CN102648713B - 一种利用真菌激活蛋白提高木霉菌剂生物防病活性的技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种真菌激活蛋白提高木霉菌剂生物防病活性的技术，属于农业生物技术领域。本发明技术要点是利用极细链格孢激活蛋白提高木霉菌剂的生防活性，通过含药介质法、室内盆栽活体接种法和田间小区药效试验验证，将激活蛋白和木霉菌剂用量的以(0.2～1.2)∶(1)的比例混合后，经适当配方，激活蛋白可显著提高木霉菌剂对蔬菜灰霉病、霜霉病、白粉病、立枯病等的生防效果，防病增效系数达2.03～13.75。通过激活蛋白与木霉菌剂混合使用，不但可以提高生防制剂的防治效果，且可部分解决木霉菌剂在施用过程中容易出现的迟效性问题，提高木霉活菌制剂的田间防治效果。

Description

一种利用真菌激活蛋白提高木霉菌剂生物防病活性的技术

技术领域

本发明涉及一种真菌激活蛋白提高木霉菌剂生物防病活性的技术，属于农业生物技术领域。

背景技术

木霉是自然界中普遍存在的一类真菌，在土壤、植物根围、叶围及种子、球茎表面经常可以分离到。近些年人们发现某些木霉是植物病原真菌的寄生菌或拮抗菌，如哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、钩状木霉(T.hamatum)、绿色木霉(T.viride)可以防治真菌病害。迄今为止有关木霉在生防方面的研究已开展近70年，在国外已经出现了商品化的木霉制剂。如以防治李属果树银叶病(Chondrostereum purpureum)的木霉制剂在西欧已商品化生产；以色列的Makhteshim Agan公司开发的以哈茨木霉T39菌株为发酵液的生防制剂，商品名Trichodex，剂型为25％可湿粉，它可以用于防治灰霉病菌(Botrytis cinerea)、菌核病菌(Scleratina sclerotiorum)、叶霉病(Cladosporium fulvum)、霜霉病(Pseudoperonasplra cubensis)和白粉病(Sphaerotheca fuliginea)等叶部病害，在国内也有研究利用木霉菌控制植物病害。

近年来植物免疫药物和促生微生物蛋白新农药的兴起，据此研制出来的蛋白质农药是对多种作物具有生物活性的蛋白激发子类药物，通过激发植物自身的抗病防虫功能基因表达，增强植物对病虫害的免疫能力和促进植物生长而备受关注，已成为新型环保生物农药发展中的一个亮点。新型多功能植物激活蛋白3％极细链格孢可湿性粉剂是中国农业科学院植物保护研究所邱德文博士开发的新型蛋白农药，其是从真菌(Alternaria)分离出的新结构的真菌激活蛋白(专利号：ZL01128666.0)。可用于蔬菜、果品等经济作物的拌种、叶面喷雾，能有效控制病毒病、真菌和细菌等多种病害、提高果品产量和质量，同时对果蔬的保鲜有明显的作用。

从公开报道的文献中可以看到人们对生防木霉菌的研究，大多集中在菌株的筛选、鉴定、发酵培养及其利用等方面。为应对当前植物病害防治过程中化学农药过量、频繁使用的问题，应用生防木霉制剂控制植物病害，可解决蔬菜和土壤中化学农药的残留污染。但由于生防木霉是活菌制剂，主要通过活菌孢子来实现其生防活性，因此优化绿色木霉、哈茨木霉等生防木霉的使用技术，提高降低该活菌剂的田间施用效果，扩大该制剂的田间应用有很好帮助。因此研究利用一种真菌激活蛋白提高木霉菌剂生物防病活性的技术，对于提高木霉菌剂的效果，加快其推广利用有较大助益。

发明内容

本发明专利提供了一种真菌激活蛋白提高木霉菌剂生物防病活性的技术，以提高生防木霉菌剂的防病效果。

本发明是通过以下技术方案实现上述发明目的。

主要包括将3％极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂与5亿孢子/克木霉菌剂，以激活蛋白和木霉菌剂用量的(0.2～1.2)∶(1)的比例混合后，用平皿稀释培养法、盆栽喷雾灌根法和田间小区药效试验，验证激活蛋白对木霉菌剂抑菌增效系数达2.03～13.75。

