CN110357949B

CN110357949B - 一种来源于内生帚枝霉属真菌的激发子蛋白及其编码基因

Info

Publication number: CN110357949B
Application number: CN201910650031.4A
Authority: CN
Inventors: 黄贵修; 杨扬; 蔡吉苗; 王宝; 刘先宝; 陈奕鹏; 徐春华
Original assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Current assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2039-07-18
Also published as: CN110357949A

Abstract

本发明公开了一种来源于内生帚枝霉属真菌Sarocladium brachiariae菌株的激发子蛋白及其编码基因。该激发子蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID

.1的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID

.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有激发子蛋白功能的由SEQ ID

Description

一种来源于内生帚枝霉属真菌的激发子蛋白及其编码基因

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种来源于内生帚枝霉属真菌Sarocladiumbrachiariae HND5菌株的激发子蛋白及其编码基因。

背景技术

蛋白类激发子是源于细菌、真菌分泌的一些蛋白，主要包括过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)、激活蛋白(Activator)等。可通过诱导植物防御相关基因的表达和激活植物体内防御信号途径如水杨酸等来激发植物获得抗性，增强植物自身免疫能力来抵抗病原微生物的侵染。截止目前为止发现了许多新的蛋白类的激发子，但目前未发现帚枝霉属真菌中可诱导植物产生抗病性的激发子蛋白及其编码基因的有关报道。

发明内容

本团队从臂形草叶片中分离得到的一株高效内生生防菌株——帚枝霉属内生真菌Sarocladium brachiariae HND5菌株。在对HND5菌株进行了全基因组测序，通过生物信息学分析时，从其基因组中发现并鉴定得到了一个编码外泌激发子的基因，将其编码的激发子蛋白命名为SbES。

基于此，本发明的目的是提供一种能够提高植物抗性和诱导植物防御反应的激发子蛋白SbES及其编码基因。

本发明所提供的具有提高植物抗性和诱导植物防御反应活性的激发子蛋白，来源于内生帚枝霉属真菌(Sarocladium brachiariae)HND5菌株，命名为SbES，具如下1)或2)或3)生物学特性的蛋白质：

1)由序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)由序列表中SEQ ID №.1的第106-387位氨基酸序列组成的蛋白质；

3)将序列表中的SEQ ID №.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有激发子蛋白功能的由SEQ ID №：1衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №.1由387个氨基酸残基组成。

为了便于SEQ ID №.1编码的SbES纯化，可在由序列表中SEQ ID №.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述SbES可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述SbES的编码基因可通过将序列表中序列2自5′末端第1-1164位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述内生帚枝霉属真菌Sarocladium brachiariae HND5菌株激发子蛋白(SbES)的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述内生帚枝霉属真菌Sarocladium brachiariae HND5菌株激发子蛋白的cDNA为具如下1)或2)或3)生物学特性的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述内生帚枝霉属真菌Sarocladium brachiariae HND5菌株激发子蛋白的DNA分子；

3)与序列表中序列2的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且编码蛋白具有提高植物抗性和诱导植物防御反应活性功能的核苷酸序列。

序列表中序列2全长为1164个核苷酸，编码一个长度为387个氨基酸(序列表中序列1)、分子量约为39kD的蛋白，即为内生帚枝霉属真菌Sarocladium brachiariae HND5菌株激发子蛋白(SbES)，1-45个碱基为SbES蛋白信号肽编码序列，46-315个碱基是前肽编码序列，316-1164个碱基是外泌成熟多肽编码序列。

所述内生帚枝霉属真菌Sarocladium brachiariae HND5菌株激发子蛋白(SbES)的基因组基因的核苷酸序列如下1)、2)、或3)所示：

1)序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列；

2)在严格条件下可与1)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列；

3)与序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且编码蛋白具有提高植物抗性和诱导植物防御反应活性功能的核苷酸序列。

