CN109096403A

CN109096403A - 一种用于蛋白质转导的蛋白质载体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109096403A
Application number: CN201810721739.XA
Authority: CN
Inventors: 傅玲琳; 谢梦华; 王彦波; 王翀; 周瑾茹; 王飞飞; 王顺余; 钱怡; 黄健健
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2018-07-04
Filing date: 2018-07-04
Publication date: 2018-12-28
Anticipated expiration: 2038-07-04
Also published as: CN109096403B

Abstract

本发明公开了一种用于蛋白质转导的蛋白质载体及其制备方法和应用。本发明的蛋白质载体采用基因工程手段，将具有促进与之融合表达的外源蛋白溶解性的麦芽糖结合蛋白(MBP)、无毒却具有跨膜功能的霍乱毒素B亚基(CTB)以及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达，得到无毒的、可溶性表达且具有跨膜作用的多亚基蛋白MCTB‑EGFP，并可将EGFP替换为其他蛋白，通过与细胞共同孵育，即可使外源蛋白进入细胞，从而研究细胞内的多种机理以及进行相关细胞治疗。

Description

一种用于蛋白质转导的蛋白质载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，特别是涉及一种用于蛋白质转导的蛋白质载体及其制备方法和应用。

背景技术

在生物学和医学领域，常用蛋白质、抗体、酶、多肽等研究细胞内活动(细胞内物质运输、表达调控)以及进行细胞内治疗，但它们无法透过细胞膜，同时较难非破坏性地将这些外源大分子输入活细胞中，因而限制了它们的应用。

目前在实验及临床上，大多采用转染的方法将外源蛋白的DNA转入细胞内，但是转染的方法只适用于少数特定的细胞，如HEK 293T细胞，应用范围有限，且对于一般细胞而言，转染效率非常低。

另外，有些研究者利用病毒携带外源蛋白进入细胞，虽然能使外源蛋白有效进入细胞，但是病毒可能对细胞产生毒害，且病毒基因可能会整合到细胞的基因组DNA上，不安全因素较大。因此，寻求一种无毒无害、安全可靠、高效率可携带外源蛋白进入多种细胞的方法具有广阔的应用前景。

2006年，日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)利用病毒载体将四个转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞，从而提出了诱导多能干细胞(IPS)，目前IPS技术快速发展，有望应用于器官移植、建立疾病模型，了解发病机理、治疗某些基因遗传病等。目前对于诱导多能干细胞的形成大多也是采用导入DNA的方法，但同样存在外源DNA整合到基因组的风险，从安全性出发，更适合采用一种无毒且能直接将外源蛋白等诱导物导入细胞。

蛋白质类物质由于其低毒性、高活性，且特异性强，已经成为生物及医药产品中的重要一部分。但是由于其无法直接跨过细胞膜，利用胞吞作用进入细胞效率很低，使其在生物技术研究、医用给药方面的应用极大受限。霍乱弧菌产生的CT是当今研究最多且最深入的黏膜佐剂之一，具有很强的黏膜佐剂活性。它是一种AB₅型蛋白毒素，由1个A亚基(CTA)和5个B亚基(CTB)组成。CTA亚基具有毒性，而CTB亚基无毒，可以与真核生物细胞膜上的GM1神经节苷脂相结合，从而促进与之相连的CTA亚基进入细胞。中国专利申请CN201410578270.0公开了一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质，其获得CTB5/EGFP-CTA2-TAT嵌合蛋白，也是通过模拟CT结构的跨膜作用，将外源药物靶向导入脑部。该发明为得到目的蛋白，构建了PET-22b-EGFP-CTA2-TAT与PET-28a-CTB两个表达载体，利用两个质粒的不相容抗性表达获得目的蛋白。但是目的蛋白含有CTA，可能具有潜在的毒理作用，存在一定的安全隐患和风险。此外，该发明只说明目的蛋白可将药物靶向导入脑部，对于其能否进入其他部位或者细胞并未有说明，应用领域具有局限性。

