CN112195135A - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治植物霜霉病害中的应用 - Google Patents

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治植物霜霉病害中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HMQAU19044，该菌株于2020年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCC No.19420。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HMQAU19044对黄瓜霜霉病有显著的防治效果，实施例的研究表明，菌株HMQAU19044发酵滤液对黄瓜霜霉病菌游动孢子的释放有明显的抑制作用；菌株HMQAU19044发酵液对黄瓜霜霉病菌游动孢子的释放有明显的抑制作用；菌株HMQAU19044发酵滤液对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长均有明显的抑制作用；菌株HMQAU19044发酵滤液在一定程度上抑制已发病黄瓜叶片的病斑扩展；本发明菌株HMQAU19044发酵滤液和发酵液对黄瓜霜霉病具有良好的防治效果。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治植物霜霉病害中的应用
技术领域
本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)及其在防治植物霜霉病害中的应用。
背景技术
黄瓜是我国重要的大宗蔬菜之一，霜霉病发生导致露地和保护地栽培的黄瓜常年遭受严重损失。黄瓜霜霉病是由古巴假霜霉侵染而引起的一种严重病害。黄瓜霜霉病流行性较强，具备较快的传播速度以及较高的发生率，如果环境条件适宜，一旦发生仅仅1～2周即可导致黄瓜植株叶片全部枯萎死亡，使黄瓜结果受到直接影响。通常情况下，霜霉病可导致黄瓜减产30％～50％，严重时其减产幅度会超过70％，甚至可能会导致绝产。因此霜霉病是黄瓜生产栽培中危害严重的病害之一，发病影响巨大，损失严重。
黄瓜品种一般不抗病，且病原菌容易产生抗药性导致农药残留超标，因此探索新的防治方法尤为关键。
贝莱斯芽孢杆菌是2005年Ruiz-García等新命名的芽孢杆菌属新种，是一种新型生防细菌，作为一种新型生防微生物因子，贝莱斯芽孢杆菌在植物病害防控、促进植物生长等方面备受关注。例如中国专利CN201811068345.5公开了一株生防贝莱斯芽孢杆菌及其在防治黄瓜白粉病菌中的应用，中国专利CN201910453041.9公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治根结线虫中的应用，中国专利CN201910891472.3公开了一株贝莱斯芽孢杆菌CY30及在茶轮斑病防治中的应用，中国专利CN201910297167.1公开了一株抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。
但是，目前，国内外尚无贝莱斯芽孢杆菌用于防治黄瓜霜霉病的报道。如何解决上述技术问题，是目前微生物技术领域需要解决的技术问题。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的不足，提供一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治植物卵菌病害中的应用。该菌对黄瓜霜霉病菌具有较好的抑制作用，为使用微生物代替化学合成杀菌剂、利用生物防治方法防治黄瓜霜霉病提供了新的资源，可作为生物农药进行开发利用。
本发明所提供的一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HMQAU19044，于2020年1月19日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCC No.19420，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所提供的一种由上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HMQAU19044制备的微生物菌剂，所述微生物菌剂含有菌株HMQAU19044和/或菌株HMQAU19044的代谢产物。
优选的，本发明所提供的上述的微生物菌剂，所述微生物菌剂的活性成分为菌株HMQAU19044的发酵液或者发酵滤液。
优选的，本发明所提供的上述的微生物菌剂，所述微生物菌剂为液体菌剂，且在该菌剂中活菌和/或活芽孢的数量≥1.5～2.0×109个/mL。
本发明所提供的微生物菌剂的制备方法，具体步骤包括：
(1)固体LB培养基制备；
(2)液体LB培养基制备；
(3)活化菌株：挑取一环菌株HMQAU19044菌落，接种在50mL液体LB培养基中，200rpm、30℃恒温振荡培养24h，制成种子液；