序列表中序列3全长为1375个核苷酸，自序列3的5’端第1-276位核苷酸是第一个外显子，第277-341位核苷酸是第一个内含子，第342-527位核苷酸是第二个外显子，第528-595位核苷酸是第二个内含子，第596-1102位核苷酸是第三个外显子，第1103-1179位核苷酸是第三个内含子，第1180-1375位核苷酸是第四个外显子，编码序列表中序列1所示的蛋白质。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

所述编码基因还可以是密码子优化的核苷酸，如所述编码基因可以为序列表中序列4，该序列可在毕赤酵母中表达上述激发子蛋白，并且，通过密码子优化使表达量增加并且表达活性也很高，该序列4也属于本发明的保护范围。

含有所述内生帚枝霉属真菌Sarocladium brachiariae HND5菌株激发子蛋白(SbES)的编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体为将序列表中序列4所述的核苷酸片段插入到出发载体获得的表达激发子蛋白的重组载体，所述出发载体优选为pRICZA。优选的，所述转基因重组菌为将该重组表达载体转入酵母中获得表达激发子蛋白的转基因重组菌；所述酵母优选为毕赤酵母X-33菌株。

所述的蛋白质及其编码基因在作为激发子蛋白激发植物防卫反应、过敏反应和/或激发植物抗病基因表达中的应用、和/或在作为蛋白农药来防御病虫害的侵害中的应用，也属于本发明的保护范围，所述植物优选为辣椒。

该蛋白质具有诱导辣椒产生对棒孢霉叶斑病抗性的活性，可以引起辣椒叶片的微过敏性坏死反应，激发辣椒叶片活性氧爆发和胼胝质积累，并能激发辣椒中抗病基因过量表达的功能，为一种具有提高植物抗性和诱导植物防御反应活性的激发子蛋白。它能够引起植物防卫反应，通过与植物细胞表面或亚细胞表面的受体结合激活植物体内的级联信号系统以及诱导防卫基因的表达等防御机制在抗病信号途径中发挥作用，具有化学农药所不具备的优势和特点，可作为一种新型微生物蛋白农药来防御病虫害的侵害。

附图说明

图1为实施例2中His-SbES融合蛋白的SDS-PAGE蛋白胶图。

图2为实施例3中His-SbES融合蛋白诱导辣椒产生抗棒孢霉叶斑病活性结果图。

图3为实施例4中His-SbES融合蛋白在辣椒叶片上micro-HR反应。

图4为实施例4中His-SbES融合蛋白在辣椒叶片上诱导活性氧积累。

图5为实施例4中His-SbES融合蛋白在辣椒叶片上诱导胼胝质积累。

图6为实施例5中His-SbES融合蛋白喷施辣椒叶片后抗性相关基因的相对表达量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、激发子蛋白SbES的编码基因及其cDNA的克隆

本团队从臂形草叶片中分离得到的一株高效生防菌株，经鉴定为内生帚枝霉属真菌Sarocladium brachiariae，命名为内生帚枝霉属真菌Sarocladium brachiariae HND5(Liu X,Guo Z,Huang G:Sarocladium brachiariae sp.nov.,an endophytic fungusisolated from Brachiaria brizantha.Mycosphere 2017,8:827-834.)。本发明的发明人，将该菌株进行全基因组测序数据的基础上，通过与亲缘属真菌已报道激发子序列进行比对分析，发现并鉴定得到的可能提高植物抗性和诱导植物防御反应活性的激发子蛋白基因。

本发明的激发子蛋白基因全长编码DNA和全长cDNA片段的获得方法如下所述：

以Sarocladium brachiariae HND5菌株提取的总DNA为模板，设计特异引物SbES-F和SbES-R，利用PCR技术扩增获得SbES基因的全长编码DNA片段；已Sarocladiumbrachiariae HND5菌株提取的总RNA为模板，设计特异引物SbES-F和SbES-R，利用RT-PCR技术扩增获得SbES基因的全长cDNA片段。引物序列如下：

