CN111713511B

CN111713511B - 来源于帚枝霉属真菌的激发子蛋白在防治木薯细菌性萎蔫病中的应用

Info

Publication number: CN111713511B
Application number: CN202010595750.3A
Authority: CN
Inventors: 李超萍; 杨扬; 时涛; 王国芬; 蔡吉苗; 李博勋; 黄贵修
Original assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Current assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2020-06-24
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2040-06-24
Also published as: CN111713511A

Abstract

本发明开了一种来源于帚枝霉属真菌的激发子蛋白在防治木薯细菌性萎蔫病的应用。所述应用是用来源于帚枝霉属真菌的激发子蛋白诱导木薯产生对细菌性萎蔫病的抗病性或者提木薯的抗病性中的应用。该激发子蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有激发子蛋白功能的由SEQ ID №：1衍生的蛋白质。实验证明，该蛋白激发子SbES可以诱导木薯产生或者提高植物对靶标病原菌的抗性，降低发病率及病情指数，为提高植物抗病性提供了新的途径，在农业生产上具有广阔的应用前景。

Description

来源于帚枝霉属真菌的激发子蛋白在防治木薯细菌性萎蔫病中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及来源于帚枝霉属真菌的激发子蛋白及其编码基因在防治木薯细菌性萎蔫病中的应用。

背景技术

蛋白类激发子是源于细菌、真菌分泌的一些蛋白，主要包括过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)、激活蛋白(Activator)等。可通过诱导植物防御相关基因的表达和激活植物体内防御信号途径如水杨酸等来激发植物获得抗性，增强植物自身免疫能力来抵抗病原微生物的侵染。截止目前为止发现了许多新的蛋白类的激发子，但目前未发现帚枝霉属真菌中可诱导植物产生抗病性的激发子蛋白及其编码基因的有关报道。

发明内容

本实验室从臂形草叶片中分离得到的高效生防菌株，帚枝霉属内生真菌Sarocladium brachiariae HND5。在对HND5菌株进行了全基因组测序，通过生物信息学分析时，从其基因组中发现并鉴定得到了一个编码外泌激发子的基因，将其编码的激发子蛋白命名为SbES。

基于此，本发明的目的是提供一种来源于内生帚枝霉属真菌的激发子蛋白及其编码基因在木薯生防上的应用，具体是激发子蛋白及其编码基因在诱导木薯产生抗病性或者提高木薯的抗病性中的应用，或者在诱导橡胶、木薯、香蕉、黄瓜对病虫害产生防御反应中的应用。所述激发子蛋白，来源于帚枝霉属内生真菌(Sarocladium brachiariae)菌株HND5，名称为SbES，是如下1)或2)或3)的蛋白质：

1)由序列表中的SEQ ID№.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)由序列表中SEQ ID№.1的第106-387位氨基酸序列组成的蛋白质；

3)将序列表中的SEQ ID№.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有激发子蛋白功能的由SEQ ID№：1衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID№.1由387个氨基酸残基组成。

为了便于SEQ ID№.1编码的SbES纯化，可在由序列表中SEQ ID№.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述SbES可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述SbES的编码基因可通过将序列表中序列2自5′末端第1-1164位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述帚枝霉属内生真菌Sarocladium brachiariae HND5激发子蛋白(SbES)的编码基因的序列如下所述所述帚枝霉属内生真菌Sarocladium brachiariaeHND5激发子蛋白的cDNA为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述帚枝霉属内生真菌Sarocladium brachiariae HND5激发子蛋白的DNA分子；

3)与序列表中序列2的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且编码蛋白具有提高植物抗性和诱导植物防御反应活性功能的核苷酸序列。

序列表中序列2全长为1164个核苷酸，编码一个长度为387个氨基酸(序列表中序列1)、分子量约为39kD的蛋白，即为帚枝霉属内生真菌Sarocladium brachiariae HND5激发子蛋白(SbES)，1-45个碱基为SbES蛋白信号肽编码序列，46-315个碱基是前肽编码序列，316-1164个碱基是外泌成熟多肽编码序列。

所述帚枝霉属内生真菌Sarocladium brachiariae HND5激发子蛋白(SbES)的基因组基因的核苷酸序列如下1)、2)、或3)所示：

1)序列表中SEQ ID№：3的核苷酸序列；

2)在严格条件下可与1)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列；

3)与序列表中SEQ ID№：3的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且编码蛋白具有提高植物抗性和诱导植物防御反应活性功能的核苷酸序列。

