CN113087804B

CN113087804B - 一种二价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用

Info

Publication number: CN113087804B
Application number: CN201911335390.7A
Authority: CN
Inventors: 孙爱友; 王立群; 乔长晟; 王众
Original assignee: Suzhou Yishuimo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Heqifeng Ecological Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN113087804A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及二价融合蛋白HrpN189‑NAC及其生产方法和应用。所述HrpN189‑NAC蛋白，是hrpN蛋白N端的1‑189个氨基酸HrpN189和新生多肽相关复合体α亚基NAC的融合体。融合体同时具有HrpN和NAC两种蛋白的功能，具有二价植物免疫蛋白的特性，其能激发烟叶产生超敏反应的枯斑面积明显高于HrpN以及NAC；并且能快速激发植物的免疫反应，提高植物抗病能力，促进植物生长，增加果实产量。且与单独的HrpN189和单独的NAC相比，HrpN189‑NAC单位浓度的活性更高、适用的植物种类更多、功能更加全面。且蛋白稳定性极高，煮沸60分钟，活性无明显变化。

Description

一种二价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及一种二价植物免疫融合蛋白的基因工程菌的构建、蛋白的制备和应用。具体涉及二价融合蛋白HrpN189-NAC、基因序列、制备方法及在提高植物的免疫力和抗逆性、促进植物的发芽和生长中的应用。

技术背景：

1992年，康奈尔大学研究者Wei等对解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)进行基因簇分析鉴定，克隆表达出一种分子量约为44KD的蛋白hrpN，对应的基因名称为hrpN，能够在非寄主烟草叶片中激发超敏反应，并使烟草产生系统获得性抗性。hrpN蛋白含有403个氨基酸，其中能引起超敏反应的区域包括从第32位氨基酸延伸到第74位氨基酸区域和从第130位氨基酸延伸到第189位氨基酸区域。2008年，研究者Sinn和Oh研究证明了hrpN蛋白N端的1-189个氨基酸HrpN189能够诱导烟草叶片的超敏反应。

互隔交链孢霉(Alternaria sp.)是一类重要的植物病原真菌，能引起多种植物病害。从该菌中分离得到的新生多肽相关复合体(nascent polypeptide-associatedcomplex，NAC)由α-NAC和β-NAC共2个亚基组成，体内和体外实验证实，NAC(尤其是α-NAC)可以形成一个稳定的异源复合体，其能够在蛋白质翻译过程中阻止新生多肽在合成之后与错误的蛋白分子结合。NAC具有蛋白翻译和基因转录的双重功能，同时也是新生多肽从细胞质中进入内质网和线粒体的一个桥梁。近年来，NAC在植物促生长、诱导免疫等方面的研究也取得了快速发展。如，可以增加烟草细胞中叶绿素的含量、促进植物的生长；对植物的花器官的形成和种子发育也具有明显的促进作用；能够增强植物在高盐、干旱等胁迫环境下的生存能力；促进植物体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等的生成，显著激发植物的免疫反应等。

无论是hrpN基因表达的hrpN植物免疫蛋白，还是NAC基因表达的NAC蛋白以及NAC的衍生物，对植物的免疫激发受体和免疫激发传导路径都有各自的局限性。开发更全面、性能更强的免疫蛋白势在必行。

发明内容：

为了解决上述问题，本发明首先提供一种二价植物免疫融合蛋白，所述二价植物免疫融合蛋白命名为HrpN189-NAC蛋白，是来源于解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)的hrpN蛋白N端的1-189个氨基酸HrpN189和来源于互隔交链孢霉(Alternaria sp.)的新生多肽相关复合体α亚基(nascent polypeptide-associated complex,alpha subunit)NAC的融合体；

所述HrpN189-NAC蛋白具体为：

(1)序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或

(2)SEQ ID NO.1同源性75％以上的氨基酸序列；或

(3)在SEQ ID NO.1的基础上进行一个或多个氨基酸替换，和/或缺失，和/或添加后获得的具有SEQ ID NO.1相同功能的氨基酸序列；

本发明还保护编码所述HrpN189-NAC蛋白的核酸分子，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA；