(4)发酵液的制备：将制备好的种子液，1/50接种于50mL液体LB培养基中，200rpm、30℃恒温振荡培养48h，制备菌株HMQAU19044发酵液；
(5)发酵滤液的制备：将制备好的发酵液于4℃，8000r/min离心15min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，制备菌株HMQAU19044发酵滤液。
本发明所提供的固体LB培养基由以下方法制备：取10g胰蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母浸出汁，15-20g琼脂粉，去离子水溶解，pH6.8，用去离子水定容至1L，121℃湿热灭菌25min。
本发明所提供的液体LB培养基由以下方法制备：取10g胰蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母浸出汁，去离子水溶解，pH6.8，用去离子水定容至1L，121℃湿热灭菌25min。
本发明所提供的微生物菌剂的应用，优选的，所述微生物菌剂用于黄瓜霜霉病的防治。
本发明所提供的一种黄瓜霜霉病的防治方法，所述方法是利用上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HMQAU19044或者上述的微生物菌剂处理。
本发明的有益效果是：
1.本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HMQAU19044对黄瓜霜霉病有显著的防治效果，实施例的研究表明，菌株HMQAU19044发酵滤液对黄瓜霜霉病菌游动孢子的释放有明显的抑制作用，其中，滤液原液对游动孢子的释放抑制率高达100％，稀释12.5倍后释放抑制率仍达92.99％；菌株HMQAU19044发酵液对黄瓜霜霉病菌游动孢子的释放有明显的抑制作用，其中，发酵液原液对游动孢子的释放抑制率高达100％，稀释12.5倍后释放抑制率仍达94.16％；菌株HMQAU19044发酵滤液对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长均有明显的抑制作用；菌株HMQAU19044发酵滤液在一定程度上抑制已发病黄瓜叶片的病斑扩展；本发明菌株HMQAU19044发酵滤液和发酵液对黄瓜霜霉病具有良好的防治效果。
2.本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HMQAU19044防治效果稳定，对环境友好，大规模生产的发酵工艺简单，生产成本低廉。
3.本发明的微生物菌剂可用于防治各种植物霜霉病害，包括但不限于，黄瓜霜霉病、菠菜霜霉病、莴苣霜霉病、大葱霜霉病、葡萄霜霉病或者荔枝霜霉病等。
附图说明
图1为菌株HMQAU19044菌落形态及革兰氏染色；
图2为菌株HMQAU19044不同稀释倍数发酵液处理对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放的影响；
其中，图2A为发酵液原液处理；图2B为发酵液稀释50倍处理；图2C为无菌水对照；图2D为游动孢子形态；
图3为菌株HMQAU19044不同稀释倍数发酵滤液处理对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发的影响；
其中，图3A为发酵滤液原液处理；图3B为发酵滤液稀释100倍处理；图3C为无菌水对照；
图4为菌株HMQAU19044菌悬液、发酵滤液及发酵液对离体黄瓜叶片霜霉病的防治效果；
其中，图4Aa为喷施菌悬液24h后接种病原菌；图4Ab为喷施菌悬液稍干燥后接种病原菌；图4Ac为接种病原菌24h后喷施菌悬液；图4Ba为喷施发酵滤液24h后接种病原菌；图4Bb为喷施发酵滤液稍干燥后接种病原菌；图4Bc为接种病原菌24h后喷施发酵滤液；图4Ca为喷施发酵液24h后接种病原菌；图4Cb为喷施发酵液稍干燥后接种病原菌；图4Cc为接种病原菌24h后喷施发酵液；图4D为无菌水对照；图4E为无菌液体LB培养基对照；
图5为菌株HMQAU19044发酵滤液对离体黄瓜叶片霜霉病的防治效果；
其中，图5A为接种病原菌0h后喷施菌株HMQAU19044发酵滤液；图5B为接种病原菌1h后喷施菌株HMQAU19044发酵滤液；图5C为接种病原菌2h后喷施菌株HMQAU19044发酵滤液；图5D为接种病原菌3h后喷施菌株HMQAU19044发酵滤液；图5E为接种病原菌4h后喷施菌株HMQAU19044发酵滤液；图5F为无菌水对照；
图6为菌株HMQAU19044发酵液对离体黄瓜叶片霜霉病的防治效果；
其中，图6A为接种病原菌0h后喷施菌株HMQAU19044发酵液；图6B为接种病原菌1h后喷施菌株HMQAU19044发酵液；图6C为接种病原菌2h后喷施菌株HMQAU19044发酵液；图6D为接种病原菌3h后喷施菌株HMQAU19044发酵液；图6E为接种病原菌4h后喷施菌株HMQAU19044发酵液；图6F为无菌水对照；
图7为菌株HMQAU19044对黄瓜霜霉病的室内盆栽防效效果；
其中，图7A为实施例6中处理1；图7B为实施例6中处理2；图7C为实施例6中处理3。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
