CN115109731A - 一种贝莱斯芽孢杆菌及其发酵方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌JKsb3，保藏编号为CGMCCNo.24516，通过16SrDNA序列分析结合形态学特征予以分类鉴定。本发明还进一步提供了所述贝莱斯芽孢杆菌JKsb3的分离方法及发酵方法。所述贝莱斯芽孢杆菌JKsb3及其发酵产物对葡萄霜霉病、灰霉病、甜瓜白粉病表现出良好的防治效果，可制备成用于农业病害防治的生物菌剂。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌及其发酵方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及微生物发酵及其应用，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌菌株的分离、发酵方法以及其在农业病害防治方面的应用。

背景技术

随着农业经济的发展，农药日益成为农业生产中不可缺少的生产资料，一方面，农药在粮食等作物的稳产、高产和产品质量等方面起着极其重要的作用，另一方面，农药的使用关系到农产品的安全问题，特别是农药残留的问题。随着人们环保意识的提高，以及人类可持续发展的不断深化，积极开发、推广应用生物农药成为全球共识。

葡萄灰霉病由灰葡萄孢菌侵染引起，是葡萄生产及储运过程中的严重病害。该病害主要危害花序果实，有时也危害叶片和新梢。果穗染病初呈淡褐色水浸状，很快变成暗褐色，整个果穗软腐，此期若遇阴雨，2-3d后果穗长出一层淡灰色霉层。成熟期染病，初期果面出现灰褐色斑点，继而出现褐色凹陷斑，很快腐烂，其上长出鼠灰色霉层。贮藏期如受病菌侵染，病斑部会溢出黄褐色粘液，浆果变色、腐烂。

葡萄霜霉病是一种高温高湿型病害，主要危害葡萄叶片，发病初期在叶面形成浅黄色近圆形至多角形病斑，容易并发角斑病，空气潮湿时叶背产生霜状霉层，有时可蔓延到叶面，后期病斑枯死连片，呈黄褐色，严重时全部外叶枯黄死亡。

白粉病俗称“白毛病”、“粉霉病”，是瓜类作物普遍发生的病害之一。白粉病在全国各地瓜类种植区保护地、露地均可发生，且多发生在结瓜期及成熟期。随着甜瓜栽培面积的逐年增加，白粉病已逐渐成为我国甜瓜主要病害之一。甜瓜白粉病发生初期主要危害叶片，若未及时防治，会迅速扩展，后期蔓延至叶柄、茎蔓甚至果实上，最终导致叶片增厚老化而植株早衰，果实膨大受抑制而产量降低，严重影响果实品质而失去市场价值。

当前，我国农林业对于葡萄霜霉病等病虫害防治的主要方式是化学防治，但是长期使用性质相对稳定的化学药剂，不仅会增强害虫、病原菌的抗药性，降低其防治效果，并且还可能会污染农产品、土壤和水资源，进而危害人、牲畜的健康和安全，同时也大大破坏了人类赖以生存的生态环境。因此，开发及应用高效、安全、不易产生抗药性的药剂来防治植物病虫害，已成为农药及其制剂开发技术领域的研究热点。

发明内容

为了解决现有技术中所存在的问题，本发明旨在提供一种安全、无污染，不仅能防治植物的病害，而且对生态环境十分友好的生物菌剂，具体为一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensi)，经鉴定，该菌归属芽孢杆菌属，所述贝莱斯芽孢杆菌(以下简称JKsb3)是本专利申请发明人于2020年7月在陕西省秦岭野生锦葵(Malva Sinensis Cavan)中分离获得的。其保藏信息如下。

菌株名称：JKsb3；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏编号：CGMCC No.24516；

保藏时间：2022年3月11日。

首先，本发明提供了一种JKsb3的分离方法具体包括：

1)截取锦葵的一段茎，将其清洗干净剪成长2cm的小段，用无菌水冲洗干净后放入超净工作台；

2)于75％的酒精中浸泡30s后用无菌水冲洗4次；

3)于1％的次氯酸钠溶液中浸泡10min后用无菌水冲洗4次；

4)将表面灭菌的锦葵茎段切成1cm左右小段，接种于PDA培养基上，每个培养皿接种三个；

5)置于28℃的恒温培养箱中培养3-5d；

6)反复划线纯化直至得到单菌落；

7)置于4℃保藏备用。

另外，本发明还通过对JKsb3的16S rDNA序列分析对其进行了分类鉴定，主要包含：

1)提取JKsb3的基因组DNA；

2)对16S rDNA片段进行PCR扩增，扩增片段大小约1450bp,扩增时所用引物序列为：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')/1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')；

