CN102329758A - 防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株bs1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物保护技术领域，涉及防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株BS1及其应用。菌株BS1，为蜡质芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.4736。一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌剂，以保藏号为CGMCC NO.4736的蜡质芽孢杆菌BS1为有效成分，其中蜡质芽孢杆菌BS1的活菌浓度为1×109～1010CFU/ml。该菌剂可以稀释100倍后在黄瓜移栽20d后喷雾处理，8d后调查发现其对黄瓜霜霉病的生防效果达到60.64％；喷雾/灌根同时处理时生防效果达到65.43％。蜡质芽孢杆菌BS1可在制备防治温室大棚黄瓜霜霉病的药物中应用。
Description
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，涉及防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株BS1及其应用。
背景技术
黄瓜是全球十大蔬菜栽培作物之一，在我国“菜篮子”工程中占有重要地位。其叶部病害很多，其中以霜霉病危害最重。黄瓜霜霉病，俗称“跑马干”，是属于鞭毛菌亚门古巴假霜霉菌(Psedoperonspora cubensis(Berkis Curt)Rostov)引起的一种真菌病害，在各地普遍发生。病菌的孢子囊可随风雨、黄瓜甲虫、农器具等进行传播，是一种主要的气传病害；且为专性寄生菌，对寄主植物的专化选择性很强。
随着我国温室大棚面积急剧增加，反季节黄瓜大棚栽培种植大量突现，合适的温湿度等条件，给霜霉病病菌的越冬、传播带来有利条件，一年四季可以侵染黄瓜，发病严重时，全叶呈黄褐色干枯，最后导致植株干枯早死，缩短收瓜期，严重影响黄瓜产量，损失可达20％到60％，是影响产量的主要制约因素之一。
目前，已有防治霜霉病的生物农药产品有霜霉威、克菌康、武夷菌素、绿盾丰、双抗等，活体的生防菌剂主要有芽孢杆菌和假单胞类，大多处于实验室研究开发阶段，登记注册的微乎其微。且因霜霉病是活体寄生菌，大多是完成简单的室内测定试验，在我国主要黄瓜栽培区进行日光温室或者露天试验药效广谱性测试的生防研究不是很多。在大棚种植中，最常用的方法是通过喷施化学药剂控制。但自从1979年首次报道黄瓜霜霉菌对甲霜灵存在抗性，随后有关其对乙磷铝抗性的报道出现，还发现对甲霜灵具有抗性的霜霉菌株存在交互抗性。因此，生物防治由于其自身的优点开始受到越来越多的重视。综上所述，开发新的、更为高效和安全的微生物杀菌剂控制黄瓜霜霉病的发生是提高社会生产总量的需要，同时更是农业安全可持续发展的需要，符号社会发展需求。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中没有对黄瓜霜霉病有较高防效的生防制剂的现状，提供一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株BS1。
本发明的另一目的是提供该菌株的应用。
本发明的又一目的是提供含有该菌株的菌剂及其制备方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株BS1，为蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)，于2011年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.4736。
所述的保藏号为CGMCC NO.4736的蜡质芽孢杆菌BS1在制备防治温室大棚黄瓜霜霉病的药物中的应用。
一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌剂，以所述的保藏号为CGMCC NO.4736的蜡质芽孢杆菌BS1为有效成分，其中所述的蜡质芽孢杆菌BS1的活菌浓度为1×109～1010CFU/ml。