序列表中序列3全长为1375个核苷酸，自序列3的5’端第1-276位核苷酸是第一个外显子，第277-341位核苷酸是第一个内含子，第342-527位核苷酸是第二个外显子，第528-595位核苷酸是第二个内含子，第596-1102位核苷酸是第三个外显子，第1103-1179位核苷酸是第三个内含子，第1180-1375位核苷酸是第四个外显子，编码序列表中序列1所示的蛋白质。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

所述编码基因还可以是密码子优化的核苷酸，如所述编码基因可以为序列表中序列4，该序列可在毕赤酵母中表达上述激发子蛋白，并且，通过密码子优化使表达量增加并且表达活性也很高。

所述应用中，所述诱导产生防御反应为引起的micro-HR反应、诱导叶片过氧化氢的积累、诱导叶片胼胝质的积累和/或激发植物抗病基因的表达。

上述蛋白质或其编码基因在制备预防木薯病虫害的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

所述应用中，所述病虫害为病害，所述病害优选为多地毯草黄单胞(Xanthomonasaxonopodis)引起的病害。

所述的激发子蛋白及其编码基因作为激发子蛋白激发植物防卫反应、过敏反应和/或激发植物抗病基因表达中的应用、和/或在作为蛋白农药来防御病虫害的侵害中的应用，均属于本发明的保护范围，所述植物为橡胶、木薯、香蕉、黄瓜。

本发明还保护一种提高植物抗病性的方法，是是使用下述激发子蛋白防治植物病害：

所述激发子蛋白是如下1)或2)或3)所示的蛋白质：

1)由序列表中的SEQ ID№.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)由序列表中的SEQ ID№.1的第106-387位氨基酸序列组成的蛋白质；

3)将1)或2)中所述的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有激发子蛋白功能的由SEQ ID№：1衍生的蛋白质；

所述植物病害为优选为地毯草黄单胞(Xanthomonas axonopodis)引起的木薯病害；

使用所述激发子蛋白提高植物抗病性的方式是将所述蛋白质喷施于橡胶、木薯、香蕉或黄瓜上或者注射在植物组织上。

所述激发子蛋白可以体外合成获得，具体方法为利用可以表达所述激发子蛋白的重组表达载体，转入酵母中获得获得表达激发子蛋白的转基因重组菌；所述酵母优选为毕赤酵母X-33菌株。

所述表达所述激发子蛋白的重组表达载体将序列表中序列4所述的核苷酸片段插入到出发载体获得的表达激发子蛋白的重组载体，所述出发载体优选为pRICZA。

上述激发子蛋白具有诱导诱导木薯产生对地毯草黄单胞(Xanthomonasaxonopodis)引起的细菌性萎蔫病抗性的活性，可以降低木薯细菌性萎蔫病发病率及病情指数，为一种具有提高植物抗性和诱导植物防御反应活性的激发子蛋白。它能够引起植物防卫反应，通过与植物细胞表面或亚细胞表面的受体结合激活植物体内的级联信号系统以及诱导防卫基因的表达等防御机制在抗病信号途径中发挥作用，具有化学农药所不具备的优势和特点，可作为一种新型微生物蛋白农药来防御病虫害的侵害。

附图说明

图1为实施例2中His-SbES融合蛋白的SDS-PAGE蛋白胶图。

图2为实施例3中SbES蛋白对地毯草黄单胞(Xanthomonas axonopodis)引起的木薯病害。其中，A为空白对照喷雾处理后接种病原菌发病图，B为SbES蛋白处理雾处理后接种病原菌发病图，C为阿泰灵处理喷雾处理后接种病原菌发病图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、激发子蛋白SbES的编码基因及其cDNA的克隆

本实验室从臂形草叶片中分离得到的一株高效生防菌株，经鉴定为帚枝霉属内生真菌Sarocladium brachiariae，命名为帚枝霉属内生真菌Sarocladium brachiariaeHND5(Liu X,Guo Z,Huang G:Sarocladium brachiariae sp.nov.,an endophytic fungusisolated from Brachiaria brizantha.Mycosphere 2017,8:827-834.)。本发明的发明人，将该菌株进行全基因组测序数据的基础上，通过与亲缘属真菌已报道激发子序列进行比对分析，发现并鉴定得到的可能提高植物抗性和诱导植物防御反应活性的激发子蛋白基因。