进一步地，所述HrpN189-NAC蛋白的编码基因如序列表SEQ ID NO.2所示；

本发明的另一目的是提供含有上述HrpN189-NAC蛋白的编码基因的表达盒、重组载体或重组菌；

进一步地，所述重组载体的表达载体可以是pET28a质粒、pET30a质粒或pBV222质粒等；

优选地，所述重组载体的表达载体为含有T7强启动子的pET28a(+)质粒；

进一步地，所述重组菌的宿主可以是大肠杆菌DH5α、BL21或C802等；

优选地，所述重组菌的宿主为E.coli BL21(DE3)；

本发明还提供上述重组菌的构建方法，是将经过密码子优化过的HrpN189和NAC的编码基因进行融合后获得HrpN189-NAC基因，与表达载体进行酶切连接后转化入宿主细胞所得；

所述HrpN189编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述NAC编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

进一步地，HrpN189和NAC编码基因的融合是通过(G₄S)₃链接肽进行融合连接；融合后获得的序列如SEQ ID NO.2所示；

进一步地，所述重组菌以含有T7强启动子的pET28a(+)质粒为载体，以E.coliBL21(DE3)为宿主，获得基因工程菌E.coli/HrpN189-NAC；

本发明还提供融合蛋白HrpN189-NAC的生产方法，具体如下：

将构建成功的E.coli/HrpN189-NAC基因工程菌接种至发酵培养基中，待OD₆₀₀达到0.6-1.8，添加IPTG诱导表达，离心收获菌体，破碎，取破碎液上清液，经Ni-NTA亲和层析纯化后，可得纯度超过90％的HrpN189-NAC蛋白产品；

进一步地，培养条件为：以1-10％的接种量接种发酵培养基，待OD₆₀₀达到0.6-1.8，添加IPTG至终浓度0.0.1-0.6mM，15-20℃，200rpm低温诱导16-20h；经16-20h诱导后，HrpN189-NAC蛋白的得率可以达到0.1-1.5g/L发酵液；

进一步地，所述发酵培养基为含50μg/mL卡那霉素的LB培养基；

进一步地，IPTG的添加量为终浓度0.3mM。

本发明还提供所述HrpN189-NAC蛋白在促进植物生长中的应用；

优选地，所述HrpN189-NAC蛋白在促进植物生长中的应用方法如下：

将HrpN189-NAC蛋白配比成终浓度为0.125-50μg/mL的溶液，单独或与化学农药混合、与其他农药/微生物菌肥/土壤调理剂/植物刺激剂/植物提取物等混合后，进行叶面喷施或灌根，可以有效激发植物的免疫反应；

优选地，HrpN189-NAC蛋白浓度为0.25μg/mL；

优选地，施用方法为叶面喷施；

本发明还提供所述HrpN189-NAC蛋白在制备植物促生长剂中的应用；

本发明还提供所述HrpN189-NAC蛋白的编码基因，或含有所述编码基因的表达盒、重组载体或重组菌在促进植物生长中的应用；

本发明还提供所述HrpN189-NAC蛋白的编码基因，或含有所述编码基因的表达盒、重组载体或重组菌在制备植物促生长剂中的应用；

进一步地，所述植物可以为小麦、水稻、烟草、辣椒、番茄等；

上述应用可快速激发植物的免疫反应，提高植物抗病能力，促进植物生长，增加果实产量。

有益效果：

通过本发明所述的方法制备的二价融合蛋白HrpN189-NAC，同时具有HrpN和NAC两种蛋白的功能，具有二价植物免疫蛋白的特性，其能激发烟叶产生超敏反应(HR)的枯斑面积明显高于HrpN以及NAC；并且能快速激发植物的免疫反应，提高植物抗病能力，促进植物生长，增加果实产量。

与单独的HrpN189和单独的NAC相比，HrpN189-NAC二价疫苗单位浓度的活性更高、适用的植物种类更多、功能更加全面。且蛋白稳定性极高，在沸水(100℃)中煮沸60分钟，活性无明显变化。