具体实施方式

下面进一步详述本发明的具体操作。

具体实施方式

下面进一步详述本发明。

本发明采用室内采用含药介质法、室内盆栽活体接种法和田间小区药效试验等多种生物测定方法，针对设施蔬菜上灰霉病、霜霉病、白粉病、立枯病等常发病害为防治对象，测定了极细链格孢激活蛋白对木霉菌剂的增效作用。结果表明，这种激活蛋白对木霉菌剂具有良好的增效作用，而且随着激活蛋白加入比例的增加，对木霉菌剂的增效作用越明显。通过将3％极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂与5亿孢子/克木霉菌剂，以激活蛋白按木霉菌剂用量的(0.2～1.2)∶(1)的比例混合后，用平皿稀释培养法、盆栽喷雾灌根法和田间小区药效试验，验证激活蛋白对木霉菌剂抑菌增效系数达2.03～13.75。

现将具体实例详述如下：

1、极细链格孢激活蛋白与木霉菌剂协同控病作用防控蔬菜灰霉病

采用含药介质法进行测定。首先进行预备试验，摸清药剂抑菌率约为20-90％时药剂的浓度范围，据此设定浓度梯度。

用万分之一天平分别称取药剂，加定量灭菌蒸馏水分别配成5×10⁶孢子/克和10000μg/ml母液。5亿孢子/克木霉菌剂与3％极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂混剂按(1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2)的比例配成母液。然后稀释成系列浓度。分别取4ml药剂稀释液放入灭菌的小三角瓶中，加36ml PDA(浓度相对稀释10倍)，充分摇匀。等分倒入三个灭菌的平皿中。5亿孢子/克木霉菌剂的浓度梯度(平皿中培养基浓度，下同)设定为5×10⁵孢子/克、5×10⁴孢子/克、5×10³孢子/克、5×10²孢子/克、5×10孢子/克；3％极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂的浓度梯度设定为3000、1000、100、10、1μg/ml；混剂的浓度梯度(稀释倍数)设定为10²、10³、10⁴、10⁵；以不加药为空白对照。

培养基凝固后接入d5mm已活化的灰霉病菌片(菌种编号003)，每处理重复三次，置于23℃恒温箱中，48h测量菌落半径增加值，计算抑菌率。抑菌率％＝(空白对照菌落半径增加值一处理菌落半径增加值)×100/空白对照菌落半径增加值。

表、极细链格孢激活蛋白与木霉菌剂防治灰霉病菌的试验剂量设置(一)

表、极细链格孢激活蛋白与木霉菌剂防治灰霉病菌的试验剂量设置(二)

表、激活蛋白和木霉协同作用对番茄灰霉病的室内生测试验(一)

表、激活蛋白和木霉协同作用对番茄灰霉病的室内生测试验(二)

试验结果表明，试验药剂5亿孢子/克木霉菌可湿性粉剂对番茄灰霉病菌有很好的抑菌作用，稀释到1000倍液的抑菌效果达仍为74.44％，随着稀释浓度的增加，抑菌效果逐渐降低。3％激活蛋白可湿性粉剂对霜霉病无明显的防治作用，稀释100倍液的抑菌效果仅为43.59％。相同剂量下5亿孢子/克木霉菌可湿性粉剂和3％激活蛋白可湿性粉剂混配的抑菌活性高于两单剂的防病效果，增效系数在2.03～13.75之间。

5亿孢子/克木霉菌可湿性粉剂属有较高抑菌效果的真菌，对多种植物病原真菌具有抑菌效果，木霉菌吸附于植物病原真菌的菌丝，与菌丝一起生长，并产生溶菌物质消解菌丝体，使菌丝断裂、解体，细胞质消解，或产生对病菌孢子细胞壁有溶解作用的次生代谢物质，使病菌失去侵染能力。木霉菌可湿性粉剂作为生防制剂已被用于无公害农产品的生产。3％激活蛋白可湿性粉剂为其是从真菌(Alternaria)分离出的新结构的真菌激活蛋白，对多种作物具有生物活性的蛋白激发子类药物，通过激发植物自身的抗病防虫功能基因表达，增强植物对病虫害的免疫能力和促进植物生长而备受关注，可用于蔬菜、果品等经济作物的拌种、叶面喷雾，能有效控制病毒病、真菌和细菌等多种病害、提高果品产量和质量，同时对果蔬的保鲜有明显的作用。通过对木霉菌与植物激活蛋白的混合使用，可以显著增强木霉菌对番茄灰霉病的防病效果。

