CN105175526A - 细胞膜穿透肽hPP8及其用途 - Google Patents

细胞膜穿透肽hPP8及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN105175526A
CN105175526A CN201510528663.5A CN201510528663A CN105175526A CN 105175526 A CN105175526 A CN 105175526A CN 201510528663 A CN201510528663 A CN 201510528663A CN 105175526 A CN105175526 A CN 105175526A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hpp8
cell
protein
medicine
albumen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510528663.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105175526B (zh
Inventor
柳长柏
王琥
邹黎黎
马节兰
杨英桂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Zhenzhen Biomedical Technology Co.,Ltd.
Original Assignee
China Three Gorges University CTGU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Three Gorges University CTGU filed Critical China Three Gorges University CTGU
Priority to CN201510528663.5A priority Critical patent/CN105175526B/zh
Publication of CN105175526A publication Critical patent/CN105175526A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105175526B publication Critical patent/CN105175526B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于生物医学领域，涉及一种人源性细胞膜穿透肽hPP8及其用途。本发明所提供的细胞膜穿透肽hPP8具有穿透细胞膜的功能，可携带蛋白质等大分子跨膜进入多种细胞内；且由于该肽段来源于人类蛋白，引起人体免疫反应的可能性小，潜在的不安全因素相对少，因此hPP8是一种极具开发前景的可用于蛋白、多肽等生物活性分子的跨膜运输载体，可用作细胞内药物运输载体。

Description

细胞膜穿透肽hPP8及其用途
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体讲，涉及一种细胞膜穿透肽及其用途。
背景技术
随着人类基因组计划的完成和蛋白质组学的兴起，人们发现越来越多的生物分子比如蛋白质、多肽、核酸等均有可能成为治疗药物。但是与传统药物不同的是，这些治疗分子在体内稳定性低，需要在胞内发挥功能的分子难以进入细胞，因而会限制其作为药物的推广应用。故开发能有效携带这些治疗性生物大分子进入靶细胞，且经济、安全的载体系统是亟需解决的问题。
近年来，非病毒药物运输载体以其安全性、低毒性、低免疫反应等优点被寄予厚望。迄今比较常用的生物大分子细胞内导入方式有电穿孔、脂质体转染和有机高分子纳米颗粒等。但可能存在着安全隐患如对细胞的毒性作用、胞内释放困难、难于组装及操作、难于应用到个体等这样或那样的缺点。因此寻找新型的、理想的非病毒药物输送系统引起了学者们的广泛兴趣(图1)。
在过去的20多年间，将核酸、多肽、蛋白等具有治疗作用的生物活性大分子跨膜转运至细胞内技术的基础研究取得了突破性进展。国内外学者在对一些病毒感染特性的研究中相继发现了一类蛋白结构域，如：HIV-1Tat(48～60)、VP22(267～300)以及果蝇蛋白ANTP(43～58)等具有介导异源蛋白、寡聚核酸、金属螯合物等生物活性大分子直接跨过细胞膜进入胞浆和核内的功能，这一类富含阳离子、具有穿膜功能的短肽被称之为细胞膜穿透肽(cell-penetratingpeptides，CPP)、穿膜肽或蛋白转导域(proteintransductiondomains，PTDs)。1988年Green和Frankel等首次发现TAT——人免疫缺陷病毒(HIV)的转录调节蛋白可以穿透细胞膜/核膜进入细胞浆/细胞核，随后的研究发现，该蛋白第48-60位氨基酸残基(YGRKKRRQRRR)形成的肽段即可完全发挥其穿膜功能。以后又相继发现了多个源自病毒或其它生物的CPP，如I型单纯疱疹病毒(herpessimplexvirustype1,HSV-1)蛋白的VP22、果蝇同源触角蛋白(drosophilahemeoproteinantennapediatranscriptionprotein,ANTP)、乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)的前S抗原等。依据其来源不同可将已经发现的CPP大致分为两类：一类为如上面提及的TAT、VP22、ANTP和前S抗原来源于病毒的短肽等；另一类为根据天然CPP的特点人工合成的短肽如多聚精氨酸、MPG、PEP-1、MAP、transportan和各种基于不同信号序列合成的肽段等。CPP能在体外或体内作为载药多肽，介导一系列生物活性分子如DNA、siRNA、多肽、蛋白质甚至纳米颗粒等进入细胞，发挥各自的生物学效应。这些CPP因其本身具有低毒、副作用小、不干扰所携带大分子生物活性等特点，被广泛用于体外或/和体内向细胞内运送生物活性分子，尤其是在抗肿瘤治疗的应用研究方面更是引人注目。CPP研究在基础生物学和应用研究上都具有极大意义，作为一种有效的胞内运载工具，有着广泛的应用前景(图2)。
然而来源于病毒或其他种属生物蛋白结构域的CPP，在临床应用上可能仍然存在一定的安全隐患，比如可能的细胞毒性和免疫原性问题。人们对TAT作为CPP进行了大量研究，腹腔注射Tat-β-半乳糖苷酶，能进入小鼠各种脏器组织，甚至可以透过血脑屏障进入脑组织。但由于TAT源于HIV病毒蛋白而恐存有安全忧患，一直未能用于临床研究。另有报道称，应用TAT携带药物的上呼吸道喷雾引发了严重的肺部病理反应。可见，针对不同治疗需要，开发更为安全的、新型穿膜肽－－人源性穿膜肽(hCPP)是非常必要的。