SbES-F：5′-ATGCGTTTCTCACTCGTCCT-3′；

SbES-R：5′-TTAACCAGAGGGGTTGCCGT-3′。

在PDA培养基上生长3天的Sarocladium brachiariae HND5菌株，收集菌丝后提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，用SbES-F和SbES-R组成的引物对进行PCR扩增(靶序列约1375bp)。PCR扩增体系为：2.5μL的10×PCR buffer(Mg²⁺free)，1.8μLMgCl₂(25mM),0.5μL的dNTPs(10mM)，0.2μLTaq酶(5U/μL)，1.0μL模板基因组DNA，正向引物和反向引物(10mM)各加0.5μL，加ddH2O补足25μL。反应程序如下：94℃预变性5min后，进入94℃30s，57℃30s，72℃50s，32个循环，最后在72℃下延伸10min。将PCR扩增产物回收连接pMD18-T载体(TaKaRa)，转化大肠杆菌DH5α，质粒经酶切鉴定，正确的克隆送到北京华大基因技术有限公司进行测序，测序结果如序列表的序列3所示，转录生成序列表的序列2所示的cDNA扩增片段(序列2和序列3均可以通过人工合成获得)。

在PDA培养基上生长7天的Sarocladium brachiariae HND5菌株，收集菌丝后提取总RNA并反转录得到cDNA。以cDNA为模板，用SbES-F和SbES-R组成的引物对进行PCR扩增(靶序列约1164bp)。PCR扩增体系为：2.5μL的10×PCR buffer(Mg²⁺free)，1.8μLMgCl₂(25mM),0.5μL的dNTPs(10mM)，0.2μLTaq酶(5U/μL)，1.0μL模板cDNA，正向引物和反向引物(10mM)各加0.5μL，加ddH2O补足25μL。反应程序如下：94℃预变性5min后，进入94℃30s，57℃30s，72℃30s，32个循环，最后在72℃下延伸10min。将PCR扩增产物回收连接pMD18-T载体(TaKaRa)，转化大肠杆菌DH5α，质粒经酶切鉴定，正确的克隆送到北京华大基因技术有限公司进行测序，测序结果如序列表的序列2所示，编码序列表的序列1所示的蛋白质。将经测序表明外源插入片段为序列2的重组质粒命名为pMD18-T/SbES。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为SbES蛋白。将编码SbES蛋白的基因命名为SbES基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。

实施例2、SbES蛋白的真核表达与纯化

一、基于毕赤酵母密码子偏好性的cDNA序列优化

为使用毕赤酵母X-33菌株进行SbES蛋白的异源表达，根据毕赤酵母的密码子偏好性，排除掉SbES蛋白的信号肽及前肽编码基因，对序列2的316-1164位核苷酸进行密码子优化，获得序列4，编码自序列表中序列1的氨基端第106-387位氨基酸所示的蛋白质。序列4由北京华大生物技术有限公司负责合成。

二、真核表达载体构建

用引物SbES-PF和SbES-PR进行配对，以序列4为模板，扩增得到的片段连接到T载体上，命名为pMD18-T/SbESp；用EcoR I和Kpn I双酶切pMD18-T/SbESp，回收小片段插入到pRICZA相同的酶切位点间，得到的重组载体命名为pRICZA/SbES。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pRICZA/SbES。该表达载体pRICZA/SbES表达的蛋白为由序列表中的SEQ ID №.1的第106-387位氨基酸序列组成的蛋白质(携带His标签方便纯化)。所用引物序列如下：

SbES-PF：5′-TCATGGCTTACACTACTCAATCTGC-3′；

SbES-PR：5′-GTTGAAAGCCAATCTGTCAGCAGTA-3′。

三、SbES蛋白的真核表达菌株构建

提取pRICZA/SbES质粒用Sac I进行单酶切，使重组表达载体完全线性化，并回收线性化后的质粒片段。向80μL毕赤酵母X-33电击感受态细胞中添加10μg线性化后的pRICZA/SbES质粒，混匀后加入到0℃(提前放在冰上)的0.2cm的电转化杯中，冰上孵育5min后，将电转化槽置于Bio-Rad Pulser电转化仪上，进行电转化，采用电击转化仪中储存的毕赤酵母所设定转化参数进行电击。电击后，立即在电转化槽中加入1mL 0℃的1M sorbital，用移液器快速混合后把电转化槽中的混合物转入到灭过菌的1.5mL离心管中，并在30℃静置培养约1.5h。取200μL培养液涂布于含有100μg/mL Zeocin的YPDS平板上，待菌液被完全干后，将平板在28℃倒置培养4～6d，可见有菌落长出。验证正确后即得到SbES蛋白的毕赤酵母表达菌株。

