CN108522508A - 蛋白质激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蛋白质激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，农作物为小麦，蚜虫是麦长管蚜。其应用包括以下步骤：采用蛋白激发子PeaT1对小麦种子进行浸种，蛋白激发子PeaT1的用量为30～90ug/ml，浸种的环境为黑暗环境。在盆栽实验中，60ug/ml的PeaT1浸种+喷雾处理小麦，能够显著抑制蚜虫的种群数量，喷雾前抑制水平为33.9％，喷雾后7天内抑制水平均在50％左右。

Description

蛋白质激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用

技术领域

本发明涉及蛋白质激发子领域，特别是涉及一种蛋白质激发子的应用。

背景技术

在漫长的进化中，植物和昆虫之间建立了十分复杂的关系。植物为防御昆虫入侵，建立起复杂且完善的防御机制，同时，昆虫也在逐渐适应植物的防御机制。植物的防御机制分为基础防御机制和诱导防御机制。在诱导防御机制中，植物在经历激发子短时间的刺激后，体内快速积累毒性化学物质，如酚类、酮类化合物，和防御性蛋白质，如蛋白质抑制酶、多酚氧化酶、几丁质酶等，从而提高其自身的抗性(Cmichael,S.and B.Elenav(2007).植物蚜虫抗性和防御反应的分子机制.昆虫学试验和应用122(1):1–16；Zhao,L.Y.,J.L.Chen,D.F.Cheng,J.R.Sun,Y.Liu and Z.Tian(2009).麦长管蚜诱导小麦防御反应的生化和分子机制.作物保护28(5):435-442.)。喷洒外源茉莉酸，可以显著增强马铃薯对马铃薯蚜虫的抗性(Cohen,Y.,U.Gisi,T.Niderman(1993).茉莉酸及茉莉酸甲酯诱导马铃薯和番茄对致病疫霉产生抗性.病理学83(10):1054-1062)，显著降低麦长管蚜的种群数量(Bruce,T.J.,J.L.Martin,J.A.Pickett,B.J.Pye,L.E.Smart,L.J.Wadhams(2003).顺-茉莉酮诱导抗性.有害生物管理科学59:1031-1036)，也可以诱导植物相邻未处理叶片的PI的基因表达(Farmer,E.E.,C.A.Ryan(1992).茉莉酸前提激活损伤诱导蛋白酶抑制子合成.植物细胞4(2):129-134.)。外源蔗糖或果糖处理，可以降低玉米螟的叶片产卵量，也可降低苹果蠹蛾在苹果叶片上的着落率(S.Derridj,I.A.,N.Lombakia,EFerre,H.Galy,J.Lambion,J.Auger(2011).可溶性糖诱导植物产生抗性.AFPP–第四届会议国际作物保护会议.法国：里尔.)。甜菜夜蛾幼虫的唾液提取物诱导玉米幼苗产生挥发性物质吸引寄生蜂，以减少甜菜夜蛾幼虫的危害(Alborn,H.,T.Turlings,T.Jones,G.Stenhagen,J.Loughrin,J.Tumlinson(1997).甜菜夜蛾幼虫唾液分泌物诱导植物产生挥发性物质.科学276(5314):945-949.)。麦长管蚜唾液处理小麦叶片后，会显著降低麦长管蚜的产卵量(Zhang,Y.,J.Fan,F.Francis,J.Chen(2017).麦长管蚜唾液分泌物激发小麦抗虫性.农业与食品化学65(40):8798.)。