2002年，Beck-SickingerAG小组开创性地发现了第一个人源性穿膜肽－－来源于人降血钙素(hCT)的第9-32的残基。随后相继报道的人源性穿膜肽还有来自于hCLOCK蛋白(一种与生物节律调节有关的蛋白，2004年)、Hph-1(一种人源转录因子，2006年)、Bag-1蛋白(一种可与Bcl-2相互作用的激活糖皮质激素受体的蛋白，2006年)、p14ARF蛋白(一种人抑癌基因蛋白，2008年)、人乳铁蛋白(2009年)、人Cytc77-101及Cytc86-101(2010年)和TCTP蛋白(来源于人翻译控制肿瘤蛋白氨基末端10个氨基酸残基，2011年)的CPP等。与其它物种蛋白来源的CPP相比，人源性CPP引起人体的免疫反应的可能性小，潜在的不安全因素相对少，作为人类疾病治疗的药物载体，具有绝对优势，有着更广阔的开发、应用前景。
FutakiS等发现穿膜肽的穿膜能力与多肽序列中精氨酸残基的数量和位置有很大的相关性。我们在从事细胞膜穿透肽研究中，通过对蛋白数据库中一级结构的检索、分析发现人源性的PHD转录因子蛋白(PHDtranscriptionfactor)的一段长为16个氨基酸的短肽的一级结构富含属于碱性氨基酸的精氨酸和赖氨酸，分布着很强的正电荷，这与大多数已知CPP的结构特点很相似，继而分析其二级结构，发现它可形成经典的α-螺旋构象。推测这段短肽可能是具有自主穿膜功能的新型的人源性穿膜肽。我们继而合成了这段短肽并命名为hPP8，观察了其对培养细胞的穿膜效率，细胞毒性及穿膜机制，同时还观察、评估了其向细胞内递送绿色荧光蛋白(GFP)的效果，为hPP8作为一种新型人源性药物运输载体的开发提供了科学依据。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“生物分子”是指，存在于生物体中的分子的总称，包括但不限于，核酸、寡肽、多肽、蛋白质、糖类、脂质、和小分子化合物以及其任意的复合物。
术语“寡肽”通常是指2-10个氨基酸组成的肽。术语“多肽”通常是指11个以上的氨基酸组成的肽。术语“蛋白质”通常是指含有51个以上的氨基酸残基的多肽链。
本发明的目的是提供一种新的细胞膜穿透肽hPP8，本发明提供的细胞膜穿透肽hPP8是源于人类PHD转录因子蛋白的一段多肽序列，所述多肽序列的长度在16个氨基酸以内，其具有细胞膜穿透能力。所述细胞膜来源的细胞优选真核细胞，更优选动物细胞，最优选哺乳动物细胞，例如肿瘤细胞。
本发明所述穿膜肽的多肽序列包含SEQIDNO：1所示的序列，即Arg-Arg-Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Leu-Val-Met-His-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg(SEQIDNO：1)(精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-赖氨酸-精氨酸-丝氨酸-亮氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸)，优选地，所述细胞膜穿透肽hPP8的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本发明所述的细胞膜穿透肽hPP8，其为合成的或重组的。
本发明还提供了合成的或重组的融合蛋白，该融合蛋白由细胞膜穿透肽hPP8和目的蛋白例如可用作药物的蛋白或用做标记的蛋白，其中，所述细胞膜穿透肽hPP8直接或者通过接头与所述目的蛋白连接，优选地，所述可用作药物的蛋白如选自抗肿瘤的蛋白，所述用做标记的蛋白如选自绿色荧光蛋白GFP。
本发明还提供了编码所述细胞膜穿透肽hPP8或者编码所述融合蛋白的核酸。
含有编码所述细胞膜穿透肽hPP8或编码所述融合蛋白的核酸的载体，例如真核表达载体或原核表达载体。含有所述核酸或所述载体的宿主细胞或重组病毒，所述宿主细胞包括转基因细胞系或重组菌，例如重组细菌或重组真菌。本发明还提供了制备所述细胞膜穿透肽hPP8或所述融合蛋白的方法，其包括：培养所述宿主细胞或重组病毒，和，从培养物中回收所述的细胞膜穿透肽hPP8或者融合蛋白。
我们首次发现这一肽段具有穿透细胞膜的功能，并可携带蛋白质等生物分子跨膜进入体外多种细胞(包括贴壁培养细胞、悬浮培养细胞、原代培养细胞及传代培养细胞等)内，是一种极具开发前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜运输载体。因此，本发明还提供了所述细胞膜穿透肽hPP8用作药物运输载体的用途或在制备药物运输载体中的应用，特别是用作细胞内药物运输载体的应用，其中所述药物运输载体携带生物分子跨膜进入细胞，这些细胞包括贴壁培养细胞、悬浮培养细胞、原代培养细胞及传代培养细胞等。其中，所述生物分子包括核酸、寡肽、多肽、蛋白质、糖类、脂质、和小分子化合物以及其任意的复合物。
本发明还提供了包含药物运输载体的复合物，其特征在于所述药物运输载体为所述的细胞膜穿透肽hPP8，优选地，所述复合物还包含可用作药物的生物分子，优选地，所述药物运输载体直接或者通过接头与生物分子连接，优选地，所述复合物包含药物运输载体与可用作药物的蛋白，优选地，所述药物运输载体直接或者通过接头与可用作药物的蛋白连接。本发明还提供了一种制备所述复合物的方法，包括将所述的细胞膜穿透肽hPP8与生物分子直接连接或通过接头连接，得到所述复合物。其中所述生物分子可来自核酸、寡肽、多肽、蛋白质、糖类、脂质、纳米颗粒和小分子化合物以及其任意的复合物；所述复合物适合用于生产药物、保健品、美容或护肤品、转染试剂或诊断试剂。
本发明还提供了包含药物运输载体的细胞内药物，其特征在于所述药物运输载体为所述的细胞膜穿透肽hPP8。本发明还提供了一种制备细胞内药物的方法，是将所述的细胞膜穿透肽hPP8与可用作药物的生物分子连接，得到所述细胞内药物。所述生物分子为生物活性分子，如DNA、siRNA、多肽、蛋白质或纳米颗粒，特别是抗肿瘤活性分子；所述细胞内药物可用于离体细胞，也可以用于体内细胞。
本发明的优点在于，与其它生物蛋白来源的CPP相比，对细胞基本无毒副作用，潜在的不安全因素相对较少。因此，作为临床应用的药物分子载体有着更为广阔的应用前景。
附图说明
图1是新型治疗分子胞内递送策略示意图。
图2是细胞膜穿透肽(CPP)及其可携带入胞的生物药物的工作原理示意图。
图3是本发明的新型人源性细胞膜穿透肽hPP8的二级轮状结构示意图。
图4是本发明的新型人源性细胞膜穿透肽hPP8的二级结构中存在的螺旋及折叠分析示意图。
图5是本发明的新型人源性细胞膜穿透肽hPP8的原核表达及纯化结果的电泳照片。其中，泳道M为：标准蛋白分子量；泳道1为：pET15b-hPP8质粒转化细菌IPTG诱导前裂解液；泳道2为：pET15b-hPP8质粒转化细菌IPTG诱导后裂解液；泳道3为：纯化后的hPP8-6×His(六聚组氨酸为纯化用标签，多聚组氨酸也有助于提高穿膜效率)。