所述的防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌剂的制备方法，包含如下步骤：
1)BS1种子菌液的培养：将所述的保藏号为CGMCC NO.4736的蜡质芽孢杆菌BS1接种到LB培养液中32℃200rpm振荡培养18-24h，12～16小时后定期取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零，直到种子菌液OD值均在0.5～0.8之间时结束培养，获得种子菌液；
2)菌剂制备：将种子菌液以1∶100体积比加入装有发酵培养液的发酵罐中(此处的1∶100体积比是指种子菌液与发酵培养液的体积比为1∶100)，30℃250rpm振荡培养20～24小时，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量20％，通气量5～7m3/小时，罐压0.05～0.1KPa，然后4000rpm离心10min，每1000ml培养液获得12～15g湿菌，取湿菌与菌体保藏液按1g∶40ml配成菌株BS1菌剂，活菌浓度为1×109～1010CFU/ml。
其中，所述的发酵培养液配方为：麦芽糖1.2g/L，玉米粉2.4g/L，黄豆粉2.4g/L，蛋白胨3.2g/L，二水氯化钙0.12g/L，一水硫酸锰0.12g/L，磷酸氢二钾0.18g/L，调节pH值为7.2～7.4；
所述的菌体保藏液的制备方法为：pH6.8，0.03mol/L的磷酸盐缓冲液中加入Tween20至Tween20在缓冲液中的终浓度为0.02mol/L即得菌体保藏液。
所述的生防菌剂在防治黄瓜霜霉病时可在作物苗床上喷雾使用，或者移栽时稀释100-1000倍喷雾使用。
本发明的有益效果：
本发明是专门针对黄瓜霜霉病开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于温室大棚蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于蔬菜的出口。同时，该菌剂还有增产功能，可为农民增加收入。
实验表明：利用该保藏号为CGMCC NO.4736的蜡质芽孢杆菌BS1制备的生防菌剂能显著降低黄瓜霜霉病的发生。该菌剂可以稀释100倍后在黄瓜移栽20d后喷雾处理，8d后调查发现其对黄瓜霜霉病的生防效果达到68.41％；喷雾/灌根同时处理时生防效果达到71.96％。
生物样品保藏信息
生防菌株BS1，分类名为蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)，于2011年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.4736。
具体实施方式
实施例1
菌株来源：BS1由广东省东莞市麻涌的香蕉根围土中分离得到。
菌株分离方法：平板稀释法(中国科学院南京土壤所微生物室.土壤微生物研究法[M].北京：科学出版杜，1985.)
菌株筛选依据：检测菌株水解五种酶的活性(蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶、嗜铁素、IAA测定Yang J.-H.，Liu H.～X.，Zhu G-M.，Xu L.-P.，Pan Y.-L.，and Guo J.-H.*.2008.Diversityanalysis of antagonists from rice associated bacteria and their application in biocontrol of ricediseases.Journal of Applied Microbiology.104(1)：91～104.)和对疫霉菌颉颃作用(对峙培养法，林福呈，李德堡.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对植物病原真菌的溶菌作用[J].植物病理学报，2003，33(2)：174～177.)，通过细菌的赋值评估(Faltin等，2004)，最终选择赋值评估分值靠前的BS1作为有效细菌成分，并送交CGMCC保藏，保藏号为CGMCC NO.4736。
菌株鉴定方法：鉴定方法为16S r DNA基因片段序列测序。
鉴定结果见表1：
表1：测序比对结果
实施例2菌剂制备