四、SbES蛋白的真核表达和蛋白纯化

将SbES蛋白的毕赤酵母表达菌株接种于含有50mL BMGY培养基的锥形瓶中，于28℃，230r/min条件下震荡培养约20h(OD600＝3.5左右)；将摇培好的菌液用50mL无菌的离心管收集，在25℃，2000g的条件下离心5min，弃上清液，将菌体转移至含有100mL BMMY培养基的锥形瓶中，并用四层无菌纱布封口，置于28℃，230r/min条件下震荡培养，进行诱导表达；每隔24h向培养物中加入100％甲醇，使其终浓度为1％，共诱导120h；收集1L发酵液的菌体，使用100mL PBS Buffer缓冲液(pH为6.5)重悬菌体，加入10μL DNA酶；菌体在冰水混合上采用新芝超声波细胞破碎仪进行破碎，程序为：150W，破碎5sec，暂停5sec，总用时30min，整个过程中隔10min重新混匀破碎结束后12000r/min，4℃，离心30min，所获上清为重组蛋白粗提物。

利用GE Healthcare的HisTrap亲和柱进行重组蛋白的纯化；使用10mL 20mM咪唑平衡亲和柱后，按照2mL/min的流速，将重组蛋白粗提物进行过柱；依次使用40mL浓度为20mM，40mM，60mM，80mM咪唑的PBS Buffer洗脱亲和柱；用10mL浓度为200mM咪唑的PBSBuffer洗脱亲和柱，收集洗脱液，使用SDS-PAGE电泳检测蛋白质量；使用10kDa MilliporeAmicon Ultra-15超滤管，浓缩并将重组蛋白溶液置换为不含有咪唑的PBS缓冲液。

结果见图1，经SDS-PAGE电泳，获得一个分子量约为32kD的His-SbES融合表达蛋白，与预测的大小一致。并且His-SbES融合蛋白富集在上清液里，纯化后的蛋白条带单一、无杂带。图1注：M为Marker，泳道1为用20mM咪唑洗下的杂蛋白；泳道2为用40mM咪唑洗下的杂蛋白；泳道3为用60mM咪唑洗下的杂蛋白；泳道4为用80mM咪唑洗下的杂蛋白；泳道5为用200mM咪唑洗下的目的蛋白。

实施例3、His-SbES融合蛋白诱导辣椒产生对棒孢霉叶斑病抗性

将重组蛋白His-SbES浓度调至0.1mg/mL，喷雾处理4～5片真叶期的辣椒幼苗8株两次，间隔3d，选用PBS缓冲液作为对照。3d后接种辣椒多主棒孢病菌(Corynesporacassiicola)(通过常规方法分离并经过鉴定对辣椒具有很强的致病性)孢子悬浮液浓度为1×10⁵个/mL，在30℃，相对湿度90％条件下10d后，调查发病情况，实验重复3次。

实验结果见图2，结果显示，CK仅使用PBS缓冲液处理，接种多主棒孢孢子后落叶明显且叶片上病斑多；使用0.1mg/mL的His-SbES重组蛋白处理后，辣椒幼苗基本没有发病，病斑少。结果显示His-SbES重组蛋白可有效诱导辣椒产生对棒孢霉叶斑病抗性。