图6是荧光标记的hPP8(hPP8-FITC)穿膜进入不同细胞后胞内荧光分布情况，其中，A为hPP8-FITC穿膜进入HeLa，MG63，ECV-304细胞后胞内荧光分布情况，B为hPP8-FITC穿膜进入HeLa，MG63，ECV-304细胞后胞内荧光定量以及与经典穿膜肽TAT-FITC比较。
图7是hPP8-FITC穿膜进入原代小鼠脾淋巴细胞后胞内荧光分布情况。
图8为不同浓度的hPP8-FITC的穿膜效率。其中，A：ECV-304胞内荧光镜下观察；B：ECV-304胞内荧光定量。
图9表示孵育时间对hPP8-FITC入胞的影响，以及细胞活力分析。其中，A：hPP8-FITC短时间孵育后的荧光定量；B：hPP8-FITC长时间孵育后的荧光定量；C：不同浓度的hPP8对细胞活力影响的定量分析。
图10表示不同细胞经DMSO预处理对hPP8-FITC穿膜效率的影响。其中，A：DMSO预处理各种不同类型细胞后胞内荧光分布情况；B：DMSO预处理不同培养细胞后的胞内荧光定量。
图11表示pET15b-hPP8-GFP重组质粒构建和NdeI/BamHI的双酶切鉴定。其中，泳道M为：标准蛋白分子量；泳道1：pET15b-hPP8-GFP的NdeI/BamHI的双酶切；泳道2：pET15b-hPP8-GFP。
图12表示SDS-PAGE分析IPTG诱导pET15b-GFP、pET15b-hPP8-GFP在Rosetta细菌中的表达及纯化。其中，泳道M为：标准蛋白分子量；泳道3和4分别为：纯化的GFP和hPP8-GFP融合蛋白；泳道2和5分别为：GFP和hPP8-GFP质粒转化细菌经IPTG诱导；泳道1和6分别为：GFP和hPP8-GFP质粒转化细菌未经IPTG诱导。
图13表示hPP8-GFP融合蛋白穿膜进入L929细胞的分布情况。
图14表示hPP8-GFP融合蛋白穿膜进入原代小鼠脾淋巴细胞的分布情况。
图15表示不同温度下荧光短肽在胞内的含量，不同内吞抑制剂对hPP8穿膜效率影响。其中，A：不同温度下hPP8-FITC穿膜进入胞内荧光定量分析；B：肝素钠处理各种不同类型细胞后胞内荧光强度；C：氯喹预处理不同培养细胞后胞内荧光强度；D：氯丙嗪处理不同培养细胞后的胞内荧光强度；E：叠氮化钠处理不同培养细胞后的胞内荧光强度。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次或以上重复实验，结果取平均值。
实施例1、CPP一级结构、二级结构分析，预测、鉴定新型人源性CPP：
1、对本发明获得的细胞膜穿透肽hPP8的二级结构进行分析，采用了emboss的在线分析程序(其分析程序请参见网页：http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/pepwheel在线分析多肽的轮状结构；http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/help/garnier在线分析二级结构的螺旋、折叠等)。hPP8的轮状结构示意图，螺旋、折叠结构示意图分别如图3和图4所示。
为了便于研究hPP8的细胞穿膜功能：
化学合成了绿色荧光标记的hPP8：
Arg-Arg-Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Leu-Val-Met-His-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg-FITC(hPP8-FITC)；
和无绿色荧光标记hPP8：
Arg-Arg-Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Leu-Val-Met-His-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg(hPP8，SEQIDNO：1)。
纯化定量、冷冻保存备用。
2、hPP8的合成途径有两种：1)化学合成；2)基因工程表达。
hPP8源于自然蛋白，可以在实验室水平或工业水平进行合成。
2.1化学合成方法：此种方法是选择羧基树脂(Fmoc-Tyr(tBu)-Wangresin)，采用固相Fmoc法合成。具体合成步骤如下：
(1)用Fmoc基团对α-氨基进行保护的精氨酸通过一个支臂连结到不溶性载体王氏树脂(Wangresin)上；
(2)用TFA(三氟乙酸)溶液洗涤精氨酸―支臂―树脂，使α-氨基脱保护；
(3)将第二个预先用适当的缩合剂DCC活化的α-氨基保护的精氨酸通过耦联反应与第一个精氨酸形成共酯连接上去；
(4)用TFA(三氟乙酸)溶液洗涤精氨酸―支臂―树脂，使α-氨基脱保护；
(5)将第三个预先用适当的缩合剂DCC活化的α-氨基保护的精氨酸通过耦联反应与第二个精氨酸形成共酯连接上去。重复进行上述脱保护、耦联，直到耦合上最后一个氨基酸——精氨酸，脱去Fmoc保护基团，合成完成。
(6)将切割试剂加入到肽——树脂中，把肽链从树脂上切割下来，同时也将各个氨基酸上的侧链保护基团从肽链上切割下来，加入乙醚，沉淀多肽，获得多肽粗品。运用HPLC/MS进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽。
2.2基因工程表达法：采用原核表达方法，具体操作如下：
(1)设计编码hPP8的两条单链cDNA，两侧带有XhoI和NdeI酶切位点，交由上海生工公司合成单链寡聚核苷酸链，再将两条单链DNA等量加入水溶液中，经95℃5min，自然冷却至室温使其完成退火，形成互补的双链DNA片段(hPP8)；
(2)利用XhoI/NdeI两种限制性内切酶进行双酶切，37℃温育2h，将表达质粒pET15b(购自Novagen)线性化；
(3)进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪的长波紫外光照射下，切胶回收含线性化质粒pET15b的条带。瞬时离心，将凝胶集中至管底，依切胶回收试剂盒内的操作说明完成切胶回收；
(4)将回收、纯化的线性化质粒DNA片段和退火后经酶切的穿膜肽cDNA片段(hPP8)分别进行琼脂糖凝胶电泳，确定连接比例，置于16℃水浴箱中温育过夜连接；
(5)用CaCl2法制备DH5α感受态细胞，用热休克法以上述连接产物pET15b-hPP8转化感受态细胞，经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜筛选后，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；
(6)离心沉淀收集扩增转化细菌，用碱裂解法提取重组质粒，筛选成功构建的阳性克隆pET15b-hPP8，酶切并测序验证；
