CN103304637B - 细胞穿膜肽hPP3及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，涉及一种人源性细胞穿膜肽hPP3及其用途。本发明所提供的细胞穿膜肽hPP3具有穿透细胞膜的功能，可携带蛋白质等大分子跨膜进入多种细胞内；且由于该肽段来源于人类蛋白，引起人体免疫反应的可能性小，潜在的不安全因素相对少，因此hPP3是一种极具开发前景的可用于蛋白、多肽等生物活性分子的跨膜运输载体，可用作细胞内药物运输载体。

Description

细胞穿膜肽hPP3及其用途

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体讲，涉及一种细胞穿膜肽及其用途。

背景技术

随着人类基因组计划的完成和蛋白质组学的兴起，人们发现越来越多的生物分子比如蛋白质、多肽、核酸等均有可能成为治疗药物。但是与传统药物不同的是，这些治疗分子在体内稳定性低，需要在胞内发挥功能的分子难以进入细胞，因而会限制其作为药物的推广应用。故开发能有效携带这些治疗性生物大分子进入靶细胞，且经济、安全的载体系统是亟需解决的问题。

近年来，非病毒药物运输载体以其安全性、低毒性、低免疫反应等优点被寄予厚望。迄今比较常用的生物大分子细胞内导入方式有电穿孔、脂质体转染和有机高分子纳米颗粒等。但可能存在着安全隐患如对细胞的毒性作用、胞内释放困难、难于组装及操作、难于应用到个体等这样或那样的缺点。因此寻找新型的、理想的非病毒药物输送系统引起了学者们的广泛兴趣（图1）。

在过去的20多年间，将核酸、多肽、蛋白等具有治疗作用的生物活性大分子跨膜转运至细胞内技术的基础研究取得了突破性进展。国内外学者在对一些病毒感染特性的研究中相继发现了一类蛋白结构域，如：HIV-1Tat（48～60）、VP22（267～300）以及果蝇蛋白ANTP（43～58）等具有介导异源蛋白、寡聚核酸、金属螯合物等生物活性大分子直接跨过细胞膜进入胞浆和核内的功能，这一类富含阳离子、具有穿膜功能的短肽被称之为细胞膜穿透肽（cell-penetrating peptides，CPP）、穿膜肽或蛋白转导域（proteintransduction domains，PTDs）。1988年Green和Frankel等首次发现TAT——人免疫缺陷病毒（HIV）的转录调节蛋白可以穿透细胞膜/核膜进入细胞浆/细胞核，随后的研究发现，该蛋白第48-60位氨基酸残基（YGRKKRRQRRR）形成的肽段即可完全发挥其穿膜功能。以后又相继发现了多个源自病毒或其它生物的CPP，如I型单纯疱疹病毒（herpes simplexvirus type1,HSV-1）蛋白的VP22、果蝇同源触角蛋白（drosophila hemeoproteinantennapedia transcription protein,ANTP）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的前S抗原等。依据其来源不同可将已经发现的CPP大致分为两类：一类为如上面提及的TAT、VP22、ANTP和前S抗原来源于病毒的短肽等；另一类为根据天然CPP的特点人工合成的短肽如多聚精氨酸、MPG、PEP-1、MAP、transportan和各种基于不同信号序列合成的肽段等。CPP能在体外或体内作为载药多肽，介导一系列生物活性分子如DNA、siRNA、多肽、蛋白质甚至纳米颗粒等进入细胞，发挥各自的生物学效应。这些CPP因其本身具有低毒、副作用小、不干扰所携带大分子生物活性等特点，被广泛用于体外或/和体内向细胞内运送生物活性分子，尤其是在抗肿瘤治疗的应用研究方面更是引人注目。CPP研究在基础生物学和应用研究上都具有极大意义，作为一种有效的胞内运载工具，有着广泛的应用前景（图2）。

然而来源于病毒或其他种属生物蛋白结构域的CPP，在临床应用上可能仍然存在一定的安全隐患，比如可能的细胞毒性和免疫原性问题。人们对TAT作为CPP进行了大量研究，腹腔注射Tat-β-半乳糖苷酶，能进入小鼠各种脏器组织，甚至可以透过血脑屏障进入脑组织。但由于TAT源于HIV病毒蛋白而恐存有安全忧患，一直未能用于临床研究。另有报道称，应用TAT携带药物的上呼吸道喷雾引发了严重的肺部病理反应。可见，针对不同治疗需要，开发更为安全的、新型穿膜肽－－人源性穿膜肽（hCPP）是非常必要的。