本发明的激发子蛋白基因全长编码DNA和全长cDNA片段的获得方法如下所述：

以Sarocladium brachiariae HND5菌株提取的总DNA为模板，设计特异引物SbES-F和SbES-R，利用PCR技术扩增获得SbES基因的全长编码DNA片段；已Sarocladiumbrachiariae HND5菌株提取的总RNA为模板，设计特异引物SbES-F和SbES-R，利用RT-PCR技术扩增获得SbES基因的全长cDNA片段。引物序列如下：

SbES-F：5′-ATGCGTTTCTCACTCGTCCT-3′；

SbES-R：5′-TTAACCAGAGGGGTTGCCGT-3′。

在PDA培养基上生长3天的Sarocladium brachiariae HND5菌株，收集菌丝后提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，用SbES-F和SbES-R组成的引物对进行PCR扩增(靶序列约1375bp)。PCR扩增体系为：2.5μL的10×PCR buffer(Mg²⁺free)，1.8μLMgCl₂(25mM),0.5μL的dNTPs(10mM)，0.2μLTaq酶(5U/μL)，1.0μL模板基因组DNA，正向引物和反向引物(10mM)各加0.5μL，加ddH₂O补足25μL。反应程序如下：94℃预变性5min后，进入94℃30s，57℃30s，72℃50s，32个循环，最后在72℃下延伸10min。将PCR扩增产物回收连接pMD18-T载体(TaKaRa)，转化大肠杆菌DH5α，质粒经酶切鉴定，正确的克隆送到北京华大基因技术有限公司进行测序，测序结果如序列表的序列3所示，转录生成序列表的序列2所示的cDNA扩增片段(序列2和序列3均可以通过人工合成获得)。

在PDA培养基上生长7天的Sarocladium brachiariae HND5菌株，收集菌丝后提取总RNA并反转录得到cDNA。以cDNA为模板，用SbES-F和SbES-R组成的引物对进行PCR扩增(靶序列约1164bp)。PCR扩增体系为：2.5μL的10×PCR buffer(Mg²⁺free)，1.8μLMgCl₂(25mM),0.5μL的dNTPs(10mM)，0.2μLTaq酶(5U/μL)，1.0μL模板cDNA，正向引物和反向引物(10mM)各加0.5μL，加ddH2O补足25μL。反应程序如下：94℃预变性5min后，进入94℃30s，57℃30s，72℃30s，32个循环，最后在72℃下延伸10min。将PCR扩增产物回收连接pMD18-T载体(TaKaRa)，转化大肠杆菌DH5α，质粒经酶切鉴定，正确的克隆送到北京华大基因技术有限公司进行测序，测序结果如序列表的序列2所示，编码序列表的序列1所示的蛋白质。将经测序表明外源插入片段为序列2的重组质粒命名为pMD18-T/SbES。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为SbES蛋白。将编码SbES蛋白的基因命名为SbES基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。

实施例2、SbES蛋白的真核表达与纯化

一、基于毕赤酵母密码子偏好性的cDNA序列优化

为使用毕赤酵母X-33菌株进行SbES蛋白的异源表达，根据毕赤酵母的密码子偏好性，排除掉SbES蛋白的信号肽及前肽编码基因，对序列2的316-1164位核苷酸进行密码子优化，获得序列4，编码自序列表中序列1的氨基端第106-387位氨基酸所示的蛋白质。序列4由北京华大生物技术有限公司负责合成。

二、真核表达载体构建

用引物SbES-PF和SbES-PR进行配对，以序列4为模板，扩增得到的片段连接到T载体上，命名为pMD18-T/SbESp；用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切pMD18-T/SbESp，回收小片段插入到pRICZA相同的酶切位点间，得到的重组载体命名为pRICZA/SbES。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pRICZA/SbES。该表达载体pRICZA/SbES表达的蛋白为由序列表中的SEQ ID №.1的第106-387位氨基酸序列组成的蛋白质(携带His标签方便纯化)。

