CN114437231A

CN114437231A - 二价植物免疫蛋白ab-nac及其应用

Info

Publication number: CN114437231A
Application number: CN202011201856.7A
Authority: CN
Inventors: 孙爱友; 乔长晟; 王众; 王立群; 孙冰; 刘旻翼
Original assignee: Suzhou Yishuimo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Yishuimo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-11-02
Filing date: 2020-11-02
Publication date: 2022-05-06

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及融合蛋白AB‑NAC及其生产方法和应用。所述AB‑NAC蛋白，是水稻黄单胞细菌的Harpin_XooN端的59个氨基酸(AB片段)和来源于互隔交链孢霉(Alternaria sp.)的新生多肽相关复合体α亚基(nascent polypeptide‑associated complex,alpha subunit)NAC的融合体。同时具有AB和NAC两种蛋白的功能，具有二价植物免疫蛋白的特性，其能激发烟叶产生超敏反应(HR)的枯斑面积明显高于AB或NAC，产生了1+1＞2的效果。能快速激发植物的免疫反应，提高植物抗病能力，植物的生长速率提高50％以上。

Description

二价植物免疫蛋白AB-NAC及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种二价植物免疫融合蛋白，具体涉及二价融合蛋白AB-NAC，及其基因工程菌的构建、制备方法及在提高植物的免疫力和抗逆性、促进植物的发芽和生长中的应用。

技术背景：

植物先天就拥有和动物相似的免疫系统，可在病原物的诱发下，对病原侵染产生快速的防卫反应。植物免疫系统主要由两个免疫反应构成：病原有关分子模式引发的免疫反应(PTI)和效应蛋白引发的免疫反应(ETI)。其中，PTI反应主要是由病原微生物表面的病原有关分子模式(如多糖、鞭毛蛋白等)刺激诱导，可致使植物发生非特异性的防卫反应(基础防卫反应)；ETI反应则由植物的抗病蛋白(R蛋白)识别病原微生物产生的效应蛋白引发，可导致植物产生特异性的防卫反应。

植物免疫蛋白，又称植物免疫诱抗剂、植物疫苗，是当前国际上生物农药方面十分热点的研究方向。利用了当植物被外界刺激或者处于逆境情况时，能经由调节本身的防卫和代谢系统发生免疫抗性，从而抑制或者减轻病害的再一次发生和蔓延的原理，成为了能够取代化学农药和肥料的生物农药、植物疫苗。植物免疫蛋白不但能提高植物的抗病性，还能增进植物根、茎、叶生长和叶绿素合成速率，最终起到作物增产的作用，还可以通过诱发农作物产生能抵御、防控农作物病虫害的物质，从而起到防治病虫害的作用。

Hpal_Xoo(hrfA，HR function)基因是从水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种中克隆到的，全长420bp，编码的Harpin_Xoo蛋白分为三个功能域：domain for enhancing plantgrowth，DEG、domain for inducing insect resistance，DIR和domain for inducingpathogen resistance，DPR三个功能域，它们分别含有59、33和49个氨基酸。孟凡宏等人对AB片段，即所谓的DEG功能域进行了表达及活性研究。AB片段位于Harpin_Xoo的N端，全长59个氨基酸，研究发现，AB具备同全长Harpin_Xoo差不多的抗病活性，且相较于全长Harpin_Xoo而言，AB片段更容易在体外高效表达。

互隔交链孢霉(Alternaria sp.)是一类重要的植物病原真菌，能引起多种植物病害。从该菌中分离得到的新生多肽相关复合体(nascent polypeptide-associatedcomplex，NAC)由α-NAC和β-NAC共2个亚基组成，体内和体外实验证实，NAC(尤其是α-NAC)可以形成一个稳定的异源复合体，其能够在蛋白质翻译过程中阻止新生多肽在合成之后与错误的蛋白分子结合。NAC具有蛋白翻译和基因转录的双重功能，同时也是新生多肽从细胞质中进入内质网和线粒体的一个桥梁。近年来，NAC在植物促生长、诱导免疫等方面的研究也取得了快速发展。如，可以增加烟草细胞中叶绿素的含量、促进植物的生长；对植物的花器官的形成和种子发育也具有明显的促进作用；能够增强植物在高盐、干旱等胁迫环境下的生存能力；促进植物体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等的生成，显著激发植物的免疫反应等。