实施例4、His-SbES融合蛋白在辣椒上引起的防御反应

一、His-SbES融合蛋白在辣椒上引起的micro-HR反应

micro-HR指诱导物导致的少量植物细胞死亡，植物通过micro-HR可将入侵病原菌限制在单个细胞中，达到防病的效果，是植物抗病反应的指标。台盼蓝可染色死细胞，但无法染色活细胞，通过此原理可检测micro-HR。

用1mL无针头注射器，将50μL浓度为0.1mg/mL纯化的SbES蛋白注射辣椒叶片，蛋白缓冲液PBS Buffer为对照。取处理24h的辣椒叶片，并用剪刀裁剪。将辣椒叶片置于台盼蓝溶液中，台盼蓝溶液中含有台盼蓝15mg、乳酸(85％)10mL、甘油(98％)10mL、水饱和酚10mL、ddH2O 10mL。通过冷冻干燥机进行抽真空，约5～10min，溶液完全进入叶片组织及细胞间隙，叶片不在漂浮于表面即可，在沸水浴中加热5min。将染好色的辣椒叶片置于无水乙醇中，沸水浴脱色至完全透明，每个处理重复3次，在Nikon显微镜下观察拍照。

结果如图3所示，His-SbES融合蛋白能够引起辣椒叶片产生micro-HR反应。图3中，A为4X物镜下对照处理，B为20X物镜下对照处理，C为40X物镜下对照处理，D为4X物镜下SbES蛋白处理，E为20X物镜下SbES蛋白处理，F为40X物镜下SbES蛋白处理。

二、His-SbES融合蛋白诱导辣椒叶片过氧化氢的积累

过氧化氢积累可抑制入侵病原菌的生长，并能诱导抗病相关信号途径的转导。

将50μL浓度为0.1mg/mL纯化的SbES蛋白注射辣椒叶片，处理24h后，将处理的叶片先用清水洗净，置于10mL离心管中，取6mL DAB染料(1mg/mL，pH 5.8)加入离心管中，在室温，避光的条件下染色过夜，去除各管中染液，加入100％乙醇去除叶绿素，沸水浴数分钟，移液枪吸除各管液体，再加入无水乙醇并沸水浴直至叶片绿色完全脱去为止，再次吸出各管液体，将叶片浸泡在70％甘油中，用镊子小心赶出细胞间气泡，显微镜观察。蛋白缓冲液PBS Buffer为对照，每个处理重复3次。

结果如图4所示，His-SbES融合蛋白能够诱导辣椒叶片过氧化氢的积累。A为4X物镜下对照处理，B为10X物镜下对照处理，C为20X物镜下对照处理，D为40X物镜下对照处理，E，I为4X物镜下SbES蛋白处理，F，J为10X物镜下SbES蛋白处理E，G，K为20X物镜下SbES蛋白处理，H，L为40X物镜下SbES蛋白处理。

三、His-SbES融合蛋白诱导诱导辣椒叶片胼胝质的积累

胼胝质的积累可增强植物细胞结构强度，阻挡病原菌的入侵。

将50μL浓度为0.1mg/mL纯化的SbES蛋白注射辣椒叶片，取处理24h的辣椒叶片，并用剪刀裁剪。将叶片置于卡诺溶液(乙醇：冰醋酸＝3:1)，真空抽气10min后，固定过夜，染色之前用50％乙醇浸泡2h使叶片组织软化，用清水冲净。将叶片置于pH值9.5、0.1％的苯胺蓝染色液(0.1g苯胺蓝溶于100mL 0.15mol/L K2HPO4缓冲液)中染色过夜，用清水洗净，在Nikon荧光显微镜下观察是否有胼胝质积累，蛋白缓冲液PBS Buffer为对照，每个处理重复3次。

结果如图5所示，蛋白SbES处理的叶片有蓝白色的荧光物质积累，而用PBS Buffer蛋白缓冲液处理的对照辣椒叶片没有观察到蓝白色荧光物质的积累，说明His-SbES融合蛋白能够诱导辣椒叶片胼胝质的积累。