(7)将验证正确的重组原核质粒pET15b-hPP8转化Rosetta感受态细菌。经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜；
(8)挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素LB培养基，37℃振荡培养过夜；
(9)用15ml无菌离心管装3.8mlAmp(+)LB液体培养基，接种0.2ml对数生长期的菌悬液(1:20)。37℃，250rpm继续培养3h；
(10)于对数生长期细菌培养物中加入40μl0.1MIPTG至终浓度1.0mM，37℃，250rpm继续培养；
(11)在加入IPTG后6h取样200μl菌悬液；
(12)离心收集沉淀，用等体积1×SampleBuffer重悬，沸水浴5min。制备的菌体全蛋白上样样品；
(13)SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况，如图5所示确认的重组表达及纯化。
3、hPP8具有强穿膜效能：
3.1hPP8-FITC具有显著穿膜特征并在胞内分布均匀；
3.1.1hPP8-FITC可以穿膜进入体外培养的肿瘤等细胞并在细胞内均匀分布，具有显著穿膜特征；
取对数生长期的三种培养细胞系：HeLa、MG63和ECV-304(人胚胎血管内皮细胞、人子宫颈癌细胞和人成骨肉瘤细胞)，依1×105个细胞/孔的密度接种于12孔板常规培养，设实验组及对照组；
至对数生长期(80％密度)时，换成无血清的RPMI-1640培养液继续培养1h；
加入终浓度10μMhPP8-FITC，常规培养1h；
弃去培养液，PBS洗涤3次；
荧光显微镜下观察培养细胞内荧光及其胞内定位情况。
结果见图6，荧光显微镜观察发现，未经hPP8-FITC处理的各种细胞内无绿色荧光。在经hPP8-FITC温育后，可在胞内见到明显绿色荧光，且这三种不同细胞系均有明显胞内荧光，提示hPP8穿膜进入细胞没有明显细胞嗜向性。
3.1.2hPP8-FITC对小鼠脾淋巴细胞有穿膜特征
新鲜采取、分离的健康小鼠脾细胞，依1×105个细胞/孔的密度接种于12孔板，设实验组及对照组；
在培养箱中常规培养2h后，换成无血清的RPMI-1640培养液继续培养1h；
加入终浓度10μMhPP8-FITC，常规培养1h；
弃去孵育液，PBS洗涤3次；
荧光显微镜下观察培养细胞内荧光及其胞内定位情况。
结果见图7：荧光显微镜观察发现，未经hPP8-FITC处理的小鼠脾淋巴细胞内不见绿色荧光；在经hPP8-FITC温育后，可见到明显的胞内绿色荧光，提示hPP8可高效穿膜进入新鲜制备的小鼠脾淋巴细胞。
3.2hPP8-FITC穿膜进入细胞具有浓度依赖性
ECV-304细胞在经无血清的RPMI-1640处理1h后，加入浓度梯度的hPP8-FITC(2.5μM、5.0μM、7.5μM、10.0μM)孵育1h后，PBS清洗3次，观察培养细胞内荧光情况。并采用荧光酶标仪检测细胞内荧光密度数值，具体方法如下：细胞在经不同浓度hPP8-FITC孵育结束后，PBS清洗3次，按300μl/孔加入0.1MNaOH，室温裂解细胞10min，1000rpm离心3min。取细胞裂解液上清50μl于96孔板在荧光酶标仪中，激发光/吸收光为490nm/520nm下测定荧光密度值。实验重复3次取平均值。在实验中，采用经典的穿膜肽TAT-FITC作为阳性对照。
图8A显示，胞内荧光强度随hPP8-FITC浓度升高而增强，并且可见相同浓度下，胞内hPP8-FITC荧光比TAT-FITC强。图8B可见，随着hPP8-FITC浓度的升高，胞内荧光强度随之增强，提示hPP8-FITC穿膜进入细胞具有浓度依赖性。当hPP8-FITC浓度为5μM时，荧光强度已经比较高，在后续实验中均选用了5μM的hPP8-FITC作为终浓度进行实验。
3.3hPP8胞内持续时间显著长于TAT
HepG2、ECV-304、PC3、HeLa在经无血清的RPMI-1640培养处理1h后，加入终浓度为5μM的hPP8-FITC分别孵育0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、5.0h、10h、20h及30h后。PBS洗涤三次，裂解细胞，依前述方法用荧光酶标仪检测490nm/520nm检测细胞裂解液上清荧光值。实验均重复3次取平均值。
不同的培养细胞随着hPP8-FITC孵育时间的延长，其荧光值均有所增强，至4h其荧光值最大(图9A)。为了进一步确定hPP8-FITC在胞内维持时间，将孵育时间延长至30h。发现hPP8-FITC在HepG2(人肝癌细胞株)、ECV-304、PC3(人前列腺癌细胞株)和HeLa等细胞系中可以维持至至少30h(图9B)。本研究显示新型人源性穿膜肽hPP8在胞内维持时间至少可达30h，而TAT仅能维持短短几小时，显著短于hPP8。
3.4DMSO预处理促进hPP8穿膜进入培养细胞
取对数生长期贴壁培养细胞HeLa、MG63、ECV-304，按照1×105个细胞/孔的接种密度接种于12孔板进行常规培养。每种细胞均分设实验组及对照组；
至对数生长期(80％密度)时，换为无血清的RPMI-1640培养液，再培养1h；
每孔加入终浓度为5％的DMSO，继续培养1h。加入终浓度为5μM的hPP8-FITC或TAT-FITC后，孵育1h；
弃去培养液，PBS洗涤3次；
荧光显微镜下观察HeLa、MG63、ECV-304胞内荧光及其胞内定位情况，或按每孔加入300μl0.1MNaOH，室温裂解HeLa、MG63、ECV-304细胞10min，1000rpm离心3min。取细胞裂解液上清50μl到96孔板于荧光酶标仪，于490nm/520nm下测定荧光吸光值。实验重复3次取平均值。
本发明人前期研究发现DMSO可以明显增强TAT穿膜效率，在此，也观察了DMSO对新型人源性穿膜肽hPP8的穿膜影响。通过荧光显微镜观察发现，DMSO对hPP8-FITC穿膜具有明显增强效果。经DMSO预处理后，hPP8-FITC在胞内显示高密度绿色荧光，且均匀分布于胞浆和胞核。荧光定量检测发现(图10A)，5％DMSO预处理后，hPP8-FITC的胞内荧光强度较未经DMSO预处理细胞强(图10B)。提示5％DMSO预处理细胞明显促进了hPP8和TAT的穿膜效率，DMSO能够显著增强CPP的穿膜效率且无细胞特异性改变。
实施例2、hPP8对细胞活力影响甚微
(1)取对数生长期培养细胞ECV-304和HepG2，以1×104个细胞/孔的接种密度接种于96孔板常规培养，每孔100μl，每种细胞设3个复孔，37℃培养；
(2)至对数生长期，培养液换成无血清的RPMI-1640培养液，继续培养1h；
(3)分别换成hPP8浓度梯度为10μM、20μM、30μM、40μM及50μM无血清的RPMI-1640培养液，继续培养24h；