PeaT1是发明人从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离到的一种蛋白激发子，具有显著的促生长作用和抗性诱导作用。前期研究证明，小麦经Peat1蛋白浸种处理后，其根长比对照组明显增长(刘峥,张宁,李承雷,杨秀芬,董健伸,袁京京,赵明治,邱德文和龙承祖(2010).CN200610152700.8一种提高植物抗性促进植物生长的蛋白质及其编码基因)，内源表达该蛋白基因能够增加水稻的抗旱性(Shi,F.,Y.Dong,Y.Zhang,X.Yang andD.Qiu(2017).PeaT1在水稻植株中过表达可以提高抗旱能力.植物科学前沿8:970.)，PeaT1还可通过水杨酸途径诱导烟草产生抗性，对TMV的防治效果十分显著(Zhang,W.,X.Yang,D.Qiu,L.Guo,H.Zeng,J.Mao and Q.Gao(2011).PeaT1诱导烟草水杨酸途径系统获得性抗性.Molecular Biology Reports 38(4):2549-2556.)。

发明内容

中国发明专利ZL200610152700.8(一种提高植物抗性促进植物生长的蛋白质及其编码基因)的说明书和权利要求书的全文内容引用至此。

在上述专利申请中，发明人公开了一种能够促进植物生长、提高植物抗病性的来自于极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)JH505菌株的蛋白质及编码该蛋白质的核苷酸序列，其中的蛋白质是一种蛋白质激发子，命名为PeaT1(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)；其编码基因为PeaT1基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)。

本发明的目的是提供一种蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用。其技术方案具体如下：

蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，所述农作物为小麦。

本发明所述的蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，所述蚜虫是麦长管蚜。

本发明所述的蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，包括以下步骤：采用蛋白激发子PeaT1水溶液对小麦种子进行浸种。

本发明所述的蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，所述蛋白激发子PeaT1的用量为30～90ug/ml；优选为60ug/ml。

本发明所述的蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，所述浸种的环境为黑暗环境。

本发明上述的蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，采用蛋白激发子PeaT1对小麦进行喷雾处理。

本发明所述的蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，所述喷雾中蛋白激发子PeaT1的用量为30～90ug/ml；优选为60ug/ml。

本发明所述的蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，在寄主选择性试验中，包括以下步骤：

以30～90ug/ml的蛋白激发子PeaT1对小麦种子黑暗浸种24小时；然后播种；10天后，对小麦进行蛋白激发子PeaT1喷雾处理，用量为30～90ug/ml；以喷自来水为对照；

1天后，分别取处理组和对照组小麦各一盆，置于60cm*60cm*60cm防虫网箱中，相距12cm，中间放置一张12cm*4cm的硬纸板；取30头麦长管蚜成蚜，置于纸板中央；

24小时后分别记录处理组和对照组小麦上的蚜虫数量。

同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

(1)本发明使用蛋白质激发子PeaT1对小麦进行浸种及喷雾处理，诱导小麦产生抗蚜能力，并揭示了小麦对蛋白激发子PeaT1的免疫应答反应。

(2)在盆栽实验中，60ug/ml的PeaT1浸种+喷雾处理小麦，能够显著抑制蚜虫的种群数量，喷雾前抑制水平为33.9％，喷雾后7天内抑制水平均在50％左右。以上结果说明PeaT1能够显著增强小麦的抗蚜能力。

(3)激发子诱导的植物对植食性昆虫的防御方式包括植物本身的物理和化学屏障以及一系列诱导性的防卫反应。研究表明，木质素含量较高的植物对蚜虫的抗性更高(Hu,Q.,J.Zhao,J.Cui(1993).大豆次级代谢产物木质素与抗蚜能力的关系.植物保护19(1):8-9；李刘杰，汪强，韩燕来和谭金芳(2009).钾水平对小麦酚类物质、木质素代谢和接种蚜虫群体动态的影响.中国农学通报2009,25(17):143-148；季春梅,曹辰兴,雷关红,王涛,陈玉茶(2011).黄瓜诱导抗蚜性与次生代谢相关酶活性的关系.山东农业科学10:32-35.)。另外，植物体内的糖含量越高，蚜虫的代谢压力越大，对蚜虫的生存越不利。在辣椒、棉花及小麦上都有相关研究表明抗蚜品种具有更高含量的可溶性糖(谢永寿,杨奇华,谢以铨,谢晓帆(1987).冬小麦品种中糖及氨基酸含量与抗麦长管蚜的关系.植物保护学报(1)；刘旭明,杨奇华(1993)."棉花抗蚜的生理生化机制及其与棉蚜种群数量消长关系的研究."植物保护学报20(1):25-29；陈青(2002)."几种生化物质与辣椒抗蚜性的相关性."园艺学报29(6):533-536.)。在本研究中，PeaT1处理的小麦叶片内可溶性糖含量增加，从而对蚜虫有抗性。综上，PeaT1诱导小麦木质素和可溶性糖积累，从而使小麦表现出对麦长管蚜的抗性。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用作进一步说明。

