CN105199968B - 一种小核菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小核菌及其应用，所述小核菌分类命名为罗尔夫小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.11302，保藏日期为2015年09月08日。相对于现有技术，本发明罗尔夫小核菌对地钱和土马鬃植物具有较强抑制作用；对病原菌的作用方式多样化；具有繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点，尤其是对地钱和土马鬃植物的防治效果佳。此外，其培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

Description

一种小核菌及其应用

技术领域

本发明属于植物保护领域的微生物除草剂，尤其涉及罗尔夫小核菌(Sclerotiumrolfsii Sacc.)及其在防治苔藓植物中的应用。

背景技术

生物除草剂研究已有近200年的历史。在自然状态下，除草剂往往只能利用植食性昆虫、动物、病原微生物等天敌，通过生态学途径，将杂草种群控制在经济上和生态上可以接受的水平。随着人们对植物病原菌认识的深入，上世纪中叶开始了微生物除草剂的开发研究。近几十年来，新的植物病原菌的不断被分离和研究，尤其是从杂草病株中筛选出来的一些植物病原菌表现出了潜在的除草活性，有可能开发成为可替代化学除草剂的新型微生物除草剂。

全世界广泛分布的杂草有30000种，约1800种对作物造成不同程度的危害，每年因杂草危害造成的农作物减产高达9.7％。近百年来，虽然采用化学除草剂能有效地控制许多杂草，但化学药剂的大量使用也引发了一系列的问题，诸如除草剂抗性杂草植株的出现、土壤污染、水质退化、以及对人、畜的危害等。随着人们对环境意识的提高和农业可持续发展的需要，高效、环保、无害的微生物除草剂研究越来越显示其社会意义、生态效益和经济价值。

1981年，Devine在美国被注册登记为第一个生物除草剂，它是美国弗罗里达州的棕榈疫霉致病菌株的厚垣孢子悬浮剂，用于防治杂草莫伦藤(Morrenia odorata)，防效可达90％以上，持效期可达2年，被广泛用于桔园杂草防除。在此之后的近15年时间里，没有新的生物除草剂商品推出，在生物除草剂的发展过程中出现了一个断层。但至今在此领域内的研究仍十分活跃，也取得了一大批研究成果。

我国也有一些利用生物除草剂防除杂草的成功例证：

①在1963年，我国已使用“鲁保一号”，即胶孢炭疽菌菟丝子专化型(Colletotrichum gloeosporoides f.sp.cuscutae)的培养物防治大豆田间的菟丝子，是世界上最早被应用于生产实践的生物除草剂之一。虽然在上世纪80年代研究，已解决了菌种在培养过程中的退化问题，但在随后的商品化研究和发展方面工作滞后。

②新疆哈密植检站于上世纪80年代，利用研制的尖孢镰刀菌列当变种(Fusariumoxysporum var.orthoceras)培养物制成的“生防剂F798”，控制西瓜田的瓜列当(Orobanche sp.)也取得实用性成果。

③紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum)上的飞机草绒孢菌(Mycovellosiellaeupatorii-edomti)作为防除紫茎泽兰的真菌除草剂。该菌的缓慢致病速度，可能更适宜用于经典的生物防治。从紫茎泽兰自然发生的病株上分离到链格孢(Altemaria altemata)菌株，显示出该菌是防治野燕麦的潜在生物除草剂。

生物除草剂农药的特性赋予了农业可持续发展战略，为保护农业生态环境，保障食品安全提供物质基础和技术支撑，也是未来经济中具有发展潜力的新增长点之一。研究微生物农药产业发展，对于政府部门科学制定促进微生物农药产业发展的政策体系，实现农药产业结构调整，促进循环经济和可持续社会发展战略，保障经济建设和农业生态环境的协调发展，将具有十分重要作用。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明提供一种小核菌，其分类命名为罗尔夫小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.11302，保藏日期为2015年09月08日。