基于上述现有技术中存在亟需解决的问题，一种新的既能安全可靠地直接将外源蛋白导入细胞，又能应用于药物的靶向给药的载体的设计与开发十分迫切。本发明开发了一种用于蛋白质转导的蛋白质载体，该蛋白质载体结构简单，安全无毒，适合多种蛋白、多肽等的转导，为研究细胞内活动(细胞内物质运输、表达调控)以及进行细胞内治疗提供一种新的、安全有效的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于蛋白质转导的蛋白质载体。

本发明的另一目的是提供该蛋白质载体的制备方法

本发明的再一目的是提供该蛋白质载体的用途。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于蛋白质转导的蛋白质载体，其特征在于，该蛋白载体的氨基酸载体如SEQID NO.1所示的MCTB-EGFP构成。

一种用于蛋白质转导的蛋白质载体，其特征在于该蛋白质载体由一个氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的MBP亚基，一个氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的CTB亚基以及一个氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的EGFP亚基构成。

麦芽糖结合蛋白(MBP)是大肠杆菌麦芽糖转运系统的成员之一，主要负责麦芽糖的摄取及分解代谢。MBP融合蛋白原核表达载体表达效率高、易于纯化。本发明采用MBP能够促进蛋白质载体与其融合表达的外源蛋白的溶解性。

霍乱弧菌产生的霍乱毒素(CT)是一种AB₅型蛋白毒素，它由1个A亚基(CTA)和5个B亚基(CTB)组成，常作为黏膜佐剂广泛应用于动物模型构建。但CT中的CTA具有毒性，而CTB无毒。单独的CTB为包涵体表达，不具有生物学活性，一般均需将CTB和CTA同时表达，使其形成CT才具有生物学活性，本发明利用MBP与CTB连接，既将CTB从CT中分离出来，大大简便了实验操作，又使CTB为可溶性表达，具备生物学活性，解决了现有技术中的蛋白质载体对细胞存在潜在毒副作用的问题。

一种用于蛋白质转导的蛋白质载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用PCR法或基因合成法获得MBP、EGFP以及CTB的编码序列DNA；

(2)将上述DNA插入pGEX-4T-1中，替换pGEX-4T-1质粒中原有的GST标签，获得重组质粒pEX-4T-MBP-CTB-EGFP；

(3)将重组质粒pEX-4T-MBP-CTB-EGFP导入大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下表达重组蛋白；

(4)纯化，得到蛋白质载体MCTB-EGFP。

进一步地，所述步骤(1)具体为：利用PCR法从pMAL-c2x质粒中获得MBP基因片段，利用PCR法从pCMV-C-EGFP质粒中获得EGFP基因片段，利用基因合成得到同源片段1-CTB-同源片段2基因。

进一步地，所述步骤(2)具体为：对MBP亚基进行PCR扩增，通过同源重组的方法将MBP片段克隆至质粒pGEX-4T-1中，且替换掉质粒中原有的GST标签，获得重组质粒pEX-4T-MBP；对EGFP亚基进行PCR扩增，通过Mre I酶切位点连入pEX-4T-MBP载体中，获得重组质粒pEX-4T-MBP-EGFP；对CTB亚基进行扩增，利用CTB基因两端的同源片段，采用同源重组将CTB基因插入pEX-4T-MBP-EGFP载体中Not I克隆位点，获得重组质粒pEX-4T-MBP-CTB-EGFP。

进一步地，所述步骤(3)具体为：将pEX-4T-MBP-CTB-EGFP转入大肠杆菌BL21感受态中，在1‰Amp抗生素压力下涂布LB琼脂平板，选择稳定存在的单菌落，再次经过菌液菌落PCR、PCR鉴定，获得能稳定传代的工程菌；然后在含1‰Amp抗生素的LB肉汤中接入获得的工程菌，摇菌培养，在培养基中加入IPTG，然后转移至16℃继续培养；离心后于沉淀中加入裂解液，并结合超声破碎，离心取上清液。

