CN101456909B

CN101456909B - 一种大豆hkt类蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101456909B
Application number: CN2009100291203A
Authority: CN
Inventors: 喻德跃; 陈华涛
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2009-01-13
Filing date: 2009-01-13
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2029-01-13
Also published as: CN101456909A

Abstract

本发明公开了一种大豆HKT类蛋白及其编码基因与应用，属于生物技术领域。该大豆HKT类蛋白，命名为GmSKC1蛋白，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。其编码基因为GmSKC1基因SEQ ID NO.1的DNA序列。本发明大豆HKT类蛋白及其编码基因可用于培育耐盐植物品种特别是耐盐大豆品种。GmSKC1的表达受高盐的诱导，在150mM NaCl的胁迫下，GmSKC1在大豆的根及叶片等组织中受到强烈诱导，在茎中的表达量呈现基本不变的趋势。过量表达GmSKC1的烟草与未转基因烟草相比，其耐盐性显著提高，说明GmSKC1基因对提高植物的耐盐能力方面起着重要作用。

Description

一种大豆HKT类蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及与耐盐性相关的高亲和性钾离子转运蛋白(high-affinity K transporter，HKT)及其编码基因与应用，并涉及来源于大豆的与耐盐性相关的HKT类蛋白GmSKC1及其编码基因与其在培育耐盐植物品种中的应用。

背景技术

土壤的盐渍化和次生盐渍化是影响农业生产和生态环境的重要因素之一。全世界至少有20％的耕地盐渍化，特别是在干旱和半干旱地区，土壤次生盐渍化日趋严重。我国约有盐渍化和和次生盐渍化土地4千万hm²以上，成为制约农业发展的主要环境因素。选育耐盐品种是缓解土壤盐渍化对农业生产影响的有效途径之一。因此，提高农作物的耐盐能力，对于扩大可耕地面积和改善农业生产均具有重要的现实意义。目前，应用基因工程技术进行育种已经成为提高作物耐盐性的重要方法之一。高等植物在应答环境中的高盐条件下的逆境胁迫时，HKT(high-affinity K transporter)类蛋白在提高植物本身的耐盐能力方面起着重要作用。HKT类蛋白是广泛存在于植物、酵母、细菌以及真菌中的一个超级蛋白家族。HKT类蛋白既作为高亲和K⁺转运载体，也是一种Na⁺转运体，也可能有双重功能但选择性不同。越来越多的结果表明在盐胁迫条件下，限制Na⁺吸收、增加Na⁺外排，同时保证K⁺的吸收，维持细胞质低Na⁺/K⁺比是植物耐盐性的关键。在小麦中首次发现了HKT类蛋白，植物中该类蛋白的功能研究尚少。

大豆是我国五大作物之一，弄清其耐盐分子机理，进而为提高其耐盐性提供基础，具有重要的理论及现实意义。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种大豆HKT类蛋白及其编码基因与应用。

技术方案

本发明所提供的大豆HKT类蛋白，名称为GmSKC1，来源于大豆属大豆(Glycine max(L.))，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。

上述的大豆HKT类蛋白的编码基因，其cDNA基因具有序列表中GmSKC1基因SEQ ID NO.1的DNA序列；其中，序列表中的GmSKC1基因SEQ ID NO.1由1260个脱氧核苷酸组成，本序列为GmSKC1基因的读码框，编码具有序列表中SEQ IDNO.2的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明GmSKC1基因SEQ ID NO.1的表达载体是指pMDC83-GmSKC1植物过量表达载体，宿主菌是指将GmSKC1基因转入的根癌农杆菌菌株EHA105。

扩增GmSKC1基因的引物是，

GmSKC1 ORF sense：5‘-ATGGGTTTAGTTTTTCTCC-3’，

GmSKC1 ORF antisense：5‘-TTACATCATGACAACGAAG-3’。

上述大豆HKT类蛋白GmSKC1蛋白及其编码基因GmSKC1基因可在培育耐盐性植物中得到应用。

有益效果

GmSKC1的表达受高盐的诱导，在150mM NaCl的胁迫下，GmSKC1在大豆的根及叶片等组织中受到强烈诱导，在茎中的表达量呈现基本不变的趋势。导入过量表达GmSKC1的烟草与未转基因烟草相比，其耐盐性显著提高，说明GmSKC1基因对提高植物的耐盐能力方面起着重要作用。