3)对扩增后的基因组进行sanger双向测序；

4)测得序列与Ezbiocloud中的相关数据进行Blast相似性分析，并与Ezbiocloud数据库中已报道的相似序列用Mega(X)软件的邻接法构建系统发育树。

结合菌株形态观察、培养特性及16S rDNA的鉴定结果，鉴定本发明所述芽孢杆菌归属于贝莱斯芽孢杆菌。

再者，本发明进一步探索了JKsb3菌株的活化、发酵方法，具体地，本发明给出了一种优选地JKsb3菌株的发酵方法，具体包括：

1)选用PDA培养基在33℃下活化JKsb3菌株1-2d；

2)配置JKsb3菌体悬浮液，控制浓度在10⁶个/mL数量级；

3)将悬浮液以5％体积比例的接种量接入发酵培养基中；

4)于33℃，180rpm条件下震荡培养5d。

其中，在本发明中优选地发酵培养基的组成包括可溶性淀粉30.0g，豆柏粉10.0g，酵母膏10.0g，NaCl 2.5g，K₂HPO₄5.0g，Mg₂SO₄ 1.5g，CaCl₂ 1.0g以及蒸馏水1000mL。

此外，基于JKsb3在农业领域的应用结合本申请所述发酵方法，本发明还提供了一种含有JKsb3，或含有JKsb3的发酵产物，或含有JKsb3及其发酵产物的农用组合物。

最后，结合JKsb3及其发酵产物(液)表现出的生物活性，本发明提出了JKsb3及其农用组合物在农业方面的应用，具体提供了JKsb3在防治葡萄霜霉病、葡萄灰霉病、甜瓜白粉病方面的应用。

根据上述技术方案，与现有技术相比，本发明所述贝莱斯芽孢杆菌及其发酵方法与应用，至少具有下述有益效果或优点：

1)本发明从陕西省秦岭野生锦葵中，分离筛选得到一株具有生物活性的芽孢杆菌JKsb3，经鉴定，该菌归属贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus vezelensis)。该贝莱斯芽孢杆菌可以作为开发新型、高效、广谱、低毒、环保的生物菌剂的原料微生物。

2)本发明明确了所述贝莱斯芽孢杆菌的活化培养基、发酵培养基，以及其发酵培养方法。

3)根据本发明的试验结果，所述贝莱斯芽孢杆菌的发酵液能直接用于灰霉病及霜霉病等植物病害的防治，尤其是，所述贝莱斯芽孢杆菌的发酵液对葡萄灰霉病及霜霉病具有较好的防治作用。

4)基于本发明的技术方案，可以预测所述贝莱斯芽孢杆菌在微生物农药、微生物制剂及其他防治农业病虫害相关领域，具有较好的开发应用前景。

附图说明

图1分别为所述贝莱斯芽孢杆菌菌株在PDA培养基上培养2d后菌落形态的正面与背面。

图2为所述贝莱斯芽孢杆菌菌株在发酵培养5d后的菌体形态图。

图3为所述贝莱斯芽孢杆菌菌株经革兰氏染色和芽孢荚膜染色后放大100倍的菌体形态图。

图4为所述贝莱斯芽孢杆菌菌株经芽孢荚膜染色后放大100倍的芽孢形态图。

图5为所述贝莱斯芽孢杆菌菌株经芽孢荚膜染色后放大100倍的荚膜形态图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例给出了贝莱斯芽孢杆菌JKsb3的发酵液防治葡萄霜霉病的田间试验，试验于2021年7月在陕西杨凌新天地科技园葡萄园进行，供试葡萄植株为红地球葡萄，共10株，高2.5m，占地约10m²，土壤肥力良好。

将JKsb3的发酵原液稀释20倍作为实验组，清水做对照组，每组3-4株葡萄。每株调查10片叶片的病级指数并根据分级做好标记，分级标准见表1。采用手动喷雾器喷药一次，使叶片正反面均匀铺满药液，同时使该叶片附加的叶片均喷满药液。喷药后3d、7d、15d分别调查病情指数并计算防效，结果见表2。