四、His-SbES融合蛋白提高辣椒抗性相关基因的转录水平

用浓度为0.1mg/mL纯化后重组表达的SbES诱抗蛋白喷施辣椒叶片后，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h取辣椒叶片，对照采用PBS Buffer喷施处理。液氮速冻。使用RNAprep Pure多酚多糖植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)进行RNA的提取，使用FastQuant cDNA试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)进行反转录cDNA第一链的合成，使用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)进行基因表达量的相对定量实时荧光PCR检测。

依次用CaEIN2-F/CaEIN2-R、CaMYB306-F/CaMYB306-R、CaNPR1-F/CaNPR1-R、CaPAL-F/CaPAL-R、CaRBOH-A-F/CaRBOH-A-R、CaRBOH-C-F/CaRBOH-C-R、CaSAMES-F/CaSAMES-R、CaPDF1.2-F/CaPDF1.2-R、CaChia5-F/CaChia5-R和CaPR1-F/CaPR1-R配对检测CaEIN2、CaMYB306、CaNPR1、CaPAL、CaRBOH-A、CaRBOH-C、CaSAMES、CaPDF1.2、CaChia5和CaPR1基因，采用CaEF-1α基因作为内参基因。引物序列见表2。

表2.本研究所用引物

结果如图6所示，His-SbES融合蛋白处理辣椒叶片能激活相关抗性相关基因的表达。

序列表

<110>中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120>一种来源于内生帚枝霉属真菌的激发子蛋白及其编码基因

<130>WHOI190079

<170>Patent-In 3.5

<160> 4

<210> 1

<211> 387

<212> PRT

<213> 帚枝霉菌（Sarocladium brachiariae）

<400> 1

Met Arg Leu Ser Leu Val Leu Ala Leu Leu Pro Ala Ala Leu Gly Ala

1 5 10 15

Pro Thr Arg Arg Asp Glu Pro Ala Pro Leu His Val Pro Arg Gly Val

20 25 30

Asp Ser Leu Ile Lys Asp Thr Tyr Ile Val Lys Tyr Lys Asp Ile Thr

35 40 45

Ala Met Ser Ala Val Asp Glu Gly Leu Lys Val Leu Pro Gly Lys Pro

50 55 60

Glu Arg Val Phe Lys Gly Ala Phe Lys Gly Phe Ala Gly Lys Ile Asp

65 70 75 80

Ala Lys Thr Leu Glu Leu Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Asp Phe Ile

85 90 95

Glu Gln Asp Ala Ile Val Lys Leu Ala Ala Tyr Thr Thr Gln Ser Ala

100 105 110

Ala Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Thr Arg Gln Arg Gly Pro Thr

115 120 125

Gly Tyr Thr Tyr Asp Thr Ser Ala Gly Gln Gly Thr Cys Ser Tyr Ile

130 135 140

Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Phe Gly Gly Arg Ala Phe

145 150 155 160

Gln Leu Ile Ser Tyr Gln Gly Gly Asn Ala Asp Gly Asn Gly His Gly

165 170 175

Thr His Val Ala Gly Thr Ile Gly Ser Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys

180 185 190

Ala Thr Thr Leu Leu Gly Val Lys Val Leu Ser Asp Ser Gly Ser Gly

195 200 205

Ser Ile Ser Gly Ile Ile Ser Gly Met Asn Tyr Val Val Ser Asp Ser

210 215 220

Arg Thr Arg Ser Cys Pro Arg Gly Ala Phe Ala Asn Met Ser Leu Gly

225 230 235 240

Gly Gly Tyr Ser Ala Ser Leu Asn Ser Ala Ala Lys Ser Met Val Asp

245 250 255

Asn Gly Val Phe Leu Ala Val Ala Ala Gly Asn Glu Asn Gln Asn Ala

260 265 270

Ala Asn Val Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala

275 280 285

Thr Thr Ser Thr Asp Ala Arg Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ala Leu

290 295 300

Val Asp Ile Phe Ala Pro Gly Gln Gly Ile Leu Ser Thr Trp Pro Gly

305 310 315 320

Ser Ser Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Ile

325 330 335

Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Ala Gly Leu Glu Gly Asn Pro Gly Ala