附图说明

图1为麦长管蚜寄主选择性试验的实验示意图；

图2为麦长管蚜寄主选择性试验结果；

图3为PeaT1处理前后，小麦叶片木质素含量变化；

图4为PeaT1处理前后，小麦叶片可溶性糖含量变化。

具体实施方式

蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，农作物为小麦(Triticumaestivum)，品种为中麦175。蚜虫是麦长管蚜(Sitobion avenae)。

1实验

1.1微生物激发子PeaT1对麦长管蚜种群数量的影响

以60ug/ml的PeaT1对小麦种子(中麦175)黑暗浸种24小时，播种(每盆6颗种子，花盆直径12cm)。每处理4盆重复，以水为对照。小麦2叶期(播种后6-7天)时接种麦长管蚜，每盆10头。10天后，对不同处理的小麦分别进行蛋白喷雾(60ug/ml)。于喷雾前及喷雾后1天、3天、5天、7天统计蚜虫数量，并计算蛋白质激发子PeaT1对麦长管蚜的防治效果。实验重复3次。实验全过程在人工培养箱中进行，温度23±1℃，光周期为16h：8h(L：D)，RH为60％，下同。

1.2麦长管蚜寄主选择性试验

以60ug/ml的PeaT1对小麦种子(中麦175)黑暗浸种24小时，播种(每盆10颗种子)，10天后，对小麦进行PeaT1喷雾处理(60ug/ml)。以喷自来水为对照。1天后，分别取处理组和对照组小麦各一盆，置于60cm*60cm*60cm防虫网箱中，相距12cm，中间放置一张12cm*4cm的硬纸板。取30头麦长管蚜成蚜，置于纸板中央(如图1)。24小时后分别记录处理组和对照组小麦上的蚜虫数量。每处理设4个重复，实验进行3次。

1.3微生物激发子PeaT1处理小麦叶片后木质素含量的变化

以60ug/ml的PeaT1对小麦种子黑暗浸种24小时，播种(每盆10颗种子)，10天后进行PeaT1喷雾处理(60ug/ml)。以水为对照。24小时后，采集小麦叶片约5g，80℃烘干24小时，随后采用TGA法对木质素的含量进行测定(Brinkmann,K.,L.Blaschke,A.Polle(2002).近红外反射光谱校准和脂蛋白应用的基础：不同木质素检测方法的比较.化学生态学28(12):2483-2501)。每处理设3个重复，实验进行3次。以碱性木质素为标准物质，配置0.0025，0.005，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05mg/ml的系列浓度溶液，制作标准曲线。

1.4PeaT1对小麦叶片可溶性糖含量的影响

以60ug/ml的PeaT1对小麦种子黑暗浸种24小时，播种(每盆10颗种子)，10天后进行PeaT1喷雾处理(60ug/ml)，以水处理作为对照。1天后，采集小麦叶片约0.5g，使用苯酚-硫酸法对可溶性糖含量进行测定(Dubois,M.,K.A.Gilles,J.K.Hamilton,P.A.Rebers,F.Smith(1956).比色法测糖含量.分析化学28(3):350-356.)。每处理设5个重复，实验进行2次。以蔗糖为标准物质，配置0.01，0.02，0.03，0.04，0.05mg/ml的系列浓度溶液，制作标准曲线。