表1葡萄叶片霜霉病分级标准

表2JKsb3发酵液对葡萄霜霉病的防治效果

从表1和表2看出，所述贝莱斯芽孢杆菌的发酵液具有防治葡萄霜霉病的作用，3d、7d、15d的防效分别为51.68％、50.91％、53.68％，对霜霉病的平均防效达到52.09％。

实施例2

本实施例给出了贝莱斯芽孢杆菌JKsb3在防治葡萄灰霉病病原菌的室内试验。试验所用患病葡萄为于2020年10月在陕西省咸阳市杨凌示范区新天地农业示范科技园葡萄种植资源基地内采集的患灰霉病的葡萄果实。

将采集的患病葡萄在PDA平板上培养，长出菌落后多次划线纯化得到灰霉病病原菌。将葡萄灰霉病菌菌饼(直径6mm)接种在培养皿中心。分离所得JKsb3菌株置于PDA平板上活化1d。用无菌玻璃棒分别挑取少量JKsb3，接种于灰霉菌菌病的上下左右方向距离菌饼中心2cm处，设置三个重复。以单独接种葡萄灰霉病菌的平板为对照。将PDA平板置于28℃培养5d，测量菌落直径，计算抑菌率。试验结果见表3。

相对抑菌率计算公式：

表3JKsb3对葡萄灰霉病菌抑制效果

从表3看出，所述贝莱斯芽孢杆菌对葡萄灰霉病菌有较强的抑制效果，对葡萄灰霉病菌的平均抑制效果达到68.11％。

实施例3

本实施例通过田间药效试验探究贝莱斯芽孢杆菌JKSb3对白粉病的防治效果。试验在杨凌五泉镇五泉村的甜瓜种植大棚中进行，贝莱斯芽孢杆菌JKSb3发酵液原液稀释2倍(菌体浓度3.5×10⁸CFU/mL)和4倍(菌体浓度1.75×10⁸CFU/mL)分别做试验组，清水做对照组，采用手动喷雾器，使甜瓜叶片正反面均匀喷布一层药液。每个处理有3株，每株查3片叶，喷洒药液前调查病情指数并做好标记(甜瓜叶片病斑分级标准同实施例1)，喷药1d、3d、5d、7d和11d后调查病情指数并计算防效。试验结果见表4-6。

表4对照组甜瓜叶片病情指数

表5试验组(稀释2倍)喷施菌剂前后叶片病情指数和防治效果

表6试验组(稀释4倍)喷施菌剂前后叶片病情指数和防治效果

由田间药效试验结果可知，贝莱斯芽孢杆菌JKsb3发酵液对于甜瓜白粉病有较好的防效，防效在50％～70％之间。此外贝莱斯芽孢杆菌JKsb3发酵液还能使遭受病害的甜瓜叶片恢复为绿色，具有一定的复绿作用。稀释4倍的贝莱斯芽孢杆菌JKsb3发酵液的防治效果没有稀释2倍的防治效果好，初步猜测是因为防治效果与稀释倍数相关。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus vezelensis)JKsb3，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.24516。

2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌16S rDNA片段PCR扩增所使用的引物为：

27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')；

1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。

3.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，活化所述贝莱斯芽孢杆菌；配制所述贝莱斯芽孢杆菌体悬浮液，菌体悬浮液浓度控制在10⁶个/mL数量级；接种发酵，将菌体悬浮液以5％体积比例的接种量接入发酵培养基中。

4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，活化所述贝莱斯芽孢杆菌的培养基选用PDA培养基，活化条件为33℃、培养1-2d。

5.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：可溶性淀粉30.0g，豆柏粉10.0g，酵母膏10.0g，NaCl 2.5g，K₂HPO₄5.0g，Mg₂SO₄1.5g，CaCl₂1.0g，蒸馏水1000mL。

6.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，发酵所述贝莱斯芽孢杆菌的条件为33℃、180rpm震荡培养5d。

7.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌的分离方法，其特征在于，表面灭菌的锦葵茎段接种于PDA培养基，28℃恒温培养3-5d，划线纯化得到单菌落。

8.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌在农业病害防治中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌用于防治葡萄霜霉病、葡萄灰霉病、甜瓜白粉病。

10.一种农用组合物，其特征在于，所述农用组合物含有所述贝莱斯芽孢杆菌，或含有所述贝莱斯芽孢杆菌的发酵产物，或含有所述贝莱斯芽孢杆菌及其发酵产物。

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