无论是hrfA基因表达的AB植物免疫蛋白，还是NAC基因表达的NAC蛋白以及NAC的衍生物，对植物的免疫激发受体、免疫激发传导路径和植物促生长等方面都有各自的局限性。开发更全面、性能更强的免疫蛋白，且兼有促生长功能的融合蛋白势在必行。

发明内容:

为了解决上述技术问题，本发明首先提供一种二价植物免疫融合蛋白，所述二价植物免疫融合蛋白命名为AB-NAC蛋白，是水稻黄单胞细菌的Harpin_XooN端的59个氨基酸(AB片段)和来源于互隔交链孢霉(Alternaria sp.)的新生多肽相关复合体α亚基(nascentpolypeptide-associated complex,alpha subunit)NAC的融合体。

所述AB-NAC蛋白具体为：

(1)序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或

(2)SEQ ID NO.1同源性75％以上的氨基酸序列；或

(3)在SEQ ID NO.1的基础上进行一个或多个氨基酸替换，和/或缺失，和/或添加后获得的具有SEQ ID NO.1相同功能的氨基酸序列；

本发明还保护编码所述AB-NAC蛋白的核酸分子，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA；

进一步地，所述AB-NAC蛋白的编码基因如序列表SEQ ID NO.2所示；

本发明的另一目的是提供含有上述AB-NAC蛋白编码基因的表达盒、重组载体或重组菌；

进一步地，所述重组载体的表达载体可以是pET28a质粒、pET30a质粒或pBV222质粒等；

优选地，所述重组载体的表达载体为含有T7强启动子的pET28a(+)质粒；

进一步地，所述重组菌的宿主可以是大肠杆菌DH5α、BL21或C802等；

优选地，所述重组菌的宿主为E.coli BL21(DE3)；

本发明还提供上述重组菌的构建方法，是将经过密码子优化过的AB片段和NAC的编码基因进行融合后获得AB-NAC基因，与表达载体进行酶切连接后转化入宿主细胞所得；

所述AB片段编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述NAC编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

进一步地，AB片段和NAC编码基因的融合是通过(G₄S)₃链接肽进行融合连接；融合后获得的序列如SEQ ID NO.2所示；

进一步地，所述重组菌以含有T7强启动子的pET28a(+)质粒为载体，以E.coliBL21(DE3)为宿主，获得基因工程菌E.coli/AB-NAC；

本发明还提供融合蛋白AB-NAC的生产方法，具体如下：

将构建成功的E.coli/AB-NAC基因工程菌接种至发酵培养基中，待OD₆₀₀达到0.6-1.8，添加IPTG诱导表达，离心收获菌体，破碎，取破碎液上清液，经Ni-NTA亲和层析纯化后，可得纯度超过90％的AB-NAC蛋白产品；

进一步地，培养条件为：以1-10％的接种量接种发酵培养基，待OD₆₀₀达到0.6-1.8，添加IPTG至终浓度0.1-0.6mM，15-20℃，200rpm低温诱导16-20h；AB-NAC蛋白的得率可以达到0.1-1.5g/L发酵液；

进一步地，所述发酵培养基为含50μg/mL卡那霉素的LB培养基；

进一步地，IPTG的添加量为终浓度0.3mM。

本发明还提供所述AB-NAC蛋白在促进植物生长中的应用；

优选地，所述AB-NAC蛋白在促进植物生长中的应用方法如下：

将AB-NAC蛋白配比成终浓度为0.125-50μg/mL的溶液，单独或与化学农药混合、与其他农药/微生物菌肥/土壤调理剂/植物刺激剂/植物提取物等混合后，进行叶面喷施或灌根，可以有效激发植物的免疫反应；

