CN1142179C - 植物用多功能真菌蛋白制品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
植物用多功能真菌蛋白制品的制备方法涉及一种由微生物提取的蛋白制品，尤其是病原真菌提取的蛋白制品。本发明从植物病原真菌中分离提取的蛋白制品，包含了分子量在42-60KD之间的活性蛋白和分子量30KD与20KD的補助活性蛋白；葡萄孢属等植物病原真菌经培养、浓缩、破碎、杀灭活菌与使不稳定和无活性蛋白变性、离心纯化后制得真菌蛋白。本制品经大量田间与室内试验表明，可增强各种作物对多种病虫害的抗性，防效率达40-80%，并能促进作物生长，增产率达4-85%，本品解决了化学制品引起的生态破坏和污染环境的问题，又克服了转基因植物存在的安全性问题，本品使用方便，用量小，持效期长。
Description
技术领域：本发明涉及一种由微生物提取的蛋白制品，尤其是病原真菌提取的蛋白制品。
背景技术：化肥和农药的广泛使用对农业发展作出了巨大贡献，至今仍是提高作物产量的主要手段之一。但长期使用化学农药和化肥也带来了诸如环境污染、生态破坏、病虫抗药性和食品安全性等问题，严重制约着农业的可持续发展。生物肥料、生物农药和转基因植物是当代作物优质、高效、无公害生产的主要措施。以前的生物农药都是生物提取物或分泌物本身直接发挥作用，如井岗霉素就是由吸水链霉菌井岗变种产生的水溶性抗生素——葡萄糖苷类化合物直接杀灭病菌，至今在生产上仍受欢迎。近代分子生物技术的迅猛发展，通过基因克隆、转化等方式生产生物农药和转基因植物成为人们关注的熟点。近年BT和PI转基因植物的研究已获得成功。但转基因植物的安全性问题受到科学家的高度重视，许多国家对这类材料的应用严加控制。我国科学工作者发现多种植物提取物诱导马铃薯对致病疫霉的抗性有良好的效果，病害保护率达54％，并能促进种薯出芽、早期生长。美国康奈尔大学ZhongminWei发现植物病原细菌Erwinia amylovora产生的一种引起植物过敏性反应的蛋白质(Harpin)，分子量为40kd，由385个氨基酸组成，能诱导植物体内一系列基因的表达，激活植物自身的生长系统和防卫机制，从而抵御常见病虫害的侵袭和不良环境的影响，同时具有增加发根量、叶面积、结实率，提早成熟和增产等功效。美国EDEN生物科学公司运用这项技术开发出广谱性无公害生物农药Messenger，在多种大田作物、经济作物上应用，效果均非常明显，一般可减少用药50-80％，增产10-20％，现发现植物病原细菌都有hrp基因簇，分子量20-40kd，包括3-13个基因。疫霉属(Phophthora)的很多病原能分泌诱导非寄主产生过敏反应的蛋白质，称为Elictin，分子量为10.6KD，它同时还能诱发多种植物产生多种防卫反应，提高这些植物的抗病力。但其它植物病原真菌能否在寄主和非寄主上产生类似的蛋白质，尚未见报道。
发明内容：本发明旨在从植物病原真菌中分离提取植物用多功能蛋白质，诱导植物的自身防御系统和生长系统，从而抵御病虫害的侵袭，同时促进植物生长发育，提高作物产量，以及促进果品保鲜。
本发明是这样实现：植物用多功能真菌蛋白制品，是一种从植物病原真菌中提取分离，诱导植物信息传导的蛋白质，它包含了分子量在42-60KD之间，活性互补的4种活性蛋白和分子量为30KD和20KD的辅助活性蛋白，植物病原真菌在常规培养液中经二级培养，至真菌孢子最大量时，用5000rpm离心30分钟，收集的孢子按培养液体积1/10加入PH6.8的5mM磷酸钾缓冲液或柠檬酸缓冲液，真菌孢子悬浮液采用超声波30分钟或180bar高压破碎孢子细胞，再次以5000rpm离心30分钟，去除沉淀的破碎细胞组织，上清液用100度沸水水浴15分钟，即制成真菌蛋白制品。
下面进一步详述本发明：