340 345 350

Ser Ala Met Cys Gly Arg Ile Ile Gln Leu Ala Thr Thr Gly Val Ile

355 360 365

Thr Gly Leu Pro Ser Gly Thr Ala Asp Arg Leu Ala Phe Asn Gly Asn

370 375 380

Pro Ser Gly

385

<210> 2

<211> 1164

<212> DNA

<213> 帚枝霉菌（Sarocladium brachiariae）

<400> 2

atgcgtctct ctctcgtcct cgcccttctc cctgccgccc tcggtgctcc cacgaggcgc 60

gatgagcccg ctccccttca tgttcctcgt ggcgtcgaca gcctgatcaa ggacacctac 120

atcgtcaagt acaaggacat tactgccatg tctgctgtcg atgaaggcct caaggttctt 180

cccggcaagc ccgagcgtgt cttcaaaggt gccttcaagg gctttgctgg caagattgat 240

gccaagactc tggagctcct ccgtgatgat cccagtgtcg acttcattga gcaggatgct 300

atcgtgaagc tcgctgccta caccacccag tcggccgccc catggggcct tgcccgtatc 360

tctactcgtc agcgtggtcc tactggatat acgtacgaca ccagcgctgg tcaaggaaca 420

tgttcctaca tcctcgacac tggcattcag gccagccacc ccttcggtgg acgagccttc 480

cagctcatct cctaccaagg cggcaatgcc gatggtaacg gtcatggcac tcacgttgcc 540

ggtaccattg gctccagaac ctacggtgtt gccaaggcta ccaccctgct cggtgtcaag 600

gtcctgagtg actcgggctc tggctccatc tctggcatca tctccggcat gaactatgtt 660

gtcagcgact ctcgcacccg tagctgccct cgcggtgcat tcgccaacat gtctctcggt 720

ggaggctact ccgcctcgct caacagcgct gccaagtcca tggtagacaa tggcgtcttc 780

cttgctgttg ctgccggtaa cgagaaccag aatgctgcca acgtatctcc cgcgtctgag 840

cccagcgtct gcacggtcgg cgccaccact tccactgatg cccgtgcttc cttctccaac 900

tacggcgctc ttgtcgatat cttcgctcct ggccagggta ttctgtctac ctggcccggc 960

agcagcacca acaccatctc tggcacctcc atggcctccc ctcatattgc tggtcttgcc 1020

gcttacctgg ctggccttga gggtaaccct ggtgcctcgg ccatgtgcgg acgtatcatc 1080

cagcttgcca ccactggtgt catcactggc ctgcccagcg gtaccgccga ccgcctcgcc 1140

ttcaacggca acccctctgg ttaa 1164

<210> 3

<211> 1375

<212> DNA

<213> 帚枝霉菌（Sarocladium brachiariae）

<400> 3

atgcgtctct ctctcgtcct cgcccttctc cctgccgccc tcggtgctcc cacgaggcgc 60

gatgagcccg ctccccttca tgttcctcgt ggcgtcgaca gcctgatcaa ggacacctac 120

atcgtcaagt acaaggacat tactgccatg tctgctgtcg atgaaggcct caaggttctt 180

cccggcaagc ccgagcgtgt cttcaaaggt gccttcaagg gctttgctgg caagattgat 240

gccaagactc tggagctcct ccgtgatgat cccagtgtaa gtggtctcgt cccgtggtca 300

aagtgtagat aggataatgt ccctgacacg ttccatcaca ggtcgacttc attgagcagg 360

atgctatcgt gaagctcgct gcctacacca cccagtcggc cgccccatgg ggccttgccc 420

gtatctctac tcgtcagcgt ggtcctactg gatatacgta cgacaccagc gctggtcaag 480

gaacatgttc ctacatcctc gacactggca ttcaggccag ccaccccgta agcgctgcac 540

attgctccct cgcccatttc cctcggccca tactgacctg accttcatca tatagttcgg 600

tggacgagcc ttccagctca tctcctacca aggcggcaat gccgatggta acggtcatgg 660

cactcacgtt gccggtacca ttggctccag aacctacggt gttgccaagg ctaccaccct 720