优选地，AB-NAC蛋白浓度为0.25μg/mL；

优选地，施用方法为叶面喷施；

本发明还提供所述AB-NAC蛋白在制备植物促生长剂中的应用；

本发明还提供所述AB-NAC蛋白的编码基因，或含有所述编码基因的表达盒、重组载体或重组菌在促进植物生长中的应用；

本发明还提供所述AB-NAC蛋白的编码基因，或含有所述编码基因的表达盒、重组载体或重组菌在制备植物促生长剂中的应用；

进一步地，所述植物可以为小麦、水稻、烟草、辣椒、番茄等；

上述应用可快速激发植物的免疫反应，提高植物抗病能力，促进植物生长，增加果实产量。

有益效果：本发明提供的二价融合蛋白AB-NAC，同时具有AB和NAC两种蛋白的功能，具有二价植物免疫蛋白的特性，其能激发烟叶产生超敏反应(HR)的枯斑面积明显高于AB或NAC，产生了1+1＞2的效果。能快速激发植物的免疫反应，提高植物抗病能力，植物的生长速率提高50％以上。

附图说明：

图1：AB-NAC基因PCR验证图；

图2：AB-NAC SDS-PAGE电泳验证图；

其中，1，蛋白marker；2，全菌破碎液；3，破碎液上清；4，破碎液沉淀。

图3：AB-NAC镍柱纯化后的SDS-PAGE电泳验证图

其中，1，蛋白marker；2，破碎液上清；3，穿透液；4-5，50mM咪唑洗脱液；6，300mM咪唑洗脱液。

图4：AB-NAC对烟草叶片的HR反应图；

其中，1：去离子水；2：PBS缓冲液；3：空载大肠杆菌提取物；4：0.5μg/mL AB蛋白形成的烟叶枯斑；5：0.5μg/mLNAC蛋白形成的烟叶枯斑；6：0.5μg/mL AB-NAC蛋白形成的烟叶枯斑。

图5：AB-NAC促进小麦生长图。

具体实施方案:

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

下述实施例的实验方法如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中所使用的实验材料及试剂，如无特别说明，均可通过商业途径购买获得。

本发明提供的AB-NAC蛋白可根据氨基酸序列进行人工合成，也可通过对编码基因进行生物表达获得。

以下将结合附图及具体实施例对本发明做进一步地解释说明。

实施例1：E.coli/AB-NAC基因工程菌构建

本发明提供的AB-NAC蛋白可根据氨基酸序列进行人工合成，也可通过对编码基因进行生物表达获得，本实施例将以生物表达的形式为例进行解释说明。

按照SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，采用全基因合成的方法，将AB-NAC基因全合成，并插入到含有T7强启动子的pET28a质粒的Nco I和Xho I酶切位点中间，构建成pET-28a-AB-NAC重组质粒。

将上述pET-28a-AB-NAC重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)，构建成E.coli/AB-NAC基因工程菌。经PCR验证和基因测序确定，阳性克隆即为构建成功的E.coli/AB-NAC基因工程菌，PCR验证结果如图1所示，将E.coli/AB-NAC基因工程菌进行培养后收集菌体，破碎后分别将全菌、上清液、沉淀进行SDS-PAGE蛋白电泳，验证如图2所示。

实施例2：AB-NAC二价融合蛋白的诱导表达

将重组菌株E.coli/AB-NAC接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm过夜培养12h制备成种子液；

按5％的接种量将种子液接种到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃继续培养，待OD₆₀₀达到1.0，添加IPTG至终浓度0.3mM，18℃，200rpm低温诱导18h；AB-NAC蛋白的得率可以达到1.5g/L发酵液；

诱导结束后，8000rpm离心5min，收集菌体，破碎，8000rpm离心5min，取上清，将上清液滤膜过滤，进样Ni-NTA亲和层析柱，管中蛋白样减少一个柱体积后即取穿透样，用4个柱体积的0.05mol/L Tris-HCl裂解缓冲液洗涤镍柱，然后用50mM或300mM的咪唑洗脱，收集洗脱液。结果显示，300mM的咪唑可以将AB-NAC蛋白完全洗脱下来，蛋白纯度90％以上(如图3所示，泳道6能够看到清晰的条带，分子量31.9kD)。

实施例3：AB-NAC对烟草叶片HR反应的检测

将AB-NAC融合蛋白产品稀释配置成0.5μg/mL的蛋白样品进行烟草叶片注射(每孔的注射剂量为100μL)，并将同等浓度的水、AB和NAC蛋白溶液作为对照。将注射后的烟草放置在植物培养箱中，30℃培养3天，观察叶片中的枯斑大小。