以植物病原真菌葡萄孢属(Botrytis)、交链孢属(Alternaria)、稻瘟菌(Pyrcularia)、毒霉菌(Penicillium)、黄曲霉菌(Asporgillus)、纹枯病菌(Rhizoctonia solani)和青霉菌(Fusarium)中的任一种为材料，在常规培养液中经二级培养，至真菌孢子最大量时，经5000rpm离心30分钟，收集的孢子按培养液体积1/10加入PH6.8的5mM磷酸钾缓冲液或柠檬酸缓冲液，真菌孢子悬浮液采用超声波30分钟或180bar高压破碎孢子细胞，再次以5000rpm离心30分钟，去除沉淀的破碎细胞组织，保留上清液中的真菌蛋白，上清液用100度沸水水浴15分钟，以杀灭活菌，使不稳定和无活性蛋白变性，经水浴的上清液又以5000rpm离心30分钟，去除杀灭的活菌和变性的蛋白，保留的上清液即为真菌蛋白，该真菌蛋白制品是分子量为42-60KD之间的4种活性蛋白，以及分子量为30KD和20KD的辅助活性蛋白。
真菌蛋白通过植物表面蛋白受体，可诱导植物的信息传导，启动植物体内一系列代谢反应，引起基因表达，激活植物自身防卫系统和生长系统，从而产生对病虫害的抗性，促进植物生长，提高作物产量。本发明的真菌蛋白可制成液体和粉剂等剂型，用于植物的拌种、浸种、浇根和叶面喷施，使用浓度为10-500ug/ml，经40多种植物的室内盆栽和田间试验，表明真菌蛋白功效全面，不仅能防治真菌病害、细菌病害、病毒病和虫害(见表1-表5)，而且能显著促进作物生长(见表6-表9)；据不完全统计，真菌蛋白对病虫害的防效率达40-80％，作物增产率达4-85％。本发明生产工艺简单，成本较低，持效期长，可广泛用于作物的高效、优质、无公害生产和果品保鲜。
表1 用真菌蛋白质处理天竺葵诱导抗灰霉真菌性病害的效果
| 处 理 | 接 种 | 效 果％ | ||
| 当 天灰霉-10ug/ml灰霉-20ug/ml青霉-10ug/ml青霉-20ug/ml缓冲液(5mMKPO4) | 第7天接种接种接种接种接种 | 第13天73.0876.9238.4642.310 | 第15天62.8671.4337.1440.000 | 第20天60.9863.4127.9534.150 |
注：T-测验表明：在95％和99％的水平，真菌蛋白质与缓冲液处理之间存在统计学的显著差异。
表2 真菌蛋白质处理蕃茄诱导抗青枯病的效果
| 处 理 | 接 种 | 效 果％ | ||
| 当 天灰霉20ug/ml双交链孢菌20ug/ml青霉20ug/ml缓冲液(5mMKPO4) | 第7天接种接种接种接种 | 第13天76.9261.5438.460 | 第15天72.7354.5531.820 | 第20天70.9754.8429.030 |
注：T-测验表明：在95％和99％的水平上，真菌蛋白质和缓冲液之间存在统计学的显著差异。
表3 真菌蛋白质处理天竺葵诱导抗黄单孢杆菌病害的效果
| 处 理 | 接 种 | 效 果％ | ||
| 当 天灰霉-10ug/ml灰霉-20ug/ml双交链孢菌-10ug/ml双交链孢菌-10ug/ml缓冲液(5mMKPO4) | 第7天接种接种接种接种接种 | 第13天75.0083.3358.3366.670 | 第15天75.0078.5757.1464.290 | 第20天65.1277.5751.1660.470 |
注：T-测验表明：在95％和99％的水平上，真菌蛋白质和缓冲液之间存在统计学的显著差异。
表4 喷真菌蛋白质后第7天接种后4天诱导烟草花叶病抗性效果
| 样 本 | 喷雾叶1TMV病斑数 | 喷雾叶2TMV病斑数 | 喷雾叶3TMV病斑数 | 喷雾叶平均病斑数 | 喷雾％效果 | 喷雾P＜0.05 | 喷雾P＜0.01 |