作为优选，所述小核菌的最适生长温度为25±1℃。

本发明还提供了所述小核菌在制备防治苔藓植物的菌块中的应用。

作为优选，所述菌块的制备方法为：将罗尔夫小核菌在25±1℃的PDA固体培养基上培养3-5d，切成4-5mm的菌块，即得。

作为另一种优选，所述苔藓植物为地钱植物和/或土马鬃植物。

本发明还提供了所述小核菌在制备防治苔藓植物的液体菌剂中的应用。

作为优选，所述液体菌剂的制备方法为：将罗尔夫小核菌接种于液体发酵培养基中，在25℃-35℃下发酵培养72-120小时，得到的发酵液，即为所述液体菌剂。

作为进一步优选，所述发酵培养基的配方为：自来水1000mL，马铃薯120-200g，蔗糖15-20g，硫酸铵0.5-1.5g，pH4.5-6.8。

作为另一种优选，所述苔藓植物为地钱植物和/或土马鬃植物。

本发明中所述的罗尔夫小核菌的形态学和生理活性特征如下：

在25±2℃的PRX-250A型智能人工气候箱内培养(RH70％，黑暗)的PDA上平均日生长量为2.5cm。菌丝白色，棉絮状或绢丝状，放射状生长；菌丝上有锁状联合；单根菌丝的无色，每个菌丝细胞长约60～100μm，菌丝宽3.93～9.46μm。菌核形成的初期是由白色绢状菌丝体聚集而成的乳白色小球体，5d渐渐变为米黄色小球、黄褐色到深红褐色(2周)，最后变为深褐色，似油菜籽大小，表生，球形或近球形，平滑，有光泽；这时在PDA上看不到菌落形态和颜色，只看到褐色菌核，直径为1～5mm，圆形至椭圆形，大多数为1～2mm，少数3×5mm,菌核在培养皿内散生，有时会在中间的接种点聚生。菌核内部白色，由拟薄壁组织构成，细胞直径6～8μm；表层细胞小而色深。

本发明罗尔夫小核菌菌落形态图见说明书附图1，其菌核形态图见说明书附图2。

本发明罗尔夫小核菌的rDNA-ITS序列如SEQ ID No.1所示。将所测rDNA-ITS序列通过BLAST比对，鉴定为罗尔夫小核菌。

罗尔夫小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)是广泛存在于自然界中的一种微生物，属于半知菌亚门、丝孢纲，无孢目，小核菌属(Sclerotium)，存在于土壤、植物根围等生态环境中，是一种专门针对苔藓植物的生防菌，它能引起地钱(Marchantia polymorphaL.)和土马鬃(Polytrichum commune L.ex Hedw.)的死亡，从而达到有效控制这2种苔藓植物生长蔓延及为害铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)的目的。利用罗尔夫整小核菌防治苔藓植物，在国内外属于首次报道。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

(1)本发明罗尔夫小核菌对地钱和土马鬃植物具有较强抑制作用；该病原菌的作用方式多样化；具有繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点，尤其是对地钱和土马鬃植物的防治效果佳。

(2)罗尔夫小核菌培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为本发明中罗尔夫小核菌的菌落形态图；

图2为本发明中罗尔夫小核菌菌核形态图

图3为本发明中用罗尔夫小核菌PDA菌块接种对地钱植物的致病作用；

图4为本发明中用罗尔夫小核菌PDA菌块接种对土马鬃植物的致病作用；

图5为本发明中用罗尔夫小核菌液体菌液喷洒接种对地钱植物致病作用；

图6为本发明中用罗尔夫小核菌液体菌液喷洒对土马鬃植物的致病作用；

图7为本发明中罗尔夫小核菌对地钱和土马鬃2种混生植物的致病作用；

图8为本发明中土马鬃防治对照；

图9为本发明中地钱防治对照。

具体实施方法

结合下面的实验例详细阐述本罗尔夫整小核菌的应用。

实施例1：罗尔夫小核菌菌块的制备

将罗尔夫小核菌在25±1℃的PDA固体培养基上培养3d，切成4-5mm的菌块，即得。

实施例2：罗尔夫小核菌菌块的制备：

将罗尔夫小核菌在25±1℃的PDA固体培养基上培养5d，切成4-5mm的菌块，即得。

实施例3：罗尔夫小核菌液体菌剂的制备

将罗尔夫小核菌接种于发酵培养基(PD)中，pH4.5，500mL三角瓶中装液量为250mL，25℃-30℃，摇床转速120转/min，72小时，得到的发酵液，即为液体菌剂。

其中发酵培养基的配方为：蒸馏水1000mL，马铃薯120g，蔗糖15g，硫酸铵0.5g，pH4.5。

实施例4：罗尔夫小核菌液体菌剂的制备

将罗尔夫小核菌接种于发酵培养基中，pH5.5，500mL三角瓶中装液量为250mL，25℃-30℃，摇床转速160转/min，120小时，得到的发酵液，即为液体菌剂。

其中发酵培养基的配方为：蒸馏水1000mL，马铃薯150g，蔗糖18g，硫酸铵1.0g，pH5.5。

实施例5：罗尔夫小核菌液体菌剂的制备

将罗尔夫小核菌接种于发酵培养基中，pH56.8，500mL三角瓶中装液量为250mL，25℃-30℃，摇床转速150转/min，96小时，得到的发酵液，即为液体菌剂。