(4)孵育时间结束后，按每孔100μl加入PBS洗涤，2min×3次；
(5)每孔加入80μl含血清的正常培养液及20μlMTT(母液浓度5mg/ml，即0.5％MTT)溶液，于37℃继续培养4h，终止培养后吸去培养液。以200μl/孔加入二甲基亚砜，振荡10min至结晶物充分溶解后用全波长酶标仪上检测波长为570nm的吸光值A，每组取3个复孔的平均值。测定OD490。重复3次，计算细胞存活率。
(6)细胞生存率的计算如下：
细胞生存率＝(实验孔OD值－对照孔OD值－空白孔OD值)/(对照孔OD值－空白孔OD值)×100％。
为明确hPP8处理细胞是否会影响其活力，本实验采用MTT法测定不同浓度hPP8处理24h后对细胞活力的影响情况。ECV-304和HepG2细胞经不同浓度hPP8处理后MTT分析数据显示，浓度高于20μM的hPP8长时间处理细胞后细胞依然保持在75％以上，对细胞的活力影响甚微(图9C)。这提示有效浓度(小于5μM)范围内hPP8-FITC并不影响细胞活力。
实施例3、pET15b-hPP8-GFP质粒构建，融合蛋白的表达及纯化和其穿膜功效的研究
3.1pET15b-hPP8-GFP重组质粒的构建和酶切鉴定
(1)设计编码hPP8的两条单链cDNA，两侧带有XhoI和NdeI酶切位点，交由上海生工公司合成单链寡聚核苷酸链，再将两条单链DNA等量加入水溶液中，经95℃，5min，自然冷却至室温使其完成退火，形成互补的双链DNA片段(hPP8)；同时设计一对引物以pEGFP(购自Clontech公司)为模板，PCR获得GFP蛋白基因片段，两侧分别有XhoI和BamHI酶切位点，纯化PCR产物备用；
(2)利用BamHI/NdeI两种限制性内切酶进行双酶切，37℃温育2h，将表达质粒pET15b(购自Novagen)线性化；
(3)进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪的长波紫外光照射下，切胶回收含线性化质粒pET15b的条带；瞬时离心，将凝胶集中至管底，依切胶回收试剂盒内的操作说明完成切胶回收；
(4)将回收、纯化的线性化质粒DNA片段和退火后经酶切的穿膜肽cDNA片段(hPP8)、以及GFP基因片段分别进行琼脂糖凝胶电泳，确定连接比例，置于16℃水浴箱中温育过夜连接；
(5)用CaCl2法制备DH5α感受态细胞，用热休克法以上述连接产物pET15b-hPP8转化感受态细胞，经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜筛选后，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；
(6)离心沉淀收集扩增转化细菌，用碱裂解法提取重组质粒，筛选成功构建的阳性克隆pET15b-hPP8-GFP，酶切并测序验证；
利用XhoI/BamHI双酶切鉴定重组质粒pET15b-hPP8-GFP得到酶切产物约为800bp(图11)，片段与预期大小相符；经测序确认无突变。说明原核表达质粒pET15b-hPP8-GFP构建成功。再用相同方法构建得到pET15b-GFP和pET15b-TAT-GFP。
3.2融合蛋白的表达及纯化
3.2.1融合蛋白的原核表达
(1)将成功构建的重组质粒pET15b-GFP和pET15b-hPP8-GFP分别转化Rosetta感受态细胞。经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜；
(2)挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素LB培养基，37℃振荡培养过夜；
(3)用15ml无菌离心管装3.8mlLB(+)Amp液体培养基，接种0.2ml对数生长期的菌悬液(1:20)。37℃，250rpm继续培养3h；
(4)于对数生长期细菌培养物中加入40μl0.1MIPTG至终浓度1.0mM，37℃，250rpm继续培养；
(5)在加入IPTG后6h取样200μl菌悬液；
(6)离心收集沉淀，用等体积1×SampleBuffer重悬，沸水浴5min。制备的菌体全蛋白上样样品；
(7)SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况。
3.2.2融合蛋白的纯化
3.2.2.1大量诱导：用1L培养瓶中盛300mlLB(+)Amp液体培养基，诱导表达可溶性的重组蛋白(1.0mMIPTG，30℃，250rpm，9h)。4℃6500rpm×10min，收集沉淀并称重，-80℃保存备用。
3.2.2.2咪唑纯化
(1)超声裂解：平均100ml菌液用15mlLysis/BindingBuffer(300mMNaCl，50mMNaH2PO4，10mM咪唑，pH8.0)重悬，冰浴。超声功率300～600W，超声2sec，间隔2sec，工作90次。如此循环12～20次，至均匀破碎细菌于悬浮溶液；
(2)12000rpm×20min，4℃，转移上清至15ml离心管中；
(3)结合：用3～5倍体积的Lysis/BindingBuffer在15ml离心管中平衡Ni-NTA，离心收集Ni-NTA，再用与沉淀等体积的Lysis/BindingBuffer重悬，即已平衡的50％Ni-NTA。取1～4ml50％Ni-NTA与裂解上清混合，在分子杂交炉中37℃转动结合1～2h；
(4)洗涤脱除杂蛋白：用至少1/2菌液体积的WashBuffer(300mMNaCl，50mMNaH2PO4，20～30mM咪唑，pH8.0)洗脱杂蛋白。收集前3～5ml穿柱液，取样备做检测；
(5)洗脱靶蛋白：共用5～10mlElutionBuffer(300mMNaCl，50mMNaH2PO4，250mM咪唑，pH8.0),每次加0.5ml，用1.5ml离心管收集；
(6)保存：在96孔板中，各取5μl样品与195μl考马斯亮蓝G-250溶液混合，比较颜色深浅。留存颜色最深的数管，分别添加100～200μl无菌甘油，混匀后于-40℃保存，并取样备做检测。
GFP和hPP8-GFP融合蛋白相对分子质量分别为30KD和31.5KD。阳性克隆在1.0mMIPTG诱导6h后，经SDS-PAGE分析所表达的融合蛋白，在35KD附近出现一条强表达带，符合预期分子质量大小(图12)。基因工程表达蛋白的纯化是利用6×His标签，通过Ni-NTA亲和层析得到有效纯化，融合蛋白的纯度大于80％。图12显示得到了纯化的GFP和hPP8-GFP蛋白。
3.3hPP8-GFP融合蛋白穿膜功效的研究
3.3.1hPP8-GFP融合蛋白跨膜进入贴壁培养细胞内的能力研究
(1)取对数生长期培养细胞L929(小鼠成纤维细胞株)，按照1×105个细胞/孔的接种密度接种于12孔板常规培养。每种细胞均分设实验组及对照组；