进一步地，所述步骤(4)采用Ni柱纯化。

一种用于蛋白质转导的蛋白质载体的应用，通过基因工程手段用待转导的外源蛋白质替换蛋白质载体中的EGFP获得重组蛋白，将重组蛋白与目标细胞共同孵育，重组蛋白穿过细胞膜，进入细胞内部。

进一步地，所述外源蛋白包括原肌球蛋白(TM)、精氨酸激酶(AK)、卵清蛋白(OVA)、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc以及Cas9等。

进一步地，所述目标细胞包括HEK 293T细胞、RBL-2H3细胞、LAD2细胞、Caco-2细胞或HeLa细胞。

本发明利用无毒的霍乱毒素B亚基为跨膜载体，利用基因工程技术在其前端插入具有促溶功能的MBP蛋白，使原为包涵体表达的CTB蛋白部分可溶，并可在CTB后端接入其他蛋白，通过与细胞共同孵育，即可使外源蛋白进入细胞，从而研究细胞内的多种机理以及进行相关细胞治疗。

CTB能够与真核细胞上的神经节苷脂(GM1)结合，从而将整个蛋白分子“固定”于细胞表面，且CTB能增加细胞膜的通透性，从而促进蛋白进入细胞。

本发明可直接携带外源蛋白进入多种真核生物细胞内，无需导入DNA，不存在外源DNA整合到细胞基因组DNA上的风险，而且蛋白本身无毒，在细胞内可降解，对细胞无毒副作用。

本发明的有益效果：

(1)本发明利用麦芽糖结合蛋白(MBP)能够促进与其融合表达的外援蛋白的溶解性特点，将其与霍乱毒素中无毒但具有黏膜佐剂功能的B亚基(CTB)连接，获得一种简单的、无毒的、具有携带外源蛋白进入多种细胞的多亚基蛋白，为研究细胞内活动(细胞内物质运输、表达调控)以及进行细胞内治疗提供一种新的、安全有效的方法。

(2)本发明通过基因筛选、密码子优化、基因合成得到一条适合在大肠杆菌中表达的CTB亚基，并将其插入质粒pEX-4T-MBP-EGFP中，利用MBP的促溶功能使其适宜在大肠杆菌中可溶性表达。

(3)本发明制备方法采用大肠杆菌作为表达宿主菌，转化效率高，目的蛋白表达量可达到120mg/L细菌培养液。

附图说明

图1是pEX-4T-MBP-EGFP质粒构建流程图；

图2是转化后MBP基因的菌液PCR产物琼脂糖电泳图；

图3是MBP-EGFP基因的菌液PCR产物琼脂糖电泳图；

图4是pEX-4T-MBP-CTB-EGFP质粒构建流程图；

图5是转化后MBP-CTB-EGFP基因的菌液PCR产物琼脂糖电泳图；

图6是转化后CTB-EGFP基因的菌液PCR产物琼脂糖电泳图；

图7是MCTB-EGFP融合蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图8是MCTB-EGFP进出细胞图；

图9是MCTB-TM融合蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图10是MCTB-TM蛋白致敏的Balb/c小鼠血清中TM特异性IgE含量。

具体实施方式

以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。

具体实施方式中所用到的生物材料及来源：

(1)载体pGEX-4T-1：南京金斯瑞公司购买；

(2)大肠杆菌BL21感受态细胞：生工生物工程(上海)股份有限公司购买；

(3)CTB基因：由通用生物系统(安徽)有限公司合成。

具体实施方式中用于蛋白质转导的蛋白质载体的一般制备步骤如下：

(1)基因设计与获得

麦芽糖结合蛋白(MBP)基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用PCR法从pMAL-c2x质粒中获得MBP基因片段。增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因，其氨基酸序列如SEQID NO.4所示，。利用PCR法从pCMV-C-EGFP质粒中获得EGFP基因片段。霍乱毒素B亚基(CTB)基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。通过NCBI搜索CTB基因序列，优化序列使其适宜在大肠杆菌中表达，并在其前后两端插入20bp目的载体(pEX-4T-MBP-EGFP)中克隆位点的同源片段(含限制性酶切位点)，利用基因合成得到同源片段1-CTB-同源片段2基因，由通用生物系统(安徽)有限公司合成。

