CN101153057A - 一种提高植物抗性促进植物生长的蛋白质及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高植物抗病性和促进植物生长的蛋白质及其编码基因。本发明从链格孢菌(Alternaria)中分离出一种蛋白质PEAt1，具有提高植物抗病性和促进植物生长的功能。本发明还涉及此蛋白及其多核苷酸的制备方法和用途，以及包含此多核苷酸基因构建的表达载体和转化子。

Description

一种提高植物抗性促进植物生长的蛋白质及其编码基因

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及一种促进植物生长和提高植物抗病性的来自链格孢菌(Alternaria spp)菌的蛋白。本发明还涉及编码此蛋白的核苷酸序列，以及包含此核苷酸序列构建的表达载体和转化子。

背景技术：

链格孢菌(Alternaria spp)具有寄生和腐生性，是一类重要的植物病原真菌，引起多种植物病害，对于链格孢菌产生引起的植物病害，已有人做过许多研究。中国专利ZL 01 128666.0(邱德文“植物用多功能真菌蛋白制品及其制备方法”)中公开了从多种植物病原真菌中提取的具有促进植物生长和提高植物抗病性作用的一类蛋白。在中国申请专利号CN200510011580.5(邱德文等“促进植物生长和提高植物抗病性的蛋白质及其人工合成基因”)中公开了从稻瘟菌中分离纯化的蛋白及其相关信息。但至今未明确从链格孢菌(Alternaria spp)中分离纯化的蛋白具有促进植物生长和提高植物抗病性的功能及其相关信息。在GenBank中未发现具有促进植物生长和提高植物抗病性功能的链格孢菌蛋白及核苷酸序列的信息。

发明内容：

本发明的目的是寻找具有促进植物生长和提高植物抗病性的功能蛋白；本发明的另一目的是依据此蛋白的氨基酸序列，通过RT-PCR的方法获得编码此蛋白的基因，用其构建表达载体和转化子，以制备用于促进植物生长和提高植物抗病性的蛋白。

本发明从细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离纯化出了一种蛋白质，编码此蛋白的基因为624bp，由207个氨基酸组成，分子量为22590Da。通过Genbank基因库比对，获知此种蛋白与是在链格孢菌(Alternaria)中未发现的一种蛋白。此蛋白氨基酸组成与Phaeosphaeria nodorum SN15的初生多肽复合酶(nascent polypeptide-associated complex(NAC)GenBank accession number CH445335)蛋白的氨基酸组成相似性为91.98％。

由于此种蛋白来源于链格孢菌，具有促进植物生长和提高植物抗病性的作用，将此蛋白命名为PEAt1。为证实上述分离的PEAt1蛋白的功能，本发明人对其对植物根系生长的促进作用和对烟草花叶病毒病的抑制作用进行了实验研究。证实本发明分离的PEAt1蛋白具有促进植物生长和提高植物抗病性的功能。此蛋白可用于制备促进植物生长和提高植物抗病性的制品。

以编码此蛋白的基因与载体质粒连接获得的重组质粒导入宿主微生物细胞，可得到含此重组质粒的转化子；通过培养此转化子，诱导培养获得的表达蛋白具有促进植物生长和提高植物抗病性作用，可用于制备促进植物生长和提高植物抗病性的制品。所述转化子，宿主微生物细胞均可选自大肠杆菌和毕赤酵母菌。

具体实施方式：

实施例1 PEAt1蛋白的分离与纯化

用PDA液体培养基培养链格孢菌，在28℃下，180r.min^-1，恒温振荡培养2d，抽滤获得的菌丝体，取菌丝块于研钵中用液氮研磨成细粉，迅速加入磷酸提取缓冲液，于沸水浴煮沸20min后，置冰水混合物中降温，在4℃条件下12000r.min^-1离心15min，上清液用微孔过滤器(Ф＝0.22μm)过滤，获得提取液。在蛋白提取液中直接加硫酸铵至终浓度为85％，继续用磁力搅拌器搅拌30min后5000rpm离心30min取沉淀，将沉淀重新用提取缓冲液溶解，按照样品与乙醇体积之比为4∶1加入-20℃预冷无水乙醇，-20℃沉淀30min，4℃5000rpm离心10min，取沉淀，冰浴干燥至无酒精气味，用阴离子交换初始缓冲液溶解后，4℃13000r/min离心30min，获得蛋白粗提液。采用阴离子交换低盐缓冲液透析过夜，获得粗蛋白溶液。然后通过离子交换层析和分子筛凝胶层析获得纯化蛋白。