2002年，Beck-Sickinger AG小组开创性地发现了第一个人源性穿膜肽－－来源于人降血钙素（hCT）的第9-32的残基。随后相继报道的人源性穿膜肽还有来自于hCLOCK蛋白（一种与生物节律调节有关的蛋白，2004年）、Hph-1(一种人源转录因子，2006年)、Bag-1蛋白（一种可与Bcl-2相互作用的激活糖皮质激素受体的蛋白，2006年）、p14ARF蛋白（一种人抑癌基因蛋白，2008年）、人乳铁蛋白（2009年）、人Cytc77-101及Cytc86-101（2010年）和TCTP蛋白（来源于人翻译控制肿瘤蛋白氨基末端10个氨基酸残基，2011年）的CPP等。与其它物种蛋白来源的CPP相比，人源性CPP引起人体的免疫反应的可能性小，潜在的不安全因素相对少，作为人类疾病治疗的药物载体，具有绝对优势，有着更广阔的开发、应用前景。

Futaki S等发现穿膜肽的穿膜能力与多肽序列中精氨酸残基的数量和位置有很大的相关性。我们在从事细胞穿膜肽研究中，通过对蛋白数据库中一级结构的检索、分析发现人源性的细胞核小体蛋白SP140-like蛋白（nuclear body protein SP140-like protein）的一段长为16个氨基酸的短肽的一级结构富含属于碱性氨基酸的精氨酸和赖氨酸，分布着很强的正电荷，这与大多数已知CPP的结构特点很相似，继而分析其二级结构，发现它可形成经典的α-螺旋构象。推测这段短肽可能是具有自主穿膜功能的新型的人源性穿膜肽。我们继而合成了这段短肽并命名为hPP3，观察了其对培养细胞的穿膜效率，细胞毒性及穿膜机制，同时还观察、评估了其向细胞内递送绿色荧光蛋白（GFP）的效果，为hPP3作为一种新型人源性药物运输载体的开发提供了科学依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的细胞穿膜肽hPP3，本发明提供的细胞穿膜肽hPP3是源于人类细胞核小体蛋白SP140-like蛋白的一段多肽序列，其具有细胞膜穿透能力。

本发明所述穿膜肽的多肽序列包含SEQ ID NO：1所示的序列，即Lys-Pro-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Gly-His-Gly-Trp-Ser-Arg（SEQ ID NO：1）（赖氨酸-脯氨酸-赖氨酸-精氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-甘氨酸-组氨酸-甘氨酸-色氨酸-丝氨酸-精氨酸）。本发明所述的细胞穿膜肽hPP3，其为合成的或重组的。

本发明还提供了合成的或重组的融合蛋白，该融合蛋白由细胞穿膜肽hPP3与可用作药物的蛋白连接获得。

含有所述细胞穿膜肽hPP3的表达载体，含有所述细胞穿膜肽hPP3或所述表达载体的转基因细胞系、重组菌或重组病毒也均属于本发明的保护范围。

我们首次发现这一肽段具有穿透细胞膜的功能，并可携带蛋白等跨膜进入体外多种细胞（包括贴壁培养细胞、悬浮培养细胞以及原代培养细胞等）内，是一种极具开发前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜运输载体。因此，本发明还提供了所述细胞穿膜肽hPP3可用作药物运输载体的用途或在制备药物运输载体中的应用，特别是用作细胞内药物运输载体的应用，其中所述药物运输载体携带生物分子跨膜进入细胞，这些细胞包括贴壁培养细胞、悬浮培养细胞、原代培养细胞等。其中，所述生物分子可以是核酸、多肽、蛋白质、糖类、脂质、和小分子以及其任意的复合物。

本发明还提供了包含药物运输载体的复合物，其特征在于所述药物运输载体为所述的细胞穿膜肽hPP3。本发明还提供了一种制备所述复合物的方法，是将所述的细胞穿膜肽hPP3与生物分子连接，得到所述复合物。其中所述生物分子可来自核酸、多肽、蛋白质、糖类、脂质、纳米颗粒和小分子以及其任意的复合物；所述复合物适合用于生产药物、保健品、美容或护肤品原料、转染试剂或诊断试剂。

本发明还提供了包含药物运输载体的细胞内药物，其特征在于所述药物运输载体为所述的细胞穿膜肽hPP3。本发明还提供了一种制备细胞内药物的方法，是将所述的细胞穿膜肽hPP3与可用作药物的生物分子连接，得到所述细胞内药物。所述生物分子为生物活性分子，如DNA、siRNA、多肽、蛋白质甚至纳米颗粒，特别是抗肿瘤活性分子；所述细胞内药物可用于离体细胞，也可以用于体内细胞。

本发明的优点在于，与其它生物蛋白来源的CPP相比，作为人源性CPP的hPP3引起人体的免疫反应的可能性小，潜在的不安全因素相对少。因此，作为临床应用的药物分子载体有着更为广阔的应用前景。