(2)待细胞生长至80％融合时，换为无血清的培养液，继续培养1h；
(3)每孔加入终浓度为5％DMSO，继续常规培养1h；
(4)实验组加入终浓度为1.25、2.5、5.0μM的融合蛋白hPP8-GFP，阴性对照组加入相同浓度的蛋白GFP，37℃培养箱孵育1h；
(5)弃去后以上清培养液，PBS洗涤三次；
(6)置于荧光显微镜下观察hPP8-GFP融合蛋白穿膜及胞内定位情况。
L929细胞中加入hPP8-GFP融合蛋白孵育1h后，荧光显微镜下观察到细胞内清晰明亮的绿色荧光，胞内荧光分布均匀(图13)；经5％DMSO预处理L929细胞后胞内hPP8-GFP荧光明显增强。显示hPP8可携带大分子(绿色荧光蛋白)高效穿膜进入细胞，5％DMSO预处理可显著增强hPP8携带绿色荧光蛋白跨膜进入细胞。
3.3.2hPP8-GFP融合蛋白跨膜进入小鼠脾细胞的穿膜能力研究
(1)新鲜采取、分离制备小鼠脾细胞，按照1×105个细胞/孔的接种密度接种于12孔板，设实验组及对照组；
(2)将12孔板在培养箱中静置2h后，换成无血清的RPMI-1640培养液继续培养1h；
(3)实验组加入终浓度为5μM的融合蛋白hPP8-GFP，阴性对照组加入相同浓度的GFP蛋白，37℃培养箱孵育1h；
(4)弃去以培养液，PBS洗涤三次；
(5)置于荧光显微镜下观察hPP8-GFP融合蛋白穿膜及胞内定位情况。
新鲜采取、分离制备的小鼠脾细胞经RPMI-1640预处理后，加入hPP8-GFP融合蛋白，荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光，胞内荧光分布均匀(图14)。
本研究提示hPP8不仅自身可以穿膜进入细胞，也可通过融合蛋白形式携带大分子蛋白(GFP)跨膜进入贴壁培养细胞和人外周血淋巴细胞。所以这一研究结果为将来开发由hPP8作为载体向细胞内递送大分子蛋白药物提供了基础。
实施例4、hPP8穿膜机制
1)低温促进hPP8-FITC穿膜
使用不同的培养细胞，如Cos7、ECV-304、PC3及Caski在经无血清的RPMI-1640处理1h后，加入终浓度为5μM的hPP8-FITC分别在4℃和37℃两个条件下孵育1h后，PBS清洗3次，依前述方法裂解细胞取其上清检测490nm/520nm波长处的荧光吸光值。实验重复3次取平均值。
一般认为细胞内吞途径是能量依赖的，低温时细胞的能量代谢几乎停滞，也即低温能够阻断细胞内吞途径。若hPP8穿膜方式是通过内吞途径实现，那么温度的变化必然会影响胞内荧光含量。本实验选用在4℃和37℃两个条件探索温度是否影响其穿膜方式。图15A表明，低温对hPP8穿膜有一定的影响。提示hPP8短肽本身穿膜可能与内吞机制有关。
2)肝素显著降低hPP8穿膜效率
观察四种内吞抑制剂对hPP8-FITC的穿膜影响，肝素(钠盐)(PBS溶解，终浓度10μM)、氯喹(PBS溶解，终浓度10μM)、氯丙嗪(PBS溶解，终浓度30μM)、叠氮化钠(PBS溶解，终浓度10μM)配成母液，0.22μm滤膜过滤灭菌。四种不同的培养细胞Cos7、ECV-304、PC3及Caski在用无血清的RPMI-1640培养1h后，细胞中分别加入终浓度的四种内吞抑制剂，继续孵育30min，加入终浓度为5μM的hPP8-FITC孵育1h，移除培养基，PBS清洗3次，依前述方法置于荧光酶标仪中，检测490nm/520nm的荧光吸光值。实验重复3次取平均值。
实验通过培养细胞与不同的内吞抑制剂孵育，考察内吞抑制剂对hPP8入胞情况的影响。其中肝素为细胞膜表面硫酸蛋白聚糖的竞争抑制剂；氯喹为抑制内含体酸化的内吞调节剂；氯丙嗪为笼型蛋白依赖的内吞抑制剂；叠氮化钠为ATPase抑制剂。从图15B中看出，在加入肝素(钠盐)后，细胞对hPP8的摄取大幅度降低。提示肝素能显著抑制hPP8被摄取进入细胞，细胞膜表面的硫酸蛋白聚糖对hPP8穿膜进入细胞发挥着重要作用。图15C、15D和15E显示，氯喹、氯丙嗪和叠氮化钠对hPP8穿膜进入细胞的影响均不明显。提示hPP8穿膜进入细胞的过程中需要与细胞膜表面硫酸蛋白聚糖等负电荷分子相互作用，可能不依赖笼型蛋白介导的内吞和内含体酸化以及非能量依耐性机制。
结论：我们在对现有CPP结构进行系统分析的基础上，通过对蛋白质数据库进行检索，预测和二级结构分析等方法，发现一全新的人源性蛋白衍生的细胞膜穿透肽(hCPP)，命名为hPP8。人工合成hPP8以及原核表达其与绿色荧光蛋白的融合蛋白(hPP8-GFP)进行了一系列体外实验研究。发现hPP8具有较强的穿膜能力，并可携带大分子GFP跨膜进入包括肿瘤细胞等贴壁培养细胞，原代细胞等多种培养细胞和小鼠脾细胞，而不影响所携带生物活性分子的功能，对细胞基本无毒副作用。显示hPP8作为一种新的人源性细胞膜穿透肽，能用于体外和体内向细胞内运送生物活性分子(如蛋白质、多肽等药物)。hPP8的开发将为科研(体外培养细胞的蛋白转导)、临床治疗(向细胞内递送蛋白或多肽药物)提供又一新型胞内运输工具。

Claims (10)

1.细胞膜穿透肽hPP8，其特征在于该细胞膜穿透肽hPP8是源于人类PHD转录因子蛋白的一段多肽序列，所述多肽序列的长度在20个氨基酸以内，其具有细胞膜穿透能力；优选的，所述穿膜肽的多肽序列包含SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；优选的，所述穿膜肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；优选的，所述穿膜肽为合成的或重组的。
2.合成的或重组的融合蛋白，该融合蛋白包含权利要求1所述的细胞膜穿透肽hPP8和目的蛋白例如可用作药物的蛋白或用做标记的蛋白，其中，所述细胞膜穿透肽hPP8直接或者通过接头与所述目的蛋白连接，优选地，所述可用作药物的蛋白如选自抗肿瘤的蛋白，所述用做标记的蛋白如选自绿色荧光蛋白GFP。
3.编码权利要求1所述的细胞膜穿透肽hPP8或者编码权利要求2所述的融合蛋白的核酸。
4.含有权利要求3所述的核酸的载体，例如真核表达载体或原核表达载体。
5.含有权利要求3所述的核酸或权利要求4所述载体的宿主细胞或重组病毒；优选的，所述宿主细胞包括转基因细胞系或重组菌例如重组细菌或重组真菌。
6.权利要求1所述的细胞膜穿透肽hPP8用作生物分子（包括用作药物的生物分子）运输载体的用途，优选地所述运输载体携带生物分子跨膜进入细胞，优选地，所述生物分子选自核酸、寡肽、多肽、蛋白质、糖类、脂质和小分子以及其任意的复合物。
7.权利要求2所述的融合蛋白用于制备药物、保健品、美容或护肤品、转染试剂或诊断试剂的用途，优选地所述药物用于治疗能够被所述的可用作药物的蛋白治疗的疾病，优选地，所述可用作药物的蛋白选自抗肿瘤的蛋白，优选地，所述疾病选自肿瘤。