本发明中，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HMQAU19044或被简称为菌株HMQAU19044。
实施例1拮抗菌株的分离筛选
1.菌株的分离与初筛
(1)拮抗菌株的分离
2019年7月于山东省海阳市留格庄镇河岸村采集具有根结线虫根结的番茄根，将约1克重的带根结的番茄根，表面消毒，之后用消毒的剪刀剪碎，加入灭菌水1mL，用灭菌后的研钵和研棒研磨，把研磨汁液采用稀释平板法分离细菌菌株，培养基为LB固体培养基，待长出菌落后，挑取细菌单菌落于LB固体平板划线纯化并保存。
(2)细菌发酵上清液制备
将斜面保存的细菌菌种于LB固体培养基上划线，于30℃培养24h，将培养好的菌落用挑针转接到装有125mL液体LB培养基的250mL三角瓶中，30℃，200r/min振荡培养48h，得到细菌发酵液。5000r/min离心5min，取发酵液上清，保存于4℃冰箱中。
(3)大量南方根结线虫二龄幼虫的获得
取线虫实验室繁殖的植物根结，用0.5％NaClO消毒2min，无菌水冲洗3次，用消毒的镊子将卵块取下，放在灭菌的培养皿中，置于28℃恒温培养箱中进行孵化，收集孵化出的二龄幼虫(J2)，4℃冰箱保存备用。
(4)生防菌发酵上清液对南方根结线虫J2的影响
取1mL发酵上清液，加入30条南方根结线虫J2，置于28℃培养箱中培养，采用“体态法”和“生理盐水刺激法”(参考文献：方中达.植病研究方法.北京:中国农业出版社，1998:307-320.)在体式显微镜下检测，分别于6h、12h观察J2死亡情况，记录J2死亡数并计算J2死亡率和校正死亡率。
根结线虫J2死亡率＝死亡的J2数量/供试J2数量×100％
根结线虫J2校正死亡率＝[(处理J2死亡率-对照J2死亡率)/(1-对照J2死亡率)]
将分离纯化得到的细菌划线活化后转接制备细菌发酵液，取上清液进行南方根结线虫杀线虫活性测定。通过该试验筛选出对南方根结线虫J2 12h致死率达到70％以上的菌株共有3株，分别是菌株4-2、菌株HMQAU19044、4-5。
表1生防细菌发酵上清液对南方根结线虫J2的影响
Figure BDA0002765074710000071
注：每列中字母相同者表示差异未达显著水平(P>0.05)，字母不同者表示差异达显著水平(P<0.05)。
2.黄瓜霜霉病拮抗菌筛选
将初筛出来菌株4-2、菌株HMQAU19044、4-5分别置于LB中摇培2d，37℃，200r/min，用血球计数板将细菌浓度调成1×108个/mL，备用。采集新鲜的霜霉病菌孢子囊，用血球计数板将孢子囊浓度调成5×104个/mL，备用。细菌菌株4-2和4-5经分子初步鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，来源与菌株HMQAU19044相同。
选取大小一致的黄瓜叶片，用脱脂棉包被叶柄，背面朝上置于垫有湿滤纸的培养皿中，先均匀喷洒细菌发酵液分别点接到黄瓜叶片上，24h后将配好的病菌孢子悬浮液点接于叶背面，每个叶片5个点，每个点滴10μL。盖上皿盖，置于光暗12h交替，25℃下培养，7d后观察结果，以喷无菌水代替细菌发酵液为对照，每个处理3个叶片。
黄瓜病情指数的调查分级标准采用国家农业行业标准中的黄瓜抗霜霉病技术鉴定规程(2010)的分级标准，如下：
0级：无症状；
1级：病斑面积占叶面积1/10以下；
3级：病斑面积占叶面积1/10～1/4；
5级：病斑面积占叶面积1/4～1/2；
7级：病斑面积占叶面积1/2～3/4；
9级：病斑面积占叶面积3/4以上，以至干枯。
病情指数的计算公式为：
病情指数＝∑(各级病叶数x相对级数)x100/[调查总叶数x9]
表2黄瓜霜霉病拮抗菌筛选情况
Figure BDA0002765074710000091
由表2可知，菌株HMQAU19044发酵液的病情指数为0，离体叶片未发病，因此用于后续的深入研究。
实施例2黄瓜霜霉病拮抗细菌菌株HMQAU19044的鉴定
1.形态学鉴定
将斜面上的菌株HMQAU19044转接到LB培养基平板上，进行三区划线，在30℃培养箱中培养48h，待长成明显单菌落后观察菌落形态并拍照，包括菌落形状、大小、颜色、表面、边缘、透明度、隆起形状。挑取培养24h的细菌菌株进行革兰氏染色镜检，方法参照《常见细菌系统鉴定手册》。
菌株HMQAU19044在LB固体培养基上30℃培养2d，菌落直径2.5-5mm，菌落凸起呈乳白色、不透明、圆形、边缘不规则、表面褶皱，菌体革兰氏染色阳性，短杆状，能够产生芽孢，芽孢呈椭圆形。如图1所示。
2.生理生化鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》，对菌株HMQAU19044分别进行了需氧性，生长温度，耐盐性，生长pH，柠檬酸盐利用，接触酶，氧化酶，葡萄糖氧化发酵，吲哚反应，硝酸盐还原，反硝化，糖醇类发酵，甲基红反应，V-P测定，淀粉水解及明胶液化等测定。