结果显示，AB-NAC能强烈引起烟草叶片的HR反应，与同等浓度的AB和NAC相比，烟叶枯斑面积大1倍以上(如图4所示)。

实施例4：AB-NAC促进小麦生长实验

选取健康饱满的小麦种子，随机分组，每组20粒种子。将AB-NAC融合蛋白产品配置成4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625μg/mL浓度梯度的蛋白样品，分别浸泡小麦种子10-12h。并分别配制同等浓度的AB和NAC蛋白样品作为对照，同时选取水做空白对照，观察小麦2天(48h)后的生长情况。

结果显示，AB-NAC能显著促进小麦种子的生长，比水空白对照提高1倍左右，比单独使用的同等浓度的AB和NAC提高约50％(如图5和表1所示)。

表1：不同浓度梯度下小麦生长情况(48h)

注：水(对照)，小麦平均高度/cm，2.9。

实施例5：抑菌性实验

分别在番茄叶片的表面喷洒(2μL/cm²)40μg/mL的AB、NAC、AB-NAC蛋白溶液，24小时后，在番茄叶片的表面均匀喷洒等量的丁香假单胞菌番茄致病变种(DC3000 bio-103914Pseudomonas sringaepv.tomato)，4天后检测叶片内部微生物数量的变化。

各摘取20g番茄叶片，用无菌水清洗，沥干后加入50mL无菌水，用组织研磨仪将叶片彻底破碎。将破碎液稀释至一定倍数，在营养肉汤固体培养基(NB)培养皿上均匀涂板，24小时后检测单菌落数量。

表2番茄叶片中丁香假单胞菌数量检测结果

样品名称	PBS	AB	NAC	AB-NAC
					单菌落数(×10<sup>6</sup>)	4.4±0.2	4.1±0.2	4.0±0.2	3.6±0.2

由上表可以很明显的发现，由于AB-NAC激发的植物免疫反应强于AB或NAC激发的植物免疫反应，因此，致病菌丁香假单胞菌的侵染和繁殖速度明显减少。

AB和NAC都具有一定的番茄免疫激发活性，但融合蛋白AB-NAC相对于AB和NAC拥有更强的激发活性，因此，施用AB-NAC可以有效的抑制致病菌丁香假单胞菌的生长和繁殖，使番茄避免番茄假单胞果腐病等疾病的侵袭。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海乙水茉生物科技有限公司

<120> 二价植物免疫蛋白AB-NAC及其应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 181

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asn Ser Leu Asn Thr Gln Phe Gly Gly Ser Thr Ser Asn Leu Gln

1 5 10 15

Val Gly Pro Ser Gln Asp Thr Thr Phe Gly Ser Asn Gln Gly Gly Asn

20 25 30

Gln Gly Ile Ser Glu Lys Gln Leu Asp Gln Leu Leu Cys Gln Leu Ile

35 40 45

Ser Ala Leu Leu Gln Ser Ser Lys Asn Ala Glu Gly Gly Gly Gly Ser

50 55 60

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Asn Pro Arg Ile Glu

65 70 75 80

Glu Leu Pro Asp Glu Pro Glu Lys Lys Asn Val Gln Ile Glu Glu Asp

85 90 95

Glu Ser Ser Asp Glu Ser Glu Gly Glu Glu Gly Glu Val Ser Val Pro

100 105 110

Ala Gly Ser Ser Val Ala Val His Ser Arg Asn Glu Lys Lys Ala Arg

115 120 125

Lys Ala Ile Ala Lys Leu Gly Leu Lys His Ile Asp Gly Ile Thr Arg

130 135 140

Val Thr Leu Arg Arg Pro Lys Asn Ile Leu Phe Val Ile Asn Gln Pro

145 150 155 160

Asp Val Tyr Lys Ser Pro Ser Ser Asn Thr Trp Ile Ile Phe Gly Glu

165 170 175

Ala Lys Ile Glu Asp

180

<210> 2

<211> 554

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccatgggcaa ctctctgaac acccagttcg gtggttctac ctctaacctg caggttggtc 60