gctcggtgtc aaggtcctga gtgactcggg ctctggctcc atctctggca tcatctccgg 780

catgaactat gttgtcagcg actctcgcac ccgtagctgc cctcgcggtg cattcgccaa 840

catgtctctc ggtggaggct actccgcctc gctcaacagc gctgccaagt ccatggtaga 900

caatggcgtc ttccttgctg ttgctgccgg taacgagaac cagaatgctg ccaacgtatc 960

tcccgcgtct gagcccagcg tctgcacggt cggcgccacc acttccactg atgcccgtgc 1020

ttccttctcc aactacggcg ctcttgtcga tatcttcgct cctggccagg gtattctgtc 1080

tacctggccc ggcagcagca ccgtgagttc acctccgaaa tcactgcaga ctcttcagag 1140

tttgcctgta tgcttgcttg tatactgaca tctcccccag aacaccatct ctggcacctc 1200

catggcctcc cctcatattg ctggtcttgc cgcttacctg gctggccttg agggtaaccc 1260

tggtgcctcg gccatgtgcg gacgtatcat ccagcttgcc accactggtg tcatcactgg 1320

cctgcccagc ggtaccgcca accgcctcgc cttcaacggc aacccctctg gttaa 1375

<210> 4

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

gaattcatgg cttacactac tcaatctgct gctccatggg gtcttgctag aatttccact 60

agacagagag gtccaaccgg ttacacttac gatacttccg ctggtcaagg tacttgctcc 120

tacattttgg acactggtat ccaggcttct cacccatttg gtggtagagc tttccagctg 180

atttcctacc aaggtggtaa cgctgatggt aacggtcatg gtactcatgt tgctggtact 240

atcggttcca gaacttacgg tgttgctaag gccactacct tgttgggtgt taaggttttg 300

tctgactctg gttccggttc catctccggt attatttccg gtatgaacta cgtcgtgtcc 360

gactccagaa ctagatcttg tccaagaggt gctttcgcca acatgtctct tggtggtggt 420

tactctgctt ccttgaactc tgctgctaag tccatggttg acaacggtgt tttcttggct 480

gttgctgccg gtaacgagaa tcaaaacgct gctaacgttt ctccagcttc tgaaccatcc 540

gtctgtactg ttggtgctac tacttctact gacgctagag cttccttctc caactacggt 600

gctttggttg acattttcgc tccaggtcag ggtattttgt ctacttggcc aggttcctcc 660

actaacacca tttctggtac ttctatggct tccccacaca ttgctggttt ggctgcttat 720

ttggctggat tggaaggtaa cccaggtgct tctgctatgt gcggtagaat tatccagttg 780

gctaccaccg gtgtcatcac tggtttgcca tctggtactg ctgacagatt ggctttcaac 840

ggtaacccat ctggtggtac c 861

Claims

1.一种具有激发子蛋白功能的蛋白质，是如下1)或2)所示的蛋白质：

1）由序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2）由序列表中的SEQ ID №.1的第106-387位氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为来源于帚枝霉属真菌的激发子蛋白,是具有提高植物抗性和诱导植物防御反应的蛋白质。

3.权利要求1或2所述的蛋白的编码基因。

4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的cDNA核苷酸序列如下1)或2）所示：

1）序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列；

2）自序列表中SEQ ID №：2的5’端第316-1164位核苷酸序列。

5.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的基因组基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID №：3所示。

6.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

7.含有权利要求3、4、5或6所述的编码基因的重组表达载体。

8.含有权利要求3、4、5或6所述的编码基因的转基因细胞系。

9.含有权利要求3、4、5或6所述的编码基因的转基因重组菌；所述转基因重组菌为将权利要求7所述的重组表达载体转入酵母中获得表达激发子蛋白的转基因重组菌；所述酵母为毕赤酵母X-33菌株。