2、极细链格孢激活蛋白与木霉菌剂协同控病作用防控蔬菜霜霉病

盆栽法测定极细链格孢激活蛋白与木霉菌剂协同对黄瓜白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea(Schlecht)Poll.)的抑菌活性，为该药剂的田间药效试验提供依据。首先进行预备试验，摸清药剂防治效果约为20-90％时药剂的浓度范围，据此设定浓度梯度。

选用感病黄瓜品种“津新密刺”，营养钵育苗，将未种过黄瓜的肥沃园田土加蛭石各一半混合，添加适量腐熟有机肥作为培养基质育苗，常规管理，待黄瓜苗龄2～4片真叶备用。施药器械采用空气压缩机接吹雾喷头，将药液均匀喷施于叶面至全部湿润，待药液自然风干后接菌。将药液均匀喷施于叶面，黄瓜叶片着药液量约为15μL/cm²。待药液自然风干后备用。每处理4盆，四次重复。试验设不含药剂只含0.05％吐温80表面活性剂的处理作空白对照。试验采用先喷药后接菌，药剂处理后24h用孢子悬浮液喷雾接种。接种后自然风干，在20～24℃，湿度80％左右条件下，培养8天。

视空白对照发病情况分级调查。每处理调查全部叶片，每片叶按病斑面积占叶面积的百分率分级记录。

分级标准：

0级：无病；

1级：病斑面积占整片叶面积的5％以下；

3级：病斑面积占整片叶面积的6％～15％；

5级：病斑面积占整片叶面积的16％～25％；

7级：病斑面积占整片叶面积的26％～50％；

9级：病斑面积占整片叶面积的51％～75％；

11级：病斑面积占整片叶面积的75％以上；

用药后8d对照充分发病时，调查各处理的病情，共调查1次。

根据调查数据计算病情指数和防治效果。按如下公式计算。

病情指数＝∑(发病叶数×相应病级数)×100/(调查总叶数×11)

防治效果(％)＝(1-pt/ck)×100

根据各药剂的浓度对数值及对应的防效机率值作回归分析，计算各药剂的EC₅₀、EC₉₀值及其95％置信限。

表、极细链格孢激活蛋白与木霉菌剂防治黄瓜霜霉病的试验剂量设置(一)

表、极细链格孢激活蛋白与木霉菌剂防治黄瓜霜霉病的试验剂量设置(二)

表、激活蛋白和木霉菌剂协同作用对黄瓜霜霉病的盆栽防病效果试验(一)

果

由田间药效试验结果可知(见表)，木霉菌可湿性粉剂与3％激活蛋白可湿性粉剂协同对番茄灰霉病、黄瓜霜霉病、黄瓜白粉病均有较好的防治效果，3次药后调查其防治效果优于或与两对照药剂50％速克灵WP、58％甲霜灵锰锌WP和70％甲基硫菌灵WP的防效无显著差异，同等施用剂量的防治效果明显优于木霉菌可湿性粉剂与3％激活蛋白可湿性粉剂单剂的防效，因此认为木霉菌可湿性粉剂与3％激活蛋白可湿性粉剂可以在生产上配合应用，具有良好的增效作用。

建议使用木霉菌可湿性粉剂与3％激活蛋白可湿性粉剂协同防治蔬菜灰霉病、霜霉病、白粉病等，依据防治对象以激活蛋白和木霉菌剂用量的(0.2～1.2)∶(1)的比例混合，施用剂量为800～1200，于发病前或发病初期开始应用，喷药时要使植株茎杆、瓜条、枝叶、叶片正反两面各部位均匀着药。

表、激活蛋白和木霉菌剂协同防治番茄灰霉病药效试验(田间)