附图说明：

图1：HrpN189-NAC基因PCR验证图

其中，M，DNA marker；1，hrpN189；2，HrpN189-NAC。

图2：HrpN189-NAC蛋白的Ni-NTA亲和层析图

其中，M，蛋白marker；1，全菌破碎液；2，破碎液上清；3，破碎液沉淀；4，过滤膜穿透液；5，50mM咪唑洗脱液；6，150mM咪唑洗脱液。

图3：HrpN189-NAC对烟草叶片的HR反应图

其中，1，PBS缓冲液；2，150μg/mLHrpN189蛋白；3，100℃水浴加热60min后的150μg/mL HrpN189蛋白；4，150μg/mL NAC蛋白；5，100℃水浴加热60min后的150μg/mL NAC蛋白；6，150μg/mLHrpN189-NAC融合蛋白；7，100℃水浴加热60min后的150μg/mL HrpN189-NAC融合蛋白。

具体实施方案：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

下述实施例的实验方法如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中所使用的实验材料及试剂，如无特别说明，均可通过商业途径购买获得。

本发明提供的HrpN189-NAC蛋白可根据氨基酸序列进行人工合成，也可通过对编码基因进行生物表达获得。

以下将结合附图及具体实施例对本发明做进一步地解释说明。

实施例1：E.coli/HrpN189-NAC基因工程菌构建

本发明提供的HrpN189-NAC蛋白可根据氨基酸序列进行人工合成，也可通过对编码基因进行生物表达获得，本实施例将以基因表达的形式为例进行解释说明。

(1)基因融合

①引物序列

NAC(SEQ ID NO.4所示)和HrpN189基因(SEQ ID NO.3所示)融合所采用的引物为NAC FP、NAC RP和HrpN189FP2、HrpN189RP，引物序列如下表所示：

所述引物NAC RP含有NAC基因3'端的25个bp、(G₄S)₃链接肽基因45个bp和HrpN189基因5'端的15个bp；

所述引物HrpN189FP2含有HrpN189基因5'端的25个bp和(G₄S)₃链接肽基因3'端的15个bp；

②基因融合

以NAC基因序列为模板，用引物NAC FP和NAC RP扩增NAC基因；以HrpN基因为模板，用引物HrpN189FP2和HrpN189RP扩增HrpN189基因；将扩增的产物进行基因融合(反应体系50μL，包含18μL的水，3μL的目的基因，2μL的前引物，2μL的后引物，25μL的2×PFU，94℃预变性90s,94℃下变性20s,60℃退火20s，72℃下延伸46s,变性、退火、延伸三个步骤循环10轮，延伸5min。)，用引物NAC FP和HrpN189 RP扩增融合得HrpN189-NAC基因.

(2)工程菌构建

表达载体为含有T7强启动子的pET28a(+)质粒，宿主为大肠杆菌BL21(DE3)，用NcoI/XhoI双酶切pET28a质粒和HrpN189-NAC基因，连接转化，经PCR验证和基因测序确定，阳性克隆即为构建成功的E.coli/HrpN189-NAC基因工程菌，PCR验证结果如图1所示。

实施例2：HrpN189-NAC二价融合蛋白的诱导表达

将重组菌株E.coli/HrpN189-NAC接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养12h制备成种子液；

按5％的接种量将种子液接种到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃继续培养，待OD₆₀₀达到1.0，添加IPTG至终浓度0.3mM，18℃，200rpm低温诱导18h；HrpN189-NAC蛋白的得率可以达到1.5g/L发酵液。

诱导结束后，8000rpm离心5min，收集菌体，破碎，8000rpm离心5min，取上清，将上清液滤膜过滤，进样Ni-NTA亲和层析柱，管中蛋白样减少一个柱体积后即取穿透样，用4个柱体积的裂解缓冲液洗涤镍柱，然后用50mM或150mM的咪唑洗脱，收集洗脱液。结果显示，150mM的咪唑可以将HrpN189-NAC蛋白完全洗脱下来，蛋白纯度约为90％。将蛋白样品进行SDS-PAGE检测，结果如图2所示，泳道6可以看到清晰的HrpN189-NAC融合蛋白，条带大小约为37kD。