参照《常见细菌系统鉴定手册》与《伯杰细菌手册》相关内容，分析菌株HMQAU19044的生理生化实验结果，鉴定结果见表3。由表3可知，菌株HMQAU19044为需氧菌，在2％～10％(质量分数)NaCl培养基，pH5.5，20℃和45℃下条件下可生长，4℃，pH9.0条件下不能生长。能分解利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及甘露醇，不能发酵果糖、乳糖及甘露糖，可水解淀粉和明胶，不能产生吲哚，能利用葡萄糖产酸，其接触酶反应、V-P反应和硝酸盐还原反应均呈阳性，氧化酶反应、柠檬酸盐反应、反硝化反应及甲基红反应均呈阴性。结合菌株HMQAU19044的形态学特征与生理生化鉴定结果，菌株HMQAU19044与贝莱斯芽孢杆菌各特征较为相似，初步将该菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
表3菌株HMQAU19044生理生化鉴定表
Figure BDA0002765074710000101
Figure BDA0002765074710000111
3.分子生物学鉴定
gyrB序列分析是芽孢杆菌属细菌鉴定的分子生物学鉴定手段，菌株基因组DNA的提取参考夏涵等的chelex100法(参考文献：夏涵,府伟灵,陈鸣,黄庆，赵猛，赵渝徽，王丰，罗阳.快速提取细菌DNA方法的研究[J].现代预防医学,2005,32(5):571-573.)。
以gyrB引物UP1(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′)和UP2r(5′-AGCAGGGTACGGATG TGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′)对菌株的基因组进行扩增。
反应体系：10×Buffer 2.5μL，5mmol/L dNTP 2μL，10μmol/L引物UP1和引物UP2r各1μL，PremixTaq(5U/μL)0.5μL，模板DNA 2.5μL，补水至25μL。
反应条件：95℃预变性5min；98℃变性10s，65℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸8min。扩增产物取5μL在1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增效果，其余扩增产物采用凝胶回收试剂盒回收。利用pMD18-T载体对回收的扩增产物进行T-A克隆和转化，菌液PCR检测后送双向测序。
本发明通过gyrB序列测序结果经Sequencher5.0软件自动装配后导出重叠群(Contig)，并在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)数据库中进行BLAST分析。
综上，该菌株通过基因序列比对，结合生理生化鉴定进一步确定其分类学地位，该菌株HMQAU19044鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，该菌株于2020年1月19日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCC No.19420，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例3菌株HMQAU19044对黄瓜霜霉病菌不同发育阶段的抑制特性
1.菌株HMQAU19044及其菌剂制备
固体LB培养基由以下方法制备：取10g胰蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母浸出汁，15-20g琼脂粉，去离子水溶解，pH6.8，用去离子水定容至1L，121℃湿热灭菌25min。
液体LB培养基由以下方法制备：取10g胰蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母浸出汁，去离子水溶解，pH6.8，用去离子水定容至1L，121℃湿热灭菌25min。
活化菌株：挑取一环菌落，接种在50mL液体LB培养基中，200rpm、30℃恒温振荡培养24h，制成种子液。
发酵液的制备：将制备好的种子液，1/50接种于50mL液体LB培养基中，200rpm、30℃恒温振荡培养48h，即为制备好的菌株HMQAU19044发酵液。该菌液中活菌和/或活芽孢的数量≥1.5～2.0×109个/mL。
发酵滤液的制备：将制备好的发酵液于4℃，8000r/min离心15min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，制备菌株HMQAU19044发酵滤液。
菌体的制备：将发酵液离心后的沉淀用无菌水洗涤，8000r/min离心5min，重复三次。用无菌水将菌体稀释，用血球计数板配制成1×109个/mL的菌悬液。
2.菌株HMQAU19044对黄瓜霜霉病菌游动孢子的抑制作用
(1)菌体对病原菌游动孢子释放及游动的影响