8.包含药物运输载体的复合物例如药物组合物，其特征在于所述药物运输载体为权利要求1所述的细胞膜穿透肽hPP8，优选地，所述复合物还包含可用作药物的生物分子，例如核酸、寡肽、多肽、蛋白质、糖类、脂质、纳米颗粒和小分子化合物以及其任意的复合物，
优选地，所述药物运输载体直接或者通过接头与生物分子连接，
优选地，所述复合物包含药物运输载体与可用作药物的蛋白，
优选地，所述药物运输载体直接或者通过接头与可用作药物的蛋白连接。
9.制备权利要求8所述复合物的方法，其包括将权利要求1所述的细胞膜穿透肽hPP8与所述生物分子直接连接或通过接头连接，得到所述复合物，优选的，所述生物分子选自核酸、寡肽、多肽、蛋白质、糖类、脂质和小分子以及其任意的复合物。
10.权利要求8所述的复合物或通过权利要求9所述的方法制备的复合物用于生产药物、保健品、美容或护肤品、转染试剂或诊断试剂的用途。
CN201510528663.5A 2015-08-25 2015-08-25 细胞膜穿透肽hPP8及其用途 Active CN105175526B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510528663.5A CN105175526B (zh) 2015-08-25 2015-08-25 细胞膜穿透肽hPP8及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510528663.5A CN105175526B (zh) 2015-08-25 2015-08-25 细胞膜穿透肽hPP8及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105175526A true CN105175526A (zh) 2015-12-23
CN105175526B CN105175526B (zh) 2018-08-14

Family

ID=54898030

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510528663.5A Active CN105175526B (zh) 2015-08-25 2015-08-25 细胞膜穿透肽hPP8及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105175526B (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106831957A (zh) * 2017-04-17 2017-06-13 扬州大学 一种源于鸡传染性贫血病毒VP1‑aa 1‑19多肽作为高效细胞穿膜肽的应用
CN106983713A (zh) * 2017-03-31 2017-07-28 杭州哈佛赛尔干细胞技术有限公司 一种干细胞护肤组合物及其制备方法和使用方法
CN106995487A (zh) * 2017-04-17 2017-08-01 扬州大学 源于鸡传染性贫血病毒VP1‑aa 23‑43多肽作为高效细胞穿膜肽的应用
CN111499759A (zh) * 2019-01-31 2020-08-07 上海科技大学 一种具有细胞穿膜性的锌指蛋白-乳铁蛋白融合蛋白质及其制备与应用
CN112457379A (zh) * 2020-11-23 2021-03-09 台州学院 一种源于鸭圆环病毒Cap蛋白的细胞穿膜肽及其设计方法和应用
CN113166216A (zh) * 2018-12-19 2021-07-23 韩国化学研究院 源自人lrrc24蛋白的跨膜结构域
CN114106132A (zh) * 2021-11-25 2022-03-01 中国人民解放军国防科技大学 一种细胞膜穿透肽RfA1-3L2M及其应用
CN114395016A (zh) * 2022-01-19 2022-04-26 中国石油大学(华东) 一种作为蛋白质和/或核酸胞内递送载体的多肽及应用
CN116589555A (zh) * 2023-03-31 2023-08-15 广东医科大学 一种细胞穿梭肽及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102827254A (zh) * 2012-07-30 2012-12-19 三峡大学 细胞穿膜肽hPP10及其用途
CN102863516A (zh) * 2012-07-30 2013-01-09 三峡大学 细胞穿膜肽hPP10的生产及其介导质粒DNA转染的方法
CN103304637A (zh) * 2013-05-04 2013-09-18 三峡大学 细胞穿膜肽hPP3及其用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102827254A (zh) * 2012-07-30 2012-12-19 三峡大学 细胞穿膜肽hPP10及其用途
CN102863516A (zh) * 2012-07-30 2013-01-09 三峡大学 细胞穿膜肽hPP10的生产及其介导质粒DNA转染的方法
CN103304637A (zh) * 2013-05-04 2013-09-18 三峡大学 细胞穿膜肽hPP3及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FREDERIC HEITZ等: "Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics", 《BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY》 *
马红辉等: "植物同源结构域(PHD 结构域)—组蛋白密码的解读器", 《生物化学与生物物理进展》 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106983713A (zh) * 2017-03-31 2017-07-28 杭州哈佛赛尔干细胞技术有限公司 一种干细胞护肤组合物及其制备方法和使用方法
CN106983713B (zh) * 2017-03-31 2020-06-26 杭州哈佛赛尔干细胞技术有限公司 一种干细胞护肤组合物及其制备方法和使用方法
CN106831957A (zh) * 2017-04-17 2017-06-13 扬州大学 一种源于鸡传染性贫血病毒VP1‑aa 1‑19多肽作为高效细胞穿膜肽的应用
CN106995487A (zh) * 2017-04-17 2017-08-01 扬州大学 源于鸡传染性贫血病毒VP1‑aa 23‑43多肽作为高效细胞穿膜肽的应用
CN106831957B (zh) * 2017-04-17 2019-12-03 扬州大学 一种源于鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽作为高效细胞穿膜肽的应用