附图说明

图1是新型治疗分子胞内递送策略示意图。

图2是细胞穿膜肽（CPP）及其可携带入胞的生物药物的工作原理示意图。

图3是本发明的新型人源性细胞穿膜肽hPP3的二级轮状结构示意图。

图4是本发明的新型人源性细胞穿膜肽hPP3的二级结构中存在的螺旋及折叠分析示意图。

图5是本发明的新型人源性细胞穿膜肽hPP3的原核表达及纯化结果的电泳照片。其中，泳道M为：标准蛋白分子量；泳道1为：pET15b-hPP3质粒转化细菌IPTG诱导前裂解液；泳道2为：pET15b-hPP3质粒转化细菌IPTG诱导后裂解液；泳道3为：纯化后的hPP3-6×His（六聚组氨酸为纯化用标签，多聚组氨酸也有助于提高穿膜效率）。

图6是荧光标记的hPP3（hPP3-FITC）穿膜进入不同细胞后胞内荧光分布情况，其中，A为hPP3-FITC穿膜进入HeLa，MG63，ECV-304细胞后胞内荧光分布情况，B为hPP3-FITC穿膜进入HeLa，MG63，ECV-304细胞后胞内荧光定量以及与经典穿膜肽TAT-FITC比较。

图7是hPP3-FITC穿膜进入原代小鼠脾细胞后胞内荧光分布情况。

图8为不同浓度的hPP3-FITC的穿膜效率。其中，A：ECV-304胞内荧光镜下观察；B：ECV-304胞内荧光定量。

图9表示孵育时间、血清对hPP3-FITC入胞的影响，以及细胞活力分析。其中，A：hPP3-FITC短时间孵育后的荧光定量；B：hPP3-FITC长时间孵育后的荧光定量；C：血清对hPP3-FITC入胞影响的荧光定量；D：不同浓度的hPP3对细胞活力影响的定量分析。

图10表示不同细胞经DMSO预处理对hPP3-FITC穿膜效率的影响。其中，A：DMSO预处理各种不同类型细胞后胞内荧光分布情况；B：DMSO预处理不同培养细胞后的胞内荧光定量；C：不同DMSO浓度预处理各种不同类型细胞后胞内荧光分布情况；D：不同DMSO浓度预处理不同培养细胞后的胞内荧光定量。

图11表示pET15b-hPP3-GFP重组质粒构建和Nde I/BamH I的双酶切鉴定。其中，泳道M为：标准蛋白分子量；泳道1：pET15b-hPP3-GFP的Nde I/BamH I的双酶切；泳道2：pET15b-hPP3-GFP。

图12表示SDS-PAGE分析IPTG诱导pET15b-GFP、pET15b-hPP3-GFP在Rosetta细菌中的表达及纯化。其中，泳道M为：标准蛋白分子量；泳道3和4分别为：纯化的GFP和hPP3-GFP融合蛋白；泳道2和5分别为：GFP和hPP3-GFP质粒转化细菌经IPTG诱导；泳道1和6分别为：GFP和hPP3-GFP质粒转化细菌未经IPTG诱导。

图13表示hPP3-GFP融合蛋白穿膜进入L929细胞的分布情况。

图14表示hPP3-GFP融合蛋白穿膜进入原代小鼠脾细胞的分布情况。

图15表示不同温度下荧光短肽在胞内的含量，不同内吞抑制剂对hPP3穿膜效率影响。其中，A：不同温度下hPP3-FITC穿膜进入胞内荧光分布情况；B：不同温度下hPP3-FITC穿膜进入胞内荧光定量分析；C：肝素钠处理各种不同类型细胞后胞内荧光强度；D：氯喹预处理不同培养细胞后胞内荧光强度；E：氯丙嗪处理不同培养细胞后的胞内荧光强度；F：叠氮化钠处理不同培养细胞后的胞内荧光强度。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次或以上重复实验，结果取平均值。

实施例1、CPP一级结构、二级结构分析，预测、鉴定新型人源性CPP：

1、对本发明获得的细胞穿膜肽hPP3的二级结构进行分析，采用了emboss的在线分析程序（其分析程序请参见网页：http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/pepwheel在线分析多肽的轮状结构；http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/help/garnier在线分析二级结构的螺旋、折叠等）。hPP3的轮状结构示意图，螺旋、折叠结构示意图分别如图3和图4所示。

为了便于研究hPP3的细胞穿膜功能：

化学合成了绿色荧光标记的hPP3：

Lys-Pro-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Gly-His-Gly-Trp-Ser-Arg-FITC（hPP3-FITC）；

和无绿色荧光标记hPP3：

Lys-Pro-Lys-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Gly-His-Gly-Trp-Ser-Arg(hPP3，SEQ IDNO：1)。

纯化定量、冷冻保存备用。

2、hPP3的合成途径有两种：1）化学合成；2）基因工程表达。

hPP3源于自然蛋白，可以在实验室水平或工业水平进行合成。

2.1化学合成方法：此种方法是选择羧基树脂（Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin），采用固相Fmoc法合成。具体合成步骤如下：