本发明的GmSKC1对培育耐盐植物品种特别是耐盐大豆，提高农作物特别是大豆的产量具有重要意义。

利用植物表达载体，将本发明的GmSKC1的编码基因导入植物细胞，可获得对高盐胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。

使用GmSKC1构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明GmSKC1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是大豆、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为GmSKC1在高盐胁迫下的表达特性图

图2为含有GmSKC1的植物表达载体的部分结构示意图

大豆GmSKC1，在大肠杆菌中，抗卡那霉素和潮霉素。农杆菌是EHA105。

图3为转基因植株Line16、Line27、Line31和野生型植株在0mM和200mM的NaCL胁迫下，野生型烟草(WT)与转基因株系等的株高、根长及鲜重等性状的考察(*，P≤0.05；**，P≤0.01)。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、大豆GmSKC1及其编码基因的cDNA克隆与鉴定

以大豆耐盐品种Lee68(公知公用，Abel & MacKenzie，1964，Crop Science 14，157-161)为材料，通过生物信息学的方法，以已报道的水稻HKT蛋白序列(OsHKT8，登陆号BAB93392)为种子序列，搜索大豆的EST数据库，找到一条高度同源的EST片段，基因命名为GmSKC1。以大豆嫩叶的cDNA为模板进行PCR扩增，结果扩增出与预期大小一致的条带，随后进行PCR产物的割胶纯化、连接及转化工作，挑取阳性克隆测序。测序结果显示已经克隆到大豆GmSKC1基因的部分序列，发现其5’端和3’端均不完整。进行了3’端的延伸，并进行克隆测序，序列分析后发现3’端序列获得完整。利用已经部分公布的大豆WGS序列，搜索大豆WGS数据库，结果5’端得到了延伸，并设计特异引物分别从大豆基因组及大豆嫩叶的cDNA中进行克隆验证。拼接后发现大豆GmSKC1基因的ORF全长为1260bp，编码419个氨基酸。

根据GmSKC1基因序列设计引物：

GmSKC1 ORF sense：5‘-ATGGGTTTAGTTTTTCTCC-3’，

GmSKC1 ORF antisense：5‘-TTACATCATGACAACGAAG-3’应用RT-PCR方法，从大豆总RNA中扩增GmSKC1基因。取大豆耐盐品种Lee68叶片，置于液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入无水乙醇进行沉淀，最后将沉淀溶于水中得到总RNA。取5μg总RNA用反转录试剂盒(Promega公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应。20μl PCR反应体系为：1μl一链cDNA(0.05μg)、1μl引物(20μM)、2μl 10×PCR缓冲液、0.4μl dNTP(10mM)和1U Taq DNA聚合酶，用超纯水补足20μl。反应在Bio-RAD PTC200型PCR仪上进行，其程序为94℃变性5min；再94℃1min，56℃1min，72℃1.5min，共32个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物经回收后序列分析，结果表明该PCR产物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

实施例2、大豆GmSKC1基因在高盐胁迫下的表达特征

对大豆耐盐品种Lee68进行NaCl胁迫处理用于分析大豆GmSKC1在盐胁迫下的表达情况。为了进行RT-PCR分析GmSKC1在盐胁迫下的表达变化趋势，采用水培(Hoagland营养液)的方式种植大豆品种Lee68，待植株的第一簇复叶长出后，使用包含150mM NaCI的Hoagland营养液进行胁迫处理，取盐处理后0h、6h、12h、24h、36h及48h等6个时期的根、茎及叶，液氮速冻后-80℃保存备用。

总RNA的提取同实施例一。以大豆组成型表达的Actin基因(GenBankaccession No.V00450)为内部参照，以来自大豆不同组织及盐诱导不同时间段的不同组织的总RNA为模板，进行RT-PCR分析。RT-PCR分析表明(图1)，在150mMNaCI胁迫下，GmSKC1在根和叶等组织中的表达量均受到强烈诱导，而其在茎中的表达量基本不变。根中的表达量在盐处理12小时后有一个明显的上调，叶中的表达量在盐处理24小时后有一个明显的上调。