(2)基因工程菌的构建

采用Primer premier 5.0专业引物设计软件设计引物如SEQ ID NO.8-9所示，对SEQ ID NO.5进行PCR扩增，通过同源重组的方法将MBP片段克隆至质粒pGEX-4T-1中，且替换掉质粒中原有的GST标签，通过质粒提取、菌落PCR、菌液PCR，测序鉴定，获得重组质粒pEX-4T-MBP。

采用Primer premier 5.0专业引物设计软件设计引物如SEQ ID NO.10-11所示，对SEQ ID NO.7进行PCR扩增，通过Mre I酶切位点连入pEX-4T-MBP载体中，转化至大肠杆菌Stbl3感受态中，1‰Amp抗生素压力下筛选稳定生长的单菌落，进行质粒提取、菌落PCR、菌液PCR，测序鉴定，获得重组质粒pEX-4T-MBP-EGFP。

采用Primer premier 5.0专业引物设计软件设计引物如SEQ ID NO.12-13所示，对SEQ ID NO.6进行PCR扩增，利用CTB基因两端的同源片段，采用同源重组将CTB基因插入pEX-4T-MBP-EGFP载体中Not I克隆位点，转化至大肠杆菌Stbl3感受态中，1‰Amp抗生素压力下筛选稳定生长的单菌落，进行质粒提取，菌落PCR、菌液PCR，测序鉴定，获得重组质粒pEX-4T-MBP-CTB-EGFP。

将pEX-4T-MBP-CTB-EGFP转入大肠杆菌BL21感受态中，在1‰Amp抗生素压力下涂布LB琼脂平板，选择稳定存在的单菌落，再次经过菌液菌落PCR、PCR鉴定，获得能稳定传代的工程菌。

(3)融合蛋白的表达和纯化

在含1‰Amp抗生素的LB肉汤中接入获得的工程菌，在37℃下摇菌培养3h后，在培养基中加入TPTG，然后转移至16℃培养16h；离心后于沉淀中加入裂解液，并结合超声破碎，离心取上清。CTB本为包涵体表达，但在连接MBP后，变为可溶性表达，无需进行包涵体复性，可直接采用Ni柱纯化得到目的蛋白。

实施例1质粒载体pEX-4T-MBP-EGFP的构建

用PCR方法从野生型含MBP、EGFP的质粒中分别获得MBP和EGFP基因片段，先将MBP基因片段(氨基酸序列如SEQ ID NO.2，DNA序列如SEQ ID NO.5)克隆到pGEX-4T-1载体中，替换载体中原有的GST标签，并在其后插入多个酶切位点，获得重组质粒pEX-4T-MBP，然后将EGFP基因片段(氨基酸序列如SEQ ID NO.4，DNA序列如SEQ ID NO.7)插入MBP后的Mre I酶切位点后，获得重组质粒pEX-4T-MBP-EGFP，其构建图如图1所示，具体实验步骤如下：

(1)MBP替换GST标签：

表1 MBP基因片段的PCR试剂用量

试剂用量如表1所示，首先用限制性酶Msc I和Not I切断原pGEX-4T-1中GST蛋白所在序列。同时利用同源重组原理，在MBP片段原有的上游引物中加入pGEX-4T-1中GST所在位置的前20bp的同源序列，下游引物加入Not I位点后20bp的同源序列，采用引物如：

Forward:5’—TCACACAGGAAACAGTATTC(同源序列上游)+ATGAAAATCGAAGAAGGTAA(MBP上游引物)—3’，SEQ ID NO.8；

Reverse:5’—GTACGTCAGTCAGTCACGAT(同源序列下游)+TGCGCCGGCGCCTGCGGCCG(MBP下游引物)—3’，SEQ ID NO.9；