(1)种子菌液的培养：将BS1(CGMCC NO.4736)接种到LB培养液中，在32℃200rpm振荡培养18-24h培养，16h后在超净工作台中每隔3h取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零，直到种子菌液OD值均在0.5～0.8之间时结束培养，获得种子菌液；
(2)湿菌制备：将种子菌液以1∶100体积比加入装有200L发酵培养液的发酵罐中，30℃250rpm振荡培养20～24小时，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量20％，通气量6m3/小时，罐压0.05～0.1KPa。然后6000rpm离心10min，每1000ml培养液获得12～15g湿菌，取湿菌与菌体保藏液按1g∶40ml配成菌株BS1菌剂，活菌浓度为1×109～1010CFU/ml。
其中，BS1发酵培养基配方：麦芽糖1.2g/L，玉米粉2.4g/L，黄豆粉2.4g/L，蛋白胨3.2g/L，二水氯化钙0.12g/L，一水硫酸锰0.12g/L，磷酸氢二钾0.18g/L，调节pH值为7.2～7.4；菌体保藏液的制备方法为：pH6.8，0.03mol/L的磷酸盐缓冲液中加入Tween20至Tween20在缓冲液中的终浓度为0.02mol/L即得菌体保藏液。
实施例3室内孢子囊萌发试验
方法：玻片培养法(参考文献：NY/T 1156.1-2006农药室内生物测定试验准则杀菌剂第1部分：抑制病原真菌孢子萌发试验凹玻片法)：将实施例2制备的以菌株BS1(CGMCC NO.4736)为有效菌的生防菌剂配制成相应浓度，分别滴加在灭菌的载玻片上，然后往菌液中滴加10μl配制好的霜霉病菌孢子囊悬浮液，浓度为105个孢子囊/ml，每个处理4个重复，以灭菌的清水作为对照，置于25℃光照培养箱培养48h后观察孢子囊萌发率，镜检以视野中30个孢子囊为准，观察标准为芽管长度大于霜霉病菌孢子囊宽度的1/2，计算公式为抑制率％＝(清水处理孢子囊萌发率-生防菌处理组孢子囊萌发率)×100/清水处理孢子囊萌发率
霜霉病病原菌Pseudoperonospora cubensis(Berkely et Curtis)Rosto wzew，公知公用，见参照文献“汤钿.葡萄霜霉病离体接种方法的研究[J]微生物学通报，1994，(06).”。
病菌孢子囊悬浮液制备方法(参考文献：杜兴兰.葡萄霜霉病和白粉病生物防治的研究[D]河北农业大学，2008)：傍晚采集发病严重的新鲜黄瓜霜霉病病叶(近几天未施过农药)，用冰壶带回实验室，冲去叶面上的杂物和原有的孢子囊，用浸水的脱脂棉包住叶柄，置于18℃培养箱中黑暗保湿培养，24h后待长出新鲜孢子囊。用无菌水刷取新长出的孢子囊，双层纱布过滤，12000rpm 15min离心，弃去上清液，用灭菌水稀释至105个孢子囊/ml，在18℃培养箱中黑暗培养2-3h，待有大量游动孢子囊出现时使用。
结果显示，以菌株BS1(CGMCC NO.4736)为有效菌的生防菌剂(表2中简称BS1生昉菌剂)对霜霉病菌孢子囊的萌发有明显的抑制作用，如表2所示。
表2：BS1对黄瓜霜霉病菌孢子囊抑制效果
实施例4离体叶片试验
从育苗地直接采取黄瓜移栽5-20d新鲜叶片用自来水冲洗、晾干，尽量打成直径为1cm的叶圆盘，每叶圆盘背面朝上，放入灭菌的培养皿中，培养皿中放一张用2mL无菌水浸湿的滤纸保湿，每培养皿9个叶圆盘，每个处理重复3次，每个叶圆盘中央接一滴10μl配好的霜霉病菌孢子囊悬浮液(浓度为105个孢子囊/ml)，置于25℃的生化培养箱中培养，对照发病时进行记录。
根据GB/T17980.26-2000《杀菌剂防治黄瓜霜霉病田间药效试验准则(一)》的黄瓜霜霉病分级标准：0级：无病斑，1级，病斑面积占整个叶面积的5％以下；3级，病斑面积占整个叶面积的6％～10％；5级，病斑面积占整个叶面积的11％～25％，7级，病斑面积占整个叶面积的26％～50％；9级，病斑面积占整个叶面积的50％以上。
调查方法：每株的每片叶子都调查，新叶也调查。
病害严重度％＝[∑(病级叶片数×代表级数)/总叶片数×最高代表级值]×100；
生物防治效果％＝(对照病害严重度-处理病害严重度)/对照病害严重度×100
以下实施例中的病害严重度和生物防治效果皆同此计算方法。
①预防试验：将叶圆盘在实施例2制备的BS1生防菌剂中浸泡5min取出后自然条件晾干，然后接种霜霉病菌孢子囊悬浮液，以无菌水为阴性对照，每个处理重复4次。置于25℃的生化培养箱中培养。接种病原菌后8日统计病害严重度及防效，结果显示：该含BS1(CGMCC NO.4736)的生防菌剂对黄瓜霜霉病预防效果为69.99％，如表3。