实施例3、GmSKC1编码蛋白的功能鉴定

利用Invitrogen公司的

Technology with Clonase^TM II试剂盒，将GmSKC1正向插入到表达载体pMDC83(Sokolov et al，2005，PNAS，103；9732-9737)(图2)中，得到pMDC83-GmSKC1植物过量表达载体，用冻融法将pMDC83-GmSKC1转入根癌农杆菌菌株EHA105(Avsian-Kretchmer et al，2004，Plant Physiology，135：1685-1696)中。pMDC83-GmSKC1通过农杆菌EHA105的介导转化烟草，PCR检测结果表明获得62株阳性植株，结合RT-PCR分析结果选择了3个阳性转基因株系(Line16、Line27、Line31)，将Line16、Line27和Line31的种子种入MS培养基，待野生型烟草(WT)以及T₁代转基因株系(Line16、Line27、Line31)萌发生长成小苗后(约15天)，将它们转入含0mM NaCl和200mM NaCl的1/2MS基本培养基中进行盐处理(约12天)，结果表明在200mM的NaCL胁迫下，野生型烟草(WT)基本上全部萎黄，长势极差，而在同样条件下的三个转基因株系(Line16、Line26和Line31)的T1代植株长势良好；在0mM NaCl和200mM NaCl胁迫下，分析了野生型烟草(WT)与转基因株系等的株高、根长及植株鲜重等性状，转基因株系生长良好，在株高、根长和鲜重等方面与野生型烟草相比均达显著或极显著水平如图3。说明过量表达GmSKC1基因能提高转基因烟草的耐盐能力。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种大豆HKT类蛋白及其编码基因与应用

<130>说明书

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1260

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max L.)

<220>

<221>GmSKC1基因读码框(ORF)

<222>(1)..(1260)

<223>

<400>1

atgggtttag tttttctcct ccttttgcat aatctaggcc acatgcagcg aattattgtg 60

ctatataaat ggctcccatt tgacggatta tccacacaca ccatgggagt acttctattt 120

gtacttgaat taaatacaat gatgaagagt acactctcgt acttttcacg cagccttcga 180

ttcttggctg gtttgatagc cttccatttc cactcctttt ttattcaact ttgttatttg 240

atgatccttt ctctggttgg ttacttgggt cttaaggttt caaagccaag gaaccctgtt 300

aggctcaatg acttggacct cttttacacc tccgtttctg cttccacagc ttctagcatg 360

gtagccgttg aaatggaggt tttctccaat tctcaactca ttctcttcac ccttctcatg 420

tttcttggcg gggaagtttt cacttccatg ctcgaccttc tatttgctgg ttataaatta 480

caaaacaaag ttagcatcaa tccttttcca cccacaaatc atgcaaatca aatagagctt 540

ggtttagtac tttctattcc tcactcggat tcagaaaaca acaatccatg tgacagtaat 600

attattaacg ttgcatcatg cgatagactc aagtataact gtcttagtta tttgacatat 660

gcagttttag gttaccttgt gatggttcaa tttgttggct ttagttttgt gtctttgtat 720

atgactttgg taccgagtgc aagacaagta ctgaaaaaca aaggcatcaa gattgtaaca 780

ttttctttgt ttaccgtagt ttccactttt gctagttgtg gttttgtccc caccaatgag 840

aacatgttag ttttcaagaa gaattcgggg cttctcctcc taatcctccc acacgtcttt 900

ctaggtaacg ccctgtatcc accatgcttg aggcttttga taatggtttt gaaaaaagtt 960

acaaagaaag aggaattctc gtacttgctg aagaattcca tagatgtggg ctatgaacat 1020

ttgctctctg atcttcgttg ttgcttcctg gttgctactg tcttgggatt caatcttata 1080

caatttgtga tgctttgctc tttggagtgg aaaaccaaaa tcatggaggg tttgaatgtg 1140

tatgagaaag tggtggcgtc attatttcaa gtaacaaacg cgagacacgc tggtgaatct 1200

gtttttgatc tctcctccat ctcttcagcc atattagtac tcttcgttgt catgatgtaa 1260

<210>2

<211>419

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max L.)