（1）用Fmoc基团对α-氨基进行保护的赖氨酸通过一个支臂连结到不溶性载体王氏树脂（Wang resin）上；

（2）用TFA（三氟乙酸）溶液洗涤赖氨酸―支臂―树脂，使α-氨基脱保护；

（3）将第二个预先用适当的缩合剂DCC活化的α-氨基保护的异亮氨酸通过耦联反应与赖氨酸形成共酯连接上去；

（4）用TFA（三氟乙酸）溶液洗涤异亮氨酸―支臂―树脂，使α-氨基脱保护；

（5）将第三个预先用适当的缩合剂DCC活化的α-氨基保护的脯氨酸通过耦联反应与异亮氨酸形成共酯连接上去。重复进行上述脱保护、耦联，直到耦合上最后一个氨基酸——精氨酸，脱去Fmoc保护基团，合成完成。

（6）将切割试剂加入到肽——树脂中，把肽链从树脂上切割下来，同时也将各个氨基酸上的侧链保护基团从肽链上切割下来，加入乙醚，沉淀多肽，获得多肽粗品。运用HPLC/MS进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽。

2.2基因工程表达法：采用原核表达方法，具体操作如下：

（1）设计编码hPP3的两条单链cDNA，两侧带有Nde I和Xho I酶切位点，交由上海生工公司合成单链寡聚核苷酸链，再将两条单链DNA等量加入水溶液中，经95℃5min，自然冷却至室温使其完成退火，形成互补的双链DNA片段（hPP3）；

（2）利用Nde I/Xho I两种限制性内切酶进行双酶切，37℃温育2h，将表达质粒pET15b（购自Novagen）线性化；

（3）进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪的长波紫外光照射下，切胶回收含线性化质粒pET15b的条带。瞬时离心，将凝胶集中至管底，依切胶回收试剂盒内的操作说明完成切胶回收；

（4）将回收、纯化的线性化质粒DNA片段和退火后的穿膜肽cDNA片段（hPP3）分别进行琼脂糖凝胶电泳，确定连接比例，置于16℃水浴箱中温育过夜连接；

（5）用CaCl₂法制备DH5α感受态细胞，用热休克法以上述连接产物pET15b-hPP3转化感受态细胞，经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜筛选后，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；

（6）离心沉淀收集扩增转化细菌，用碱裂解法提取重组质粒，筛选成功构建的阳性克隆pET15b-hPP3，酶切并测序验证；

（7）将验证正确的重组原核质粒pET15b-hPP3转化Rosetta感受态细菌。经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜；

（8）挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素LB培养基，37℃振荡培养过夜；

（9）用15ml无菌离心管装3.8ml Amp(+)LB液体培养基，接种0.2ml对数生长期的菌悬液（1:20）。37℃，250rpm继续培养3h；

（10）于对数生长期细菌培养物中加入40μl0.1M IPTG至终浓度1.0mM，37℃，250rpm继续培养；

（11）在加入IPTG后6h取样200μl菌悬液；

（12）离心收集沉淀，用等体积1×Sample Buffer重悬，沸水浴5min。制备的菌体全蛋白上样样品；

（13）SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况，如图5所示确认的重组表达及纯化。

3、hPP3具有强穿膜效能：

3.1hPP3-FITC具有显著穿膜特征并在胞内分布均匀；

3.1.1hPP3-FITC可以穿膜进入体外培养的肿瘤等细胞并在细胞内均匀分布，具有显著穿膜特征；

取对数生长期的三种培养细胞系：ECV-304、HeLa和MG63（人胚胎血管内皮细胞、人子宫颈癌细胞和人成骨肉瘤细胞），依1×10⁵个细胞/孔的密度接种于12孔板常规培养，设实验组及对照组；

至对数生长期（80%密度）时，换成无血清的RPMI-1640培养液继续培养1h；

加入终浓度10μM hPP3-FITC，常规培养1h；

弃去培养液，PBS洗涤3次；

荧光显微镜下观察培养细胞内荧光及其胞内定位情况。

结果见图6，荧光显微镜观察发现，未经hPP3-FITC处理的各种细胞内无绿色荧光。在经hPP3-FITC温育后，可在胞内见到明显绿色荧光，且这三种不同细胞系均有明显胞内荧光，提示hPP3穿膜进入细胞没有明显细胞嗜向性。

3.1.2hPP3-FITC对小鼠脾细胞有穿膜特征

新鲜采取、分离的健康小鼠脾细胞，依1×10⁵个细胞/孔的密度接种于12孔板，设实验组及对照组；

在培养箱中常规培养2h后，换成无血清的RPMI-1640培养液继续培养1h；

加入终浓度10μM hPP3-FITC，常规培养1h；

弃去孵育液，PBS洗涤3次；

荧光显微镜下观察培养细胞内荧光及其胞内定位情况。

结果见图7：荧光显微镜观察发现，未经hPP3-FITC处理的小鼠脾细胞内不见绿色荧光；在经hPP3-FITC温育后，可见到明显的胞内绿色荧光，提示hPP3可高效穿膜进入新鲜制备的小鼠脾细胞。