表3：BS1生防菌剂对黄瓜霜霉病预防效果
②治疗试验：在叶圆盘上接种霜霉病菌孢子囊悬浮液，置于25℃的生化培养箱中培养1d，从培养皿中取出叶圆盘，在实施例2制备的BS1生防菌剂中浸泡5min，以无菌水为阴性对照，以霜霉威为阳性对照，每个处理重复3次，取出后自然条件下晾干，置于25℃的生化培养箱中继续培养。BS1处理后8d统计病害严重度及防效。数据显示，该含BS1(CGMCC NO.4736)的生防菌剂对黄瓜霜霉病治疗效果为56.78％，数据如表4。
表4：BS1生防菌剂对黄瓜霜霉病防治治疗效果
实施例5实验室温室试验
本实验黄瓜品种采用“津优35”，待长出8片真叶时开始喷施处理药剂，设3个处理组，处理药剂分别为：A：用清水40倍稀释的实施例2制备的BS1生防菌剂；B：20％霜霉威水剂；C：清水对照。每处理设4个重复，每个重复24棵苗。喷施处理药剂后5d接种霜霉病菌孢子囊，浓度为105个孢子囊/ml，接种后8d时对照组发病。
调查病害严重度并计算防效，BS1生防菌剂生防效果为64.07％，如表5。
表5：BS1生防菌剂对防治黄瓜霜霉病生防效果
实施例6温室日光大棚田间试验
实验地点一：淮安市丁集镇黄瓜日光温室大棚
大田试验选择在淮安市丁集镇黄瓜日光温室大棚，共设2个处理组分别为：A：用清水100倍稀释的实施例2制备的BS1生防菌剂；B：清水对照。每处理设4个重复小区，每个重复60棵苗，各小区采用随机区组排列，小区之间以保护行隔离。施药方法采用小喷壶精细喷雾至每片黄瓜叶子上，主要喷施叶子背面；以及喷雾和灌根处理同时进行两种方法。
移栽后20d(长出5-6片真叶)喷施处理药剂，采用一定农用措施，控制好大棚温湿度，大棚出现霜霉病情开始调查。
数据显示，该含BS1(CGMCC NO.4736)的生防菌剂喷雾处理对黄瓜霜霉病生防效果为60.64％，而喷雾和灌根同时处理则相应提高了生防效果，其值为65.43％，如表6。
表6：BS1生防菌剂对黄瓜霜霉病的生防效果处理8d)
注：sp表示采用喷雾处理；ss表示采用喷雾和灌根处理同时进行，BS1生防菌剂稀释100倍，灌根处理时每株黄瓜苗100ml。
实验地点二：淮安市柴米河公司黄瓜日光温室大棚
黄瓜品种为“津绿农家乐”。共设3个处理组，处理药剂分别为：A：用清水200倍稀释的实施例2制备的BS1生防菌剂；B：20％霜霉威水剂；C：清水对照。每处理设4个重复小区，每个重复60棵苗，各小区采用随机区组排列，小区之间以保护行隔离。施药方法采用小喷壶精细喷雾至每片黄瓜叶子上，主要喷施叶子背面；以及喷雾和灌根处理同时进行两种方法。
移栽后20d(长出5-6片真叶)喷施处理药剂，采用一定农用措施，控制好大棚温湿度，大棚出现霜霉病情开始调查。
数据显示，此菌剂采用喷雾处理对黄瓜霜霉病的生防效果为58.91％，而喷雾和灌根同时处理的生防效果为63.68％，如表7。
表7：BS1对黄瓜霜霉病的生防效果(处理7d)
注：sp表示采用喷雾处理；ss表示采用喷雾和灌根处理同时进行，BS1菌剂稀释200倍，灌根处理时每株黄瓜苗100ml。
实施例7：温室促生试验
选用4-5叶期的黄瓜苗，生防菌处理组，每株苗用30ml含BS1(CGMCC NO.4736)浓度为108CFU/ml的生防菌剂灌根和喷雾处理，对照组用清水处理，每个处理48棵苗，每处理重复4次。25d天后测量苗株高、茎围及鲜重等指标并计算生物量增加，计算各组生物量增加，结果见表8。
生物量增加＝[(处理平均鲜重-对照平均鲜重)/对照平均鲜重]×100％
表8：BS1对黄瓜的温室促生效果
注：*不同英文字母表示处理间在P＝0.05水平上差异性显著(Duncan’test)
实施例8大棚促生效果统计
黄瓜品种为津优“35”，共设3个处理：A：用清水100倍稀释的含BS1(CGMCC NO.4736)108CFU/ml的生防菌剂，在黄瓜移栽当天灌根和喷雾处理；B：20％霜霉威水剂，在黄瓜移栽当天喷雾处理；C：清水对照，在黄瓜移栽当天喷雾处理。在黄瓜移栽后第30天、60天进行田间促生效果的调查，每个处理4个重复小区。每小区按照5点取样法随机取5株进行最大叶面积cm2(从黄瓜茎顶端向下第4-5节黄瓜植株当时最大叶片面积)，茎粗(黄瓜茎顶端自上向下第五节处茎粗)，叶片数、挂果数，以及成果率的调查统计。同时从采收开始分别对不同处理组进行产量统计。从采收开始分别对小区产量进行登记，并统计小区总产量。
