尔比30:1的条件下制备的(CR3)3C/BSA-FITC复合物在与细胞共孵育4小时后，细胞内可以明显观察到FITC的绿色荧光，且借助细胞核的定位作用，可以确定绿色荧光是位于细胞内而非附着于表面。因此可以证实多肽(CR3)3C实现了蛋白质BSA-FITC的胞内递送。
实施例3(CR3)3C/BSA复合物的理化性质的表征
按照15:1的摩尔比，将等体积的BSA溶液(3μM)缓慢加入到(CR3)3C溶液(45μM)中，室温孵育30min，即得(CR3)3C/BSA复合物溶液。向单纯的BSA溶液(3μM)中加入等体积的1×PBS，使其终浓度与实验组保持一致，均为1.5μM，作为对照，采用如下方法进行理化性质表征。
①.游离的BSA和(CR3)3C/BSA复合物的TEM图像
在干净的封口膜上沉积10μL上述方法制备的(CR3)3C/BSA复合物溶液，将碳支持膜置于其上吸附6min，然后用滤纸仔细地擦去膜上多余的液体，随后滴加10μL乙酸双氧铀溶液(2％)进行负染，5分钟后吸干负染液。利用透射电子显微镜(TEM)对制备的样品进行成像。通过ImageJ软件对TEM图像中纳米粒子的粒径进行统计(至少测量100个)；结果如图3所示：其中，图3中a为单纯的BSA溶液，b为(CR3)3C/BSA复合物溶液，两种溶液中的BSA含量相同，终浓度均为1.5μM。b为(CR3)3C/BSA复合物溶液；通过a与b对比可以看出，(CR3)3C/BSA复合物与BSA相比，其尺寸略有增加，一定程度上证明了(CR3)3C多肽与BSA的有效结合。
②.BSA与(CR3)3C复合前后的圆二色光谱
在25℃下，用去离子水将制备的(CR3)3C/BSA复合物稀释至合适浓度，测定其在190-260nm的圆二色光谱，并以单纯的BSA溶液作为对照，对照组与试验组的蛋白质浓度相同，终浓度为0.8μM。选用的石英杯光径为0.2cm，带宽1.0nm，扫描速率100nm/min，响应时间0.1s，分辨率0.1nm，每个样品扫描3次，测试时对光源系统通氮气。通过圆二色光谱分析BSA与(CR3)3C多肽复合前后，二级结构的变化。
结果如图4所示：单独的BSA的圆二色光谱在211nm和224nm处存在两个负峰，为典型的蛋白质α螺旋结构。(CR3)3C/BSA复合物的圆二色光谱几乎与BSA相同，说明在该条件下，(CR3)3C多肽的加入未改变BSA的二级结构。因此，在实验条件下，(CR3)3C多肽未对蛋白质结构造成破坏，对于(CR3)3C多肽在作为蛋白质胞内递送载体的同时能够保持蛋白质生物活性，使其在胞内仍能发挥生物学功能十分关键。
实施例4(CR3)3C/BSA-FITC复合物的细胞毒性实验
①.递送蛋白质所使用的细胞为人肝癌细胞HepG2；
②.预先在96孔板中接种100μL人肝癌细胞HepG2悬液(密度为1×105个/mL),于恒温培养箱中(37℃，5％CO2)培养12小时,待细胞贴壁后。移去孔板中的培养基，利用1×PBS清洗三次，随后每孔中加入100μL新鲜的培养基(无血清、无双抗)和50μL不同摩尔比条件下制备的(CR3)3C/BSA-FITC复合物溶液，置于培养箱中继续培养4小时。与细胞共孵育结束后，移去每孔原有的培养基，每孔加入100μL PBS冲洗细胞三次，并每孔加入100μL新鲜培养基。
③.随后每孔加入20μL噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/mL)，避光培养4小时，吸出溶液，每孔加入150μL二甲亚砜(DMSO)，至于摇床上混匀，10分钟后用酶标仪检测样品在570nm处的OD值。
其中，上述不同摩尔配比的(CR3)3C/BSA-FITC复合物由以下方法制备而成：
(CR3)3C多肽与BSA-FITC的摩尔配比6:1：将等体积的BSA-FITC溶液(1μM)缓慢加入到(CR3)3C溶液(6μM)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与BSA-FITC的摩尔配比18:1：将等体积的BSA-FITC溶液(1μM)缓慢加入到(CR3)3C溶液(18μM)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与BSA-FITC的摩尔配比30:1：将等体积的BSA-FITC溶液(1μM)缓慢加入到(CR3)3C溶液(30μM)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与