对MBP基因序列进行PCR扩增，PCR反应条件见表2，采用高保真PCR试剂盒(南京诺唯赞公司)，PCR反应体系(50μL)：

表2 MBP基因片段的PCR反应条件

PCR产物经Dnp I酶切，加热使酶失活。后将线性化的pGEX-4T-1质粒与MBP的PCR产物用ClonII One Step Cloning Kit试剂盒(南京诺唯赞公司)进行同源重组。重组产物立刻转化导入大肠杆菌Stbl3中，涂布与LB琼脂(含1‰Amp)上，于37℃培养16h后挑取单菌落，接种于5mL LB肉汤(含1‰Amp)于37℃，200r/min，培养16h后进行菌液PCR，PCR产物琼脂糖电泳图如图2所示，1-3泳道为PCR成功的不同菌落的菌液。之后利用细菌质粒提取试剂盒(上海生工有限公司)提取转化成功组中的质粒。

(2)插入EGFP基因片段

各试剂用量如表3所示，首先用限制性酶Mre I切断质粒pGEX-4T-1-MBP，使其线性化。同时利用同源重组的方法，在EGFP片段原有的引物中加入pGEX-4T-1-MBP中Not I位点的前后各20bp的同源序列，且在上游插入Not I，采用引物如：

Forward:5’—CGGCCGCAGGCGCCGGCGCA(同源片段+Mre I)+ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA(EGFP上游引物)—3’，SEQ ID NO.10

Reverse:5’—GTACGTCAGTCAGTCACGAT(同源片段)+GATATCTCAGTGGTGGTGGT(EGFP下游引物)—3’SEQ ID NO.11；

对EGFP基因序列进行PCR扩增，PCR反应条件见表4，采用高保真PCR试剂盒，PCR反应体系(50μL)：

表3 EGFP基因片段的PCR反应试剂用量

表4 EGFP基因片段的PCR反应条件：

PCR产物经Dnp I酶切，加热使酶失活。将线性化的pGEX-4T-MBP质粒与EGFP的PCR产物用ClonII One Step Cloning Kit试剂盒进行同源重组。重组产物立刻转化导入大肠杆菌Stbl3中，涂布与LB琼脂(含1‰Amp)上，于37℃培养16h后挑取单菌落，接种于5mL LB肉汤(含1‰Amp)于37℃，200r/min，培养16h后进行菌液PCR(采用MBP的上游引物，EGFP的下游引物)，MBP-EGFP基因片段的PCR产物琼脂糖电泳图如图3所示，1-4泳道为不同单菌落的菌液。之后利用细菌质粒提取试剂盒提取转化成功组中的质粒

实施例2质粒载体pEX-4T-MBP-CTB-EGFP的构建

pEX-4T-MBP-CTB-EGFP的构建流程图如图4所示。试剂用量见表5，通过NCBI搜索CTB基因序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.3，DNA序列如SEQ ID NO.6)，优化序列使其适宜在大肠杆菌中表达，并在其前后两端插入20bp目的载体(pEX-4T-MBP-EGFP)中克隆位点(NotI位点)的同源片段(含限制性酶切位点)，由通用生物系统(安徽)有限公司合成得到同源片段1-CTB-同源片段2基因。采用引物：