3.2hPP3-FITC穿膜进入细胞具有浓度依赖性

ECV-304细胞在经无血清的RPMI-1640处理1h后，加入浓度梯度的hPP3-FITC（2.5μM、5.0μM、7.5μM、10.0μM）孵育1h后，PBS清洗3次，观察培养细胞内荧光情况。并采用荧光酶标仪检测细胞内荧光密度数值，具体方法如下：细胞在经不同浓度hPP3-FITC孵育结束后，PBS清洗3次，按300μl/孔加入0.1M NaOH，室温裂解细胞10min，1000rpm离心3min。取细胞裂解液上清50μl于96孔板在荧光酶标仪中，激发光/吸收光为490nm/520nm下测定荧光密度值。实验重复3次取平均值。在实验中，采用经典的穿膜肽TAT-FITC作为阳性对照。

图8A显示，胞内荧光强度随hPP3-FITC浓度升高而增强，并且可见相同浓度下，胞内hPP3-FITC荧光比TAT-FITC强。图8B可见，随着hPP3-FITC浓度的升高，胞内荧光强度随之增强，提示hPP3-FITC穿膜进入细胞具有浓度依赖性。当hPP3-FITC浓度为5μM时，荧光强度已经比较高，在后续实验中均选用了5μM的hPP3-FITC作为终浓度进行实验。

3.3hPP3胞内持续时间显著长于TAT

HepG2、ECV-304、PC3、HeLa在经无血清的RPMI-1640培养处理1h后，加入终浓度为5μM的hPP3-FITC分别孵育0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、10h、20h及30h后。PBS洗涤三次，裂解细胞，依前述方法用荧光酶标仪检测490nm/520nm检测细胞裂解液上清荧光值。实验均重复3次取平均值。

不同的培养细胞随着hPP3-FITC孵育时间的延长，其荧光值均有所增强，至2h其荧光值为最高（图9A）。为了进一步确定hPP3-FITC在胞内维持时间，将孵育时间延长至30h。发现hPP3-FITC在HepG2（人肝癌细胞株）、ECV-304、PC3（人前列腺癌细胞株）和HeLa等细胞系中可以维持至至少30h（图9B）。本研究显示新型人源性穿膜肽hPP3在胞内维持时间至少可达30h，而TAT仅能维持短短几小时，显著短于hPP3。一般情况下血清的存在会影响细胞对穿膜肽的内吞摄取。通过荧光定量检测发现，血清的存在对hPP3-FITC穿膜入胞有较大影响。无血清组hPP3穿膜效率明显高于有血清组（P＜0.05）；结果显示血清的存在影响hPP3的穿膜效率（图9C）。

3.4DMSO预处理促进hPP3穿膜进入培养细胞

取对数生长期贴壁培养细胞HeLa、MG63、ECV-304，按照1×10⁵个细胞/孔的接种密度接种于12孔板进行常规培养。每种细胞均分设实验组及对照组；

至对数生长期（80%密度）时，换为无血清的RPMI-1640培养液，再培养1h；

每孔加入终浓度为5%的DMSO，继续培养1h。加入终浓度为5μM的hPP3-FITC或TAT-FITC后，孵育1h；

弃去培养液，PBS洗涤3次；

荧光显微镜下观察HeLa、MG63、ECV-304胞内荧光及其胞内定位情况，或按每孔加入300μl0.1M NaOH，室温裂解ECV-304，Caski或B16细胞10min，1000rpm离心3min。取细胞裂解液上清50μl到96孔板于荧光酶标仪，于490nm/520nm下测定荧光吸光值。实验重复3次取平均值。

本发明人前期研究发现DMSO可以明显增强TAT穿膜效率，在此，也观察了DMSO对新型人源性穿膜肽hPP3的穿膜影响。通过荧光显微镜观察发现，DMSO对hPP3-FITC穿膜具有明显增强效果。经DMSO预处理后，hPP3-FITC在胞内显示高密度绿色荧光，且均匀分布于胞浆和胞核。荧光定量检测发现，5%DMSO预处理后，hPP3-FITC的胞内荧光强度较未经DMSO预处理细胞强（图10A-B），并且在一定的范围内具有DMSO的剂量依赖性（图10C-D）。提示5%DMSO预处理细胞明显促进了hPP3和TAT的穿膜效率，DMSO能够显著增强CPP的穿膜效率且无细胞特异性（图10）。