实施例3：HrpN189-NAC对烟草叶片HR反应的检测

将HrpN189-NAC融合蛋白产品用PBS缓冲液稀释，配置如下样品：

样品1：150μg/mL HrpN189-NAC融合蛋白；

样品2：150μg/mL HrpN189-NAC融合蛋白，100℃水浴加热60min；

阴性对照1：PBS缓冲液；

阴性对照2：150μg/mL HrpN189蛋白；

阴性对照3：150μg/mL HrpN189蛋白，100℃水浴加热60min；

阴性对照4：150μg/mL NAC蛋白；

阴性对照5：150μg/mL NAC蛋白，100℃水浴加热60min；

取上述蛋白样品和对照样品，对处于生长期的烟草叶片进行注射，每孔的注射计量均为50μl。将注射后的烟草放置在植物培养箱中，30℃培养3天，观察叶片中的枯斑大小。

结果如图3显示，HrpN189-NAC能强烈引起烟草叶片的HR反应，与同浓度的HrpN189和NAC相比，烟草叶片的枯斑面积大1倍以上；用100℃水浴处理60min后，HrpN189-NAC与HrpN189和NAC相似，并没有明显影响蛋白的生物活性，说明由于(G₄S)₃链接肽的存在，融合蛋白的空间稳定性较好，实用性强。

实施例4：HrpN189-NAC促进种子发芽和生长实验

选取健康饱满的小麦种子，随机分组，每组20粒种子。将HrpN189、NAC和HrpN189-NAC融合蛋白产品用PBS稀释配置成0.5μg/mL蛋白样品，同时选取水和PBS缓冲液做空白对照，分别浸泡小麦种子10-12h，然后放置在植物培养箱中30℃栽培24h后，观察小麦的发芽率，发芽率＝发芽数目/20目麦的发芽；随后观察小麦4天后的生长情况。

结果如表1显示，HrpN189-NAC能显著促进小麦种子的发芽，栽培24h后发芽率达到90％，比水和PBS空白对照提高50％，比单独使用的同等浓度的HrpN189和NAC提高20％；同时，HrpN189-NAC也能显著促进小麦的生长，与同等浓度的HrpN189和NAC相比，小麦的高度提高了20％以上。

表1 HrpN189-NAC促进小麦发芽和生长的作用

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 上海韦美生物科技有限公司

<120> 一种二价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用

<130> 1

<141> 2019-12-23

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser

1 5 10 15

Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln

20 25 30

Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn

35 40 45

Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met

50 55 60

Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu

65 70 75 80

Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu

85 90 95

Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr

100 105 110

Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro

115 120 125

Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser

130 135 140

Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln

145 150 155 160

Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly

165 170 175

Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Gly Gly Gly

180 185 190

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Asn Pro

195 200 205

Arg Ile Glu Glu Leu Pro Asp Glu Pro Glu Lys Lys Asn Val Gln Ile

210 215 220

Glu Glu Asp Glu Ser Ser Asp Glu Ser Glu Gly Glu Glu Gly Glu Val

225 230 235 240

Ser Val Pro Ala Gly Ser Ser Val Ala Val His Ser Arg Asn Glu Lys

245 250 255

Lys Ala Arg Lys Ala Ile Ala Lys Leu Gly Leu Lys His Ile Asp Gly

260 265 270

Ile Thr Arg Val Thr Leu Arg Arg Pro Lys Asn Ile Leu Phe Val Ile

275 280 285

Asn Gln Pro Asp Val Tyr Lys Ser Pro Ser Ser Asn Thr Trp Ile Ile

290 295 300

Phe Gly Glu Ala Lys Ile Glu Asp

305 310

<210> 2

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgtctctga acacctctgg tctgggtgct tctaccatgc agataagtat cggtggtgct 60

ggtggtaaca acggtctgct gggtacttct cgtcagaacg ctggtctggg tggtaactct 120

gctctgggtc tgggtggtgg taaccagaac gacaccgtta accagctggc tggtctgctg 180

accggtatga tgatgatgat gtctatgatg ggtggtggtg gtctgatggg tggtggtctg 240

ggtggtggtc tgggtaacgg tctgggtggt tctggtggtc tgggtgaagg tctgtctaac 300

gctctgaacg acatgctggg tggttctctg aacaccctgg gttctaaagg tggtaacaac 360

accacctcta ccaccaactc tccgctggac caggctctgg gtatcaactc tacctctcag 420

aacgacgact ctacctctgg tactgactct acctctgact cttctgaccc gatgcagcag 480

ctgctgaaaa tgttctctga aatcatgcag tctctgttcg gtgacggtca ggacggtact 540

cagggttctt cttctggtgg taaacagggt ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc 600