Forward:5’—ACAAGGACGACGATGACAAG—3’，SEQ ID NO.12；

Reverse:5’—TGGTGATGATGATGATGATG—3’，SEQ ID NO.13；

对同源片段1-CTB-同源片段2基因进行PCR扩增，扩增条件见表6，采用高保真PCR试剂盒，PCR反应体系(50μL)：

表5试剂用量

表6 PCR反应条件

PCR产物经Dnp I酶切，加热使酶失活。将pGEX-4T-MBP质粒采用Not I酶线性化后，与同源片段1-CTB-同源片段2基因的PCR产物采用ClonII One Step Cloning Kit试剂盒进行同源重组。重组产物立刻转化导入大肠杆菌Stbl3中，涂布与LB琼脂(含1‰Amp)上，于37℃培养16h后挑取单菌落，接种于5mL LB肉汤(含1‰Amp)于37℃，200r/min，培养16h后进行菌液PCR(采用MBP的上游引物，EGFP的下游引物)，MBP-CTB-EGFP基因片段的PCR产物琼脂糖电泳图如图5所示，1-3泳道为PCR成功的不同菌落的菌液；CTB-EGFP基因片段的PCR产物琼脂糖电泳图如图6所示，1-4泳道为不同单菌落的菌液。之后将PCR成功的几组菌液进行测序，比对测序结果，将成功重组的组别再次转接到LB肉汤(含1‰Amp)中，于37℃，200r/min，培养16h后提取质粒，获得重组质粒pEX-4T-MBP-CTB-EGFP。

实施例3重组蛋白在大肠杆菌中表达

(1)获得工程菌

将实施例2中获得的重组质粒pEX-4T-MBP-CTB-EGFP转化到大肠杆菌BL21中，涂布与LB琼脂(含1‰Amp)上，于37℃培养16h后挑取单菌落，接种于5mL LB肉汤(含1‰Amp)于37℃，200r/min，培养16h，获得工程菌。

(2)诱导

将1中获得的工程菌按照1∶100接入300mL的LB肉汤(含1‰Amp)中，于37℃，200r/min，培养至OD₆₀₀为0.6-1.0(约3h)时，加入IPTG(终浓度为0.1mmol/L)，立即放置于16℃，200r/min，培养16-24h。4000r/min，20min，室温离心收集菌体，称重。

(3)酶解结合超声破碎

按照菌体湿重：酶解液(含0.2mg/mL溶菌酶，20μg/mL DNAse，1mM MgCl₂，1mMPMSF)为1：30的比例加入酶解液，吹打使菌体悬浮，然后置于4℃裂解30min；在冰浴，超声2s、间歇5s条件下，用超声破碎机将裂解液超声5min，至液体颜色均一、无粘稠团聚物质。20000×g，20min离心，收集上清，用0.45μm滤膜过滤。

(4)Ni-NTA亲和柱纯化蛋白

(4.1)取适量的Ni-NTA树脂到柱中。存储缓冲液通过重力流出。

(4.2)将蛋白提取物与Binding/wash buffer混匀，使总体积相当于两个柱体积。

(4.3)用两倍柱体积的Binding/wash buffer平衡柱子。使用0.5～1mL/min流速，使缓冲液排出树脂。

(4.4)将蛋白提取物与Binding/wash buffer混匀，加入柱子。收集流穿液到离心管中。如有需要样品可再次上样，重新流通一次。

(4.5)用两倍柱体积的Binding/wash buffer清洗柱子并收集流穿液。使用一个新的收集管重复这个步骤，直到流穿液的吸光度280n m接近基线。

(4.6)用两倍柱体积的Elution buffer洗脱柱上的组氨酸标签蛋白。此步骤重复两次，每次的洗脱液分别保存。

(4.7)在4℃下，将洗脱液放置于PBS缓冲液中透析24h，中间更换3次PBS缓冲液。

(4.8)用BCA试剂盒测定蛋白含量，再进行SDS-PAGE，SDS-PAGE电泳图如图7所示。上样量为10μL，1泳道样品稀释1000倍，2号泳道样品稀释50倍。

实施例4目的蛋白(MCTB-EGFP)穿细胞膜活性鉴定

取对数生长期的HEK293T细胞消化后，以每孔0.5mL接种于24孔板，培养1d后，直接加入过0.22μm滤膜的目的蛋白，终浓度为4μmol/L，作用5h后，用无菌PBS洗涤3次，直接用荧光显微镜观察细胞。同时利用转染的方法将目的蛋白的基因转染HEK293T细胞内，同时作用5h，作为对照。荧光显微镜观察的细胞图如图8所示。