实施例2、hPP3对细胞活力影响甚微

（1）取对数生长期培养细胞ECV-304和HepG2，以1×10⁴个细胞/孔的接种密度接种于96孔板常规培养，每孔100μl，每种细胞设3个复孔，37℃培养；

（2）至对数生长期，培养液换成无血清的RPMI-1640培养液，继续培养1h；

（3）分别换成hPP3浓度梯度为10μM、20μM、30μM、40μM及50μM无血清的RPMI-1640培养液，继续培养24h；

（4）孵育时间结束后，按每孔100μl加入PBS洗涤，2min×3次；

（5）每孔加入80μl含血清的正常培养液及20μl MTT（母液浓度5mg/ml，即0.5%MTT）溶液，于37℃继续培养4h，终止培养后吸去培养液。以200μl/孔加入二甲基亚砜，振荡10min至结晶物充分溶解后用全波长酶标仪上检测波长为570nm的吸光值A，每组取3个复孔的平均值。测定OD490。重复3次，计算细胞存活率。

（6）细胞生存率的计算如下：

细胞生存率＝（实验孔OD值－对照孔OD值－空白孔OD值）／（对照孔OD值－空白孔OD值）×100%。

为明确hPP3处理细胞是否会影响其活力，本实验采用MTT法测定不同浓度hPP3处理24h后对细胞活力的影响情况。ECV-304和HepG2细胞经不同浓度hPP3处理后MTT分析数据显示，浓度高于20μM的hPP3长时间处理细胞后细胞依然保持在75%以上，对细胞的活力影响甚微（图9D）。这提示有效浓度（小于5μM）范围内hPP3-FITC并不影响细胞活力。

实施例3、pET15b-hPP3-GFP质粒构建，融合蛋白的表达及纯化和其穿膜功效的研究

3.1pET15b-hPP3-GFP重组质粒的构建和酶切鉴定

（1）设计编码hPP3的两条单链cDNA，两侧带有Nde I和Xho I酶切位点，交由上海生工公司合成单链寡聚核苷酸链，再将两条单链DNA等量加入水溶液中，经95℃，5min，自然冷却至室温使其完成退火，形成互补的双链DNA片段（hPP3）；同时设计一对引物以pEGFP（购自Clontech公司）为模板，PCR获得GFP蛋白基因片段，两侧分别有Xho I和BamH I酶切位点，纯化PCR产物备用；

（2）利用BamH I/Nde I两种限制性内切酶进行双酶切，37℃温育2h，将表达质粒pET15b（购自Novagen）线性化；

（3）进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪的长波紫外光照射下，切胶回收含线性化质粒pET15b的条带；瞬时离心，将凝胶集中至管底，依切胶回收试剂盒内的操作说明完成切胶回收；

（4）将回收、纯化的线性化质粒DNA片段和退火后的穿膜肽cDNA片段（hPP3）、以及GFP基因片段分别进行琼脂糖凝胶电泳，确定连接比例，置于16℃水浴箱中温育过夜连接；

（5）用CaCl₂法制备DH5α感受态细胞，用热休克法以上述连接产物pET15b-hPP3转化感受态细胞，经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜筛选后，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；

（6）离心沉淀收集扩增转化细菌，用碱裂解法提取重组质粒，筛选成功构建的阳性克隆pET15b-hPP3-GFP，酶切并测序验证；

利用Nde I/BamH I双酶切鉴定重组质粒pET15b-hPP3-GFP得到酶切产物理论值为783bp（图11），片段与预期大小一致；经测序确认无突变。说明原核表达质粒pET15b-hPP3-GFP构建成功。再用相同方法构建得到pET15b-GFP和pET15b-TAT-GFP。

3.2融合蛋白的表达及纯化

3.2.1融合蛋白的原核表达

（1）将成功构建的重组质粒pET15b-GFP和pET15b-hPP3-GFP分别转化Rosetta感受态细胞。经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜；

（2）挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素LB培养基，37℃振荡培养过夜；

（3）用15ml无菌离心管装3.8ml LB(+)^Amp液体培养基，接种0.2ml对数生长期的菌悬液（1:20）。37℃，250rpm继续培养3h；

（4）于对数生长期细菌培养物中加入40μl0.1M IPTG至终浓度1.0mM，37℃，250rpm继续培养；

（5）在加入IPTG后6h取样200μl菌悬液；

（6）离心收集沉淀，用等体积1×Sample Buffer重悬，沸水浴5min。制备的菌体全蛋白上样样品；

（7）SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况。

3.2.2融合蛋白的纯化

3.2.2.1大量诱导：用1L培养瓶中盛300ml LB(+)^Amp液体培养基，诱导表达可溶性的重组蛋白（1.0mM IPTG，30℃，250rpm，9h）。4℃6500rpm×10min，收集沉淀并称重，-40℃保存备用。

3.2.2.2咪唑纯化

（1）超声裂解：平均100ml菌液用15ml Lysis/Binding Buffer（300mM NaCl，50mMNaH₂PO₄，10mM咪唑，pH8.0）重悬，冰浴。超声功率300～600W，超声2sec，间隔2sec，工作90次。如此循环12～20次，至均匀破碎细菌于悬浮溶液；