BSA-FITC的摩尔配比42:1：将等体积的BSA-FITC溶液(1μM)缓慢加入到(CR3)3C溶液(42μM)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与BSA-FITC的摩尔配比48:1：将等体积的BSA-FITC溶液(1μM)缓慢加入到(CR3)3C溶液(48μM)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与BSA-FITC的摩尔配比54:1：将等体积的BSA-FITC溶液(1μM)缓慢加入到(CR3)3C溶液(54μM)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与BSA-FITC的摩尔配比60:1：将等体积的BSA-FITC溶液(1μM)缓慢加入到(CR3)3C溶液(60μM)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与BSA-FITC的摩尔配比90:1：将等体积的BSA-FITC溶液(1μM)缓慢加入到(CR3)3C溶液(90μM)中，室温孵育30min，即得。
结果如图5所示，其中图5中的BSA指的是采用未与(CR3)3C多肽复合的BSA-FITC溶液作为对照组。为保证实验的准确性，对照组与实验组中均加入等量的蛋白质，最终浓度为0.17μM。
由图5可知，(CR3)3C多肽与蛋白质摩尔比为6:1、18:1、30:1的条件下制备的复合物，在与细胞共孵育后，细胞的存活率均在80％以上，说明该条件下制备的复合物生物相容性较好。随着二者摩尔比的增加，在较高的摩尔比42:1、48:1、54:1、60:1、90:1条件下制备的复合物，逐渐表现出增强的细胞毒性。因此，在合适的摩尔比(6:1-30:1)条件下，该复合物具有较好的生物相容性，对细胞无不良影响。
实施例5(CR3)3C胞内递送β-Gal的应用
(1)(CR3)3C/β-Gal复合物，由以下方法制备而成：
①.将1.15mg(CR3)3C多肽粉末溶于4mL磷酸盐缓冲液(1×PBS)中，100μM的(CR3)3C多肽溶液，根据实验需要将多肽稀释至相应的浓度；
②.用电子天平称取适量β-Gal(源于大肠杆菌，≥500units/mg)于离心管中；
③.向装有β-Gal粉末的离心管中加入适量的Tris-HCl缓冲液(50mM,pH＝7.3，10mM氯化镁)，使之充分溶解，得到浓度为0.88μM的β-Gal溶液；
④.按照15:1的摩尔比，将等体积的β-Gal溶液(0.88μM)缓慢加入到(CR3)3C溶液(13.2μM)中，室温孵育30min，即得(CR3)3C/β-Gal复合物溶液。
(2)(CR3)3C多肽对β-Gal的胞内递送
①.递送蛋白质所使用的细胞为人肝癌细胞HepG2；
②.在蛋白递送实验前，首先将HepG2细胞以1×105个/mL的密度，培养在24孔板中,过夜，使细胞贴壁。之后将细胞培养板中的培养基吸出，利用1×PBS清洗三次，随后每孔加入400μL无血清培养基。接着将上述方法制备的(CR3)3C/β-Gal复合物溶液加入细胞培养板中，每孔中复合物用量为50μL。37℃培养箱孵育4小时。
③.之后吸除细胞培养液，利用1×PBS清洗三次，根据β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒的说明书进行操作。每孔加入400μLβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定10分钟。然后吸除细胞固定液，用1×PBS洗涤细胞3次。之后吸除PBS，每孔加入400μL染色工作液(按照说明说配制)。于37℃，无CO2的条件下，孵育2小时，可以用保鲜膜封住细胞培养板，防止蒸发。
④.染色结束后，移除染色工作液，利用1×PBS清洗三次，最后每孔加入400μL 1×PBS，利用倒置荧光显微镜观察并拍摄照片。
结果如图6所示，其中，图6中的a指的是采用未与(CR3)3C多肽复合的β-Gal溶液处理细胞作为对照组，图6中b指的是采用的(CR3)3C/β-Gal复合物处理细胞的试验组；为保证实验的准确性，对照组与试验组中均加入等量的蛋白质，每孔(24孔板)蛋白质用量为10μg。
由图6中a与b对比可知，单独β-gal与细胞共孵育后未观察到蓝色产物，说明β-gal自身不能进入细胞。(CR3)3C/β-gal复合物与细胞共孵育后可以观察到细胞被染成蓝色，说明功能蛋白β-gal被递送到细胞内部，并在细胞内仍保持其生物活性。