实施例2 PEAt1蛋白对植物根系生长的促进作用

将小麦种子分别浸种在纯化蛋白稀释至3μg.ml^-1、2μg.ml^-1、1μg.ml^-1的水溶液中，以蒸馏水浸种作为阴性对照。浸种8小时后将种子平铺在培养皿中于28℃光照培养箱光照培养，并加适量蒸馏水以保持湿度。培养7天后随机测量各处理小麦的主根长度，每个处理测量30个平行并取平均值。

从表1看出，在蛋白浓度为1μg/ml时对小麦根系生长仍有促进作用。根长在在激活蛋白浓度为3μg.ml^-1、2μg.ml^-1、1μg.ml^-1时，小麦根长比对照组分别提高了12.29％、11.7％、8.06％。

表1不同浓度蛋白溶液对小麦根长的变化

对照	3μg.ml-1	2μg.ml-1	1μg.ml-1
				10.17±0.85A	11.42±0.325B	11.36±0.552B	10.99±0.4327AB

实施例3 PEAt1蛋白对烟草花叶病毒的抑制作用

珊西烟在防虫温室中培养(20～27℃)，植株长至8叶期时，采用半叶法，用PEAt1蛋白2μg.ml^-1浸叶片10min，以清水作对照，每处理6片叶，每处理重复3次。处理后的叶片置于直径为15cm的培养皿中，于25℃下保湿2天后接种病毒。

采用常规汁液摩擦接种法接种，取毒源烟草病叶加0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)研磨(病毒汁液浓度为每克病叶加50mL0.01moL/L磷酸缓冲液)。处理后的叶片采用半叶法等量接种TMV病毒，3天后记录枯斑数并按下式计算枯斑抑制率。

PEAt1蛋白对TMV在离体叶片上的枯斑数有较高的抑制作用，PEAt1蛋白与清水处理间的单叶枯斑数具有显著差异，枯斑抑制率达45～58％。

用PEAt1蛋白和水分别处理珊西烟叶片的左右两片叶，等量接种病毒后3天后测量枯斑大小，然后将叶片置于37℃下24h后转于25℃下温育3天，再次测量枯斑大小，记录两次枯斑大小的差异，计算枯斑面积增加率。从测量结果显示，PEAt1蛋白不仅能抑制枯斑大小，同时对TMV在叶片上的扩展有一定影响，清水处理枯斑直径增加2.33mm，而PEAt1蛋白处理的枯斑直径增加1.51mm，枯斑扩展抑制率为54.3％，说明PEAt1蛋白能抑制枯斑的进一步扩大，有效控制烟草病毒病病情的进一步发展。

实施例4 PEAt1蛋白的氨基酸序列分析

纯化的PEAt1蛋白经SDS-PAGE检测，切取单带经胰蛋白酶酶解后，用基质辅助激光电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)测定蛋白质的肽指纹图谱。用胰蛋白酶、凝乳蛋白酶、V8酶分别酶解后做液质连用(nanolc-ESI-IT-ms/ms)获得PEAt1蛋白部分肽段氨基酸序列(表2)。

表2 PEAt1蛋白部分肽段氨基酸序列

肽段	氨基酸序列
		PEAt1-1PEAt1-2PEAt1-3PEAt1-4	NILFVINKPDVYKSPSSNTWIIFGEAKDIELVMQQASVSRALKENDNDIVNSIMALSIRPKN I/L I/L FV I/L NQPDVYK

实施例5编码PEAt1蛋白的基因克隆

利用Trizol试剂(Invitrogen)从新鲜培养的链格孢菌中提取总RNA，用M-MuLV逆转录酶获得含有oligo(dT)尾巴的cDNA第一链，首先利用质谱测序获得的氨基酸序列设计正向引物5’-CCYAAGAACATYCTCTTYGTC-3’和反向引物5’-GTTGACg/tATATCRTTATCGTT-3’，利用RT-PCR的方法获得一段长度为373bp的居中序列；利用获得的序列重新设计引物进行3’RACE，利用反向引物5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)₁₆V-3’合成cDNA第一链，然后利用GSP1 5’-AGGGCAAGGGCAAGGCTGTCG-3’和A1做单侧PCR，最后以单侧PCR的产物为模板，用GSP2：5’-GGACGAGGAGGAGGAGGATGACG-3’和A2 5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’进行巢式PCR；利用获得的居中序列重新设计引物进行5’RACE。利用RT-primer5’-CCTCGGCCTGAGCAAGCTGCTG-3’合成cDNA第一链，5’完整序列采用Invitrogen GeneRacerkit的方法获得；将上述循环获得的核苷酸片段进行拼接后获得一个大小为624bp的完整阅读框的核苷酸序列，将其命名为peat1基因(SEQ ID NO 1)，其推测的氨基酸序列(SEQ IDNO 1)中包含实施例4中获得的4个肽段，确认获得的peat1基因正确。