CN106995487B (zh) * 2017-04-17 2019-12-03 扬州大学 源于鸡传染性贫血病毒VP1-aa 23-43多肽作为高效细胞穿膜肽的应用
CN113166216A (zh) * 2018-12-19 2021-07-23 韩国化学研究院 源自人lrrc24蛋白的跨膜结构域
CN111499759A (zh) * 2019-01-31 2020-08-07 上海科技大学 一种具有细胞穿膜性的锌指蛋白-乳铁蛋白融合蛋白质及其制备与应用
CN111499759B (zh) * 2019-01-31 2022-12-20 上海科技大学 一种具有细胞穿膜性的锌指蛋白-乳铁蛋白融合蛋白质及其制备与应用
CN112457379A (zh) * 2020-11-23 2021-03-09 台州学院 一种源于鸭圆环病毒Cap蛋白的细胞穿膜肽及其设计方法和应用
CN114106132A (zh) * 2021-11-25 2022-03-01 中国人民解放军国防科技大学 一种细胞膜穿透肽RfA1-3L2M及其应用
CN114106132B (zh) * 2021-11-25 2024-04-16 中国人民解放军国防科技大学 一种细胞膜穿透肽RfA1-3L2M及其应用
CN114395016A (zh) * 2022-01-19 2022-04-26 中国石油大学(华东) 一种作为蛋白质和/或核酸胞内递送载体的多肽及应用
CN114395016B (zh) * 2022-01-19 2023-11-24 中国石油大学(华东) 一种作为蛋白质和/或核酸胞内递送载体的多肽及应用
CN116589555A (zh) * 2023-03-31 2023-08-15 广东医科大学 一种细胞穿梭肽及其应用
CN116589555B (zh) * 2023-03-31 2024-02-06 广东医科大学 一种细胞穿梭肽及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105175526B (zh) 2018-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105175526A (zh) 细胞膜穿透肽hPP8及其用途
CN103304637B (zh) 细胞穿膜肽hPP3及其用途
CN105112383A (zh) 细胞膜穿透肽hPP5及其用途
CN102827254B (zh) 细胞穿膜肽hPP10及其用途
CN102863516B (zh) 细胞穿膜肽hPP10的生产及其介导质粒DNA转染的方法
CN105263506B (zh) 稳定的人免疫缺陷病毒(HIV)包膜(EnV)三聚体疫苗及其使用方法
Geng et al. Emerging landscape of cell-penetrating peptide-mediated nucleic acid delivery and their utility in imaging, gene-editing, and RNA-sequencing
CN112675202A (zh) 一种基于靶向配基细胞偶联技术的抗肿瘤免疫细胞及其制备方法与应用
CN108752425A (zh) 利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法
CN105555799A (zh) 一种trail穿膜肽样突变体、制备方法及应用
WO2023087823A1 (zh) 一种线粒体定位多肽、定位系统及其应用
CN102816246B (zh) 一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法和用途
CN104328138A (zh) 基因组靶标目的基因的定向敲除的方法及试剂盒
Xia et al. PM1-loaded recombinant human H-ferritin nanocages: A novel pH-responsive sensing platform for the identification of cancer cells
CN107417772B (zh) 一种可拮抗hnRNPU蛋白RNA结合活性的多肽HIP-20及其应用
CN101643511A (zh) 抑制端粒酶活性的融合蛋白、其制备及应用
CN102731658B (zh) 一种Tat PTD-Endostatin重组蛋白及其制备方法与应用
US20100173840A1 (en) Pharmaceutical Composition for Treating Autoimmune, Allergic and Inflammatory Diseases and Delivery Method Thereof
CN106478785A (zh) 一种鸡贫血病毒凋亡素融合重组蛋白及其制备方法和应用
CN106132986B (zh) TRAIL穿膜肽样突变体MuR5、制备方法及应用
CN103360497A (zh) 一种新型抗肿瘤融合蛋白疫苗及其制备方法和应用
RU2290204C1 (ru) Рекомбинантный гибридный белок, препарат для иммунотерапии на его основе и способ иммунотерапии рецидивирующего папилломатоза гортани
CN102477096B (zh) 分子伴侣功能的人肌酸激酶单链抗体
CN109207488B (zh) 利用肿瘤特异性启动子介导的pe38kdel基因表达质粒的构建方法及应用
CN106913864A (zh) 融合蛋白tat‑dcf1的新用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210813

Address after: 518000 No. 330-332, third floor, comprehensive Xinxing phase I, No. 1, Haihong Road, Fubao community, Fubao street, Futian District, Shenzhen, Guangdong Province

Patentee after: Shenzhen Zhenzhen Biomedical Technology Co.,Ltd.

Address before: 443002 No. 8, University Road, Yichang, Hubei

Patentee before: CHINA THREE GORGES University

TR01 Transfer of patent right