1.5数据统计分析

采用Excel及SPSS(Version 18.0)软件对数据进行统计分析。

2结果与分析

2.1麦长管蚜取食PeaT1处理的小麦后种群数量下降

小麦经经过PeaT1浸种及喷雾处理后，麦长管蚜取食幼苗期后种群数量受到明显抑制。如表1所示，喷雾前，PeaT1处理组对蚜虫种群数量的抑制率为33.9％，说明在盆栽条件下，PeaT1浸种能够提高小麦苗期的抗蚜能力。在PeaT1喷雾后一星期内，处理组麦长管蚜的种群数量抑制率均在50％左右。说明喷雾能够在浸种的基础上显著提高小麦的抗蚜能力。

种群数量抑制水平(％)＝(对照组蚜虫数量-处理组蚜虫数量)/对照组蚜虫数量*100％

表1微生物激发子PeaT1对麦长管蚜种群数量的抑制作用(％)

注：daa＝PeaT1施用后天数，下同。

2.2PeaT1处理的小麦对麦长管蚜有明显趋避作用

从麦长管蚜选择性试验结果看，麦长管蚜成蚜偏好取食对照组小麦，说明PeaT1处理的小麦有明显的趋避蚜虫作用。对照组蚜虫平均数量为16.8头，处理组蚜虫平均数量为9.6头。

2.3PeaT1处理增加小麦叶片木质素含量

小麦叶片木质素含量测定结果显示，PeaT1处理过的小麦叶片木质素含量明显高于对照(P<0.05)。对照组平均含量为2.34mg/g*DW，处理组平均含量为2.59mg/g*DW(DW：dryweight，干重)。

木质素浓度(ug/ml)＝24.797*A₂₈₀-0.004

木质素含量(mg/g*DW)＝1000*(24.797*A₂₈₀-0.004)*稀释倍数*体积*ml/(叶片干重*g)

2.4PeaT1处理增加小麦叶片可溶性糖含量

PeaT1处理后，小麦叶片中可溶性糖含量增加(P<0.05)。对照组可溶性糖含量为6.43mg/g*FW，处理组可溶性糖含量为7.50mg/g*FW(FW：fresh weight，鲜重)。

蔗糖浓度(mg/ml)＝10.477*A₄₉₀-0.046

蔗糖含量(mg/g*FW)＝(10.477*A₄₉₀-0.046)*稀释倍数*体积*ml/(叶片鲜重*g)

3结论

用60ug/ml的PeaT1蛋白液浸种及喷雾处理，小麦苗期对麦长管蚜的抗性明显增强，蚜虫种群数量降低50％左右；选择性试验证明蚜虫趋向取食对照组小麦，PeaT1蛋白处理的小麦对蚜虫有明显的趋避作用。说明蛋白激发子PeaT1明显提高小麦的抗蚜能力。

在实验1.1中，PeaT1水溶液浓度还可以为30～90ug/ml(表2)。最终实验结果表明，60ug/ml的效果最佳。

表2微生物激发子PeaT1对麦长管蚜种群数量的抑制作用(％)

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学研究院植物保护研究所

<120> 蛋白质激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 207

<212> PRT

<213> 蛋白质激发子PeaT1(PeaT1)

<400> 1

Met Ala Asn Pro Arg Ile Glu Glu Leu Pro Asp Glu Pro Glu Lys Lys

1 5 10 15

Asn Val Gln Ile Glu Glu Asp Glu Ser Ser Asp Glu Ser Glu Gly Glu

20 25 30

Glu Gly Glu Val Ser Val Pro Ala Gly Ser Ser Val Ala Val His Ser

35 40 45

Arg Asn Glu Lys Lys Ala Arg Lys Ala Ile Ala Lys Leu Gly Leu Lys

50 55 60

His Ile Asp Gly Ile Thr Arg Val Thr Leu Arg Arg Pro Lys Asn Ile

65 70 75 80

Leu Phe Val Ile Asn Gln Pro Asp Val Tyr Lys Ser Pro Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Trp Ile Ile Phe Gly Glu Ala Lys Ile Glu Asp Leu Asn Ser Gln