通过Genbank基因库比对，获知此种蛋白与是在链格孢菌(Alternaria)中未发现的一种蛋白。此蛋白氨基酸组成与Phaeosphaeria nodorum SN15的初生多肽复合酶(nascentpolypeptide-associated complex(NAC)GenBank accession number CH445335)蛋白的相似性为91.98％。

实施例6编码PEAt1蛋白的peat1基因大肠杆菌表达系统的构建及表达

设计引物包含完整阅读框并引入酶切位点和酶切保护碱基，正向引物5’-CCGGAATTCATGGCCAACCCCCGCATTGAA-3’(下划线为EcoR I的酶切位点)反向引物5’-CCGCTCGAGCTATATGCTCAGCGCCATGAT-3’(下划线为Xho I的酶切位点)，以链格孢菌cDNA为模板，以上述引物进行RT-PCR扩增，扩增获得的片段胶回收后连接到PMD18-T克隆载体上进行测序，测序验证是否获得获得完整的基因序列且正确引入酶切位点，将此质粒命名为PMD18-T-peat1。

将PMD18-T-peat1质粒和表达载体PET-28-a分别进行EcoR I和Xho I的双酶切，酶切后的片段进行胶回收并在16℃连接过夜，连接产物转化BL21(DE3)表达菌株中，在含有Kana的固体培养基上筛选阳性克隆并提取质粒进行酶切鉴定，同时进行测序确定读码框正确，将获得的连接有正确peatl基因的阳性克隆在含有Kana的液体培养基中进行培养；待表达菌株生长到对数期后用化学诱导剂IPTG进行诱导，诱导浓度为1mmol/ml，诱导表达12小时后离心收集菌体，将菌体用纯化缓冲液Binding Buffer悬浮后采用超声破碎的方法提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳检测表达蛋白。利用GE公司的Chealting Column柱在AKTA Explorer蛋白纯化仪上进行纯化获得纯化重组蛋白的纯化样品。重组表达蛋白的纯化方法按照ChealtingColumn说明书进行操作。

实施例7编码PEAt1蛋白的peat1基因毕赤酵母表达系统的构建及蛋白表达

用EcoR I和Xho I分别双酶切PMD18-T-peat1和pPIC-9K载体，用T4连接酶将人工合成基因重组连接在pPIC-9K构建重组载体pPIC-9K-peat1，热激转化大肠杆菌DH5α细胞，筛选阳性克隆，PCR法鉴定阳性克隆，将经鉴定含正确插入片段的重组载体pPIC-9K-peat1线性化，电击法转化毕赤酵母GS115细胞，涂布于组氨酸缺陷培养基(RDB)，挑取转化子分别点接MM和MD培养基，筛选甲醇敏感型重组转化子，将阳性转化子接种于5ml BMG培养基中，30℃220r·min^-1培养48h，离心收集菌体，加入10ml BMM培养基重悬菌体，30℃220r·min^-1继续培养，每24h补加甲醇1％，诱导表达3-4d，离心收集上清用ELISA方法鉴定表达蛋白，并作SDS-PAGE检测。

实施例8重组激活蛋白对小麦种子幼根生长的促进作用

将小麦种子浸种在纯化重组表达蛋白2μg.ml^-1的水溶液中，以蒸馏水浸种作为阴性对照。浸种8小时后将种子平铺在培养皿中于28℃光照培养箱光照培养，并加适量蒸馏水以保持湿度。培养7天后随机测量各处理小麦的主根长度，每个处理测量30个平行并取平均值。

结果表明纯化重组表达蛋白对小麦根系生长具有有促进作用。根长在在激活蛋白浓度为2μg.ml^-1时，小麦根长比对照组提高了10～15％。

实施例9重组激活蛋白对番茄灰霉病的控制作用

番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)在PDA培养基上培养7～9d，收集孢子制成孢子悬浮液。用2μg·ml^-1重组表达蛋白提取液喷雾处理番茄幼苗，以清水作对照，每处理30株苗。处理5d后，将番茄灰霉病菌孢子悬浮液(105·ml^-1)用喷雾法挑战接种，48h保湿，一周后进行病级调查，计算防治效果。结果显示，PEAt1蛋白处理番茄能增强其对灰霉病的抗性，防治效果达到65％-70％。