（2）12000rpm×20min，4℃，转移上清至15ml离心管中；

（3）结合：用3～5倍体积的Lysis/Binding Buffer在15ml离心管中平衡Ni-NTA，离心收集Ni-NTA，再用与沉淀等体积的Lysis/Binding Buffer重悬，即已平衡的50%Ni-NTA。取1～4ml50%Ni-NTA与裂解上清混合，在分子杂交炉中37℃转动结合1～2h；

（4）洗涤脱除杂蛋白：用至少1/2菌液体积的Wash Buffer(300mM NaCl，50mMNaH₂PO₄，20～30mM咪唑，pH8.0）洗脱杂蛋白。收集前3～5ml穿柱液，取样备做检测；

（5）洗脱靶蛋白：共用5～10ml Elution Buffer（300mM NaCl，50mM NaH₂PO₄，250mM咪唑，pH8.0）,每次加0.5ml，用1.5ml离心管收集；

（6）保存：在96孔板中，各取5μl样品与195μl考马斯亮蓝G-250溶液混合，比较颜色深浅。留存颜色最深的数管，分别添加100～200μl无菌甘油，混匀后于-40℃保存，并取样备做检测。

GFP和hPP3-GFP融合蛋白相对分子质量分别为30KD和31.5KD。阳性克隆在1.0mM IPTG诱导6h后，经SDS-PAGE分析所表达的融合蛋白，在35KD附近出现一条强表达带，符合预期分子质量大小（图12）。基因工程表达蛋白的纯化是利用6×His标签，通过Ni-NTA亲和层析得到有效纯化，融合蛋白的纯度大于80%。图12显示得到了纯化的GFP和hPP3-GFP蛋白。

3.3hPP3-GFP融合蛋白穿膜功效的研究

3.3.1hPP3-GFP融合蛋白跨膜进入贴壁培养细胞内的能力研究

（1）取对数生长期培养细胞L929（小鼠成纤维细胞株），按照1×10⁵个细胞/孔的接种密度接种于12孔板常规培养。每种细胞均分设实验组及对照组；

（2）待细胞生长至80%融合时，换为无血清的培养液，继续培养1h；

（3）每孔加入终浓度为5%DMSO，继续常规培养1h；

（4）实验组加入终浓度为1.25、2.5、5.0μM的融合蛋白hPP3-GFP，阴性对照组加入相同浓度的蛋白GFP。37℃培养箱孵育1h；

（5）弃去后以上清培养液，PBS洗涤三次；

（6）置于荧光显微镜下观察hPP3-GFP融合蛋白穿膜及胞内定位情况。

L929细胞中加入hPP3-GFP融合蛋白孵育1h后，荧光显微镜下观察到细胞内清晰明亮的绿色荧光，胞内荧光分布均匀（图13）；经5%DMSO预处理L929细胞后胞内hPP3-GFP荧光明显增强。显示hPP3可携带大分子（绿色荧光蛋白）高效穿膜进入细胞，5%DMSO预处理可显著增强hPP3携带绿色荧光蛋白跨膜进入细胞。

3.3.2hPP3-GFP融合蛋白跨膜进入小鼠脾细胞的穿膜能力研究

（1）新鲜采取、分离制备人外周血淋巴细胞，按照1×10⁵个细胞/孔的接种密度接种于12孔板，设实验组及对照组；

（2）将12孔板在培养箱中静置2h后，换成无血清的RPMI-1640培养液继续培养1h；

（3）实验组加入终浓度为5μM的融合蛋白hPP3-GFP，阴性对照组加入相同浓度的GFP蛋白，37℃培养箱孵育1h；

（4）弃去以培养液，PBS洗涤三次；

（5）置于荧光显微镜下观察hPP3-GFP融合蛋白穿膜及胞内定位情况。

新鲜采取、分离制备的小鼠脾细胞经RPMI-1640预处理后，加入hPP3-GFP融合蛋白，荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光，胞内荧光分布均匀（图14）。

本研究提示hPP3不仅自身可以穿膜进入细胞，也可通过融合蛋白形式携带大分子蛋白（GFP）跨膜进入贴壁培养细胞和人外周血淋巴细胞。所以这一研究结果为将来开发由hPP3作为载体向细胞内递送大分子蛋白药物提供了基础。

实施例4、hPP3穿膜机制

1）低温促进hPP3-FITC穿膜

使用不同的培养细胞，如Cos7、Caski及PC3在经无血清的RPMI-1640处理1h后，加入终浓度为5μM的hPP3-FITC分别在4℃和37℃两个条件下孵育1h后，PBS清洗3次，依前述方法裂解细胞取其上清检测490nm/520nm波长处的荧光吸光值。实验重复3次取平均值。

一般认为细胞内吞途径是能量依赖的，低温时细胞的能量代谢几乎停滞，也即低温能够阻断细胞内吞途径。若hPP3穿膜方式是通过内吞途径实现，那么温度的变化必然会影响胞内荧光含量。本实验选用在4℃和37℃两个条件探索温度是否影响其穿膜方式。图15A-B表明，低温对hPP3穿膜几乎没有影响。提示hPP3短肽本身穿膜可能与内吞机制无关。