100 105 110

Ala Gln Ala Ser Ala Ala Gln Gln Leu Ala Gln Ala Glu Ala Ala Ser

115 120 125

His Asp His Ala Gly His Asp His Gly Asp Glu Ala Ser Lys Gly Lys

130 135 140

Gly Lys Ala Val Glu Asp Lys Lys Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp

145 150 155 160

Glu Glu Ile Asp Asp Ser Gly Leu Glu Ala Lys Asp Ile Glu Leu Val

165 170 175

Met Gln Gln Ala Ser Val Ser Arg Lys Lys Ala Val Lys Ala Leu Lys

180 185 190

Glu Asn Asp Asn Asp Ile Val Asn Ser Ile Met Ala Leu Ser Ile

195 200 205

<210> 2

<211> 624

<212> DNA

<213> PeaT1基因(PeaT1)

<400> 2

atggccaacc cccgcattga agagctcccc gacgagcccg agaagaagaa cgtccagatc 60

gaggaggatg agtccagcga cgagtctgag ggcgaggagg gcgaggtcag cgtacccgcg 120

ggctcctccg tcgctgtcca ctcccgcaac gagaagaagg ctcgcaaggc catcgccaag 180

ctcggcctga agcacatcga cggcatcaca cgcgtcaccc tccgccgacc caagaacatc 240

ctctttgtca tcaaccagcc cgacgtctac aagtcccctt caagcaacac ctggatcatc 300

ttcggtgagg ccaagatcga ggacctcaac tcccaggctc aggcttccgc cgcccagcag 360

cttgctcagg ccgaggccgc atcccacgac cacgccggcc acgaccacgg cgacgaggcc 420

agcaagggca agggcaaggc tgtcgaggac aagaaggacg aggaggagga ggatgacgat 480

gaggagattg acgactctgg ccttgaggcc aaggacatcg agctcgtcat gcagcaggcc 540

agcgtttcgc ggaagaaggc cgtcaaggcc ctcaaggaga acgataacga tatagtcaac 600

tccatcatgg cgctgagcat atag 624

Claims (8)

1.蛋白质激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其特征在于：所述农作物为小麦。

2.根据权利要求1所述的蛋白质激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其特征在于：所述蚜虫是麦长管蚜。

3.根据权利要求1或2所述的蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其特征在于，包括以下步骤：采用蛋白激发子PeaT1水溶液对小麦种子进行浸种。

4.根据权利要求3所述的蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其特征在于：所述蛋白激发子PeaT1的浓度为30～90ug/ml。

5.根据权利要求4所述的蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其特征在于：所述浸种的环境为黑暗环境。

6.根据权利要求1-5任一所述的蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，包括以下步骤：采用蛋白激发子PeaT1对小麦进行喷雾处理。

7.根据权利要求6所述的蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其特征在于：所述喷雾中蛋白激发子PeaT1的用量为30～90ug/ml。

8.根据权利要求7所述的蛋白激发子PeaT1在诱导农作物抗蚜中的应用，其特征在于，在寄主选择性试验中，包括以下步骤：

以30～90ug/ml的蛋白激发子PeaT1对小麦种子黑暗浸种24小时；然后播种；10天后，对小麦进行蛋白激发子PeaT1喷雾处理，用量为30～90ug/ml；以喷自来水为对照；

1天后，分别取处理组和对照组小麦各一盆，置于60cm*60cm*60cm防虫网箱中，相距12cm，中间放置一张12cm*4cm的硬纸板；取30头麦长管蚜成蚜，置于纸板中央；

24小时后分别记录处理组和对照组小麦上的蚜虫数量。