序列表

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>一种提高植物抗性促进植物生长的蛋白质及其编码基因

<130>05-01

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>624

<212>DNA

<213>细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)

<400>1

ATGGCCAACC CCCGCATTGA AGAGCTCCCC GACGAGCCCG AGAAGAAGAA CGTCCAGATC    60

GAGGAGGATG AGTCCAGCGA CGAGTCTGAG GGCGAGGAGG GCGAGGTCAG CGTACCCGCG    120

GGCTCCTCCG TCGCTGTCCA CTCCCGCAAC GAGAAGAAGG CTCGCAAGGC CATCGCCAAG    180

CTCGGCCTGA AGCACATCGA CGGCATCACA CGCGTCACCC TCCGCCGACC CAAGAACATC    240

CTCTTTGTCA TCAACCAGCC CGACGTCTAC AAGTCCCCTT CAAGCAACAC CTGGATCATC    300

TTCGGTGAGG CCAAGATCGA GGACCTCAAC TCCCAGGCTC AGGCTTCCGC CGCCCAGCAG    360

CTTGCTCAGG CCGAGGCCGC ATCCCACGAC CACGCCGGCC ACGACCACGG CGACGAGGCC    420

AGCAAGGGCA AGGGCAAGGC TGTCGAGGAC AAGAAGGACG AGGAGGAGGA GGATGACGAT    480

GAGGAGATTG ACGACTCTGG CCTTGAGGCC AAGGACATCG AGCTCGTCAT GCAGCAGGCC    540

AGCGTTTCGC GGAAGAAGGC CGTCAAGGCC CTCAAGGAGA ACGATAACGA TATAGTCAAC    600

TCCATCATGG CGCTGAGCAT ATAG                                           624

Met Ala Asn Pro Arg Ile Glu Glu Leu Pro Asp Glu Pro Glu Lys Lys

1               5                   10                  15

Asn Val Gln Ile Glu Glu Asp Glu Ser Ser Asp Glu Ser Glu Gly Glu

            20                  25                  30

Glu Gly Glu Val Ser Val Pro Ala Gly Ser Ser Val Ala Val His Ser

        35                  40                  45

Arg Asn Glu Lys Lys Ala Arg Lys Ala Ile Ala Lys Leu Gly Leu Lys

    50                  55                  60

His Ile Asp Gly Ile Thr Arg Val Thr Leu Arg Arg Pro Lys Asn Ile

65                  70                  75                  80

Leu Phe Val Ile Asn Gln Pro Asp Val Tyr Lys Ser Pro Ser Ser Asn

                85                  90                  95

Thr Trp Ile Ile Phe Gly Glu Ala Lys Ile Glu Asp Leu Asn Ser Gln

            100                 105                 110

Ala Gln Ala Ser Ala Ala Gln Gln Leu Ala Gln Ala Glu Ala Ala Ser

        115                 120                 125

His Asp His Ala Gly His Asp His Gly Asp Glu Ala Ser Lys Gly Lys

    130                 135                 140

Gly Lys Ala Val Glu Asp Lys Lys Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp

145                 150                 155                 160

Glu Glu Ile Asp Asp Ser Gly Leu Glu Ala Lys Asp Ile Glu Leu Val

                165                 170                 175

Met Gln Gln Ala Ser Val Ser Arg Lys Lys Ala Val Lys Ala Leu Lys

            180                 185                 190

Glu Asn Asp Asn Asp Ile Val Asn Ser Ile Met Ala Leu Ser Ile

        195                 200                 205

Claims (9)

1.一种提高植物抗病性和促进植物生长的蛋白质，其序列如SEQ ID NO1所示，此蛋白质来源于链格孢菌(Alternaria)。

2.根据权利要求1所述的提高植物抗病性和促进植物生长的蛋白质用于制备促进植物生长和提高植物抗性的粗制品或精制品。

3.根据权利要求2所述的提高植物抗病性和促进植物生长的蛋白质，所述制品用于提高植物抗性和促进植物生长的用途。

4.根据权利要求1中的蛋白质的氨基酸序列，从链格孢菌中获得编码此蛋白质的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO1所示。

5.一种重组质粒，含有权利要求4所述的核苷酸序列。

6.一种转化子，含有导入权利要求5所述的重组质粒的宿主微生物细胞。

7.权利要求6中的转化子，宿主微生物细胞可选自大肠杆菌和毕赤酵母菌。

8.用权利要求6所述的转化子制备的重组蛋白制品，包括粗制品或精制品。

9.根据权利要求8中的重组蛋白制品用于提高植物抗病性和促进植物生长的用途。