<220>

<221>GmSKC1蛋白序列

<222>(1)..(419)

<223>

<400>2

Met Gly Leu Val Phe Leu Leu Leu Leu His Asn Leu Gly His Met Gln

1 5 10 15

Arg Ile Ile Val Leu Tyr Lys Trp Leu Pro Phe Asp Gly Leu Ser Thr

20 25 30

His Thr Met Gly Val Leu Leu Phe Val Leu Glu Leu Asn Thr Met Met

35 40 45

Lys Ser Thr Leu Ser Tyr Phe Ser Arg Ser Leu Arg Phe Leu Ala Gly

50 55 60

Leu Ile Ala Phe His Phe His Ser Phe Phe Ile Gln Leu Cys Tyr Leu

65 70 75 80

Met Ile Leu Ser Leu Val Gly Tyr Leu Gly Leu Lys Val Ser Lys Pro

85 90 95

Arg Asn Pro Val Arg Leu Asn Asp Leu Asp Leu Phe Tyr Thr Ser Val

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Ala Ser Ser Met Val Ala Val Glu Met Glu Val Phe

115 120 125

Ser Asn Ser Gln Leu Ile Leu Phe Thr Leu Leu Met Phe Leu Gly Gly

130 135 140

Glu Val Phe Thr Ser Met Leu Asp Leu Leu Phe Ala Gly Tyr Lys Leu

145 150 155 160

Gln Asn Lys Val Ser Ile Asn Pro Phe Pro Pro Thr Asn His Ala Asn

165 170 175

Gln Ile Glu Leu Gly Leu Val Leu Ser Ile Pro His Ser Asp Ser Glu

180 185 190

Asn Asn Asn Pro Cys Asp Ser Asn Ile Ile Asn Val Ala Ser Cys Asp

195 200 205

Arg Leu Lys Tyr Asn Cys Leu Ser Tyr Leu Thr Tyr Ala Val Leu Gly

210 215 220

Tyr Leu Val Met Val Gln Phe Val Gly Phe Ser Phe Val Ser Leu Tyr

225 230 235 240

Met Thr Leu Val Pro Ser Ala Arg Gln Val Leu Lys Asn Lys Gly Ile

245 250 255

Lys Ile Val Thr Phe Ser Leu Phe Thr Val Val Ser Thr Phe Ala Ser

260 265 270

Cys Gly Phe Val Pro Thr Asn Glu Asn Met Leu Val Phe Lys Lys Asn

275 280 285

Ser Gly Leu Leu Leu Leu Ile Leu Pro His Val Phe Leu Gly Asn Ala

290 295 300

Leu Tyr Pro Pro Cys Leu Arg Leu Leu Ile Met Val Leu Lys Lys Val

305 310 315 320

Thr Lys Lys Glu Glu Phe Ser Tyr Leu Leu Lys Asn Ser Ile Asp Val

325 330 335

Gly Tyr Glu His Leu Leu Ser Asp Leu Arg Cys Cys Phe Leu Val Ala

340 345 350

Thr Val Leu Gly Phe Asn Leu Ile Gln Phe Val Met Leu Cys Ser Leu

355 360 365

Glu Trp Lys Thr Lys Ile Met Glu Gly Leu Asn Val Tyr Glu Lys Val

370 375 380

Val Ala Ser Leu Phe Gln Val Thr Asn Ala Arg His Ala Gly Glu Ser

385 390 395 400

Val Phe Asp Leu Ser Ser Ile Ser Ser Ala Ile Leu Val Leu Phe Val

405 410 415

Val Met Met

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>GmSKC1 ORF sense

<222>(1)..(19)

<223>

<400>3

atgggtttag tttttctcc 19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>GmSKC1 ORF antisense

<222>(1)..(19)

<223>

<400>4

ttacatcatg acaacgaag 19

Claims

1.一种大豆高亲和性钾离子转运HKT类蛋白，命名为GmSKC1蛋白，其是序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。

2.权利要求1所述的大豆HKT类蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述大豆HKT类蛋白的cDNA基因，为序列表中GmSKC1基因SEQ ID NO.1的DNA序列。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的宿主菌。

6.根据权利要求5所述的宿主菌，是指将GmSKC1基因转入的根癌农杆菌菌株EHA105。

7.扩增权利要求2或3所述基因的引物，其特征是，GmSKC1 ORF sense：5‘-ATGGGTTTAGTTTTTCTCC-3’，GmSKC1 ORF antisense：5‘-TTACATCATGACAACGAAG-3’。

8.权利要求1所述的大豆HKT类蛋白在培育耐盐性植物中的应用。

9.权利要求2或3所述的大豆HKT类蛋白编码基因在培育耐盐性植物中的应用。