| 灰霉-10ug/ml灰霉-20ug/ml双交链孢菌-10ug/ml双交链孢菌-20ug/ml青霉-10ug/ml青霉-20ug/ml缓冲液(5mMKPO4) | 7698232164 | 77128271962 | 871011282361 | 7.336.6710.339.0026.0021.0062.33 | 88.2489.3083.4285.5658.2966.31无 | 显著显著显著显著显著显著不显著 | 显著显著显著显著显著显著不显著 |
表5 真菌蛋白对蕃茄病毒病与果实病害的影响
| 处理 | 病毒病发病数(240株) | 防效(％) | 死株数 | 防效(％) | 百果烂果数 | 防效(％) |
| 60ug/ml30ug/ml15ug/mlCK | 0.300.672.3019.30 | 98.4**96.5**88.0** | 0003.3 | 100100100 | 11.3313.6717.0028.30 | 60.151.639.9 |
注：烂果包括果实上有病斑的所有果实，造成的病害种类不止一种。
表6 用真菌蛋白质处理蕃茄后种苗高度效应
处理 效率％ 效率％ 效率％
第1天 第14天 第18天 第21天
灰霉-10ug/ml 9.52 10.14 10.28
灰霉-20ug/ml 11.43 12.16 13.08
青霉-10ug/ml 6.67 6.08 6.07
青霉-20ug/ml 6.67 7.43 7.48
缓冲缓
无 无 无
(5mMKPO4)
注：本处理为用真菌蛋白浸泡蕃茄种子一夜，并于21°-24℃的生长室内育苗。T-测验表明：在真菌蛋白质处理与缓冲液处理之间，在95％和99％水平上有统计学的显著性差异。
表7 真菌蛋白对辣椒产量的影响
| 处理 | 平均产量(斤) | 平均果数(个) | 平均重/果(斤) | 比对照±％(平均产量) | 比对照±％(平均果数) |
| 60ug/ml30ug/ml15ug/mlCK | 49.345.342.431.1 | 294278259217 | 0.0720.0720.0720.066 | 58.545.736.3 | 35.528.119.4 |
表8 对西瓜产量的影响
| 处理 | 7/13-16小区实收平均产量 | 7/13-16小区平均瓜果数 | 平均单个重(斤) | 比对照±％(小区平均实量) | 比对照±％(小区平均单个瓜重) |
| 60ug/ml30ug/ml15ug/mlCK | 157.8**156.1**141.6**97 | 19.719.72014 | 87.97.44.8 | 66.5060.7649.02 | 66.6764.5854.17 |
表9 对蕃茄产量的影响
| 处理 | 平均产量(斤/小区) | 平均单果重(斤) | 比对照±％产量 | 比对照±％单果重 |
| 60ug/ml30ug/ml15ug/mlCK | 1001955858546 | 1.150.980.860.55 | 83.374.957.3 | 107.177.455.5 |
表10 真菌蛋白对水稻幼苗生长的影响
| 处理 | 苗高(cm)(15盆平均) | 植株干重(g)(6盆平均) |
| 真菌蛋白440ug/mlCK | 15.22**13.73 | 0.32*0.29 |
Claims (1)
1、一种植物用多功能真菌蛋白制品，其特征在于该真菌蛋白制品是从植物病原真菌中提取分离的诱导植物信息传导蛋白质，将在常规培养液中经二级培养至真菌孢子最大量并经浓缩、破碎和纯化的真菌孢子，用5000rpm离心30分钟，收集的孢子按培养液体积1/10计，加入PH6.8的5mM磷酸钾缓冲液或柠檬酸缓冲液，真菌孢子悬浮液采用超声波30分钟或180bar高压破碎孢子细胞，再次以5000rpm离心30分钟，去除沉淀的破碎细胞组织，上清液用100度沸水水浴15分钟，即制成包含分子量在42-60KD之间、活性互补的4种活性蛋白和分子量为30KD和20KD的辅助活性蛋白的真菌蛋白制品。
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