表、激活蛋白和木霉菌剂协同防治黄瓜霜霉病药效试验(田间)

表、激活蛋白和木霉菌剂协同作用对黄瓜霜霉病的盆栽防病效果试验(二)

试验结果表明，试验药剂5亿孢子/克木霉菌可湿性粉剂对黄瓜白粉病菌有很好的抑菌作用，稀释到1000倍液的抑菌效果达仍为53.8％，随着稀释浓度的增加，抑菌效果逐渐降低。3％激活蛋白可湿性粉剂对霜霉病无明显的防治作用，稀释100倍液的抑菌效果仅为2.56％。相同剂量下5亿孢子/克木霉菌可湿性粉剂和3％激活蛋白可湿性粉剂混配的抑菌活性高于两单剂的防病效果，增效系数在0.84～4.47之间。

5亿孢子/克木霉菌可湿性粉剂属有较高抑菌效果的真菌，对多种植物病原真菌具有抑菌效果，木霉菌吸附于植物病原真菌的菌丝，与菌丝一起生长，并产生溶菌物质消解菌丝体，使菌丝断裂、解体，细胞质消解，或产生对病菌孢子细胞壁有溶解作用的次生代谢物质，使病菌失去侵染能力。木霉菌可湿性粉剂作为生防制剂已被用于无公害农产品的生产。3％激活蛋白可湿性粉剂为其是从真菌(Alternaria)分离出的新结构的真菌激活蛋白，对多种作物具有生物活性的蛋白激发子类药物，通过激发植物自身的抗病防虫功能基因表达，增强植物对病虫害的免疫能力和促进植物生长而备受关注，可用于蔬菜、果品等经济作物的拌种、叶面喷雾，能有效控制病毒病、真菌和细菌等多种病害、提高果品产量和质量，同时对果蔬的保鲜有明显的作用。通过对木霉菌与植物激活蛋白的混合使用，可以显著增强木霉菌对黄瓜霜霉病的防病效果。

3、木霉菌可湿性粉剂与3％激活蛋白可湿性粉剂协同防治蔬菜灰霉病、黄瓜白粉病的使用效

木霉菌剂	1000	1.76	4.19	73.65	c	BC
							激活蛋白	1000	2.03	5.46	70.30	d	C
40％嘧霉胺悬浮剂	1000	1.71	3.01	80.58	a	A
							空白对照	-	1.89	17.14

表、激活蛋白和木霉菌剂协同防治黄瓜白粉病药效试验(田间)

表、激活蛋白和木霉菌剂协同防治黄瓜立枯病药效试验(田间)

在田间自然条件下，病菌与寄主植株、果实接触，木霉菌剂、激活蛋白与病原菌孢子菌丝的接触都是随机的。具有诱导免疫激活功能的激活蛋白与木霉菌剂混合使用，激活蛋白对植物具有诱导免疫功能，同时还具有激活木霉菌剂生防活性的效果，较单独施用木霉菌剂能更有利于生防菌定殖于植株表面，且对植物病原菌的控制机率较单独使用木霉菌剂作用大。相信在植物病害的防治中，实现免疫激活功能的激活蛋白与木霉菌制剂混合使用，不但可以提高生防制剂的防治效果，且可部分解决木霉菌剂在施用过程中容易出现的迟效性问题，提高木霉活菌制剂的防治效果，同时减少化学农药的使用剂量及农药的残留，并可望取得稳定而持久的防治效果，将是当前植物病害防治的一条新途径。

Claims (2)

1.一种利用真菌激活蛋白提高木霉菌剂生物防病活性的方法，涉及到利用3％极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂与木霉菌剂，以3％极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂和木霉菌剂用量按0.2～1.2：1.00的比例混合后防治蔬菜灰霉病的防病增效系数达2.03～13.75；以3％极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂和木霉菌剂用量按0.2～0.4：1.00的比例混合后防治蔬菜霜霉病的防病增效系数达2.83～4.47。

2.根据权利要求1所述的一种利用真菌激活蛋白提高木霉菌剂生物防病活性的方法，其特征在于所述的防治蔬菜灰霉病、霜霉病的施用方法为喷雾法和灌根法，适用作物为番茄、黄瓜、辣椒、茄子。