其中发酵培养基的配方为：蒸馏水1000mL，马铃薯200g，蔗糖20g，硫酸铵1.5g，pH5.8。本配方为最佳。

实验例1

1、实验设备

超净工作台、PRX-250A型智能人工气候箱、培英牌DHZ-DA TCYQ恒温振荡器等。

2、实验原理

在整个铁皮石斛生长期，在铁皮石斛大棚内特别潮湿的条件下，都会伴有地钱和土马鬃两种植物的生长，其根系缠绕在铁皮石斛的植株上、根周围及根部，致使基质透气性差，直接影响铁皮石斛的生长，严重时会造成根部腐烂，植株死亡。有时会诱发软体动物的滋生

使用方法是在地钱和土马鬃植物生长期喷洒罗尔夫小核菌液体菌剂，菌丝可以粘附在地钱和土马鬃植株上及周围，迅速生长繁殖，产生代谢产物，从而抑制地钱和土马鬃的生长。

3、实验方法：

(1)罗尔夫小核菌的PDA平板固体培养。在25±1℃，RH75-85％，黑暗条件下培养3d，供接种使用(见实验例2)。

(2)罗尔夫小核菌的液体培养。在500mL的三角烧瓶中，将罗尔夫小核菌接种到含有250mL的PD培养液的三角瓶中，120转/min，25±1℃培养3d，(见实验例4)。

(3)菌剂使用

①将配制好的罗尔夫小核菌原菌液，用粉碎机将菌丝团打碎成菌丝段，兑水稀释20倍，直接用喷雾器喷洒到地钱和土马鬃植物上。

②对照：用无菌PDA块和无菌水喷洒地钱和土马鬃植物。

4、致病实验：按照以下实验例进行致病试验，观察致病结果。

实验例2：PDA菌块接种实验，验证罗尔夫小核菌对地钱和土马鬃植物在铁皮石斛棚内的防治效果。

将用PDA平面培养3d的罗尔夫小核菌菌株，用灭菌的解剖刀划成4-5mm的菌块，直接接种于地钱和土马鬃植物上，每天观察一次，共观察6d，测量病斑扩展速度，并记录数据；用无菌的PDA块作为对照(表1)。

表1罗尔夫小核菌对地钱和土马鬃的致病作用

(1)罗尔夫小核菌对地钱植物致病作用，如图3所示；

(2)罗尔夫小核菌对土马鬃植物的致病作用，如图4所示；

(3)对照试验，如图8和图9。

由以上结果可得，相比较对照组，本发明罗尔夫小核菌菌块分别用于地钱和土马鬃，植物病斑直径显著增大，扩展速度快，表明对于地钱和土马鬃的致病效果显著。

实验例2：液体菌剂喷洒接种实验，验证罗尔夫小核菌对地钱和土马鬃植物在铁皮石斛棚内的防治效果。

将用PD液体培养基中振荡培养3d的罗尔夫小核菌液体，用榨汁机将菌丝团打碎成菌丝片段，加20倍的水，用喷雾器直接喷洒到地钱和土马鬃植物上，每天观察一次，共观察6d，测量病斑扩展速度，并记录数据；用无菌水喷洒作为对照(表2)。实验证明，罗尔夫小核菌对地钱和土马鬃的致病能力基本相似，二者无明显差异。

表2罗尔夫小核菌对地钱和土马鬃的致病作用

(1)用罗尔夫小核菌菌液喷洒接种对地钱植物致病作用，如图5所示；

(2)用罗尔夫小核菌菌液喷洒对土马鬃植物的致病作用，如图6所示；

(3)用罗尔夫小核菌菌液喷洒对地钱和土马鬃两种混生植物致病作用，如图7所示；

(3)对照试验，如图8和图9。

由以上结果可得，相比较对照组，本发明罗尔夫小核菌液体菌剂分别用于地钱、土马鬃或者两者混生植物，所得植物病斑直径显著增大，表明对于地钱、土马鬃或者两者混生植物的致病效果显著。

Claims (7)

1.一种防治地钱植物和/或土马鬃植物的小核菌，其特征在于，其分类命名为罗尔夫小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.11302，保藏日期为2015年09月08日。

2.权利要求1所述的小核菌，其特征在于，所述小核菌的最适生长温度为25±1℃。

3.权利要求1-2任一项所述小核菌在制备防治地钱植物和/或土马鬃植物的菌块中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菌块的制备方法为：将罗尔夫小核菌在25±1℃的PDA固体培养基上培养3-5d，切成4-5mm的菌块，即得。

5.权利要求1-2任一项所述小核菌在制备防治地钱植物和/或土马鬃植物的液体菌剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述液体菌剂的制备方法为：将罗尔夫小核菌接种于液体发酵培养基中，在25℃-35℃下发酵培养72-120小时，得到的发酵液，即为所述液体菌剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：自来水1000mL，马铃薯120-200g，蔗糖15-20g，硫酸铵0.5-1.5g，pH4.5-6.8。