实施例6(CR3)3C在基因转染中的应用
(1)(CR3)3C/pEGFP(增强型绿色荧光蛋白质粒)复合物，由以下方法制备而成：
①.将1mg(CR3)3C多肽粉末溶于1mL磷酸盐缓冲液(1×PBS)中，1mg/mL的(CR3)3C多肽溶液，根据实验需要将多肽稀释至相应的浓度；
②.采用去离子水将pEGFP质粒DNA溶液稀释至20μg/mL；
③.按照(CR3)3C多肽与pEGFP质粒DNA的电荷比(N/P)，将相应浓度的多肽溶液与质粒溶液等体积混合；获得(CR3)3C/pEGFP复合物。
(2)不同电荷比的(CR3)3C/pEGFP复合物的Zeta电势(ζ)测量
采用上述(1)中的方法制备不同电荷比的(CR3)3C/pEGFP复合物，具体如下：
(CR3)3C多肽与pEGFP的电荷比0：将等体积的pEGFP溶液(20μg/mL)缓慢加入到去离子水中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与pEGFP的电荷比10:1：将等体积的pEGFP溶液(20μg/mL)缓慢加入到(CR3)3C溶液(195.8μg/mL)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与pEGFP的电荷比20:1：将等体积的pEGFP溶液(20μg/mL)缓慢加入到(CR3)3C溶液(391.6μg/mL)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与pEGFP的电荷比30:1：将等体积的pEGFP溶液(20μg/mL)缓慢加入到(CR3)3C溶液(587.4μg/mL)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与pEGFP的电荷比40:1：将等体积的pEGFP溶液(20μg/mL)缓慢加入到(CR3)3C溶液(783.2μg/mL)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与pEGFP的电荷比50:1：将等体积的pEGFP溶液(20μg/mL)缓慢加入到(CR3)3C溶液(979.0μg/mL)中，室温孵育30min，即得。
不同电荷比的(CR3)3C/pEGFP复合物的电势测量：室温条件下，在MalvernZetasizer Nano-ZS仪器上测量DNA以及(CR3)3C/pEGFP复合物的ζ电位，所有实验均使用型号为DTS1060C的样品池。为确保数据的准确性，需对其进行多次重复测量。
结果如图7所示，其中，采用未与(CR3)3C多肽复合的pEGFP溶液作为对照组，在五种电荷比条件下制备了(CR3)3C/pEGFP复合物作为试验组；为保证实验的准确性，对照组与试验组中均加入等量的质粒DNA，每组DNA用量为10μg。
由图7可知，电荷比为0的时，即溶液中仅含有质粒DNA，Zeta电势为-10；电荷比在0-10时，多肽/质粒DNA复合物的表面电势出现了由负到正的转变，主要是由于带正电的多肽结合到了带负电的DNA表面，中和了DNA表面的部分负电，使之发生聚集，之后随着多肽量的的不断增多，聚集体结构由原来的松散状态变得更加聚集，复合物表面电荷密度加大，表现为Zeta电势的增高；当电荷比为30-50时，电势基本达到了稳定，证明了(CR3)3C多肽具有很好的DNA结合能力。
(3)(CR3)3C介导的基因转染
①.(CR3)3C/pEGFP复合物，由以下方法制备而成：
将1mg(CR3)3C多肽粉末溶于1mL磷酸盐缓冲液(1×PBS)中，1mg/mL的(CR3)3C多肽溶液，根据实验需要采用无血清无双抗培养基(DMEM)将多肽稀释至相应的浓度；采用无血清无双抗培养基将pEGFP质粒DNA溶液稀释至0.008μg/μL；设置(CR3)3C多肽与pEGFP质粒DNA的电荷比为10:1、16:1、20:1、32:1，将相应浓度的多肽溶液与质粒溶液等体积混合，室温孵育30min，获得不同电荷比的(CR3)3C/pEGFP复合物，每孔DNA用量为0.2μg。
其中，上述不同电荷比的(CR3)3C/pEGFP复合物由以下方法制备而成：