cgtctcagga caccaccttc ggttctaacc agggtggtaa ccagggtatc tctgaaaaac 120

agctggacca gctgctgtgc cagctgataa gtgctctgct gcagtcttct aaaaacgctg 180

aaggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggct aacccgcgta 240

tcgaagaact gccggacgaa ccggaaaaaa aaaacgttca gatagaagaa gacgaatctt 300

ctgacgaatc tgaaggtgaa gaaggtgaag tttctgttcc ggctggttct tctgttgctg 360

ttcactctcg taacgaaaaa aaagctcgta aagctatcgc taaactgggt ctgaaacaca 420

tcgacggtat cacccgtgtt accctgcgtc gtccgaaaaa catcctgttc gttatcaacc 480

agccagacgt gtacaaaagc ccgtcttcta acacctggat aatcttcggt gaagctaaaa 540

tcgaagacct cgag 554

<210> 3

<211> 180

<212> DNA

<213> 水稻黄单胞细菌

<400> 3

atgaactctc tgaacaccca gttcggtggt tctacctcta acctgcaggt tggtccgtct 60

caggacacca ccttcggttc taaccagggt ggtaaccagg gtatctctga aaaacagctg 120

gaccagctgc tgtgccagct gataagtgct ctgctgcagt cttctaaaaa cgctgaataa 180

<210> 4

<211> 327

<212> DNA

<213> 互隔交链孢霉（Alternaria sp.）

<400> 4

atggctaacc cgcgtatcga agaactgccg gacgaaccgg aaaaaaaaaa cgttcagata 60

gaagaagacg aatcttctga cgaatctgaa ggtgaagaag gtgaagtttc tgttccggct 120

ggttcttctg ttgctgttca ctctcgtaac gaaaaaaaag ctcgtaaagc tatcgctaaa 180

ctgggtctga aacacatcga cggtatcacc cgtgttaccc tgcgtcgtcc gaaaaacatc 240

ctgttcgtta tcaaccagcc agacgtgtac aaaagcccgt cttctaacac ctggataatc 300

ttcggtgaag ctaaaatcga agactaa 327

Claims

1.一种植物免疫融合蛋白，其特征在于，所述植物免疫融合蛋白具体为AB-NAC蛋白，是水稻黄单胞细菌的Harpin_XooN端的59个氨基酸(AB片段)和来源于互隔交链孢霉(Alternaria sp.)的新生多肽相关复合体α亚基(nascent polypeptide-associatedcomplex,alpha subunit)NAC的融合体。

2.如权利要求1所述的一种植物免疫融合蛋白，其特征在于，所述AB-NAC蛋白具体为：

(1)序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或

(2)SEQ ID NO.1同源性75％以上的氨基酸序列；或

(3)在SEQ ID NO.1的基础上进行一个或多个氨基酸替换，和/或缺失，和/或添加后获得的具有SEQ ID NO.1相同功能的氨基酸序列。

3.编码权利要求1或2所述植物免疫融合蛋白的核酸分子。

4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

5.含有权利要求3或4核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。

6.如权利要求5所述的表达盒、重组载体或重组菌，采用的表达载体为pET28a质粒、pET30a质粒或pBV222质粒；采用的宿主菌为大肠杆菌DH5α、BL21或C802。

7.一种制备权利要求1-3项任意所述免疫融合蛋白的方法，其特征在于，采用权利要求5或6所述的重组菌以1-10％的接种量接种发酵培养基，待OD₆₀₀达到0.6-1.8，添加IPTG至终浓度0.1-0.6mM，15-20℃，200rpm低温诱导16-20h。

8.权利要求1-3项任意所述免疫融合蛋白在促进植物生长或在制备植物促生长剂中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，具体方法如下：将AB-NAC蛋白配比成终浓度为0.125-50μg/mL的溶液，单独或与化学农药混合、与其他农药/微生物菌肥/土壤调理剂/植物刺激剂/植物提取物等混合后，进行叶面喷施或灌根。

10.权利要求5所述的表达盒、重组载体或重组菌在促进植物生长或在制备植物促生长剂中的应用。