所用引物序列如下：

SbES-PF：5′-TCATGGCTTACACTACTCAATCTGC-3′；

SbES-PR：5′-GTTGAAAGCCAATCTGTCAGCAGTA-3′。

三、SbES蛋白的真核表达菌株构建

提取pRICZA/SbES质粒用SacⅠ进行单酶切，使重组表达载体完全线性化，并回收线性化后的质粒片段。向80μL毕赤酵母X-33电击感受态细胞中添加10μg线性化后的pRICZA/SbES质粒，混匀后加入到0℃(提前放在冰上)的0.2cm的电转化杯中，冰上孵育5min后，将电转化槽置于Bio-Rad Pulser电转化仪上，进行电转化，采用电击转化仪中储存的毕赤酵母所设定转化参数进行电击。电击后，立即在电转化槽中加入1mL 0℃的1M sorbital，用移液器快速混合后把电转化槽中的混合物转入到灭过菌的1.5mL离心管中，并在30℃静置培养约1.5h。取200μL培养液涂布于含有100μg/mL Zeocin的YPDS平板上，待菌液被完全干后，将平板在28℃倒置培养4～6d，可见有菌落长出。验证正确后即得到SbES蛋白的毕赤酵母表达菌株。

四、SbES蛋白的真核表达和蛋白纯化

将SbES蛋白的毕赤酵母表达菌株接种于含有50mL BMGY培养基的锥形瓶中，于28℃，230r/min条件下震荡培养约20h(OD600＝3.5左右)；将摇培好的菌液用50mL无菌的离心管收集，在25℃，2000g的条件下离心5min，弃上清液，将菌体转移至含有100mL BMMY培养基的锥形瓶中，并用四层无菌纱布封口，置于28℃，230r/min条件下震荡培养，进行诱导表达；每隔24h向培养物中加入100％甲醇，使其终浓度为1％，共诱导120h；收集1L发酵液的菌体，使用100mL PBS Buffer缓冲液(pH为6.5)重悬菌体，加入10μL DNA酶；菌体在冰水混合上采用新芝超声波细胞破碎仪进行破碎，程序为：150W，破碎5sec，暂停5sec，总用时30min，整个过程中隔10min重新混匀破碎结束后12000r/min，4℃，离心30min，所获上清为重组蛋白粗提物。

利用GE Healthcare的HisTrap亲和柱进行重组蛋白的纯化；使用10mL 20mM咪唑平衡亲和柱后，按照2mL/min的流速，将重组蛋白粗提物进行过柱；依次使用40mL浓度为20mM，40mM，60mM，80mM咪唑的PBS Buffer洗脱亲和柱；用10mL浓度为200mM咪唑的PBSBuffer洗脱亲和柱，收集洗脱液，使用SDS-PAGE电泳检测蛋白质量；使用10kDa MilliporeAmicon Ultra-15超滤管，浓缩并将重组蛋白溶液置换为不含有咪唑的PBS缓冲液。

结果见图1，经SDS-PAGE电泳，获得一个分子量约为32kD的His-SbES融合表达蛋白，与预测的大小一致。并且His-SbES融合蛋白富集在上清液里，纯化后的蛋白条带单一、无杂带。图1注：M为Marker，泳道1为用20mM咪唑洗下的杂蛋白；泳道2为用40mM咪唑洗下的杂蛋白；泳道3为用60mM咪唑洗下的杂蛋白；泳道4为用80mM咪唑洗下的杂蛋白；泳道5为用200mM咪唑洗下的目的蛋白。

实施例3、SbES蛋白对木薯细菌性萎蔫病的防治效果评价

病原菌菌株：地毯草黄单胞(Xanthomonas axonopodis)菌株XamGX11(木薯细菌性枯萎病菌转座子库的构建及其质量评价[J].热带作物学报，2013，34(6)：1144-1148.)，公众可从中国热带农业科学院环境与植物保护研究所获得该菌株。

木薯品种：SC10

药剂：重组蛋白SbES(0.1mg/mL)、阿泰灵(3％寡糖蛋白·3％链隔孢激活蛋白WP)(中国农业科学院植物保护研究所)，对照为PBS Buffer缓冲液。

药剂处理：将重组蛋白His-SbES浓度调至0.1mg/mL，喷雾处理木薯盆栽苗10株3次，间隔3d，阿泰灵处理组：阿泰灵(3％寡糖蛋白·3％链隔孢激活蛋白WP)稀释800倍喷雾处理、选用PBS缓冲液作为对照。3d后进行人工接种，保湿，5d后调查发病情况。处理3株，15张叶片。

人工接种方法：接种菌液的浓度为OD₆₀₀值约为0.2，将7根大头针用橡皮筋捆绑成束针状用于针刺接种。采用针刺法接种木薯苗，自上而下选取生长期一致的完全成熟叶片，每株木薯选择3张复叶，每张复叶接种中间的5张小叶片中部，避开叶片主脉，每个处理接种3株木薯。