用灭菌自来水制备浓度为1×105个/mL的黄瓜霜霉病孢子囊悬浮液。将菌株HMQAU19044菌悬液梯度稀释为1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104个/mL并与孢子囊悬浮液等体积混匀，以灭菌自来水和孢子囊悬浮液等体积混匀为对照。各处理取40μL滴加在凹玻片上，将凹玻片放入铺有湿滤纸的培养皿中，放在4℃,RH>80％黑暗的冰箱中保湿培养1h，再在20℃培养箱中培养1h。待对照中80％以上的孢子囊释放出游动孢子，在显微镜下观察100个孢子囊的空囊率及游动孢子的游动频率，并进行显微拍照。每处理设3个重复，试验重复3次。
游动孢子释放抑制率(％)＝(对照组游动孢子释放率-处理组游动孢子释放率)/对照组游动孢子释放率×100％
游动孢子游动抑制率(％)＝(对照组游动孢子游动率-处理组游动孢子游动率)/对照组游动孢子游动率×100％
表4菌株HMQAU19044菌悬液对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及游动的影响
Figure BDA0002765074710000131
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
试验结果如表4所示，菌株HMQAU19044菌悬液对黄瓜霜霉病菌游动孢子的释放和游动均没有明显的抑制作用，释放抑制率最高仅为14.33％，游动抑制率最高仅为18.12％。
(2)发酵滤液对病原菌游动孢子释放及游动的影响
用灭菌自来水制备浓度为1×105个/mL的孢子囊悬浮液。将发酵滤液按0，12.5，25，50,100,150和200倍的稀释比例分别与孢子囊悬浮液等体积混匀，以灭菌自来水和孢子囊悬浮液等体积混匀为对照。各处理取40μL滴加在凹玻片上，将凹玻片放入铺有湿滤纸的培养皿中，放在4℃,RH>80％黑暗的冰箱中保湿培养1h，再在20℃培养箱中培养1h。待对照中80％以上的孢子囊释放出游动孢子，在显微镜下观察100个孢子囊的空囊率及游动孢子的游动频率，并进行显微拍照。每处理设3个重复，试验重复3次。
表5菌株HMQAU19044发酵滤液对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及游动的影响
Figure BDA0002765074710000141
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
试验结果如表5所示，菌株HMQAU19044发酵滤液对黄瓜霜霉病菌游动孢子的释放有明显的抑制作用，其中滤液原液对游动孢子的释放抑制率高达100％，而稀释12.5倍后释放抑制率仍为92.99％，由不同稀释倍数发酵滤液处理的游动孢子释放抑制率得回归曲线y＝2.2755x+0.9732(R2＝0.9907)，有效抑制中浓度EC50值为58.83。但对游动孢子游动的抑制效果不明显。
(3)发酵液对病原菌游动孢子释放及游动的影响
用灭菌自来水制备浓度为1×105个/mL的孢子囊悬浮液。将发酵液按0，12.5，25，50,100,150和200倍的稀释比例分别与孢子囊悬浮液等体积混匀，以灭菌自来水和孢子囊悬浮液等体积混匀为对照。各处理取40μL滴加在凹玻片上，将凹玻片放入铺有湿滤纸的培养皿中，放在4℃,RH>80％黑暗的冰箱中保湿培养1h，再在20℃培养箱中培养1h。待对照中80％以上的孢子囊释放出游动孢子，在显微镜下观察100个孢子囊的空囊率及游动孢子的游动频率，并进行显微拍照。每处理设3个重复，试验重复3次。
表6菌株HMQAU19044发酵液对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及游动的影响
Figure BDA0002765074710000151
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
试验结果如表6和图2所示，菌株HMQAU19044发酵液对黄瓜霜霉病菌游动孢子的释放有明显的抑制作用，其中发酵液原液对游动孢子的释放抑制率高达100％，而稀释12.5倍后释放抑制率仍为94.16％，由不同稀释倍数发酵液处理的游动孢子释放抑制率得回归曲线y＝2.607x+0.449(R2＝0.9584)，有效抑制中浓度EC50值为55.68。但对游动孢子游动的抑制不明显。
3.发酵滤液对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响
用灭菌自来水制备浓度为1×105个/mL的孢子囊悬浮液。将孢子囊悬浮液20μL滴加到凹玻片上，放在13℃、RH＞80％黑暗的培养箱中保湿培养2h，待对照中80％以上的孢子囊释放，分别加入稀释100倍、50倍、25倍、12.5倍的发酵滤液及发酵滤液原液各20μL，放入13℃、RH＞80％黑暗的培养箱中保湿培养4-5h。待大于80％的游动孢子形成休止孢，再继续培养4h后，待对照休止孢萌发率大于45％，进行拍照记录并测量芽管长度。
表7发酵滤液对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响
Figure BDA0002765074710000161
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