2）肝素显著降低hPP3穿膜效率

观察四种内吞抑制剂对hPP3-FITC的穿膜影响，肝素（钠盐）（PBS溶解，终浓度10μM）、氯喹（PBS溶解，终浓度10μM）、氯丙嗪（PBS溶解，终浓度30μM）、叠氮化钠（PBS溶解，终浓度10μM）配成母液，0.22μm滤膜过滤灭菌。四种不同的培养细胞Caski、ECV-304、和PC3在用无血清的RPMI-1640培养1h后，细胞中分别加入终浓度的四种内吞抑制剂，继续孵育30min，加入终浓度为5μM的hPP3-FITC孵育1h，移除培养基，PBS清洗3次，依前述方法置于荧光酶标仪中，检测490nm/520nm的荧光吸光值。实验重复3次取平均值。

实验通过培养细胞与不同的内吞抑制剂孵育，考察内吞抑制剂对hPP3入胞情况的影响。其中肝素为细胞膜表面硫酸蛋白聚糖的竞争抑制剂；氯喹为抑制内含体酸化的内吞调节剂；氯丙嗪为笼型蛋白依赖的内吞抑制剂；叠氮化钠为ATPase抑制剂。从图15C中看出，在加入肝素（钠盐）后，细胞对hPP3的摄取大幅度降低。提示肝素能显著抑制hPP3被摄取进入细胞，细胞膜表面的硫酸蛋白聚糖对hPP3穿膜进入细胞发挥着重要作用。图15D、15E和15F显示，氯喹、氯丙嗪和叠氮化钠对hPP3穿膜进入细胞的影响均不明显。提示hPP3穿膜进入细胞的过程中需要与细胞膜表面硫酸蛋白聚糖等负电荷分子相互作用，可能不依赖笼型蛋白介导的内吞和内含体酸化以及非能量依耐性机制。

结论：我们在对现有CPP结构进行系统分析的基础上，通过对蛋白质数据库进行检索，预测和二级结构分析等方法，发现一全新的人源性蛋白衍生的细胞膜穿透肽（hCPP），命名为hPP3。人工合成hPP3以及原核表达其与绿色荧光蛋白的融合蛋白（hPP3-GFP）进行了一系列体外实验研究。发现hPP3具有较强的穿膜能力，并可携带大分子GFP跨膜进入包括肿瘤细胞等贴壁培养细胞，原代细胞等多种培养细胞和小鼠脾细胞，而不影响所携带生物活性分子的功能，对细胞基本无毒副作用。显示hPP3作为一种新的人源性细胞穿膜肽，能用于体外和体内向细胞内运送生物活性分子（如蛋白质、多肽等药物）。hPP3的开发将为科研（体外培养细胞的蛋白转导）、临床治疗（向细胞内递送蛋白或多肽药物）提供又一新型胞内运输工具。

SEQUENCE LISTING

<110>  三峡大学

<120>  细胞穿膜肽hPP3及其用途

<130>  2013

<160>  1

<170>  PatentIn version3.3

<210>  1

<211>  16

<212>  PRT

<213>  人

<400>  1

Lys Pro Lys Arg Lys Arg Arg Lys Lys Lys Gly His Gly Trp Ser Arg

1                 5                      10                     15

Claims (10)

1.细胞穿膜肽hPP3，其特征在于：该细胞穿膜肽hPP3是源于人类细胞核小体蛋白SP140-like蛋白的一段多肽序列，其具有细胞膜穿透能力，其多肽序列为SEQ ID NO：1所示的序列。

2.合成的或重组的融合蛋白，该融合蛋白由权利要求1所述的细胞穿膜肽hPP3与可用作药物的蛋白连接获得。

3.含有权利要求1所述细胞穿膜肽hPP3或权利要求2所述融合蛋白的表达载体。

4.含有权利要求1所述细胞穿膜肽hPP3、权利要求2所述融合蛋白、或权利要求3所述表达载体的转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

5.权利要求1所述细胞穿膜肽hPP3用作药物运输载体的用途。

6.权利要求5所述的用途，其中所述药物运输载体携带生物分子跨膜进入细胞。

7.包含药物运输载体的复合物，其特征在于所述药物运输载体为权利要求1所述细胞穿膜肽hPP3。

8.制备权利要求7所述复合物的方法，是将权利要求1所述细胞穿膜肽hPP3与生物分子连接，得到所述复合物。

9.权利要求8所述的方法，其中所述生物分子选自核酸、多肽、糖类、脂质和小分子以及其任意的复合物。

10.权利要求8所述的方法，其中所述复合物适合用于生产药物、保健品、美容或护肤品原材料、转染试剂或诊断试剂。