病情统计和相对防效计算：

分级标准：0级，无发病症状；1级，有发病症状且发病面积占接种面积的50％以下；2级，发病面积占接种面积的50％-100％；3级，发病面积占接种面积的100％-150％；4级，发病面积占接种面积的150％-200％；5级，发病面积占接种面积的200％以上。

病情指数＝(∑各病斑病级数×相应病级数值)/(调查总病斑数×最高病害级别数)×100

相对防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

结果如表2和图2所示，结果表明，SbES蛋白对木薯细菌性萎蔫病具有很优异的诱导抗性活性作用，其防治效果要显著优于阿泰灵。

表2供试SbEB蛋白对木薯细菌性萎蔫病的防治效果

序列表

<110> 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120> 来源于帚枝霉属真菌的激发子蛋白在防治木薯细菌性萎蔫病中的应用

<130> WHOI201030

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 387

<212> PRT

<213> 帚枝霉菌(Sarocladium brachiariae)

<400> 1

Met Arg Leu Ser Leu Val Leu Ala Leu Leu Pro Ala Ala Leu Gly Ala

1 5 10 15

Pro Thr Arg Arg Asp Glu Pro Ala Pro Leu His Val Pro Arg Gly Val

20 25 30

Asp Ser Leu Ile Lys Asp Thr Tyr Ile Val Lys Tyr Lys Asp Ile Thr

35 40 45

Ala Met Ser Ala Val Asp Glu Gly Leu Lys Val Leu Pro Gly Lys Pro

50 55 60

Glu Arg Val Phe Lys Gly Ala Phe Lys Gly Phe Ala Gly Lys Ile Asp

65 70 75 80

Ala Lys Thr Leu Glu Leu Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Asp Phe Ile

85 90 95

Glu Gln Asp Ala Ile Val Lys Leu Ala Ala Tyr Thr Thr Gln Ser Ala

100 105 110

Ala Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Thr Arg Gln Arg Gly Pro Thr

115 120 125

Gly Tyr Thr Tyr Asp Thr Ser Ala Gly Gln Gly Thr Cys Ser Tyr Ile

130 135 140

Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Phe Gly Gly Arg Ala Phe

145 150 155 160

Gln Leu Ile Ser Tyr Gln Gly Gly Asn Ala Asp Gly Asn Gly His Gly

165 170 175

Thr His Val Ala Gly Thr Ile Gly Ser Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys

180 185 190

Ala Thr Thr Leu Leu Gly Val Lys Val Leu Ser Asp Ser Gly Ser Gly

195 200 205

Ser Ile Ser Gly Ile Ile Ser Gly Met Asn Tyr Val Val Ser Asp Ser

210 215 220

Arg Thr Arg Ser Cys Pro Arg Gly Ala Phe Ala Asn Met Ser Leu Gly

225 230 235 240

Gly Gly Tyr Ser Ala Ser Leu Asn Ser Ala Ala Lys Ser Met Val Asp

245 250 255

Asn Gly Val Phe Leu Ala Val Ala Ala Gly Asn Glu Asn Gln Asn Ala

260 265 270

Ala Asn Val Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala

275 280 285

Thr Thr Ser Thr Asp Ala Arg Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ala Leu

290 295 300

Val Asp Ile Phe Ala Pro Gly Gln Gly Ile Leu Ser Thr Trp Pro Gly

305 310 315 320

Ser Ser Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Ile

325 330 335

Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Ala Gly Leu Glu Gly Asn Pro Gly Ala

340 345 350

Ser Ala Met Cys Gly Arg Ile Ile Gln Leu Ala Thr Thr Gly Val Ile

355 360 365

Thr Gly Leu Pro Ser Gly Thr Ala Asp Arg Leu Ala Phe Asn Gly Asn

370 375 380

Pro Ser Gly

385

<210> 2

<211> 1164

<212> DNA

<213> 帚枝霉菌(Sarocladium brachiariae)