实施例5 MCTB与过敏原蛋白融合表达促进食物过敏动物模型构建成功

将甲壳类水产品主要过敏原——原肌球蛋白(tropomyosin，TM)替换EGFP，获得MCTB-TM融合蛋白，利用MCTB的黏膜佐剂效果，在Balb/c小鼠模型中，促进小鼠肠道黏膜部位TM的吸收率，增加过敏原的免疫原性及致敏性，从而提高食物致敏口服致敏小鼠模型的成功率，并降低过敏原的剂量。MCTB-TM蛋白的SDS-PAGE的电泳图如图9所示，上样量为10μL，1泳道样品稀释100倍，2号泳道样品稀释50倍。

而食物过敏口服致敏Balb/c小鼠血清中TM特异性免疫球蛋白E(sIgE)如图10所示，PBS组为空白对照组，MCTB-TM即融合蛋白致敏组，CTB+TM(L)为与MCTB-TM等剂量的市售CTB与虾中提取的TM简单混合致敏组，CTB+TM(H)为与MCTB-TM 4倍剂量的市售CTB与虾中提取的TM简单混合致敏组。如图所示，MCTB-TM融合蛋白有效地提高了小鼠的致敏效果，显著降低了过敏原的使用剂量，大大缩短了构建食物过敏动物模型的前期工作量。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

序列表

<110> 浙江工商大学

<120> 一种用于蛋白质转导的蛋白质载体及其制备方法和应用

<130> 2018.7.2

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 772

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 1

Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys

1 5 10 15

Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr

20 25 30

Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe

35 40 45

Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala

50 55 60

His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile

65 70 75 80

Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp

85 90 95

Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu

100 105 110

Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys

115 120 125

Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro

145 150 155 160

Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly

180 185 190

Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp

195 200 205

Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala

210 215 220

Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys

225 230 235 240

Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser

245 250 255

Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro

260 265 270

Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp

275 280 285

Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala

290 295 300

Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala

305 310 315 320

Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln

325 330 335

Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala

340 345 350

Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn

355 360 365

Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile

370 375 380

Glu Gly Arg Ile Phe Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Asp Tyr

385 390 395 400

Lys Asp Asp Asp Asp Lys Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala

405 410 415

Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser

420 425 430

Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe

435 440 445

Lys Asn Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile

450 455 460

Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile

465 470 475 480

Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn

485 490 495

Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Ala Ala Ala

500 505 510

Gly Ala Gly Ala Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val

515 520 525

Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe

530 535 540

Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr

545 550 555 560

Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr

565 570 575

Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro

580 585 590

Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly

595 600 605

Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys

610 615 620

Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile

625 630 635 640

Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His

645 650 655

Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp

660 665 670

Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile

675 680 685

Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro

690 695 700

Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr

705 710 715 720

Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val

725 730 735

Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu

740 745 750

Leu Tyr Lys Gly Ala Gly Leu Ala Ile Ala His His His His His His

755 760 765

His His His His

770

<210> 2

<211> 413

<212> PRT

<213> 人工()

<400> 2

Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys

1 5 10 15

Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr

20 25 30

Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe

35 40 45

Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala

50 55 60

His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile

65 70 75 80

Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp

85 90 95

Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu

100 105 110

Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys

115 120 125

Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro

145 150 155 160

Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly

180 185 190

Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp

195 200 205

Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala

210 215 220

Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys

225 230 235 240

Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser

245 250 255

Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro

260 265 270

Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp

275 280 285

Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala

290 295 300

Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala

305 310 315 320

Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln

325 330 335

Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala

340 345 350

Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn

355 360 365

Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile

370 375 380

Glu Gly Arg Ile Phe Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Asp Tyr

385 390 395 400

Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala

405 410

<210> 3

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工()

<400> 3

Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln

1 5 10 15

Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala

20 25 30

Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Thr Phe

35 40 45

Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala

50 55 60

Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala

65 70 75 80

Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile

85 90 95

Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn

100

<210> 4

<211> 256

<212> PRT

<213> 人工()