增产率(％)＝(药剂处理后黄瓜产量-空白对照产量)/空白对照产量×100
从表9、表10可见，处理30天时，BS1生防菌剂对黄瓜地上部分的促生作用明显。处理60天时挂果数较空白对照增加17.86％。从表11可见，处理60天时，BS1生防菌剂对黄瓜的增产率达49.33％，显著高于对照药剂霜霉威。
表9：不同处理黄瓜30天时后促生效果
表10：不同处理黄瓜60天时促生效果
表11：黄瓜单果和产量测定
Claims (6)
1.一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株BS1，为蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)，于2011年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.4736。
2.权利要求1所述的保藏号为CGMCC NO.4736的蜡质芽孢杆菌BS1在制备防治温室大棚黄瓜霜霉病的药物中的应用。
3.一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌剂，其特征在于以权利要求1所述的保藏号为CGMCCNO.4736的蜡质芽孢杆菌BS1为有效成分，其中蜡质芽孢杆菌BS1的活菌浓度为1×109～1010CFU/ml。
4.权利要求3所述的防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌剂的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
1)BS1种子菌液的培养：将权利要求1所述的菌株BS1接种到LB培养液中32℃200rpm振荡培养18-24h，12～16小时后定期取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零，直到种子菌液OD值均在0.5～0.8之间时结束培养，获得种子菌液；
2)菌剂制备：将种子菌液以1∶100体积比加入装有发酵培养液的发酵罐中，30℃250rpm振荡培养20～24小时，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量20％，通气量5～7m3/小时，罐压0.05～0.1KPa，然后4000rpm离心10min，每1000ml培养液获得12～15g湿菌，取湿菌与菌体保藏液按1g∶40ml配成以菌株BS1为有效成分的生防菌剂，活菌浓度为1×109～1010CFU/ml。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的发酵培养液配方为：麦芽糖1.2g/L，玉米粉2.4g/L，黄豆粉2.4g/L，蛋白胨3.2g/L，二水氯化钙0.12g/L，一水硫酸锰0.12g/L，磷酸氢二钾0.18g/L，调节pH值为7.2～7.4；
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的菌体保藏液的制备方法为：pH6.8，0.03mol/L的磷酸盐缓冲液中加入Tween20至Tween20在缓冲液中的终浓度为0.02mol/L即得菌体保藏液。
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| CN102586143A (zh) * | 2012-02-09 | 2012-07-18 | 河北省农林科学院植物保护研究所 | 用于防治黄瓜霜霉病的摩加夫芽孢杆菌及其微生物菌剂 |
| CN102586143B (zh) * | 2012-02-09 | 2013-07-10 | 河北省农林科学院植物保护研究所 | 用于防治黄瓜霜霉病的摩加夫芽孢杆菌及其微生物菌剂 |
| CN112195135A (zh) * | 2020-11-06 | 2021-01-08 | 青岛农业大学 | 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治植物霜霉病害中的应用 |
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| CN102329758B (zh) | 2012-10-03 |
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