<400> 2

atgcgtctct ctctcgtcct cgcccttctc cctgccgccc tcggtgctcc cacgaggcgc 60

gatgagcccg ctccccttca tgttcctcgt ggcgtcgaca gcctgatcaa ggacacctac 120

atcgtcaagt acaaggacat tactgccatg tctgctgtcg atgaaggcct caaggttctt 180

cccggcaagc ccgagcgtgt cttcaaaggt gccttcaagg gctttgctgg caagattgat 240

gccaagactc tggagctcct ccgtgatgat cccagtgtcg acttcattga gcaggatgct 300

atcgtgaagc tcgctgccta caccacccag tcggccgccc catggggcct tgcccgtatc 360

tctactcgtc agcgtggtcc tactggatat acgtacgaca ccagcgctgg tcaaggaaca 420

tgttcctaca tcctcgacac tggcattcag gccagccacc ccttcggtgg acgagccttc 480

cagctcatct cctaccaagg cggcaatgcc gatggtaacg gtcatggcac tcacgttgcc 540

ggtaccattg gctccagaac ctacggtgtt gccaaggcta ccaccctgct cggtgtcaag 600

gtcctgagtg actcgggctc tggctccatc tctggcatca tctccggcat gaactatgtt 660

gtcagcgact ctcgcacccg tagctgccct cgcggtgcat tcgccaacat gtctctcggt 720

ggaggctact ccgcctcgct caacagcgct gccaagtcca tggtagacaa tggcgtcttc 780

cttgctgttg ctgccggtaa cgagaaccag aatgctgcca acgtatctcc cgcgtctgag 840

cccagcgtct gcacggtcgg cgccaccact tccactgatg cccgtgcttc cttctccaac 900

tacggcgctc ttgtcgatat cttcgctcct ggccagggta ttctgtctac ctggcccggc 960

agcagcacca acaccatctc tggcacctcc atggcctccc ctcatattgc tggtcttgcc 1020

gcttacctgg ctggccttga gggtaaccct ggtgcctcgg ccatgtgcgg acgtatcatc 1080

cagcttgcca ccactggtgt catcactggc ctgcccagcg gtaccgccga ccgcctcgcc 1140

ttcaacggca acccctctgg ttaa 1164

<210> 3

<211> 1375

<212> DNA

<213> 帚枝霉菌(Sarocladium brachiariae)

<400> 3

atgcgtctct ctctcgtcct cgcccttctc cctgccgccc tcggtgctcc cacgaggcgc 60

gatgagcccg ctccccttca tgttcctcgt ggcgtcgaca gcctgatcaa ggacacctac 120

atcgtcaagt acaaggacat tactgccatg tctgctgtcg atgaaggcct caaggttctt 180

cccggcaagc ccgagcgtgt cttcaaaggt gccttcaagg gctttgctgg caagattgat 240

gccaagactc tggagctcct ccgtgatgat cccagtgtaa gtggtctcgt cccgtggtca 300

aagtgtagat aggataatgt ccctgacacg ttccatcaca ggtcgacttc attgagcagg 360

atgctatcgt gaagctcgct gcctacacca cccagtcggc cgccccatgg ggccttgccc 420

gtatctctac tcgtcagcgt ggtcctactg gatatacgta cgacaccagc gctggtcaag 480

gaacatgttc ctacatcctc gacactggca ttcaggccag ccaccccgta agcgctgcac 540

attgctccct cgcccatttc cctcggccca tactgacctg accttcatca tatagttcgg 600

tggacgagcc ttccagctca tctcctacca aggcggcaat gccgatggta acggtcatgg 660

cactcacgtt gccggtacca ttggctccag aacctacggt gttgccaagg ctaccaccct 720

gctcggtgtc aaggtcctga gtgactcggg ctctggctcc atctctggca tcatctccgg 780

catgaactat gttgtcagcg actctcgcac ccgtagctgc cctcgcggtg cattcgccaa 840

catgtctctc ggtggaggct actccgcctc gctcaacagc gctgccaagt ccatggtaga 900

caatggcgtc ttccttgctg ttgctgccgg taacgagaac cagaatgctg ccaacgtatc 960

tcccgcgtct gagcccagcg tctgcacggt cggcgccacc acttccactg atgcccgtgc 1020

ttccttctcc aactacggcg ctcttgtcga tatcttcgct cctggccagg gtattctgtc 1080

tacctggccc ggcagcagca ccgtgagttc acctccgaaa tcactgcaga ctcttcagag 1140

tttgcctgta tgcttgcttg tatactgaca tctcccccag aacaccatct ctggcacctc 1200

catggcctcc cctcatattg ctggtcttgc cgcttacctg gctggccttg agggtaaccc 1260

tggtgcctcg gccatgtgcg gacgtatcat ccagcttgcc accactggtg tcatcactgg 1320

cctgcccagc ggtaccgcca accgcctcgc cttcaacggc aacccctctg gttaa 1375

<210> 4

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gaattcatgg cttacactac tcaatctgct gctccatggg gtcttgctag aatttccact 60