<400> 4

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly

225 230 235 240

Ala Gly Leu Ala Ile Ala His His His His His His His His His His

245 250 255

<210> 5

<211> 1239

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 5

atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60

ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120

ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180

atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240

accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300

aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360

gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420

aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480

ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540

gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600

aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660

ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720

gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780

ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840

ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900

ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960

actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020

tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080

gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140

aacctcggga tcgagggaag gattttcgga tccgaaaatc tgtacttcca aggtgactac 1200

aaggacgacg atgacaaggc ggccgcaggc gccggcgca 1239

<210> 6

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 6

acccctcaga atattaccga tctgtgcgca gaatatcata atacccagat tcataccctg 60

aatgataaaa ttttcagcta taccgaaagc ctggcaggta aacgtgaaat ggcaattatt 120

acctttaaga atggcgcaac ctttcaggtg gaagttccgg gcagccagca tattgatagt 180

cagaaaaaag ccattgaacg catgaaagat accctgcgca ttgcatatct gaccgaagca 240

aaagtggaaa aactgtgtgt ttggaataat aagaccccgc atgccattgc agccattagt 300

atggccaat 309

<210> 7

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 7

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagggg 720

gccggcctag cgatcgcaca tcatcatcat catcaccacc accaccactg agatatc 777

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 8

tcacacagga aacagtattc atgaaaatcg aagaaggtaa 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 9

gtacgtcagt cagtcacgat tgcgccggcg cctgcggccg 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 10

cggccgcagg cgccggcgca atggtgagca agggcgagga 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 11

gtacgtcagt cagtcacgat gatatctcag tggtggtggt 40

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 12

acaaggacga cgatgacaag 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工()

<400> 13

tggtgatgat gatgatgatg 20

Claims

1.一种用于蛋白质转导的蛋白质载体，其特征在于，该蛋白质载体的氨基酸序列如SEQID NO.1所示的MCTB-EGFP构成。

2.根据权利要求1所述的一种用于蛋白质转导的蛋白质载体，其特征在于，该蛋白质载体由一个氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的MBP亚基，一个氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的CTB亚基以及一个氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的EGFP亚基构成。

3.一种用于蛋白质转导的蛋白质载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采用PCR法或基因合成法获得MBP、EGFP以及CTB的编码序列DNA；

(4)纯化，得到蛋白质载体MCTB-EGFP。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：利用PCR法从pMAL-c2x质粒中获得MBP基因片段，利用PCR法从pCMV-C-EGFP质粒中获得EGFP基因片段，利用基因合成得到同源片段1-CTB-同源片段2基因。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：对MBP亚基进行PCR扩增，通过同源重组的方法将MBP片段克隆至质粒pGEX-4T-1中，且替换掉质粒中原有的GST标签，获得重组质粒pEX-4T-MBP；对EGFP亚基进行PCR扩增，通过Mre I酶切位点连入pEX-4T-MBP载体中，获得重组质粒pEX-4T-MBP-EGFP；对CTB亚基进行扩增，利用CTB基因两端的同源片段，采用同源重组将CTB基因插入pEX-4T-MBP-EGFP载体中Not I克隆位点，获得重组质粒pEX-4T-MBP-CTB-EGFP。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：将pEX-4T-MBP-CTB-EGFP转入大肠杆菌BL21感受态中，在1‰Amp抗生素压力下涂布LB琼脂平板，选择稳定存在的单菌落，再次经过菌液菌落PCR、PCR鉴定，获得能稳定传代的工程菌；然后在含1‰Amp抗生素的LB肉汤中接入获得的工程菌，摇菌培养，在培养基中加入TPTG，然后转移至16℃继续培养；离心后于沉淀中加入裂解液，并结合超声破碎，离心取上清液。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)采用Ni柱纯化。

8.一种如权利要求1-7中任一项所述的用于蛋白质转导的蛋白质载体的应用，其特征在于，通过基因工程手段用待转导的外源蛋白质替换蛋白质载体中的EGFP获得重组蛋白，将重组蛋白与目标细胞共同孵育，重组蛋白穿过细胞膜，进入细胞内部。

9.一种如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述外源蛋白包括原肌球蛋白(TM)、精氨酸激酶(AK)、卵清蛋白(OVA)、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc以及Cas9等。

10.一种如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述目标细胞包括HEK293T细胞、RBL-2H3细胞、LAD2细胞、Caco-2细胞或HeLa细胞。