(CR3)3C多肽与pEGFP的电荷比10:1将等体积的pEGFP溶液(0.008μg/μL)缓慢加入到(CR3)3C溶液(0.078μg/μL)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与pEGFP的电荷比16:1：将等体积的pEGFP溶液(0.008μg/μL)缓慢加入到(CR3)3C溶液(0.13μg/μL)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与pEGFP的电荷比20:1：将等体积的pEGFP溶液(0.008μg/μL)缓慢加入到(CR3)3C溶液(0.16μg/μL)中，室温孵育30min，即得。
(CR3)3C多肽与pEGFP的电荷比32:1：将等体积的pEGFP溶液(0.008μg/μL)缓慢加入到(CR3)3C溶液(0.25μg/μL)中，室温孵育30min，即得。
②.基因转染所使用的细胞为人胚肾细胞293E；
③.在基因转染实验前，首先将293E细胞以1×105个/mL的密度，培养在96孔板中,将其放入培养箱中培养24h。之后将细胞培养板中的培养基吸出，随后每孔加入100μL无血清无双抗培养基。接着将上述方法制备的不同电荷比的(CR3)3C/pEGFP复合物溶液加入细胞培养板中，每孔中复合物用量为50μL。37℃培养箱孵育4-6小时，随后以新鲜的含血清培养基更新每孔，继续孵育，24h后，在倒置荧光显微镜上观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况(激发波长488nm)。
结果如图8所示，其中，a)、b)、c)、d)分别对应电荷比为10:1、16:1、20:1、32:1条件下制备的复合物处理的293E细胞，其下方图片均为与之相对应的明场图片；
由图8可知，(CR3)3C多肽成功介导了绿色荧光蛋白的表达，并且在电荷比为20:1时取得较高的表达效率。这一结果证明了，(CR3)3C多肽分子能够有效的将pEGFP质粒DNA递送至细胞内，并对核酸分子提供保护作用，使其在细胞内免于被酶解，从而能够在细胞内得到有效的表达。且在该电荷比下，细胞的形态良好，表明该复合物具有良好的生物相容性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种作为蛋白质和/或核酸胞内递送载体的多肽，其特征在于，具有如下序列：
Nap-Phe-Phe-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly-Cys-Arg-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg-Cys-NH2，具体结构如下：
其中，Nap为1-萘乙酸，Phe为苯丙氨酸，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Leu为亮氨酸，Ala为丙氨酸，Cys为半胱氨酸，Arg为精氨酸，分子质量为2863.46g/mol。
2.权利要求1所述作为蛋白质和/或核酸胞内递送载体的多肽在蛋白质和/或核酸胞内递送中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的蛋白质为在等电点条件下pH小于7的蛋白质。
4.一种蛋白质胞内递送的方法，其特征在于，将蛋白质与权利要求1所述的胞内递送载体混合，制备成胞内递送载体与蛋白质的复合物，然后将该复合物与待转运细胞共培养。
5.根据权利要求4所述蛋白质胞内递送的方法，其特征在于，所述胞内递送载体与蛋白质的复合物是由以下方法制备而成：
按照5:1-90:1的摩尔比，向胞内递送载体的多肽溶液中加入蛋白质溶液，室温孵育后，即得。
6.根据权利要求5所述蛋白质胞内递送的方法，其特征在于，所述胞内递送载体的多肽与蛋白质的摩尔比为5:1-30:1。
7.根据权利要求5所述蛋白质胞内递送的方法，其特征在于，所述的蛋白质为在等电点条件下pH小于7的蛋白质。
8.一种基因转染的方法，其特征在于，将核酸分子与权利要求1所述的胞内递送载体混合，制备成胞内递送载体与核酸的复合物，然后将该复合物与待转运细胞共培养。
9.根据权利要求8所述基因转染的方法，其特征在于，所述胞内递送载体与核酸的复合物是由以下方法制备而成：
按照10:1-50:1的电荷比，向胞内递送载体的多肽溶液中加入核酸分子溶液，室温孵育后，即得。
10.权利要求1所述作为蛋白质和/或核酸胞内递送载体的多肽在制备蛋白质胞内递送试剂和/或基因转染试剂中的应用。
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