由表7和图3可知，菌株HMQAU19044发酵滤液对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长均有明显的抑制作用。其中发酵滤液原液对休止孢萌发抑制率和芽管伸长抑制率均达到100％，除稀释100倍处理的休止孢萌发率与对照相比差异不显著，其余处理与对照相比均差异显著。由不同稀释倍数发酵滤液处理的休止孢萌发抑制率得回归曲线y＝-3.343x+10.391(R2＝0.9437)，有效抑制中浓度EC50＝40.98；由不同稀释倍数处理的芽管伸长抑制率得回归曲线y＝-1.5097x+7.4736(R2＝0.9488)，有效抑制中浓度EC50＝43.50。
4.发酵滤液对黄瓜霜霉病菌病斑扩展和产孢的影响
本试验采用点滴法，用离体叶片代替叶盘，将大小一致的黄瓜叶片背面朝上置于垫有湿润滤纸的培养皿中，用灭菌自来水制备浓度为1×105个/mL的孢子囊悬浮液，于叶片背面接种孢子囊悬浮液，每个叶片5个点，每个点滴10μL，置于白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替的培养箱中培养4d，此时病斑产生但未产孢，调查初始病斑面积。再用小喷壶将稀释100倍、50倍、25倍、12.5倍的发酵滤液及发酵滤液原液均匀喷施到叶片表面至流失，空白对照喷无菌水，培养3～6d至产孢，调查最终病斑面积。根据不同稀释倍数处理的初始值与最终值计算病斑面积的扩展抑制率；单位病斑面积产孢量调查采用1mL无菌水将各处理叶片上产生的霉层洗下制成孢子囊悬浮液，摇匀后取10μL在10x10倍显微镜下检查孢子囊数量，并换算每毫升孢子囊悬浮液中所含的孢子囊数量，进而计算单位体积单位病斑面积的产孢量，根据处理及对照叶片的产孢量比较计算稀释不同倍数发酵滤液处理的产孢抑制率。
病斑扩展量＝病斑最终面积平均值-病斑初始面积平均值
病斑扩展抑制率(％)＝[(对照的平均病斑扩展量-处理的平均病斑扩展量)/对照的平均病斑扩展量]x100％
单位病斑面积产孢量抑制率(％)＝[(对照的单位病斑面积产孢量-处理的单位病斑面积产孢量)/对照的单位病斑面积产孢量]x100％
表8菌株HMQAU19044发酵滤液对黄瓜霜霉病菌的病斑扩展和产孢的影响
Figure BDA0002765074710000171
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
由表8可知，菌株HMQAU19044发酵滤液能够在一定程度上抑制已发病黄瓜叶片的病斑扩展，但各处理与对照间均差异不显著，由不同稀释倍数发酵滤液处理的抑制率得回归曲线y＝-0.3985x+5.025(R2＝0.9867)，有效抑制中浓度EC50＝1.16。
但菌株HMQAU19044发酵滤液能有效抑制黄瓜霜霉病菌的产孢量，单位病斑面积产孢量随稀释倍数的升高而升高，各处理与对照间均差异显著，根据不同稀释倍数发酵滤液处理的单位病斑面积产孢量抑制率得回归曲线y＝-0.4662x+5.7866(R2＝0.9335)，有效抑制中浓度EC50＝48.67。
实施例4菌株HMQAU19044不同喷施处理对离体黄瓜叶片霜霉病的防治作用
选取大小一致的黄瓜叶片，用自来水冲洗后吸干水分，背面朝上置于垫有湿滤纸的培养皿中，待用。用灭菌自来水制备浓度为1×105个/mL的孢子囊悬浮液。试验设9种处理，分别为3种喷施时间(a喷施药剂24h后接种孢子囊悬浮液；b喷施药剂后待药液稍干燥立即接种孢子囊悬浮液；c接种孢子囊悬浮液24h后喷施药剂)和3种喷施药剂(A菌悬液；B发酵滤液；C发酵液)的组合。
采用点滴法接种，每个叶片5个点，每个点滴10μL。以接种无菌水和无菌LB培养基分别作为A和B、C的对照。培养条件为白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替。7d后测量病斑大小，根据病斑大小计算病情指数和防治效果。
表9菌株HMQAU19044对离体黄瓜叶片霜霉病的防治效果
Figure BDA0002765074710000181
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
由表9和图4可知，使用A(菌悬液)的3个处理中，a(施药24h后接种)、b(施药同时接种)和c(接种24h后施药)的防效之间均无显著差异，对病害基本无防效，甚至有使病害加重的趋势；使用B(发酵滤液)的处理中，a(施药24h后接种)和b(施药同时接种)的防效之间无显著差异，防效均较高，b的防效高达100％，而c(接种24h后施药)的防效明显低于其他2个处理，仅为17.23％；使用C(发酵液)的处理中，a(施药24h后接种)和b(施药同时接种)的防效之间无显著差异，防效均在90％以上，b效果最佳，c(接种24h后施药)的防效明显低于其他2个处理，仅为40.50％，如图4所示。可见，施用发酵液和发酵滤液对病害的防效较高，而施用菌悬液对病害无防效，先施药后接种病原菌的防效优于先接种病原菌后施药。
实施例5菌株HMQAU19044不同喷施时间对离体黄瓜叶片霜霉病的治疗作用