ggtggcggat cgggtgctaa cccgcgtatc gaagaactgc cggacgaacc ggaaaaaaaa 660

aacgttcaga tagaagaaga cgaatcttct gacgaatctg aaggtgaaga aggtgaagtt 720

tctgttccgg ctggttcttc tgttgctgtt cactctcgta acgaaaaaaa agctcgtaaa 780

gctatcgcta aactgggtct gaaacacatc gacggtatca cccgtgttac cctgcgtcgt 840

ccgaaaaaca tcctgttcgt tatcaaccag ccagacgtgt acaaaagccc gtcttctaac 900

acctggataa tcttcggtga agctaaaatc gaagac 936

<210> 3

<211> 570

<212> DNA

<213> 解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)

<400> 3

atgtctctga acacctctgg tctgggtgct tctaccatgc agataagtat cggtggtgct 60

ggtggtaaca acggtctgct gggtacttct cgtcagaacg ctggtctggg tggtaactct 120

gctctgggtc tgggtggtgg taaccagaac gacaccgtta accagctggc tggtctgctg 180

accggtatga tgatgatgat gtctatgatg ggtggtggtg gtctgatggg tggtggtctg 240

ggtggtggtc tgggtaacgg tctgggtggt tctggtggtc tgggtgaagg tctgtctaac 300

gctctgaacg acatgctggg tggttctctg aacaccctgg gttctaaagg tggtaacaac 360

accacctcta ccaccaactc tccgctggac caggctctgg gtatcaactc tacctctcag 420

aacgacgact ctacctctgg tactgactct acctctgact cttctgaccc gatgcagcag 480

ctgctgaaaa tgttctctga aatcatgcag tctctgttcg gtgacggtca ggacggtact 540

cagggttctt cttctggtgg taaacagtaa 570

<210> 4

<211> 324

<212> DNA

<213> 隔交链孢霉(Alternaria sp.)

<400> 4

ggtgctaacc cgcgtatcga agaactgccg gacgaaccgg aaaaaaaaaa cgttcagata 60

gaagaagacg aatcttctga cgaatctgaa ggtgaagaag gtgaagtttc tgttccggct 120

ggttcttctg ttgctgttca ctctcgtaac gaaaaaaaag ctcgtaaagc tatcgctaaa 180

ctgggtctga aacacatcga cggtatcacc cgtgttaccc tgcgtcgtcc gaaaaacatc 240

ctgttcgtta tcaaccagcc agacgtgtac aaaagcccgt cttctaacac ctggataatc 300

ttcggtgaag ctaaaatcga agac 324

Claims

1.一种二价植物免疫融合蛋白，其特征在于，所述二价植物免疫融合蛋白命名为HrpN189-NAC蛋白，是来源于解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)的hrpN蛋白N端的1-189个氨基酸HrpN189和来源于互隔交链孢霉(Alternaria sp.)的新生多肽相关复合体α亚基(nascent polypeptide-associated complex,alpha subunit)NAC的融合体；

所述HrpN189-NAC蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述二价植物免疫融合蛋白的核酸分子。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

4.含有权利要求2或3核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。

5.一种制备权利要求1所述免疫融合蛋白的方法，其特征在于，采用权利要求4所述的重组菌以1-10％的接种量接种发酵培养基，待OD₆₀₀达到0.6-1.8，添加IPTG至终浓度0.0.1-0.6mM，15-20℃，200rpm低温诱导16-20h。

6.权利要求1所述免疫融合蛋白在促进植物生长或在制备植物促生长剂中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，具体方法如下：将HrpN189-NAC蛋白配比成终浓度为0.125-50μg/mL的溶液，单独或与化学农药混合、与其他农药/微生物菌肥/土壤调理剂/植物刺激剂/植物提取物等混合后，进行叶面喷施或灌根。

8.权利要求4所述的表达盒、重组载体或重组菌在促进植物生长或在制备植物促生长剂中的应用。