agacagagag gtccaaccgg ttacacttac gatacttccg ctggtcaagg tacttgctcc 120

tacattttgg acactggtat ccaggcttct cacccatttg gtggtagagc tttccagctg 180

atttcctacc aaggtggtaa cgctgatggt aacggtcatg gtactcatgt tgctggtact 240

atcggttcca gaacttacgg tgttgctaag gccactacct tgttgggtgt taaggttttg 300

tctgactctg gttccggttc catctccggt attatttccg gtatgaacta cgtcgtgtcc 360

gactccagaa ctagatcttg tccaagaggt gctttcgcca acatgtctct tggtggtggt 420

tactctgctt ccttgaactc tgctgctaag tccatggttg acaacggtgt tttcttggct 480

gttgctgccg gtaacgagaa tcaaaacgct gctaacgttt ctccagcttc tgaaccatcc 540

gtctgtactg ttggtgctac tacttctact gacgctagag cttccttctc caactacggt 600

gctttggttg acattttcgc tccaggtcag ggtattttgt ctacttggcc aggttcctcc 660

actaacacca tttctggtac ttctatggct tccccacaca ttgctggttt ggctgcttat 720

ttggctggat tggaaggtaa cccaggtgct tctgctatgt gcggtagaat tatccagttg 780

gctaccaccg gtgtcatcac tggtttgcca tctggtactg ctgacagatt ggctttcaac 840

ggtaacccat ctggtggtac c 861

Claims

1.一种来源于内生帚枝霉属真菌的激发子蛋白或其编码基因在诱导木薯产生抗病性或者提高木薯的抗病性中的应用，所述来源于内生帚枝霉属真菌的激发子蛋白是如下1)或2)所示的蛋白质：

1）由序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2）由序列表中的 SEQ ID №.1的第106-387位氨基酸序列组成的蛋白质；所述提高木薯的抗病性为诱导木薯产生对地毯草黄单胞（Xanthomonas axonopodis）引起的细菌性萎蔫病抗性的活性。

2.一种来源于内生帚枝霉属真菌的激发子蛋白或其编码基因在诱导木薯对病害产生防御反应中的应用；所述激发子蛋白是如下1)或2)所示的蛋白质：

1）由序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2）由序列表中的SEQ ID №.1的第106-387位氨基酸序列组成的蛋白质；

所述病害为毯草黄单胞（Xanthomonas axonopodis）引起的病害。

3.一种来源于内生帚枝霉属真菌的激发子蛋白或其编码基因在制备预防木薯病害的药物中的应用；

所述激发子蛋白是如下1)或2)所示的蛋白质：

1）由序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2）由序列表1 SEQ ID №.1的第106-387位氨基酸序列组成的蛋白质；

所述病害为地毯草黄单胞（Xanthomonas axonopodis）引起的细菌性萎蔫病病害。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的应用，其特征在于：所述编码基因的cDNA核苷酸序列如下1)、2）或3）所示：

1）序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列；

2）自序列表中SEQ ID №：2的5’端第316-1164位核苷酸序列；

3）序列表中SEQ ID №：4的核苷酸序列。

5.根据权利要求1-3中任意一项所述的应用，其特征在于：所述编码基因的基因组基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID №：3所示。

6.一种提高木薯抗病性的方法，是使用下述蛋白质防治植物病害：

所述蛋白质是如下1)或2)所示的蛋白质：

1）由序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2）由序列表中的 SEQ ID №.1的第106-387位氨基酸序列组成的蛋白质；

所述植物病害为由地毯草黄单胞（Xanthomonas axonopodis）引起的木薯细菌性萎蔫病病害；

使用所述蛋白质防治植物病害的方式是将所述蛋白质喷施于木薯上或者注射在木薯组织上。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述蛋白质通过如下方法获得：将表达所述蛋白质的重组载体转入毕赤酵母中表达获得所述蛋白质；所述重组载体是将序列所示的DNA片段插入到pRICZA的EcoRⅠ和KpnⅠ酶识别位点之间，获得表达由序列表中的SEQ ID №.1的第106-387位氨基酸序列组成的蛋白质的重组表达载体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述毕赤酵母为毕赤酵母X-33。