为进一步探究生防菌菌株HMQAU19044对黄瓜霜霉病的治疗作用，选取大小一致的黄瓜叶片，用自来水冲洗后吸干水分，背面朝上置于垫有湿滤纸的培养皿中，待用。用灭菌自来水制备浓度为1×105个/mL的孢子囊悬浮液。采用点滴法接种，每个叶片5个点，每个点滴10μL。待接种病原菌0h、1h、2h、3h和4h后分别均匀喷施菌株HMQAU19044发酵滤液和发酵液，以均匀喷施无菌水为对照。培养条件为白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替。7d后测量病斑大小，根据病斑大小计算病情指数和防治效果。
表10菌株HMQAU19044对离体黄瓜叶片霜霉病的治疗效果
Figure BDA0002765074710000191
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
由表10、图5和图6可知，接种病原菌1h内分别喷施菌株HMQAU19044发酵滤液和发酵液对病害有很好的治疗作用，相对防效均达到100％；接种病原菌2h后再喷施菌株HMQAU19044发酵液和发酵滤液，叶片上开始出现病斑，且随时间的延长相对防效逐渐降低，如图5、图6所示，接种病原菌4h后再分别喷施菌株HMQAU19044发酵滤液和发酵液，相对防效仅为45.29％和38.58％。
实施例6菌株HMQAU19044对黄瓜霜霉病的室内盆栽防效测定
用灭菌自来水制备浓度为1×104个/mL的孢子囊悬浮液，用于喷雾接种。黄瓜苗选用改良鲁黄瓜3号品种，以沙子：营养土1：1作为育苗基质，将种子播种于育苗盘，幼苗长到约有2-3片真叶时移栽到5×5×7cm的花盆中，待幼苗长至4-5片真叶时进行盆栽防效试验。
处理1：先将菌株HMQAU19044发酵滤液均匀喷施至叶片背面，每盆用量2mL，待滤液稍干燥后再均匀喷施孢子囊悬浮液于叶片背面，每盆用量2mL。
处理2：先将菌株HMQAU19044发酵液均匀喷施至叶片背面，每盆用量2mL，待菌液稍干燥后再均匀喷施孢子囊悬浮液于叶片背面，每盆用量2mL。
处理3：病原菌对照，先均匀喷施灭菌自来水至叶片背面，每盆用量2mL，稍干燥后再均匀喷施孢子囊悬浮液，每盆用量2mL。
每个处理4个重复。各处理在接种病原菌后，用黑色塑料袋罩住，置于18℃培养箱中保湿24h，取下塑料袋，置于白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替的培养箱中培养，7d后调查各处理的发病情况。如图7所示。
表11菌株HMQAU19044对黄瓜霜霉病的室内盆栽防效
Figure BDA0002765074710000201
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
如表11所示，菌株HMQAU19044对黄瓜霜霉病具有较好的防治作用，其中发酵滤液处理后相对防效达79.45％，而发酵液处理后相对防效也有59.82％。经统计学分析，两种处理的防效差异显著，而试验组与病原菌对照组的病情指数也达差异显著水平。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治植物霜霉病害中的应用
<141> 2020-11-04
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> synthetic sequence
<400> 1
gaagtcatca tgaccgttct gcaygcnggn ggnaarttyg a 41
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> synthetic sequence
<400> 2
agcagggtac ggatgtgcga gccrtcnacr tcngcrtcng tcat 44
<210> 3
<211> 1259
<212> DNA
<213> gene GyrB of Bacillus velezensis
<400> 3
gaagtcatca tgaccgttct gcacgcgggc ggtaagttcg acggaagcgg atataaagta 60
tccggcggtc ttcacggtgt aggggcgtcc gtcgtaaacg ccttgtcgac cactcttgac 120
gttacggttc atcgtgacgg aaaaatccac tatcaggcgt acgagcgcgg tgtgcctgtg 180
gccgatcttg aagtgatcgg tgatactgat aagaccggaa cgattacgca cttcgttccg 240
gatccggaaa tcttcaaaga aacaactgta tacgactatg atctgctttc aaaccgtgtc 300
cgggaattgg ccttcctgac aaaaggcgta aacatcacga ttgaagacaa acgtgaagga 360
caagaacgga aaaacgagta ccactacgaa ggcggaatca aaagctatgt tgagtactta 420
acccgttcca aagaagtcgt tcatgaagag ccgatttata tcgaaggcga gaaagacggc 480
ataacggttg aagttgcatt gcaatacaac gacagctata caagcaatat ttattctttc 540
acaaataata tcaacacata cgaaggcggg acgcacgagg ccggatttaa aactggtctg 600
acccgtgtca taaacgacta tgcaagaaga aaagggattt tcaaagaaaa tgatccgaat 660
ttaagcgggg atgatgtgag agaagggctg actgccatta tttcaattaa gcaccctgat 720
ccgcaattcg aagggcagac gaaaaccaag ctcggcaact ctgaagcgag aacgatcact 780
gacacgctgt tttcttctgc gctggaaaca ttccttcttg aaaatccgga ctcagcccgc 840
aaaatcgttg aaaaaggttt aatggccgca agagcgcgga tggcagcgaa aaaagcgcgg 900
gaattgatcc ggcgcaaaag tgcgcttgag atttccaatc tgccgggcaa actggcgggc 960
tgttcttcta aagatccgag catttccgag ctgtatatcg tagagggtga ctctgcgggc 1020
ggatcagcga aacagggacg ggaccgtcat ttccaagcca ttctgccgct gcgcggtaag 1080
attctgaacg tcgagaaagc tagacttgat aagattctct caaacaatga ggtcagatca 1140
atgatcacgg ccctcggaac aggaatcggc gaagatttta atcttgaaaa agcgcgttat 1200
cataaagtgg tcatcatgac ggatgctgat gtagacggct cgcacatccg taccctgct 1259

Claims (9)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HMQAU19044，其特征在于，该菌株于2020年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCC No.19420。
2.一种由权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HMQAU19044制备的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有菌株HMQAU19044和/或菌株HMQAU19044的代谢产物。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的活性成分为菌株HMQAU19044的发酵液或者发酵滤液。
4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液体菌剂，且在该菌剂中活菌和/或活芽孢的数量≥1.5～2.0×109个/mL。
5.根据权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
(1)固体LB培养基制备；
(2)液体LB培养基制备；
(3)活化菌株：挑取一环菌株HMQAU19044菌落，接种在50mL液体LB培养基中，200rpm、30℃恒温振荡培养24h，制成种子液；
(4)发酵液的制备：将制备好的种子液，1/50接种于50mL液体LB培养基中，200rpm、30℃恒温振荡培养48h，制备菌株HMQAU19044发酵液；
(5)发酵滤液的制备：将制备好的发酵液于4℃，8000r/min离心15min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，制备菌株HMQAU19044发酵滤液。
6.根据权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述固体LB培养基由以下方法制备：取10g胰蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母浸出汁，15-20g琼脂粉，去离子水溶解，pH6.8，用去离子水定容至1L，121℃湿热灭菌25min。
7.根据权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述液体LB培养基由以下方法制备：取10g胰蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母浸出汁，去离子水溶解，pH6.8，用去离子水定容至1L，121℃湿热灭菌25min。
8.根据权利要求2所述的微生物菌剂的应用，其特征在于，所述微生物菌剂用于黄瓜霜霉病的防治。
9.一种黄瓜霜霉病的防治方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HMQAU19044或者权利要求2所述的微生物菌剂处理。
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